CN108441431B - 一株高抗逆性解脂耶氏酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能直接利用L‑苯丙氨酸发酵产2‑苯乙醇的高抗逆性解脂耶氏酵母及应用。本发明公开了一株解脂耶氏酵母，分类命名为Yarrowia lipolytica Y66，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2017753。本发明通过离子束诱变，经含有高浓度醇类抑制物的平板和摇瓶发酵筛选，得到的突变菌株以葡萄糖作为碳源，在摇瓶发酵中对苯乙醇的耐受性和产物的产量分别达到了4.0g/L和3.2g/L，分别是同等条件培养的出发菌株的4倍和2.13倍；其抗逆性强、产物产量高、重复性好，是一种适合利用L‑苯丙氨酸发酵产2‑苯乙醇的优良菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一株能利用L-苯丙氨酸的解脂耶氏酵母及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
2-苯乙醇是一种具有玫瑰气味的芳香醇，天然存在于玫瑰和百合等多种植物的精油中。现如今在国内外，2-苯乙醇已被广泛应用于医药、食品、化妆品、烟草和日化用品等产业中。以其为原料可以合成许多应用价值很高的衍生物，例如，苯乙醇的酯类衍生物-乙酸苯乙酯，是一种重要的芳香物质，香气似玫瑰而带有蜜甜，可以用作日化香精和食用香精。全球2-苯乙醇的年产量近万吨，除了很少一部分是从天然的玫瑰花中提取之外，大部分采用廉价的化工原料苯或苯乙烯通过化学途径合成的，即苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢法。但化学合成所使用的原料很多属于致癌物质，对人体健康和环境都有巨大危害。此外，化学合成的苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物，例如，联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等具有不良气味，严重影响了2-苯乙醇的产品质量，难以达到食用和日用香料的质量标准。
从上世纪末开始，随着人们对生活品质要求的提高和对健康的关注，消费者越来越注重食品、日用品等的安全性，更崇尚“绿色”和“天然”，食品、化妆品等生产也越来越倾向于使用天然的添加剂。所谓“天然”，即此物质必须来源于自然，在美国和欧洲，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产，其售价也更昂贵。
天然2-苯乙醇虽然存在于很多花和植物的精炼油中如茉莉、水仙、百合等，但多数情况下浓度太低，无法提取。唯一例外的是玫瑰精油，然而，玫瑰花每年只开一次，从玫瑰中提取天然2-苯乙醇的生产周期长、生产成本昂贵，无法进行大规模工业化生产，难以满足市场的需要。微生物具有体积小、繁殖快、吸收多、转化快、适应强等特点，采用微生物转化法生产天然的2-苯乙醇保留了产品的单纯、天然的特点，又具有成本低、周期短、效率高等优点，且产品的质量符合国际标准。研究表明，酵母细胞具有从头合成2-苯乙醇的代谢途径，也可通过氨基酸分解代谢途径将L-苯丙氨酸直接转化为2-苯乙醇。1907年艾利希在酵母培养物中添加L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量得到大幅提高，给利用酵母菌生物转化生产天然2-苯乙醇的产业化带来了希望。在欧美发达国家，健康天然的生活理念已经深入人心，人们很早就开始重视天然物质的生物合成，对于2-苯乙醇生物合成的研究较早，目前已达到较高水平。我国虽然已有很多关于L-苯丙氨酸生物合成的研究报告，但对于2-苯乙醇生物合成的研究尚处于起步阶段，有关的文献报道也甚少，这与国外差距甚远。
和许多醇类物质一样，高浓度的2-苯乙醇对微生物有一定的毒性，浓度介于2～3g/L的2-苯乙醇能完全抑制多种细菌和真菌的生长，因而已经作为杀菌剂在医药行业中应用。此外，酵母在发酵过程中除生产2-苯乙醇外也会产生大量乙醇，乙醇和2-苯乙醇联合作用产生的毒性比它们各自产生的毒性作用累加还要高，这是微生物转化法生产2-苯乙醇工艺中产物浓度低的主要原因，也是生物法生产天然2-苯乙醇的瓶颈。
因此，在要达到高产量生产2-苯乙醇的工艺过程中，必须考虑2-苯乙醇和乙醇对酵母的毒性问题，而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株具有高抗逆性的解脂耶氏酵母，其对2-苯乙醇的耐受性显著提高，且发酵的最终产物的产量也得到了明显的提高。
本发明还要解决的技术问题是提供上述高抗逆性解脂耶氏酵母的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株高抗逆性解脂耶氏酵母，其分类命名为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Y66，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2017753，保藏日期为2017年11月30日。
上述高抗逆性解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66是2017年8月以江苏省南京市浦口区南京工业大学校园内土壤中筛选出的解脂耶氏酵母为出发菌株离子束诱变后，利用含有高浓度2-苯乙醇的平板筛选得到对抑制物耐受性高、还原力强的菌株，最后以L-苯丙氨酸为底物，经好氧发酵筛选获得产物产量高的解脂耶氏酵母目标菌株。
其具体诱变筛选步骤如下：
a)离子束诱变：将解脂耶氏酵母菌株活化培养，100ml的三角瓶装液量20mL，培养温度30℃，培养时间10～12h，得到处于对数生长期的菌液，用生理盐水将培养的细胞稀释到OD600＝0.6，取10微升菌液铺开在小铁片上，用无菌空气吹干；以5～15KeV作为离子注入的能量，以0.4～2.4×1016ions/cm2作为诱变剂量对菌株进行离子束诱变；
b)平板初筛：菌株经离子诱变后，用生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于含抑制物的常规固体培养基平板上，在30℃温度下好氧培养12～30h，挑选出在该平板上较大的菌落；
c)平板复筛：将步骤b)筛选的菌株接种于100mL的三角瓶装液量20mL，30℃好氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.6的菌悬液，吸取2μL点滴到含抑制物平板上，在30℃温度下好氧培养12～30h，挑选出长得明显大于出发菌的菌落；
d)三角瓶发酵筛选：将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度30℃，好氧培养培养时间10～16h，然后在发酵培养基中发酵，接种量1％～2％(v/v)，发酵温度30℃，好氧发酵发酵时间60～80h；考察筛选出的菌落发酵产2-苯乙醇的产量，同时选出2-苯乙醇产量高的菌株。
步骤a)中所述的离子诱变方法中，优选10KeV作为离子注入的能量，1.6×1016ions/cm2作为诱变剂量。
步骤b)所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为YNB、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。
步骤c)和d)所采用的固体培养基、种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、甘油、乙酸的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为YNB、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合，另外，还有尿嘧啶和底物苯丙氨酸。
上述筛选出的高抗逆性解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66，其18srDNA序列如SEQ ID No.：1所示。
上述筛选出的高抗逆性解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66在生产2-苯乙醇中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体应用步骤如下：
1)平板培养：将解脂耶氏酵母CCTCC NO：M 2017753接种至平板培养基好氧培养，培养温度28℃～30℃(优选30℃)，培养时间12～24h；
2)种子培养：将平板培养的解脂耶氏酵母CCTCC NO：M 2017753接种到种子培养基中，250mL的三角瓶装液量40～60mL，好氧培养，培养温度28℃～30℃(优选30℃)，培养时间12～24h；
3)发酵产2-苯乙醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量1～2％(v/v)，好氧发酵，发酵温度28℃～30℃(优选30℃)，发酵培养时间为200～300h。
其中，所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源1％～2％、氮源1％～3％、琼脂1.5％～2％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的任意一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合。
其中，所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源4％、氮源0.05％、无机盐0.1％～0.25％、生长因子0.0001％～0.1％、尿嘧啶0.01％、L-苯丙氨酸0.5％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；所述的氮源为YNB、乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
其中，所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源4～10％、氮源0.5％、无机盐0.1％～0.25％、生长因子0.0001％～0.1％、尿嘧啶0.01％、L-苯丙氨酸0.5～1％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；所述的氮源为YNB、乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
本发明的有益效果在于：
本发明采用离子束诱变解脂耶氏酵母，利用含高浓度醇类抑制物的平板筛选对醇类抑制物具有较强的耐受性、并能直接利用L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇，产物产量高的菌株。利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以葡萄糖作为碳源，在摇瓶发酵中对苯乙醇的耐受性和产物的产量分别达到了4.0g/L和3.2g/L，分别是同等条件培养的出发菌株的4倍和2.13倍；具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：本实施例说明将解脂耶氏酵母原始菌株进行第一步离子束诱变的方法。
解脂耶氏酵母原始菌株取于本实验室原有的筛选的野生菌；进行第一步离子束诱变的方法如下：
用将解脂耶氏酵母原始菌株活化培养，培养温度30℃，100mL摇瓶装液量20mL，培养时间12～18h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600＝0.6，取10微升菌液铺开在小铁片上，无菌空气吹干；用10KeV注入不同剂量，脉冲方式每次注入5s，间隔15s。离子注入诱变后，将菌膜洗脱下来。
实施例2：本实例说明进一步筛选优良解脂耶氏酵母的方法。
其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)：
(1)固体平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH6。
(2)2-苯乙醇平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，2-苯乙醇0.2％琼脂2％，其余为水，pH 6。
(3)2-苯乙醇平板合成培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，葡萄糖4％，2-苯乙醇0.2％，VB10.0002％，FeCl2.4H2O0.00015％，NaCl 0.1％，MgCl2.6H2O 0.05％，KH2PO40.02％，KCl 0.03％，CaCl2.2H2O 0.0015％，其余为水。
(4)摇瓶发酵筛选培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖4％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB1 0.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O0.0015％)，其余为水。
筛选步骤：
1、抑制物平板筛选
用生理盐水洗出经离子束诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于含有醇类抑制物(0.2％)的常规固体培养基平板上，在28～30℃温度下好氧培养30h，挑选可以在筛选平板上生长、菌落较大的菌落几株。
2、2-苯乙醇平板复筛
将筛选的菌株接种于100mL的三角瓶装液量20mL，28～30℃好氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.6的菌悬液，吸取2uL点滴到含有醇类抑制物(0.2％)的合成培养基平板上，在28～30℃温度下好氧培养12～24h，挑选出菌落显大于出发菌的菌落。
最终菌株Y66和Y77显示了较强的抑制物耐受性和还原活力。
3、摇瓶发酵筛选
将菌株Y66、Y77和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度30℃，250mL的三角瓶装液量50mL，培养时间12h。然后再以发酵培养基好氧发酵，接种量1％(v/v)，发酵温度30℃，500mL三角瓶装液量100mL，发酵时间240h后检测各菌株的2-苯乙醇产量如表1所示：
表1筛选培养基中Y66、Y77和原始菌发酵结果
经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中2-苯乙醇产量均明显高于出发菌株，其中Y66具有最高的产量。这与组合平板筛选的结果一致。
实施例3：本实施例说明突变株Y66和Y77的传代稳定性。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株Y66和Y77的传代稳定性。菌株Y66和Y77传代发酵试验结果如表2所示：
表2菌株Y66和Y77传代发酵试验结果
从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的2-苯乙醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4：本实施例说明突变株Y66、Y77和原始菌株的2-苯乙醇耐受性。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，分别加入不同浓度的2-苯乙醇，检测突变株Y66、Y77和原始菌株的2-苯乙醇耐受性。菌株Y66、Y77和原始菌株耐受性发酵试验结果如表3所示：
表3菌株Y66、Y77和原始菌的耐受性实验
从实验结果可知，经过抑制物2-苯乙醇的浓度梯度试验，两株突变株的2-苯乙醇耐受性很高，是同等条件下的原始菌的耐受性的4倍，可作为进一步研究和开发的生产菌株。由于Y66不管是产量还是耐受性上都要比Y77要更好，更稳定一些，所以我们选择Y66作为进一步的研究的菌株。
实施例5：本实施例说明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66发酵生产2-苯乙醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH6。
种子培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖4％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB10.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O 0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O 0.05％，KH2PO4 0.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O0.0015％)，其余为水。
发酵培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖4％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB1 0.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O0.0015％)，其余为水。
将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66接种至平板培养基好氧培养，培养温度30℃，培养时间12h。将平板培养的Y66接种到种子培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，培养温度30℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量1％(v/v)，发酵温度28℃～30℃，500mL三角瓶装液量100mL，好氧发酵培养240h后，检测2-苯乙醇产量达到了1.9g/L，比同等条件培养的出发菌株提高了26.7％。
实施例6：本实施例说明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66发酵生产2-苯乙醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH 6。
种子培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖4％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB1 0.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O 0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O 0.0015％)，其余为水。
发酵培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖10％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB1 0.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O 0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O 0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O 0.0015％)，其余为水。
将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66接种至平板培养基培养，培养温度30℃，培养时间12h。将平板培养的Y66接种到种子培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，培养温度30℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量1％(v/v)，发酵温度30℃，500mL三角瓶装液量100mL，好氧发酵培养240h后，检测2-苯乙醇产量达到了2.8g/L，是同等条件培养的出发菌株的1.9倍。
实施例7：本实施例说明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66发酵生产2-苯乙醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH 6。
种子培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸0.5％)，碳源(葡萄糖4％)，氮源(YNB 0.05％)，生长因子(VB10.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O 0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O 0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O0.0015％)，其余为水。
发酵培养基：尿嘧啶0.01％，底物(L-苯丙氨酸1％)，碳源(葡萄糖10％)，氮源(YNB0.05％)，生长因子(VB10.0002％)，无机盐(FeCl2.4H2O 0.00015％，NaCl0.1％，MgCl2.6H2O0.05％，KH2PO40.02％，KCl0.03％，CaCl2.2H2O 0.0015％)，其余为水。
将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66接种至平板培养基培养，培养温度30℃，培养时间12h。将平板培养的Y66接种到种子培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，培养温度30℃，培养时间12h；将种子接种到培养基中，500mL三角瓶装液量100mL，接种量1％(v/v)，发酵温度30℃，好氧发酵培养240h后，检测2-苯乙醇产量达到了3.2g/L，是同等条件培养的出发菌株的2.13倍。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株高抗逆性解脂耶氏酵母及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1619
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 1
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actccgtcgt gctggggata gagcattgca attattgctc ttcaacgagg aattcctagt 1440
aagcgcaagt catcagcttg cgttgattac gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg 1500
ctactaccga ttgaatggtt tagtgagacc ttgggagggc gagatgaggg gggcaacccc 1560
ttttgaacat ccaaacttgg tcaaacttga ttattagagg aagaaaagtc tacattccc 1619
Claims (6)
1.一株高抗逆性解脂耶氏酵母，其分类命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y66，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2017753，保藏日期为2017年11月30日。
2.权利要求1所述的高抗逆性解脂耶氏酵母在生产2-苯乙醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体应用步骤如下：
1)平板培养：将解脂耶氏酵母CCTCC NO：M 2017753接种至平板培养基培养，培养温度28℃～30℃，培养时间12～24h；
2)种子培养：将平板培养的解脂耶氏酵母CCTCC NO：M 2017753接种到种子培养基中，好氧培养，培养温度28℃～30℃，培养时间12～24h；
3)发酵产2-苯乙醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量1～2％v/v，好氧发酵，发酵温度28℃～30℃，发酵培养时间为200～300h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源1％～2％、氮源1％～3％、琼脂1.5％～2％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源4％、氮源0.05％、无机盐0.1％～0.25％、生长因子0.0001％～0.1％、尿嘧啶0.01％、L-苯丙氨酸0.5％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；所述的氮源为无氨基酵母氮源、乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源4～10％、氮源0.05％、无机盐0.1％～0.25％、生长因子0.0001％～0.1％、尿嘧啶0.01％、L-苯丙氨酸0.5～1％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、甘油、乙酸中的一种或多种；所述的氮源为无氨基酵母氮源、乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、镍盐、铜盐、锌盐、锰盐、钴盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
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