CN101033471A - 可表达和分泌β－半乳糖苷酶的大肠杆菌－乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种可表达和分泌β－半乳糖苷酶的大肠杆菌－乳酸菌穿梭质粒，所含基因由编码β－半乳糖苷酶的基因及该基因上游含SD位点的调控序列组成。实验证明，上述重组质粒可转化乳酸乳球菌，在大肠杆菌和乳酸乳球菌中高效表达非融合β－半乳糖苷酶，在β－半乳糖苷酶制备和构建可表达β－半乳糖苷酶的乳酸菌株中应用。构建方法包括以下步骤：以德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA为模板，扩增得到含上游调控序列的β－半乳糖苷酶基因；将上述扩增得到的β－半乳糖苷酶基因双酶切后与用同种酶双酶切并去磷酸化的载体连接并转化感受态大肠杆菌；筛选阳性大肠杆菌，提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进行测序。

Description

可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用

                                    技术领域

本发明涉及一种可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用。

                                    背景技术

β-半乳糖苷酶(乳糖酶)因其能催化乳糖生成半乳糖和葡萄糖而在工业和医药领域都具有非常重要的用途。纯化的β-半乳糖苷酶在工业生产上可用于乳品加工生产低乳糖牛奶，在医药领域可用于治疗乳糖不耐受症等。另一方面，一些细菌如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌等因能产生β-半乳糖苷酶而使它们具有特定的实用价值。例如乳酸菌等益生菌因能产生β-半乳糖苷酶而使其可用于制备缓解乳糖不耐症的益生菌制剂；德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌在发酵制作酸奶的过程中，将依靠其产生的β-半乳糖苷酶分解奶中的乳糖。

一些细菌、酵母菌和霉菌可产生β-半乳糖苷酶。与酵母菌和霉菌相比，细菌的β-半乳糖苷酶产量虽较低，但它们具有酵母菌和霉菌无法比拟的一些优点。大肠杆菌很容易培养和保存，遗传背景清楚，是目前首选的基因工程宿主菌株；乳酸菌具有公认的安全性，常用于发酵酸奶，是人体肠道的正常菌群，对人体具有许多非常重要的益生作用。因此，提高大肠杆菌和乳酸菌等细菌的β-半乳糖苷酶产量将大大提高这类细菌在工业酶生产和食品发酵、医疗保健领域的应用价值。

常用的提高菌种产酶量的方法包括诱变筛选育种和基因工程技术。采用诱变的方法筛选高产酶菌株具有工作量大、菌株易变异、需大量诱导物、酶活提高率小等缺点，而基因工程技术则具有操作简便、蛋白表达量高、性能稳定的优点。现在已有研究者采用基因工程技术构建高产β-半乳糖苷酶的菌株，如陈卫等构建的表达嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶的大肠杆菌表达质粒和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒，能在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达耐热β-半乳糖苷酶，其酶活性分别为1.35U/ml和0.32U/mg(陈卫，葛佳佳，张灏，丁霄霖.半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件.无锡轻工大学学报，2002，21(5)：492-495；张灏，夏雨，傅晓燕，陈卫，丁霄霖.耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达.无锡轻工大学学报，2003，22(6)：1-4，14)。但这些质粒具有以下一些不足：①表达产生的β-半乳糖苷酶为融合蛋白，即表达的蛋白N端融合有来自于载体的一段多肽，这可能改变蛋白的三维结构，影响蛋白活性基团的形成从而使酶活性降低；②表达的β-半乳糖苷酶产量不高，这将直接影响其应用；③表达的β-半乳糖苷酶不具有分泌性，不利于工业制备酶产品，另外，表达的β-半乳糖苷酶不能分泌也会影响活菌直接发挥酶水解作用；④不能在乳酸菌中表达。乳酸乳球菌等乳酸菌在食品发酵工业上已有上千年的应用史，近年来，乳酸菌的益生作用也受到了越来越广泛的重视。由于具有公认安全性，来源于乳酸菌的β-半乳糖苷酶可不经过精制而直接应用。另外，具有高活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌将具有更好的发酵酸奶的能力，如果作为益生菌，则具有更强的缓解乳糖不耐受的能力，这些都是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌不具备的优点。

                                发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒，此种质粒不仅能在大肠杆菌中高效表达非融合β-半乳糖苷酶，而且能在乳酸乳球菌中高效表达和分泌非融合β-半乳糖苷酶；本发明的再一目的是提供上述质粒的构建方法；本发明的又一目的是提供上述质粒的应用。

本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒，其所含基因由编码β-半乳糖苷酶的基因(见序列表中SEQ ID NO.2)及该基因上游含SD位点的调控序列(见序列表中SEQ ID NO.1)组成，为序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。其载体为pMG36e(Van de GM，Van der VJM，Kok，J，et al.Construction of a lactococcalexpression vector：expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.lactis.Appl Environ Microbiol，1989，55(1)：224～228.)及其他一些大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达质粒。

本发明通过实验证明，上述重组质粒可转化乳酸乳球菌，在大肠杆菌中高效表达非融合β-半乳糖苷酶，在乳酸乳球菌中高效表达和分泌非融合β-半乳糖苷酶，因此可在β-半乳糖苷酶制备和构建可表达β-半乳糖苷酶的乳酸菌株中应用。

本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒，其构建方法包括以下步骤：

(1)以德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA为模板，扩增得到含上游调控序列的β-半乳糖苷酶基因；

(2)将上述扩增得到的β-半乳糖苷酶基因用Pst I、Xba I双酶切后与用同种酶双酶切并去磷酸化的载体连接并转化感受态大肠杆菌；

(3)筛选阳性大肠杆菌，提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进行测序。

本发明具有以下有益效果：

(1)表达的β-半乳糖苷酶为非融合蛋白。本发明采用非融合表达技术构建表达质粒，在扩增的德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因阅读框(SEQ ID NO.2)上游加入一段含SD位点的调控序列(SEQ ID NO.1)，实现了载体小肽和目的蛋白的分离。实施例5表明，本发明所述重组质粒确能在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达非融合的β-半乳糖苷酶。

(2)可在大肠杆菌和乳酸乳球菌中穿梭表达。实施例3和实施例4表明，本发明所述重组质粒能在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达具有活性的β-半乳糖苷酶。由于能应用于乳酸乳球菌等乳酸菌，因而本发明构建的穿梭质粒具有更直接和广泛的应用价值。

(3)表达的β-半乳糖苷酶酶活性高。实施例6表明，携带本发明所述质粒的大肠杆菌和乳酸乳球菌均能表达高活性的β-半乳糖苷酶，酶活性与基因初始菌相比均有成倍增加。携带本发明所述质粒的大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性可达到4.755U/ml，为基因初始菌的11.86倍；携带本发明所述质粒的乳酸乳球菌β-半乳糖苷酶活性可达到1.578U/ml，为基因初始菌株的3.94倍；高于陈卫等构建的表达嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶的大肠杆菌T7表达系统表达的β-半乳糖苷酶活性(陈卫，葛佳佳，张灏，丁霄霖.半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件.无锡轻工大学学报，2002，21(5)：492-495)。

(4)在乳酸乳球菌中表达的β-半乳糖苷酶具有分泌性。细菌产生的β-半乳糖苷酶为胞内酶，不具有分泌性。与胞外酶相比，工业制备胞内酶产品难度较大，细菌胞内的β-半乳糖苷酶活性也较难发挥。实施例7表明，本发明所述质粒在乳酸乳球菌中表达的β-半乳糖苷酶能部分分泌到胞外，其分泌率最高可达27.1％，显著高于基因初始菌(3％)。这将大大降低酶产品制备的难度，有利于细菌发挥其β-半乳糖苷酶活性。

                                附图说明

图1为本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)的一种结构图谱；

图2为构建本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)的技术路线图。

图3为提取的德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果，在＞10kb处有一明显的DNA条带，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA提取成功，图中泳道1，2为德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA，泳道3为DNA markerVI。

图4为PCR扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因片段(SEQ ID NO.3)的琼脂糖凝胶电泳结果，在约3.0kb处有一条特异条带，表明扩增成功，图中泳道1，2为德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因片段PCR反应液，泳道3为DNA 500bpladder。

图5为质粒载体pMG36e双酶切和去磷酸化的琼脂糖凝胶电泳结果，在约3.6kb处出现一条条带，与预期产物大小相符，图中泳道1为双酶切并去磷酸化的pMG36e质粒，泳道2为pMG36e质粒Pst I、Xba I双酶切后纯化产物，泳道3，4为pMG36e质粒PstI、Xba I双酶切反应液，泳道5为500bp DNA ladder。

图6为本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)转化大肠杆菌的平板筛选结果，阳性大肠杆菌生长为蓝色菌落，表明本发明所述质粒转化大肠杆菌成功，阳性大肠杆菌具有β-半乳糖苷酶活性，图中箭头所指即为阳性大肠杆菌。

图7为本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)及其Pst I、Xba I双酶切的琼脂糖凝胶电泳结果，在约3.0kb和3.6kb处出现两条条带，与预期产物大小相符，表明扩增的β-半乳糖苷酶基因片段已插入载体pMG36e，重组质粒构建成功，图中泳道1为DNA marker VI，泳道2为重组质粒pMG36e-lacZ，泳道3为pMG36e-lacZ Pst I、Xba I双酶切反应液，泳道4为500bp DNAladder。

图8为本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)的测序图。

图9为本发明所述质粒pMG36e-lacZ中插入的β-半乳糖苷酶基因片段序列与L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene(Genbank序列号：GI：149546)比对结果，pMG36e-lacZ中插入的外源基因序列与Genbank中德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因标准序列相比，符合率为99.5％(按1个反应保真长度为800bp计)，表明重组质粒构建成功，图中第1条DNA是pMG36e-lacZ中插入的β-半乳糖苷酶基因片段序列，第2条DNA是L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene，( )内数字为第1条DNA碱基数，[ ]内数字为第2条DNA碱基数。

图10为从携带重组质粒的大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-lacZ中提取的重组质粒pMG36e-lacZ的琼脂糖凝胶电泳结果，图中泳道1为500bp DNA ladder，泳道2为重组质粒pMG36e-lacZ。

图11为本发明所述可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒(pMG36e-lacZ)转化乳酸乳球菌的平板筛选结果，阳性乳酸乳球菌生长为蓝色函落，表明重组质粒转化乳酸乳球菌成功，阳性乳酸乳球菌具有β-半乳糖苷酶活性，图中箭头所指即为阳性乳酸乳球菌。

图12为PCR扩增本发明所述重组质粒pMG36e-lacZ中的β-半乳糖苷酶基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果，可见扩增得到了长度约为3.0kb的特异条带，与预期相符，表明pMG36e-lacZ已成功电转化乳酸乳球菌，图中泳道1为PCR扩增结果，泳道2为DNAmarkerIII。

图13为携带本发明所述重组质粒pMG36e-lacZ的大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性测定结果，β-半乳糖苷酶能催化底物ONPG水解产生亮黄色的产物——ONP，使反应液颜色变为亮黄色，在相同条件下反应液颜色越深表明酶活性越大，结果表明携带本发明所述重组质粒的大肠杆菌超声破壁液中含有β-半乳糖苷酶，E.coli DH5α超声破壁液中不含β-半乳糖苷酶，图中1，2为携带重组质粒的大肠杆菌DH5α，3为大肠杆菌DH5α，4为空白对照。

图14为携带本发明所述重组质粒pMG36e-lacZ的乳酸乳球菌β-半乳糖苷酶活性测定结果，结果表明携带本发明所述重组质粒的乳酸乳球菌超声破壁液中含有β-半乳糖苷酶，L.lactis超声破壁液中不含β-半乳糖苷酶，图中1为携带重组质粒的乳酸乳球菌，2为L.lactis，3为空白对照。

图15为表达非融合β-半乳糖苷酶的本发明所述重组质粒pMG36e-lacZ的翻译偶联调控片段各元件组成， ATG为载体来源起始密码， A[TG为非融合蛋白来源起始密码，[TGA]示载体来源小肽的终止密码；载体来源小肽密码子以阿拉伯数字标出，非融合蛋白密码子以带括弧的阿拉伯数字标出，加有双底线的序列为SEQ ID NO.1中的SD序列，加有波浪线的序列为Xba I酶切位点。

图16为携带本发明所述重组质粒pMG36e-lacZ的乳酸乳球菌粗酶液和上清液β-半乳糖苷酶活性测定结果，结果可见粗酶液和上清液中均有明显的β-半乳糖苷酶活性，图中1为粗酶液酶促反应结果，2为上清液酶促反应结果，3为空白对照。

                              具体实施方式

本发明下述实施例中：德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株可购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，或分离自活菌发酵酸奶，分离方法见《酸奶中保加利亚乳杆菌分离条件的优化》(汪川，张朝武，余倩.中国微生态学杂志，2001，13(2)：73-74，80)。大肠杆菌DH5α购买于天根生化科技(北京)有限公司。乳酸乳球菌菌种可购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心。所用各种分子生物学工具酶和试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司和宝生物工程(大连)有限公司。引物合成和基因测序由Invitrogen上海公司完成。

实施例1：可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒的构建

本实施例及后续各实施例中，将可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒命名为pMG36e-lacZ。其构建方法的步骤如下：

(1)扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因片段(SEQ ID NO.3)

将德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种从-20℃冰箱取出，37℃水浴融化后划线MRS平板，于37℃培养48h，挑菌落转种5ml MRS肉汤，37℃培养24h，用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA作为模板，抽提产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检查，阳性结果在＞10kb处有一明显的条带(见图3)。设计合成上下游引物，上游引物lacZf1：5‘-GCGTCTAGAGAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3’，下游引物lacZr1：5‘-GCGCTGCAGTTATTTTAGTAAAAGGGGCTGA-3’。按表1加样，PCR扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因片段，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，在3.0kb处可得到一条特异条带(见图4)。制备0.8％琼脂糖凝胶，将300μl PCR反应液全部上样电泳，在紫外灯下切下含β-半乳糖苷酶基因片段的凝胶，用Gel Extraction Kit回收纯化成30μl。

表1 PCR扩增β-半乳糖苷酶基因片段

(2)β-半乳糖苷酶基因片段Pst I、Xba I双酶切及酶切产物纯化取无菌1.5ml EP管，按表2加样，对纯化的基因片段进行Pst I、Xba I双酶切。

表2 β-半乳糖苷酶基因片段Pst I、Xba I双酶切体系表

试剂	加样量(μl)
		ddH2O10×M bufferβ-半乳糖苷酶基因片段Pst IXba I	56102455

瞬时离心使各成分集中于管底，于37℃水浴反应4h。将全部酶切反应液用Cycle-Pure kit纯化成30μl。

(3)pMG36e质粒的提取

E.coli DH5α/pMG36e菌种从-20℃冰箱取出，37℃水浴融化后划线含红霉素300μg/ml的LB平板(以下简称LB-Ery平板)，于37℃培养24h。挑单菌落接种5ml含红霉素300μg/ml的LB肉汤(以下简称LB-Ery肉汤)，37℃ 220r/min振荡培养12～16h。吸取1.5ml肉汤于1.5ml EP管中，12000r/min离心1min收集细菌，用Plasmid Miniprepkit提取pMG36e质粒。

(4)质粒pMG36e Pst I、Xba I双酶切及酶切产物纯化

取无菌1.5ml EP管，按表3加样，对提取的pMG36e进行Pst I、Xba I双酶切。瞬时离心使各成分集中于管底，于37℃水浴反应4h。将全部酶切反应液用Cycle-Pure kit纯化成30μl。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后在约3.6kb处出现一条条带，与预期相符(见图5)。

表3 pMG36e Pst I、Xba I双酶切体系表

试剂	加样量(μl)
		ddH2OpMG36e10×M bufferPst IXba I	88401688

(5)双酶切后的pMG36e去磷酸化

取无菌1.5ml EP管，按表4加样，对双酶切后的pMG36e去磷酸化。

表4 双酶切后的pMG36e去磷酸化反应体系表

试剂	加样量(μl)
		ddH2O双酶切后的pMG36e10×CIAP bufferCIAP	6225103

瞬时离心使各成分集中于管底，于50℃水浴反应30min。将全部反应液用Cycle-Purekit纯化成30μl。pMG36e双酶切后去磷酸化产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图5。

(6)感受态大肠杆菌DH5α的制备

从-20℃冰箱取出大肠杆菌DH5α菌种，置37℃水浴融化后，吸50～100μl菌种液于5ml LB肉汤，37℃ 220r/min培养12～16h。吸1ml菌液于预热的100ml LB肉汤培养瓶中，37℃220r/min培养至A₆₀₀＝0.35左右，停止培养。将菌液转移至两支无菌、预冷的50ml聚丙烯离心管中(40ml菌液/管)，于冰上放置10min，4℃ 4000r/min离心7min，弃上清。将管倒置1min使最后的痕量培养液流尽。离心管中加入预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液7ml重悬菌沉淀，4℃ 4000r/min离心7min，弃上清。将管倒置1min使最后的痕量培养液流尽。离心管中加入预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液10ml重悬菌沉淀，于冰上放置30min。4℃ 4000r/min离心7min，弃上清，将管倒置1min使最后的痕量培养液流尽。离心管中加入预冷的CaCl₂冻存液1.6ml重悬菌沉淀，分装预冷EP管(100μl/管)，立即于-70℃保存备用。

(7)β-半乳糖苷酶基因片段与pMG36e连接、转化感受态大肠杆菌DH5α取无菌100μl PCR反应管，按表5加样进行连接反应。

表5 β-半乳糖苷酶基因片段与pMG36e连接

试剂	加样量(μl)
		ddH2O10×T4 Ligase reaction bufferβ-半乳糖苷酶基因片段pMG36eT4 DNA Ligase	31321

瞬时离心使各成分集中于管底，于16℃连接3h，22℃连接1h。

用预冷枪头吸5μl连接反应液于预冷100μl感受态大肠杆菌DH5α中，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴3min。加入800μl 37℃预热的SOC培养基，于37℃ 160r/min培养1h，12000r/min离心数s，弃700μl上清。用枪头轻轻吹散菌沉淀，取150μl菌液于含红霉素300μg/ml，X-gal 40μg/ml的LB平板(以下简称LB-Ery-X-gal平板)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于37℃培养48～72h。阳性菌生长为蓝色菌落(见图6)。

(8)阳性克隆的鉴定

①提取重组质粒进行酶切鉴定

阳性克隆接种LB-Ery肉汤，37℃ 220r/min振荡培养12～16h。使用Plasmid Miniprepkit，按说明书操作说明，收集2.5ml肉汤中细菌于1.5ml EP管中，提取重组质粒。重组质粒用Pst I、Xba I双酶切，酶切反应体系见表6。瞬时离心使各成分集中于管底，于37℃水浴反应4h。0.8％琼脂糖凝胶电泳检查酶切片段，结果在约3.0kb和3.6kb处出现两条条带(见图7)，表明β-半乳糖苷酶基因片段已插入载体，重组质粒鉴定合格。

表6 重组质粒Pst I、Xba I双酶切体系表

试剂	加样量(μl)
		ddH2O重组质粒pMG36e-lacZ10×M bufferPst IXba I	2210422

②重组质粒测序

阳性克隆交Invitrogen上海公司，由该公司对重组质粒中插入的β-半乳糖苷酶基因片段进行测序。以上游引物lacZf1为测序引物，进行1个反应，结果见图8，图9。测序结果表明，pMG36e-lacZ中插入的外源基因序列与genebank中德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因标准序列相比，符合率分别为99.5％(按1个反应保真长度为800bp计)。表明β-半乳糖苷酶基因片段已插入载体，重组质粒鉴定合格。

(9)重组质粒的提取和保存

经酶切和测序鉴定合格的重组质粒可保存于-20℃环境中；携带有鉴定合格的重组质粒的大肠杆菌DH5α(以下简称E.coli DH5α/pMG36e-lacZ)菌种可于-20℃保存或-70℃长期保存，必要时可将其复苏培养后再从其中提取重组质粒(见图10)。

实施例2：重组质粒pMG36e-lacZ电转化乳酸乳球菌

(1)电转化用乳酸乳球菌细胞的制备

从-20℃冰箱取出乳酸乳球菌菌种，于37℃水浴融化后，划线MRS平板30℃培养48h。从平板上挑菌落接种5ml MRS肉汤，30℃培养12～16h，吸取5ml菌液至100ml MRS肉汤，30℃培养至A₆₀₀为0.5～0.8(约4h)。停止培养前1h，加入氨苄青霉素使其终浓度为20μg/ml。停止培养后吸取菌液于洁净、无菌、预冷的50ml聚丙烯离心管中，置冰浴10min。4℃离心4000r/min 7min，弃上清，将管倒置，用无菌滤纸条吸净残留液体。加入20ml冰冷甘油缓冲液重悬菌沉淀，于4℃离心4000r/min 7min，弃上清，再用20ml冰冷甘油缓冲液洗1次。加入500μl冰冷甘油缓冲液重悬菌沉淀，分装预冷无菌EP管(100μl/管)，立即于-70℃保存备用。

(2)电转化乳酸乳球菌

从-70℃冰箱取出装有100μl乳酸乳球菌细菌的EP管放于冰上融化，用预冷枪头吸入在冰上预冷的重组质粒10μl，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴5min。用预冷枪头将EP管内全部液体吸入放冰浴预冷的转化杯(间距0.1cm)样品槽中，放冰上5min。取出转化杯置于电转化仪内电击1次(电击参数为2KV，5ms)，立即取出电转杯放冰浴5min。加入700μl于37℃预温的MRS蔗糖肉汤于电转杯中，轻轻用枪头吹出样品槽内菌液并混匀，将电转杯内全部液体吸至无菌EP管中，于37℃静止培养3h。取200μl菌液于含红霉素5μg/ml，X-gal 40μg/ml的MRS平板(以下简称MRS-Ery-X-gal平板)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于30℃培养48～72h。阳性菌(L.lactis/pMG36e-lacZ)生长为蓝色菌落(见图11)。

(3)阳性克隆的鉴定

从待鉴定的阳性菌中提取重组质粒，以其为模板PCR鉴定其中的β-半乳糖苷酶基因片段。

①重组质粒的提取

待鉴定的阳性菌划线MRS-Ery-X-gal平板，30℃培养48h，挑取平板上菌落接种5ml含红霉素5μg/ml的MRS肉汤(以下简称MRS-Ery肉汤)，30℃ 220r/min培养12～16h。离心(12000r/min 1min/次)收集5ml菌液于1.5ml EP管中，弃上清，加入230μl溶菌酶溶液(25mg/ml)、20μl RNase A(4mg/ml)重悬菌沉淀，于37℃水浴作用1h。然后用Plasmid Miniprep kit提取质粒(按操作说明书，从第4步开始)。

②以重组质粒为模板PCR扩增β-半乳糖苷酶基因片段

按表7加样进行PCR扩增β-半乳糖苷酶基因片段。

表7 PCR扩增β-半乳糖苷酶基因片段

PCR扩增结果见图12，可见扩增得到了长度约为3.0kb的特异条带，与预期相符，表明pMG36e-lacZ已成功电转化乳酸乳球菌。

实施例3：重组质粒pMG36e-lacZ在大肠杆菌DH5α中的表达

重组质粒pMG36e-lacZ转化大肠杆菌DH5α后获得阳性菌E.coli DH5α/pMG36e-lacZ，测定该菌的β-半乳糖苷酶活性以研究重组质粒pMG36e-lacZ在大肠杆菌中的表达情况。

E.coli DH5α/pMG36e-lacZ划线LB-Ery-X-gal平板，37℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml LB-Ery肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h；E.coli DH5α划线LB平板，37℃培养24h，挑取平板上单菌落接种15ml LB肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h。分别取菌液10ml于50ml离心管中(10ml菌液/离心管)，4℃离心15000r/min 3min，弃上清，菌沉淀用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，最后加入10ml磷酸盐缓冲液重悬。将离心管置于冰上，用超声波破碎仪破壁，制备粗酶液。超声破壁条件为输出功率50W，脉冲持续时间6S，间隙2S，脉冲9次。按表8操作测定粗酶液中β-半乳糖苷酶活性。1个酶活性单位(U)定义为在37℃下每分钟分解出1μmolONP所需的酶量。

表8 β-半乳糖苷酶活性测定

试剂(ml)	试验组	空白对照
			样品磷酸盐缓冲液	0.10.9	0.10.9
混合，于37℃预温5min
			ONPG溶液1mol/L Na2CO3ONPG溶液	5混合，于37℃精确保温10min2-	-不保温，立即加25

于25℃静置15min，以空白调零，测定试验管A₄₂₀。

按下式计算酶活性(U/ml)：

$U/\mathrm{ml}=\frac{A_{420}\×8}{4.45\×t\×v}$ t：酶促反应时间；v：样品体积

用总蛋白测定试剂盒测定粗酶液中总蛋白浓度(pro mg/ml)，将结果换算为酶比活性(U/mg pro)：

$U/\mathrm{mg\; pro}=\frac{U/\mathrm{ml}}{\mathrm{promg}/\mathrm{ml}}$

酶活测定结果见表9，图13。

表9 E.coli DH5α和E.coli DH5α/pMG36e-lacZ的β-半乳糖苷酶活测定

菌株	酶活性(U/ml粗酶液)	酶比活性(U/mg pro)
			E.coli DH5α/pMG36e-lacZ 1#E.coli DH5α/pMG36e-lacZ 2#E.coli DH5α	4.7553.077-	8.5376.939-

注：-：无法检出；1^#和2^#菌株中插入的β-半乳糖苷酶基因片段扩增自不同的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株；表中数据均为5次测定的平均值。

酶活测定结果表明，重组质粒pMG36e-lacZ转化大肠杆菌DH5α后，可在其中表达产生具有活性的β-半乳糖苷酶。

实施例4：重组质粒pMG36e-lacZ在乳酸乳球菌中的表达

重组质粒pMG36e-lacZ转化乳酸乳球菌后获得阳性菌L.lactis/pMG36e-lacZ，测定该菌的β-半乳糖苷酶活性以研究重组质粒pMG36e-lacZ在乳酸乳球菌中的表达情况。

L.lactis/pMG36e-lacZ划线MRS-Ery-X-gal平板，30℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml MRS-Ery肉汤，30℃ 220r/min振荡培养24h；L.lactis划线MRS平板，30℃培养48h，挑取平板上菌落接种15ml MRS肉汤，30℃ 220r/min振荡培养24h。按实施例3中方法测定和计算粗酶液中β-半乳糖苷酶活性，不同之处仅为制备粗酶液时的超声破壁条件改为输出功率50W，脉冲持续时间6S，间隙2S，脉冲13次。

酶活测定结果见表10，图14。

表10 L.lactis和L.lactis/pMG36e-lacZ的β-半乳糖苷酶活测定

菌株	酶活性(U/ml粗酶液)	酶比活性(U/mg pro)
			L.lactis/pMG36e-lacZ 1#L.lactis/pMG36e-lacZ 2#L.lactis	1.5781.469-	16.9715.84-

注：-：无法检出；1^#和2^#菌株中插入的β-半乳糖苷酶基因片段扩增自不同的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株；表中数据均为5次测定的平均值。

酶活测定结果表明，重组质粒pMG36e-lacZ转化乳酸乳球菌后，可在其中表达产生具有活性的β-半乳糖苷酶。

实施例5：重组质粒表达的蛋白非融合性分析

本发明的技术创新为采用非融合表达技术，在扩增β-半乳糖苷酶基因片段时，将其上游的一段长18bp的序列(SEQ ID NO.1)一起扩增出来，SEQ ID NO.1含有SD序列，可实现在融合表达载体上进行非融合蛋白表达。采用的上下游引物序列如下：上游引物lacZf1：5‘-GCGTCTAGAGAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3’，下游引物lacZr1：5‘-GCGCTGCAGTTATTTTAGTAAAAGGGGCTGA-3’。

利用该引物扩增所得的基因插入pMG36e后的翻译偶联调控片段各元件组成见图15。从图中可见，如果SEQ ID NO.1中的SD序列不能被宿主菌识别，那么蛋白的表达将是融合表达，即从载体来源起始密码ATG开始进行翻译，此时β-半乳糖苷酶蛋白的三联密码将出现移位，即β-半乳糖苷酶蛋白的起始密码将发生错位，结果将导致翻译出完全错误的蛋白。只有在进行非融合表达即从β-半乳糖苷酶蛋白起始密码ATG进行翻译才可能得到具有酶活性的蛋白。实施例3和4中酶活测定结果可证实，本发明构建的重组质粒确能表达非融合的β-半乳糖苷酶。

实施例6：阳性菌与基因初始菌的β-半乳糖苷酶活性比较

E.coli DH5α/pMG36e-lacZ划线LB-Ery-X-gal平板，37℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml LB-Ery肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h；L.lactis/pMG36e-lacZ划线MRS-Ery-X-gal平板，30℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml MRS-Ery肉汤，30℃ 220r/min振荡培养24h；德氏乳杆菌保加利亚亚种划线MRS平板，37℃培养48h，挑取平板上单菌落接种15ml MRS肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h。按实施例3和实施例4方法测定和计算各菌β-半乳糖苷酶活性，其中保加利亚乳杆菌粗酶液制备中采用的超声破壁条件同实施例4。结果见表11。

表11 阳性转化菌及基因初始菌的β-半乳糖苷酶活测定

菌株	酶活性(U/ml粗酶液)	酶比活性(U/mg pro)
			E.coli DH5α/pMG36e-lacZL.lactis/pMG36e-lacZ德氏乳杆菌保加利亚亚种	4.7551.5780.401	8.53716.976.169

注：表中数据均为5次测定的平均值。

从表中可见，携带pMG36e-lacZ质粒的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶活性为基因初始菌的11.86倍，酶比活性为基因初始菌的1.38倍；携带pMG36e-lacZ质粒的乳酸乳球菌的β-半乳糖苷酶活性为基因初始菌株的3.94倍，酶比活性为基因初始菌的2.75倍，表明pMG36e-lacZ质粒可在大肠杆菌和乳酸乳球菌中高效表达β-半乳糖苷酶。

实施例7：阳性菌与基因初始菌的β-半乳糖苷酶分泌率比较

E.coli DH5α/pMG36e-lacZ划线LB-Ery-X-gal平板，37℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml LB-Ery肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h；L.lactis/pMG36e-lacZ划线MRS-Ery-X-gal平板，30℃培养48h，挑取平板上蓝色菌落接种15ml MRS-Ery肉汤，30℃ 220r/min振荡培养24h；德氏乳杆菌保加利亚亚种划线MRS平板，37℃培养48h，挑取平板上单菌落接种15ml MRS肉汤，37℃ 220r/min振荡培养24h。分别取菌液10ml于50ml离心管中(10ml菌液/离心管)，4℃离心15000r/min 3min，分别收集菌沉淀和上清于洁净试管中。按实施例3，实施例4和实施例6中方法测定和计算粗酶液中β-半乳糖苷酶活性，同时按表8操作测定上清液中β-半乳糖苷酶活性。按下式计算酶分泌率：

结果见表12，图16。

表12 阳性转化菌及基因初始菌的β-半乳糖苷酶分泌率测定

菌株	酶活性(U/ml粗酶液)	酶活性(U/ml上清液)	酶分泌率(％)
				E.coli DH5α/pMG36e-lacZL.lactis/pMG36e-lacZ德氏乳杆菌保加利亚亚种	4.7551.5780.401	-0.5870.012	-27.13.0

注：-：无法检出；表中数据均为5次测定的平均值。

结果表明，本发明所述的pMG36e-lacZ质粒在乳酸乳球菌中表达的β-半乳糖苷酶能部分分泌到胞外，其分泌率最高可达27.1％，显著高于基因初始菌(3％)。

                          SEQUENCE  LISTING

<110>四川大学

<120>可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用

<160>3

<170>PatentIn Version 3.2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)

<400>1

gaagggaaga attagaaa 18

<210>2

<211>3024

<212>DNA

<213>德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)

<400>2

atgagcaata agttagtaaa agaaaaaaga gttgaccagg cagacctggc ctggctgact  60

gacccggaag tttacgaagt caatacaatt cccccgcact ccgaccatga gtccttccaa  120

agccaggaag aactggagga gggcaagtcc agtttagtgc agtccctgga cggggactgg  180

ctgattgact acgctgaaaa cggccaggga ccagtcaact tctatgcaga agactttgac  240

gatagcaatt ttaagtcagt caaagtaccc ggcaacctgg aactgcaagg ctttggccag  300

ccccagtatg tcaacgtcca atatccatgg gacggcagtg aggagatttt cccgccccaa  360

attccaagca aaaatccgct cgcttcttat gtcagatact ttgacctgga tgaagctttc  420

tgggacaagg aagtcagctt gaagtttgac ggggcggcaa cagccatcta tgtctggctg  480

aacggccact tcgtcggcta cggggaagac tcctttaccc caagcgagtt tatggttacc  540

aagttcctca agaaagaaaa taaccgcctg gcagtggctc tctacaagta ttcttccgcc  600

tcctggctgg aagaccagga cttctggcgc atgtctggtt tgttcagatc agtgactctt  660

caggccaagc cgcgtctgca cttggaggac cttaagctta cggccagctt gaccgataac  720

taccaaaaag gaaagctgga agtcgaagcc aatattgcct accgcttgcc aaatgccagc  780

tttaagctgg aagtgcggga tagtgaaggt gacttggttg ctgaaaagct gggcccaatc  840

agaagcgagc agctggaatt cactctggct gatttgccag tagctgcctg gagcgcggaa  900

aagcctaacc tttaccaggt ccgcctgtat ttataccagg caggcagcct cttagaggtt  960

agccggcagg aagtgggttt ccgcaacttt gaactaaaag acgggattat gtaccttaac  1020

ggccagcgga tcgtcttcaa gggggccaac cggcacgaat ttgacagtaa gttgggtcgg  1080

gctatcacgg aagaggatat gatctgggac atcaagacca tgaagcgaag caacatcaat  1140

gctgtccgct gctctcacta cccgaaccag tccctctttt accggctctg tgacaagtac  1200

ggcctttacg tcattgatga agctaacctg gaaagccacg gcacctggga aaaagtgggg  1260

gggcacgaag atcctagctt caatgttcca ggcgatgacc agcattggct gggagccagc  1320

ttatcccggg tgaagaacat gatggctcgg gacaagaacc atgcttcaat cctaatctgg  1380

tctttaggca atgagtctta cgccggcact gtctttgccc aaatggctga ttacgtccgg  1440

aaggctgatc cgacccgggt tcagcactat gaaggggtga cccacaaccg gaagtttgac  1500

gacgccaccc agattgaaag ccggatgtat gctccggcca aggtaattga agaatacttg  1560

accaataaac cagccaagcc atttatctca gttgaatacg ctcacgccat gggcaactcc  1620

gtcggtgacc tggccgccta cacggccctg gaaaaatacc cccactacca gggcggcttc  1680

atctgggact ggattgacca aggactggaa aaagacgggc acctgcttta tgggggcgac  1740

ttcgatgacc ggccaaccga ctatgaattc tgcgggaacg gcctggtctt tgctgaccgg  1800

actgaatcgc cgaaactggc taatgtcaag gccctttacg ccaaccttaa gttagaagta  1860

aaagatgggc agctcttcct caaaaacgac aatttattta ccaacagctc atcttactac  1920

ttcttgacta gtcttttggt cgatggcaag ttgacctacc agagccggcc tctgaccttt  1980

ggcctggagc ctggcgaatc cgggaccttt gccctgcctt ggccggaagt cgctgatgaa  2040

aaaggggagg tcgtctaccg ggtaacggcc cacttaaaag aagacttgcc ttgggcggat  2100

gagggcttca ctgtggctga agcagaagaa gtagctcaaa agctgccgga atttaagccg  2160

gaagggcggc cagatttagt tgattccgac tacaacctag gcctgaaagg aaataacttc  2220

caaattctct tctccaaggt caagggctgg ccggtttccc tcaagtatgc cggtagggaa  2280

tacttgaagc ggctgccgga atttaccttc tggcgggccc tgacggacaa cgaccgggga  2340

gctggttacg gctatgatct ggcccggtgg gaaaatgccg gcaagtatgc ccgcttgaaa  2400

gacatcagct gcgaggtcaa ggaagactcc gttttggtca agactgcctt tacgttgcct  2460

gtcgccttaa agggtgattt aaccgtgacc tatgaagtcg atggacgggg caagattgct  2520

gtaacagctg acttcccagg cgcggaagaa gctggtctct tgccagcctt tggcttgaac  2580

ctggccctgc caaaagaact gaccgattac cgctactatg gtctgggacc taatgagagc  2640

tacccagacc gcttggaagg taattacctg ggcatctacc agggagcggt aaaaaagaac  2700

tttagcccat atcgtccgca ggaaacgggc aaccggagca aggttcgctg gtaccagctc  2760

tttgatgaaa agggcggctt ggaatttacg gccaatgggg cagacttgaa cttgtctgct  2820

ttgccatatt ctgccgccca aattgaagca gcggaccacg cttttgaact gactaacaat  2880

tacacttggg ttagagcctt aagcgcccag atgggggtcg gcggggatga ctcctggggg  2940

cagaaggtcc acccggaatt ctgcctggat gctcaaaaag cccgccagct tcgcctggtg  3000

attcagcccc ttttactaaa ataa                                         3024

<210>3

<211>3042

<212>DNA

<213>德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)

<400>3

gaagggaaga attagaaaat gagcaataag ttagtaaaag aaaaaagagt tgaccaggca  60

gacctggcct ggctgactga cccggaagtt tacgaagtca atacaattcc cccgcactcc  120

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tccctggacg gggactggct gattgactac gctgaaaacg gccagggacc agtcaacttc  240

tatgcagaag actttgacga tagcaatttt aagtcagtca aagtacccgg caacctggaa  300

ctgcaaggct ttggccagcc ccagtatgtc aacgtccaat atccatggga cggcagtgag  360

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gacctggatg aagctttctg ggacaaggaa gtcagcttga agtttgacgg ggcggcaaca  480

gccatctatg tctggctgaa cggccacttc gtcggctacg gggaagactc ctttacccca  540

agcgagttta tggttaccaa gttcctcaag aaagaaaata accgcctggc agtggctctc  600

tacaagtatt cttccgcctc ctggctggaa gaccaggact tctggcgcat gtctggtttg  660

ttcagatcag tgactcttca ggccaagccg cgtctgcact tggaggacct taagcttacg  720

gccagcttga ccgataacta ccaaaaagga aagctggaag tcgaagccaa tattgcctac  780

cgcttgccaa atgccagctt taagctggaa gtgcgggata gtgaaggtga cttggttgct  840

gaaaagctgg gcccaatcag aagcgagcag ctggaattca ctctggctga tttgccagta  900

gctgcctgga gcgcggaaaa gcctaacctt taccaggtcc gcctgtattt ataccaggca  960

ggcagcctct tagaggttag ccggcaggaa gtgggtttcc gcaactttga actaaaagac  1020

gggattatgt accttaacgg ccagcggatc gtcttcaagg gggccaaccg gcacgaattt  1080

gacagtaagt tgggtcgggc tatcacggaa gaggatatga tctgggacat caagaccatg  1140

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ccagcctttg gcttgaacct ggccctgcca aaagaactga ccgattaccg ctactatggt  2640

ctgggaccta atgagagcta cccagaccgc ttggaaggta attacctggg catctaccag  2700

ggagcggtaa aaaagaactt tagcccatat cgtccgcagg aaacgggcaa ccggagcaag  2760

gttcgctggt accagctctt tgatgaaaag ggcggcttgg aatttacggc caatggggca  2820

gacttgaact tgtctgcttt gccatattct gccgcccaaa ttgaagcagc ggaccacgct  2880

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ggggatgact cctgggggca gaaggtccac ccggaattct gcctggatgc tcaaaaagcc  3000

cgccagcttc gcctggtgat tcagcccctt ttactaaaat aa                     3042

Claims (6)

1、一种可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒，其特征在于所含基因由编码β-半乳糖苷酶的基因及该基因上游含SD位点的调控序列组成，为序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒，其特征在于以质粒pMG36e为载体。

3、一种权利要求1所述的可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA为模板，扩增得到含上游调控序列的β-半乳糖苷酶基因；

(2)将上述扩增得到的β-半乳糖苷酶基因用Pst I、Xba I双酶切后与用同种酶双酶切并去磷酸化的载体连接并转化感受态大肠杆菌；

(3)筛选阳性大肠杆菌，提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进行测序。

4、根据权利要求3所述的可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒的构建方法，其特征在于构建质粒选用的载体为pMG36e。

5、权利要求1所述的可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒在制备β-半乳糖苷酶中的应用。

6、权利要求1所述的可表达和分泌β-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒在构建可表达β-半乳糖苷酶的乳酸菌株中的应用。

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