KR20060032663A - 내열성 리보뉴클레아제 ｈ - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전공학에서 매우 유용한 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드; 이들 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자; 및 이들 폴리펩타이드를 유전공학적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

내열성 리보뉴클레아제 Ｈ{Thermotolerant ribonuclease H}

본 발명은 폴리펩타이드, 구체적으로 유전공학에서 매우 가치있는 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전공학에 의해 상기 폴리펩타이드를 제조하는데 유용한 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 유전공학에 의해 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

엔도형과 엑소형의 리보뉴클레아제(RNA-분해효소)가 있다. 그들의 기질 특이성은 다양하고, 그들은 복잡한 생리학적 활성에 관여하고 있다. 리보뉴클레아제 T₁, 리보뉴클레아제 T₂, 리보뉴클레아제 H, 리보뉴클레아제 P, 리보뉴클레아제 Ⅰ, 리보뉴클레아제 Ⅱ, 리보뉴클레아제 Ⅲ, 리보뉴클레아제 Ⅳ, 리보뉴클레아제 L과 같은 효소가 리보뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

리보뉴클레아제 H(이하 RNase H라고도 함)는 1969년에 W. H. Stein과 P. Hausen에 의해 송아지 흉선으로부터 최초로 분리되었다. RNase H는 현재 세포성 RNase H와 바이러스성 RNase H로 구별된다. 바이러스성 RNase H가 RNA 종양 바이러스에 존재하는 반면, 세포성 RNase H는 다양한 동물세포 및 효모와 같은 진핵세 포와 대장균과 같은 원핵세포에 광범위하게 존재한다. 몇몇 종류의 RNase H 활성이 세포에 존재한다. 그들은 Mg^{2 +} 및 Mn^{2 +}와 같은 이가 금속 이온을 요구한다.

대장균으로부터의 RNase H는 155 아미노산으로 구성된 하이드롤라제이고, 17 KDa의 분자량을 가지며, 엔도-형 방식으로 DNA-RNA 하이브리드에서 RNA 쇄만을 특이적으로 절단하는 기질 특이성을 갖는다. 생성된 올리고머는 5' 말단에 포스페이트 그룹과 3' 말단에 하이드록실 그룹을 갖는다.

RNase HⅠ과 RNase HⅡ가 대장균으로부터의 RNase H로 확인되어 있다. RNase HⅠ는 Col E1 플라스미드의 복제에서 하기 생리학적 기능을 갖는 것으로 나타나 있다: 1) 정상 복제 기원을 보장하기 위하여 정상 복제 기원 이외의 부분에 결합한 RNA를 분해하고; 2) 정상 복제 기원에 특이적인 RNA 프라이머를 합성한다. RNase HⅡ의 기능은 알려져 있지 않다.

유전공학의 발달과 함께 RNase H가 점점 더 중요해지는 것으로 인식되고 있다. 그러나, 대장균에서 이 효소의 발현수준은 상당히 낮다. 그래서, 재조합 DNA 기술을 이용한 이 효소의 생산이 시도되었다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된 RNase H는 현재 BRL, 아머샴 파마시아 바이오텍, 다카라 슈조 등으로부터 공급되고 있다.

이들 상업적으로 입수가능한 재조합 RNase H는 숙주로서 대장균을 이용하여 제조된다(Kanaya 등, The Journal of Biological Chemistry, 264: 11546-11549(1989)). 대장균을 이용하여, 대장균으로부터의 RNase H 보다 훨씬 더 안정 한 고온균의 RNase H를 생산하는 방법이 보고되었다(Kanaya 등, 다이 2 카이 니폰 탄파쿠코우가쿠카이 넨카이 프로그램/초록(1990) pp. 69; 일본특허 제2533671호). 그러나, 대장균을 이용하여 생산된 고온균의 RNase H의 효소 활성은 대장균의 RNase H의 것 보다 더 낮다.

RNase H는 기질 특이성에 기초하여 하기 예시하는 바와 같은 용도를 갖고, RNase H가 매우 가치있는 효소로 주목받고 있다:

1) cDNA 클로닝 시 주형 mRNA의 제거;

2) mRNA에서 폴리(A) 부분의 제거; 및

3) RNA의 단편화

그러나, 상기한 바와 같이, 생산성과 효소 활성이 대장균의 RNase H의 것 보다 낮은 내열성 RNase H만이 이용가능하다. 따라서, 생산성과 효소 활성이 대장균의 RNase H의 것과 대등하거나 더 높은 내열성 RNase H를 개발하는 것이 RNase H의 용도를 확장하기 위해 요구되어 왔다.

상기한 바와 같은 상황에 비추어, 본 발명자들은 내열성 RNase H를 얻기 위하여 예의 연구를 행하고 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 높은 RNase H 활성을 갖는 내열성 RNase H 폴리펩타이드를 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 유전공학 기술을 이용한 생산에서 그렇게 얻은 내열성 RNase H의 생산성이 높음을 발견하였다. 따라서, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주 목적은 유전공학을 위해 매우 가치있는 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 및 유전공학에 의해 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 개요는 하기와 같다.

본 발명의 제1면은

(a) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열, 또는 그의 일부를 갖는 폴리펩타이드;

(b) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및

(c) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열과 적어도 71%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 내열성 리보뉴클레아제 H 폴리펩타이드, 즉 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은

(a) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열, 또는 그의 일부를 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산;

(b) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산;

(c) 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산;

(d) 뉴클레오타이드의 결실, 부가, 삽입 또는 치환이 아미노산 서열로 번역되도록 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 핵산;

(e) 엄격한 조건 하에서 (a) 내지 (d)의 핵산 중 어느 하나 또는 그의 상보쇄에 혼성화할 수 있는 핵산; 및

(f) 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 69%의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산:

으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 내열성 리보뉴클레아제 H 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 즉 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은 제2면의 핵산을 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 제4면은 제3면의 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 제5면은

제4면의 형질전환체를 배양하고;

배양물로부터 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 모으는 것:

을 포함하는 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴레펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제6면은 플라스미드 pRHB11, pBCA3Nd2, pPFU220, pTM-RNH, pPHO238, pAFU204, pTLI204 및 pTCE207 중 어느 하나가 도입된 형질전환체를 배양함으로써 얻을 수 있는, 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이들 플라스미드를 갖는 대장균 균주가 부다페스트 조약 하에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 수탁번호 FERM BP-7655, FERM BP-7653, FERM BP-7654, FERM BP-7652, FERM BP-7692, FERM BP-7691, FERM BP-7693 및 FERM BP-7694로 각각 기탁되어 있다.

이하, 본 발명을 상세히 기술한다.

본 명세서에서 사용된, RNase H는 DNA-RNA 하이브리드에서 RNA 쇄만을 특이적으로 엔도-타입 형태로 절단하는 기질 특이성을 가져, 생성된 올리고머가 5' 말단에 포스페이트 그룹과 3' 말단에 하이드록실 그룹을 갖는 하이드롤라제를 가리킨다.

본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 폴리펩타이드에 관하여 본 명세서에서 사용된 내열성 RNase H 활성을 갖는다는 것은 폴리펩타이드가 60 ℃ 이상의 온도에서 15 분 동안 인큐베이션한 후 RNase H 활성을 갖는 것을 의미한다.

예를 들어, 내열성 RNase H 활성은 하기와 같이 결정될 수 있다.

1 ㎎의 폴리(rA) 또는 폴리(dT)(모두 아머샴 파마시아 바이오텍으로부터 입수)를 1 mM EDTA를 함유하는 40 mM 트리스-HCl(pH 7.7) 1㎖ 중에 용해시켜 폴리(rA) 용액과 폴리(dT) 용액을 제조한다.

그 후 폴리(rA) 용액(최종 농도 20 ㎍/㎖) 및 폴리(dT) 용액(최종 농도 30 ㎍/㎖)을 4 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤을 함유하는 40 mM 트리스-HCl(pH 7.7)에 가한다. 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 4 ℃로 냉각하여 폴리(rA)-폴리(dT) 용액을 제조한다.

1 ㎕의 효소 용액을 100 ㎕의 폴리(rA)-폴리(dT) 용액에 가한다. 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시킨다. 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 반응을 종결시킨다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정한다. 대조군으로서, 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 반응 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 흡광도를 측정한다. 값(흡광도의 차이)을 EDTA 부재시 반응의 흡광도에서 대조군의 흡광도를 빼서 얻는다. 따라서, 효소 반응에 의해 폴리(rA)-폴리(dT) 하이브리드로부터 방출된 뉴클레오타이드의 농도를 흡광도 차이에 기초하여 결정한다. 이리하여, 본 발명에 따른 내열성 RNase H 활성을 결정할 수 있다.

다르게는, 본 발명에 따른 내열성 RNase H 활성을 하기와 같이 결정할 수 있다. 40 ℃에서 인큐베이션된 100 ㎕의 반응 혼합물[20 mM HEPES-수산화칼륨(pH 8.5), 0.01% 소혈청알부민(다카라 슈조), 1% 디메틸 설폭사이드, 4 mM 아세트산 마그네슘, 20 ㎍/㎖ 폴리(dT)(아머샴 파마시아 바이오텍), 30 ㎍/㎖ 폴리(rA)(아머샴 파마시아 바이오텍)]을 활성을 측정하고자 하는 효소 용액 1 ㎕에 가한다. 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시킨다. 그 후 반응을 10 ㎕의 0.5 M EDTA(pH 8.0)을 가하여 종결시킨다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정한다.

1 유닛의 RNase H는 하기 등식에 따라 계산된 10 분에 1 nmol의 리보뉴클레오타이드의 방출에 상응하여 A₂₆₀을 증가시키는 효소 량으로 정의된다:

유닛=[흡광도 차이×반응 부피(㎖)]/0.0152

본 발명의 폴리펩타이드는 내열성 RNase H 활성을 나타내는 한, 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

아미노산 서열에서 아미노산의 결실, 삽입, 부가 또는 치환과 같은 돌연변이는 자연 발생 폴리펩타이드에서 생성될 수 있다. 그러한 돌연변이는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 다형성이나 돌연변이, 또는 생체내에서 폴리펩타이드의 변형으로 인하거나 합성 후 정제 중 생성될 수 있다. 그러나, 그러한 돌연변이된 폴리펩타이드는 그러한 돌연변이가 폴리펩타이드의 활성이나 구조 유지에 중요하지 않은 부분에 존재하면 돌연변이가 없는 폴리펩타이드의 것과 실질적으로 균등한 생리학적 또는 생물학적 활성을 나타낼 수 있음이 알려져 있다.

이는 그러한 돌연변이가 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 인공적으로 도입된 폴리펩타이드에 적용될 수 있다. 이 경우, 더욱 다양한 돌연변이를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 인간 인터류킨-2(IL-2)의 아미노산 서열 중 시스테인 잔기가 세린 잔기로 대체된 폴리펩타이드가 인터류킨-2 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다(Science, 224: 1431(1984)).

더욱이, 특정 폴리펩타이드는 활성에 필수적이지 않은 펩타이드 부위를 갖는 것으로 알려져 있다. 그러한 펩타이드 부위의 예를 들면 세포외로 분비되는 폴리펩타이드에서 신호 펩타이드, 또는 프로테아제 전구체에서 발견되는 프로서열 또는 프리-프로서열이 있다. 대부분의 그러한 부위는 번역 후 또는 활성 폴리펩타이드로의 전환 시 제거된다. 그러한 폴리펩타이드는 제거될 부위가 없는 폴리펩타이드의 것과 상이한 일차 구조를 가지만, 최종적으로는 균등한 기능을 나타낸다.

본 발명에 따라 분리된 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자는 각각 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. 이들 폴리펩타이드는 내열성 RNase H 활성을 갖는다. 본 발명의 폴리펩타이드는 활성에 필수적이지 않은 펩타이드 부위가 제거된 폴리펩타이드를 포함한다.

폴리펩타이드를 유전공학에 의해 생산할 때, 관심 있는 폴리펩타이드의 활성과 무관한 펩타이드 쇄를 폴리펩타이드의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 관심 있는 폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키기 위하여 사용하고자 하는 숙주에서 고 수준으로 발현되는 폴리펩타이드의 아미노 말단 부위의 일부가 관심 있는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 첨가된 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 다른 경우, 발현된 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여 특정 물질에 대한 친화성을 갖는 펩타이드를 관심 있는 폴리펩타이드의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 첨가할 수 있다. 첨가된 펩타이드는 관심 있는 폴리펩타이드의 활성에 해로운 효과를 미치지 않으면 첨가된 상태로 남아 있을 수 있다. 필 요한 경우, 그것은 적절한 처리, 예를 들면, 프로테아제로의 제한된 분해에 의해 관심 있는 폴리펩타이드로부터 제거될 수 있도록 조작될 수 있다.

따라서, 본 명세서에 개시된 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 내열성 RNase H 활성을 갖는 한 본 발명에 포함된다.

더욱이, 본 명세서에 개시된 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열과 적어도 71%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 내열성 RNase H 활성을 갖는 한 본 발명에 포함된다.

상동성은 예를 들어, 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac(다카라 슈조), 컴퓨터 알고리즘 FASTA(버젼 3.0; Pearson, W. R. 등, Pro. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1988) 또는 컴퓨터 알고리즘 BLAST(버젼 2.0, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)를 사용하여 결정할 수 있다.

예를 들어, 바실러스 칼도테넥스로부터의 리보뉴클레아제 HⅡ의 아미노산 서열(서열번호 9)과 적어도 44%의 상동성, 바실러스 칼도데넥스로부터의 리보뉴클레아제 HⅢ의 아미노산 서열(서열번호 17)과 적어도 47%의 상동성, 피로코커스 퓨리오서스로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 23)과 적어도 69%의 상동성, 써모토가 마리티마로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 59)과 적어도 53%의 상동성, 아캐오글로부스 풀기두스로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 37)과 적어도 51%의 상동성, 써모코커스 리토랄리스로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 47)과 적어도 65%의 상동성, 써모코커스 셀레르로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 57)과 적어도 71%의 상동성, 또는 피로코커스 호리코쉬이로부터의 리보뉴클레아제 H의 아미노산 서열(서열번호 32)과 적어도 71%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드가 내열성 RNase H 활성을 갖는 한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어, (1) 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 미생물의 배양물로부터의 정제, 또는 (2) 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하는 형질전환체의 배양물로부터의 정제에 의해 제조될 수 있다.

(1) 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 미생물의 배양물로부터의 정제

본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 미생물의 예를 들면 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입 가능한 바실러스 칼도테넥스(DSM406), 피로코커스 퓨리오서스(DSM3638), 써모토가 마리티마(DSM3109), 아캐오글로부스 풀기두스(DSM4139), 써모코커스 리토랄리스(DSM5473) 또는 써모코커스 셀레르(DSM2476), 또는 Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)으로부터 구입 가능한 피로코커스 호리코쉬이(JCM9974)를 들 수 있다. 미생물을 미생물 증식에 적합한 조건 하에서 배양한다. 바람직하게는, 관심 있는 폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키는 배양 조건을 사용한다. 세포 또는 배양 배지에서 생산된 관심 있는 폴리펩타이드는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 방법에 따라 정제될 수 있다.

내열성 세균을 배양하는데 통상적으로 사용되는 방법을 상기 균주를 배양하는데 사용할 수 있다. 균주에 의해 사용될 수 있는 영양분을 배양 배지에 첨가한다. 예를 들어, 전분을 탄소원으로, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출물을 질소원으로 사용할 수 있다. 마그네슘 염, 나트륨 염 또는 철 염과 같은 금속 염을 미량원소로 배양 배지에 가할 수 있다. 또한, 예를 들어, 내열성 해양 세균의 경우 배양 배지의 제조를 위해 인공 해수를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

배양은 정치 배양 또는 스피너 배양일 수 있다. 예를 들어, Applied and Environmental Microbiology, 55: 2086-2088(1992)에 기재된 바와 같은 투석 배양법을 사용할 수 있다. 폴리펩타이드의 생산성이 최대가 되도록 균주 또는 배양 배지의 조성에 따라 배양 조건과 배양 시간을 결정하는 것이 바람직하다.

폴리펩타이드를 얻기 위하여 무세포 추출물을 먼저 제조한다. 무세포 추출물을 예를 들어, 원심분리, 여과 등에 의해 배양물로부터 세포를 모은 후, 세포를 파쇄하여 제조할 수 있다. 관심 있는 효소를 추출하는데 유효한 세포 파쇄법은 초음파 처리, 비드를 이용한 파쇄, 용균 효소로의 처리 등으로부터 선택될 수 있다. 폴리펩타이드가 배양 상등액으로 분비되면, 배양 상등액에 있는 폴리펩타이드는 황산암모늄 침전, 한외여과 등에 의해 농축된다. 농축된 폴리펩타이드를 무세포 추출물로 사용한다. 단백질을 정제하는데 통상적으로 사용되는 방법을 그렇게 얻은 무세포 추출물로부터 폴리펩타이드를 분리하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피 등을 복합하여 사용할 수 있다.

(2) 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체의 배양물로부터의 정제

본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 예를 들어 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 함유하는 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체로부터 얻을 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 36의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다. 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 제조한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 플라스미드, pRHB11, pBCA3Nd2, pPFU220, pTM-RNH, pPHO238, pAFU204, pTLI204 및 pTCE207 중 어느 하나가 도입된 형질전환체를 배양하여 얻은 배양물로부터 정제될 수 있다.

형질전환되는 숙주는 특정의 것으로 제한되지 않으며 예를 들어 대장균, 바실러스 서브틸리스, 효모, 필라멘트상 진균, 식물, 동물, 배양 식물 세포 및 배양 동물 세포를 포함한 재조합 DNA 분야에서 통상적으로 사용되는 것들을 들 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 핵산이 lac 프로모터나 T7 파지 프로모터의 하류에 연결된 플라스미드를 갖는 대장균을 통상적인 배양 조건, 예를 들어 37 ℃에서 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.2)에서 대수 증식기까지 배양하고, 최종 농도 1 mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 첨가하고, 추가로 37 ℃에서 배양하여 배양 세포에서 폴리펩타이드를 발현시켜 얻을 수 있다.

세포를 배양 후 원심분리하여 모으고, 초음파 처리에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 모은 상등액을 무세포 추출물로 사용한다. 이 무세포 추출물은 내열성 RNase H 활성을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩타이드는 이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과, 소수성 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전과 같은 공지의 방법을 사용하여 무세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 자연적으로, 상기 정제 과정 중 얻어진 부분 정제된 산물 또한 RNase H 활성을 나타낸다. 본 발명의 핵산에 연결된 플라스미드를 갖는 대장균에서 발현된 본 발명의 폴리펩타이드는 내열성이므로, 폴리펩타이드를 정제하기 위하여 배양 세포 및/또는 무세포 추출물을 예를 들어 40 ℃ 이상의 온도에서 약 10 분간 가열하여 숙주로부터 유래된 열변성된 불용성 단백질을 제거할 수 있다. 열 처리를 위한 최적 온도 및 시간은 적절하게 선택될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드가 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 갖는 형질전환체를 사용하여 정상 온도(예: 37 ℃)에서 발현될 때, 생성되는 발현 산물은 활성, 내열성 등을 보유한다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 원래 생산 세포의 증식 온도와 상당히 다른 온도에서 발현되더라도 고유의 고차원 구조를 유지한다.

본 발명의 핵산은 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이다. 구체적으로, (1) 서열번호 9, 17, 23, 32, 37, 47, 57 또는 59의 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산; (2) 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산; (3) 엄격한 조건 하에서 (1) 또는 (2)의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있고, 상기 (1) 또는 (2)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 69%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 등이다.

뉴클레오타이드 서열의 상동성은 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac, 또는 컴퓨터 알고리즘 FASTA(버젼 3.0) 또는 BLAST(버젼 2.0)를 사용하여 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA를 의미한다. 상기 (2)의 핵산이 RNA이면, 예를 들어 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열에서 T가 U에 의해 대체된 뉴클레오타이드 서열에 의해 나타내어진다.

예를 들어, 본 발명의 핵산은 하기와 같이 얻어진다.

서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 상기 (2)의 핵산은 하기와 같이 분리될 수 있다. 게놈 DNA는 본 발명의 폴리펩타이드를 위해 상기한 바와 같이 배양한 바실러스 칼도테넥스(DSM406), 피로코커스 퓨리오서스(DSM3638), 써모토가 마리티마(DSM3109), 아캐오글로부스 풀기두스(DSM4139), 써모코커스 리토랄리스(DSM5473) 또는 써모코커스 셀레르(DSM2476), 또는 피로코커스 호리코쉬이(JCM9974)로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 게놈 DNA를 사용하여 DNA 라이브러리를 제작한다. 핵산을 DNA 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 또한, 주형으로 게놈 DNA를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 증폭하여 핵산을 얻을 수 있다.

더욱이, 본 발명의 폴리펩타이드의 것과 유사한 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 본 발명에 의해 제공되는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열번호 8, 16, 22, 31, 36, 46, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열)에 기초하여 얻을 수 있다. 구체적으로, 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA는 세포로부터 추출된 DNA 또는 DNA를 주형으로 사용하여 얻어진 PCR 산물로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 핵산 서열의 일부를 혼성화 탐침으로 사용하여 스크리닝할 수 있다. 다르게는, 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA는 상기 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 이용하여 PCR과 같은 유전자 증폭방법을 사용하여 증폭할 수 있다. 또한, 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴 리펩타이드를 코딩하는 DNA는 화학 합성할 수 있다. 상기 (1) 또는 (3)의 핵산을 그러한 방법에 따라 얻을 수 있다.

관심 있는 핵산의 일부만을 함유하는 핵산 단편을 상기 방법에 따라 얻을 수 있다. 이 경우, 관심 있는 전체 핵산을 아래와 같이 얻을 수 있다. 얻어진 핵산 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 단편이 관심 있는 핵산의 일부임을 확인한다. 혼성화를 탐침으로서 핵산 단편 또는 그의 일부를 사용하여 수행한다. 다르게는, PCR을 핵산 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성한 프라이머를 사용하여 수행한다.

"엄격한 조건 하에서 혼성화한다"는 T, Maniatis 등(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재된 바와 같은 조건, 예를 들어 하기 조건 하에서 혼성화할 수 있는 것을 가리킨다. 핵산을 고정화시킨 막을 탐침과 함께 50 ℃에서 0.5% SDS, 0.1% 소혈청알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜 400 및 0.01% 변성 연어 정자 핵산을 함유하는 6×SSC(1×SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산 나트륨, pH 7.0) 중에서 12 내지 20 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 고정화된 핵산을 배경으로부터 구별할 수 있을 때까지 SSC 농도를 0.1×까지 낮추고 온도를 50 ℃까지 높이면서 막을 37 ℃에서 0.5% SDS를 함유하는 2×SSC로 세척한 후, 탐침을 검출한다. 그렇게 얻은 신규 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 상기한 바와 같이 결정하여, 핵산이 관심 있는 핵산인지 여부를 확인한다.

본 발명을 제한하고자 하는 것은 아닐지라도, 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하면, "엄격한 조건"은 예를 들어 6×SSC, 0.5% SDS, 5×덴하르츠 및 0.01% 변성 연어 정자 핵산을 함유하는 용액에서 밤새 [Tm-25 ℃]의 온도에서의 인큐베이션을 가리킨다.

올리고뉴클레오타이드 탐침이나 프라이머의 Tm은 예를 들어 하기 등식에 의해 결정될 수 있다:

Tm=81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(%G+C)-(600/N)

상기 식에서, N은 올리고뉴클레오타이드 탐침이나 프라이머의 쇄 길이이고; %G+C는 올리고뉴클레오타이드 탐침이나 프라이머에서 구아닌과 시토신의 함량이다.

올리고뉴클레오타이드 탐침이나 프라이머의 쇄 길이가 18 염기 보다 짧으면, Tm은 예를 들어, A+T(아데닌과 티민) 잔기 수에 2를 곱한 것(℃)과 G+C 잔기 수에 4를 곱한 것(℃)의 합[(A+T)×2+(G+C)×4]으로서 측정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산은 상기한 바와 같이, 여기에 개시된 것과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않더라도 내열성 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 한 본 발명의 범위에 포함된다.

유전자에서 아미노산을 지정하는, 1 내지 6 개의 코돈(들)(3 염기의 결합)이 각각의 아미노산에 할당되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 아미노산 서열에 의존하기는 하지만, 많은 핵산이 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 핵산은 자연에서 반드시 안정할 필요는 없다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변 이 생성이 드물지는 않다. 핵산에서 생성된 돌연변이는 코딩되는 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수 있다(침묵 돌연변이라 불림). 이 경우, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 핵산이 생성된다고 말할 수 있다. 따라서, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산이 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유하는 개체의 계대 동안 생성될 수 있음을 부인할 수 없다. 더욱이, 다양한 유전공학 기술을 이용한다면 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조하는 것은 어렵지 않다.

예를 들어, 관심 있는 단백질을 코딩하는 원래 핵산에 사용된 코돈이 유전공학에 의해 단백질을 생산하기 위해 사용하고자 하는 숙주에서 그 코돈 사용도가 낮은 것인 경우, 단백질의 발현 수준은 낮을 수 있다. 이 경우, 관심 있는 단백질의 발현 수준을 높이기 위하여 코딩되는 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 코돈을 숙주에서 빈번하게 사용되는 것으로 인공적으로 전환시킨다(예: JP-B 7-102146). 상기한 바와 같이, 물론 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조할 수 있다. 그들은 또한 자연적으로 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(예: 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산)을 적절한 벡터에 결찰시켜 재조합 DNA를 제작할 수 있다. 재조합 DNA를 제작하는데 사용하되는 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 및 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA 목적에 적합한 벡터를 선택할 수 있다.

더욱이, 재조합 DNA를 적절한 숙주에 도입시켜 형질전환체를 제조할 수 잇 다. 형질전환체 제조에 사용되는 숙주는 특별히 제한되는 것은 아니다. 세균, 효모, 필라멘트상 진균과 같은 미생물 및 동물, 식물, 곤충 등의 배양 세포를 사용할 수 있다. 형질전환체를 배양하여 배양물에서 본 발명의 폴리펩타이드를 제조함으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 대량으로 제조할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 고온균 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase H의 제조

바실러스 칼도테넥스 YT-G(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen으로부터 구입; DSM406)를 0.2% 트립톤(딥코 래보러토리즈) 및 1.5% 효모 추출물(딥코 래보러토리즈)을 함유하는 배지 100 ㎖에 접종하고, 60 ℃에서 140 분 동안 교반 배양하고 예비-배양물로 사용하였다. 30 ㎖의 예비-배양물을 동일한 조성을 갖는 3 ℓ의 배지에 접종하고 60 ℃ 온도에서 5 시간 동안 2.5 ℓ/분으로 통기시키고 250 rpm으로 교반하면서 배양하였다.

배양물을 5000×g에서 15 분동안 원심분리하여 세포를 모았다. 402 g(습윤 중량)의 세포를 10 mM 머캅토에탄올, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA 및 20 μM PAPMSF를 함유하는 50 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 1000 ㎖에 현탁하고 MINI-Lab(APV GAULIN/RANNIE)을 사용하여 파쇄하였다. 세포 찌꺼기를 원심분리에 의해 제거하고 상등액을 회수하였다.

폴리에틸렌 이민 용액을 생성된 상등액에 최종 농도 0.1%로 가하였다. 교반 후, 혼합물을 1 시간 동안 방치하였다. 그 후 상등액을 원심분리에 의해 회수하였다. 황산암모늄을 상등액에 50% 포화도로 가하였다. 원심분리로 얻은 침전물을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해시켰다. 용액을 동일한 완충액으로 투석하였다. 투석한 샘플을 동일한 완충액으로 평형화시킨 280-㎖ DE52 컬럼(와트만)상에 로딩하고 비흡착 분획을 모았다.

컬럼을 평형화에 사용된 완충액 420 ㎖로 더 세척하고 세척 분획을 모았다. DE52 컬럼 크로마토그래피로부터의 비흡착성 분획과 세척 분획을 혼합하고 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 240-㎖ P-11 컬럼(와트만)상으로 로딩하였다. 그 후 0 내지 0.5 M NaCl을 함유하는 평형화 완충액을 사용하여 용출을 수행하였다.

생성된 활성 분획을 투석 튜브에 위치시켰다. 튜브를 4 ℃에서 탈수-농축을 위하여 고체 폴리에틸렌 글리콜 20000상에 위치시켰다. 그 후 효소 농축물을 5 mM 머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA, 30 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 25 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 300-㎖ 슈퍼덱스 G-200 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)상으로 로딩하였다. 평형화에 사용된 완충액을 사용하여 용출을 수행하여 활성 분획을 얻었다. 활성 분획을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 15-㎖ 헤파린-세파로스 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)상으로 로딩하였다. 0 내지 0.5 M NaCl을 함유하는 평형 완충액을 사용하여 용출을 수행하였다.

생성된 활성 분획을 10 mM 머캅토에탄올, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 5-㎖ Hitrap-SP 칼럼(아머샴 파마시아 바이오텍)상으로 로딩하였다. 0 내지 0.5 M NaCl을 함유하는 평형 완충액을 사용하여 용출을 수행하였다. 생성된 활성 분획을 5 mM 머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA, 30 mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유하는 25 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 300-㎖ 슈퍼덱스 G-200 컬럼상으로 다시 로딩하였다. 생성된 활성 분획을 RNase H 제제(효소 용액)로 사용하였다.

내열성 RNase H 활성을 아래와 같이 측정하였다.

1 ㎎의 폴리(rA) 또는 폴리(dT)(모두 아머샴 파마시아 바이오텍 제품)를 1 mM EDTA를 함유하는 1 ㎖의 40 mM 트리스-HCl(pH 7.7)에 용해시켜 폴리(rA) 용액과 폴리(dT) 용액을 제조하였다.

그 후 폴리(rA) 용액(최종 농도 20 ㎍/㎖)과 폴리(dT) 용액(최종 농도 30 ㎍/㎖)을 4 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤을 함유하는 40 mM 트리스-HCl(pH 7.7)에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 4 ℃로 냉각시켜 폴리(rA)-폴리(dT) 용액을 제조하였다.

1 ㎕의 효소 용액을 100 ㎕의 폴리(rA)-폴리(dT) 용액에 가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰 다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서, 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 반응 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 흡광도를 측정하였다. EDTA 부재 시 반응에 대한 흡광도에서 대조군에 대한 흡광도를 빼 값(흡광도 차이)을 얻었다. 따라서, 효소 반응에 의해 폴리(rA)-폴리(dT) 하이브리드로부터 방출된 뉴클레오타이드의 농도를 흡광도 차이에 기초하여 결정하였다. 1 유닛의 RNase H를 아래 등식에 따라 계산한 10 분에 1 nmol의 리보뉴클레오타이드의 방출에 상응하여 A₂₆₀을 증가시킨 효소 량으로 정의하였다:

유닛=[흡광도 차이×반응 부피(㎖)]/0.0152

실시예 2: 바실러스 칼도테넥스 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 바실러스 칼도테넥스로부터 게놈 DNA의 제조

바실러스 칼도테넥스 YT-G(DSM406)를 60 ㎖의 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 0.5% NaCl, pH 7.2)에 접종하고 65 ℃에서 20 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양물을 원심분리하여 세포를 모았다. 세포를 2 ㎖의 25% 슈크로스와 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 0.2 ㎖의 10 ㎎/㎖ 염화 라이소자임(나칼라이 테스크) 수용액을 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.1 ㎖의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조)를 함유하는 12 ㎖의 혼합물과 1 ㎖의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

그 후 2.1 ㎖의 5 M NaCl과 2 ㎖의 CTAB-NaCl 용액[10% 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(나칼라이 테스크) 및 0.7 M NaCl]을 혼합물에 가하고 생성된 혼합물을 완전히 혼합하여 65 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 동일 부피의 클로로포름/이소아밀 알콜(24:1, v/v) 혼합물을 가하였다. 생성된 혼합물을 10 분간 부드럽게 혼합한 후 10 분간 10,000×g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 동일 부피의 100 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 포화된 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1, v/v) 혼합물을 생성된 상등액에 가하였다. 생성된 혼합물을 10 분간 부드럽게 혼합한 후 10 분간 10,000×g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 0.6 부피의 2-프로판올을 생성된 상등액에 가하였다. 생성된 섬유상 침전물을 유리 막대기를 사용하여 감고, 70% 에탄올 수용액으로 세척하고, 공기-건조시킨 후 0.5 ㎖ TE 완충액에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 얻었다.

(2) RNase HⅡ 유전자 중간 부분의 클로닝

서열번호 1과 2로 나타내어진 올리고뉴클레오타이드 BsuⅡ-3과 BsuⅡ-6을 다양한 개체로부터의 RNase HⅡ의 아미노산 서열 간에 보존된 부분인 모티프 Ⅰ과 모티프 Ⅲ을 기초로 하여 합성하였다(Biochemistry, 38: 605-608(1999)).

주형으로 실시예 2-(1)에서 제조한 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA 용액 1 ㎕와, 프라이머로 각각 100 pmol의 BsuⅡ-3 및 BsuⅡ-6를 사용하여 100 ㎕ 부피 중에서 PCR을 수행하였다. TaKaRa Taq(다카라 슈조)을 첨부된 프로토콜에 따라 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초간, 45 ℃ 30 초간, 72 ℃ 1 분간 50 사이클). 반응 후, 반응 혼합물을 페놀 처리 한 후 에탄올 침전시켜 DNA를 정제하였다. 생성된 DNA를 T4 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 사용하여 평활-말단화시킨 후 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 0.4 kb의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 0.4-kb DNA 단편을 T4 DNA 리가제(다카라 슈조)를 사용하여 SmaⅠ으로 분해된 pUC119(다카라 슈조)로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 대장균 JM109를 형질전환시키는데 사용하였다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 0.4-kb 단편이 삽입된 플라스미드 21-12를 얻었다.

(3) RNase HⅡ 유전자의 상류 부분 클로닝

실시예 2-(2)에서 얻은 플라스미드 21-12에 약 0.4 kb 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 서열번호 3과 4로 나타낸 올리고뉴클레오타이드 RNⅡ-S1과 RNⅡ-S2를 결정된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

실시예 2-(1)에서 제조한 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA를 BamHⅠ(다카라 슈조)로 분해하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 Sau3AⅠ 카세트(다카라 슈조)로 결찰시켰다. 주형으로 결찰 혼합물을, 일차 PCR을 위한 프라이머로 RNⅡ-S2를, 이차 PCR을 위한 프라이머로 RNⅡ-S1을 사용하여, TakaRa LA PCR 시험관내 클로닝 키트(다카라 슈조)에 첨부된 프로토콜에 따라 과정을 수행하였다. 이차 PCR 후 페놀 추출에 의해 용액으로부터 DNA를 정제하였다. DNA를 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활-말단화시킨 후 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 1.5 kb의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 1.5-kb DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 SmaⅠ으로 분해된 pUC119로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰 다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 1.5-kb DNA 단편이 삽입된 플라스미드 B25N16을 얻었다.

(4) 전체 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

서열번호 5 및 6으로 나타내어지는 올리고뉴클레오타이드 RNⅡ-S5 및 RNⅡ-S6를 실시예 2-(3)에서 결정된 바와 같은 플라스미드 21-12에서 약 0.4 kb의 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

주형으로 실시예 2-(2)에서 제조한 플라스미드 21-12를, 프라이머로 RNⅡ-S5 및 RNⅡ-S6를 사용하여 PCR을 수행하였다. TaKaRa Ex Taq(다카라 슈조)을 첨부된 프로토콜에 따라 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 및 72 ℃ 30 초 25 사이클. 반응 후, 반응 혼합물을 아가로스 젤 전기영동시켰다. 약 0.3 kb의 증폭된 DNA 단편을 젤로부터 회수하였다. 약 0.3-kb DNA 단편을 DIG 하이-프라임(로쉐 다이아그노스틱스)을 이용하여 디곡시제닌으로 표지하였다.

탐침으로 디곡시제닌-표지된 DNA를 사용하여 실시예 2-(1)에서 제조한 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA의 HindⅢ(다카라 슈조), SacⅠ(다카라 슈조), 또는 HindⅢ 및 SacⅠ으로의 분해물에 대해 서던 혼성화를 수행하였다.

혼성화와 검출을 DIG 화학발광 검출 키트(로쉐 다이아그노스틱스)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다.

그 결과, 약 4.5 kb, 약 5.8 kb, 및 약 1.3 kb의 DNA 단편이 각각 HindⅢ, SacⅠ, 및 HindⅢ 및 SacⅠ으로의 분해물에 대한 탐침과 혼성화하였다.

이들 결과에 기초하여, 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA를 HindⅢ로 분해시키고 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 4.5 kb의 DNA 단편을 회수하였다. 생성된 DNA 단편을 SacⅠ으로 분해하고 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 1.3 kb의 DNA 단편을 회수하였다. 생성된 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 HindⅢ 및 SacⅠ으로 분해된 pUC19(다카라 슈조)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 HB101을 형질전환시켰다.

생성된 형질전환체를 하이본드-N(아머샴 파마시아 바이오텍)상에 레플리카-플레이팅하였다. 그 후 콜로니 혼성화를 상기 디곡시제닌-표지된 탐침을 이용하여 통상의 방법에 따라 수행하였다. 플라스미드 pRHB1을 그렇게 얻은 양성 클론으로부터 제조하였다.

그 후 pRHB1에 삽입된 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 아미노산 서열과 바실러스 서브틸리스로부터의 RNase HⅡ의 아미노산 서열의 비교는 개시 코돈으로부터 약 40 bp의 부위가 pRHB1에 있는 DNA에서 제거되었음을 암시하였다. 그 후, 전장 RNase HⅡ 유전자를 아래와 같이 제작하였다.

실시예 2-(3)에서 제조한 B25N16을 HindⅢ로 분해시키고 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 160 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 약 160-bp DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 HindⅢ로 분해된 pRHB1에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 HB101을 형질전환시켰다. 플라스미드를 생성된 형질전환체로부터 제 조하였다.

다음, 서열번호 7에 의해 나타내어지는 올리고뉴클레오타이드 RNⅡ-Nde를 개시 코돈 근처의 추정 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다. 주형으로 형질전환체로부터 제조된 플라스미드를, 프라이머로 RNⅡ-Nde 및 RNⅡ-S6를 사용하여 PCR을 수행하였다. 약 0.7 kb의 DNA 단편을 증폭시킨 플라스미드를 선별하고 pRHB11로 명명하였다.

그렇게 얻은 플라스미드 pRHB11에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 결과 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 밝혔다. 이 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 8에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ의 아미노산 서열을 서열번호 9에 나타내었다.

플라스미드 pRHB11로 형질전환된 대장균 HB101을 대장균 HB101/pRHB11로 명명 및 표시하고, 일본, 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 2000. 9. 5자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7655로 기탁하였다.

(5) 바실러스 칼도테넥스 RNase HⅡ 유전자의 발현

pRHB11 또는 pRHB1으로 형질전환된 대장균 HB101을 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 0.5 ㎖의 TE 완충액에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 원심분리에 의해 얻은 상등액을 조 세포 추출물로 사용하였다.

10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM DTT(나칼라이 테스크), 0.003% BSA(분획 Ⅴ, 시그마), 4% 글리세롤, 20 ㎍/㎖ 폴리(dT)(아머샴 파마시아 바이오텍) 및 30 ㎍/㎖ 폴리(rA)(아머샴 파마시아 바이오텍)를 함께 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션하고 RNase H 활성을 측정하기 위한 기질 용액으로 사용하였다.

1 ㎕의 1 M MnCl₂를 100 ㎕의 기질 용액에 첨가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 조 세포 추출물 10 배 희석물을 혼합물에 가하여 반응을 개시하였다. 40 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, pRHB11을 갖는 대장균 HB101로부터 제조된 조 세포 추출물이 사용된 반응으로부터의 260 ㎚에서의 흡광도가 pRHB1을 갖는 대장균 HB101로부터 제조된 조 세포 추출물이 사용된 반응으로부터의 것 보다 분명히 더 높았다. 따라서, pRHB11이 RNase HⅡ 유전자를 함유하고 pRHB11을 갖는 대장균이 RNase H 활성을 발현하는 것이 입증되었다.

(6) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

실시예 2-(4)에서 얻은 pRHB11로 형질전환된 대장균 HB101을 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 52.3 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 2 mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 60 ℃에서 15 분간 원심분리하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 50.0 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

용액을 완충액 C[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 2 mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

51 ㎖의 유출 RNase HⅡ 분획을 완충액 C로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

3.0 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 C로 평형화된 PD-10 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 2 부분으로 가하였다. 7.0 ㎖의 생성된 용출액을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 C로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 310 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

4.4 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(아미콘)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 280 ㎕의 농축물을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)로 평형화된 슈퍼덱스 200 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오 텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 35 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Bca RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Bca RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 아래와 같이 측정하였다.

40 ℃에서 인큐베이션시킨 100 ㎕의 반응 혼합물[20 mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 0.01% 소혈청알부민(다카라 슈조), 1% 디메틸설폭사이드, 10 mM 염화망간, 20 ㎍/㎖ 폴리(dT)(아머샴 파마시아 바이오텍), 30 ㎍/㎖ 폴리(rA)(아머샴 파마시아 바이오텍)]를 1 ㎕의 Bca RNase HⅡ 제제에 가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 10 ㎕의 0.5 M EDTA(pH 8.0)를 가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, RNase H 활성을 Bca RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 3: 바실러스 칼도테넥스 RNase HⅢ 유전자의 클로닝

(1) RNase HⅢ 유전자 단편의 클로닝

RNase HⅢ를 코딩하는 유전자를 스크리닝하기 위하여 서열번호 10 내지 13에 의해 나타내어지는 프라이머 BsuⅢ-1, BsuⅢ-3, BsuⅢ-6 및 BsuⅢ-8을 바실러스 서브틸리스로부터의 RNase HⅢ의 아미노산 서열 사이의 상동성에 기초하여 결정된 바실러스 서브틸리스와 다른 개체 간에 잘 보존된 부위의 아미노산 서열[Otani, N. 등, Biochemistry, 38: 605-608(1999)]에 기초하여 합성하였다.

제1 PCR을 주형으로 실시예 2-(1)에서 제조된 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA 200 ng을, 프라이머로 각각 100 pmol의 BsuⅢ-1 및 BsuⅢ-8을 사용하여 50 ㎕ 부피에서 수행하였다. 그 후 제2 PCR을 주형으로 1 ㎕의 반응 혼합물을, 프라이머로 각각 100 pmol의 BsuⅢ-3 및 BsuⅢ-6를 사용하여 100 ㎕의 부피에서 수행하였다. TaKaRa Taq 폴리머라제(다카라 슈조)를 두 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 45 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 25(제1 PCR) 및 30(제2 PCR) 사이클.

약 450 bp의 증폭된 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 사용하여 평활-말단화시킨 후 아가로스 젤 전기영동시켜 약 450 bp의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 450-bp DNA 단편을 T4 DNA 리가제(다카라 슈조)를 사용하여 SmaⅠ(다카라 슈조)으로 분해된 pUC119(다카라 슈조)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 450-bp DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pBCA3204를 얻었다.

(2) 서던 혼성화 방법을 이용한 RNase HⅢ 유전자의 클로닝

실시예 3-(1)에서 얻은 pBCA3204에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 서열번호 14 및 15로 나타내어지는 프라이머 RNⅢ-S3 및 BcaRNⅢ-3를 결정된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다. 주형으로 pBCA3204를, 프라이머로 RNⅢ-S3 및 BcaRNⅢ-3를 사용하여 100 ㎕ 부피에서 PCR을 수행하였다. TaKaRa Z-Taq(다카라 슈조)을 첨부된 프로토콜에 따라 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 98 ℃ 0 초, 55 ℃ 0 초, 및 72 ℃ 20 초 30 사이클. 반응 후, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 아가로스 젤 전기영동시켜 약 0.4 kb의 DNA 단편을 젤로부터 회수하였다. 약 0.4-kb DNA 단편을 DIG DNA 라벨링 키트(베링거 만하임)를 이용하여 표지하여 탐침을 제조하였다.

실시예 2-(1)에서 제조된 바실러스 칼도테넥스 DNA 20 ㎍을 BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, PstⅠ 또는 XbaⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 완전히 분해하였다. 그 후 각 분해물의 절반을 아가로스 젤 전기영동시켰다. DNA를 아가로스 젤로부터 나일론 막으로 0.4 N NaOH를 사용하여 옮기고 120 ℃에서 30 분간 고정시켰다. 막을 60 ℃, 30 ㎖의 혼성화 완충액[43.4 g/ℓ 염화나트륨, 17.6 g/ℓ 시트르산나트륨, 1% 차단제(베링거 만하임), 0.1% N-라우릴 사르코신, 0.02% 라우릴황산나트륨(SDS)]을 함유하는 밀봉 백에서 4 시간 동안 예비-인큐베이션시킨 후, 60 ℃, 탐침을 함유하는 혼성화 완충액 5 ㎖를 함유하는 밀봉 백에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다.

막을 실온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC(17.5 g/ℓ NaCl, 7.7 g/ℓ 시트르산나트륨) 50 ㎖에서 2 회, 45 ℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.5×SSC(4.4 g/ℓ 염화나트륨, 1.9 g/ℓ 시트르산나트륨)에서 2 회 세척하였다. 그 후, 탐침에 상보적인 서열을 갖는 약 8 kb의 EcoRⅠ 단편, 약 4.5 kb의 PstⅠ 단편, 및 약 1 kb의 HindⅢ 단편을 DIG 핵산 검출 키트(베링거 만하임)를 사용하여 검출하였다.

PstⅠ으로 완전 분해된 바실러스 칼도테넥스 게놈 DNA의 나머지 절반을 아가로스 젤 전기영동시켰다. 약 4.5 kb의 PstⅠ 단편을 젤로부터 회수하였다. 그 후 DNA 단편을 PstⅠ으로 분해되고 알칼라인 포스파타제(다카라 슈조)로 탈인산화된 플라스미드 벡터 pTV119N에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

프라이머로 RNⅢ-S3 및 BcaRNⅢ-3를, 주형으로 콜로니 중 하나를 사용하여 50 ㎕의 부피에서 PCR을 수행하여 RNase HⅢ 유전자를 갖는 것으로 추정되는 콜로니를 선별하였다. TaKaRa-Z Taq(다카라 슈조)을 PCR을 위해 첨부된 프로토콜에 따라 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 98 ℃ 0 초, 55 ℃ 0 초, 및 72 ℃ 20 초 30 사이클. 그 결과, 관심 있는 유전자가 콜로니 번호 88에 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다.

주형으로 콜로니 번호 88으로부터 제조된 플라스미드와 프라이머 쌍 RN-N(다카라 슈조)와 BcaRNⅢ-3 또는 프라이머 쌍 M4(다카라 슈조)와 RNⅢ-S3를 사용하여 PCR을 수행하여 전체 RNase HⅢ 유전자가 플라스미드에 함유되어 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과 증폭 산물의 길이에 기초하여 전체 RNase HⅢ 유전자가 pBCA3P88로 명명된 플라스미드에 함유되어 있는 것으로 예상되었다.

(3) RNase HⅢ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 3-(2)에서 얻은 플라스미드 pBCA3P88에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 RNase HⅢ의 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 존재가 밝혀졌다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열과 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase H Ⅲ의 아미노산 서열을 각각 서열번호 16 및 17에 나타내었다.

(4) RNase HⅢ를 발현하기 위한 플라스미드의 제작

주형으로 실시예 3-(2)에 기재된 플라스미드 pBCA3P88과, RNase HⅢ의 상기 오픈 리딩 프레임 부근의 서열을 참고로 하여 설계된 서열번호 18에 의해 나타내어지는 BcaRNⅢNde 및 M13 프라이머 M4(다카라 슈조)를 사용하여 100 ㎕ 부피에서 PCR을 수행하였다. 피로베스트 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 첨부된 프로토콜에 따라 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 3 분의 30 사이클. 약 4 kb의 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ(다카라 슈조)으로 분해하고 아가로스 젤 전기영동시켜 젤로부터 약 1.4 kb의 NdeⅠ 단편을 회수하였다. 약 1.4-kb DNA 단편을 NdeⅠ으로 분해되고 알칼라인 포스파타제(다카라 슈조)로 탈인산화된 pTV119Nd(pTV119N의 NcoⅠ 위치가 NdeⅠ 위치로 전환된 플라스미드)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

다음으로, NdeⅠ 단편에 있는 RNase HⅢ 유전자가 벡터 pTV119Nd의 lac 프로모터로부터의 하류에 연결된 플라스미드를 스크리닝하기 위하여 주형으로 콜로닝 중 하나를, 프라이머로 RV-N(다카라 슈조) 및 BcaRNⅢ-3(서열번호 15)를 사용하여 50 ㎕ 부피에서 PCR을 수행하였다. 그 후 RNase HⅢ 유전자를 갖는 것으로 추정되는 콜로니를 선별하였다. TaKaRa-Z Taq(다카라 슈조)을 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 98 ℃ 0 초, 55 ℃ 0 초 및 72 ℃ 20 초의 30 사이클. 그 결과, 콜로니 번호 2가 NdeⅠ 단편의 RNase HⅢ 유전자가 벡터 pTV119Nd에 있는 lac 프로모터로부터의 하류에 연결되어 있는 플라스미드를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 플라스미드를 pBCA3Nd2라 명명하였다.

디데옥시 방법에 의한 플라스미드로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정으로 개시 코돈 GTG가 ATG로 바뀐 것을 제외하고는 PCR로 인해 돌연변이가 일어나지 않았음을 밝혔다.

플라스미드 pBCA3Nd2로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pBCA3Nd2라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키-켄 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2000. 9. 5자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7653으로 기탁하였다.

(5) 정제된 RNase HⅢ 제제의 제조

실시예 3-(4)에서 얻은 pBCA3Nd2로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 39.6 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 60 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 39.8 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마 시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅢ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

45 ㎖의 유출 RNase HⅢ 분획을 완충액 B[50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA]로 2 시간 동안 투석시켰다. 투석을 동일한 조건 하에서 2 회 더 반복하였다. 55.8 ㎖의 투석된 효소 용액을 완충액 B로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 105 mM NaCl로 용출된 RNase HⅢ를 함유하는 분획을 얻었다.

1 M NaCl을 함유하는 완충액 B를 7.0 ㎖의 분획에 가하여 NaCl 농도를 150 mM로 만들었다. 혼합물을 150 mM NaCl을 함유하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하였다. 그 결과, RNase HⅢ가 HiTrap-헤파린 컬럼으로부터 유출되었다.

7.5 ㎖의 유출 RNase HⅢ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 190 ㎕의 농축물을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl로 평형화된 슈퍼덱스 200 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅢ가 33 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅢ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅢ를 Bca RNase HⅢ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Bca RNase HⅢ 제제의 효소 활성을 아래와 같이 측정하였다.

40 ℃에서 인큐베이션시킨 100 ㎕의 반응 혼합물[20 mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 0.01% 소혈청알부민(다카라 슈조), 1% 디메틸설폭사이드, 4 mM 아세트산 마그네슘, 20 ㎍/㎖ 폴리(dT)(아머샴 파마시아 바이오텍), 30 ㎍/㎖ 폴리(rA)(아머샴 파마시아 바이오텍)]를 1 ㎕의 Bca RNase HⅢ 제제에 가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 10 ㎕의 0.5 M EDTA(pH 8.0)를 가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 260 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, RNase H 활성을 Bca RNase HⅢ 제제에서 관찰하였다.

실시예 4: 피로코커스 퓨리오서스 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 피로코커스 퓨리오서스로부터의 게놈 DNA의 제조

1% 트립톤(딥코 래보러토리즈), 0.5% 효모 추출물(디코 래보러토리즈), 1% 가용성 전분(나칼라이 테스크), 3.5% 자마린 S 고체(자마린 래보러토리), 0.5% 자마린 S 액체(자마린 래보러토리), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂O, 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂O, 0.0001% ZnSO₄, 0.1 ppm CuSO₄·5H₂O, 0.1 ppm KAl(SO₄)₂, 0.1 ppm H₃BO₄, 0.1 ppm NaMoO₄·2H₂O 및 0.25 ppm NiCl₂·6H₂O를 2-ℓ 배지 병에 위치시키고, 120 ℃에서 20 분간 멸균시키고, 질소 가스로 버블링시켜 용해된 산소를 제거한 후, 피로코커스 퓨리오서스(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen으로부터 구입; DSM638)를 배지에 접종하고 95 ℃에서 16 시간 동안 교반하지 않고 배양하였다. 배양 후, 세포를 원심분리로 모았다.

그 후 생성된 세포를 4 ㎖의 25% 슈크로스, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현 탁시켰다. 여기에 0.4 ㎖의 10 ㎎/㎖ 염화 라이소자임(나칼라이 테스크) 수용액을 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.2 ㎖의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조) 및 2 ㎖의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 함유하는 혼합물 24 ㎖을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시킨 후 에탄올 침전시켜 약 1 ㎎의 게놈 DNA를 제조하였다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 클로닝

피로코커스 호리코쉬이의 전체 게놈 서열은 알려져 있다[Kawarabayashi, Y. 등, DNA Research, 5: 55-76(1998)]. 게놈에서 RNase HⅡ의 상동체(PH1650)을 코딩하는 유전자의 존재가 알려져 있다(서열번호 19, National Institute of Technology and Evaluation의 홈페이지: http://www.nite.go.jp/).

PH1650 유전자(서열번호 19)와 피로코커스 퓨리오서스의 일부 공개된 게놈 서열(유타 대학의 홈페이지, 유타 게놈 센터: http://www.genome.utah.edu/sequence.html) 간의 상동성을 검색하였다. 그 결과 고도로 상동적인 서열을 발견하였다. 프라이머 1650Nde(서열번호 20) 및 1650Bam(서열번호 21)을 상동성 서열을 기초로 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 4-(1)에서 제조된 피로코커스 퓨리오서스 DNA 200 ng을, 프라이머로 각각 20 pmol의 1650Nde 및 1650Bam을 사용하여 100 ㎕ 부피에서 수행하였다. TaKaRa Ex Taq 폴리머라제(다카라 슈조)를 PCR을 위하여 첨부된 프로 토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 30 사이클. 약 0.7 kb의 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ과 BamHⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시켰다. 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(노바젠)에 있는 NdeⅠ 위치와 BamHⅠ 위치 사이에 삽입시켜 플라스미드 pPFU220을 제조하였다.

(3) RNase HⅡ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 4-(2)에서 얻은 플라스미드 pPFU220에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임의 존재가 밝혀졌다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 22에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ 아미노산 서열을 서열번호 23에 나타내었다.

플라스미드 pPFU220으로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pPFU220이라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2000. 9. 5자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7654로 기탁하였다.

(4) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

대장균 HMS174(DE3)(노바젠)를 실시예 4-(2)에서 얻은 pPFU220으로 형질전환시켰다. 생성된 pPFU220을 갖는 대장균 HMS174(DE3)를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배 양 후, 원심분리로 모은 세포를 66.0 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 80 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 61.5 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

60.0 ㎖의 유출 RNase HⅡ 분획을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

2.0 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 250 ㎕의 농축물을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl로 평형화된 슈퍼덱스 200 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 17 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Pfu RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Pfu RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Pfu RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 5: 써모토가 마리티마 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 써모토가 마리티마로부터의 게놈 DNA의 제조

1% 트립톤(딥코 래보러토리즈), 0.5% 효모 추출물(디코 래보러토리즈), 1% 가용성 전분(나칼라이 테스크), 3.5% 자마린 S 고체(자마린 래보러토리), 0.5% 자마린 S 액체(자마린 래보러토리), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂O, 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂O, 0.0001% ZnSO₄, 0.1 ppm CuSO₄·5H₂O, 0.1 ppm KAl(SO₄)₂, 0.1 ppm H₃BO₃, 0.1 ppm NaMoO₄·2H₂O 및 0.25 ppm NiCl₂·6H₂O를 함유하는 2 ℓ의 배지를 2-ℓ 배지 병에 위치시키고, 120 ℃에서 20 분간 멸균시키고, 질소 가스로 버블링시켜 용해된 산소를 제거한 후, 써모토가 마리티마 퓨리오서스(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen로부터 구입; DSM3109)를 배지에 접종하고 85 ℃에서 16 시간 동안 교반하지 않고 배양하였다. 그 후, 300 ㎖의 배양물로부터 원심분리에 의해 모은 세포를 3 ㎖의 TE 완충액[10 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA]에 현탁시켰다. 여기에 15 ㎕의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조) 및 150 ㎕의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

반응 후, 0.5 ㎖의 5 M NaCl을 혼합물에 가하였다. 완전히 혼합한 후, 0.4 ㎖의 CTAB-NaCl 용액[10% 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(나칼라이 테스크), 0.7 M MaCl]을 혼합물에 가하였다. 완전히 혼합한 후, 혼합물을 65 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물(24:1, v/v) 1.5 ㎖를 가하였다. 혼합물을 10 분간 부드럽게 혼합하고 20,000×g에서 5 분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 동일 부피의 100 mM 트리스-HCl(pH 8.0)로 포화된 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1, v/v)의 혼합물을 생성된 상등액에 가하였다. 혼합물을 10 분간 부드럽게 혼합한 후 20,000×g에서 5 분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 0.6 부피의 2-프로판올을 상등액에 가하였다. 10,000×g에서 5 분간 원심분리하여 얻은 침전물을 70% 에탄올 수용액으로 세척하고, 공기-건조시킨 후 200 ㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 얻었다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 클로닝

주형으로 써모토가 마리티마 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행함으로써 RNase HⅡ 유전자를 함유하는 증폭된 DNA 단편을 얻기 위하여, 서열번호 24 내지 27에 의해 나타내어지는 올리고뉴클레오타이드 915-F1, 915-F2, 915-R1 및 915-R2를 써모토가 마리티마의 게놈 DNA의 뉴클레오타이드 서열(http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)에서 RNase HⅡ 유전자로 확인된 부분의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 5-(1)에서 제조된 써모토가 마리티마 게놈 DNA를, 프라이머 쌍으로 915-F1 및 915-R1, 915-F1 및 915-R2, 915-F2 및 915-R1, 또는 915-F2 및 915-R2를 사용하여 수행하였다. TaKaRa Ex Taq 폴리머라제(다카라 슈조)를 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래 와 같이 수행하였다: 95 ℃ 0.5 분, 55 ℃ 0.5 분 및 72 ℃ 1.5 분의 30 사이클. 반응 후, 각각의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동시켜 약 0.7 kb의 증폭된 DNA 단편을 추출 및 정제하였다.

프라이머 쌍 915-F1 및 915-R1 또는 915-F1 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 HindⅢ와 XbaⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시키고 T4 DNA 리가제(다카라 슈조)를 사용하여 HindⅢ와 XbaⅠ으로 분해된 pUC19(다카라 슈조)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 0.7-kb DNA 단편이 삽입된 플라스미드 DNA를 제조하였다. 그 결과, 915-F1 및 915-R1을 사용하여 증폭된 DNA 단편을 갖는 플라스미드 번호 1 및 2, 및 915-F1 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 번호 3 및 4를 얻었다.

또한, 프라이머 쌍 915-F2 및 915-R1 또는 915-F2 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 NcoⅠ(다카라 슈조) 및 XbaⅠ으로 이중 분해시키고 T4 DNA 리가제를 이용하여 NcoⅠ 및 XbaⅠ으로 이중 분해된 pTV119N(다카라 슈조)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 0.7-kb DNA 단편이 삽입된 플라스미드 DNA를 제조하였다. 그 결과, 915-F2 및 915-R1을 사용하여 증폭된 DNA 단편을 갖는 플라스미드 번호 5 및 6, 및 915-F2 및 915-R2를 사용하여 증폭된 DNA를 갖는 플라스미드 번호 7을 수득하였다.

플라스미드 번호 7로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pTM-RNH라 명 명 및 표시하고, 일본, 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 2000. 9. 5자(원기탁일)에 수탁번호 FERM BP-7652로 기탁하였다.

(3) 써모토가 마리티마 RNase HⅡ 유전자의 발현

플라스미드 번호 1 내지 7 중 하나 또는 pUC19로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 5 ㎖의 LB 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.2)에 접종하고 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 660 ㎚에서의 흡광도가 0.5에 도달하였을 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 최종 농도 1 mM로 가하고 세포를 밤새 배양하였다. 배양 후, 원심분리에 의해 모은 세포를 1 ㎖의 TE 완충액에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 80 ℃에서 10 분간 가열하였다. 원심분리에 의해 얻은 상등액을 조 세포 추출물로 사용하였다.

흡광도를 실시예 2-(5)에 기재된 바와 같이 조 세포 추출물을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 반응을 MnCl₂ 존재 하에 수행하였을 때, 플라스미드 번호 3, 5, 6 또는 7을 갖는 대장균 JM109로부터 제조된 조 세포 추출물을 사용한 각각의 반응으로부터의 260 ㎚에서의 흡광도가 pUC19를 갖는 대장균 JM109로부터 제조된 조 추출물을 사용한 반응으로부터의 것 보다 분명히 더 높았다. 따라서, 플라스미드 3, 5, 6 및 7이 RNase HⅡ 유전자를 함유하고 이들 플라스미드 중 하나를 갖는 대장균 이 RNase H 활성을 발현하는 것이 증명되었다.

대장균에서 RNase H 활성을 발현하는 것으로 증명된 플라스미드로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 결정된 뉴클레오타이드 서열의 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임을 밝혔다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 58에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ의 아미노산 서열을 서열번호 59에 나타내었다. 그 후, PCR 시 생성된 것으로 추정되는 일 염기 치환이 플라스미드 번호 7에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열에서 관찰되어 코딩된 아미노산 잔기를 변화시키는 것이 발견되었다.

(4) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

대장균 JM109를 실시예 5-(2)에서 얻은 플라스미드 번호 7(pTM-RNH)로 형질전환시켰다. 생성된 pTM-RNH를 갖는 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 31.0 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 2 mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 32.0 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 C[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 2 mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

32.5 ㎖의 유출 RNase HⅡ 분획을 완충액 C로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

2.0 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 C로 평형화된 PD-10 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하였다. 3.5 ㎖의 생성된 용출액을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 C로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 그 결과, 약 295 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Tma RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Tma RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 2-(6)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Tma RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 6: 피로코커스 호리코쉬이 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 피로코커스 호리코쉬이로부터의 게놈 DNA의 제조

1% 트립톤(딥코 래보러토리즈), 0.5% 효모 추출물(디코 래보러토리즈), 1% 가용성 전분(나칼라이 테스크), 3.5% 자마린 S 고체(자마린 래보러토리), 0.5% 자 마린 S 액체(자마린 래보러토리), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂O, 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂O, 0.0001% ZnSO₄, 0.1 ppm CuSO₄·5H₂O, 0.1 ppm KAl(SO₄)₂, 0.1 ppm NaMoO₄·2H₂O 및 0.25 ppm NiCl₂·6H₂O를 2-ℓ 배지 병에 위치시키고, 120 ℃에서 20 분간 멸균시키고, 질소 가스로 버블링시켜 용해된 산소를 제거한 후, 피로코커스 호리코쉬이 OT3(the Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)로부터 구입; JCM9974)를 배지에 접종하고 95 ℃에서 16 시간 동안 교반하지 않고 배양하였다. 배양 후, 세포를 원심분리로 모았다.

그 후 세포를 4 ㎖의 25% 슈크로스, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 여기에 0.4 ㎖의 10 ㎎/㎖ 염화 라이소자임(나칼라이 테스크) 수용액을 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.2 ㎖의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조) 및 2 ㎖의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 함유하는 혼합물 24 ㎖을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시킨 후 에탄올 침전시켜 약 1 ㎎의 게놈 DNA를 제조하였다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 클로닝

피로코커스 호리코쉬이의 전체 게놈 서열은 알려져 있다[DNA Research, 5: 55-76(1998)]. RNase HⅡ의 상동체(PH1650)을 코딩하는 유전자의 존재가 알려져 있다(서열번호 28, National Institute of Technology and Evaluation의 홈페이지: http://www.nite.go.jp/).

PH1650 유전자(서열번호 28)의 서열에 기초하여 프라이머 PhoNde(서열번호 29) 및 PhoBam(서열번호 30)을 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 6-(1)에서 제조된 피로코커스 호리코쉬이 DNA 100 ng을, 프라이머로 각각 20 pmol의 PhoNde 및 PhoBam을 사용하여 100 ㎕ 부피에서 수행하였다. TaKaRa Ex Taq(다카라 슈조)을 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 40 사이클. 약 0.7 kb의 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ과 BamHⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시켰다. 그 후, 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(노바젠)에 있는 NdeⅠ 위치와 BamHⅠ 위치 사이에 삽입시켜 플라스미드 pPHO238을 제조하였다.

(3) RNase HⅡ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 6-(2)에서 얻은 pPHO238에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 31에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ 아미노산 서열을 서열번호 32에 나타내었다.

플라스미드 pPHO238로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pPHO238이라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2001. 2. 22자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7692로 기탁하였다.

(4) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

대장균 HMS174(DE3)(노바젠)를 실시예 6-(2)에서 얻은 pPHO238로 형질전환시켰다. 생성된 pPHO238을 갖는 대장균 HMS174(DE3)를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 34.3 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 80 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 33.5 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

35.0 ㎖의 유출 RNase HⅡ 분획을 2 ℓ의 완충액 B(50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA)로 2 시간 동안 투석하였다. 투석을 2 회 더 반복하였다. 34.5 ㎖의 투석된 효소 용액을 완충액 B로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 155 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

완충액 B를 4.0 ㎖의 분획에 가하여 NaCl 농도를 50 mM로 만들었다. 혼합물을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출하였다. 그 결과, 약 160 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

6.9 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 250 ㎕의 농축물로부터 각각 분리된 두 부분을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0)로 평형화된 슈페로스 6 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 24.5 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

상기한 바와 같이 용출된 RNase HⅡ를 Pho RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Pho RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Pho RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 7: 아캐오글로부스 풀기두스로부터의 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 아캐오글로부스 풀기두스로부터의 게놈 DNA의 제조

8 ㎖의 배양물로부터 모은 아캐오글로부스 풀기두스(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입; DSM4139) 세포를 100 ㎕의 25% 슈크로스, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 여기에 20 ㎕의 0.5 M EDTA와 10 ㎕의 10 ㎎/㎖ 염화 라이소자임(나칼라이 테스크) 수용액을 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10 ㎕의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조) 및 50 ㎕의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 함유하는 혼합물 800 ㎕를 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 공기-건조시킨 후 50 ㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 얻었다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 클로닝

아캐오글로부스 풀기두스의 전체 게놈 서열은 알려져 있다[Klenk, HP 등, Nature, 390: 364-370(1997)]. RNase HⅡ의 상동체(AF0621)을 코딩하는 유전자의 존재가 알려져 있다(서열번호 33, http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm).

AF0621 유전자(서열번호 33)의 서열에 기초하여 프라이머 AfuNde(서열번호 34) 및 AfuBam(서열번호 35)을 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 7-(1)에서 제조된 아캐오글로부스 풀기두스 게놈 DNA 30 ng을, 프라이머로 각각 20 pmol의 AfuNde 및 AfuBam을 사용하여 100 ㎕ 부피에서 수행하였다. 피로베스트 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 40 사이클. 약 0.6 kb의 증폭 DNA 단편을 NdeⅠ과 BamHⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시켰다. 그 후, 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 PTV119Nd(pTV119N에 있는 NcoⅠ 위치가 NdeⅠ 위치로 전환 된 플라스미드)에 있는 NdeⅠ 위치와 BamHⅠ 위치 사이에 삽입시켜 플라스미드 pAFU204를 제작하였다.

(3) RNase HⅡ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 7-(2)에서 얻은 플라스미드 pAFU204에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 36에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ 아미노산 서열을 서열번호 37에 나타내었다.

플라스미드 pAFU204로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pAFU204이라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2001. 2. 22자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7691로 기탁하였다.

(4) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

대장균 JM109를 실시예 7-(2)에서 얻은 pAFU204로 형질전환시켰다. 생성된 pAFU204를 갖는 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 37.1 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 15 분간 가열 하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 40.3 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

유출 RNase HⅡ 분획을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 이용하여 크로마토그래피시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

40.0 ㎖의 유출 RNase HⅡ 분획을 50 mM NaCl을 함유하는 2 ℓ의 완충액 B(50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA)로 2 시간 동안 투석하였다. 투석을 2 회 더 반복하였다. 40.2 ㎖의 투석된 효소 용액을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 그 결과, 약 240 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

7.8 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 600 ㎕의 농축물로부터 각각 분리된 네 부분을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0)로 평형화된 슈페로스 6 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 30.0 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량 은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Afu RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Afu RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Afu RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 8: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 써모코커스 리토랄리스로부터의 게놈 DNA의 제조

써모코커스 리토랄리스(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입; DSM5473) 세포를 11 ㎖의 배양물로부터 모았다. 세포를 500 ㎕의 25% 슈크로스, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 여기에 100 ㎕의 0.5 M EDTA와 50 ㎕의 10 ㎎/㎖ 염화 라이소자임(나칼라이 테스크) 수용액을 가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50 ㎕의 20 ㎎/㎖ 프로티나제 K(다카라 슈조) 및 250 ㎕의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 함유하는 혼합물 4 ㎖를 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 공기-건조시킨 후 100 ㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 얻었다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 중간 부분의 클로닝

다양한 내열성 RNase HⅡ의 아미노산 서열 간에 보존된 부분에 기초하여 서열번호 38 및 39로 나타내어지는 올리고뉴클레오타이드 RN-F1 및 RN-R0를 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 8-(1)에서 제조된 써모코커스 리토랄리스 게놈 DNA 용액 5 ㎕를, 프라이머로 각각 100 pmol의 RN-F1 및 RN-R0을 사용하여 100 ㎕ 부피에서 수행하였다. TaKaRa Taq(다카라 슈조)을 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 45 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 50 사이클. 반응 후, 마이크로콘-100(다카라 슈조)을 사용하여 반응 혼합물로부터 프라이머를 제거하고 반응 혼합물을 농축시켰다.

(3) RNase HⅡ 유전자의 상류 및 하류 부분의 클로닝

실시예 8-(2)에서 얻은 약 0.5 kb, TliF1R0의 삽입된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 상류 부분의 클로닝을 위해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 TliRN-1(서열번호 40) 및 하류 부분의 클로닝을 위해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 TliRN-2(서열번호 41)을 결정된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다. 또한, 표 1에 나타낸 바와 같은 48 프라이머를 합성하였다. 표 1에서 tag 서열은 서열번호 60에 나타내었다.

주형으로 실시예 8-(1)에서 제조한 써모코커스 리토랄리스 게놈 DNA 용액 1 ㎕와, 20 pmol의 TliRN-1 또는 20 pmol의 TliRN-2와 20 pmol의 표 1에 나타낸 48 프라이머 중 하나, 20 mM 트리스-아세테이트(pH 8.5), 50 mM 아세트산 칼륨, 3 mM 아세트산 마그네슘, 0.01 % BSA, 각각 30 μM의 dNTPs 및 2.5 유닛의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)의 배합물을 함유하는 반응 혼합물에서 PCR을 수행하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 3 분간 인큐베이션; 98 ℃ 10 초, 50 ℃ 10초, 72 ℃ 40 초의 40 사이클. 각각의 PCR 산물의 일부를 아가로스 젤 전기영동시켰다. 마이크로콘-100(다카라 슈조)을 사용하여 반응 혼합물로부터 프라이머를 제거하여 단일 밴드를 생성시키고 반응 혼합물을 농축시켰다. 농축물을 직접 서열분석하여 RNase HⅡ의 상류 또는 하류 부분을 함유하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 450-bp의 PCR-증폭된 단편 TliN7이 RNase HⅡ 유전자의 상류 부분을 함유하고 약 600-bp PCR-증폭된 단편 TliC25 및 약 400-bp의 PCR-증폭된 단편 TliC26이 RNase HⅡ 유전자의 하류 부분을 각각 함유하는 것으로 나타났다.

(4) 전체 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

Tli RNase HⅡ를 함유하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 42에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ의 아미노산 서열을 서열번호 43에 나타내었다. 프라이머 TliNde(서열번호 44) 및 TliBam(서열번호 45)을 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

주형으로 실시예 8-(1))에서 제조한 1 ㎕의 써모코커스 리토랄리스 게놈 DNA 용액을, 프라이머로 각각 20 pmol의 TliNde 및 TliBam을 사용하여 100 ㎕의 부피 중에서 PCR을 수행하였다. Ex Taq DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 및 72 ℃ 1 분 40 사이클. 약 0.7 kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeⅠ 및 BamHⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시켰다. 그 후, 플라스미드 pTLI223Nd 및 pTLI204를 플라스미드 벡터 pTV119Nd(pTV119N에서 NcoⅠ 위치가 NdeⅠ 위치로 전환된 플라스미드) 또는 pET3a(노바젠)의 NdeⅠ과 BamHⅠ 위치 사이에 생성된 DNA를 각각 도입함으로써 제작하였다.

(5) RNase HⅡ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 8-(4)에서 얻은 플라스미드 pTLI223Nd 및 pTLI204에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임의 존재가 밝혀졌다. pTLI204의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 46에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ 아미노산 서열을 서열번호 47에 나타내었다. pTLI204의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열에서 484 위치의 "T"는 pTLI223Nd의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열에서 "C"로 대체된다. 아미노산 서열에서, 162 위치의 페닐알라닌이 류신으로 대체된다.

플라스미드 pTLI204로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3)를 대장균 HMS174(DE3)/pTLI204라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2001. 2. 22자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7693으로 기탁하였다.

(6) 써모코커스 리토랄리스 RNase HⅡ 유전자의 발현

pTLI223Nd로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린과 1 mM의 IPTG를 함유하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 196 ㎕의 완충액 A에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 10 분간 가열한 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 가열된 상등액으로서 상등액을 모았다. 유사하게, pTLI204로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3)를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 상기 과정에 다라 가공하여 가열된 상등액을 얻었다.

196 ㎕의 완충액 A에 현탁시키고 원심분리에 의해 얻은 상등액을 조 세포 추출물로 사용하였다.

효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 가열된 상등액에 대해 측정하였다. 그 결과 RNase H 활성이 형질전환체 둘 다에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 활성이 뉴클레오타이드 서열이나 아미노산 서열의 치환에도 불구하고 확인되었다.

(7) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

실시예 8-(4)에서 얻은 pTLI223Nd로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 38.7 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 37.2 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

샘플을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 220 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

3 ㎖의 RNase HⅡ 분획 및 NaCl 농도가 50 mM이 되도록 첨가된 완충액 A를 함유하는 혼합물을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 A로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출하였다. 그 결과 약 320 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

6 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 약 198 ㎕의 농축물을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl로 평형화된 슈페로스 6 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 26.5 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Tli RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Tli RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Tli RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 9: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

(1) 써모코커스 셀레르로부터의 게놈 DNA의 제조

써모코커스 셀레르(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입; DSM2476) 세포를 11 ㎖의 배양물로부터 모았다. 게놈 DNA 용액을 실시예 8-(1)에 기재된 바와 같이 얻었다.

(2) RNase HⅡ 유전자의 중간 부분의 클로닝

다양한 내열성 RNase HⅡ의 아미노산 서열 간에 보존된 부분에 기초하여 서열번호 48 및 49로 나타내어지는 올리고뉴클레오타이드 RN-F1 및 RN-R0를 합성하였다.

PCR을 주형으로 실시예 9-(1)에서 제조된 써모코커스 셀레르 게놈 DNA 용액 5 ㎕를, 프라이머로 각각 100 pmol의 RN-F1 및 RN-R0을 사용하여 100 ㎕ 부피에서 수행하였다. TaKaRa Taq(다카라 슈조)을 PCR을 위하여 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 45 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분의 50 사이클. 반응 후, 증폭에 의해 얻은 약 500-bp DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 이용하여 평활-말단화한 후 아가로스 젤 전기영동시켜 약 500 bp의 증폭된 DNA 단편을 회수하였다. 약 500-bp DNA 단편을 T4 DNA 리가제(다카라 슈조)를 사용하여 SmaⅠ(다카라 슈조)으로 분해된 pUC119(다카라 슈조)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다.

생성된 형질전환체를 배양하여 약 500-bp DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTceF1R0을 얻었다.

(3) RNase HⅡ 유전자의 상류 및 하류 부분의 클로닝

실시예 9-(2)에서 얻은 플라스미드 pTceF1R0의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 상류 부분의 클로닝을 위해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 TceRN-1(서열번호 50) 및 하류 부분의 클로닝을 위해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 TceRN-2(서열번호 51)을 결정된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

주형으로 실시예 9-(1)에서 제조한 써모코커스 셀레르 게놈 DNA 용액 1 ㎕와, 20 pmol의 TliRN-1 또는 20 pmol의 TliRN-2와 20 pmol의 48 프라이머 중 하나(실시예 8 표 1에 나타낸 것), 20 mM 트리스-아세테이트(pH 8.5), 50 mM 아세트산 칼륨, 3 mM 아세트산 마그네슘, 0.01 % BSA, 각각 30 μM의 dNTPs 및 2.5 유닛의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)의 배합물을 함유하는 반응 혼합물에서 PCR을 수행하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 3 분간 인큐베이션; 98 ℃ 10 초, 50 ℃ 10초, 72 ℃ 40 초의 40 사이클. 마이크로콘-100(다카라 슈조)을 사용하여 반응 혼합물로부터 프라이머를 제거하여 PCR 산물에 대한 단일 밴드를 생성시키고 반응 혼합물을 농축시켰다. 농축물을 직접 서열분석하여 RNase HⅡ의 상류 또는 하류 부분을 함유하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 450-bp의 PCR-증폭된 단편 TceN24가 RNase HⅡ 유전자의 상류 부분을 함유하고 약 400-bp PCR-증폭된 단편 TceC29가 RNase HⅡ 유전자의 하류 부분을 각각 함유하는 것으로 나타났다.

(4) 전체 RNase HⅡ 유전자의 클로닝

Tce RNase HⅡ를 함유하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 52에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ의 아미노산 서열을 서열번호 53에 나타내었다. 프라이머 TceNde(서열번호 54) 및 TceBam(서열번호 55)을 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성하였다.

주형으로 실시예 9-(1)에서 제조한 1 ㎕의 써모코커스 셀레르 게놈 DNA 용액을, 프라이머로 각각 20 pmol의 TceNde 및 TceBam을 사용하여 100 ㎕의 부피 중에서 PCR을 수행하였다. 피로베스트 DNA 폴리머라제(다카라 슈조)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR을 위한 DNA 폴리머라제로 사용하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 및 72 ℃ 1 분 40 사이클. 약 0.7 kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeⅠ 및 BamHⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시켰다. 그 후, 플라스미드 pTCE265Nd 및 pTCE207을 플라스미드 벡터 pTV119Nd(pTV119N에서 NcoⅠ 위치가 NdeⅠ 위치로 전환된 플라스미드) 또는 pET3a(노바젠)의 NdeⅠ과 BamHⅠ 위치 사이에 생성된 DNA를 각각 도입함으로써 제작하였다.

(5) RNase HⅡ 유전자를 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정

실시예 9-(4)에서 얻은 pTCE265Nd 및 pTCE207에 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법에 따라 결정하였다.

결정된 뉴클레오타이드 서열 분석으로 각각 RNase HⅡ를 코딩하는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임의 존재가 밝혀졌다. pTCE207의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 56에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유추된 RNase HⅡ 아미노산 서열을 서열번호 57에 나타내었다. pTCE207의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열에서 14 위치의 "A"는 pTCE265Nd의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열에서 "G"로 대체되고 693 내지 696 위치의 뉴클레오타이드는 결실되었다. 그 결과, 5 위치의 글루탐산이 글리신으로 대체되고 231 위치의 페닐알라닌이 아미노산 서열에서 제거된다.

플라스미드 pTCE207로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3)를 대장균 HMS174(DE3)/pTCE207라 명명 및 표시하고, 일본 이바라키 305-8566, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-1, AIST 츠쿠바 센트럴 6, 독립행정법인 산업기술총합연구소, 특허생물기탁센터에 2001. 2. 22자(원기탁일)로 수탁번호 FERM BP-7694로 기탁하였다.

(6) 써모코커스 셀레르 RNase HⅡ 유전자의 발현

pTCE265Nd로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린과 1 mM의 IPTG를 함유하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 203 ㎕의 완충액 A에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 10 분간 가열한 후 12,000 rpm에서 10 분간 재 원심분리하여 가열된 상등액으로서 상등액을 모았다. 유사하게, pTCE207로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3)를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 상기 과정에 다라 가공하여 가열된 상등액을 얻었다.

효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 가열된 상등액에 대해 측정하였다. 그 결과 RNase H 활성이 형질전환체 둘 다에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 활성이 뉴클레오타이드 서열이나 아미노산 서열의 치환 및 결실에도 불구하고 확인되었다.

(7) 정제된 RNase HⅡ 제제의 제조

실시예 9-(4)에서 얻은 pTCE265Nd로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 모은 세포를 39 ㎖의 초음파 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 현탁액을 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 70 ℃에서 15 분간 가열하였다. 그 후 12,000 rpm에서 20 분간 재 원심분리하여 상등액을 모았다. 따라서, 37.5 ㎖의 가열된 상등액을 얻었다.

가열된 상등액을 완충액 A[50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA]로 평형화된 RESOURSE Q 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 그 결과, RNase HⅡ가 RESOURSE Q 컬럼을 통해 유출되었다.

샘플을 완충액 A로 평형화된 RESOURSE S 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템(아머샴 파마시아 바이오텍)을 사용하여 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 220 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

3 ㎖의 RNase HⅡ 분획 및 NaCl 농도가 50 mM이 되도록 첨가된 완충액 A를 함유하는 혼합물을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 A로 평형화된 HiTrap-헤파린 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 FPLC 시스템을 사용하여 50 내지 550 mM NaCl의 선형 구배로 용출하였다. 그 결과 약 415 mM NaCl로 용출된 RNase HⅡ를 함유하는 분획을 얻었다.

6 ㎖의 RNase HⅡ 분획을 센트리콘-10(밀리포어)을 사용하여 한외여과시켜 농축시켰다. 약 178 ㎕의 농축물을 100 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스-HCl로 평형화된 슈페로스 6 젤 여과 컬럼(아머샴 파마시아 바이오텍)에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 그 결과, RNase HⅡ가 29.5 킬로달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 단량체 형태의 RNase HⅡ의 것에 상응한다.

그렇게 용출된 RNase HⅡ를 Tce RNase HⅡ 제제로 사용하였다.

그렇게 얻은 Tce RNase HⅡ 제제의 효소 활성을 실시예 3-(5)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 그 결과, RNase H 활성을 Tce RNase HⅡ 제제에서 관찰하였다.

실시예 10

상동성 검색을 실시예 2 내지 9에서 얻은 바실러스 칼도테넥스(이하 BCA라 함), 피로코커스 퓨리오서스(PFU), 써모토가 마리티마(TMA), 아캐오글로부스 풀기두스(AFU), 써모코커스 리토랄리스(TLI), 써모코커스 셀레르(TCE) 및 피로코커스 호리코쉬이(PHO)로부터의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 대해 수행하였다. 검색 프로그램으로 DNASIS-Mac(다카라 슈조)에서 최대 매칭 또는 컴퓨터 알고리즘 FASTA(버젼 3.0; Pearson, W. R. 등, Pro. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1998)을 사용하여 계산을 수행하였다.

DNASIS를 이용하여 결정된 PFU 아미노산 서열의 PHO, AFU, TLI 및 TCE 아미노산 서열에 대한 상동성은 각각 69%, 45%, 65% 및 58%였다. DNASIS를 이용하여 결정된 PFU 뉴클레오타이드 서열의 PHO, AFU, TLI 및 TCE 뉴클레오타이드 서열에 대한 상동성은 각각 68%, 60%, 65% 및 61%였다.

컴퓨터 알고리즘 FASTA를 사용하여 유전자 데이터베이스 검색을 PHO, AFU 및 TMA에 대해 수행하였다. PHO 아미노산 서열에 대해, 리보뉴클레아제로 추정된 아미노산 서열에 대한 가장 높은 상동성은 70%였고 가장 낮은 것은 20%였다. PHO의 AFU에 대한 상동성은 50%였고 PHO의 TMA에 대한 상동성은 35%였다. AFU 아미노산 서열에 대하여, 가장 높은 상동성은 50%였고 가장 낮은 것은 25%였다. AFU의 TMA에 대한 아미노산 서열 상동성은 32%였다. TMA 아미노산 서열에 대하여, 가장 높은 상동성은 52%였고 가장 낮은 것은 22%였다.

유전자 데이터베이스 검색을 컴퓨터 알고리즘 BLAST를 사용하여 BCA, PFU, TCE 및 TLI에 대해 수행하였다. BCA 리보뉴클레아제 HⅡ, BCA 리보뉴클레아제 HⅢ, PFU, TCE 및 TLI 아미노산 서열에 대하여, 리보뉴클레아제인 것으로 추정된 아미노산 서열에 대해 가장 높은 상동성은 각각 43%, 46%, 68%, 70% 및 65%였다.

또한, DNASIS를 사용하여 결정된 PHO의 AFU에 대한 아미노산 서열 상동성 역시 50%였다. 컴퓨터 알고리즘 FASTA를 사용하여 결정된 값은 상기한 바와 같이 50%였다. 따라서, DNASIS와 컴퓨터 알고리즘 FASTA를 사용하여 얻은 상동성 값 사이에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.

실시예 11: 다양한 RNase H의 작용 양식 및 성질

(1) Bca RNase HⅢ의 작용 양식

Bca RNase HⅢ와 대장균 RNase HⅠ의 절단 양식을 비교하기 위하여 기질을 아래와 같이 제조하였다. 주형으로 대장균 O157의 가열 추출물을, 3' 말단으로부터 3 개의 뉴클레오타이드가 RNA인 5' FITC-표지된 키메라성 프라이머 VT2-R280N3-I7(서열번호 61), 및 DNA 프라이머 VT2-F110(서열번호 62)을 사용하여 PCR을 수행하여 두 쇄 중 하나에서 3 개의 RNA를 갖는 DNA 단편을 얻었다. 마이크로콘-100(밀리포어)을 사용하여 PCR 산물로부터 프라이머를 제거하여 RNase H로의 절단을 위한 기질을 얻었다.

0.3 pmol의 기질을 함유하는 39.2 ㎕의 반응 완충액(20 mM Hepes-KOH(pH 7.8), 1% 디메틸설폭사이드, 0.01% 소혈청알부민, 100 mM 아세트산 칼륨, 4 mM 아세트산 마그네슘, 0.002% 프로필렌디아민)을 제조하였다. 0.8 ㎕의 E. coli RNase HⅠ 30 U/㎕(다카라 슈조)나 실시예 3-(5)에서 얻은 Bca RNase HⅢ의 정제된 제제의 10-배 희석물을 가하였다. 혼합물을 55 ℃에서 5 또는 10 분간 반응시켰다. 반응 후, 각각 2 ㎕의 반응 혼합물을 변성 10% 아크릴아미드 젤 상에서 전기영동시켜 절단된 DNA 단편의 크기를 결정하였다.

E. coli RNase HⅠ의 경우, 신호가 18 염기와 19 염기 위치에서 나타났다. 19 염기 위치에서의 신호는 시간에 따라 감소하였다. 프라이머의 불완전한 제거로 인한 20 염기 위치에서의 배경 역시 시간에 따라 감소하였다. Bca RNase HⅢ의 경우, 신호가 19 염기 위치에서 나타났다. 프라이머 배경의 감소가 관찰되지 않았다.

상기에 기초하여, E. coli RNase HⅠ은 RNA 간에 두 위치에서 절단한다. 또한, E. coli RNase HⅠ은 3' RNA의 5' 측에서 절단하고 추가로 DNA에 결합되지 않은 3' RNA의 5' 측에서 절단하는 활성을 가졌다. 한편, Bca RNase HⅢ는 3' RNA의 5' 측만을 절단하고 DNA가 RNA의 3' 측에 결합되지 않으면 절단하지 않는 것으로 여겨졌다. 따라서, Bca RNase HⅢ의 절단 위치 선택성이 E. coli RNase HⅠ의 것 보다 더 높은 것으로 여겨졌다.

(2) Pfu RNase HⅡ, Pho RNase HⅡ 및 Afu RNase HⅡ의 작용 양식

Pfu(피로코커스 퓨리오서스) RNase HⅡ, Pho(피로코커스 호리코쉬이) RNase HⅡ 및 Afu(아캐오글로부스 풀기두스) RNase HⅡ의 절단 양식을 비교하기 위하여 기질을 아래와 같이 제조하였다. 주형으로 대장균 O157의 가열 추출물을, 3' 말단으로부터 3 개의 뉴클레오타이드가 RNA인 5' FITC-표지된 키메라성 프라이머 VT2-IF20N3(서열번호 63), 3' 말단으로부터 두 개의 뉴클레오타이드가 RNA인 5' FITC-표지된 키메라성 프라이머 VT2-IF19N2(서열번호 64) 또는 3' 말단에 있는 1 개의 뉴클레오타이드가 RNA인 5' FITC-표지된 키메라성 프라이머 VT2-IF18N1(서열번호 65), 및 DNA 프라이머 VT2IR20(서열번호 66)을 사용하여 PCR을 수행하여 두 쇄 중 하나에서 각각 3 개, 2 개 및 1 개의 RNA를 갖는 DNA 단편 VFN3, VFN2 및 VFN1을 얻었다. 마이크로콘-100(밀리포어)을 사용하여 PCR 산물로부터 프라이머를 제거하여 RNase H로의 절단을 위한 기질을 얻었다.

0.3 pmol의 기질 중 하나를 함유하는 39 ㎕의 반응 완충액(20 mM Hepes-KOH(pH 7.8), 1% 디메틸설폭사이드, 0.01% 소혈청알부민, 100 mM 아세트산 칼륨, 4 mM 아세트산 마그네슘, 0.002% 프로필렌디아민)을 제조하였다. 37.2 U/㎕ 농도의 RNase H 각각의 정제된 제제 1 ㎕를 가하였다. 혼합물을 55 ℃에서 5 또는 10 분간 반응시켰다. 반응 후, 각각 2 ㎕의 반응 혼합물을 변성 10% 아크릴아미드 젤 상에서 전기영동시켜 절단된 DNA 단편의 크기를 결정하였다.

각각의 Pfu RNase HⅡ, Pho RNase HⅡ 및 Afu RNase HⅡ에 대하여, 신호가 VFN3를 기질로 사용하여 19 염기 위치에서 관찰되었다. 각각의 Pfu RNase HⅡ, Pho RNase HⅡ 및 Afu RNase HⅡ에 대하여, 신호가 VFN2를 기질로 사용하여 18 염기 위치에서 관찰되었다. 각각의 Pfu RNase HⅡ, Pho RNase HⅡ 및 Afu RNase HⅡ에 대하여, 신호가 VFN1을 기질로 사용하여 17 염기 위치에서 관찰되었다.

상기에 기초하여, 각각의 Pfu RNase HⅡ, Pho RNase HⅡ 및 Afu RNase HⅡ는 3' RNA의 5' 측에서 절단하였다. Pfu RNase HⅡ 및 Pho RNase HⅡ는 RNA의 수가 1 개인 경우에도 RNA의 5' 측에서 절단하였다. RNA의 수가 1 개인 경우에도 절단하는 RNase H는 보고된 바 없었다. 절단 시 신호의 강도가 RNA의 수와 무관하게 유사하므로, RNA의 수에 따른 절단 효율에 차이는 없는 것으로 나타났다. 또한, 시간에 따라 나타난 신호의 감소나 더 짧은 신호의 출현이 관찰되지 않았으므로, DNA가 RNA의 3' 측에 결합되지 않으면 절단은 일어나지 않는 것으로 나타났다.

(3) Bca RNase HⅡ 및 Tma RNase HⅡ의 이온 요구성

실시예 1에 기재된 바와 같은 RNase H 활성을 측정하는 방법에 따르면, Bca RNase HⅡ 및 Tma RNase HⅡ는 Mn^{2 +}를 요구하고 Mg^{2 +} 존재 시에는 전혀 활성을 나타내지 않았다. Mg^{2 +} 또는 Mn^{2 +} 존재 시 절단의 비교를 기질로서 실시예 11-(2)에 기재된 VFN3를 사용하여 수행하였다.

0.3 pmol의 기질을 함유하는 39.2 ㎕의 반응 완충액(20 mM Hepes-KOH(pH 7.8), 1% 디메틸설폭사이드, 0.01% 소혈청알부민, 100 mM 아세트산 칼륨, 4 mM 아세트산 마그네슘, 0.002% 프로필렌디아민)과 0.3 pmol의 기질을 함유하는 39.2 ㎕의 Mn⁺ 반응 완충액(액(20 mM Hepes-KOH(pH 7.8), 1% 디메틸설폭사이드, 0.01% 소혈청알부민, 100 mM 아세트산 칼륨, 10 mM 염화망간, 0.002% 프로필렌디아민)을 제조하였다. 0.8 ㎕의 E. coli RNase HⅠ(30 U/㎕, 다카라 슈조), 완충액 A로의 Bca RNase HⅡ의 정제된 제제(실시예 2-(6)에서 얻음)의 10-배 희석물 또는 완충액 A로의 Tma RNase HⅡ의 조 세포 추출물(실시예 5-(3)에서 얻음)의 25-배 희석물을 가하였다. 혼합물을 55 ℃에서 5 또는 10 분간 반응시켰다. 반응 후, 각각 2 ㎕의 반응 혼합물을 변성 10% 아크릴아미드 젤 상에서 전기영동시켜 절단된 DNA 단편의 크기를 결정하였다.

Bca RNase HⅡ 또는 Tma RNase HⅡ를 Mg^{2 +} 또는 Mn^{2 +} 존재 하에 사용하였을 때, 각 경우 신호가 19 염기 위치에서 나타났다. 신호의 수준은 서로 균등하였다.

Bca RNase HⅡ와 Tma RNase HⅡ는 실시예 1에 기재된 바와 같은 RNase H 활성 측정방법에 따르면 Mg^{2 +} 존재 시 전혀 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 상기한 바와 같이 그들은 Mg^{2 +} 존재 시 Mn^{2 +} 존재 시에 관찰되는 것과 균등한 절단 활성을 나타내었다.

상기에 기초하여, 효소는 기질 형태에 따라 절단을 위하여 Mn^{2 +}를 요구하지 않을 수 있으며, Mn^{2 +}를 Mg^{2 +}로 치환하는 것이 가능할 수 있으며, Mn^{2 +} 또는 Mg^{2 +}을 요구하는 효소를 위한 동일한 반응 혼합물에서의 반응이 가능할 수 있는 것으로 나타났다.

(4) RNase H의 내열성 조사

하기하는 것으로 형질전환된 대장균을 이용하여 내열성을 조사하였다: 바실러스 칼도테넥스 RNase H를 위하여 실시예 2-(5)와 3-(4)에서 얻은 pRHB11과 pBCA3Nd; 피로코커스 퓨리오서스 RNase H를 위하여 실시예 4-(2)에서 얻은 pPFU220; 써모토가 마리티마 RNase H를 위하여 실시예 5-(2)에서 얻은 pTM-RNH; 피로코커스 호리코쉬이 RNase H를 위하여 실시예 6-(2)에서 얻은 pPHO238; 아캐오글로부스 풀기두스 RNase H를 위하여 실시예 7-(2)에서 얻은 pAFU204; 써모코커스 리토랄리스 RNase H를 위하여 실시예 8-(4)에서 얻은 pTLI204 및 pTLI223Nd; 써모코커스 셀레르 RNase H를 위하여 실시예 9-(4)에서 얻은 pTCE207 및 pTCE265Nd. E. coli 균주를 배양하고, 배양물로부터 제조된 조 효소 추출물을 60 ℃에서 15 분간 가열하고, RNase H 활성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 결정하였다. 그 결과, RNase H 활성이 모든 균주로부터의 RNase H에 대해 관찰되었다.

본 발명은 유전공학을 위해 매우 가치 있는 RNase H 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 및 상기 폴리펩타이드를 유전공학에 의 해 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 RNase H는 내열성이므로, 본 발명은 산업적으로 우수한 RNase H를 제조하는 방법을 제공한다.

이제 본 발명의 RNase H를 본 발명에 따른 다양한 목적을 위해 사용하는 것이 가능하다.

서열목록 프리 텍스트

서열번호 1: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅡ-3.

서열번호 2: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅡ-6.

서열번호 3: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅡ-S1.

서열번호 4: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅡ-S2.

서열번호 5: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅡ-S5.

서열번호 6: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅡ-S6.

서열번호 7: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅡ-Nde.

서열번호 10: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅢ-1.

서열번호 11: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅢ-3.

서열번호 12: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅢ-6.

서열번호 13: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BsuⅢ-8.

서열번호 14: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RNⅢ-S3.

서열번호 15: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 BcaRNⅢ-3.

서열번호 18: 바실러스 칼도테넥스로부터의 RNase HⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 BcaRNⅢNde.

서열번호 20: 피로코커스 퓨리오서스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Nde.

서열번호 21: 피로코커스 퓨리오서스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 1650Bam.

서열번호 24: 써모토가 마리티마로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 915-F1.

서열번호 25: 써모토가 마리티마로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 915-F2.

서열번호 26: 써모토가 마리티마로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 915-R1.

서열번호 27: 써모토가 마리티마로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 915-R2.

서열번호 29: 피로코커스 호리코쉬이로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 PhoNde.

서열번호 30: 피로코커스 호리코쉬이로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 PhoBam.

서열번호 34: 아캐오글로부스 풀기두스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuNde.

서열번호 35: 아캐오글로부스 풀기두스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuBam.

서열번호 38: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RN-F1.

서열번호 39: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RN-R0.

서열번호 40: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 TliRN-1.

서열번호 41: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 TliRN-2.

서열번호 44: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 TliNde.

서열번호 45: 써모코커스 리토랄리스로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 TliBam.

서열번호 48: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RN-F1.

서열번호 49: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 RN-R0.

서열번호 50: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 TceRN-1.

서열번호 51: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 TceRN-2.

서열번호 54: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 TceNde.

서열번호 55: 써모코커스 셀레르로부터의 RNase HⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 TceBam.

서열번호 61: 출혈성 대장균 0-157로부터의 베로 톡신 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 VT2-R280N3-I7로서 설계된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이 머. "뉴클레오타이드 18 내지 20은 리보뉴클레오타이드이고-다른 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다".

서열번호 62: 출혈성 대장균 0-157로부터의 베로 톡신 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 VT2-F110으로서 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.

서열번호 63: 출혈성 대장균 0-157로부터의 VFN3를 증폭시키기 위한 VT2-IF20N3로서 설계된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머. "뉴클레오타이드 17 내지 19는 리보뉴클레오타이드이고-다른 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다".

서열번호 64: 출혈성 대장균 0-157로부터의 VFN2를 증폭시키기 위한 VT2-IF19N2로서 설계된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머. "뉴클레오타이드 16 내지 18은 리보뉴클레오타이드이고-다른 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다".

서열번호 65: 출혈성 대장균 0-157로부터의 VFN1을 증폭시키기 위한 VT2-IF18N1으로서 설계된 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머. "뉴클레오타이드 15 내지 17은 리보뉴클레오타이드이고-다른 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다".

서열번호 66: 출혈성 대장균 0-157로부터의 베로 톡신 2-코딩 서열의 일부를 증폭시키기 위한 VT21R20으로서 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머.

<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Thermostable ribonuclease H <130> 662774 <150> JP 2000-280785 <151> 2000-09-14 <150> JP 2001-64074 <151> 2001-03-07 <160> 66 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 1 gtcgccagcg cagtnathyt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 2 cggtccctcg tcacyttngc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 3 cgcgcttttc cggcgtcagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 4 acggcgcacg cttcaatttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S5 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 5 acgcctattt gccggggctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-S6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 6 atgaccgacg cagcggcgat 20 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNII-Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax <400> 7 tagaagaggg agaggcatat gaagcggtat acggtgaaa 39 <210> 8 <211> 780 <212> DNA <213> Bacillus caldotenax <400> 8 atgaagcggt atacggtgaa agacattgaa gcgctgcttc cgaagcttgg cgcggacgac 60 ccgcgctggg agatgctgcg gcaggatgag cgaaaaagcg tgcaggcgct tcttgcccgt 120 tttgaaaggc agaaagcgcg ccggcacgcc atcgagcagc ggtgggaaga actaatgcgt 180 tatgagaggg aactatacgc cgctggcgtt agacggatcg ccggcattga tgaggccggg 240 cgcggcccgc tggccggccc ggtcgtcgcc gccgcggtca tcttgccgaa agacgcctat 300 ttgccggggc ttgacgactc gaagcggctg acgccggaaa agcgcgaggc attgtttgcg 360 caaattgaag cgtgcgccgt cgccatcggc atcggcatcg tcagcgcggc ggagatcgat 420 gaaaggaata tttacgaagc gacaaggcaa gcgatggcga aagcggtgaa cgccctttcc 480 ccgccgcctg aacatttgct tgttgatgcg atggcggtgc cgtgcccact gccgcaacag 540 cgcctcataa aaggagacgc caacagcgct tcaatcgccg ctgcgtcggt catcgccaaa 600 gtgacgcgcg accggtggat gaaagaactg gatcgccgct atccacaata cgggttcgcg 660 cgccatatgg gctacggaac gccggaacat ttcgaggcga tccgccgcta cggcgttacg 720 cctgagcacc gtcgttcgtt cgcaccggtg agggaggtgc tgaaggcgag cgagcagctc 780 <210> 9 <211> 260 <212> PRT <213> Bacillus caldotenax <400> 9 Met Lys Arg Tyr Thr Val Lys Asp Ile Glu Ala Leu Leu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Gly Ala Asp Asp Pro Arg Trp Glu Met Leu Arg Gln Asp Glu 20 25 30 Arg Lys Ser Val Gln Ala Leu Leu Ala Arg Phe Glu Arg Gln Lys 35 40 45 Ala Arg Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Trp Glu Glu Leu Met Arg 50 55 60 Tyr Glu Arg Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly 65 70 75 Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Leu Ala Gly Pro Val Val Ala 80 85 90 Ala Ala Val Ile Leu Pro Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Gly Leu Asp 95 100 105 Asp Ser Lys Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Glu Ala Leu Phe Ala 110 115 120 Gln Ile Glu Ala Cys Ala Val Ala Ile Gly Ile Gly Ile Val Ser 125 130 135 Ala Ala Glu Ile Asp Glu Arg Asn Ile Tyr Glu Ala Thr Arg Gln 140 145 150 Ala Met Ala Lys Ala Val Asn Ala Leu Ser Pro Pro Pro Glu His 155 160 165 Leu Leu Val Asp Ala Met Ala Val Pro Cys Pro Leu Pro Gln Gln 170 175 180 Arg Leu Ile Lys Gly Asp Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ala Ala Ala 185 190 195 Ser Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Trp Met Lys Glu Leu 200 205 210 Asp Arg Arg Tyr Pro Gln Tyr Gly Phe Ala Arg His Met Gly Tyr 215 220 225 Gly Thr Pro Glu His Phe Glu Ala Ile Arg Arg Tyr Gly Val Thr 230 235 240 Pro Glu His Arg Arg Ser Phe Ala Pro Val Arg Glu Val Leu Lys 245 250 255 Ala Ser Glu Gln Leu 260 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 10 ggtaaggtct tgttycargg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 11 ggaaccggag attayttygg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 12 atgattgaag cagcngcnac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BsuIII-8 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 13 gtattggcga aatgnarytt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RNIII-S3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 14 cccgatcgtc gtcgccgccg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BcaRNIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 15 gatacgtgga cactttccgc 20 <210> 16 <211> 915 <212> DNA <213> Bacillus caldotenax <400> 16 gtgattcaag ccgaccaaca gctgcttgac gccttgcgcg cccactacca agacgcctta 60 tccgaccggc ttccggctgg agcgttgttt gccgtcaagc gcccggatgt cgtcatcacc 120 gcctaccgct caggcaaagt gctgtttcaa gggaaagcgg cggagcaaga agcagcgaaa 180 tggatatcag gggcgagcgc ctcaaacgaa acagctgacc accagccgtc cgctttggca 240 gctcatcaac tcgggtctct ttccgccatc ggttccgatg aagtcggcac cggcgattat 300 ttcggcccga tcgtcgtcgc cgccgcctac gtggatcggc cgcatatcgc caaaatcgcg 360 gcgcttggcg tgaaagattc gaaacaattg aacgatgagg caatcaaacg gatcgccccc 420 gccatcatgg aaaccgtgcc gcatgcggtc accgtgttgg acaatgccga atacaaccgc 480 tggcagcgaa gcggcatgcc gcagacgaaa atgaaagcgc tccttcacaa ccggacgctc 540 gtgaaactcg ttgacgccat cgcgcccgcc gaaccagaag caatcatcat cgacgaattt 600 ttaaaacggg attcgtattt ccgttacctt tccgatgaag atcgcattat ccgcgagcgg 660 gtgcactgcc ttcccaaggc ggaaagtgtc cacgtatcag tcgccgccgc ctcgatcatc 720 gcccgctatg tgtttttaga ggagatggag caattatccc gcgccgtcgg cctcctgctt 780 ccaaaaggcg ccggcgccat tgtcgatgaa gccgcggcca acatcatccg cgcgcggggg 840 gcggaagcgc ttgagacatg cgccaagctt catttcgcca atacaaaaaa ggcgctggac 900 atcgccaaac gccgg 915 <210> 17 <211> 305 <212> PRT <213> Bacillus caldotenax <400> 17 Met Ile Gln Ala Asp Gln Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala His 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Ala Leu Ser Asp Arg Leu Pro Ala Gly Ala Leu Phe 20 25 30 Ala Val Lys Arg Pro Asp Val Val Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gly 35 40 45 Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys Ala Ala Glu Gln Glu Ala Ala Lys 50 55 60 Trp Ile Ser Gly Ala Ser Ala Ser Asn Glu Thr Ala Asp His Gln 65 70 75 Pro Ser Ala Leu Ala Ala His Gln Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ile 80 85 90 Gly Ser Asp Glu Val Gly Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Pro Ile Val 95 100 105 Val Ala Ala Ala Tyr Val Asp Arg Pro His Ile Ala Lys Ile Ala 110 115 120 Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ala Ile 125 130 135 Lys Arg Ile Ala Pro Ala Ile Met Glu Thr Val Pro His Ala Val 140 145 150 Thr Val Leu Asp Asn Ala Glu Tyr Asn Arg Trp Gln Arg Ser Gly 155 160 165 Met Pro Gln Thr Lys Met Lys Ala Leu Leu His Asn Arg Thr Leu 170 175 180 Val Lys Leu Val Asp Ala Ile Ala Pro Ala Glu Pro Glu Ala Ile 185 190 195 Ile Ile Asp Glu Phe Leu Lys Arg Asp Ser Tyr Phe Arg Tyr Leu 200 205 210 Ser Asp Glu Asp Arg Ile Ile Arg Glu Arg Val His Cys Leu Pro 215 220 225 Lys Ala Glu Ser Val His Val Ser Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile 230 235 240 Ala Arg Tyr Val Phe Leu Glu Glu Met Glu Gln Leu Ser Arg Ala 245 250 255 Val Gly Leu Leu Leu Pro Lys Gly Ala Gly Ala Ile Val Asp Glu 260 265 270 Ala Ala Ala Asn Ile Ile Arg Ala Arg Gly Ala Glu Ala Leu Glu 275 280 285 Thr Cys Ala Lys Leu His Phe Ala Asn Thr Lys Lys Ala Leu Asp 290 295 300 Ile Ala Lys Arg Arg 305 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BcaRNIIINde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax <400> 18 cgaacgttgt caaaccatat gattcaagcc gaccaacag 39 <210> 19 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 19 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 20 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 21 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210> 22 <211> 672 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 22 atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60 gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120 tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180 gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240 aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300 cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360 agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420 gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480 aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540 gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600 gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660 tttaagaaac ct 672 <210> 23 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 23 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 50 55 60 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn 65 70 75 Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 110 115 120 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 24 aaaaagcttg ggaatagatg agctttac 28 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-F2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 25 aaaccatggg aatagatgag ctttac 26 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-R1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 26 aaatctagat cctcaacttt gtcgatgtg 29 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 915-R2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima <400> 27 aatctagatt aaaaaagagg gagattatgg 30 <210> 28 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 28 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer PhoNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii <400> 29 aggaggaaaa tcatatgaag gttgctggag 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer PhoBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii <400> 30 ttacatgaag gatccaagat cacttaagga 30 <210> 31 <211> 673 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 31 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tgatcttgga tcc 673 <210> 32 <211> 220 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 32 Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro Gly Gln Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu 50 55 60 Asp Asp Tyr Tyr Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu 65 70 75 Arg His His Ser Met Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Arg Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp 95 100 105 Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala 110 115 120 Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys Gln Lys Tyr Gly Glu 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Lys Glu Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe Arg Lys 200 205 210 Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys 215 220 <210> 33 <211> 626 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 33 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60 ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180 gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240 attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300 gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360 agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 34 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus <400> 35 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210> 36 <211> 638 <212> DNA <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 36 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210> 37 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 37 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu 20 25 30 Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu 50 55 60 Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75 Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile 80 85 90 Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu 110 115 120 Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135 Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser 170 175 180 Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser 185 190 195 Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RN-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis <400> 38 ggcattgatg aggctggnar rgg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RN-R0 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis <400> 39 gtccttggat cgctgggrta ncc 23 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TliRN-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis <400> 40 tagctttttt gaatctttga ctcc 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TliRN-2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis <400> 41 ctgctgcatc aatactagct aaag 24 <210> 42 <211> 675 <212> DNA <213> Thermococcus litoralis <400> 42 atgaagctgg gaggaataga tgaagccggc aggggaccag ttataggccc tcttgtaatt 60 gcagcggttg ttgtcgatga atcccgtatg caggagcttg aagctttggg agtcaaagat 120 tcaaaaaagc taacaccaaa aagaagagaa gagctatttg aggagattgt gcaaatagtt 180 gatgaccacg ttatcattca gctttcccca gaggagatag acggcagaga tggtacaatg 240 aacgagcttg aaattgaaaa ctttgccaaa gcgttgaact cccttaaagt taagccggat 300 gtgctctaca tagatgcggc cgatgtcaag gaaaagcgct ttggcgacat tataggtgaa 360 agactttcct tctctccaaa gataatcgcc gaacataagg cagattcaaa gtacattcca 420 gtggctgctg catcaatact agctaaagtt acccgtgaca gggcaataga gaagctcaag 480 gagctttatg gggagatagg ctcaggatat ccaagtgatc caaatacaag gaggtttctg 540 gaggagtatt acaaggctca tggggaattc cccccaatag tgaggaaaag ctggaagacc 600 cttagaaaga tagaagaaaa actaaaagct aaaaagactc agcccactat cttggacttc 660 ttaaaaaagc cttaa 675 <210> 43 <211> 224 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis <400> 43 Met Lys Leu Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Ser Arg Met 20 25 30 Gln Glu Leu Glu Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Thr 35 40 45 Pro Lys Arg Arg Glu Glu Leu Phe Glu Glu Ile Val Gln Ile Val 50 55 60 Asp Asp His Val Ile Ile Gln Leu Ser Pro Glu Glu Ile Asp Gly 65 70 75 Arg Asp Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Ile Glu Asn Phe Ala Lys 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Lys Val Lys Pro Asp Val Leu Tyr Ile Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Lys Glu Lys Arg Phe Gly Asp Ile Ile Gly Glu 110 115 120 Arg Leu Ser Phe Ser Pro Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ser Lys Tyr Ile Pro Val Ala Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys Glu Leu Tyr Gly Glu 155 160 165 Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Thr Arg Arg Phe Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Ala His Gly Glu Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Lys Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Lys Pro 215 220 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TliNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis <400> 44 gaggaggtag gcatatgaag ctgggaggaa tagatgaag 39 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TliBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Thermococcus litoralis <400> 45 aaaggaaacc ttcggatcca ttaaggcttt tttaagaag 39 <210> 46 <211> 675 <212> DNA <213> Thermococcus litoralis <400> 46 atgaagctgg gaggaataga tgaagccggc aggggaccag ttataggccc tcttgtaatt 60 gcagcggttg ttgtcgatga atcccgtatg caggagcttg aagctttggg agtcaaagat 120 tcaaaaaagc taacaccaaa aagaagagaa gagctatttg aggagattgt gcaaatagtt 180 gatgaccacg ttatcattca gctttcccca gaggagatag acggcagaga tggtacaatg 240 aacgagcttg aaattgaaaa ctttgccaaa gcgttgaact cccttaaagt taagccggat 300 gtgctctaca tagatgcggc cgatgtcaag gaaaagcgct ttggcgacat tataggtgaa 360 agactttcct tctctccaaa gataatcgcc gaacataagg cagattcaaa gtacattcca 420 gtggctgctg catcaatact agctaaagtt acccgtgaca gggcaataga gaagctcaag 480 gagttttatg gggagatagg ctcaggatat ccaagtgatc caattacaag gaggtttctg 540 gaggagtatt acaaggctca tggggaattc cccccaatag tgaggaaaag ctggaagacc 600 cttagaaaga tagaagaaaa actaaaagct aaaaagactc agcccactat cttggacttc 660 ttaaaaaagc cttaa 675 <210> 47 <211> 224 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis <400> 47 Met Lys Leu Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Ser Arg Met 20 25 30 Gln Glu Leu Glu Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Thr 35 40 45 Pro Lys Arg Arg Glu Glu Leu Phe Glu Glu Ile Val Gln Ile Val 50 55 60 Asp Asp His Val Ile Ile Gln Leu Ser Pro Glu Glu Ile Asp Gly 65 70 75 Arg Asp Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Ile Glu Asn Phe Ala Lys 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Lys Val Lys Pro Asp Val Leu Tyr Ile Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Lys Glu Lys Arg Phe Gly Asp Ile Ile Gly Glu 110 115 120 Arg Leu Ser Phe Ser Pro Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ser Lys Tyr Ile Pro Val Ala Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys Glu Phe Tyr Gly Glu 155 160 165 Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Ile Thr Arg Arg Phe Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Ala His Gly Glu Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Lys Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Lys Pro 215 220 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RN-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 48 ggcattgatg aggctggnar rgg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer RN-R0 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 49 gtccttggat cgctgggrta ncc 23 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TceRN-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 50 tctctgagct tcggaacgtt cttc 24 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TceRN-2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 51 acccgtgaca gggcgataga aaag 24 <210> 52 <211> 702 <212> DNA <213> Thermococcus celer <400> 52 ttgaagctcg caggaataga cgaggctgga aggggccccg taatcggccc gatggtcatc 60 gcggccgtcg tcctcgatga gaagaacgtt ccgaagctca gagatctcgg cgtcagggac 120 tcgaaaaagc tgaccccaaa gaggagggag agattattta acgacataat taaacttttg 180 gatgattatg taattcttga attatggccg gaggagatag actcccgcgg cgggacgctt 240 aacgagctcg aggtggagag gttcgtggag gccctcaact cgcttaaggt gaagcccgac 300 gtcgtttaca tagacgcggc ggacgtgaag gagggccgct ttggcgagga gataaaggaa 360 aggttgaact tcgaggcgaa gattgtctca gagcacaggg cggacgataa gtttttaccg 420 gtgtcctctg cctcgatact ggcgaaggtg acccgtgaca gggcgataga aaagctcaag 480 gagaagtacg gcgagatcgg gagcggctac ccgagcgacc caaggacgag ggagttcctc 540 gagaactact acagacaaca cggcgagttc ccgcccgtag tccggcgaag ctggaagacg 600 ctgagaaaga tagaggaaaa gctgaggaaa gaggccgggt caaaaaaccc ggagaattca 660 aaggaaaagg gacagacgag cctggacgta tttttgaggt ag 702 <210> 53 <211> 233 <212> PRT <213> Thermococcus celer <400> 53 Leu Lys Leu Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Leu Asp Glu Lys Asn Val 20 25 30 Pro Lys Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr 35 40 45 Pro Lys Arg Arg Glu Arg Leu Phe Asn Asp Ile Ile Lys Leu Leu 50 55 60 Asp Asp Tyr Val Ile Leu Glu Leu Trp Pro Glu Glu Ile Asp Ser 65 70 75 Arg Gly Gly Thr Leu Asn Glu Leu Glu Val Glu Arg Phe Val Glu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Lys Val Lys Pro Asp Val Val Tyr Ile Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Lys Glu Gly Arg Phe Gly Glu Glu Ile Lys Glu 110 115 120 Arg Leu Asn Phe Glu Ala Lys Ile Val Ser Glu His Arg Ala Asp 125 130 135 Asp Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Glu 155 160 165 Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Phe Leu 170 175 180 Glu Asn Tyr Tyr Arg Gln His Gly Glu Phe Pro Pro Val Val Arg 185 190 195 Arg Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu Arg Lys 200 205 210 Glu Ala Gly Ser Lys Asn Pro Glu Asn Ser Lys Glu Lys Gly Gln 215 220 225 Thr Ser Leu Asp Val Phe Leu Arg 230 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TceNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 54 cagggggtga gcatatgaag ctcgcaggaa tagacgagg 39 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TceBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer <400> 55 tgaacccgcg taggatccta cctcaaaaat acgtccagg 39 <210> 56 <211> 702 <212> DNA <213> Thermococcus celer <400> 56 atgaagctcg cagaaataga cgaggctgga aggggccccg taatcggccc gatggtcatc 60 gcggccgtcg tcctcgatga gaagaacgtt ccgaagctca gagatctcgg cgtcagggac 120 tcgaaaaagc tgaccccaaa gaggagggag agattattta acgacataat taaacttttg 180 gatgattatg taattcttga attatggccg gaggagatag actcccgcgg cgggacgctt 240 aacgagctcg aggtggagag gttcgtggag gccctcaact cgcttaaggt gaagcccgac 300 gtcgtttaca tagacgcggc ggacgtgaag gagggccgct ttggcgagga gataaaggaa 360 aggttgaact tcgaggcgaa gattgtctca gagcacaggg cggacgataa gtttttaccg 420 gtgtcctctg cctcgatact ggcgaaggtg acccgtgaca gggcgataga aaagctcaag 480 gagaagtacg gcgagatcgg gagcggctac ccgagcgacc caaggacgag ggagttcctc 540 gagaactact acagacaaca cggcgagttc ccgcccgtag tccggcgaag ctggaagacg 600 ctgagaaaga tagaggaaaa gctgaggaaa gaggccgggt caaaaaaccc ggagaattca 660 aaggaaaagg gacagacgag cctggacgta tttttgaggt ag 702 <210> 57 <211> 233 <212> PRT <213> Thermococcus celer <400> 57 Met Lys Leu Ala Glu Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile 1 5 10 15 Gly Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Leu Asp Glu Lys Asn Val 20 25 30 Pro Lys Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr 35 40 45 Pro Lys Arg Arg Glu Arg Leu Phe Asn Asp Ile Ile Lys Leu Leu 50 55 60 Asp Asp Tyr Val Ile Leu Glu Leu Trp Pro Glu Glu Ile Asp Ser 65 70 75 Arg Gly Gly Thr Leu Asn Glu Leu Glu Val Glu Arg Phe Val Glu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Lys Val Lys Pro Asp Val Val Tyr Ile Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Lys Glu Gly Arg Phe Gly Glu Glu Ile Lys Glu 110 115 120 Arg Leu Asn Phe Glu Ala Lys Ile Val Ser Glu His Arg Ala Asp 125 130 135 Asp Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Glu 155 160 165 Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Phe Leu 170 175 180 Glu Asn Tyr Tyr Arg Gln His Gly Glu Phe Pro Pro Val Val Arg 185 190 195 Arg Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu Arg Lys 200 205 210 Glu Ala Gly Ser Lys Asn Pro Glu Asn Ser Lys Glu Lys Gly Gln 215 220 225 Thr Ser Leu Asp Val Phe Leu Arg 230 <210> 58 <211> 714 <212> DNA <213> Thermotoga maritima <400> 58 atgggaatag atgagcttta caaaaaagag tttggaatcg tagcaggtgt ggatgaagcg 60 ggaagagggt gcctcgcagg tcccgttgtg gcggccgctg tcgttctgga aaaagaaata 120 gaaggaataa acgattcaaa acagctttcc cctgcgaaga gggaaagact tttagatgaa 180 ataatggaga aggcagcagt tgggttagga attgcgtctc cagaggaaat agatctctac 240 aacatattca atgccacaaa acttgctatg aatcgagcac tggagaacct gtctgtgaaa 300 ccatcatttg tactcgttga cgggaaagga atcgagttga gcgttcccgg tacatgctta 360 gtgaagggag accagaaaag caaattgata ggagcagctt ccattgttgc gaaggtcttc 420 agagatagat tgatgagcga gtttcacagg atgtatccac agttttcctt ccacaaacac 480 aaaggttacg ccacaaaaga acatctgaac gaaatcagaa agaacggagt tttaccaatc 540 caccggctga gttttgaacc tgttttagaa cttctgaccg atgatttgtt gagggagttc 600 ttcgaaaaag gcctcatctc cgaaaatcga ttcgaacgaa tattgaatct tctgggggcg 660 agaaaaagtg tggttttccg gaaagaaaga acaaaccata atctccctct tttt 714 <210> 59 <211> 238 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 59 Met Gly Ile Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Glu Phe Gly Ile Val Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Cys Leu Ala Gly Pro Val Val 20 25 30 Ala Ala Ala Val Val Leu Glu Lys Glu Ile Glu Gly Ile Asn Asp 35 40 45 Ser Lys Gln Leu Ser Pro Ala Lys Arg Glu Arg Leu Leu Asp Glu 50 55 60 Ile Met Glu Lys Ala Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Ser Pro Glu 65 70 75 Glu Ile Asp Leu Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Thr Lys Leu Ala Met 80 85 90 Asn Arg Ala Leu Glu Asn Leu Ser Val Lys Pro Ser Phe Val Leu 95 100 105 Val Asp Gly Lys Gly Ile Glu Leu Ser Val Pro Gly Thr Cys Leu 110 115 120 Val Lys Gly Asp Gln Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ala Ala Ser Ile 125 130 135 Val Ala Lys Val Phe Arg Asp Arg Leu Met Ser Glu Phe His Arg 140 145 150 Met Tyr Pro Gln Phe Ser Phe His Lys His Lys Gly Tyr Ala Thr 155 160 165 Lys Glu His Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn Gly Val Leu Pro Ile 170 175 180 His Arg Leu Ser Phe Glu Pro Val Leu Glu Leu Leu Thr Asp Asp 185 190 195 Leu Leu Arg Glu Phe Phe Glu Lys Gly Leu Ile Ser Glu Asn Arg 200 205 210 Phe Glu Arg Ile Leu Asn Leu Leu Gly Ala Arg Lys Ser Val Val 215 220 225 Phe Arg Lys Glu Arg Thr Asn His Asn Leu Pro Leu Phe 230 235 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as tag sequence. <400> 60 ggcacgattc gataacg 17 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-R280N3-I7 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 61 tgctcaataa tcanacgaag 20 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer as VT2-F110 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. <400> 62 tcgttaaata gtatacggga ag 22 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF20N3 for amplifying a VFN3 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 63 tactgggttt ttcttcgua 19 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF19N2 for amplifying VFN2 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 64 tactgggttt ttcttcgu 18 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF18N1 for amplifying a VFN1 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 65 tactgggttt ttcttcg 17 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer as VT21R20 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. <400> 66 gtcccctgag atatatgttc 20 ?? ?? ?? ?? 1/41

Claims (6)

1. (a) 서열번호 23, 32 또는 37의 아미노산 서열을 갖는 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드.
2. (a) 서열번호 23, 32 또는 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산; 및

   (b) 서열번호 22, 31 또는 36의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산:

   으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
3. 제2항에 의해 정의된 핵산을 포함하는 재조합 DNA.
4. 제3항에 의해 정의된 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체.
5. 제4항에 의해 정의된 형질전환체를 배양하고;

   배양물로부터 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드를 모으는 것:

   을 포함하는 내열성 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조방법.
6. 플라스미드 pPFU220(FERM BP-7654), pPHO238(FERM BP-7692) 및 pAFU204(FERM BP-7691) 중 어느 하나가 도입된 형질전환체를 배양하여 얻을 수 있는, 리보뉴클레아제 H 활성을 갖는 폴리펩타이드.