CN105349564B - 一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法 - Google Patents

一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法 Download PDF

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本发明公开了一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法，采用重组DNA技术将唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476的胆盐水解酶基因克隆连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148，并转化至Lactococcus lactis NZ9000，经筛选鉴定得到具有胆盐水解酶活性的重组乳酸乳球菌。该菌株胆汁耐受能力比野生菌提高了近5倍。采用本发明方法构建出的具有胆盐水解酶活性的乳酸乳球菌可作为具有降低血清胆固醇功能的益生菌制剂的模式菌株，应用于医药、食品领域。

Description

一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法
技术领域
本发明涉及一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
乳酸菌(LAB)作为益生菌，在工业、农业和医学等领域与人类生活密切相关，是一类在食品中应用最广泛的重要的工业菌株，能够作为活的载体在食品或体内传递感兴趣的蛋白。其中，LAB的模式菌株Lactococcus lactis及常用的nisin控制的食品级诱导表达系统NICE(nisin controlled gene expression system)为LAB在食品、医药工程及其改良方面的应用提供了可能。
然而，乳酸菌为了有效发挥益生功能，必须耐受来自宿主胃肠道环境的各种生理化学屏障以提高其肠道定植能力。其中，胆汁胁迫是乳酸菌面临的重要挑战之一。结合胆盐是胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合并以钠盐或钾盐形式存在的一类重要的胆汁组分，其在脂肪的乳化和增溶中发挥着必不可少的作用；同时，结合胆盐的双亲性使其具有扰乱细胞膜脂质双分子层的特性，从而干扰细胞稳态而呈现出抗菌性。
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，能够水解肠道内的结合态胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸。其功能体现在两个方面：一、对人类宿主的作用。由于经BSH作用后产生的游离胆汁酸会与肠道中的钠盐/钾盐形成去结合型胆盐，该去结合型胆盐比水解前的结合态胆盐重吸收效率降低，从而会随粪便排出，而胆固醇的主要去路是转变成结合胆盐，因此通过BSH的水解作用可以使胆固醇不断向合成结合胆盐的方向进行以保证肠道内结合胆盐与脂质物质的平衡，从而消耗体内更多的胆固醇，达到降低血清胆固醇的目的。二、对微生物的作用。BSH是肠道微生物为了抵抗胆盐得以生存而产生的一种代谢产物；经BSH作用形成的氨基酸既可以作为营养物质被菌体利用，又能够解除结合胆盐的毒害作用，提高益生菌的胆汁耐受能力及肠道定植能力。
因此，运用基因工程手段获得携有BSH活性的乳酸菌菌株可以为研究BSH作用于菌体自身和宿主提供技术平台，也为应用口服活菌细胞疗法控制人体血清胆固醇水平提供了一种有效提高菌体细胞胆汁耐受和肠道定植能力的技术方法。
发明内容
本发明提供了两株胆汁耐受能力提高了的乳酸乳球菌，是将含有编码胆盐水解酶的基因导入乳酸菌得到的两株基因工程菌。
所述胆盐水解酶基因为bsh1和bsh2；bsh1基因序列如SEQ ID NO.1所示；bsh2基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
所述胆盐水解酶优选bsh1。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种增强乳酸乳球菌胆汁耐受能力的方法，包括如下步骤：
1)设计引物以LMG14476的基因组DNA为模板扩增出bsh1和bsh2基因；
2)将bsh1和bsh2基因分别连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148，得到重组载体；pNZ8148-bsh1和pNZ8148-bsh2
3)重组载体转化至Lactococcus lactis NZ9000。
所述引物根据NCBI网站报道的Lactobacillus salivarius LMG14476中胆盐水解酶BSH1和BSH2的基因序列设计，引物序列如下：
bsh1-F(SEQ ID NO.3)：
5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3’
bsh1-R(SEQ ID NO.4)：
5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTT-3’
bsh2-F(SEQ ID NO.5)：
5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3’
bsh2-R(SEQ ID NO.6)：
5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3’
参照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书配制PCR反应体系；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，45℃退火60s，68℃延伸1min，5个循环；95℃变性30s，55℃退火60s，68℃延伸1min，25个循环；68℃延伸10min。
利用同源重组酶Exnase II将胶回收纯化后的PCR产物连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148，得到重组载体pNZ8148-bsh1和pNZ8148-bsh2，分别转化至Lactococcus lactisNZ9000，经筛选鉴定获得重组菌Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148-bsh1和Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148-bsh2。
胆盐水解酶酶活测定方法：收集菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为5。取1mL上述细胞悬浊液，超声破碎7min(工作时间:间歇时间＝2:4)，离心收集上清液。取10μL上清液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
菌体细胞胆汁耐受性的测定方法：诱导4h的菌体细胞(菌体OD600nm值约为2.0)按4％(w/v)接种量转接至含有0.1％(w/v)猪胆盐和5ng/mL(w/v)的GM17培养基中，于30℃静置培养，间隔一定时间测定菌体浓度(OD600nm值)，制作生长曲线。
本发明的有益效果是具有BSH1和BSH2活性的基因工程菌比野生菌的胆汁耐受能力分别提高了近5和4倍，为开发具有较高胆汁耐受能力的益生菌制剂奠定了基础。
附图说明
图1：目的基因的扩增。M：DL 2,000 DNA Marker；泳道1和泳道2：bsh1和bsh2基因的PCR扩增条带。
图2：蛋白电泳(SDS-PAGE)实验结果。M：蛋白质分子量标准；1：含有pNZ8148的L.lactis NZ9000野生菌株细胞提取液；2：经过Nisin诱导后的重组菌的细胞提取液。
图3：重组菌中BSH对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)和牛磺脱氧胆酸钠(TDCA)的活性检测。
图4：重组菌与野生菌株胆汁耐受能力的比较。
具体实施方式
实施例1重组菌的构建及鉴定
1)从唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476提取基因组DNA作模板，进行PCR扩增，引物为：
bsh1-F：
5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3’
bsh1-R：
5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTT-3’
bsh2-F：
5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3’
bsh2-R：
5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3’
参照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书配制PCR反应体系；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，45℃退火60s，68℃延伸1min，5个循环；95℃变性30s，55℃退火60s，68℃延伸1min，25个循环；68℃延伸10min。
2)以1％琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到与文献报道大小相符的bsh基因片段(图1泳道1、泳道2)。
3)利用同源重组酶Exnase II将胶回收纯化后的PCR产物连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148，得到重组载体pNZ8148-bsh1和pNZ8148-bsh2，连接液分别电转化至Lactococcus lactisNZ9000感受态细胞，转化菌液涂布于在含有氯霉素(10μg/mL)的GM17平板上，30℃静置培养，得到能在含有氯霉素(10μg/mL)的GM17平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148-bsh1和Lactococcus lactisNZ9000-pNZ8148-bsh2。
乳酸乳球菌感受态细胞的电转化为：将超低温冰箱保存的乳酸乳球菌感受态细胞(盛装于离心管)置于冰上融化，取2μL DNA与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电转化条件为：电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL GM17培养基(含20mM MgCl2，2mM CaCl2)。然后置于30℃静置培养1.5h，5000rpm离心2min，100-200μL涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养24-36h，挑取转化子验证。
实施例2重组菌中酶蛋白的诱导表达及酶活测定
GM17培养基(1L)：M17合成培养基37.3g，葡萄糖10g；115℃高压灭菌15min，冷却至60℃添加终浓度为10mg/L(w/v)的氯霉素；
培养方法：将30℃静置培养18h的种子以4％的接种量转接，于30℃静置培养；
诱导条件：诱导OD值为0.35，重组菌在30℃诱导4h，Nisin浓度为5ng/mL(w/v)。
以空载体作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为37kDa的蛋白条带(见图2)，同时测定重组菌细胞提取液对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)和牛磺脱氧胆酸钠的水解活性(见图3)。
实施例3重组菌胆汁耐受能力的测定
胁迫培养基(1L)：M17合成培养基37.3g，葡萄糖10g，猪胆盐1g；115℃高压灭菌15min，冷却至60℃添加终浓度为10mg/L(w/v)的氯霉素和5mg/L(w/v)的Nisin；
培养方法：将诱导表达后的菌液(菌体OD值约为2.0)以4％的接种量转接至胁迫培养基中，于30℃静置培养；
以携有空载体的野生菌株作为对照，测定重组菌在含有猪胆盐的胁迫培养中的生长情况(见图4)，表达bsh1的菌株耐受性提高5倍，表达bsh2基因的菌株，耐受性提高4倍。
实施例4BSH1与BSH2共表达重组菌胆汁耐受能力的测定
以唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476提取的基因组DNA作模板，进行PCR扩增，引物为：
bsh12F:5’-ATATGATCTAGAGGAGGCACTCACCATGTGTACATCGATTTTATATACTGCT-3’
bsh12R:5’-GAATTCaagcttTTAATTTTGCATATTAATTGATTGG-3’
PCR反应体系及条件同实施例1。
将胶回收纯化后的PCR产物用Xba I和Hind III双酶切后连接到重组载体pNZ8148-bsh1，得到重组载体pNZ8148-bsh12，转化Lactococcus lactis NZ9000，经筛选鉴定获得重组菌Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148-bsh12。
以携有空载体的野生菌株作为对照，测定重组菌在含有猪胆盐的胁迫培养中的生长情况，共表达bsh1和bsh2的菌株胆汁耐受性提高了3倍。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法，其特征在于，将胆盐水解酶基因在乳酸乳球菌中进行表达；
所述胆盐水解酶基因为bsh1或bsh2，bsh1基因序列如SEQ ID NO.1所示；bsh2基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述胆盐水解酶基因优选bsh1。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于克隆bsh1及bsh2所用的引物序列为：
bsh1-F:5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3’
bsh1-R:5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTT-3’
bsh2-F:5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3’
bsh2-R:5’-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3’。
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Relative gene expression of bile salt hydrolase and surface proteins in two putative indigenous Lactobacillus plantarum strains under in vitro gut conditions;Duary R K 等;《Mol Biol Rep》;20121231;第39卷(第3期);2541-2552
植物乳杆菌胆盐水解酶基因的克隆及其在乳酸乳球菌ML23中的表达;张波;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）》;20120815(第08期);中文摘要,正文第17页第2.6.1节

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