CN112011496A - 一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法 - Google Patents

一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法 Download PDF

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CN112011496A CN202010862658.9A CN202010862658A CN112011496A CN 112011496 A CN112011496 A CN 112011496A CN 202010862658 A CN202010862658 A CN 202010862658A CN 112011496 A CN112011496 A CN 112011496A
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李晓霞
宋艳
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，通过利用软件设计伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂引物；PCR扩增伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂，分别扩增两管；PCR扩增结束后，取全部产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂的融合及克隆；伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段与自杀质粒连接；pld基因缺失株的筛选(包括单交换菌株的筛选和双交换菌株的筛选)及鉴定。本发明采用不在目标菌的基因组中引入抗性基因的无痕缺失方法，构建了伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株。

Description

一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法。
背景技术
目前，我国山羊遭受伪结核棒状杆菌感染十分普遍，该病原感染主要引起干酪样淋巴结炎，造成山羊的生产性能下降，肉制品及皮张废弃等，严重山羊养殖业经济效益。伪结核棒状杆菌感染引起山羊致病与该病原表达大量的毒力因子密切相关，因此通过构建伪结核棒状杆菌目标毒力基因敲除菌株，对研究对应毒力因子在该病原致病中的作用与机制，以及基于关键毒力因子制备疫苗防控伪结核棒状杆菌均具有重要的意义。磷脂酶D(PLD，由pld基因编码)是伪结核棒状杆菌致病最重要的毒力因子。同源重组技术是构建伪结核棒状杆菌基因缺失株的经典技术，利用该技术已经有成功构建获得了伪结核棒状杆菌pld基因、Fag B基因、aro Q基因、Opp D基因和pho P基因缺失株的研究报道，但是这些研究中均使用了卡那霉素、氯霉素或红霉素等抗生素作为筛选标记，替换了相应的目的基因,且将这些抗性基因保留在目标菌中。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中均使用了卡那霉素、氯霉素或红霉素等抗生素作为筛选标记，替换了伪结核棒状杆菌中相应的目的基因,且将这些抗性基因保留在目标菌中。这些抗性基因的存在有可能影响缺失株的特性，并有潜在的生物安全隐患。
解决以上问题及缺陷的难度为：利用同源重组技术构建细菌的特定靶基因缺失株时，通常均需要两次同源重组筛选，其中的筛选条件常用抗性基因(如抗生素耐药基因)的引入，但是这些抗性基因引入后无法去除而保留在目标菌中，不仅具有潜在的生物安全隐患，不利于临床推广应用；而且采用这种方法很难实现伪结核棒状杆菌双基因、三基因甚至更多基因的敲除。解决以上问题及缺陷的意义为：通过无痕缺失手段，敲除pld基因，直接消除了引入其他抗性基因对伪结核棒状杆菌生物功能的影响，同时可以在pld基因无痕缺失基础上，进一步采用相同的方法缺失伪结核棒状杆菌的其他基因，为该病原同时缺失多个毒力基因，研制伪结核棒状杆菌基因工程弱毒菌苗提供了很好的思路。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，旨在通过无痕缺失方法构建伪结核棒状杆菌pld基因缺失菌株，为伪结核棒状杆菌pld基因功能研究及疫苗研发提供基础。
本发明是这样实现的，一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，所述伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，包括：
步骤一，参照GenBank中的伪结核棒状杆菌标准菌株ATCC 19410全基因组序列，利用Primer Premier 5软件设计伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂引物；
步骤二，PCR扩增伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂，分别扩增两管；PCR扩增结束后，取全部产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤三，伪结核棒状杆菌PLD基因上下游同源臂的融合及克隆；
步骤四，伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段与自杀质粒pK18mobsacB连接：以BamH I和Hind III限制性核酸内切酶对ZTOPO-T-Δpld和pK18mobsacB质粒进行双酶切；于30℃双酶切1h，37℃双酶切1h，取酶切后的DNA加5μL 6×Loadingbuffer，充分混匀后，于1％琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤五，自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌感受态细胞；
步骤六，pld基因缺失株的筛选包括单交换菌株的筛选及鉴定和双交换菌株的筛选及鉴定；
步骤七，伪结核棒状杆菌pld基因缺失株生物学功能评价，将马红球菌(ATCC6939)菌液沿鲜血琼脂平板的直径划线接种一条直线，然后将伪结核棒状杆菌野生型ATCC19410与缺失株ATCC 19410Δpld分别和马红球菌菌液垂直但不相交接种于鲜血琼脂平板上，待菌液干燥后，将鲜血琼脂平板于37℃倒置培养24h观察其溶血情况。
进一步，所述步骤一中，上、下游同源臂扩增片段长度分别为1326bp和970bp。
进一步，所述步骤二中，扩增上、下游同源臂的反应体系为ddH2O 16.375μL，bufferⅡ2.5μL，dNTP 2μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.125μL，DNA2μL，pld-N-F(pld-C-F)1μL，pld-N-R(pld-C-R)1μL；
分别扩增两管，反应条件为94℃30s预变性；94℃40s变性；55℃40s退火；72℃1min延伸；40个循环；72℃10min终末延伸，16℃保存。
进一步，所述步骤二中，获得pld基因上、下游同源臂扩增片段后，以基因组纯化试剂盒对pld基因上、下游同源臂进行DNA回收，并以1％琼脂糖凝胶电泳检测；pld基因上下游同源臂进行扩增结果，泳道1为pld基因上游同源臂，片段大小与1326bp相符，泳道2为pld基因下游同源臂，片段大小与970bp相符，说明同源臂片段扩增成功。
进一步，所述步骤三中，融合伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂；
(1)融合PCR第一步：
反应体系如下：
Figure BDA0002648665610000031
反应条件如下：
Figure BDA0002648665610000032
Figure BDA0002648665610000041
融合PCR第二步：
向第一步融合PCR体系中加入引物N-F 2μL，引物C-R 2μL，继续按上述条件完成30个循环，反应结束后，将融合PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；上、下游同源臂融合，成功扩增出2296bp左右的片段，与预期结果相符；
(2)伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段的克隆
以基因组纯化试剂盒纯化pld基因上下游同源臂融合片段，将融合片段连接ZTOPO-T载体，获得ZTOPO-T-Δpld；连接体系如下：
ZTOPO-TVector 0.5μL
10×TOPO Buffer 0.5μL
纯化后的融合片段 4μL
混匀后室温静置10min。
进一步，所述将连接了PLD基因的ZTOPO-T载体转化DH5α感受态细胞，步骤如下：
将连接产物加入50μL DH5α感受态细胞冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤(不含抗生素)37℃200rpm复苏培养1h，在含Amp 100μg/mL LB抗性平板上，取250μL菌液加在Amp琼脂平板上涂布均匀，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干单菌落加入至1mL含Amp 100μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用M13引物进行菌液PCR鉴定，鉴定正确的菌液送生工生物技术有限公司进行测序。
进一步，所述步骤四中，将双酶切后的产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后将片段大小正确的目的片段切胶后，参照胶回收试剂盒说明书进行纯化，取纯化后的DNA 5μL加1μL 6×Loading buffer，混匀后于1％琼脂糖凝胶电泳检测；
将目的片段与pK18mobsacB质粒的连接，构建pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，连接体系如下：
Figure BDA0002648665610000051
转化步骤为将连接产物加入50μL JM110感受态细胞(提前10min冰上融化)用枪头轻轻混匀后，于冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤(不含抗生素)37℃200rpm复苏培养1h，取250μL菌液加在含Kana 50μg/mL LB抗性琼脂平板上涂布均匀，待干后，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干菌落加入至1mL含Kana 50μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用同源臂引物进行菌液PCR鉴定。
进一步，所述步骤五中，自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌感受态细胞具体过程为：
(1)伪结核棒状杆菌感受态细胞制备
取-80℃保存的ATCC 19410菌株划线接种于含5％兔血的LB营养琼脂平板上，培养48h后，挑取单个菌落于1mL含100μL血清的LB营养肉汤中，24h后，将菌液接种在100mL Epomedium，37℃震荡培养至OD595nm为1左右；
将OD595 nm为1左右的伪结核棒状杆菌菌液冰浴10min后，4000rpm离心10min，弃上清，用10％甘油洗涤四次，洗涤结束后，将菌体重悬在1mL 10％甘油中，100μL/管分装，即为伪结核棒状杆菌感受态细胞，制备好的感受态于-80℃冰箱保存；
(2)电转化
提取pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，提前从-80℃冰箱取出伪结核棒状杆菌感受态细胞ATCC 19410于冰上融化，取2-5μL质粒DNA加入至伪结核棒状杆菌感受态细胞中，用枪头轻轻混匀后，冰浴15min，设置不同的电压及时间进行电转化，电击条件分别为1.25KV 12ms；1.75KV 12ms和2.5KV 12ms电击时将电转杯外壁水珠擦拭干净，电击结束后，加入1mL预热的血清肉汤，46℃热激6min，于37℃静置培养2h后，取200μL菌液涂布于含卡那霉素25μg/mL的鲜血琼脂平板上培养，直至长出单个菌落。
进一步，所述步骤六中，单交换菌株的筛选
将电转化后抗性平板上长出的单菌落接种于含Kana 50μg/mL的血清肉汤中，培养24h，待菌液浑浊后取出1μL菌液，用pld引物进行菌液PCR鉴定，PCR后电泳出现924bp和426bp两条带的菌液即为单交换菌株；反应体系为：
Figure BDA0002648665610000061
反应条件为：
Figure BDA0002648665610000062
以扩增pld基因全长序列的引物进行PCR检测，筛选单交换菌株；
双交换菌株的筛选及鉴定
将鉴定后的单交换菌株于20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，待长出单个菌落后，随机挑取若干单菌落于液体培养基中培养24h，用pld引物进行菌液PCR，反应体系及条件参照单交换体系等，选取426bp条带较亮的菌液继续在20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，并进行菌液PCR，直至仅出现426bp片段为止；同时将缺失株的pld外侧引物扩增产物进行测序。
进一步，所述步骤七中，马红球菌周围溶血区域在与野生型菌株ATCC19410交界处明显扩大，而缺失株ATCC 19410Δpld与马红球菌的交界处溶血情况则未发生明显变化，说明pld基因缺失后ATCC 19410的协同溶血功能受到破坏，不能与马红球菌发生协同溶血，从而进一步确证了伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株构建成功。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：无外源抗性基因的引入，生物安全性更高。同时，可以采用该方法对伪结核棒状杆菌多个目标基因依次进行缺失，为研制伪结核棒状杆菌基因工程弱毒菌苗提供了很好的思路。与之前这些构建伪结核棒状杆菌基因缺失株的方法相比，本发明以pk18mobsacB为载体，采用不在目标菌的基因组中引入抗性基因的无痕缺失方法，构建了伪结核棒状杆菌pld基因无恒缺失株，其优势包括：(1)没有在目标菌中引入抗性基因，从生物安全角度而言，该方法所构建的pld基因缺失株更具有安全性。(2)以该方法构建的pld基因缺失株不保留任何外源基因，对突变后的伪结核棒状杆菌生物性状的影响更小，更有益于研究该基因功能。(3)可以在伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失的基础上，构建双基因缺失或更多基因的缺失株。(4)由于没有引入抗性基因，该方法构建的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株更具有成为疫苗株的潜能。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的用pK18mobsacB为载体构建伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株的方案示意图。
图3是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂PCR扩增结果示意图；
图中：M：DL2000 DNA Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂。
图4是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合结果示意图；
图中：M：DL10000 DNA Marker；1：融合片段。
图5是本发明实施例提供的ZTOPO-Δpld及pK18mobsacB双酶切结果示意图；
图中：M：DL10000 DNA Marker；1：ZTOPO-Δpld双酶切；2.pK18mobsacB双酶切。
图6是本发明实施例提供的pld基因缺失自杀重组质粒pK18mobsacB/Δpld的PCR鉴定结果示意图；
图中：M：DL10000 DNA Marker；1-8：pK18mobsacB/Δpld PCR检测结果。
图7是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌ATCC 19410单交换菌株的鉴定示意图；
图中：M：DL2000 DNA Marker；1-23:PCR鉴定单交换菌株。
图8是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌ATCC 19410双交换菌株的鉴定示意图；
图中：M：DL2000 DNA Marker；1：ATCC 19410野生型菌株；2：ATCC19410Δpld菌株pld引物扩增片段。
图9是本发明实施例提供的ATCC 19410Δpld与ATCC 19410野生型菌株的pld基因序列比对结果示意图；
图中：红色框内为ATCC 19410完整的pld基因编码序列，浅蓝色部分为ATCC 19410Δpld所缺失的序列。
图10是本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌野生株和pld基因缺失株与马红球菌协同溶血结果示意图；
图中：ATCC 19410及其pld缺失株(ATCC 19410Δpld)与马红球菌(Re)协同溶血。ATCC 19410与Re显示出明显的协同溶血作用
Figure BDA0002648665610000091
ATCC 19410Δpld则完全失去协同溶血功能。
注：Re为马红球菌ATCC 6939；Cp为伪结核棒状杆菌野生株ATCC 19410；CpΔpld为ATCC 19410pld缺失株(ATCC 19410Δpld)。
图11是本发明实施例提供的ATCC 19410Δpld与ATCC 19410感染小鼠的生存曲线示意图。
图12是本发明实施例提供的ATCC 19410Δpld与ATCC 19410感染小鼠的脏器载菌量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明的伪结核棒状杆菌ATCC 19410购自广东省微生物菌种保藏中心。
如图1所示，本发明实施例提供的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，包括：
S101：参照GenBank中的伪结核棒状杆菌标准菌株ATCC 19410全基因组序列，利用Primer Premier 5软件设计伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂引物。
S102：PCR扩增伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂，分别扩增两管；PCR扩增结束后，取全部产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
S103：伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂的融合及克隆。
S104：伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段与自杀质粒pK18mobsacB连接，以BamH I和Hind III限制性核酸内切酶对ZTOPO-T-Δpld和pK18mobsacB质粒进行双酶切；于30℃双酶切1h，37℃双酶切1h，取酶切后的DNA加5μL 6×Loadingbuffer，充分混匀后，于1％琼脂糖凝胶电泳检测。
S105：自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌感受态细胞。
S106：pld基因缺失株的筛选包括单交换菌株的筛选及鉴定和双交换菌株的筛选及鉴定。
S107：伪结核棒状杆菌pld基因缺失株生物学功能评价，将马红球菌(ATCC6939)菌液沿鲜血琼脂平板的直径划线接种一条直线，然后将伪结核棒状杆菌野生型ATCC 19410与缺失株ATCC 19410Δpld分别和马红球菌菌液垂直但不相交接种于鲜血琼脂平板上，待菌液干燥后，将鲜血琼脂平板于37℃倒置培养24h观察其溶血情况。
本发明提供的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步描述。
以伪结核棒状杆菌标准菌株ATCC19410基因组为模板，PCR方法扩增获得pld基因上游同源臂(1326bp)和下游同源臂(970bp)，以融合PCR将上、下游同源臂连接，克隆进ZTOPO-T载体，测序验证后，通过双酶切将上下游同源臂融合片段连接到质粒pk18mobsacB，构建出含pld基因的自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld。将pk18mobsacB/Δpld电转入伪结核棒状杆菌感受态细胞，以含卡那霉素的鲜血琼脂平板筛选出第一次同源重组的卡那霉素抗性克隆。将第一次同源重组的伪结核棒状杆菌涂布于含20％蔗糖的血琼脂LB平板上，通过蔗糖致死基因(sacB)负筛选出经过第二次同源重组的克隆，方案如图2。经PCR鉴定和产物测序，获得了无痕缺失pld基因(在pld内部缺失了496bp)的伪结核棒状杆菌菌株(ATCC19410Δpld)。协同溶血试验发现，伪结核棒状杆菌野生株与马红球菌(ATCC 6939)显示出显著的协同溶血活性，而pld基因缺失株(ATCC 19410Δpld)则完全失去了与马红球菌的协同溶血作用。证实ATCC19410菌株的pld基因无痕缺失株均构建成功。
详细内容如下：
1、设计伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂引物
参照GenBank中的伪结核棒状杆菌标准菌株ATCC 19410全基因组序列，利用Primer Premier 5软件设计在pld基因的上、下游设计同源臂引物，上、下游同源臂扩增片段长度分别为1326bp和970bp，见表1。
表1构建及鉴定伪结核棒状杆菌pld基因缺失株的引物
Figure BDA0002648665610000111
注：下划线为酶切位点；pld-F和pld-R为鉴定引物，若pld基因扩增片段为426bp，则pld基因缺失株构建成功，pld基因扩增片段为924bp，则构建失败。
SEQ ID NO：1为N-F BamH I；SEQ ID NO：2为N-R和C-F；SEQ ID NO：3为C-R HindIII；SEQ ID NO：4为pld-F和pld-R。
2、PCR扩增伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂
扩增上、下游同源臂的反应体系为ddH2O 16.375μL，bufferⅡ2.5μL，dNTP 2μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.125μL，DNA 2μL，pld-N-F(pld-C-F)1μL，pld-N-R(pld-C-R)1μL，分别扩增两管，反应条件为94℃30s预变性；94℃40s变性；55℃40s退火；72℃1min延伸；40个循环；72℃10min终末延伸，16℃保存。
PCR扩增结束后，取全部产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。获得pld基因上、下游同源臂扩增片段后，以北京全式金生物技术有限公司基因组纯化试剂盒对pld基因上、下游同源臂进行DNA回收，并以1％琼脂糖凝胶电泳检测。pld基因上下游同源臂进行扩增结果如图3所示，泳道1为pld基因上游同源臂，片段大小与1326bp相符，泳道2为pld基因下游同源臂，片段大小与970bp相符，说明同源臂片段扩增成功。
3、伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂的融合及克隆
(1)融合伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂
融合PCR第一步：
反应体系如下：
Figure BDA0002648665610000121
反应条件如下：
Figure BDA0002648665610000122
融合PCR第二步：
向第一步融合PCR体系中加入引物N-F 2μL，引物C-R 2μL，继续按上述条件完成30个循环，反应结束后，将融合PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。上、下游同源臂融合如图4所示，成功扩增出2296bp左右的片段，与预期结果相符。
(2)伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段的克隆
以基因组纯化试剂盒纯化pld基因上下游同源臂融合片段，将融合片段连接ZTOPO-T载体，获得ZTOPO-T-Δpld。连接体系如下：
ZTOPO-T Vector 0.5μL
10×TOPO Buffer 0.5μL
纯化后的融合片段 4μL
混匀后室温静置10min。
将连接了pld基因的ZTOPO-T载体转化DH5α感受态细胞，步骤如下：
将连接产物加入50μL DH5α感受态细胞冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤(不含抗生素)37℃200rpm复苏培养1h，在含Amp 100μg/mL LB抗性平板上，取250μL菌液加在Amp琼脂平板上涂布均匀，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干单菌落加入至1mL含Amp 100μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用M13引物进行菌液PCR鉴定。鉴定正确的菌液送生工生物技术有限公司进行测序。
4、伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段与自杀质粒pK18mobsacB连接；
以BamH I和Hind III限制性核酸内切酶对ZTOPO-T-Δpld和pK18mobsacB质粒进行双酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0002648665610000131
于30℃双酶切1h，37℃双酶切1h，取酶切后的DNA加5μL 6×Loading buffer，充分混匀后，于1％琼脂糖凝胶电泳检测。
ZTOPO-T-Δpld经双酶切获得2296bp(融合后的pld上下游同源臂)和1865bp(ZTOPO-T载体)大小两个片段(图5)，而pK18mobsacB质粒经双酶切获得5.66kb大小片段(图5)，说明pK18mobsacB质粒酶切成功。
将双酶切后的产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后将片段大小正确的目的片段切胶后，参照北京全式金生物技术有限公司胶回收试剂盒说明书进行纯化，取纯化后的DNA 5μL加1μL 6×Loading buffer，混匀后于1％琼脂糖凝胶电泳检测。
将目的片段与pK18mobsacB质粒的连接，构建pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，连接体系如下：
Figure BDA0002648665610000141
转化步骤为将连接产物加入50μL JM110感受态细胞(提前10min冰上融化)用枪头轻轻混匀后，于冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤(不含抗生素)37℃200rpm复苏培养1h，取250μL菌液加在含Kana 50μg/mL LB抗性琼脂平板上涂布均匀，待干后，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干菌落加入至1mL含Kana 50μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用同源臂引物进行菌液PCR鉴定。鉴定发现，融合片段和pK18mobsacB连接后，PCR扩增获得2296bp左右片段(图6)，与预期结果相符，表明pld基因缺失自杀质粒pK18mobsacB/Δpld构建成功。
5、自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌感受态细胞
(1)伪结核棒状杆菌感受态细胞制备
参考文献报道(DorellaF A，et al，2006)，取-80℃保存的ATCC 19410菌株划线接种于含5％兔血的LB营养琼脂平板上，培养48h后，挑取单个菌落于1mL含100μL血清的LB营养肉汤中，24h后，将菌液接种在100mL Epo medium，37℃震荡培养至OD595nm为1左右。
将OD595 nm为1左右的伪结核棒状杆菌菌液冰浴10min后，4000rpm离心10min，弃上清，用10％甘油洗涤四次，洗涤结束后，将菌体重悬在1mL 10％甘油中，100μL/管分装，即为伪结核棒状杆菌感受态细胞，制备好的感受态于-80℃冰箱保存。
(2)电转化
提取pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，提前从-80℃冰箱取出伪结核棒状杆菌感受态细胞ATCC 19410于冰上融化，取2-5μL质粒DNA加入至伪结核棒状杆菌感受态细胞中，用枪头轻轻混匀后，冰浴15min，设置不同的电压及时间进行电转化，电击条件分别为1.25KV 12ms；1.75KV 12ms和2.5KV 12ms电击时将电转杯外壁水珠擦拭干净，电击结束后，加入1mL预热的血清肉汤，46℃热激6min，于37℃静置培养2h后，取200μL菌液涂布于含卡那霉素25μg/mL的鲜血琼脂平板上培养，直至长出单个菌落。
6、pld基因缺失株的筛选
(1)单交换菌株的筛选
将电转化后抗性平板上长出的单菌落接种于含Kana 50μg/mL的血清肉汤中，培养24h，待菌液浑浊后取出1μL菌液，用pld引物进行菌液PCR鉴定，PCR后电泳出现924bp和426bp两条带的菌液即为单交换菌株。反应体系为：
Figure BDA0002648665610000151
反应条件为：
Figure BDA0002648665610000152
以扩增pld基因全长序列的引物进行PCR检测，筛选单交换菌株。结果如下图7所示，泳道1-泳道23均出现约924bp和426bp两条带，说明pK18mobsacB/Δpld与伪结核棒状杆菌基因组成功发生单交换。
(2)双交换菌株的筛选及鉴定
将鉴定后的单交换菌株于20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，待长出单个菌落后，随机挑取若干单菌落于液体培养基中培养24h，用pld引物进行菌液PCR，反应体系及条件参照单交换体系等，选取426bp条带较亮的菌液继续在20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，并进行菌液PCR，直至仅出现426bp片段为止。经多次筛选—传代—筛选，获得仅能扩增出426bp的菌株(图8泳道2)。同时将缺失株的pld外侧引物扩增产物送至生物公司测序。结果，发现缺失株pld基因内部缺失了496bp的核苷酸片段(图9)，证实成功获得伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株ATCC 19410Δpld。
7、伪结核棒状杆菌pld基因缺失株生物学功能评价
将马红球菌(ATCC 6939)菌液沿鲜血琼脂平板的直径划线接种一条直线，然后将伪结核棒状杆菌野生型ATCC 19410与pld基因缺失株ATCC 19410Δpld分别和马红球菌菌液垂直但不相交接种于鲜血琼脂平板上，待菌液干燥后，将鲜血琼脂平板于37℃倒置培养24h观察其溶血情况。结果如图10所示，马红球菌周围溶血区域在与野生型菌株ATCC 19410交界处明显扩大，而缺失株ATCC 19410Δpld与马红球菌的交界处溶血情况则未发生明显变化，说明pld基因缺失后ATCC 19410的协同溶血功能受到破坏，不能与马红球菌发生协同溶血(图10)，从而进一步确证了伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株构建成功。
以6×105CFU/0.2mL/只的ATCC 19410野生株和pld基因缺失株(ATCC19410Δpld)体内接种SPF昆明系小鼠，发现ATCC 19410野生株组小鼠在接种后第2天开始死亡，在试验观察期内，其致死率为85.7％(6/7)，而ATCC 19410Δpld组小鼠仅在接种后第5天开始死亡，在试验观察期内，其致死率仅为14.3％(1/7)，比ATCC 19410野生株对小鼠的致死率下降71.4％，差异极显著(P＜0.01％)，此外ATCC 19410Δpld所感染小鼠死亡时间比ATCC19410延后(图11)。
以1×105CFU/0.2mL/只的ATCC 19410Δpld和ATCC 19410体内接种C57BL/6小鼠，检测发现ATCC 19410Δpld感染(C57BL/6)小鼠肝脏和脾脏中的伪结核棒状杆菌载菌量均低于野生型菌株，其中以脾脏最显著，其载菌量下降84％，差异极显著(P＜0.01％)(图12)，表明，pld基因缺失可显著降低伪结核棒状杆菌对小鼠的致病力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatcct cccattcgta atcgtct 27
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaactgcgt catccacgtg gatgacgcag ttgccaactc cgtaagtcca gc 52
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaagcttt gtgcccgtat tcttgc 26
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagggaga aagttgtttt atcaccacgg gttatccgc 39

Claims (10)

1.一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法包括：
步骤一，参照GenBank中的伪结核棒状杆菌标准菌株ATCC 19410全基因组序列，利用Primer Premier 5软件设计伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂引物；
步骤二，PCR扩增伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂，分别扩增两管；PCR扩增结束后，取全部产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤三，伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂的融合及克隆；
步骤四，伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段与自杀质粒pK18mobsacB连接，以BamH I和Hind III限制性核酸内切酶对ZTOPO-T-Δpld和pK18mobsacB质粒进行双酶切；于30℃双酶切1h，37℃双酶切1h，取酶切后的DNA加5μL 6×Loading buffer，充分混匀后，于1％琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤五，自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌ATCC19410感受态细胞；
步骤六，pld基因缺失株的筛选包括单交换菌株的筛选及鉴定和双交换菌株的筛选及鉴定；
步骤七，伪结核棒状杆菌pld基因缺失株生物学功能评价，将马红球菌ATCC 6939菌液沿鲜血琼脂平板的直径划线接种一条直线，然后将伪结核棒状杆菌野生型ATCC 19410与pld基因缺失株ATCC 19410Δpld分别和马红球菌菌液垂直但不相交接种于鲜血琼脂平板上，待菌液干燥后，将鲜血琼脂平板于37℃倒置培养24h观察其溶血情况。
2.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，上、下游同源臂扩增片段长度分别为1326bp和970bp。
3.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，扩增上、下游同源臂的反应体系为ddH2O 16.375μL，buffer Ⅱ 2.5μL，dNTP2μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.125μL，DNA 2μL，pld-N-F(pld-C-F) 1μL，pld-N-R(pld-C-R) 1μL；
分别扩增两管，反应条件为94℃ 30s预变性；94℃ 40s变性；55℃ 40s退火；72℃ 1min延伸；40个循环；72℃ 10min终末延伸，16℃保存。
4.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，获得pld基因上、下游同源臂扩增片段后，以基因组纯化试剂盒对pld基因上、下游同源臂进行DNA回收，并以1％琼脂糖凝胶电泳检测；pld基因上下游同源臂进行扩增结果，泳道1为pld基因上游同源臂，片段大小与1326bp相符，泳道2为pld基因下游同源臂，片段大小与970bp相符，说明同源臂片段扩增成功。
5.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤三中，融合伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂；
(1)融合PCR第一步：
反应体系如下：
Figure FDA0002648665600000021
反应条件如下：
Figure FDA0002648665600000022
融合PCR第二步：
向第一步融合PCR体系中加入引物N-F 2μL，引物C-R 2μL，继续按上述条件完成30个循环，反应结束后，将融合PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；上、下游同源臂融合，成功扩增出2296bp左右的片段，与预期结果相符；
(2)伪结核棒状杆菌pld基因上下游同源臂融合片段的克隆
以基因组纯化试剂盒纯化pld基因上下游同源臂融合片段，将融合片段连接ZTOPO-T载体，获得ZTOPO-T-Δpld；连接体系如下：
ZTOPO-T Vector 0.5μL
10×TOPO Buffer 0.5μL
纯化后的融合片段 4μL
混匀后室温静置10min。
6.如权利要求5所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述将连接了pld基因的ZTOPO-T载体转化DH5α感受态细胞，步骤如下：
将连接产物加入50μL DH5α感受态细胞冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤(不含抗生素)37℃ 200rpm复苏培养1h，在含Amp 100μg/mL LB抗性平板上，取250μL菌液加在Amp琼脂平板上涂布均匀，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干单菌落加入至1mL含Amp 100μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用M13引物进行菌液PCR鉴定，鉴定正确的菌液送生工生物技术有限公司进行测序。
7.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤四中，将双酶切后的产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后将片段大小正确的目的片段切胶后，参照胶回收试剂盒说明书进行纯化，取纯化后的DNA 5μL加1μL 6×Loading buffer，混匀后于1％琼脂糖凝胶电泳检测；
将目的片段与pK18mobsacB质粒的连接，构建pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，连接体系如下：
Figure FDA0002648665600000031
Figure FDA0002648665600000041
转化步骤为将连接产物加入50μL JM110感受态细胞用枪头轻轻混匀后，于冰上放置30min，42℃热激1min，冰上放置2min，加入500μL LB肉汤37℃ 200rpm复苏培养1h，取250μL菌液加在含Kana 50μg/mL LB抗性琼脂平板上涂布均匀，待干后，37℃过夜培养，待长出单个菌落后，挑取若干菌落加入至1mL含Kana 50μg/mL的LB液体培养基，待培养24h后，用同源臂引物进行菌液PCR鉴定。
8.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤五中，自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld转化伪结核棒状杆菌感受态细胞具体过程为：
(1)伪结核棒状杆菌感受态细胞制备
取-80℃保存的ATCC 19410菌株划线接种于含5％兔血的LB营养琼脂平板上，培养48h后，挑取单个菌落于1mL含100μL血清的LB营养肉汤中，24h后，将菌液接种在100mL Epomedium，37℃震荡培养至OD595nm为1；
将OD595 nm为1左右的伪结核棒状杆菌菌液冰浴10min后，4000rpm离心10min，弃上清，用10％甘油洗涤四次，洗涤结束后，将菌体重悬在1mL 10％甘油中，100μL/管分装，即为伪结核棒状杆菌感受态细胞，制备好的感受态于-80℃冰箱保存；
(2)电转化
提取pld基因自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld，提前从-80℃冰箱取出伪结核棒状杆菌感受态细胞ATCC 19410于冰上融化，取2-5μL质粒DNA加入至伪结核棒状杆菌感受态细胞中，用枪头混匀后，冰浴15min，设置不同的电压及时间进行电转化，电击条件分别为1.25KV12ms；1.75KV 12ms和2.5KV 12ms电击时将电转杯外壁水珠擦拭干净，电击结束后，加入1mL预热的血清肉汤，46℃热激6min，于37℃静置培养2h后，取200μL菌液涂布于含卡那霉素25μg/mL的鲜血琼脂平板上培养，直至长出单个菌落。
9.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤六中，单交换菌株的筛选将电转化后抗性平板上长出的单菌落接种于含Kana 50μg/mL的血清肉汤中，培养24h，待菌液浑浊后取出1μL菌液，用pld引物进行菌液PCR鉴定，PCR后电泳出现924bp和426bp两条带的菌液即为单交换菌株；反应体系为：
Figure FDA0002648665600000051
反应条件为：
Figure FDA0002648665600000052
以扩增pld基因全长序列的引物进行PCR检测，筛选单交换菌株；
双交换菌株的筛选及鉴定
将鉴定后的单交换菌株于20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，待长出单个菌落后，随机挑取若干单菌落于液体培养基中培养24h，用pld引物进行菌液PCR，反应体系及条件参照单交换体系等，选取426bp条带较亮的菌液继续在20％蔗糖鲜血琼脂平板上传代培养，并进行菌液PCR，直至仅出现426bp片段为止；同时将缺失株的pld外侧引物扩增产物进行测序。
10.如权利要求1所述的伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤八中，马红球菌周围溶血区域在与野生型菌株ATCC 19410交界处明显扩大，而缺失株ATCC 19410Δpld与马红球菌的交界处溶血情况则未发生明显变化，说明pld基因缺失后ATCC 19410的协同溶血功能受到破坏，不能与马红球菌发生协同溶血，从而进一步确证了伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株构建成功。
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