CN111057710A - 一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法、重组乳酸菌及其用途 - Google Patents
一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法、重组乳酸菌及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，本发明方法在乳酸菌中分别过表达与菌株胁迫耐受性(酸、乙醇和高温)有关的基因，提高了乳酸菌对乳酸、醋酸、极端pH、乙醇、高温条件的耐受能力，所述构建方法是在乳酸菌中过表达编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc或者编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL。该方法提高了乳酸菌的胁迫耐受性，为提高菌株的工业应用属性和发酵生产能力提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于基因工程以及微生物工程技术领域，尤其是一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法、重组乳酸菌及其用途。
背景技术
乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲料、化学品等工业领域中。乳酸菌在工业生产以及作为益生菌应用的过程中不可避免地面临着多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、高温胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌的生长性能和发酵活力。因此，提供一种提高乳酸菌胁迫耐受性的方法尤为重要。
在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸、乙醇和高温胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。酸胁迫一方面是由乳酸菌代谢产物乳酸等酸性物质造成的，随着菌体的生长，酸性物质不断产生、积累。另一方面，乳酸菌在应用过程中还常常面临醋酸或极端pH的胁迫作用。这些酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的酸性物质迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌的发酵活力和生产效率。
乙醇属有机溶剂，其主要积累于细胞膜上。乙醇能渗入细胞膜改变它们的结构和功能。因此，过高的乙醇浓度不仅抑制菌体的生长，还会影响其生理代谢活性等，甚至导致菌体死亡。
高温对菌体的毒害主要体现在以下三个方面：导致菌体内酶和蛋白的变性失活；导致菌体细胞膜失去稳定性，使核酸和脂类受到胁迫；导致菌体内产生自由基和过氧化物，影响生物分子的正常功能，甚至导致菌体死亡。
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发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境胁迫问题的不足之处，提供一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法、重组乳酸菌及其用途，该方法提高了乳酸菌的胁迫耐受性，为提高菌株的工业应用属性和发酵生产能力提供新思路。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，所述构建方法是在乳酸菌中过表达编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc或者编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL。
而且，所述编码酰基载体蛋白的基因acpP的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc的核苷酸序列为SEQ ID No.2，所述编码天冬酰胺酶的基因asn的核苷酸序列为SEQ ID No.3，所述编码ATP合酶的基因atpC的核苷酸序列为SEQ ID No.4，所述编码冷激蛋白的基因csp的核苷酸序列为SEQ ID No.5，所述编码锰离子催化酶的基因mnc的核苷酸序列为SEQ ID No.6，所述编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的核苷酸序列为SEQ ID No.7。
而且，所述乳酸菌为乳酸片球菌或乳酸乳球菌。
而且，具体步骤如下：
以P.acidilactici CGMCC No.17856的基因组为模板，分别以SEQ ID No.8至SEQID No.14所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7的acpP、acc、asn、atpC、csp、mnc、ftsL基因，然后将如以上核苷酸序列所示的基因片段与表达载体pNZ8148或pMG36e载体通过限制性内切酶进行酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到了分别含有编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc、编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的重组质粒；
再将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactisNZ9000中，得到耐受性提高的重组乳酸菌，即为胁迫耐受性增强的乳酸菌。
而且，所述将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactis NZ9000的具体步骤如下：
乳酸菌活化后进行扩大培养，当生长OD600值在0.4～1.2时收集经扩大培养所得的菌体，用电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用终浓度为1000～3000U/mL的溶菌酶处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，得感受态细胞；
向制备得到的感受态细胞中加入验证正确的重组质粒，轻轻吹吸混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms，电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h；氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn、P.a-atpC、P.a-csp、P.a-mnc、P.a-ftsL重组乳酸片球菌菌株，即为重组乳酸菌。
而且，所述电击缓冲液A的配方为：质量浓度10％甘油，蔗糖150～200g/L，K2HPO420～40g/L，KH2PO4 1～3g/L和MgCl2 0.1～0.3g/L，溶剂为水；
电击缓冲液B的配方为：质量浓度10％甘油，0.4～0.6mol/L蔗糖，溶剂为水；
如上所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在提高乳酸菌胁迫抗性方面中的应用。
如上所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
利用如权利要求1至6任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法制备得到的胁迫抗性提高的乳酸菌。
如上所述的胁迫抗性提高的乳酸菌在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法在乳酸菌中分别过表达与菌株胁迫耐受性(酸、乙醇和高温)有关的基因，主要包括编码酰基载体蛋白的基因acpP，编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc，编码天冬酰胺酶的基因asn，编码ATP合酶的基因atpC，编码冷激蛋白的基因csp，编码锰离子催化酶的基因mnc，编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL，提高乳酸菌对乳酸、醋酸、极端pH、乙醇、高温条件的耐受能力，在乳酸、醋酸、极端pH、乙醇、高温胁迫下表现出更好的胁迫耐受性，该方法提高了乳酸菌的胁迫耐受性，为提高菌株的工业应用属性和发酵生产能力提供新思路。
2、本发明方法首次发现在乳酸菌中过量表达编码酰基载体蛋白的基因acpP，编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc，编码天冬酰胺酶的基因asn，编码ATP合酶的基因atpC，编码冷激蛋白的基因csp，编码锰离子催化酶的基因mnc，编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL可显著提高乳酸菌的胁迫耐受性。
通过采用在乳酸菌中过量表达acpP、acc、asn、atpC、csp、mnc和ftsL基因，得到了胁迫耐受性增强的重组乳酸菌P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn、P.a-atpC、P.a-csp、P.a-mnc、P.a-ftsL、La-acpP、La-acc、La-asn、La-csp、La-mnc、La-ftsL。
3、本发明获得的耐受基因重组乳酸菌对乳酸、醋酸、极端pH、高浓度乙醇和高温的耐受能力明显提高。
利用本发明得到的重组乳酸菌在乳酸、醋酸、极端pH、乙醇和高温胁迫条件下耐受性显著提高。其中，acpP重组乳酸片球菌经3％(v/v)乳酸冲击180min后，活菌数比对照菌株提高三个数量级。acc重组乳酸片球菌经5％(v/v)醋酸冲击180min后，活菌数保持在103数量级，而对照菌株无存活。asn重组乳酸片球菌在pH 3.0培养6h后活菌数比对照菌株提高了3.72倍。19％(v/v)乙醇或65℃冲击30min后，acc重组乳酸片球菌和csp重组乳酸片球菌的活菌数与对照菌株的活菌数相比相对倍数为13.3倍和16.7倍。
4、利用本发明方法得到的重组乳酸菌在构建时具有成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的优势，为大规模工业化生产提供了优良菌株。
附图说明
图1为本发明中重组质粒的PCR验证电泳图；
其中，M-DL5000；1-重组质粒pNZ8148-acpP、pNZ8148-acc、pNZ8148-asn、pNZ8148-atpC、pNZ8148-csp、pNZ8148-mnc、pNZ8148-ftsL；
图2为本发明中重组质粒的单酶切验证电泳图；
其中，M-DL5000；1-pNZ8148线性化载体；2-重组质粒pNZ8148-acpP、pNZ8148-acc、pNZ8148-asn、pNZ8148-atpC、pNZ8148-csp、pNZ8148-mnc、pNZ8148-ftsL
图3为本发明中3％(v/v)乳酸下冲击180min后重组乳酸片球菌活菌数和对照菌株活菌数；
图4为本发明中5％(v/v)醋酸下冲击180min后重组乳酸片球菌活菌数和对照菌株活菌数；
图5为本发明中19％(v/v)乙醇下冲击30min后重组乳酸片球菌活菌数比对照菌株活菌数提高倍数图；
图6为本发明中65℃下冲击30min后重组乳酸片球菌活菌数比对照菌株活菌数的提高倍数图；
图7为本发明中2％(v/v)乳酸下冲击20min后重组乳酸乳球菌活菌数和对照菌株活菌数；
图8为本发明中pH 2.5(盐酸调节)冲击20min后重组乳酸乳球菌活菌数比对照菌株活菌数提高倍数图；
图9为本发明中19％(v/v)乙醇下冲击30min后重组乳酸乳球菌活菌数比对照菌株活菌数提高倍数图；
图10为本发明中65℃下冲击30min后重组乳酸乳球菌活菌数比对照菌株活菌数提高倍数图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，所述构建方法是在乳酸菌中过表达编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc或者编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL。
较优地，所述编码酰基载体蛋白的基因acpP的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc的核苷酸序列为SEQ ID No.2，所述编码天冬酰胺酶的基因asn的核苷酸序列为SEQ ID No.3，所述编码ATP合酶的基因atpC的核苷酸序列为SEQ IDNo.4，所述编码冷激蛋白的基因csp的核苷酸序列为SEQ ID No.5，所述编码锰离子催化酶的基因mnc的核苷酸序列为SEQ ID No.6，所述编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的核苷酸序列为SEQ ID No.7。
较优地，所述乳酸菌为乳酸片球菌或乳酸乳球菌。
较优地，具体步骤如下：
以P.acidilactici CGMCC No.17856的基因组为模板，分别以SEQ ID No.8至SEQID No.14所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7的acpP、acc、asn、atpC、csp、mnc、ftsL基因，然后将如以上核苷酸序列所示的基因片段与表达载体pNZ8148或pMG36e载体通过限制性内切酶进行酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到了分别含有编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc、编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的重组质粒；
再将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactisNZ9000中，得到耐受性提高的重组乳酸菌，即为胁迫耐受性增强的乳酸菌。
较优地，所述将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactis NZ9000的具体步骤如下：
乳酸菌活化后进行扩大培养，当生长OD600值在0.4～1.2时收集经扩大培养所得的菌体，用电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用终浓度为1000～3000U/mL的溶菌酶处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，得感受态细胞；
向制备得到的感受态细胞中加入验证正确的重组质粒，轻轻吹吸混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms，电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h；氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn、P.a-atpC、P.a-csp、P.a-mnc、P.a-ftsL重组乳酸片球菌菌株，即为重组乳酸菌。
较优地，所述电击缓冲液A的配方为：质量浓度10％甘油，蔗糖150～200g/L，K2HPO420～40g/L，KH2PO4 1～3g/L和MgCl2 0.1～0.3g/L，溶剂为水；
电击缓冲液B的配方为：质量浓度10％甘油，0.4～0.6mol/L蔗糖，溶剂为水；
如上所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在提高乳酸菌胁迫抗性方面中的应用。
如上所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
利用如权利要求1至6任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法制备得到的胁迫抗性提高的乳酸菌。
如上所述的胁迫抗性提高的乳酸菌在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
更为具体地，本发明方法的相关制备如下：
一、重组质粒的构建
(1)使用G+细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取基因组DNA，以提取的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为模板，分别扩增得到SEQ ID No.1所示的基因acpP、EQ ID No.2所示的基因acc、SEQ ID No.3所示的基因asn、SEQ ID No.4所示的基因atpC、SEQ ID No.5所示的基因csp、SEQ ID No.6所示的基因mnc、SEQ ID No.7所示基因ftsL。该步骤中所使用的引物见表1。
表1引物序列及序列表对应编码
注：下划线序列为与线性化质粒两端互补序列，其余序列为与目的基因互补序列。
(2)线性化载体片段的获得及连接反应
以载体pNZ8148或pMG36e为模板，利用反向PCR进行扩增，得到线性化的载体。将成功线性化的载体与制备好的目的片段(SEQ ID No.1所示的基因acpP、SEQ ID No.2所示的基因acc、SEQ ID No.3所示的基因asn、SEQ ID No.4所示的基因atpC、SEQ ID No.5所示的基因csp、SEQ ID No.6所示的基因mnc、SEQ ID No.7所示基因ftsL)进行连接反应，将连接产物分别化转到大肠杆菌DH5α中，收菌、提取质粒后进行质粒PCR及单酶切验证，并将质粒PCR产物和单酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，进行PCR和双酶切验证。如图1所示，质粒PCR出现条带与对应基因的理论大小相符合。如图2所示，质粒单酶切后出现的条带大小比载体pNZ8148(3167bp)的大小要大，这部分大出的条带大小与目的基因的理论大小相符。将验证成功的重组质粒均送到金唯智生物科技有限公司进一步测序验证，其中，重组质粒pNZ8148-acpP没有合适的酶切位点，直接送去测序。选择测序结果正确的重组质粒pNZ8148-acpP、pNZ8148-acc、pNZ8148-asn、pNZ8148-atpC、pNZ8148-csp、pNZ8148-mnc、pNZ8148-ftsL用于后续重组菌的构建。
二、重组乳酸片球菌菌株的构建
(1)P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn重组乳酸片球菌菌株的构建
a)菌株活化和扩大：将-80℃保存P.acidilactici CGMCC No.17856的甘油管在MRS固体平板上划线活化，37℃培养2天后有单菌落出现，挑取单菌落于装有5m1 MRS液体培养基的试管中，37℃静置培养至OD600到1.0左右。将上述培养液，按1％接种量转接于装有100mLMRS液体培养基的250mL的三角瓶中，调节初始OD600为0.1，37℃恒温箱中静置培养至OD600值为1.2。
b)离心收集菌体并用电击缓冲液A洗涤3次，加入溶菌酶溶液(终浓度3000U/mL)处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，具体过程为：5000rpm离心10min后，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，使用10％甘油，蔗糖150g/L，K2HPO4 20g/L，KH2PO4 1g/L和MgCl20.1g/L配制的电击缓冲液A洗涤沉淀3次，6000rpm离心10min收集乳酸片球菌菌体。再用溶菌酶溶液(终浓度3000U/mL)重悬菌体，37℃水浴20min。重悬液经6000rpm离心10min，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，最后用10％甘油和0.4mol/L蔗糖配制的电击缓冲液B重悬菌体，每个1.5mL管中分装100μL即得感受态细胞。
c)乳酸片球菌的电转及验证：向制备得到的感受态细胞中加入100ng构建成功的重组质粒，轻轻吹吸混匀，转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms。电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有800μL复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取100μL菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h。氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的重组菌株P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn。
(2)P.a-atpC、P.a-csp重组乳酸片球菌菌株的构建
a)菌株活化和扩大：将-80℃保存P.acidilactici CGMCC No.17856的甘油管在MRS固体平板上划线活化，37℃培养2天后有单菌落出现，挑取单菌落于装有5m1 MRS液体培养基的试管中，37℃静置培养至OD600到1.0左右。将上述培养液，按1％接种量转接于装有100mLMRS液体培养基的250mL的三角瓶中，调节初始OD600为0.1，37℃恒温箱中静置培养至OD600值为0.8。
b)离心收集菌体并用电击缓冲液A洗涤3次，加入溶菌酶溶液(终浓度2000U/mL)处理菌体，最后在用电击缓冲液B使菌体重悬，具体过程为：5000rpm离心10min后，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，使用10％甘油，蔗糖175g/L，K2HPO4 30g/L，KH2PO4 2g/L和MgCl20.2g/L配制的电击缓冲液A洗涤沉淀3次，6000rpm离心10min收集乳酸片球菌菌体。再用溶菌酶溶液(终浓度2000U/mL)重悬菌体，37℃水浴20min。重悬液经6000rpm离心10min，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，最后用10％甘油和0.5mol/L蔗糖配制的电击缓冲液B重悬菌体，每个1.5mL管中分装100μL即得感受态细胞。
c)乳酸片球菌的电转及验证：向制备得到的感受态细胞中加入100ng构建成功的重组质粒，轻轻吹吸混匀，转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms。电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有800μL复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取100μL菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h。氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的重组菌株最终获得正确的重组菌株P.a-atpC、P.a-csp。
(3)P.a-mnc、P.a-ftsL重组乳酸片球菌菌株的构建
a)菌株活化和扩大：将-80℃保存P.acidilactici CGMCC No.17856的甘油管在MRS固体平板上划线活化，37℃培养2天后有单菌落出现，挑取单菌落于装有5m1 MRS液体培养基的试管中，37℃静置培养至OD600到1.0左右。将上述培养液，按1％接种量转接于装有100mLMRS液体培养基的250mL的三角瓶中，调节初始OD600为0.1，37℃恒温箱中静置培养至OD600值为0.4。
b)电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用溶菌酶溶液(终浓度1000U/mL)处理菌体，最后在用电击缓冲液B使菌体重悬具体过程为：5000rpm离心10min后，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，使用10％甘油，蔗糖200g/L，K2HPO4 40g/L，KH2PO4 3g/L和MgCl2 0.3g/L配制的电击缓冲液A洗涤沉淀3次，6000rpm离心10min收集乳酸片球菌菌体。再用溶菌酶溶液(终浓度1000U/mL)重悬菌体，37℃水浴20min。重悬液经6000rpm离心10min，收集乳酸片球菌菌体，去除上清液，最后用10％甘油和0.6mol/L蔗糖配制的电击缓冲液B重悬菌体，每个1.5mL管中分装100μL即得感受态细胞。
c)乳酸片球菌的电转及验证：向制备得到的感受态细胞中加入100ng构建成功的重组质粒，轻轻吹吸混匀，转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms。电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有800μL复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取100μL菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h。氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的重组菌株最终获得正确的P.a-mnc、P.a-ftsL重组乳酸片球菌菌株。
三、乳酸片球菌重组菌株在乳酸胁迫下的耐受性试验
(1)从斜面挑取构建成功的P.a-ftsL重组乳酸片球菌，接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL MRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加2％(v/v)乳酸作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、培养6h后取样，利用平板活菌计数法测定活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表2可知，2％(v/v)乳酸培养6h后，P.a-ftsL重组乳酸片球菌的相对活菌数为1.54％，比对照菌株的相对活菌数(1.30％)提高了19％。该结果说明，P.a-ftsL重组乳酸片球菌对乳酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性得到显著提高。
表2 P.a-ftsL重组乳酸片球菌与对照菌株在2％乳酸胁迫条件下培养6h的相对活菌数
(2)从斜面挑取构建成功的P.a-asn、P.a-mnc重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL MRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加2％(v/v)乳酸作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液OD600值调至1.0，37℃、培养24h后取样，利用平板活菌计数法测定活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表3可知，2％(v/v)乳酸培养24h后，P.a-asn、P.a-mnc重组乳酸片球菌的相对活菌数分别0.0905％、0.0254％，为比对照菌株的相对活菌数(0.0190％)分别提高了3.77倍、0.34倍。该结果说明，P.a-asn、P.a-mnc重组乳酸片球菌对乳酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
表3 P.a-asn、P.a-mnc重组乳酸片球菌与对照菌株在2％乳酸胁迫条件下培养24h的相对活菌数
(3)从斜面挑取构建成功的P.a-csp重组乳酸片球菌，接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加3％(v/v)乳酸作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、冲击90min后取样，稀释不同梯度点种于MRS平板上观察活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表4可知，3％(v/v)乳酸冲击90min后，P.a-csp重组乳酸片球菌的相对活菌数为6.70％，比对照菌株的相对活菌数(1.33％)提高了4.13倍。该结果说明，P.a-csp重组乳酸片球菌对乳酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
表4 P.a-csp重组乳酸片球菌与对照菌株在3％乳酸胁迫条件下培养冲击90min的相对活菌数
(4)从斜面挑取构建成功的P.a-acc、P.a-acpP重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加3％(v/v)乳酸作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、冲击180min后取样，稀释不同梯度点种于MRS平板上观察活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图3所示，3％(v/v)乳酸冲击180min后，对照菌株的活菌数的数量级在100，而P.a-acc、P.a-acpP重组乳酸片球菌的活菌数的数量级保持在103，相比对照菌株的活菌数均提高三个数量级。该结果说明，P.a-acc、P.a-acpP重组乳酸片球菌对乳酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
四、重组乳酸片球菌菌株在醋酸胁迫下的耐受性试验
(1)从斜面挑取构建成功的P.a-csp、P.a-asn、P.a-atpC重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL MRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加3％醋酸作为胁迫的装有50mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，培养温度选择37℃、培养24h后取样，利用平板活菌计数法测定活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCCNO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表5可知，3％(v/v)醋酸条件下培养24h后，P.a-csp、P.a-asn、P.a-atpC重组菌的相对活菌数分别为0.0501％、0.0345％、0.00216％，比对照菌株的相对活菌数(0.00174％)分别提高了27.79、19.18倍、2.07倍。该结果说明P.a-csp、P.a-asn、P.a-atpC重组乳酸片球菌株对醋酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
表5 P.a-csp、P.a-asn、P.a-atpC重组乳酸片球菌与对照菌株在3％醋酸胁迫条件下培养24h的相对活菌数
(2)从斜面挑取构建成功的P.a-acc、P.a-mnc、P.a-acpP重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL MRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加5％醋酸作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、冲击180min后取样，稀释不同梯度点种于MRS平板上观察活菌数，实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图4所示，5％(v/v)醋酸冲击180min后，P.a-acc、P.a-mnc、P.a-acpP重组菌的活菌数的数量级分别在103、102、102，而对照菌株无存活。该结果说明P.a-acc、P.a-mnc、P.a-acpP重组乳酸片球菌株对醋酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
五、重组乳酸片球菌菌株在极端pH胁迫下的耐受性试验
(1)从斜面挑取构建成功的，P.a-acpP、P.a-asn重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加盐酸调节至pH值为3.0作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、培养6h后取样，利用平板活菌计数法测定活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCCNO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表6可知，pH3.0(盐酸调节)培养6h后，P.a-asn、P.a-acpP重组乳酸片球菌的相对活菌数为13.7％、6.12％，比对照菌株的相对活菌数(2.90％)分别提高了3.72倍、1.12倍。该结果说明，P.a-asn、P.a-acpP重组乳酸片球菌对极端pH胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
表6 P.a-acpP、P.a-asn重组乳酸片球菌与对照菌株在pH3.0胁迫条件下培养6h的相对活菌数
(2)从斜面挑取构建成功的acc、ftsL、atpC、mnc重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加盐酸调节至pH值为3.0作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、培养24h后取样，利用平板活菌计数法测定活菌数，并按照式(1)计算相对活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
由表7可知，pH 3.0(盐酸调节)培养24h后P.a-acc、P.a-ftsL、P.a-atpC、P.a-mnc重组乳酸片球菌的相对活菌数分别为6.65％、5.82％、2.61％、1.82％，比对照菌株的相对活菌数(1.36％)分别提高了3.88倍、3.28倍、0.92倍、0.47倍。该结果说明P.a-acc、P.a-ftsL、P.a-atpC、P.a-mnc重组乳酸片球菌对极端pH胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
表7 P.a-acc、P.a-ftsL、P.a-atpC、P.a-mnc重组乳酸片球菌与对照菌株在pH3.0胁迫条件下培养24h的相对活菌数
六、重组乳酸片球菌菌株在乙醇胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的acpP、acc、atpC、ftsL、mnc重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加19％(v/v)无水乙醇作为胁迫的装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，37℃、冲击30min后取样，稀释不同梯度点种于MRS平板上观察活菌数，并按照式(2)计算相对倍数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图5所示，19％(v/v)无水乙醇下冲击30min后，重组菌P.a-acc、P.a-mnc、P.a-ftsL、P.a-acpP、P.a-atpC的相对倍数为13.33倍、6.67倍、6.67倍、3.33倍、3.33倍。该结果说明，重组菌P.a-acc、P.a-mnc、P.a-acpP、P.a-atpC、P.a-ftsL对无水乙醇胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
七、重组乳酸片球菌菌株在高温胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的acpP、acc、asn、atpC、csp、mnc、ftsL重组乳酸片球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养试管中，37℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mLMRS液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，37℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体悬浮于装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至10，65℃、冲击30min后取样，稀释不同梯度点种于MRS平板上观察活菌数，并按照式(2)计算相对倍数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称P.a-8148)，以在37℃培养条件作为空白对照，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图6所示，65℃下冲击30min后，重组菌P.a-acpP、P.a-csp、P.a-mnc、P.a-asn、P.a-ftsL、P.a-acc、P.a-atpC的相对倍数为16.67倍、16.67倍、13.33倍、6.67倍、3.33倍、3.33倍、3.33倍。该结果说明重组菌P.a-acpP、P.a-csp、P.a-ftsL、P.a-asn、P.a-acc、P.a-atpC、P.a-mnc对高温胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性明显提高。
八、乳酸乳球菌重组菌株的构建
将重组质粒pNZ8148-acpP(acc/asn/csp/mnc/ftsL)电转化到感受态L.lactisNZ9000中，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株La-acpP、La-acc、La-asn、La-csp、La-mnc、La-ftsL。
九、乳酸乳球菌重组菌株在乳酸胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的csp、mnc重组乳酸乳球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL GM17液体培养试管中，30℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL GM17液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，30℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加2％(v/v)乳酸作为胁迫的装有50mL GM17液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液OD600值调至1.0，30℃、冲击20min后取样，稀释不同梯度点种于GM17平板上观察活菌数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称La-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图7所示，2％(v/v)乳酸冲击20min后，对照菌株无存活，而重组菌La-csp、La-mnc的活菌数的数量级保持在101。说明重组菌株La-csp、La-mnc对乳酸胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
十、乳酸乳球菌重组菌株在极端pH胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的acc、csp、mnc重组乳酸乳球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL GM17液体培养试管中，30℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL GM17液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，30℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加盐酸调节至pH值为2.5作为胁迫的装有50mL GM17液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，30℃、冲击20min后取样，稀释不同梯度点种于GM17平板上观察活菌数，并按照式(2)计算相对倍数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称La-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图8所示，pH2.5(盐酸调节)冲击20min后，重组菌La-acc、La-csp、La-mnc的活菌数比对照菌株的活菌数分别提高了4倍、4倍、2倍。说明重组菌La-acc、La-csp、La-mnc对极端pH胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
十一、乳酸乳球菌重组菌株在乙醇胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的asn、mnc、ftsL重组乳酸乳球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL GM17液体培养试管中，30℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL GM17液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，30℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于不添加胁迫和添加19％(v/v)无水乙醇作为胁迫的装有50mL GM17液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，30℃、冲击30min后取样，稀释不同梯度点种于GM17平板上观察活菌数，并按照式(2)计算相对倍数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称La-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图9所示，19％(v/v)无水乙醇冲击30min后，重组菌La-asn、La-mnc、La-ftsL的相对倍数为2.5倍、2.5倍、2.0倍。该结果说明重组菌La-asn、La-mnc、La-ftsL对无水乙醇胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
十二、乳酸乳球菌重组菌株在高温胁迫下的耐受性试验
从斜面挑取构建成功的asn、mnc、ftsL重组乳酸乳球菌，分别接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL GM17液体培养试管中，30℃，静置培养8h，将上述培养液转接入装有含有10μg/mL氯霉素的50mL GM17液体培养基250mL三角瓶中，并将初始OD600值调为1.0，30℃静置培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将收集得到的菌体分别悬浮于装有50mLGM17液体培养基的250mL三角瓶中，并将菌液初始OD600值调至1.0，65℃、冲击30min后取样，稀释不同梯度点种于GM17平板上观察活菌数，并按照式(2)计算相对倍数。实验中，以含有空载体pNZ8148的乳酸片球菌CGMCC NO.17856作为对照菌株(简称La-8148)，培养基中加入10μg/mL的氯霉素用以维持质粒的稳定性。
如图10所示，65℃下冲击30min后，重组菌La-acpP、La-asn、La-ftsL的相对倍数为12.5倍、7.5倍、2.0倍。该结果说明重组菌La-acpP、La-asn、La-ftsL对高温胁迫的耐受性较对照菌株的耐受性均得到显著提高。
部分序列：
237bp
NO.1
ATGACAAAAGAAGAAGTATTCGCAAAGGTACAAGAAGTAATCGCAGACCAATTGGAAAAAGACGCAAGCAAAATCACAATGGAAACTAGTTTTTCAGAAGATTTAGAAGCAGATAGCTTGGACATTTTTGAAGTTGTGGATCAATTAGAAGATGAATTTGATATCGACATTGATACTGACGAAAACATGGATACCGTAGGCAAATTAGTTGATTACATCATTGAAAATCAAGATTAG
768bp
NO.2
ATGACAAAAACAGCATATGAAACGGTTATGGCAGCTCGGGCAAAAGAAAAGGTTGCCACCGAAGATTTGATTAATAATATTTTTACCGACTTTACTGAATTTCATGGTGATCGGCAATTAAGCGATGATCCGGCAATCATTGGTGGAATTGCCCGACTAAACGGTTTACCAGTGACCGTCATCGGAACCCAAAAGGGAAAAAATACCGCCGAAAATATTGAACGCCATTTCGGGACGGTTGAACCGGAGGGCTATCGTAAGGCAATTCGTTTAATGAAGCAGGCTGAAAAATTTAAACGCCCAGTAATTACCTTTGTTAACACGCCGGGTGCTTACCCAGGAATGGATGCTGAATATCAC
GGCCAGGGATCGGCAATTGCCCAATGCTTAATGGTGGGTATGGAGCTGCGGGTACCATACATCAGCGTAATTGTTGGTGAAGGTGGCAGTGGTGGCGCATTAGCCTTGGCAACTGCGGACCGGGTCTGGATGTTTGAAAACAGCATCTATTCGGTGCTATCGCCAGAAGGCTACGCCTCAATCGTTTGGAAAGATGCTAAACGAGTGGCGGACGCGGCGGAAGAATTAAAGCTGACACCAGAGATTCTGCTGACCGAAGGAATCATTGATAAAATCATTCCGGAAGTTGTCGACCAAGAAAGCACGAAAGTTTTAAAAAATATGTTAGTTTCCGAAGTGGAAAGTTTACGACAATTTTCGGCTGACGAACTTGTTGAACAGCGCCACGAACGGTTTAGTAAATTTTAG
972bp
NO.3
ATGAAAAAAATATTGGCATTACACACTGGCGGAACAATTTCGATGTCGGCTAGTAATGATAAGGTAAAGACTAACGAAGAAAATCCGTTATTGGATACCCAATTTATTAACGAAAATATTGATTTGGCAAACGAAGTCGTATTAAATAAGCCTTCGGAACACATTACCCCAGAAGATATGTTGGTAATTAAAAAACGGGTCAAAAAAGCTATCGACAATGATGAATGTGACGGAATCGTAATTACCCACGGTACCGATACGCTCGAAGAAACGGCTTATTTTCTTGATCTTACGATCCCAAGCGTGATTCCAATTGTTTTAACGGGCGCAATGCGTTCTTCTAACGAGCTTGGTTCTGATGGTGTTTATAATTTCCAAAGTGCGATTTTAACGGCGGCTTCCGACGAAGCTACGGGCAAGGGCGTGTTAGTAGTCATGAATGATGAAATTCACACCGCCCGGTTTGTTACTAAAACCCACACAACTAACGTAGATACTTTCCGGACGCCAACGTTTGGACCGTTAGGAATTGTATACAAACGGGATATTCGTTTCTTCCAAGCCTTAATTAGCCAACAAGTTTGTGATATTGACGAGCTAGTTTCTGGTGTTTACTTAGTTAAGGCTTACGCAGGAATTCCAGGAGCCATTTTTGAGACGCTAGATCGCCCAGAAACTAAGGGGATCGTTATTGAAGGACTTGGTGCGGGAAATTTGCCAGTTGAAGTGGTAGAACCCATTCAAAAATTGATTGAAAAGGGAATTCCAGTAGTAATGGTTTCCCGATGCTACAACGGGCTTGCTGAACCAATTTACGATTACGTTGGCGGCGGCATTGACTTAGAACGGATGGGAGTGATCTTCTGCCAGGGACTTAACGGACAAAAGGCGCGGATCAAACTCCAAGTGGGGTTAAGCAATCACATGAACGGCAAAGAAATTGCCCGCTACATGCATGATGCCGTTTCTTAA
420 bp
NO.4
TTGGCTGAAAATTCAGTATTAACAGTTAGTATTGTTACTCCTGATGGTCAGATTTATAATGATGACCAAGTTACCATGCTGGTAGTCAATACCAGAGAAGGTGAATTGGGAATCTTACCTAATCACGTTCCAGTAATTGCAACTTTAGCGATTGACGAAGTGCGCATTAAGCATGACAAAGCTGAAGATGTAGTGGCGGTGAACGGTGGTTTTGTTGAGTTTTCAGATAACACGGCAACGATTGTTGCGGATACTGCTGAAAATCAAGCTGACATTGACGTAGCGCGAGCTGAAAGTGCTAAGAAACGTGCTGAGGCAACGATCCGTAAAGCACAACAAGCTCACGATAATAGCGAGCTTCGGCGTGCGCAAATTCATTTGCGGCGGGCGATTAACCGAATCAACGTTTCAAAACATTAA
213bp
NO.5
TTGGAAACTGGTACGGTAACGAGCTTTGATAAAACCAAAGGTTACGGCTTCATCGAGCTTGACAACGGGGAAAAGGCTTTTGTACATTATAGTGCGGTACAATCCGATGATTTTAAAACTTTAGATGAAAACGAGGTCGTCCAGTTAATGGTGGCTGAGGGTCCCAAAGGATTGGTGGCTGTAAAAGTATTTCGTAAAGGAGAACAGGATTAA
816bp
NO.6
ATGTTTCGACACCAAAAAGAATTACAATTTGAAGCTAAGCCTACTCAACCTGATCCAACGGTTGCCAAGTATTTACAAGAATTAATTGGCGGTCAATATGGAGAAATGAGCGTGGCCATGCAGTACCTCTTCCAGGGCTGGAGTTGCCGCGGAGAAGCTAAGTATAAGGACATGATCCTCGACATTGCTACCGAAGAAATTGGACACGTAGAAATGTTAGCTACTATGGTAGCGCGTCTACTAGAAGATGCACCTGTCGAAGACCAACAGGCGGCAATGGAACAAGATCCCGTAGTTGGGGCAGTGATTGCCGGTATGAATCCACAACATGCGATTGTAGCAGGGTTAGGACCGCGTCCAGCTGATAGTGTAGGGAATCCATGGAGCGGAGCATACATCATTTCTAGTGGCAATTTACTTGCTGACTTCCGCGCCAACCTTAATGCAGAATCACAAGGCCGTTTGCAAGCGGCACGGATTTACGAAATGGTCGACGATCCAGGGGTGAAAGATCTCTTAGCCGTACTTCTTGCCCGGGATAGCTACCACCAAAATCAATGGGCGGCAGCAATCAAAGAACTAGAGGAACAAGTTGGAACGATTCTGGTGCCAAGCGATTTCCCACGTGAAAAAGAGCGTAAGGACATTGCCTACGACTTCTACAACTTCTCTAAGGGAGATGAAAGTAGCCAAGGTGCTTGGGCACATGGTGAAGCTCTTGATGGCGAAGGCGAATACAAGTGGCAGGCAGAGCCTAAGGCGGAAGGTCAAGCTCCTGACTTAAAACCTGTTAACCCTAAAATGTATGGTTCTTAA
390bp
NO.7
ATGGCTCAAAATAATGATTATGCTGGTCGTTCAAGAATGATTAACGAACCAACTTCAATTGCCGGAGTAGGGAAAAAAGAATTAAAAAAAGCCCGGGAGGTTGTAACTGCTCGACAACTGCCCTTGTCGAAGTTTGAAAAGTTTTTGATAACATTTTGCGGATTTATTTTGGTAGGGTTAATGCTTACCGTTGTTTCTGGTAAAATAAGTTTATCTAATGCACAGCATAAACTTGAAGCAACACAAGAGAAGACAACGGCCTTATCAAGCAAAAATACAACTATGAAACAAGAGGTTAATCAGTTATCCGACCAAAATCGGTTAAATAAAGTTGCTAAAAAGGCAGGCCTTTCTCTTAATTCAGAGAATATAAGGAATGTAAATAAATGA
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
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<213> 编码酰基载体蛋白的基因acpP(Unknown)
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atgacaaaag aagaagtatt cgcaaaggta caagaagtaa tcgcagacca attggaaaaa 60
gacgcaagca aaatcacaat ggaaactagt ttttcagaag atttagaagc agatagcttg 120
gacatttttg aagttgtgga tcaattagaa gatgaatttg atatcgacat tgatactgac 180
gaaaacatgg ataccgtagg caaattagtt gattacatca ttgaaaatca agattag 237
<210> 2
<211> 768
<212> DNA/RNA
<213> 编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc(Unknown)
<400> 2
atgacaaaaa cagcatatga aacggttatg gcagctcggg caaaagaaaa ggttgccacc 60
gaagatttga ttaataatat ttttaccgac tttactgaat ttcatggtga tcggcaatta 120
agcgatgatc cggcaatcat tggtggaatt gcccgactaa acggtttacc agtgaccgtc 180
atcggaaccc aaaagggaaa aaataccgcc gaaaatattg aacgccattt cgggacggtt 240
gaaccggagg gctatcgtaa ggcaattcgt ttaatgaagc aggctgaaaa atttaaacgc 300
ccagtaatta cctttgttaa cacgccgggt gcttacccag gaatggatgc tgaatatcac 360
ggccagggat cggcaattgc ccaatgctta atggtgggta tggagctgcg ggtaccatac 420
atcagcgtaa ttgttggtga aggtggcagt ggtggcgcat tagccttggc aactgcggac 480
cgggtctgga tgtttgaaaa cagcatctat tcggtgctat cgccagaagg ctacgcctca 540
atcgtttgga aagatgctaa acgagtggcg gacgcggcgg aagaattaaa gctgacacca 600
gagattctgc tgaccgaagg aatcattgat aaaatcattc cggaagttgt cgaccaagaa 660
agcacgaaag ttttaaaaaa tatgttagtt tccgaagtgg aaagtttacg acaattttcg 720
gctgacgaac ttgttgaaca gcgccacgaa cggtttagta aattttag 768
<210> 3
<211> 972
<212> DNA/RNA
<213> 编码天冬酰胺酶的基因asn(Unknown)
<400> 3
atgaaaaaaa tattggcatt acacactggc ggaacaattt cgatgtcggc tagtaatgat 60
aaggtaaaga ctaacgaaga aaatccgtta ttggataccc aatttattaa cgaaaatatt 120
gatttggcaa acgaagtcgt attaaataag ccttcggaac acattacccc agaagatatg 180
ttggtaatta aaaaacgggt caaaaaagct atcgacaatg atgaatgtga cggaatcgta 240
attacccacg gtaccgatac gctcgaagaa acggcttatt ttcttgatct tacgatccca 300
agcgtgattc caattgtttt aacgggcgca atgcgttctt ctaacgagct tggttctgat 360
ggtgtttata atttccaaag tgcgatttta acggcggctt ccgacgaagc tacgggcaag 420
ggcgtgttag tagtcatgaa tgatgaaatt cacaccgccc ggtttgttac taaaacccac 480
acaactaacg tagatacttt ccggacgcca acgtttggac cgttaggaat tgtatacaaa 540
cgggatattc gtttcttcca agccttaatt agccaacaag tttgtgatat tgacgagcta 600
gtttctggtg tttacttagt taaggcttac gcaggaattc caggagccat ttttgagacg 660
ctagatcgcc cagaaactaa ggggatcgtt attgaaggac ttggtgcggg aaatttgcca 720
gttgaagtgg tagaacccat tcaaaaattg attgaaaagg gaattccagt agtaatggtt 780
tcccgatgct acaacgggct tgctgaacca atttacgatt acgttggcgg cggcattgac 840
ttagaacgga tgggagtgat cttctgccag ggacttaacg gacaaaaggc gcggatcaaa 900
ctccaagtgg ggttaagcaa tcacatgaac ggcaaagaaa ttgcccgcta catgcatgat 960
gccgtttctt aa 972
<210> 4
<211> 420
<212> DNA/RNA
<213> 编码ATP合酶的基因atpC(Unknown)
<400> 4
ttggctgaaa attcagtatt aacagttagt attgttactc ctgatggtca gatttataat 60
gatgaccaag ttaccatgct ggtagtcaat accagagaag gtgaattggg aatcttacct 120
aatcacgttc cagtaattgc aactttagcg attgacgaag tgcgcattaa gcatgacaaa 180
gctgaagatg tagtggcggt gaacggtggt tttgttgagt tttcagataa cacggcaacg 240
attgttgcgg atactgctga aaatcaagct gacattgacg tagcgcgagc tgaaagtgct 300
aagaaacgtg ctgaggcaac gatccgtaaa gcacaacaag ctcacgataa tagcgagctt 360
cggcgtgcgc aaattcattt gcggcgggcg attaaccgaa tcaacgtttc aaaacattaa 420
<210> 5
<211> 213
<212> DNA/RNA
<213> 编码冷激蛋白的基因csp(Unknown)
<400> 5
ttggaaactg gtacggtaac gagctttgat aaaaccaaag gttacggctt catcgagctt 60
gacaacgggg aaaaggcttt tgtacattat agtgcggtac aatccgatga ttttaaaact 120
ttagatgaaa acgaggtcgt ccagttaatg gtggctgagg gtcccaaagg attggtggct 180
gtaaaagtat ttcgtaaagg agaacaggat taa 213
<210> 6
<211> 816
<212> DNA/RNA
<213> 编码锰离子催化酶的基因mnc(Unknown)
<400> 6
atgtttcgac accaaaaaga attacaattt gaagctaagc ctactcaacc tgatccaacg 60
gttgccaagt atttacaaga attaattggc ggtcaatatg gagaaatgag cgtggccatg 120
cagtacctct tccagggctg gagttgccgc ggagaagcta agtataagga catgatcctc 180
gacattgcta ccgaagaaat tggacacgta gaaatgttag ctactatggt agcgcgtcta 240
ctagaagatg cacctgtcga agaccaacag gcggcaatgg aacaagatcc cgtagttggg 300
gcagtgattg ccggtatgaa tccacaacat gcgattgtag cagggttagg accgcgtcca 360
gctgatagtg tagggaatcc atggagcgga gcatacatca tttctagtgg caatttactt 420
gctgacttcc gcgccaacct taatgcagaa tcacaaggcc gtttgcaagc ggcacggatt 480
tacgaaatgg tcgacgatcc aggggtgaaa gatctcttag ccgtacttct tgcccgggat 540
agctaccacc aaaatcaatg ggcggcagca atcaaagaac tagaggaaca agttggaacg 600
attctggtgc caagcgattt cccacgtgaa aaagagcgta aggacattgc ctacgacttc 660
tacaacttct ctaagggaga tgaaagtagc caaggtgctt gggcacatgg tgaagctctt 720
gatggcgaag gcgaatacaa gtggcaggca gagcctaagg cggaaggtca agctcctgac 780
ttaaaacctg ttaaccctaa aatgtatggt tcttaa 816
<210> 7
<211> 390
<212> DNA/RNA
<213> 编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL(Unknown)
<400> 7
atggctcaaa ataatgatta tgctggtcgt tcaagaatga ttaacgaacc aacttcaatt 60
gccggagtag ggaaaaaaga attaaaaaaa gcccgggagg ttgtaactgc tcgacaactg 120
cccttgtcga agtttgaaaa gtttttgata acattttgcg gatttatttt ggtagggtta 180
atgcttaccg ttgtttctgg taaaataagt ttatctaatg cacagcataa acttgaagca 240
acacaagaga agacaacggc cttatcaagc aaaaatacaa ctatgaaaca agaggttaat 300
cagttatccg accaaaatcg gttaaataaa gttgctaaaa aggcaggcct ttctcttaat 360
tcagagaata taaggaatgt aaataaatga 390
<210> 8
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> acpP-F(Unknown)
<400> 8
taaggaggca ctcaccatgg ggatgacaaa agaagaagta ttcgcaaa 48
<210> 9
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> acpP-R(Unknown)
<400> 9
gaaagcttga gctctctaga ctaatcttga ttttcaatga tgtaatcaa 49
<210> 10
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> acc-F(Unknown)
<400> 10
taaggaggca ctcaccatgg ggatgacaaa aacagcatat gaaacgg 47
<210> 11
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> acc-R(Unknown)
<400> 11
gaaagcttga gctctctaga ctaaaattta ctaaaccgtt cgtggc 46
<210> 12
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> asn-F(Unknown)
<400> 12
taaggaggca ctcaccatgg ggatgaaaaa aatattggca ttacacact 49
<210> 13
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> asn-R(Unknown)
<400> 13
gaaagcttga gctctctaga ttaagaaacg gcatcatgca tg 42
<210> 14
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> csp-F(Unknown)
<400> 14
taaggaggca ctcaccatgg ggttggaaac tggtacggta acga 44
<210> 15
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> csp-R(Unknown)
<400> 15
gaaagcttga gctctctaga ttaatcctgt tctcctttac gaaatact 48
<210> 16
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> atpC-F(Unknown)
<400> 16
taaggaggca ctcaccatgg ggttggctga aaattcagta ttaacagtt 49
<210> 17
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> atpC-R(Unknown)
<400> 17
gaaagcttga gctctctaga ttaatgtttt gaaacgttga ttcgg 45
<210> 18
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> mnc-F(Unknown)
<400> 18
taaggaggca ctcaccatgg ggatgtttcg acaccaaaaa gaattaca 48
<210> 19
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> mnc-R(Unknown)
<400> 19
gaaagcttga gctctctaga ttaagaacca tacattttag ggttaaca 48
<210> 20
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> ftsL-F(Unknown)
<400> 20
taaggaggca ctcaccatgg ggatggctca aaataatgat tatgctg 47
<210> 21
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> ftsL-R(Unknown)
<400> 21
gaaagcttga gctctctaga tcatttattt acattcctta tattctctga a 51
Claims (10)
1.一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法是在乳酸菌中过表达编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc或者编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL。
2.根据权利要求书1所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，其特征在于：所述编码酰基载体蛋白的基因acpP的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc的核苷酸序列为SEQ ID No.2，所述编码天冬酰胺酶的基因asn的核苷酸序列为SEQID No.3，所述编码ATP合酶的基因atpC的核苷酸序列为SEQ ID No.4，所述编码冷激蛋白的基因csp的核苷酸序列为SEQ ID No.5，所述编码锰离子催化酶的基因mnc的核苷酸序列为SEQ ID No.6，所述编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的核苷酸序列为SEQ ID No.7。
3.根据权利要求书1所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，其特征在于：所述乳酸菌为乳酸片球菌或乳酸乳球菌。
4.根据权利要求书1至3任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
以P.acidilactici CGMCC No.17856的基因组为模板，分别以SEQ ID No.8至SEQ IDNo.14所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7的acpP、acc、asn、atpC、csp、mnc、ftsL基因，然后将如以上核苷酸序列所示的基因片段与表达载体pNZ8148或pMG36e载体通过限制性内切酶进行酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到了分别含有编码酰基载体蛋白的基因acpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因acc、编码天冬酰胺酶的基因asn、编码ATP合酶的基因atpC、编码冷激蛋白的基因csp、编码锰离子催化酶的基因mnc、编码细胞壁分离蛋白的基因ftsL的重组质粒；
再将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactis NZ9000中，得到耐受性提高的重组乳酸菌，即为胁迫耐受性增强的乳酸菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactis NZ9000的具体步骤如下：
乳酸菌活化后进行扩大培养，当生长OD600值在0.4～1.2时收集经扩大培养所得的菌体，用电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用终浓度为1000～3000U/mL的溶菌酶处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，得感受态细胞；
向制备得到的感受态细胞中加入验证正确的重组质粒，吹吸混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms，电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h；氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的P.a-acpP、P.a-acc、P.a-asn、P.a-atpC、P.a-csp、P.a-mnc、P.a-ftsL重组乳酸片球菌菌株，即为重组乳酸菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述电击缓冲液A的配方为：质量浓度10％甘油，蔗糖150～200g/L，K2HPO4 20～40g/L，KH2PO4 1～3g/L和MgCl2 0.1～0.3g/L，溶剂为水；
电击缓冲液B的配方为：质量浓度10％甘油，0.4～0.6mol/L蔗糖，溶剂为水。
7.如权利要求书1至6任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在提高乳酸菌胁迫抗性方面中的应用。
8.如权利要求书1至6任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
9.利用如权利要求1至6任一项所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法制备得到的胁迫抗性提高的乳酸菌。
10.如权利要求9所述的胁迫抗性提高的乳酸菌在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN116004499A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-04-25 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种具有高生长能力的工程菌株及其制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004499A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-04-25 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种具有高生长能力的工程菌株及其制备方法 |
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