CN110699311A - 一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。为了解决目前缺乏有效的非药物途径限制饮食过程中胆固醇的摄入量，本发明提供了一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。本发明所述的降血脂的重组菌是在乳酸乳球菌感受态细胞中过表达胆盐水解酶基因，所述胆盐水解酶基因为来源于嗜酸乳杆菌NCFM。对本发明所获得的重组菌进行诱导表达试验，通过SDS‑PAGE电泳验证，能够获得重组胆盐水解酶蛋白的成功表达。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。
背景技术
近年来，不合理的膳食结构逐步导致了人们体内胆固醇含量过量堆积，胆固醇过量堆积将导致冠心病、高血脂症、动脉粥样硬化以及其它心血管疾病。流行病研究表明，我国人群中心脑血管病的患病率、发病率呈不断上升趋势，1992年心脑血管病死亡率占世界人口死亡总数的25％，居各种死因之首。1996年为29％，1999年已达33％。目前，我国这一比例已高达40％，全国每年心脑血管及相关疾病死亡的人数已达200万人，可以说心脑血管病已成为人类第一杀手，而高血脂正是诱发心脑血管病的重要因素之一。对高胆固醇的人来说，降低胆固醇水平意味着减少心脏疾病发生的风险。
人体内血清胆固醇的70％为内源合成，其余30％为膳食胆固醇。目前研究认为人体内胆固醇的合成速度受膳食胆固醇的影响很大。因此，人们尤其希望通过非药物途径限制饮食过程中胆固醇的含量。国内外大量临床实验证实，服用乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效。体外研究发现，乳酸菌产生的胆盐水解酶可以使结合胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸与胆固醇形成复合物共同沉淀下来，从而导致环境中胆固醇含量的降低。随着基因工程技术的迅猛发展和食品级乳酸菌研究的深入，利用食品级乳酸乳球菌表达胆盐水解酶来降血脂有良好的前景。
发明内容
为了解决目前缺乏有效的非药物途径限制饮食过程中胆固醇的摄入量，本发明提供了一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。
本发明所述重组菌过表达胆盐水解酶基因，宿主菌为乳酸乳球菌。
优选的，所述胆盐水解酶基因为来源于嗜酸乳杆菌NCFM，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的过表达胆盐水解酶的重组菌的构建方法，步骤如下：
(1)根据胆盐水解酶基因序列设计引物对；
(2)对嗜酸乳杆菌NCFM进行基因组DNA的提取；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，步骤(1)所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(4)将步骤(3)获得的PCR产物与克隆载体进行连接，筛选获得含有胆盐水解酶基因的克隆载体；
(5)使用限制性内切酶对步骤(4)的克隆载体进行酶切，获得含有胆盐水解酶基因的DNA酶切片段，然后与经具有相同酶切位点的限制性内切酶双酶切的表达载体pNZ8148进行连接，获得含有胆盐水解酶基因的表达载体；
(6)将步骤(5)获得的含有胆盐水解酶基因的表达载体转化入乳酸乳球菌感受态细胞中，获得含有携带胆盐水解酶基因的乳酸乳球菌。
优选的，步骤(4)所述的克隆载体是pSIMPLE19 EcoRV/BAP。
优选的，步骤(5)所述的限制性内切酶是NcoI和HindIII。
优选的，步骤(6)所述的乳酸乳球菌感受态细胞是乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000。
优选的，步骤(7)所述的转化是电转化法。
优选的，步骤(8)所述的培养是在GM17培养基中，30℃条件下培养20-26小时。
本发明所述的过表达胆盐水解酶的重组菌在制备降血脂的保健品或药品中的的应用。
有益效果
对本发明所获得的重组菌进行诱导表达试验，通过SDS-PAGE电泳验证，能够获得重组胆盐水解酶蛋白的成功表达。
附图说明
图1是重组质粒的PCR鉴定电泳图，其中M表示DNA Marker，从上到下为2000，1000，750，500，250，100bp，泳道1是pNZ8148-BSHA的PCR结果，目的带大小为970bp，泳道2是pNZ8148-BSHA的PCR结果，目的带大小为970bp；
图2是过表达胆盐水解酶基因的乳酸乳球菌NCFM的SDS-PAGE电泳鉴定图，其中M为蛋白质Marker，泳道1是实施例1中过表达BSHA的乳酸乳球菌诱导后产生的重组菌胞内蛋白，泳道2是实施例2中过表达BSHB的乳酸乳球菌诱导后产生的重组菌胞内蛋白，3是未诱导的重组菌胞内蛋白，胞内蛋白SDS-PAGE显示，经诱导的重组菌胞内蛋白有出现一条约35.3KD大小的蛋白条带(第1,2泳道)，与预期的目的蛋白位置一致，而未经诱导的重组菌胞内蛋白经SDS-PAGE没有出现约35.3KD大小的条带(第3泳道)。
具体实施方式
实施例1.过表达胆盐水解酶BSHA的重组菌及其构建方法。
(1)根据GenBank上所提交的嗜酸乳杆菌NCFM的胆盐水解酶(BSHA)基因序列，所述序列如SEQ ID NO.1所示，设计一对扩增BSHA的引物，引物名称为BSHA-F的引物序列如SEQID NO.3所示，BSHA-R的引物序列如SEQ ID NO.4所示，引物由北京英俊生物技术有限公司合成；
(2)采用DNA提取试剂盒的方法对嗜酸乳杆菌NCFM进行基因组DNA的提取，所用嗜酸乳杆菌NCFM来自于丹麦丹尼斯克(Danisco)公司，；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，步骤(1)所述引物对，通过PCR技术采用高保真DNA聚合酶进行扩增BSHA目的基因，
扩增体系如下：
表1.PCR扩增体系
| PCR反应缓冲液buffer | 5.0μL |
| dNTP Mixture | 4.0μL |
| 上游引物 | 0.5μL |
| 下游引物 | 0.5μL |
| 基因组DNA | 2.0μL |
| Pyrobest DNA Polymerase | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 加至50.0μL |
PCR反应条件为95℃下预变性1min，95℃下变性15s，55℃下退火15s，72℃下延伸30s，共循环35次，72℃7min。
(4)将步骤(3)获得的目的基因与克隆载体pSIMPLE19 EcoRV/BAP一起连接转化大肠杆菌DH5α中，培养后筛选鉴定获得重组质粒pS19-BSHA，所述筛选鉴定是将待鉴定质粒送到上海生物工程技术服务有限公司进行双向测序，获得序列正确的重组质粒pS19-BSHA；
(5)将pS19-BSHA和表达载体pNZ8148分别经NcoI和HindIII双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pNZ8148-BSHA；
酶切体系如下表：
表2.双酶切体系
| 10×Buffer | 2.0μL |
| NcoI | 1.0μL |
| HindIII | 1.0μL |
| 重组质粒pS19-BSHA或pNZ8148 | 7.0μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 加至20.0μL |
(6)将pNZ8148-BSHA经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，培养后筛选鉴定得到含有重组质粒的乳酸乳球菌，针对重组质粒pNZ8148-BSHA序列信息设计引物，pNZ8148-BSH-F序列信息如SEQ ID NO.7所示，pNZ8148-BSH-R序列信息如SEQ ID NO.8所示，,以待鉴定质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系及条件如下表，获得970bp大小的条带，结果如图1中1所示；
表3.PCR扩增体系
| PCR反应缓冲液buffer | 10.0μL |
| dNTP Mixture | 4.0μL |
| 上游引物 | 0.5μL |
| 下游引物 | 0.5μL |
| 提取质粒 | 0.5μL |
| Primer STAR<sup>TM</sup> HS DNA Polymerase | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 加至50.0μL |
PCR反应条件为98℃下预变性1min，98℃下变性10s，68℃下退火1min，72℃下延伸2min，共循环35次。
(7)将步骤(6)获得的含有重组质粒的乳酸乳球菌接种于GM17培养基中(GM17液体培养基由4.225％肉汤和0.5％葡萄糖组成)，30℃，静置培养24小时。
(8)使用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，完成胆盐水解酶的诱导表达。
诱导终止后，经溶菌酶处理提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE(蛋白质电泳)，结果如图2中，泳道1是过表达BSHB的乳酸乳球菌诱导后产生的重组菌胞内蛋白，3是未诱导的重组菌胞内蛋白，胞内蛋白SDS-PAGE显示，经诱导的重组菌胞内蛋白有出现一条约35.3KD大小的蛋白条带，与预期的目的蛋白位置一致，而未经诱导的重组菌胞内蛋白经SDS-PAGE没有出现约35.3KD大小的条带，由此可见，胆盐水解酶基因在乳酸乳球菌NZ9000中表达成功。
实施例2.过表达胆盐水解酶BSHB的重组菌及其构建方法。
步骤(1)根据GenBank上所提交的嗜酸乳杆菌NCFM的胆盐水解酶(BSHB)基因序列，所述序列如SEQ ID NO.2所示，设计一对扩增BSHB的引物，引物名称为BSHB-F的引物序列如SEQ ID NO.5所示，BSHA-R的引物序列如SEQ ID NO.6所示，引物由北京英俊生物技术有限公司合成；
(2)采用DNA提取试剂盒的方法对嗜酸乳杆菌NCFM进行基因组DNA的提取，所用嗜酸乳杆菌NCFM来自于丹麦丹尼斯克(Danisco)公司，；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，步骤(1)所述引物对，通过PCR技术采用高保真DNA聚合酶进行扩增BSHB目的基因，PCR扩增体系及条件与实施例1相同。
(4)将步骤(3)获得的目的基因与克隆载体pSIMPLE19 EcoRV/BAP一起连接转化大肠杆菌DH5α中，培养后筛选鉴定获得重组质粒pS19-BSHB；
(5)将pS19-BSHB和表达载体pNZ8148分别经NcoI和HindIII双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pNZ8148-BSHB，酶切体系及反应条件与实施例1相同；
(6)将pNZ8148-BSHB经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，培养后筛选鉴定得到含有重组质粒的乳酸乳球菌，利用实施1步骤(6)中所用的引物，pNZ8148-BSH-F和pNZ8148-BSH-R，以待鉴定质粒为模板进行PCR扩增，获得970bp大小的条带，结果如图1中2所示；
(7)将步骤(6)获得的含有重组质粒的乳酸乳球菌接种于GM17培养基中(GM17液体培养基由4.225％肉汤和0.5％葡萄糖组成)，30℃，静置培养26小时。
(8)使用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，完成胆盐水解酶的诱导表达。
诱导终止后，经溶菌酶处理提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE(蛋白质电泳)，结果如图2中，泳道2是过表达BSHB的乳酸乳球菌诱导后产生的重组菌胞内蛋白，3是未诱导的重组菌胞内蛋白，胞内蛋白SDS-PAGE显示，经诱导的重组菌胞内蛋白有出现一条约35.3KD大小的蛋白条带，与预期的目的蛋白位置一致，而未经诱导的重组菌胞内蛋白经SDS-PAGE没有出现约35.3KD大小的条带，由此可见，胆盐水解酶基因在乳酸乳球菌NZ9000中表达成功。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 989
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌NCFM的胆盐水解酶BSHA基因序列
<400> 1
aagagaaaaa tatgtgtaca tcaattatat tcagtcccaa agatcattac tttggtcgta 60
accttgattt agaaattact tttggtcaac aagttgttat tacgccacgc aattacactt 120
ttaaattccg taagatgccc agtttaaaaa agcactatgc aatgattggt atctcattag 180
atatggatga ttatccccta tatttcgacg ctacaaatga aaaaggttta ggtatggccg 240
gactcaacta tccaggaaat gctacatatt atgaagaaaa agaaaataaa gataatattg 300
cttcctttga attcatccct tggattttag gacagtgtag cactattagc gaagtaaagg 360
atttacttag cagaatcaac atcgccgatt taaatttcag cgaaaaaatg caagcctcct 420
ctcttcactg gcttattgca gataaaacag gtacatcatt agttgttgaa acagacaaag 480
atggaatgca tatttatgat aatccagttg gctgcttaac taataatcca caatttccaa 540
agcaattatt caatttaaat aactatgctg acgtatctcc aaaaatgcct aaaaataact 600
tctcagataa agtaaatatg gctggctaca gccgtggatt agggtctcac aacttaccag 660
gtggaatgga ttctgaatca cgttttgtca gagtagcttt caataaattt aatgctccaa 720
ttgctgaaac cgaagaagaa aatattgata cttacttcca cattttacat tcggttgaac 780
aacaaaaggg actggatgaa gttggtccaa actcatttga atatacaatt tattctgatg 840
gaactaactt agacaaaggt attttctact acaccactta ttcaaacaaa caaattaacg 900
ttgttgatat gaataaagaa gatctagata gcagcaattt gatcacttat gatatgcttg 960
ataaaactaa atttaaccat caaaactaa 989
<210> 2
<211> 994
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌NCFM的胆盐水解酶BSHB基因序列
<400> 2
agaaagcgtg cagtaaatgt gtacatcaat ttgttataat cctaacgatc attattttgg 60
tagaaatctt gactatgaaa ttgcttatgg tcaaaaagta gtcattgtac caagaaacta 120
cgaatttaag tatagagaaa tgccctctca aaagatgcat tatgctttta tcggagtatc 180
tgtagttaat gatgattatc cattattatg tgatgcaatt aatgaaaagg ggcttggtat 240
tgcaggatta aattttcaag gtcctaatca ttactttcct aaaatcgaag gtaagaagaa 300
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tacattggtt cctaatgttg atcttaatct atatagtaga ggcttaggta ctcaccactt 660
acctggtgga atggattcta gctctcgatt tgttaaggta gcttttgtct tggcacacac 720
tccacaagga aaaaatgaag tggaaaatgt tactaattat ttccatattc tgcattcagt 780
agaacaacct gatggtttag atgaagtaga agataatcgc tatgaatata ctatgtatac 840
agattgtatg aacttagata aaggtatttt gtactttact acttatgaca ataatcggat 900
taatgcagta gatatgcata aagcagattt agattcagaa gatttaatct gctacgattt 960
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<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> BSHA-F
<400> 3
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<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> BSHA-R
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<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> BSHB-F
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<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> BSHA-R
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<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> pNZ8148-BSH-F
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<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> pNZ8148-BSH-R
<400> 8
tcaagggctt ttacgctacg a 21
Claims (9)
1.一种过表达胆盐水解酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达胆盐水解酶基因，宿主菌为乳酸乳球菌。
2.根据权利要求1所述的过表达胆盐水解酶的重组菌，其特征在于，所述胆盐水解酶基因为来源于嗜酸乳杆菌NCFM，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1所述的过表达胆盐水解酶的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)根据胆盐水解酶基因序列设计引物对；
(2)对嗜酸乳杆菌NCFM进行基因组DNA的提取；
(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，步骤(1)所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(4)将步骤(3)获得的PCR产物与克隆载体进行连接，筛选获得含有胆盐水解酶基因的克隆载体；
(5)使用限制性内切酶对步骤(4)的克隆载体进行酶切，获得含有胆盐水解酶基因的DNA酶切片段，然后与经具有相同酶切位点的限制性内切酶双酶切的表达载体pNZ8148进行连接，获得含有胆盐水解酶基因的表达载体；
(6)将步骤(5)获得的含有胆盐水解酶基因的表达载体转化入乳酸乳球菌感受态细胞中，获得含有携带胆盐水解酶基因的乳酸乳球菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述的克隆载体是pSIMPLE19EcoRV/BAP。
5.根据权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的限制性内切酶是NcoI和HindIII。
6.根据权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(6)所述的乳酸乳球菌感受态细胞是乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000。
7.根据权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(7)所述的转化是电转化法。
8.根据权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(8)所述的培养是在GM17培养基中，30℃条件下培养20-26小时。
9.权利要求1所述的重组菌在制备降血脂的保健品或药品中的的应用。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN105349564A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-02-24 | 江南大学 | 一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法 |
| US20190010506A1 (en) * | 2016-01-11 | 2019-01-10 | Synlogic, Inc. | Bacteria engineered to treat metabolic diseases |
-
2019
- 2019-11-06 CN CN201911076204.2A patent/CN110699311A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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