CN1306038C - 一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为“一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法”，属生物技术领域。本发明涉及的瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法，其特征是该方法应用改良的ASCM选择性培养基富集分离、免疫吸附磁性分离和(实时荧光)PCR相结合的方法，从而提高了灵敏度和准确性并且快速。还涉及改良的ASCM培养基配方、PCR引物序列、实时定量PCR的探针、哈密瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)ITS区部分序列、燕麦食酸菌卡特莱兰亚种(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)和麦食酸菌蘑芋亚种(Acidovorax avenae subsp.konjaci)16S-23S ITS全序列。本发明在哈密瓜等瓜类细菌性果斑病防治和种子带菌检测方面，具有很高的应用价值。

Description

一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。进一步，本发明涉及一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法。更进一步，本发明涉及应用选择性培养基富集分离、免疫吸附磁性分离病菌和PCR技术以使瓜类种子带菌检测快速、灵敏和准确。

背景技术

瓜类果斑病是由燕麦食酸西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(Willems，A.，Goar，M.et al.Int.J.Syst.Bacteriol.1992，42：107～119)引起的细菌性病害，该病病菌现已分布美国，澳大利亚，巴西、日本、马利亚纳群岛，印度尼西亚，土耳其等国家(赵廷昌，孙福在，王兵万，《植保技术与推广》，2001(3)：37～38)，寄主包括西瓜、哈密瓜、罗马甜瓜、黄瓜、南瓜、白兰瓜、蜜露洋香瓜和网文洋香瓜等多种瓜类(Walcott R R，Langston D B Jr.，F.H.Sanders，Jr.，et al.Plant Disease，2000，84(3)：372；Assouline，I.et al.Phytoparasitica，1997，25(2)：117～118；Martin H L，O’Brien R G.，Plant Disease，1999，10：965；O’Brien R G.，Martin H L.Australian Journalof Experimental Agriculture，1999，39：479～485.)。该病菌以人工接种，可以感染其他葫芦科(包括甜瓜、节瓜、瓠瓜、丝瓜、苦瓜、西葫芦等)、菠菜、番茄、胡椒及茄子等作物。该病为种子带菌病害，病菌可附着在瓜种子表面，也可以侵入种子的内部组织，带菌的种子成为本病的主要初侵染源，病菌于低温下在种子上可存活相当长的时间，带菌的种子保存在12℃下，经一年后传病率也没有降低。

以哈密瓜为例就可知此瓜类果斑病的严重危害性。哈密瓜又称厚皮甜瓜，汁多味甜，清凉爽口，深受消费者喜爱。哈密瓜作为新疆的主要特产闻名于世，种植面积60余万亩，年总产值12.64亿元，为新疆的经济发展发挥了非常重要的作用。哈密瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli(Schaad et al.)Willemset al.)是我国检疫性有害生物，该病为害叶片和果实，一般生产田发病率在45％以上，特别是在阴雨天较多，空气湿度大，露水大的天气条件下，该病迅速发展，并且可在暴风雨后1-2天大流行，其发病率高达100％。如果防治不及时，叶片会出现干枯，瓜被侵染，病菌进入瓜体内部，侵染瓜肉，成熟时腐烂。哈密瓜细菌性果斑病为种子带菌病害，近年在新疆和内蒙古发生严重，严重影响哈密瓜生产和瓜类种子的进出口贸易，该病的发生受到国内外专家的高度关注，因此必须建立快速准确灵敏的检测方法，对种子进行检验，防止病害的传播和危害。

种子带菌检测的方法很多，传统的种子传病原细菌的检测方法有：肉眼检测法、过筛检测法、比重检测法、解剖检测法、洗涤检测法、分离培养检测法、化学染色检测法、噬菌体检测法、生物测定检测法、离体培养检测法等。这些方法的基本特点是：精确度低，耗时长，灵敏度差。

应用血清学技术检测植物病原细菌已是一种成熟的技术，适合应用于种子带菌诊断，尤其是对大批量的种子进行检疫检测。主要方法有：酶联免疫吸附测定、直接琼脂双扩散、免疫放射分析法、免疫荧光分析法、免疫荧光菌落染色、免疫吸附免疫荧光、免疫分离法、免疫亲合分离。但血清学检测容易产生假阳性的结果。

近年来人们开始应用PCR的方法来对病菌进行鉴定和检测。PCR方法灵敏、准确、方便、快速，可在短时间内扩增出数百万个特异DNA序列的拷贝。目前研究人员已在检测种子带菌方面应用PCR技术做了大量工作，设计得到了大量相关引物。利用特异引物的新方法使细菌性病害检测能力得到加强。如用对16S和23S rRNA基因通用的引物来扩增病原物及其亲缘关系相近的细菌菌系，然后分析得到的扩增片段。基于对DNA序列数据的对比分析，特别是非同源部分的表现分析，可设计特异引物用专一性检测某病原。

现已证明PCR要比ELISA或免疫荧光等方法检测病原要灵敏得多。免疫学和PCR技术相结合的检测方法包括免疫PCR和免疫磁性分离-PCR。免疫磁性分离所用的磁性免疫微球(IMMS)是近年发展起来的一类新型功能性材料，它是磁性微球(MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小，比表面积大，故而偶联容量较高，悬浮稳定性较好，便于各种反应高效而方便地进行；又因其具有顺磁性，在外电场的作用下固液相的分离十分简单，可省去过滤、离心等繁杂操作，并可在磁场作用下定位，方便地进行分离同配体相对应的物质。该方法应用于种子带菌检测的具体做法是：包被于IMMS上的抗体选择性吸附目标菌，洗掉未吸附的污染物，然后对目标菌扩增培养，进行PCR扩增目的片段，根据所得结果判断目标菌是否存在。对病原菌的检测也可以在液体或固体培养基内进行预富集后进行PCR(即BIO-PCR)，可获得更强的敏感性。BIO-PCR作为PCR的一种辅助手段，正越来越多地被人们所采用(Schaad N W，Berthier-Schaad Y，Sechler A，et al.Plant Dis.，1999，83：1095～1100.)。实时荧光定量PCR的出现，成为DNA或RNA检测方法的又一突破性进步。实时PCR技术已开始在医学、生物学领域中使用(Stead D E，Elphinstone J G，Simpkins S，et al.Phytopathology92：S110.Publication no.P-2002-0120-SSA)。

目前已有的种子带菌单项检测技术都有自己的优点，但单项技术也存在漏检和假阳性问题，结合生物学、免疫学和分子生物学技术，我们提出BIO-免疫磁性分离-PCR技术(BIO-IMS-PCR)，BIO-IMS-PCR的特点是对目标菌进行三步逐级检测：一是选择性培养基的筛选作用，二是血清的免疫富集作用，三是PCR特异性扩增作用。经过逐级检测，能够提高灵敏度，防止检测时的漏检和假阳性。这一检测目标细菌技术，与在种子带菌检测上已用的多种方法如种植、选择性培养基、ELISA的检测方法、IMS-PCR方法、BIO-PCR方法、实时PCR相比，更加准确和灵敏。哈密瓜种子带菌BIO-IMS-PCR检测技术可为瓜类细菌性果斑病种子带菌的快速检验提供技术支持，对保障我国种子贸易和哈密瓜等瓜类的安全生产具有重要意义。

发明内容

针对上述各种种子带菌检测技术中存在的问题，本发明的目的是为瓜类种子带细菌性果斑病菌提供一种快速、可靠和灵敏的检测方法。本发明通过应用生物特性分离培养技术、免疫学技术、免疫磁性分离-聚合酶链式反应(IMS-PCR)技术以及实时定量PCR(Real-time PCR)相结合的技术检测目标细菌，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法相比，更能够省时、省空间、准确、灵敏。因此可有益于对瓜类种子带果斑病菌进行带菌检验，以防止病害的传播和危害。

一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法，其特征是该方法结合了如下步骤：①应用选择性培养基进行富集、筛选和分离；②应用免疫吸附磁性分离技术进行免疫富集；③应用PCR技术进行特异性扩增，其中所说的选择性培养基是改良的ASCM培养基，其组成配方和配制过程为：

KH₂PO₄                0.5g

Na₂HPO₄·12H₂O       2.0g

(NH₄)₂SO₄            2.0g

己二酸二胺               5g

酵母浸膏                 10g

MgSO₄·7H₂O           29mg

CaCl₂                   51mg

Na₂MoO₄·2H₂O        25mg

BTB(溴麝香草酚蓝)        12.5mg

琼脂                     15g

加水至1000ml，调pH为7.0～7.2之间，121℃灭菌20分钟；

冷却后加入：

氨苄青霉素         20mg

苯氧乙基青霉素     100mg

新生霉素           5mg

放线菌酮           25mg；

ASCM液体培养基除不含琼脂外，其他成分与固体培养基相同。

其中所说的应用PCR技术是在PCR中应用具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的一对引物序列。

其中所说的应用PCR技术是在实时荧光PCR中应用具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列的探针。

其中所说的应用PCR技术是在PCR中应用SEQ ID NO 5所示的DNA序列。

其中所说的应用PCR技术是在应用实时荧光PCR技术中应用具有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的DNA序列。

1.果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的分离培养检测

选常规供试菌株(见表1和表2，供试菌株由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室保存提供)在KB培养基上活化后在改良的ASCM培养基上划线培养，于37℃培养48小时，观察并记录菌株生长情况。制备果斑病菌株的3×10⁴CFU/ml菌悬液，吸取100μl置于ASCM液体培养基中于37℃，200rpm培养。每3小时吸取培养液100μl，连续取10次，涂布于KB培养基上，37℃培养48小时后记录菌落个数。通过菌落数绘制的生长曲线图。

                    表1  供试果斑病(靶标)菌株

代号	菌株学名	中文名
			Aacw1Aacw2Aac5Aac13Aac14Pslb-1～16Pslb-18～31Pslb-33～42Pslb-44～56Pslb-60～76Pslb-81～847500	Acidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulliAcidovorax avenae subsp.citrulli	燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种燕麦食酸菌西瓜亚种

                    表2  供试非果斑病(非靶标)菌株

代号	菌株学名	中文名
			2826773331832584C.m.m	Acidovorax avenae subsp.cattleyaeA.avenae subsp.konjaciA.avenae subsp.avenaeCurtobacterium flaccumfaciens pv.FlaccumfaciensClavibacter michiganensis subsp.	燕麦食酸菌卡特莱兰亚种燕麦食酸菌蘑芋亚种燕麦食酸菌燕麦亚种萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种密执安棒形杆菌密执安亚种

C.m.sEccZ4-215231411850JM109Psl-1Psl-2Psl-8Psp5Pst47Pst42SM-15B-139352814283530233113245221895707ISL4TE-6P041SDTB00224

michiganensisC.michiganensis subsp.sepedonicumErwinia carotovora subsp.carotovoraE.carotovora subsp.atrosepticaE.hebicolaE.ananasEscherichia coliPseudomonas syringae pv.lachrymansP.syringae pv.lachrymansP.syringae pv.lachrymansP.syringae pv.phaseolicolaP.syringae pv.tomatoP.syringae pv.tomatoP.syringae subsp.savastanoiP.syringae pv.maculicolaP.syringae pv.maculicolaP.syringae pv.apiiP.syringae pv.tabaciP.syringae pv.syringaeP.syringae pv.coronafaciensP.syringae pv.pisiP.syringae pv.glycineaP.cichoriiP fluorescens biovar IIRalstonia(Pseudomonas)solonacearumRalstonia(Pseudomonas)solanacearumXanothomonas oryzae pv.oryzicolaXanothomonas oryzae pv.oryzae

密执安棒形杆菌环腐亚种胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种草生欧文氏菌凤梨腐烂病欧文氏菌大肠杆菌丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌菜豆致病变种丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌萨氏亚种丁香假单胞菌斑点致病变种丁香假单胞菌斑点致病变种丁香假单胞菌芹致病变种丁香假单胞菌烟草致病变种丁香假单胞菌丁香致病变种丁香假单胞菌燕麦晕斑致病变种丁香假单胞菌豌豆致病变种丁香假单胞菌大豆致病变种菊苣假单胞菌荧光假单胞菌II型茄假单胞菌茄假单胞菌油菜黄单胞菌水稻生致病变种油菜黄单胞菌水稻致病变种

Xcm6XV14008

X.campestris pv.malvacearumX.campestris pv.vesicatoriaX.campestris pv.campestris

油菜黄单胞菌锦葵致病变种油菜黄单胞菌疱斑致病变种油菜黄单胞菌油菜致病变种

改良的ASCM(Acidovorax avenae subsp.citrulli Semiselective Culture Medium)培养基的制备：依照白川隆(白川隆，《日本NARO(National Agriculture andBio-oriented Research Organization)报告》，2003)提供的培养基成分，根据我国果斑病菌的特性，经过多次摸索，确定最合适的改良ASCM培养基成分和制作方法为：

KH₂PO₄                0.5g

Na₂HPO₄·12H₂O       2.0g

(NH₄)₂SO₄            2.0g

己二酸二胺               5g

酵母浸膏                 10g

MgSO₄·7H₂O           29mg

CaCl₂                   51mg

Na₂MoO₄·2H₂O        25mg

BTB(溴麝香草酚蓝)        12.5mg

琼脂                     15g

加水至1000ml。调pH为7.0～7.2之间，121℃灭菌20分钟；

冷却后加入：

氨苄青霉素            20mg

苯氧乙基青霉素        100mg

新生霉素              5mg

放线菌酮              25mg

ASCM液体培养基除不含琼脂外，其他成分与固体培养基相同。

2.果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的免疫学检测

参照《兽医微生物学及免疫学技术》(曹澍泽等，北京：北京农业大学出版社，1992)、《植病研究方法》(方中达，北京：中国农业出版社，1998)、《精编分子生物学实验指南》(F·奥斯伯等，北京：科学出版社，1998)中的方法进行菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备、菌体全蛋白抗原的制备、免疫家兔、测定血清效价、抗体专一性(试管凝集法、间接ELISA法)、间接ELISA法测定抗原的检测精度和模拟种子带菌检测精度。

模拟种子带菌悬液的配制：

取1000粒健康瓜种子，放入250ml三角瓶中，盖上棉塞，在121℃下高压灭菌20分钟，向其中加入PBS(pH 7.4)100ml，室温下200rpm摇动4小时，移去种子，用种子浸泡液配制成的Pslb-27的3×10⁸CFU/ml菌悬液，以模拟种子带菌悬液。

3.细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的常规PCR检测

参照《精编分子生物学实验指南》，采用CTAB法提取所有靶标及非靶标细菌的染色体DNA。

以2826和7733染色体DNA为模板，引物采用已报道的16S-23S rDNA ITS的通用(简并)引物(Borneman J，Triplett E W.，Applied and Environmental Microbiology，1997，63(7)：2647～2653；Fisher M M，Triplett E W.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(10)：4630～4636)，由上海生工生物公司(中国上海市松江工业区茸兴路111号)合成。参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋，北京：高等教育出版社，1993)进行PCR扩增ITS。其中：

Primer1(+)(正向引物)：5’TGYACACACCGCCCGT 3’16bp(小亚基rDNA通用序列)

Primer1(-)(反向引物)：5’GGGTTBCCCCATTCRG 3’16bp(细菌23SrDNA通用序列)

注：Y＝C/T，B＝G/T/C，R＝A/G

按照天为时代公司(中国北京清华大学学研大厦B座1115室)提供的PCRFragment Recovery Kit使用说明书进行PCR产物的回收。

PCR回收产物与pMD18-T克隆载体连接，置于16℃反应2～4h后取5μl用于转化。参照《现代分子生物学实验技术》进行大肠杆菌JM109感受态细胞的制备。转化参照Promega公司(277 Granada Drive，San Luis Obispo CA 93401，USA)的《Protocols and Applications Guide》(1996，Promega Corporation)进行连接产物转化JM109感受态细胞。碱裂解法提取重组质粒、重组质粒的PCR鉴定、重组质粒的酶切鉴定、采用Sanger双脱氧终止法对经鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序由上海博亚生物技术有限公司(中国上海市龙吴路1594号)完成。使用ITS通用(简并)引物，以2826和7733菌株的染色体DNA为模板进行PCR，分别得到长度为897bp和872bp的片段。经过PCR产物的回收、与pMD18-T载体连接、转化大肠杆菌JM109、提取重组质粒并检测、测序和拼接，获得两个亚种16S-23S rDNA ITS的全序列。

由于细菌的ITS区的DNA核酸序列决定种下分类的地位，即用各个菌株的ITS区DNA核酸序列可以鉴定和区分其菌株。根据Vector NTI v7.0对食酸菌属各亚种16S-23SrDNA间ITS序列比对的结果，分析2826和7733菌株ITS的编码功能。运用Beacon Designer 2.0和DNA Club等软件进行引物设计，共设计4对引物，最终经过实验检测，确定其中一对。

Primer1(+)(正向引物)：5’gttggaagaattcggtgctacc 3’    22bp

Primer1(-)(反向引物)：5’attcgtcattactgaatttcaacaag 3’26bp

使用所设计的果斑病菌引物进行引物专一性检测，以全部靶标菌和非靶标菌的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司(中国上海市松江工业区茸兴路111号)的Taq DNA Polymerase，选用Mg²⁺分装buffer，以50μl体系进行扩增。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，溴化乙锭染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。

使用所设计的果斑病菌引物，以菌株Pslb-27的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相应buffer，以50μl体系进行扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。经过PCR产物的回收、与pMD18-T载体连接、转化大肠杆菌JM109菌株、提取重组质粒并检测、测序，获得扩增产物的全序列。通过Vector NTI进行序列比对及分析，确定PCR产物确为16S-23S rDNA ITS序列，分析发现2个菌株ITS中均含有两个tRNA的编码序列，且编码的tRNA种类相同，分别为识别和运输异亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)的tRNA。

用无菌水配制果斑病菌菌株plsb-27的3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml离心管中，沸水煮15分钟。分别取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定以PSlb-27进行直接菌体PCR，其反应呈阳性的最小菌浓度。

取1000粒瓜种子，放入250ml三角瓶中，盖上棉塞，在121℃下高压灭菌20分钟，向其中加入用PBS(pH 7.4)100ml，室温下200rpm摇动培养4小时，移去种子，用种子浸泡液配制成Pslb-27的3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液，取1ml分别置于1.5ml离心管中，沸水煮15分钟，分别吸取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应。菌体PCR反应的体系和条件与上述PCR反应一致。PCR反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定模拟种子带菌检测的最小菌浓度。

4.免疫吸附PCR(IMS-PCR)检测果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)

使用MOPS与PBS同时对相同的种子浸泡液配置的菌悬液进行分离，并对结果进行比较。配制果斑病菌菌株Pslb-27的3×10⁵CFU/ml菌悬液，吸取100μl，分别置于100ml PBS(pH 7.4)、MOPS分离液和由PBS、MOPS制成的无菌种子浸泡悬液中，室温摇动培养4小时，吸取100ul，涂布KB平面培养基。37℃培养48小时，计数菌落个数。

用PBS(pH7.4)洗涤免疫磁珠(IMBs)3～4次，加入3ml PBS重悬磁珠，加入纯化的IgG 100μg，于4℃缓慢摇动孵育24h。用4ml PBS-BSA洗涤IMBs 3～4次，并将IMBs重悬于3ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1×10⁷个/ml。

将1000粒瓜种子灭菌，在无菌条件下加入100ml PBS中，于室温150rpm摇动培养2h，移去种子，保留悬浊液，用该悬浊液配制10⁵～10¹CFU/ml的菌悬液各1ml，置于1.5ml离心管中，用于模拟不同浓度的种子带菌分离液。免疫吸附果斑病菌(IMS)、处理后进行菌体PCR、电泳后在凝胶成像仪中检测，根据扩增结果确定检测瓜果斑病菌的最小浓度。将Pslb-27菌株及各种非靶标菌株分别用无菌水和MOPS种子浸泡液制成菌悬液，混合后各菌株终浓度约为3×10³CFU/ml，进行IMS-PCR，电泳检测结果。

5.实时定量PCR(Real-time PCR)检测瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)

依据瓜果斑病菌16S-23S ITS的引物之间的保守序列区，进行探针设计(5’ACGCTCTGCGGTAGGGCGAAGAAACC 3’)，如SEQ ID NO2所示。采用Pslb-27的染色体DNA为模板进行实时定量PCR，40循环后检测荧光曲线；在专一性测定中，以2μl煮沸15分钟的Pslb-27和非靶标菌的3×10⁸CFU/ml的菌悬液为模板进行实时定量PCR。

采用灭菌的种子浸泡液配制不同浓度的菌悬液，煮沸15分钟后，吸取2μl溶液作为实时定量PCR反应的模板，进行实时定量PCR。确定检测最小浓度。

6.瓜种子带菌快速检测方法的建立

带菌种子抽样的模拟，将健康瓜种子1000粒置于500ml三角瓶，121℃灭菌20分钟，商品种子不灭菌，待用。制备Pslb-273×10⁸CFU/ml菌悬液，浸泡无菌正常种子30分钟，于超净工作台吹干。将不同数量(灭菌)的种子放入三角瓶中，模拟0/1000，1/1000，5/1000，1/100带菌种子样本。模拟0/1000，1/1000商品种子的带菌样本。向含有不同带菌种子样本的三角瓶中加入MOPS分离液200ml，室温摇动培养4小时。吸取培养液1ml，置于100ml ASCM液体选择性培养基内，37℃摇动培养8小时。吸取1ml培养液，置于1.5ml EP管中。加入包被过的IMBs 50μl，室温缓慢摇动孵育1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5分钟，吸取上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15分钟，取2μl上清液用于常规PCR和实时定量PCR反应。确定检测精度。

本发明的有益效果：

本发明应用生物特性分离培养技术、免疫学技术、聚合酶链式反应(PCR)技术或实时定量PCR技术相结合的检测技术检测目标细菌，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法相比，更能够省时、省空间、准确、灵敏，更能建立快速、准确的种子带菌检测技术。该技术可应用于对瓜类种子带细菌性果斑病菌进行快速分子检测，可为瓜类的安全生产、种子引进和外销提供技术保障，具有实际的应用价值。

附图说明：

图1为Pslb-27在KB培养基上培养的菌落形态。

图2为Pslb-27在ASCM上培养的菌落形态。

图3为空白(左)与长有果斑病菌的ASCM培养基(右)对比。

图4为ASCM培养基的选择性效果测定。

图5为细菌细胞个数在ASCM中培养的变化曲线。

图6为菌体全蛋白抗原的SDS-PAGE电泳结果。

其中，道1、2分别代表Aac13；Pslb-27。

图7为试管凝集法检测Pslb-27抗菌体全蛋白血清效价的结果。

其中，管1～10管分别代表1∶20；1∶40；1∶80；1∶160；1∶320；1∶640；1∶1280；1∶2560；1∶5120；1∶10240。

图8为试管凝集法检测抗Pslb-27菌体抗原的抗血清的专一性。

其中，管1～12分别代表阴性对照；Pslb-27阳性对照；Pslb-3；Pslb-16；Aacwl；7500；Pslb-7；Pslb-11；Aac13；Pslb-60；Pslb-51；Pslb-82。

图9为部分非靶菌的试管凝集阴性反应。

其中，管1～9分别代表阴性对照；Pst47；008；SM-15；141；EccZ4-2；TE-6；Psl-1；Pslb-27阳性对照

图10为食酸菌属非靶标菌的假阳性试管凝集反应。

其中，管1～5分别为阴性对照；2826；7733；3183；Pslb-27阳性对照

图11为试管凝集反应中阳性与阴性反应对比。

其中，管1～6都为阳性反应；管7为阴性反应。

图12为部分靶标菌与非靶菌间接ELISA检测结果。

其中，A1-E7都为靶标菌株；E8、E9、E11、E12都为阴性对照；E10为Aac13阳性对照；Fl-612为非靶标菌，G8、G9、G10分别为2826；3183；7733。

图13为间接ELISA法对不同浓度Pslb-27抗原的检测结果。

其中，孔1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表3×10⁸CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10⁷CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10⁶CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10⁵CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10⁴CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10³CFU/ml Pslb-27菌悬液；3×10²CFU/mlPslb-27菌悬液；3×10¹CFU/ml Pslb-27菌悬液；空白对照。

图14为间接ELISA法进行模拟种子带菌(Pslb-27)检测的结果。

其中，孔1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表Pslb-273×10⁸CFU/ml的纯水菌悬液(阳性对照)；200μl模拟种子带菌悬液；150μl模拟种子带菌悬液；100μl模拟种子带菌悬液；50μ1模拟种子带菌悬液；10μl模拟种子带菌悬液；5μl模拟种子带菌悬液；1μl模拟种子带菌悬液；CK。

图15为部分菌株染色体DNA的电泳图谱。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8分别代表λDNA/HindIII；Aac13；Pslb-27；Pslb-10；7500；Pslb-14；Pslb-8；Pslb-30；Pslb-70。

图16为2826和7733的ITS PCR、重组质粒及质粒PCR检测电泳图谱。

其中，道M1、1、2、3、4、5、6、7、8、M2分别代表λDNA/HindIII；2826质粒；7733质粒；2826 ITS PCR；7733 ITS PCR；空白对照；2826质粒PCR；7733质粒PCR；空白对照；DNA Marker II(天为时代)。

图17以各菌株染色体DNA为模板进行PCR的结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别代表DNA Marker(天为时代)；Aac13；2826；3183；Pslb-27；7733；Psl-1；7500；B-1；Pslb-31；Pslb-50；CK。

图18部分靶标菌株DNA的PCR反应的电泳图谱。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别代表DNA Marker；Pslb-9；Pslb-10；Pslb-22；Pslb-25；Pslb-31；Pslb-35；Pslb-47；Pslb-48；Pslb-76；Pslb-84；CK。

图19重组质粒及其酶切、PCR检测结果。

其中，道M1、1、2、3、M2分别代表DNA/HindIII；质粒；质粒HindIII/EcoR I双酶切；质粒PCR；DNA marker。

图20Pslb-27扩增序列与国外报道Aac对应序列的单核苷酸差异。

图21扩增产物与报道序列的相似性和复杂性分析。

图22浓度梯度菌体PCR结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表DNA marker(天为时代)；Pslb-27DNA PCR；3×10⁸CFU/ml菌悬液；3×10⁷CFU/ml菌悬液；3×10⁶CFU/ml菌悬液、3×10⁵CFU/ml菌悬液、3×10⁴CFU/ml菌悬液、3×10³CFU/ml菌悬液、3×10²CFU/ml菌悬液；3×10¹CFU/ml菌悬液；无模板对照。

图23菌体PCR模拟种子检测结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表DNA marker；纯水3×10⁸CFU/ml菌悬液；3×10⁸种子浸泡液配制的菌悬液；3×10⁷种子浸泡液配制的菌悬液；3×10⁶种子浸泡液配制的菌悬液；3×10⁵种子浸泡液配制的菌悬液；3×10⁴种子浸泡液配制的菌悬液；3×10³种子浸泡液配制的菌悬液；3×10²种子浸泡液配制的菌悬液；3×10¹CFU/ml种子浸泡液配制的菌悬液；无模板对照。

图24MOPS与PBS细菌分离效果比较。

图25MOPS与PBS分离效果比较(菌落数)。

其中，左、右分别代表MOPS；PBS。

图26MOPS与PBS分离种子带菌的效果比较(菌落数)。

其中，左、右分别代表MOPS；PBS。

图27IMS-PCR模拟种子带菌检测结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7分别代表DNA Marker(天为时代)；3×10⁸CFU/ml菌体PCR；3×10⁵CFU/ml模拟种子带菌悬液；3×10⁴CFU/ml模拟种子带菌悬液；3×10³CFU/ml模拟种子带菌悬液；3×10²CFU/ml模拟种子带菌悬液；3×10¹CFU/ml模拟种子带菌悬液；无菌种子悬液。

图28多菌株及种子浸泡液配制的多菌株菌悬液进行IMS-PCR的检测结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6分别代表DNA marker；Pslb-27的3×10³CFU/ml菌悬液；含有Pslb-27及非靶标菌株的3×10³CFU/ml菌悬液；仅含非靶标菌株的3×10³CFU/ml菌悬液；含有Pslb-27及非靶标菌株的3×10³CFU/ml种子浸泡液；仅含非靶标菌株的3×10³CFU/ml种子浸泡液；无菌种子浸泡液。

图29以Pslb-27 DNA为模板进行实时PCR的荧光曲线。

图30用Pslb-27和非靶标菌的3×10⁸CFU/ml的菌悬液进行实时定量PCR的结果。

图31实时定量PCR模拟种子带菌检测。

图32模拟种子带菌IMS-PCR电泳结果。

其中，道M、1、2、3、4分别代表DNA Maker(天为时代)；10/1000；5/1000；1/1000；CK。

图33IMS-realtime-PCR检测中的荧光曲线。

图34商品种子带菌IMS-PCR检测电泳结果。

其中，道M、1、2、3分别代表DNA Marker(天为时代)；3×10⁸CFU/ml菌悬液；1/1000；未加带菌种子的CK。

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了哈密瓜细菌性果斑病菌特异性引物的设计、实时PCR探针、燕麦食酸菌卡特莱兰亚种(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)和蘑芋亚种(Acidovorax avenae subsp.konjaci)的2826菌株、7733菌株16S-23S ITS全序列、哈密瓜细菌性果斑病菌的部分165-23S ITS序列，然而这并不意味本发明的基因只限于用哈密瓜细菌性果斑病菌的检测。因此，使用本发明所描述的瓜细菌性果斑病菌的检测技术(BIO-免疫磁性分离-(实时荧光定量)PCR技术(BIO-IMS-PCR))，检测用引物，探针，燕麦食酸菌卡特莱兰亚种(Acidovoraxavenae subsp.cattleyae)和蘑芋亚种(Acidovorax avenae subsp.konjaci)的2826菌株、7733菌株16S-23S ITS全序列、哈密瓜细菌性果斑病菌的部分16S-23SITS序列及改良ASCM配方，以本领域普通技术人员所具有的任何涉及上述的引物、探针、序列、配方的方法检测其他作物病原细菌和其他方面的应用，均包括在本发明所要求的权利范围之内。由于本发明是对果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的检测，因此应用本发明对任何种子带果斑病菌的检测均也包括在本发明所要求的权利范围之内。

实施例1.哈密瓜果斑病菌的分离培养检测

选常规供试菌株(见以上表1和表2)在KB培养基上活化后在改良的ASCM培养基上划线培养，于37℃培养48小时，观察并记录菌株生长情况。制备果斑病菌株的3×10⁴CFU/ml菌悬液，吸取100μl置于ASCM液体培养基中于37℃，200rpm培养。每3小时吸取培养液100μl，连续取10次，涂布于KB培养基上，37℃培养48小时后记录菌落个数。

经过37℃下培养48小时发现，哈密瓜果斑病菌在KB培养基上形成的菌落(如图1所示)和在ASCM上形成的菌落(如图2所示)在形态和颜色上有所不同。三个靶标菌株Aac13、Pslb-27和Pslb-4均可长出大量菌落，且有菌落生长处的培养基呈现蓝色，如图3所示。而所有供试非靶标菌株在此培养基上均不能生长，如图4所示。与经过多次实验摸索，改良的ASCM哈密瓜细菌性果斑病菌选择性固体和液体培养基，均可专一性地培养出哈密瓜细菌性果斑病菌，而且长势较好，而其它近源或常见菌株在其上不能生长，初步达到分离培养的检测目的。

通过取样、涂布KB平板并在培养48小时后，计数菌落个数，确定哈密瓜果斑病菌Pslb-27在ASCM液体培养基的生长速率。每次吸取的100μl培养液中所含细菌个数，如表3所示。通过菌落数绘制的生长曲线图，如图5所示。测得了哈密瓜果斑病菌在ASCM培养基中培养初期的生长曲线，为后继实验中确定最佳的培养时间和细菌数量提供依据。

表3随时间增长，每100μl培养液内所含菌体细胞个数变化

取样次序	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											菌落数/100μl	14	32	106	138	216	323	757	1545	2538	5675

实施例2.哈密瓜果斑病菌的免疫学检测

参照《兽医微生物学及免疫学技术》、《植病研究方法》、《精编分子生物学实验指南》中的方法进行菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备、菌体全蛋白抗原的制备(图6)、免疫家兔、测定血清效价和抗体专一性(试管凝集法、间接ELISA法)、间接ELISA法测定抗原的检测精度和模拟种子带菌检测精度。

模拟种子带菌悬液的配制：

取1000粒健康哈密瓜种子，放入250ml三角瓶中，盖上棉塞，在121℃下高压灭菌20分钟，向其中加入PBS(pH 7.4)100ml，室温下200rpm摇动4小时，移去种子，用种子浸泡液配制成的Pslb-27的3×10⁸CFU/ml菌悬液，以模拟种子带菌悬液。

通过试管凝集法测定的Aac13和Pslb-27的菌体细胞抗原和全蛋白抗原的效价结果显示，均达到1∶1280，满足实验要求。如图7，为测定用Pslb-27菌体全蛋白制得的抗血清的效价。

试管凝集法和间接ELISA法结果发现哈密瓜细菌性果斑病菌所有菌株均呈阳性反应，与哈密瓜果斑病菌属同一种的2826、3183、7733三个亚种呈现假阳性反应，其余的非靶标菌株均呈阴性。图8所示为部分哈密瓜果斑病菌与抗血清的试管凝集反应阳性结果，图9显示了部分非靶标菌与血清反应的阴性结果，图10为2826，3183和7733与血清反应的假阳性结果。图11为阳性反应与阴性反应的结果比较。图12间接ELISA法结果，其对应的OD值如表4所示。

表4间接ELISA检测抗体专一性中各样本的OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													ABCDEFGH	2.0451.9321.9361.7391.8370.1240.012-0.091	1.8901.9381.8891.7661.8210.1080.099-0.090	1.9521.9341.9531.8431.8920.0090.016-0.091	1.9251.9051.8651.8811.8930.0010.065-0.088	1.9431.8661.8991.8741.9170.0130.103-0.092	1.9081.8451.8581.8131.7610.1270.049-0.090	1.9401.9011.9381.9061.8830.0010.009-0.089	1.8421.7991.7871.8880.1300.0261.179-0.085	1.9751.8551.9011.8230.1630.0251.279-0.086	1.9051.8951.4541.8641.8140.0150.989-0.088	1.9541.5661.8691.8740.0040.0010.010-0.083	1.8721.8661.7201.8300.0170.0270.011-0.081

注：A1-E7按照从左至右，从上至下顺序，依次为靶标菌株；E8、E9、E11、E12为阴性对照；E10为Aac13阳性对照；F1-G12为非靶标菌，其中G8、G9、G10分别为：2826、3183和7733。

经过实验测得，间接ELISA法检测抗原的最小浓度通过机器测定可达到约3×10⁵CFU/ml，如图13所示。但信号比较微弱，如表5所示。

                              表5间接ELISA检测靶标抗原精度中的OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													C	1.847	1.115	0.687	0.316	0.045	0.040	0.029	0.025	0.023	-0.064	-0.061	-0.065

注：1-8依次为3×10⁸～3×10¹CFU/ml Pslb-27菌悬液，9为空白对照。

用间接ELISA模拟种子带菌检测的精度为5μl3×10⁸CFU/ml细菌/种子悬液，如图14所示。其对应OD值如表6所示。

                                表6间接ELISA模拟种子带菌检测中的OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													E	1.163	0.870	0.635	0.521	0.503	0.470	0.423	0.175	0.091	0.031	0.021	0.012

注：1-9依次为Pslb-273×10⁸CFU/ml的纯水菌悬液(阳性对照)、200μl、150μl、100μl、50μl、10μl、5μl、1μl、阴性CK

实施例3.哈密瓜细菌性果斑病菌的常规PGR检测

参照《精编分子生物学实验指南》，采用CTAB法提取所有靶标及非靶标细菌的染色体DNA(图15为部分菌株染色体DNA)。

以2826和7733染色体DNA为模板，引物采用已报道的16S-23S rDNA ITS的通用(简并)引物(Borneman，et al.1997)(Fisher，et al.1999)，由上海生工生物公司合成。参照《现代分子生物学实验技术》进行PCR扩增ITS。

Primer1(+)(正向引物)：5’TGYACACACCGCCCGT 3’16bp(小亚基rDNA通用序列)

Primer1(-)(反向引物)：5’GGGTTBCCCCATTCRG 3’16bp(细菌23SrDNA通用序列)

注：Y＝C/T，B＝G/T/C，R＝A/G

按照天为时代公司提供的PCR Fragment Recovery Kit使用说明书进行PCR产物的回收。PCR回收产物与pMD18-T克隆载体连接，置于16℃反应2～4h后取5μl用于转化。参照《现代分子生物学实验技术》进行大肠杆菌JM109感受态细胞的制备。转化参照Promega公司的《Protocols and Applications Guide》(1996，PromegaCorporation)进行连接产物、转化JM109感受态细胞。碱裂解法提取重组质粒、重组质粒的PCR鉴定、重组质粒的酶切鉴定、采用Sanger双脱氧终止法对经鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序由上海博亚生物技术有限公司完成。使用ITS通用(简并)引物，以2826和7733菌株的染色体DNA为模板进行PCR，分别得到长度为897bp和872bp的片段。经过PCR产物的回收、与pMD18-T载体连接、转化大肠杆菌JM109、提取重组质粒并检测、测序和拼接，获得两个亚种16S-23SrDNA ITS的全序列。结果见图16。分析发现2个菌株ITS中均含有两个tRNA的编码序列，且编码的tRNA种类相同，分别为识别和运输异亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)的tRNA(表7)。

           表7食酸菌各亚种16S-23S rDNA ITS所含tRNA的分布情况

菌株	tRNA序	tRNA起点	tRNA终点	tRNA种类	反密码子
						2826282677337733	1212	223331223332	299406296404	IleAlaIleAla	GATTGCGATTGC

由于细菌的ITS区的DNA核酸序列决定种下分类的地位，即用各个菌株的ITS区DNA核酸序列可以鉴定和区分其菌株。根据Vector NTI v7.0对食酸菌属各亚种16S-23S rDNA间ITS序列比对的结果，运用Beacon Designer 2.0和DNA Club等软件进行引物设计，共设计4对引物，最终经过实验检测，确定其中一对。

Primer1(+)(正向引物)：5’gttggaagaattcggtgctacc 3’    22bp

Primer1(-)(反向引物)：5’attcgtcattactgaatttcaacaag 3’26bp

使用所设计的果斑病菌引物进行引物专一性检测，以全部靶标菌和非靶标菌的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司的Taq DNA Polymerase，选用Mg²⁺分装buffer，以50μl体系进行扩增。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，溴化乙锭染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。经过多次PCR，进行反应条件和Mg²⁺浓度的摸索，最终确定退火温度为60℃，Mg²⁺浓度为1.5mM。在此反应条件下进行PCR，以所有靶标菌株染色体DNA为模板的反应均成阳性，扩增产生448bp条带一条，而全部非靶标菌均呈阴性。图17，图18为以部分靶标和非靶染色体DNA为模板进行PCR的电泳结果。

使用所设计的果斑病菌引物，以菌株Pslb-27的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相应buffer，以50μl体系进行扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。经过PCR产物的回收、与pMD18-T载体连接、转化大肠杆菌JM109菌株、提取重组质粒并检测(图19)、测序，获得扩增产物的全序列。通过Vector NTI进行序列比对及分析，确定PCR产物确为16S-23S rDNA ITS序列。分析还发现我国分离的Pslb-27的ITS相应序列与国外报道的存在3个单核苷酸多态性，如图20和图21所示。

用无菌水配制果斑病菌菌株plsb-27的3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml离心管中，沸水煮15分钟。分别取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，(溴化乙锭)EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定以PSlb-27进行直接菌体PCR，其反应呈阳性的最小菌浓度约为3×10⁵CFU/ml，如图22所示。

取1000粒哈密瓜种子，放入250ml三角瓶中，盖上棉塞，在121℃下高压灭菌20分钟，向其中加入用PBS(pH 7.4)100ml，室温下200rpm摇动培养4小时，移去种子，用种子浸泡液配制成Pslb-27的3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液，取1ml分别置于1.5ml离心管中，沸水煮15分钟，分别吸取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应。菌体PCR反应的体系和条件与上述PCR反应一致。PCR反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。发现模拟种子带菌检测的最小菌浓度依然约为3×10⁵CFU/ml，但信号较弱，见图23。

实施例4.免疫吸附PCR(IMS-PCR)检测哈密瓜果斑病菌

使用MOPS与PBS同时对相同的种子浸泡液配置的菌悬液进行分离，并对结果进行比较。配制果斑病菌菌株Pslb-27的3×10⁵CFU/ml菌悬液，吸取100μl，分别置于100ml PBS(pH 7.4)、MOPS分离液和由PBS、MOPS制成的无菌种子浸泡悬液中，室温摇动培养4小时，吸取100ul，涂布KB平面培养基。37℃培养48小时，计数菌落个数。发现MOPS缓冲液对果斑病菌的分离效果强于PBS，细菌个数明显增加，表明果斑病菌可以在MOPS溶液中生长，如表8和图24、25、26所示。

                表8 MOPS与PBS细菌分离效果比较

原始菌浓度	542
			PBS缓冲液MOPS缓冲液	纯缓冲液分离效果527879	种子浸泡液分离效果426703

注：单位CFU/100μl

用PBS(pH7.4)洗涤免疫磁珠(IMBs)3～4次，加入3ml PBS重悬磁珠，加入纯化的IgG 100μg，于4℃缓慢摇动孵育24h。用4ml PBS-BSA洗涤IMBs 3～4次，并将IMBs重悬于3ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1×10⁷个/ml。

将1000粒哈密瓜种子灭菌，在无菌条件下加入100ml PBS中，于室温150rpm摇动培养2h，移去种子，保留悬浊液，用该悬浊液配制10⁵～10¹CFU/ml的菌悬液各1ml，置于1.5ml离心管中，用于模拟不同浓度的种子带菌分离液。免疫吸附果斑病菌(IMS)、处理后进行菌体PCR、电泳后在凝胶成像仪中检测，扩增结果显示检测哈密瓜果斑病菌的最小浓度约可达到3×10²CFU/ml，如图27所示。将Pslb-27菌株及各种非靶标菌株分别用无菌水和MOPS种子浸泡液制成菌悬液，混合后各菌株终浓度约为3×10³CFU/ml，进行IMS-PCR，电泳检测结果。结果表明对非靶标菌进行IMS-PCR均呈阴性，且其存在对IMS-PCR的结果没有影响。如图28所示。

实施例5.实时定量PCR(Real-time PCR)检测哈密瓜果斑病菌

依据哈密瓜果斑病菌16S-23SITS的引物之间的保守序列区，进行探针设计(5’ACGCTCTGCGGTAGGGCGAAGAAACC 3’)。采用Pslb-27的染色体DNA为模板进行实时定量PCR；在专一性测定中，以2μl煮沸15分钟的Pslb-27和非靶标菌的3×10⁸CFU/ml的菌悬液为模板进行实时定量PCR。以Pslb-27 DNA为模板进行实时定量PCR，40循环后检测荧光曲线，结果如图29所示，表明荧光探针可以正常使用。以煮沸15分钟后的Pslb-27和各非靶标菌3×10⁸CFU/ml的菌悬液2μl为模板进行实时PCR，结果显示，只有Pslb-27呈阳性反应，而各非靶标菌均呈阴性，其荧光曲线如图30所示。

采用灭菌的种子浸泡液配制不同浓度的菌悬液，煮沸15分钟后，吸取2μl溶液作为实时定量PCR反应的模板，进行实时定量PCR。其检测最小浓度仍约为3×10⁴CFU/ml，但其荧光信号明显变弱，且较不稳定。如图31所示。

实施例6.哈密瓜种子带菌快速检测方法的建立

带菌种子抽样的模拟，将健康哈密瓜种子1000粒置于500ml三角瓶，121℃灭菌20分钟，商品种子不灭菌，待用。制备Pslb-273×10⁸CFU/ml菌悬液，浸泡无菌正常种子30分钟，于超净工作台吹干。将不同数量的种子放入三角瓶中，模拟0/1000，1/1000，5/1000，1/100带菌种子样本。模拟0/1000，1/1000商品种子带菌样本。向含有不同带菌种子样本的三角瓶中加入MOPS分离液200ml，室温摇动培养4小时。吸取培养液1ml，置于100ml ASCM液体选择性培养基内，37℃摇动培养8小时。吸取1ml培养液，置于1.5ml EP管中。加入包被过的IMBs 50μl，室温缓慢摇动孵育1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5分钟，吸取上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15分钟，取2μl上清液用于常规PCR和实时定量PCR反应。经过分离、培养、IMS-PCR，发现每千粒种子中含有的一粒病种子仍可以检测到(见图32)。经过分离、培养、IMS-realtime-PCR，仍可检测出每千粒种子中含有的一粒病种子，即1粒带菌种子/1000粒仍呈阳性反应，结果如图33所示。经过分离、培养、IMS-PCR，发现每干粒商品种子中含有的一粒病种子仍可以检测到(见图34)。

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ ID NOl(哈密瓜细菌性果斑病菌检测用引物)：

正向引物(22bp)：5’gttggaagaa ttcggtgcta cc     3’

反向引物(26bp)：5’attcgtcatt actgaatttc aacaag 3’

SEQ ID NO2(哈密瓜细菌性果斑病菌检测用探针，26bp)：

5’acgctctgcg gtagggcgaa gaaacc 3’

SEQ ID NO 3(2826菌株16S-23S ITS全序列)：

tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagc gggttctgcc agaagtaggt agcctaaccg    60

taaggagggc gcttaccacg gcagggttcg tgactggggt gaagtcataa caaggtagcc    120

gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctggaaaa cagcattcaa tattgaacgc    180

ccacacttat cggttgttgg aagagtcggt gctaaccgac atgggtctgt agctcagctg    240

gttagagcac cgtcttgata aggcgggggt cgttggttcg agcccaacta gacccaccaa    300

atcttccgaa cataagatgc gaggatcagt gggggattag ctcagctggg agagcacctg    360

ctttgcaagc agggggtcgt cggttcgatc ccgtcatcct ccaccaaacg atatgctccg    420

cggtagggcg aagaaactaa caccaaagcg gcttcgcaag aggcctcttt gttgttggtc    480

cggtatagac cgggtcaatc ggctgttctt taaaaattca tagagtcgaa tcagcgttgc    540

cggcggaaag caggaaactg caccgtgccg tcggcaacaa taatttgatt gcgtcaaaac    600

gaatgttcaa ttgagcgaaa gctgattgaa attcagtaat gacgaattgt tctcgaggta    660

gcaataccga agaagaattc acattacggc ataacgcgcg aggtgaaaga cctcgcaagt    720

ccttgaaaga aagcggagat gtctcgcaag agatgtcaaa gttatagggt caagtgacta    780

agagcatgtg gtggatgcct tggcgatgat aggcgacgaa agacgtgata gcctgcgata    840

agcttcgggg agctggcaaa taagctttga tccggagatt tctgaatggg gaaaccc       897

SEQ ID NO 4(7733菌株16S-23S ITS全序列)：

tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagc gggttctgcc agaagtaggt agcctaaccg    60

taaggagggc gcttaccacg gcagggttcg tgactggggt gaagtcataa caaggtagcc    120

gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctggaaga cagcattcaa tattgaacgc    180

ccacacttat cggttgttgg aagaagtcgg tgcaaccgac atgggtctgt agctcagctg    240

gttagagcac cgtcttgata aggcgggggt cgttggttcg agcccaacta gacccaccaa    300

atacttccaa acatcagata cggggaatga agggggatta gctcagctgg gagagcacct    360

gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgtcatcc tccaccaaac aattgaagat    420

agaaatcaac accaaagagg ctttgtaaaa ggcttctttg ttgttgaccg gtattgaccg    480

gatcaatcgg ctgttcttta aaaattcata gagtcgaatc agcgttgtcg gcggaaagca    540

ggaaactgca ccgtgccgcc gacaactaat ttgattgcgt caaaacgaat taaggctttg    600

ctttatttca agtaatgacg aattgttctc gaggtagcga taccgaagaa acattcacat    660

tacggcttaa cgcgcgaggt gaaagacctc gcaagtcctt gaagtaaacg gagatatttc    720

gcaagagatg tcaaagttat agggtcaagt gactaagagc atgtggtgga tgccttggcg    780

atgataggcg aagaaagacg tgatagcctg cgataagctt cggggagctg gcaaacaagc    840

tttgatccgg agatttctga atggggaaac cc                                  872

SEQ ID NO 5(哈密瓜细菌性果斑病菌ITS区部分序列)：

ggaagaattc ggtgctaccc gacatgggtc tgtagctcag ctggttagag caccgtcttg    60

ataaggcggg ggtcgttggt tcgagcccaa ctagacccac caaatcttcc gaacataaga    120

tgcgaggatc agtgggggat tagctcagct gggagagcac ctgctttgca agcagggggt    180

cgtcggttcg atcccgtcat cctccaccaa ccaatacgct ctgcggtagg gcgaagaaac    240

caacaccaaa gcggcttcgc gagaggcctc tttgttgttg gtccggtata gaccggatca    300

atcggctgtt ctttaaaaat tcatagagtc gaatcagcgt tgccggcgga aagcaggaaa    360

ctgcaccgtg ccgccggtga caaaaatttg attgcgtcaa aacgaatatt caattgagcg    420

aaagcttgtt gaaattcagt aatgacga                                       448

Claims (5)

1.一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法，其特征是该方法结合了如下步骤：①应用选择性培养基进行富集、筛选和分离；②应用免疫吸附磁性分离技术进行免疫富集；③应用PCR技术进行特异性扩增，其中所说的选择性培养基是改良的ASCM培养基，其组成配方和配制过程为：

            KH₂PO₄                0.5g

            Na₂HPO₄·12H₂O       2.0g

            (NH₄)₂SO₄            2.0g

            己二酸二胺               5g

            酵母浸膏                 10g

            MgSO₄·7H₂O           29mg

            CaCl₂                   51mg

            Na₂MoO₄·2H₂O        25mg

            BTB(溴麝香草酚蓝)        12.5mg

            琼脂                     15g

            加水至1000ml，调pH为7.0～7.2之间，121℃灭菌20分钟；

            冷却后加入：

            氨苄青霉素               20mg

            苯氧乙基青霉素           100mg

            新生霉素                 5mg

            放线菌酮                 25mg；

            ASCM液体培养基除不含琼脂外，其他成分与固体培养基相同。

2.权利要求1的方法，其中所说的应用PCR技术是在PCR中应用具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的一对引物序列。

3.权利要求1的方法，其中所说的应用PCR技术是在实时荧光PCR中应用具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的探针。

4.权利要求1的方法，其中所说的应用PCR技术是在PCR中应用SEQ ID NO5所示的DNA序列。

5.权利要求1的方法，其中所说的应用PCR技术是在应用实时荧光PCR技术中应用具有SEQID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的DNA序列。

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