JPH08205870A

JPH08205870A - ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子

Info

Publication number: JPH08205870A
Application number: JP7016812A
Authority: JP
Inventors: Harumi Shimado; はるみ島戸; Yoshizumi Ishino; 良純石野; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1995-02-03
Publication date: 1996-08-13
Anticipated expiration: 2021-10-18
Also published as: DE69607874T2; US5789226A; CN1138100A; KR960031612A; EP0725138A2; EP0725138A3; CN1101469C; EP0725138B1; DE69607874D1; JP3836168B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ＢａｌＩ制限酵素を遺伝子工学的に大量に製
造する。【構成】単離されたＢａｌＩ制限酵素遺伝子、Ｂａｌ
Ｉ修飾酵素遺伝子、これらの遺伝子を含むベクター、該
ベクターによる形質転換体および該形質転換体を用いる
ＢａｌＩ制限酵素の製造方法。【効果】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子が単離さ
れ、該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換したエシ
ェリヒア・コリにより、遺伝子工学において有用なＢａ
ｌＩ制限酵素を効率よく大量に製造することが可能とな
った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学試薬として
有用な制限酵素および修飾酵素の遺伝子、さらに詳細に
は、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子およびそれらを
用いたＢａｌＩ制限酵素の遺伝子工学的製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素は、ブレビ
バクテリウム・アルビダム（Brevibacterium albidum）
ＡＴＣＣ１５８３１（以下、Ｂａｌ菌と略記する）によ
り生産され、ＤＮＡを切断する活性を有するＢａｌＩ
制限酵素と、ＢａｌＩ制限酵素による切断からＤＮＡを
保護するＢａｌＩ修飾酵素（メチラーゼまたはメチルト
ランスフェラーゼともいう）により構成される。Ｂａｌ
Ｉ制限酵素は典型的ＩＩ型制限酵素であり、ＤＮＡ塩基
配列中、二回転対称構造の６塩基からなる配列（５’−
ＴＧＧＣＣＡ−３’）を認識し、その認識配列のＧとＣ
の間を平滑末端となるように切断する酵素である〔ゲリ
ナス(Gelinas)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー (Journal of Molecular Biology) 第１１
４巻、第４３３〜４４０頁（１９７７）〕。一方、Ｂａ
ｌＩ修飾酵素は、認識配列の５’側から４番目のシトシ
ン塩基（Ｃ）にメチル基を導入する作用を有し、Ｂａｌ
Ｉ制限酵素による切断よりＤＮＡを保護する機能を有す
る酵素である。

【０００３】Ｂａｌ菌からのＢａｌＩ制限酵素の製造方
法としては、上記のゲリナスらのジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジーの報文に記載されている。し
かしながら、Ｂａｌ菌より得られるＢａｌＩ制限酵素の
含量は少なく、当該酵素を大量に得ることは困難であ
る。そこで、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子をクローニング
し、遺伝子工学的に大量に製造することが考えられる。
このとき、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子とＢａｌＩ修飾酵素
遺伝子の両方が必要とされる。ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子
については、ウイルソン(Wilson)が、ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）第７４巻、第２８１〜２８９頁（１９８８）におい
てクローニングされた種々の修飾酵素遺伝子の一つとし
て挙げている。しかしながら、その具体的なクローニン
グ方法や、クローニングされた遺伝子の遺伝子構造や塩
基配列など、遺伝子を特定するに足る記載はなく、その
詳細は明らかではない。また、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子
についての報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｂａ
ｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を提供し、ＢａｌＩ制限
酵素の工業的製造に適したＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺
伝子を含むプラスミドを導入した新規微生物、特に、エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）を創製し、該微
生物を用いたＢａｌＩ制限酵素の製造方法を提供するこ
とにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｂａｌ菌
よりＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片
をクローニングすることに成功し、さらに、これらのＤ
ＮＡ断片全体あるいは一部が同一または個別のプラスミ
ドに組み込まれたプラスミドを導入した微生物、特に、
エシェリヒア・コリを培養することにより、菌体中に著
量のＢａｌＩ制限酵素が蓄積し、これらの培養物より大
量のＢａｌＩ制限酵素を取得できることを見出し、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明の第１の態様は、単離さ
れたＢａｌＩ制限酵素遺伝子およびそれとハイブリダイ
ズ可能な遺伝子に関する。本発明の第２の態様は、単離
されたＢａｌＩ修飾酵素遺伝子およびそれとハイブリダ
イズ可能な遺伝子に関する。本発明の第３の態様は、第
１の態様の遺伝子を含むベクターに関する。本発明の第
４の態様は、第２の態様の遺伝子を含むベクターに関す
る。本発明の第５の態様は、第１の態様の遺伝子と第２
の態様の遺伝子両方を含むベクターに関する。

【０００７】本発明の第６の態様は、第３および第４の
態様の両方のベクターで形質転換され、ＢａｌＩ制限酵
素を生産することができる形質転換体に関する。本発明
の第７の態様は、第５の態様のベクターで形質転換さ
れ、ＢａｌＩ制限酵素を生産することができる形質転換
体に関する。本発明の第８の態様は、ＢａｌＩ制限酵素
の製造方法に関し、第６または第７の態様の形質転換体
を培養し、該培養物からＢａｌＩ制限酵素を採取するこ
とを特徴とする。

【０００８】本明細書においては、ＢａｌＩ制限酵素活
性を有するポリペプチドの総称としてＢａｌＩ制限酵
素、ＢａｌＩ修飾酵素活性を有するポリペプチドの総称
としてＢａｌＩ修飾酵素なる用語を使用する。ＢａｌＩ
制限・修飾系酵素遺伝子にはＤＮＡを切断する活性を
有するＢａｌＩ制限酵素をコードする遺伝子と、Ｂａｌ
Ｉ制限酵素による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素を
コードする遺伝子が含まれている。ここで、制限・修飾
系酵素遺伝子とは、制限および修飾の両酵素遺伝子をも
つ遺伝子とその各個別の遺伝子との両者を統合した意味
の用語である。換言すれば、制限および／または修飾酵
素遺伝子を意味する。これらの遺伝子は、単独あるいは
複合体の形で利用できる。また、上記の両遺伝子を組
み込んだプラスミドを用いる場合、そのプラスミドは両
遺伝子を同一のプラスミドに組み込んだものでも、ある
いは両遺伝子を各個別に複数のプラスミドに組み込んだ
もののいずれであってもよい。

【０００９】本発明において、制限・修飾系酵素遺伝子
をクローニングする方法としては、ベクター修飾法ある
いはメチラーゼ選択法と呼ばれる方法がよく用いられて
いる〔上記ウイルソン、ジーン、第７４巻、第２８１〜
２８９頁（１９８８）〕。この方法は、制限酵素遺伝子
と修飾酵素遺伝子がゲノム上で互いに近傍に存在し発現
しているという仮定に基づいている。すなわち、修飾酵
素活性を有するクローンの中には対応する制限酵素遺伝
子も合わせて持つものがあるはずである。しかし、Ｂａ
ｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子のクローニングに関して
は、この方法をそのまま適用することはできなかった。
すなわち、ＢａｌＩ修飾酵素活性を有するクローンの中
からは、ＢａｌＩ制限酵素活性は検出されなかった。Ｂ
ａｌＩ制限酵素活性が検出されない理由としては、Ｂａ
ｌＩ制限酵素遺伝子がＢａｌＩ修飾酵素遺伝子に隣接し
て存在していない、あるいは、隣接はしているが全長が
クローニングされていない、あるいは、全長がクローニ
ングされているが宿主内で発現されない、等の理由が考
えられるが、この時点では３つのうちのどの理由による
ものかは予想できない。

【００１０】ウイルソンは上記のジーンで、メチラーゼ
選択法をさらに発展させた多段階クローニング法（Mult
i-step cloning）も報告している。しかし、全長がクロ
ーニングされているが発現されない場合は、この方法も
そのまま適用できない。結果的に、ＢａｌＩ制限酵素遺
伝子はそのままの形ではエシェリヒア・コリ内で発現し
ないことが判明し、本発明者らは、ＢａｌＩ制限酵素遺
伝子の全塩基配列を決定した後に、遺伝子の開始部分を
改変して発現ベクターに結合し、別途発現系を構築し
た。また、用いるエシェリヒア・コリの株によっては、
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をクローニングするこ
とができないことも明らかとなった。

【００１１】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をクロー
ニングし、発現させるための手順を以下に例示する。（１）ＤＮＡ供与体であるＢａｌ菌から染色体ＤＮＡ
を抽出してＳａｕ３ＡＩ制限酵素で部分消化し、Ｂａｌ
Ｉ認識配列をもつベクターに結合させる。（２）（１）で作製したプラスミドライブラリーでエ
シェリヒア・コリＥＲ１６４８株を形質転換し、プラス
ミド抽出法によりプラスミドライブラリーを得る。（３）（２）で作製したプラスミドライブラリーをイ
ン・ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＢａｌＩ制限酵素で
消化する。このとき、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含有し
かつ発現しているプラスミドは消化されない。（４）（３）のプラスミドライブラリーをエシェリヒ
ア・コリＥＲ１６４８株に再び戻して形質転換させる。
このとき、消化されていない環状のプラスミドのみが効
率よく選択的に導入され、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子が発
現している形質転換体のみを選択できる。（５）（４）で得られた形質転換体についてＢａｌＩ
制限酵素活性をイン・ビトロの方法で測定する。

【００１２】もし、ＢａｌＩ制限酵素活性が検出された
なら、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子もそのクローン中に存在
し、かつ発現していることになり、以下の手順（６）〜
（１０）は不要である。しかしながら、本発明によれ
ば、ＢａｌＩ制限酵素活性は検出されず、さらに以下の
手順が必要であった。（６）Ｂａｌ菌より上記のゲリナスの方法等によりＢ
ａｌＩ制限酵素をできるだけ高純度に精製し、そのＮ末
端側よりアミノ酸配列を決定する。さらに、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を
行い、分子量の情報を得る。（７）（５）のＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含んでいる
クローンについて種々の欠失変異体を作製し、ＢａｌＩ
修飾酵素遺伝子の位置を特定する。（８）（７）で作製した適当な欠失変異体について全
塩基配列を決定する。次に、オープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）を検索し、（６）および（７）の情報か
らＢａｌＩ制限酵素遺伝子、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を
特定する。（９）（８）で特定された（エシェリヒア・コリ内で
発現しない）ＢａｌＩ制限酵素遺伝子を発現するように
遺伝子工学的に改変した後、発現ベクターに結合し、Ｂ
ａｌＩ制限酵素遺伝子発現用ベクターを構築する。（１０）（７）で作製したＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を
含むベクターと、（９）で作製したＢａｌＩ制限酵素遺
伝子を含むベクターでエシェリヒア・コリＥＲ１６４８
株を形質転換し、ＢａｌＩ制限酵素を生産することがで
きる形質転換体を作製する。（１１）（１０）で作製した形質転換体を培養し、該
培養物からＢａｌＩ制限酵素を大量に得る。

【００１３】（１）において使用するベクターとして
は、ＢａｌＩ認識配列を含み、かつ当該配列がＢａｌＩ
制限酵素で切断されるものであれば使用可能である。本
発明者らは、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩ
部位にＢａｌＩリンカー（５’−ＴＴＧＧＣＣＡＡ−
３’）を挿入して、ＢａｌＩ認識配列を新たに導入した
ベクターを構築し、使用した。なお、このベクターをｐ
ＢＢＢ１と命名した。新たなＢａｌＩ認識配列を導入し
た理由は、もとからｐＢＲ３２２上にあるＢａｌＩ認識
配列がｄｃｍメチラーゼの影響により切断されにくいこ
とを考慮したものである。

【００１４】（２）における形質転換に際しては、本発
明者らの実験によれば、用いるエシェリヒア・コリ株の
種類によっては安定した形質転換体が得られない。すな
わち、ＥＲ１６４８株を用いたときのみ安定した形質転
換体が得られ、ＨＢ１０１株やＭＣ１０６１株では得ら
れない。よって、以降の手順においてもＥＲ１６４８株
を用いた。（３）〜（４）において得られた形質転換体
から、本発明者らはＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含む約
５．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドを選択し、該
プラスミドをｐＢＢ５と命名した。（５）においては、
得られたクローンのＢａｌＩ制限酵素活性を調べる。Ｂ
ａｌＩ制限酵素活性は、以下のようなイン・ビトロの
方法により調べることができる。すなわち、試験するク
ローンを培養し、その培養物を粉砕し、超遠心分離を行
い残渣を除去した上清を用い、ラムダファージＤＮＡを
基質として、３７℃で制限酵素反応を行いアガロースゲ
ル電気泳動により解析することができる。本発明者ら
は、当該方法を用いてｐＢＢ５を有するエシェリヒア・
コリＥＲ１６４８の抽出液についてＢａｌＩ制限酵素活
性を調べたが、活性は検出されなかった。活性が検出さ
れない理由としては上記の３つの理由が考えられたが、
この時点ではどの理由によるものかは予想できない。こ
の３つの可能性のうちのいずれであるかを決めるために
以下の手順を進めた。

【００１５】（６）において、ＢａｌＩ制限酵素のＮ末
端側アミノ酸配列の決定は、精製したＢａｌＩ制限酵素
をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移し、
自動アミノ酸シーケンサーにより行うことができる。当
該方法によって決定したＢａｌＩ制限酵素のＮ末端側ア
ミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。また、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果によれば、ＢａｌＩ制限酵素の分子量
は約２９,０００であった。（７）において、作製した
各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素活性の関係を図１に示
す。この結果、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片上にＢａｌＩ
修飾酵素遺伝子が存在することが判明した。当該ＤＮＡ
断片をｐＢＢＢ１に挿入したプラスミドを作製し、ｐＢ
ＳＲ１と命名した。図２にｐＢＳＲ１の構築過程を示
す。

【００１６】（８）において、ｐＢＳＲ１に挿入されて
いる約３．２ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し
た。その塩基配列を配列表の配列番号６に示す。さら
に、ＯＲＦを検索した結果、塩基番号４３７〜１２７６
に正方向のＯＲＦ（ＯＲＦ１）およびび１２７９〜２０
５８に逆方向のＯＲＦ（ＯＲＦ２）が存在した。ＯＲＦ
１の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の
配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
ＯＲＦ２の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配
列表の配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号１に
示す。（７）における各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素
活性の関係から、ＯＲＦ１がＢａｌＩ修飾酵素をコード
していると決定した。このことは、ＯＲＦ１のみをＰＣ
Ｒで増幅したＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが導
入されたエシェリヒア・コリがＢａｌＩ修飾酵素活性を
有していたことからも裏付けられた。また、（６）のＮ
末端側アミノ酸配列がＯＲＦ２のそれと一致することか
ら、ＯＲＦ２がＢａｌＩ制限酵素をコードしていると決
定した。さらに、配列番号１のアミノ酸配列から計算さ
れる分子量は２９,０４３であり（６）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果とよく一致した。図３にクローニングされた
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示す。図中、
Ｍは修飾酵素遺伝子を、Ｒは制限酵素遺伝子を、矢印は
ＯＲＦの方向を表す。

【００１７】以上より、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝
子の構造が明らかとなり、かつＢａｌＩ制限酵素遺伝子
はその全体がクローニングされているにもかかわらず、
エシェリヒア・コリ内で発現しないことが明らかとなっ
た。（９）において、本発明者らは、ＯＲＦ２の開始コ
ドンをＧＴＧからＡＴＧに改変し、さらに、エシェリヒ
ア・コリ内で強力に働くｌａｃプロモーターの下流に遺
伝子を結合することによって、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子
の発現系を構築した。まず、ＯＲＦ２をＰＣＲで増幅す
る。この際、開始コドンがＡＴＧになるようにプライマ
ーの配列を工夫する。つぎに、増幅した遺伝子をｐＳＴ
Ｖ２８ベクター（宝酒造社）のｌａｃプロモーターの下
流に結合させた。当該ベクターをｐＳＲＢ８と命名し
た。ｐＳＢＲ８およびＢａｌＩ修飾酵素を発現するｐＢ
ＳＲ１をエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株に導入した
形質転換体は Escherichia coliER1648/pBSR1/pSRB8 と
命名、表示され、平成６年１１月１０日から工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４６２５の
受託番号の下で寄託されている。

【００１８】（１０）において、Escherichia coli ER1
648/pBSR1/pSRB8の培養菌体１ｇから約７０,０００単位
のＢａｌＩ制限酵素活性が検出され、これはＢａｌ菌の
生産量の約１,０００倍であった。形質転換体の培養物
からＢａｌＩ制限酵素を採取するにあたっては、例え
ば、培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離
等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフ
ィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、イオン交
換クロマトグラフィー法等を組み合わせ精製すればよ
い。この方法により、ＢａｌＩ制限酵素を大量に得るこ
とができる。

【００１９】また、上記で得られた遺伝子をプローブと
して厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、
得られた遺伝子と配列は少し異なるが、同様な酵素活性
を持つ類似の遺伝子を得ることができ、これも本発明範
囲のものである。かかる厳密な条件下とは、ＤＮＡを固
定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＣＣは塩化ナ
トリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを
１リットルの水に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナ
トリウム、サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５×デン
ハルツ（Denhardt's）（ウシ血清アルブミン、ポリビニ
ルピロリドン、フィコールを各々０．１％の濃度で含
む）を含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとハイ
ブリダイゼーションを行うことをいう。

【００２０】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素をコードする類
似の遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法と
しては、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、目的
の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従い、プラス
ミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライ
ブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で
培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセル
ロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮ
Ａを膜に固定する。この膜をあらかじめ³²Ｐ等で標識し
たプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列
番号１または３に記載したアミノ酸配列またはその一部
をコードする遺伝子であればよく、例えば、配列表の配
列番号２または４に記載した遺伝子またはその一部を使
用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤ
ＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例
えば、ＤＮＡを固定化した膜を、上記の厳密な条件でプ
ローブとハイブリダイゼーションを行う。

【００２１】ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着
を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブ
とハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作
をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り
返す。こうして得られたクローンの中には、目的の蛋白
質をコードする遺伝子が挿入されている。

【００２２】得られた遺伝子は、例えば、つぎのように
塩基配列を決定し、遺伝子が目的のＢａｌＩ制限・修飾
系酵素をコードする遺伝子であるかを確認する。塩基配
列の決定は、ハイブリダイゼーションにより得られたク
ローンの場合、組換体がエシェリヒア・コリであれば、
試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従って抽出
する。これを制限酵素により切断し、挿入断片を取り出
し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、
ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファ
ージの場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定
することができる。これら培養から塩基配列決定までの
基本的な実験法については、例えば、ティ・マニアティ
ス（T. Maniatis）らのモレキュラー・クローニング・
ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning A
Laboratory Manual、１９８２年、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー発行）等に記載されている。

【００２３】得られた遺伝子が目的のＢａｌＩ制限・修
飾系酵素であるかどうかを確認するには、決定された塩
基配列を配列表の配列番号２または４に記載した塩基配
列および配列表の配列番号１または３に記載したアミノ
酸配列と比較してその遺伝子構造およびアミノ酸配列を
知ることができる。得られた遺伝子がＢａｌＩ制限・修
飾系酵素をコードする領域の全てを含まない場合には、
得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製
し、ＰＣＲによって足りない領域を増幅したり、得られ
た遺伝子の断片をプローブとして、さらにＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、全コード領域
を得ることができる。

【００２４】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素活性を持つポリ
ペプチドを遺伝子工学的に得るには、まず、得られたＢ
ａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を適当な宿主細胞、例え
ば、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis）、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクター
に常法に従い接続して、それを宿主細胞に導入し、形質
転換体を作製する。この形質転換体を培養することによ
りＢａｌＩ制限・修飾系酵素活性を有するポリペプチド
を生産させることができる。

【００２５】用いる発現系によっては、形質転換体中で
発現されたポリペプチドが不溶物［封入体（inclusion
body）］として蓄積される場合がある。この場合は、こ
の不溶物を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等で可溶
化した後に、変性剤を除くことによって回復させること
ができる。発現は、ＢａｌＩ制限酵素活性またはＢａｌ
Ｉ修飾酵素活性を測定することにより確認できる。Ｂａ
ｌＩ制限酵素活性は上記のイン・ビトロ法により測定で
き、ＢａｌＩ修飾酵素活性は形質転換体のＤＮＡのＢａ
ｌＩ認識配列がＢａｌＩ制限酵素によって消化されない
ことにより確認することができる。

【００２６】形質転換体からのＢａｌＩ制限・修飾系酵
素活性を有するポリペプチドを精製するには、上記と同
様なクロマトグラフィーの手法を用いることができる。
発現産物が不溶物として蓄積されている場合も、上記と
同様に、例えば、細胞を破砕後、沈殿を回収し、尿素等
の変性剤で可溶化する。ついで、変性剤を除き、リフォ
ールディングさせた後、上記のようなクロマトグラフィ
ーにより目的の活性を有するポリペプチドを得ることが
できる。

【００２７】さらに、本発明においては、ＢａｌＩ制限
酵素遺伝子とＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の両方を含み、か
つ発現可能なベクターで宿主を形質転換することによっ
ても、ＢａｌＩ制限酵素を生産することのできる形質転
換体を得ることができ、該形質転換体を培養することに
よって、ＢａｌＩ制限酵素を製造することができる。こ
のようなベクターは、例えば、ｐＢＳＲ１上のＢａｌＩ
制限酵素遺伝子を宿主内で発現するように改変したベク
ターを作製することによって得ることができる。ｐＢＳ
Ｒ１上のＢａｌＩ制限酵素遺伝子がエシェリヒア・コリ
内で発現しない理由として、例えば、制限酵素の構造遺
伝子上流にエシェリヒア・コリ内での転写に適したプロ
モーター配列がないこと、翻訳の開始コドンがエシェリ
ヒア・コリでは比較的効率のよくないＧＴＧであること
等が考えられる。したがって、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子
の上流に試験管内遺伝子操作法を用いて適当なプロモー
ター配列を挿入したり、試験管内部位特異的変位導入法
を用いて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに変換すること
により、目的のベクターを得ることができる。

【００２８】さらに、図３に示すように、ｐＢＳＲ１上
では制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子が翻訳の終始点が
見合う形で、転写、翻訳の方向が逆向きであり、両遺伝
子の間で発現過程において互いに阻害しあう可能性があ
る。したがって、両遺伝子の方向をそろえることによっ
て発現しやすくなることも考えられる。このような改変
の方法としては、例えば、まず、制限酵素遺伝子、修飾
酵素遺伝子のそれぞれ全長を含む領域をＰＣＲ法によっ
て増幅する。このとき、プライマーの配列を工夫し、増
幅された遺伝子の末端に適当な認識配列を導入する。つ
いで、その部位を利用して両遺伝子を同方向に連結し、
ｌａｃプロモーター等の適当なプロモーターを有する発
現ベクターに組み込むことにより目的のベクターを得る
ことができる。これらのベクターによる宿主細胞の形質
転換、得られた形質転換体の培養、発現された酵素の精
製も上記と同様に行うことができる。

【００２９】

【実施例】つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。実施例１Ｂａｌ菌染色体ＤＮＡの調製Ｂａｌ菌を、Ｌ培地（１０ｇ／リットルトリプトン
、５ｇ／リットル酵母エキス、５ｇ／リットルＮ
ａＣｌ）１００ｍｌ中３７℃で１晩培養した後、遠心分
離により集菌した。当該菌体を１０ｍｌの溶液Ａ〔２５
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグル
コース、１０ｍＭＥＤＴＡ〕に懸濁し、リゾチームを
同液に２ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたものを１．０
ｍｌ加えて撹拌し、３７℃で１５分静置した。つぎに、
当該溶液に２８ｍｌの溶液Ｂ〔１００ｍＭＮａＣｌ、
１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、
撹拌し、さらに４ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、撹拌
し、３７℃で１時間静置した。当該溶液に１ｍｌの溶液
Ｃ〔１０％ＳＤＳ、８％サルコシル(Sarcosyl)〕を
加えて撹拌し、６０℃で１５分静置した。当該溶液を静
置後、等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）混
液を加え、１０分間穏やかに撹拌した後、遠心分離（５
０００ｇ、１０分）により、水層とクロロホルム層を分
離した。分離後水層を取り、これに等量のイソプロピル
アルコールを加え、撹拌し、０℃で１０分間静置した
後、遠心分離（１３５００ｇ、１０分)により沈殿を回
収した。これを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍｌの
ＴＥ溶液〔１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭＥＤＴＡ〕に溶解させ、４℃で保存し
た。

【００３０】実施例２クローニングベクターの構築ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をスクリーニングする
ためのクローニングベクターとして、ｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＶ制限酵素切断部位およびＮｒｕＩ制限酵素切断
部位にＢａｌＩリンカー（５’−ＴＴＧＧＣＣＡＡ−
３’）（宝酒造社製）を導入したベクターを以下のよう
に新たに構築した。まず、２５μｇのｐＢＲ３２２を制
限酵素ＥｃｏＲＶ１５０ユニットと緩衝液〔１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭＭｇＣｌ₂、１
５０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、０．０１％ウシ血清アルブミン〕中、３７℃で１時
間反応させ、エタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを
回収した。このＤＮＡを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）に溶解し、２．５ユニットのアルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造社）を加え、５５℃、１時間反応さ
せ、フェノール処理、エタノール沈殿を行いＤＮＡを回
収した。一方、１００ｐｍｏｌのＢａｌＩリンカーの
５’末端を、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造社）を用いてリン酸化し、エタノール沈殿
後リンカーＤＮＡを回収した。リン酸化したＢａｌＩ
リンカー５０ｐｍｏｌとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＲ３
２２ＤＮＡ１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）７
００ユニットを用い、リガーゼ緩衝液〔６６ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、０．１ｍＭＡＴＰ〕中、５℃で１６時
間反応させ結合させた後、７０℃で５分間加熱してか
ら、２０ユニットのＥｃｏＲＶで消化した。こうして得
られたプラスミドＤＮＡでエシェリヒア・コリＨＢ１０
１株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
むＬ寒天培地に塗布した。３７℃で生育したコロニーを
分離し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌ
のＬ培地で３７℃で１６時間培養した後、集菌し、アル
カリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを分離した。

【００３１】すなわち、集菌体に０．２ｍｌの溶液Ｉ
〔５０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ〕を加え、懸濁し、０．４
ｍｌの溶液ＩＩ（０．２ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を
加え、０℃で５分間保持した。これに０．３ｍｌの溶液
ＩＩＩ〔５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）〕を加え、０
℃で１５分間保持した後、遠心分離し、上清を回収し
た。イソプロピルアルコール０．６ｍｌを加え０℃で１
０分間保持した後、遠心により沈殿を回収し、これを７
０％エタノールで洗浄し乾燥した。これに２０μｇ／ｍ
ｌのＲＮａｓｅＡを０．１ｍｌ加え、３７℃で４０分間
反応させ、０．０３ｍｌの１ＭＭｇＣｌ₂を加え０℃
で１０分間保持した。遠心分離により、上清を回収しこ
れに０．０６ｍｌの溶液ＩＶ〔２０％ポリエチレングリ
コール＃6000、２ＭＮａＣｌ〕を加え、攪拌し、０℃
で６０分間保持した。遠心分離で沈殿を回収後、ＴＥ溶
液に溶解した。このＤＮＡ溶液にＢａｌＩ制限酵素を作
用させ、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｌＩリンカ
ーを含むプラスミドを選択した。ついで、このＥｃｏＲ
Ｖ切断部位にＢａｌＩリンカーが挿入されたプラスミド
をＮｒｕＩ制限酵素で消化し、上記の方法に準じ、Ｎｒ
ｕＩ制限酵素切断部位にもＢａｌＩリンカーを導入し
た。その結果ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部
位及びＮｒｕＩ制限酵素切断部位にＢａｌＩリンカーを
導入したベクターが得られた。当該ベクターをｐＢＢＢ
１と命名した。

【００３２】実施例３ライブラリーの作製実施例１で得られたＢａｌ菌の染色体ＤＮＡ２５μｇ
に１ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを緩衝液〔５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭＮａＣｌ〕中、３
７℃で１〜１０分間反応させて部分消化した後、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、ゲルより３〜７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。このＤＮＡ断片をあらかじめＢａｍ
ＨＩで開裂しておいたｐＢＢＢ１に結合した後、これら
のプラスミドでエシェリヒア・コリＥＲ１６４８を形質
転換した。こうして得られた形質転換体からアルカリ−
ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、プラスミドライ
ブラリーを調製した。

【００３３】実施例４修飾酵素遺伝子の単離実施例３で得られたプラスミドライブラリー３μｇにＢ
ａｌＩ制限酵素５０ユニットを緩衝液〔２０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７ｍＭＭｇＣｌ₂、７ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アル
ブミン〕中３７℃で３時間反応させた。このときＢａ
ｌＩ修飾酵素が発現しているプラスミドはＢａｌＩ制限
酵素で切断されない。反応後、フェノール処理、エタノ
ール沈殿を行い、ＤＮＡを回収した。つぎに、このＤＮ
Ａを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解
し、２．５ユニットのアルカリホスファターゼを加えて
５５℃で１時間反応させた後、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行い、再びＤＮＡを回収した。こうして得ら
れた切断されている、あるいは切断されていないプラス
ミドＤＮＡの混合物でエシェリヒア・コリＥＲ１６４８
を形質転換した。このとき、切断されていない環状のプ
ラスミドのみが効率よくエシェリヒア・コリ中に導入さ
れ、アンピシリンを含むプレート上で形質転換体として
選択される。この結果、約１０,０００個のコロニーが
出現し、この中から１０個のコロニーを無作為に選択し
た。つぎに、それぞれのコロニーを１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む２ｍｌのＬ培地で３７℃で１６時間
培養した後に集菌し、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミ
ドを抽出して、ＢａｌＩ制限酵素で処理した。その結
果、３個のプラスミドがＢａｌＩ制限酵素に対して耐性
を示したが、このうち２個はプラスミド上のＢａｌＩ部
位そのものが欠失しており、残りの１個のみがＢａｌＩ
修飾酵素遺伝子を発現していた。このようにして、Ｂａ
ｌＩ修飾酵素遺伝子を含んでいる形質転換体が得られ
た。しかしながら、この形質転換体についてＢａｌＩ制
限酵素活性を解析したところ、活性は認められなかっ
た。

【００３４】実施例５修飾酵素遺伝子の解析実施例４で得られたＢａｌＩ修飾酵素が発現しているプ
ラスミドは約５．２ｋｂのＢａｌ菌由来のＤＮＡ断片を
含んでいた。該プラスミドをｐＢＢ５と命名した。つぎ
に、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の位置を限定するために、
当該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、これを用いて
様々の領域を欠失させたＤＮＡ断片をもつプラスミドを
作製し、修飾酵素活性を測定した。その結果を図１に示
す。すなわち、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子は約３．２ｋｂ
のＤＮＡ断片上に存在することがわかった。この約３．
２ｋｂのＤＮＡ断片を含むＥｃｏＲＶ−ＳｓｐＩ断片
（約３．７ｋｂ）をｐＢＢ５から切り出し、ｐＢＢＢ１
に結合させたプラスミドを作製し、ｐＢＳＲ１と命名し
た。図２にｐＢＳＲ１の構築過程を示す。

【００３５】実施例６ＢａｌＩ制限酵素のＮ末端側アミノ酸配列の決定Ｂａｌ菌よりゲリナスの方法でＢａｌＩ制限酵素を精製
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に移し、
クマシーブリリアントブルーにより染色し、１０％酢酸
−５０％メタノールで脱色した。分子量約２９,０００
のＢａｌＩ制限酵素の部分を切り取り、アミノ酸シーク
エンサー４７０Ａ型（アプライドバイオシステムズ社
製）に供し自動エドマン分解により、Ｎ末端側アミノ酸
配列を決定した。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号
５に示す。

【００３６】実施例７ＢａｌＩ制限・修飾系遺伝子の構造解析ｐＢＳＲ１に挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を、
エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造社製）、およびマン
グビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を用いて種々の大
きさの欠失変異体を作成した後、ジデオキシ法で決定し
た。その塩基配列を配列表の配列番号６に示す。さら
に、ＯＲＦを検索した結果、塩基番号４３７〜１２７６
に正方向のＯＲＦ（ＯＲＦ１）および１２７９〜２０５
８に逆方向のＯＲＦ（ＯＲＦ２）が存在した。ＯＲＦ１
の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配
列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。Ｏ
ＲＦ２の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列
表の配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号１に示
す。各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素活性の関係から、
ＯＲＦ１がＢａｌＩ修飾酵素をコードしていると決定し
た。また、Ｎ末端側アミノ酸配列がＯＲＦ２のそれと一
致することから、ＯＲＦ２がＢａｌＩ制限酵素をコード
していると決定した。さらに、配列番号１のアミノ酸配
列から計算される分子量は２９,０４３であり、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。図３にクローニング
されたＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示す。
図中、Ｍは修飾酵素遺伝子を、Ｒは制限酵素遺伝子を、
矢印はＯＲＦの方向を表す。以上より、ＢａｌＩ制限・
修飾系酵素遺伝子の構造が明らかとなり、かつＢａｌＩ
制限酵素遺伝子はその全体がクローニングされているに
もかかわらず、エシェリヒア・コリ内で発現しないこと
が明らかとなった。

【００３７】実施例８ＢａｌＩ制限酵素遺伝子の発現系構築配列表の配列番号７で表されるＢＡＬ−Ｒ１プライマー
と配列番号８で表されるＢＡＬ−Ｒ２プライマーをプラ
イマー対とし、ｐＢＳＲ１をテンプレートとして、９４
℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間、２５サ
イクルのＰＣＲを行い、ＯＲＦ２の部分を増幅した。な
お、ＢＡＬ−Ｒ１プライマーは１番目の塩基がＡになっ
ているので増幅された遺伝子の開始コドンはＧＴＧから
ＡＴＧに変換される。つぎに、この増幅されたＤＮＡ断
片をｐＳＴＶ２８ベクターのＳｍａＩ部位に挿入し、ｌ
ａｃプロモーターの下流にＢａｌＩ制限酵素遺伝子が配
置されるようにした。このベクターをｐＳＲＢ８と命名
した。ｐＢＳＲ１およびｐＳＲＢ８によりエシェリヒア
・コリＥＲ１６４８株を形質転換し、得られた形質転換
体の抽出液のＢａｌＩ制限酵素活性を測定したところ、
活性が認められた。上記のごとく、この形質転換体を E
scherichia coli ER1648/pBSR1/pSRB8と命名、表示し、
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲ
ＭＰ−１４６２５）。このようにして、ＢａｌＩ制限
酵素を発現する形質転換体が得られた。

【００３８】実施例９ＢａｌＩ制限酵素の形質転換体による生産実施例８で得られたEscherichia coli ER1648/pBSR1/p
SRB8 （ＦＥＲＭＰ−１４６２５）をアンピシリン１
００μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ
を含む１００ｍｌのＬ培地に接種し、３７℃で５時間培
養した後、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように添
加し、更に３７℃で５時間培養した。集菌により得られ
た１ｇの菌体を、５ｍｌの１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
に懸濁し、超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１
０,０００ｇ、３０分）により上清を回収した。上清の
活性を測定したところ、ＢａｌＩ制限酵素は湿菌体１
ｇ当り約７０,０００ユニット生産されており、これは
Ｂａｌ菌からの生産量と比較して約１,０００倍の上昇
であった。以上のように、ＢａｌＩ制限酵素の大量生産
系が完成した。

【００３９】

【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明によ
りＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子が単離された。該遺
伝子を含有するプラスミドで形質転換したエシェリヒア
・コリにより、遺伝子工学において有用なＢａｌＩ制限
酵素を効率よく大量に製造することが可能となった。

【００４０】

【配列表】

【００４１】配列番号：1 配列の長さ：260 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： Met Asp Tyr Ala Phe Arg Asp Arg Pro Leu Asp Asp Val Glu Leu 1 5 10 15 Glu Val Leu Arg Leu Val Leu Ser Ser Phe Arg Asp Gly Ser Gly 20 25 30 Gln Val Val Arg Pro Asn Gly Gly Thr Met Pro Gly Phe Arg Asp 35 40 45 Tyr Glu Arg Gly Leu Ala Ala Val Leu His Ala Ser Ala Pro Glu 50 55 60 Asn Lys Gly Val Phe Asp Val Ile Val Pro Val Asp Gly Asp Lys 65 70 75 Ser Phe Gly Ile Ser Cys Lys Met Ala Thr Thr Pro Pro Ala Lys 80 85 90 His Ala Ser Ser Phe Met Glu Leu Ser Asn Ser Ala Ala Gln Phe 95 100 105 Arg Gln Ala Leu Leu Ala Gln Gln Ile Asn Trp Ala Thr Glu Pro 110 115 120 Gly Leu Ala Gly Pro Ala Ile Val Arg Leu Val Thr Gly Trp His 125 130 135 Asp Ala Thr Ala Asp Thr His Gln Leu Asp Leu Pro Ala Ser Lys 140 145 150 Tyr Ser Val Leu Ala His Asn Pro Ser Trp Thr Gln Phe Gln Leu 155 160 165 Leu Cys Phe Pro Leu Asp Leu Gln Ile Ala Asn Pro Val Gly Glu 170 175 180 Val Glu Trp Leu His Glu Gly Ala Ser Leu Asn Gly Tyr Ile Asp 185 190 195 Asp Gly Gly Arg Arg His Arg Leu Trp Gln Cys Tyr Met Asn Ser 200 205 210 Gly Gly Gln Leu Lys Tyr Tyr Pro Leu Leu Arg Trp Ala Asp Trp 215 220 225 Val Thr Glu Pro Phe Thr Leu Glu Leu Pro Pro Val Ala Ser Pro 230 235 240 Ile Leu Arg Ala Arg Asp Tyr Phe Asn Glu Val Trp Pro His Gly 245 250 255 Trp Asp Asp Arg Asn 260

【００４２】配列番号：2 配列の長さ：780 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： GTG GAT TAC GCG TTT CGT GAC CGG CCG CTC GAC GAT GTC GAG CTG 45 Met Asp Tyr Ala Phe Arg Asp Arg Pro Leu Asp Asp Val Glu Leu 1 5 10 15 GAG GTC CTC CGG CTG GTA TTG AGC TCG TTC CGA GAC GGA TCC GGT 90 Glu Val Leu Arg Leu Val Leu Ser Ser Phe Arg Asp Gly Ser Gly 20 25 30 CAG GTT GTC CGC CCC AAT GGC GGC ACA ATG CCA GGC TTC CGC GAC 135 Gln Val Val Arg Pro Asn Gly Gly Thr Met Pro Gly Phe Arg Asp 35 40 45 TAC GAG CGT GGT CTC GCC GCC GTG CTG CAT GCG TCA GCT CCG GAG 180 Tyr Glu Arg Gly Leu Ala Ala Val Leu His Ala Ser Ala Pro Glu 50 55 60 AAC AAG GGC GTC TTC GAC GTC ATC GTG CCC GTC GAC GGC GAT AAG 225 Asn Lys Gly Val Phe Asp Val Ile Val Pro Val Asp Gly Asp Lys 65 70 75 TCG TTC GGG ATC TCC TGC AAA ATG GCC ACG ACA CCT CCG GCG AAG 270 Ser Phe Gly Ile Ser Cys Lys Met Ala Thr Thr Pro Pro Ala Lys 80 85 90 CAT GCG TCG AGT TTC ATG GAG CTG TCT AAC TCC GCC GCC CAG TTC 315 His Ala Ser Ser Phe Met Glu Leu Ser Asn Ser Ala Ala Gln Phe 95 100 105 CGC CAG GCG CTG CTG GCG CAG CAG ATC AAT TGG GCG ACC GAG CCC 360 Arg Gln Ala Leu Leu Ala Gln Gln Ile Asn Trp Ala Thr Glu Pro 110 115 120 GGT CTT GCT GGC CCT GCG ATC GTG CGT CTG GTT ACC GGT TGG CAC 405 Gly Leu Ala Gly Pro Ala Ile Val Arg Leu Val Thr Gly Trp His 125 130 135 GAC GCC ACC GCC GAC ACC CAT CAA CTC GAC CTG CCC GCG AGT AAG 450 Asp Ala Thr Ala Asp Thr His Gln Leu Asp Leu Pro Ala Ser Lys 140 145 150 TAC TCG GTG TTG GCC CAC AAT CCG TCA TGG ACG CAG TTT CAG CTG 495 Tyr Ser Val Leu Ala His Asn Pro Ser Trp Thr Gln Phe Gln Leu 155 160 165 CTC TGC TTC CCC CTG GAC TTG CAG ATC GCG AAC CCG GTG GGC GAG 540 Leu Cys Phe Pro Leu Asp Leu Gln Ile Ala Asn Pro Val Gly Glu 170 175 180 GTG GAG TGG CTG CAC GAG GGT GCT TCG CTG AAC GGG TAT ATC GAT 585 Val Glu Trp Leu His Glu Gly Ala Ser Leu Asn Gly Tyr Ile Asp 185 190 195 GAC GGC GGC CGA CGG CAT CGG TTG TGG CAG TGC TAC ATG AAT TCC 630 Asp Gly Gly Arg Arg His Arg Leu Trp Gln Cys Tyr Met Asn Ser 200 205 210 GGC GGG CAG CTG AAG TAC TAC CCG CTG TTG CGG TGG GCG GAC TGG 675 Gly Gly Gln Leu Lys Tyr Tyr Pro Leu Leu Arg Trp Ala Asp Trp 215 220 225 GTG ACG GAG CCG TTC ACG CTG GAA CTG CCG CCG GTG GCG TCA CCG 720 Val Thr Glu Pro Phe Thr Leu Glu Leu Pro Pro Val Ala Ser Pro 230 235 240 ATC CTC CGG GCC CGT GAC TAC TTC AAC GAG GTC TGG CCG CAC GGT 765 Ile Leu Arg Ala Arg Asp Tyr Phe Asn Glu Val Trp Pro His Gly 245 250 255 TGG GAC GAC CGT AAC 780 Trp Asp Asp Arg Asn 260

【００４３】配列番号：3 配列の長さ：280 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： Met Thr Leu Glu Gln Ile Ser Ala Ala Leu Arg Thr Glu Arg Val 1 5 10 15 Pro Ala Ser Ser Asp Val Pro Trp Ala Ala Pro Asn Ala Ala Val 20 25 30 Met Arg Tyr Pro Gly Ser Lys Trp Ser Leu Ala Arg Gln Ile Val 35 40 45 Ala Glu Phe Asp Asp His Tyr His Tyr Val Glu Pro Phe Phe Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Val Phe Phe Ser Lys Pro Pro Val Pro His Glu Ile 65 70 75 Leu Asn Asp Thr Asn Gly Gln Val Val Asn Leu Phe Arg Val Leu 80 85 90 Arg Asp Arg Thr Glu Asp Leu Val Trp Gln Leu Glu Ala Thr Pro 95 100 105 Trp Ser Arg Asp Glu Tyr Asp Arg Ser His Val Leu Thr Gly Asp 110 115 120 Asp Val Glu Asp Ala Arg Arg Phe Val Val Arg Cys Trp Gln Ala 125 130 135 His Ala Ser Asp Leu Ala Lys Lys Thr Gly Trp Lys Thr Arg Gly 140 145 150 Ala Gln Gln Arg Ala Gly Gly Met Ser Leu Arg Trp Gln Lys Val 155 160 165 Pro Ala Gln Leu Arg Glu Leu Ala Trp Arg Leu Leu Asp Ala Glu 170 175 180 Ile Glu Asn Arg Asp Ala Val Gln Val Ile Arg Arg His Asn Ala 185 190 195 Glu Asn Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Pro Pro Tyr Leu His Ser Val 200 205 210 Arg Thr Gln Arg Met Tyr Gly Glu Glu Met Thr Asp Thr Glu His 215 220 225 Ile Ala Leu Leu Asp Ala Leu Leu Ala His Lys Gly Pro Val Val 230 235 240 Val Ser Gly Tyr Ala Asn Asp Leu Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Gly 245 250 255 Trp Arg Lys Val Thr Met Lys Ala Pro Lys Val Glu Lys Gly Ala 260 265 270 Ala Arg Thr Glu Val Leu Trp Val Lys Arg 275 280

【００４４】配列番号：4 配列の長さ：840 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： ATG ACG CTC GAG CAG ATC AGC GCG GCT CTA CGC ACG GAG CGG GTC 45 Met Thr Leu Glu Gln Ile Ser Ala Ala Leu Arg Thr Glu Arg Val 1 5 10 15 CCG GCA TCT TCA GAC GTC CCA TGG GCG GCG CCG AAT GCT GCA GTG 90 Pro Ala Ser Ser Asp Val Pro Trp Ala Ala Pro Asn Ala Ala Val 20 25 30 ATG CGC TAC CCG GGG TCG AAG TGG TCC CTC GCT CGG CAG ATT GTC 135 Met Arg Tyr Pro Gly Ser Lys Trp Ser Leu Ala Arg Gln Ile Val 35 40 45 GCG GAA TTC GAT GAC CAC TAC CAC TAC GTG GAA CCG TTC TTC GGT 180 Ala Glu Phe Asp Asp His Tyr His Tyr Val Glu Pro Phe Phe Gly 50 55 60 TCG GGG GCG GTG TTC TTC AGC AAG CCG CCG GTG CCG CAC GAG ATC 225 Ser Gly Ala Val Phe Phe Ser Lys Pro Pro Val Pro His Glu Ile 65 70 75 CTC AAC GAC ACC AAC GGT CAG GTC GTG AAC CTG TTC CGG GTG CTT 270 Leu Asn Asp Thr Asn Gly Gln Val Val Asn Leu Phe Arg Val Leu 80 85 90 CGC GAT CGG ACC GAG GAT CTG GTG TGG CAG CTT GAG GCG ACG CCT 315 Arg Asp Arg Thr Glu Asp Leu Val Trp Gln Leu Glu Ala Thr Pro 95 100 105 TGG TCT CGG GAC GAG TAT GAC CGG TCG CAC GTC CTG ACC GGG GAT 360 Trp Ser Arg Asp Glu Tyr Asp Arg Ser His Val Leu Thr Gly Asp 110 115 120 GAT GTC GAG GAC GCC AGA CGG TTC GTG GTT CGG TGC TGG CAG GCG 405 Asp Val Glu Asp Ala Arg Arg Phe Val Val Arg Cys Trp Gln Ala 125 130 135 CAC GCG AGC GAC CTG GCG AAG AAG ACT GGG TGG AAG ACC CGC GGC 450 His Ala Ser Asp Leu Ala Lys Lys Thr Gly Trp Lys Thr Arg Gly 140 145 150 GCG CAG CAG CGT GCC GGC GGG ATG TCG CTG CGG TGG CAG AAG GTG 495 Ala Gln Gln Arg Ala Gly Gly Met Ser Leu Arg Trp Gln Lys Val 155 160 165 CCG GCG CAG CTG CGG GAG CTT GCC TGG CGG CTG TTG GAT GCG GAA 540 Pro Ala Gln Leu Arg Glu Leu Ala Trp Arg Leu Leu Asp Ala Glu 170 175 180 ATC GAG AAC CGT GAC GCG GTG CAA GTG ATC CGC CGG CAC AAC GCC 585 Ile Glu Asn Arg Asp Ala Val Gln Val Ile Arg Arg His Asn Ala 185 190 195 GAG AAC GCT CTG ATC TAC GCA GAC CCG CCG TAT CTA CAC AGC GTC 630 Glu Asn Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Pro Pro Tyr Leu His Ser Val 200 205 210 CGC ACG CAG CGC ATG TAC GGC GAG GAG ATG ACC GAC ACC GAG CAC 675 Arg Thr Gln Arg Met Tyr Gly Glu Glu Met Thr Asp Thr Glu His 215 220 225 ATC GCC CTG CTG GAC GCG CTA CTG GCC CAC AAG GGG CCG GTG GTG 720 Ile Ala Leu Leu Asp Ala Leu Leu Ala His Lys Gly Pro Val Val 230 235 240 GTC AGC GGG TAC GCC AAC GAC CTA TAC GAC ACT GCG CTC GAG GGG 765 Val Ser Gly Tyr Ala Asn Asp Leu Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Gly 245 250 255 TGG CGC AAG GTG ACA ATG AAG GCG CCG AAG GTC GAG AAG GGT GCC 810 Trp Arg Lys Val Thr Met Lys Ala Pro Lys Val Glu Lys Gly Ala 260 265 270 GCC CGT ACT GAG GTG CTG TGG GTA AAG CGC 840 Ala Arg Thr Glu Val Leu Trp Val Lys Arg 275 280

【００４５】配列番号：5 配列の長さ：26 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の特徴： 1 E Xaaは不明のアミノ酸 6 E Xaaは不明のアミノ酸 24 E Xaaは不明のアミノ酸配列： Xaa Asp Tyr Ala Phe Xaa Asp Arg Pro Leu Asp Asp Val Glu Leu 1 5 10 15 Glu Val Leu Arg Leu Val Leu Ser Xaa Phe Arg 20 25

【００４６】配列番号：6 配列の長さ：3182 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： GATCGTCACA AACCGAGGGT GGTCGTCGCC ATCGACACGC CGGTCGGAGT GTCCCGCGGA 60 CGGTACCGCC TGTTACGGTA CCGGTTATGG GACATCAGGG GCAGCACGTG CCGCAGGCGG 120 TGCGTTGGGC GCAGAAAGCG CGTGAGGTGG AGGCGTTCAC CTCCGAATAC ATCGAGTACC 180 TGCAGGCGCA GCTGGTCAAG CATGCCCTGC ACGCCACTGG TGCAAGTCAG CGTGAGCTCG 240 CGGAGGACCT CGGGACGAGT AAGTCCCGGA TCAATCGTCT CGCGCGAGCG TCCTCGGAGC 300 CGCCGCATGC TGCGGAGACT GAGGACGTCG CAGCAGCGTT GGAGACGATC TTCCTCGGTA 360 CCCGCGTCAC CGAGGTGCGG GAGGGTGCTG CTGCCTACGA CCAGGCATCG TCGGTGGCAG 420 CTGGGACGGT GACCCGATGA CGCTCGAGCA GATCAGCGCG GCTCTACGCA CGGAGCGGGT 480 CCCGGCATCT TCAGACGTCC CATGGGCGGC GCCGAATGCT GCAGTGATGC GCTACCCGGG 540 GTCGAAGTGG TCCCTCGCTC GGCAGATTGT CGCGGAATTC GATGACCACT ACCACTACGT 600 GGAACCGTTC TTCGGTTCGG GGGCGGTGTT CTTCAGCAAG CCGCCGGTGC CGCACGAGAT 660 CCTCAACGAC ACCAACGGTC AGGTCGTGAA CCTGTTCCGG GTGCTTCGCG ATCGGACCGA 720 GGATCTGGTG TGGCAGCTTG AGGCGACGCC TTGGTCTCGG GACGAGTATG ACCGGTCGCA 780 CGTCCTGACC GGGGATGATG TCGAGGACGC CAGACGGTTC GTGGTTCGGT GCTGGCAGGC 840 GCACGCGAGC GACCTGGCGA AGAAGACTGG GTGGAAGACC CGCGGCGCGC AGCAGCGTGC 900 CGGCGGGATG TCGCTGCGGT GGCAGAAGGT GCCGGCGCAG CTGCGGGAGC TTGCCTGGCG 960 GCTGTTGGAT GCGGAAATCG AGAACCGTGA CGCGGTGCAA GTGATCCGCC GGCACAACGC 1020 CGAGAACGCT CTGATCTACG CAGACCCGCC GTATCTACAC AGCGTCCGCA CGCAGCGCAT 1080 GTACGGCGAG GAGATGACCG ACACCGAGCA CATCGCCCTG CTGGACGCGC TACTGGCCCA 1140 CAAGGGGCCG GTGGTGGTCA GCGGGTACGC CAACGACCTA TACGACACTG CGCTCGAGGG 1200 GTGGCGCAAG GTGACAATGA AGGCGCCGAA GGTCGAGAAG GGTGCCGCCC GTACTGAGGT 1260 GCTGTGGGTA AAGCGCTAGT TACGGTCGTC CCAACCGTGC GGCCAGACCT CGTTGAAGTA 1320 GTCACGGGCC CGGAGGATCG GTGACGCCAC CGGCGGCAGT TCCAGCGTGA ACGGCTCCGT 1380 CACCCAGTCC GCCCACCGCA ACAGCGGGTA GTACTTCAGC TGCCCGCCGG AATTCATGTA 1440 GCACTGCCAC AACCGATGCC GTCGGCCGCC GTCATCGATA TACCCGTTCA GCGAAGCACC 1500 CTCGTGCAGC CACTCCACCT CGCCCACCGG GTTCGCGATC TGCAAGTCCA GGGGGAAGCA 1560 GAGCAGCTGA AACTGCGTCC ATGACGGATT GTGGGCCAAC ACCGAGTACT TACTCGCGGG 1620 CAGGTCGAGT TGATGGGTGT CGGCGGTGGC GTCGTGCCAA CCGGTAACCA GACGCACGAT 1680 CGCAGGGCCA GCAAGACCGG GCTCGGTCGC CCAATTGATC TGCTGCGCCA GCAGCGCCTG 1740 GCGGAACTGG GCGGCGGAGT TAGACAGCTC CATGAAACTC GACGCATGCT TCGCCGGAGG 1800 TGTCGTGGCC ATTTTGCAGG AGATCCCGAA CGACTTATCG CCGTCGACGG GCACGATGAC 1860 GTCGAAGACG CCCTTGTTCT CCGGAGCTGA CGCATGCAGC ACGGCGGCGA GACCACGCTC 1920 GTAGTCGCGG AAGCCTGGCA TTGTGCCGCC ATTGGGGCGG ACAACCTGAC CGGATCCGTC 1980 TCGGAACGAG CTCAATACCA GCCGGAGGAC CTCCAGCTCG ACATCGTCGA GCGGCCGGTC 2040 ACGAAACGCG TAATCCACCC GCACATCGTA GAAGCCAACA AACAGTCGCC AACGGTCATA 2100 GCGCCGTGTC GCGGTGTCGG TTGCCGGCTG GTTCGACATG GCTGTTTGCC AAGACGCGAC 2160 GTCACGCCGT CCGAGGGGGA AGGATGACGT GCATGGATGC GGCACTGTGG GGTCAGGTTG 2220 TCATCGCCGC TGTCGCTGTT TTCGGGTCGG TCCTTGGGTA CATGCTCTCC GGCCTCAATG 2280 ATGCGCGGCG TGACCGGCGT ACGACGCTTC GGGAGCGTGC AGCACGGCAC GAGGAACGCG 2340 ACGCGGAAGA CCGACGTGAG CGGCATGCGT TCCAACGTGC AACGCTGCTC GAGCTGCAGG 2400 ACGCCGTTCA ACTCATGGCT CGGCTGACAG GCCGAACGAT GCACTTCGAC CACATGCAGG 2460 CGCGAGAGGG CAAACAGACA CAGCTTCCAT CGCAGTACGA CGATGAGATG CACGCAAACG 2520 GGGTCGATGT CATCCGTTTT CGGAACCGGC TCCTCGACGA CGACCTCCGT CGGTCGATCG 2580 CGGTGTTCGA ATCGCAGTGC GACCAGGTGT CGAAGCTGCC GCTGCGGTAT CAGGGACATG 2640 TCGGCGAGGA AGCCGACGGT GTGGCGTTCG AGCTGATGCG GACATTCGGC GATCAAGTGT 2700 CAGTCGTTAT GGACGCCGTC GGAGTAGCGC TGCGCCTAAA CCTCAGCACC CCTCCCCCCT 2760 TCGCCACCTC GTCGTGACAC ACGCTCGTGG TGGTCGAGGT CACCGACGCC CATGCCCATG 2820 TCCACGAGCC ACCGCCTTAC TTCGCGGACA CTAAGTGGAT ACCGTCCGTC GGGCGCCCGA 2880 TGCTGGGATG GTGGCAGTCC GGTAGCCGGT CCGCCAGCAA GCCACGAAAT GCCTGCGGGG 2940 GCTTCGGACT CCTTCGGCTC TGCTCTGGAG GGAAACCCTG TCTCACATAG GTGGTCCGCG 3000 GACTATCTCA GTTCAGGCAC GCTGTACGGA CGCGTCCCAG CGCAGGAAGG CTGAGCCGGG 3060 CGCTAGTCGA CGTGGCCAAA TAACCTGTCC AACTCCGTAT TTCCGGACAG GTTGTGTGGC 3120 AGTAGGACAA GTTAGCCTGC GGACGACAAC AAACGTGTCG ACTGCCAGCC AACTTGTCCG 3180 AT 3182

【００４７】配列番号：7 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他のＤＮＡ（合成ＤＮＡ）配列： ATGGATTACG CGTTTCGTGA CCGGCCGCTC 30

【００４８】配列番号：8 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他のＤＮＡ（合成ＤＮＡ）配列：ＣＴＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＡＡＣＣＧＴ
ＧＣＧＧＣＣＡ３０

【図面の簡単な説明】

【図１】各欠失変異体と修飾酵素活性の関係を示す図
である。

【図２】ｐＢＳＲ１の構築過程を示す図である。

【図３】ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたＢａｌＩ制限酵素遺伝子。
【請求項２】ブレビバクテリウム・アルビダムＡＴ
ＣＣ１５８３１から取得可能な請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】プラスミドｐＳＲＢ８から取得可能な請
求項１記載の遺伝子。
【請求項４】配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列またはその一部をコードする請求項１記載の遺伝
子。
【請求項５】配列表の配列番号２で表される塩基配列
またはその一部を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項６】配列表の配列番号２で表される塩基配列
の塩基番号１のＧがＡに置換された塩基配列またはその
一部を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項７】配列表の配列番号２で表される塩基配列
を有する遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズ可能な
請求項１記載の遺伝子。
【請求項８】単離されたＢａｌＩ修飾酵素遺伝子。
【請求項９】ブレビバクテリウム・アルビダムＡＴ
ＣＣ１５８３１から取得可能な請求項８記載の遺伝子。
【請求項１０】プラスミドｐＢＳＲ１から取得可能な
請求項８記載の遺伝子。
【請求項１１】配列表の配列番号３で表されるアミノ
酸配列またはその一部をコードする請求項８記載の遺伝
子。
【請求項１２】配列表の配列番号４で表される塩基配
列またはその一部を有する請求項８記載の遺伝子。
【請求項１３】配列表の配列番号４で表される塩基配
列を有する遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズ可能
な請求項８記載の遺伝子。
【請求項１４】請求項１〜７のいずれか１項記載の遺
伝子を含むベクター。
【請求項１５】請求項８〜１３のいずれか１項記載の
遺伝子を含むベクター。
【請求項１６】請求項１〜７いずれか１項記載の遺伝
子と、請求項８〜１３いずれか１項記載の遺伝子を含む
ベクター。
【請求項１７】請求項１４および請求項１５記載のベ
クターで形質転換されたＢａｌI制限酵素を生産するこ
とのできる形質転換体。
【請求項１８】請求項１６記載のベクターで形質転換
されたＢａｌＩ制限酵素を生産することのできる形質転
換体。
【請求項１９】請求項１７または１８記載の形質転換
体を培養し、該培養物からＢａｌＩ制限酵素を採取する
ことを特徴とするＢａｌＩ制限酵素の製造方法。