WO2002022831A1

WO2002022831A1 - Ribonuclease h thermotolerant

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Publication number: WO2002022831A1
Application number: PCT/JP2001/007930
Authority: WO
Inventors: Takashi Uemori; Yoshimi Sato; Nobuto Koyama; Ryo Hirano; Hikaru Takakura; Hiroshi Kobori; Yuji Hashimoto; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2002-03-21
Also published as: TWI310404B; US8008055B2; JPWO2002022831A1; EP2009107A3; AU2001286211A1; ATE411389T1; US7422888B2; KR20030031178A; EP1318197B1; KR100578476B1; EP2009107A2; EP1318197A4; KR20060032663A; EP1318197A1; US20040038366A1; US20090098600A1; JP3910142B2; KR100696390B1; CN1474873A; CN1250726C

Description

明細書耐熱性リボヌクレアーゼ H 技術分野

本発明はポリペプチド、さらに詳しくは、遺伝子工学において利用価値の高いリポヌクレアーゼ H活性を有するポリペプチドに関する。また、本発明は該ポリペプチドの遺伝子工学的生産に有用な遺伝子に関する。さらに、本発明は該ポリぺプチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。背景技術

リボヌクレアーゼ (RNA分解酵素）にはエンド型とェキソ型が存在し、基質特異性も多様で、複雑な生理活性に関与している。リボヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、リポヌクレアーゼ Ί\、リポヌクレアーゼ Τ₂、リボヌクレア一ゼH、リポヌクレア一ゼ、リボヌクレアーゼ I、リボヌクレアーゼ I I、リボヌクレアーゼ I I I、リポヌクレアーゼ I V、リボヌクレアーゼ L等の酵素が知られている。

リボヌクレアーゼ Η (本明細書に於いては、 RNa s eHと称する場合もある）は 1969年に W. H. スティン及び P. ハウゼンにより仔ゥシ胸腺から初めて単離された。現在、 RNa s eHは種々の動物細胞、酵母等の真核生物及び大腸菌等の原核生物に広く存在する細胞性 R N a s e Hと、 R N A腫瘍ゥィルスに存在するウィルス性 RN a s eHとに分けられている。 1種の細胞に数種の R Na s eH活性が存在しており、 Mg^{2 +}、 Mn^{2 +}等の 2価金属イオン要求性である。

大腸菌由来 RNa s eHは 155アミノ酸からなる分子量約 17 k D aの加水分解酵素であって、 DNAZRNAハイプリッドの RN A鎖のみを特異的にェンド型で切断するという基質特異性を有する。生成したオリゴマーは 5' 末端にリン酸基を、 3' 末端に水酸基を有する。

大腸菌由来 RNa s e Hとしては、 RNa s eHIと RNa s eHI Iが同定されている。 RNa s eH Iの生理的機能として、 Co l E lプラスミドの複製において、 1) 正常な複製開始点ではない箇所に結合した RN Aを分解し、正常な複製開始点を確保する、 2) 正常な複製開始点に特異的な RNAプライマーの合成をすることが示されている。しかしながら、 RNa s eHI Iの機能は未だ不明である。

RNa s eHの重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵素は、大腸菌内での発現量が極めて低いことから、組換え DNA技術による該酵素の生産が試みられており、既に BRL、アマシャムフアルマシァバイオテク及び宝酒造等から、組換え DNA技術により生産された RNa s eHが供給されている。

これらの市販の糸且換え RNa s eHは、大腸菌を宿主として生産されるものである〔金谷ら、ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) 、第 264卷、第 1 1546— 11549 頁（1989) 〕。また、大腸菌由来 RNa s e Hよりも極めて高い安定†生を有する好熱菌由来 RNa s eHの大腸菌による製造法も報告されている〔金谷ら、第 2回日本蛋白工学会年会プログラム '要旨集（1990) 、 69頁；特許第 2 533671号公報〕力大腸菌を用いて産生された好熱菌 RNa s e Hの酵素活性は大腸菌由来 RN a s e Hよりも低いものであった。

RNa s eHは、その基質特異性に基づき、下記に例示される様な用途を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されている。

1) c DNAのクローニングの際の铸型 mRNAの除去。

2) mRNAのポリ A領域の除去。

3) RNAの断片化。

しかしながら、上述のように耐熱性を有する RNa s eHは大腸菌由来 RNa s e Hよりも生産性及び酵素活性が低いものしかなく、 R N a s e Hの用途拡大のため、大腸菌と同等もしくはそれ以上の生産性及び酵素活性を有する耐熱性 R N a s eHの開発が望まれていた。 ' 発明の目的本発明の目的は、遺伝子工学において利用価値の高い RN a s eH活性を有するポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードする遺伝子ならびに該ポリぺプチドの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。発明の概要

本発明者らは、上記の事情を鑑み、耐熱性 RNa s eHを得るために鋭意研究及び探索を行った結果、高い RNa s eH活性を有する耐熱性 RNa s eHポリペプチドを見出した。更に、得られた耐熱性 RNa s eHは遺伝子工学的手法による製造においても生産性がよいことも見出し、本発明を完成するに至った。本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、耐熱性リポヌクレアーゼ Hポリペプチドに関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼ H活性を有することを特徴とするポリぺプチドに関する。

(a) 配列表の配列番号 9、 17、 23、 32, 37、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるァミノ酸配列又はその一部を有するポリぺプチド；

(b) 配列表の配列番号 9、 17、 23、 32, 37、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換を有するポリペプチド；

(c) 配列表の配列番号 9、 17、 23、 32、 37、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるァミノ酸配列と少なくとも 71 %の相同十生を有するァミノ酸配列を有するポリぺプチド。

本発明の第 2の発明は、耐熱性リボヌクレアーゼ Hをコードする核酸に関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼ H活性を有するポリぺプチドをコ一ドする核酸に関する。

(a) 配列表の配列番号 9、 17、 23、 32、 37、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリべプチドをコードする核酸；

(b) 配列表の配列番号 9、 17、 23、 32、 37、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換を有するポリぺプチドをコ一ドする核酸； (c) 配列表の配列番号 8、 16、 22、 31、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列を有する核酸；

(d) 配列表の配列番号 8、 16、 22、 31、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列において、少なくとも 1つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；

(e) 前記 (a) 〜（d) のいずれか記載の核酸又はその相捕鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；

(f ) 配列表の配列番号 8、 16、 22、 31、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列に少なくとも 69 %の相同性を有する塩基配列である核酸。

本発明の第 3の発明は組換え DN Aに関し、第 2の発明の核酸を含んでなることを特 ί敷とする。

本発明の第 4の発明は形質転換体に関し、第 3の発明の組換え DNAにより形質転換されてなることを特徴とする。

本発明の第 5の発明は耐熱性リポヌクレアーゼ Η活性を有するポリぺプチドの製造方法に関し、第 4の発明の形質転換体を培養し、該培養物中より耐熱性リポヌクレアーゼ Η活性を有するポリぺプチドを採取することを特徴とする。

第 6の発明はプラスミド p RHB 1 1、 p BCA3Nd 2、 p PFU 220, pTM— RNH、 p PH0238、 pAFU204、 pTL I 204又は pTC E 207のいずれか 1つを導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リポヌクレアーゼ H活性を有するポリペプチドに関する。なお、これらのプラスミドを有する大腸菌株は、プダぺスト条約の下、それぞれ F ERM BP— 7655、 FERM BP— 7653、 FERM BP— 7654、 FERM BP— 76 52、 FERM BP— 7692、 F ERM BP— 7691、 FERM BP 一 7693および FERM BP— 7694の受託番号の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。発明の詳細な説明

以下、本発明に関して具体的に説明する。本明細書において、 RN a s e Hとは、 D NA/RN Aハイブリッドの RNA 鎖のみを特異的にェンド型で切断するという基質特異性を有する加水分解酵素であって、生成したオリゴマーが 5 ' 末端にリン酸基を、 3，末端に水酸基を有するものをいう。

本発明において、ポリペプチドが耐熱性の RN a s e H活性を有するとは、特に限定するものではないが、 60°C以上の温度で 1 5分間保持した後においても RN a s e H活性を有することを意味する。

耐熱性 RNa s e H¾†生は、例えば、次のようにして測定することができる。ポリ（r A) 及びポリ（d T) (ともにアマシャムファノレマシアバイオテク製） l mgをそれぞれ I mM EDTAを含む 4 OmMトリス一 HC 1 ( H

7. 7) 1m lに溶解し、ポリ（r A) 溶液及びポリ（d T) 溶液を調製する。次に、 4mM Mg C l ₂、 I mM DTT、 0. 00 3%B SA、 4%グリセロールを含む 4 OmMトリスー HC 1 (p H7. 7 ) に、終濃度 20 g Zm 1となるようにポリ（r A) 溶液を、終濃度 30 μ g/m 1となるようにポリ (d T) 溶液を加え、 3 7°Cで 1 0分間反応後、 4°Cに冷却し、ポリ（ r A) — ポリ（d T) 溶液を調製する。

このポリ（r A) —ポリ（d T) 溶液 1 0 0 μ 1に酵素液 1 μ 1を加え、 4 0°Cで 1 0分間反応させ、 0. 5M EDTA 1 ◦ x 1を加えて反応を停止させた後、 2 60 nmの吸光度を測定する。対照として、上記反応液に 0. 5M EDTA 1 0 μ Iを加えた後、 40°Cで 1 0分間反応させ、吸光度を測定する。その後、 EDTA非添加で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値 (吸光度差）を求めることにより、酵素反応によってポリ（r A) —ポリ（d T) ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求め、本発明の耐熱性 R Na s e H活性を測定することができる。

また、活性測定しょうとする酵素液 1 μ 1に 40°Cであらかじめインキュベーシヨンした反応液〔2 OmMへぺス一水酸化カリウム（p H8. 5) 、 0. 0 1 %牛血清アルブミン（宝酒造社製）、 1 %ジメチルスルホキシド、 4mM酢酸マグネシウム、 20 μ g / 1ポリ (d T) (アマシャムフアルマシアバイ才テク社製）、 3 0 μ g/ 1ポリ (r A) (アマシャムフアルマシアバイォテク社製）〕 100 μ \を添加し、 40°Cで 10分間反応させた後、 0. 5M EDTA (pH8. 0) 1 0 μ 1で反応を停止し、 260 n mの吸光度を測定することにより、本発明の耐熱性 RN a s eH活性を測定することもできる。

R N a s e Hの 1単位（ユエット）は、 1 n m o 1のリポヌクレオチドが遊離したのに相当する A₂₆。を 10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出することができる。

単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量（m l) 〕 /0. 01 52

本発明のポリペプチドは、耐熱性 RNa s eH活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 3 7、 47、 5 7又は 5 9のいずれか 1つに示されるァミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸残基の欠失、付加、揷入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたァミノ酸配列で示されるポリぺプチドを包含する。

すなわち、天然に存在するポリペプチドにはそれをコードする DNAの多型や変異の他、生成後のポリぺプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのァミノ酸配列中にァミノ酸の欠失、揷入、付加、置換等の変異が起こりうる。しカし、このような変異が該ポリぺプチドの活性や構造の保持に関して重要でない部分に存在する場合には、変異を有しないポリぺプチドと実質的に同等の生理、生物学的活 14を示すものがあることが知られている。

人為的にポリぺプチドのァミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインタ一ロイキン 2 (I L— 2) のアミノ酸配列中のあるシスティン残基をセリンに置換したポリぺプチドがィンターロイキン 2活性を保持することが知られている〔サイエンス（Science) 、第 224卷、 143 1頁（1 98 4) 〕。

また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列あるいはプレ 'プ口配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、あるいは活性型ポリべプチドへの転換に際して除去される。このようなポリべプチドはー 7火構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を発現するポリべプチドである。

本発明により単離された、配列表の配列番号 8、 16、 22、 31、 36、 4 6、 56又は 58に示される塩基配列の遺伝子には、それぞれ配列表の配列番号 9、 17、 23、 32、 37、 47、 57又は 59記載のアミノ酸配列を持つポリぺプチドがコードされており、該ポリぺプチドは耐熱性 R N a s e H活性を有している。そこから、活性には必須でないペプチド領域が削除さらたポリべプチドも、本願のポリペプチドに含まれる。

遺伝子工学的にポリぺプチドの生産を行う場合には、目的のポリぺプチドのァミノ末端、あるいはカルボキシル末端に該ポリぺプチドの活性とは無関係のぺプチド鎖が付加されることがある。例えば、目的のポリペプチドの発現量を上げるために、使用される宿主中で高発現されているポリぺプチドのァミノ末端領域の一部を目的のポリぺプチドのァミノ末端に付加した融合ポリぺプチドが作製されることがある。あるいは、発現されたポリペプチドの精製を容易にするために、特定の物質に親和性を有するぺプチドを目的のポリぺプチドのァミノ末端またはカルボキシル末端に付加することも行われている。これらの付加されたぺプチドは目的ポリペプチドの活性に悪影響をおよぼさない場合には付加されたままであつてもよく、また、必要であれば適当な処理、例えば、プロテアーゼによる限定分解などによって目的ポリぺプチドから除去できるようにすることもできる。従って、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号 9、 17、 23、

32、 37、 47、 57又は 59) に 1個以上のアミノ酸残基の欠失、揷入、付加又は置換が生じたアミノ酸配列によって示されるポリぺプチドであっても、耐熱性 RNa s eH活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。また、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号 9、 17、 23、 3 2、 37、 47、 57又は 59) に少なくとも 71 %、好ましくは 80 %、さらに好ましくは 90 %の相同性を有するァミノ酸配列を有するポリぺプチドは、耐熱性 RNa s eH活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。上記相同性は、例えばコンピュータープログラム DNAS I S-Ma c (宝酒造社製）、コンピュータアルゴリズム FAS TA (バージョン 3.0；パーソン (Pearson, W. R.)ら、 Pro. Natl. Acad. Sci.， 85:2444 - 2448， 1988)、コンビュ一ターァノレゴリズム B LAST (バージョン 2.0； Altschulら、 Nucleic Acids Res. 25 :3389 - 3402, 1997) によって測定することができる。

例えば、上記アミノ酸配列の相同性が、バチルスカルドテナックス

(Bacillus caldotenax)由来のリボヌクレアーゼ H I I (配列表の配列番号 9 ) と少なくとも 44%、バチルスカルドテナックス由来のリボヌクレアーゼ H I I I (配列表の配列番号 1 7) と少なくとも 47 %、ピロコッカスフリォサス (Pyrococcus furiosus)由来リポヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 23) と少なくとも 69 %、サーモトガマリティマ（Thermotoga maritiraa)由来リポヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 59) と少なくとも 5 3%、アルカェォグロバスフルギダス（Archaeoglobus fulgidus)由来リポヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 3 7) と少なくとも 5 1 サーモコッカスリトラリス（Thermococcus litoralis)由来リボヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 47) と少なくとも 6 5%、サーモコッカスセラー（Thermococcus celer)由来リポヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 57) と少なくとも 7 1 %、ピロコッカスホリコシィ

(Pyrococcus horikoshii)由来リボヌクレアーゼ H (配列表の配列番号 32) と少なくとも 7 1 %であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドは、耐熱性 RN a s eH活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。

本発明のポリペプチドは、例えば、（1) 本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、 (2) 本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物からの精製、等の方法により製造することができる。

( 1 ) 本発明のポリぺプチドを生産する微生物の培養物からの精製

本発明のポリべプチドを生産する微生物としては、例えば、ドィッチェ ·ザムノレンク · フォン · ミクロオルガニスメン · ゥント■ツエノレクノレツレン Gmb H (Deutsche Sammlung von Mikroorgani smen una Zellkulturen GmbH) より購入可能なバチルスカルドテナックス（DSM406) 、ピロコッカスフリオサス（DSM36 38) ゃサーモトガマリティマ（DSM3 1 09) 、ァノレカェォグロバスフルギダス（DSM4 1 3 9) 、サーモコッカスリトラリス（D SM5473) 、サーモコッカスセラー（DSM2476) 又は理化学研究所より購入可能なピロコッカスホリコシィ（ J CM 9 9 7 4 ) 等が挙げられる。微生物の培養は、その微生物の生育に適した条件で行えばよく、好ましくは、目的のポリペプチドの発現量が高くなるような培養条件が用いられる。力、くして菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法によって精製することができる。

上記菌株の培養にあたっては、通常、耐熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加える栄養源は該菌株が利用しうるものであればよい。炭素源としては、例えば、デンプン等が利用でき、窒素源としては、例えば、トリプトン、ぺプトン、酵母エキス等が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩等の金属塩を微量元素として加えてもよい。また、例えば、海洋性の耐熱菌の場合、培地の調製に人工海水を用いることが有利である。

培養は静置培養又は撹抨培養で行なうことができるが、例えば、アプライドアンドェンノィロンメンタノレマイクロノィォロジー (Applied and

Environmental Microbiology) 、第 5 5卷、第 2 0 8 6— 2 0 8 8頁（1 9 9 2 ) に記載のように、透析培養法を用いてもよい。培養条件や培養時間は、使用する菌株、培地組成に応じ、ポリぺプチドの生産量が最大になるように設定するのが好ましい。

ポリペプチドを採取するに当たっては、まず、無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液は、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などによって菌体を集め、ついで菌体を破砕することにより調製できる。菌体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破碎、溶菌酵素処理等のうちから目的酵素の抽出効果の高い方法を選べばよい。また、培養液上清中に該ポリペプチドが分泌されている場合には、硫安塩析法ゃ限外濾過法等によって培養液上清中のポリぺプチドを濃縮し、これを無細胞抽出液とする。力、くして得られた無細胞抽出液からポリペプチドを単離するにあたっては、通常のタンパク質の精製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ一等の方法を組み合わせて使用できる。

( 2 ) 本発明のポリぺプチドをコ一ドする核酸を含む組換え D N Aにより形質転換された形質転換体の培養物からの精製本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば配列番号 8、 16、 22、 3 1、 36、 46、 56又は 58に示される塩基配列を有する核酸を含む組換え D N Aで形質転換された形質転換体より、本発明のポリぺプチドを取得することができる。配列番号 8に示される塩基配列からは配列番号 9に示されるアミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 16に示される塩基配列からは配列番号 17に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号 22に示される塩基配列からは配列番号 23に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 31に示される塩基配列からは配列番号 32に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 36に示される塩基配列からは配列番号 37に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 46に示される塩基配列からは配列番号 47に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 56に示される塩基配列からは配列番号 57に示されるァミノ酸配列のポリぺプチドが、配列番号 58に示される塩基配列からは配列番号 59に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、それぞれ生成する。

さらに、本発明のプラスミド p RHB 11、 pBCA3Nd 2、 p P FU 22

0、 pTM— RNH、 p PHO 238_N pAFU204、 pTL I 204又は p TCE 207のいずれか 1つを導入した形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のポリペプチドを精製してもよい。

形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換え DN Aの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。

例えば、本発明のポリペプチドは、 1 a cプロモーターや T 7ファージプロモ一ターの下流に本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌を通常の培養条件、例えば、 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む LB培地（トリプトン 10 gZリットル、酵母エキス 5 gZリットル、 Na C 1 5 g/リットル、 p H7. 2) 中、 37 °Cで対数増殖期まで培養後、 1 mMとなるようイソプロピル — β— D—チォガラタトビラノシドを添加し、さらに 37 °Cで培養することにより、培養菌体中にポリペプチドを発現させることができる。

培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を超音波で破砕し、さらに遠心分離して上清を集め、無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液は耐熱性 RN a s eH活性を示す。さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトダラフィ一、硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から本発明のポリぺプチドを精製することができる。上記の精製過程において得られる部分精製品も、当然ながら RN a s eH活性を示す。なお、本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌で発現される本発明のポリぺプチドは耐熱性を有しているため、精製手段として培養菌体及び/又は無細胞抽出液に対して、例えば、 40 °C以上の温度で、約 10分間の熱処理を行つて熱変性して不溶化した宿主由来のタンパク質を除去してもよい。また、この熱処理の温度や時間は、適宜、最適な温度及び時間を選択すればよい。

上記のように本発明のポリぺプチドを、当該ポリぺプチドをコ一ドする核酸を保持する形質転換体を用いて常温、例えば、 37°Cで発現させた場合でも、得られた発現産物はその活性、耐熱性などを保持している。すなわち、本発明のポリぺプチドは、その本来の生産菌が生育する温度とは離れた温度において発現された場合にも、その固有の高次構造を形成し得る。

本発明の核酸は、本発明のポリべプチドをコ一ドする核酸であり、具体的には、配列表の配列番号 9、 17、 23、 32、 37、 47、 57又 59のいずれか 1 つに記載のァミノ酸配列、または該配列において 1個以上のァミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたァミノ酸配列で示され、かつ、耐熱性 RN a s e H活性を示すポリぺプチドをコ一ドする核酸（ 1 ) 、配列表の配列番号 8、 16、 22、 31， 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに記載の塩基配列で示される核酸（2) 、および上記核酸（1) または（2) にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるか、（ 1 ) または（ 2 ) の塩基配列に少なくとも 69 %、好ましくは 80 %、さらに好ましくは 90 %の相同性を有する塩基配列で、かつ耐熱性 R N a s e H活性を示すポリぺプチドをコードする核酸（3) 等である。

上記塩基配列の相同性は、コンピュータープログラム DNAS I S— Ma c、コンピュータアルゴリズム FASTA (バージョン 3.0)、 BLAST (バージョン 2.0) によって測定することができる。本明細書における核酸とは、 1本鎖または 2本鎖の D N Aまたは R N Aを意味する。上記核酸（2) が RNAである場合は、例えば配列表の配列番号 8記載の塩基配列において Tを Uで置換した塩基配列で示される。

本発明の核酸は、例えば、次のようにして得ることができる。

まず、配列表の配列番号 8、 16、 22、 31， 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに記載の塩基配列で示される核酸（2) は、本発明のポリペプチドの説明中に記載した方法で培養したバチルスカルドテナツタス（D SM40 6) 、ピロコッカスフリオサス（DSM3638) 、サーモトガマリティマ (D SM3109) 、アルカェォグロバスフルギダス（DSM4139) 、サ一モコッカスリトラリス（DSM5473) 、サーモコッカスセラー（D S

M2476) 又はピロコッカスホリコシィ（J CM9974) より常法にしたがってゲノム DNAを調製し、それを用いて作製した DNAライブラリーから単離することができる。またこのゲノム DN Aを鎵型としたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により、配列表の配列番号 8、 16、 22、 31， 36、 46、 56 又は 58のいずれか 1つに記載の塩基配列で示される核酸を増幅することによつても取得できる。

また、本発明により提供される、本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列、例えば配列表の配列番号 8、 16、 22、 31, 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに記載の塩基配列を基に、本発明のポリペプチドと同様の耐熱性 RN a s e H活性を有するポリべプチドをコ一ドする核酸を取得することも可能である。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはその塩基 S1列の一部をハイブリダイゼーションのプローブに用いることにより、耐熱个生 RNa s eH活性を有するポリペプチドをコードする DNAを、細胞から抽出した DNA、該 DNAを铸型として得られた； PC R産物等からスクリーニングすることができる。あるいは上記の塩基配列から設計されたプライマーを使用した P CR等の遺伝子増幅法を用いることにより、耐熱性 RNa s eH活性を有するポリペプチドをコードする DNAを増幅することができる。また、耐熱性 RNa s e H活性を有するポリぺプチドをコ一ドする DNAを化学的に合成することも可能である。かかる方法により、上記核酸（1) または（3) を得ることができる。上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、それが目的の核酸の一部であることを確かめた上、該核酸断片、あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行う力または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いて PC Rを行うことにより、目的の核酸全体を取得することがでさる。

上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、 1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、 T. マニアテイス（T. Maniatis) ら編集、モレキュラークローニング：ァラボラトリーマ二ユアノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. ) 等に記載された条件でハイプリダイズ可能なことを意味し、例えば、以下の条件でハイブリダィズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンプレンを 0. 5%SDS、 0. 1%ゥシ血清アルブミン（BSA) 、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1 %フィコーノレ 400、 0. 01 %変性サケ精子核酸を含む 6 X S S C (I X S SCは 0. 15M Na C l、 0. 015 Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0 を示す）中で、 50°Cにて 12〜20時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、 0. 5%SDSを含む 2 X S SC中、 37°C での洗浄から始めて、 33〇濃度は0. 1倍までの範囲で、また、温度は 50°C までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たな核酸について、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によつて調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。

また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、 6 XSSC、 0. 5 % S D S、 5 Xデンハルト、 0. 01 %変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Tm— 2 5 °C〕の温度で一 B免保温する条件などをいう。

オリゴヌクレオチドプロープまたはプライマーの Tmは、例えば、下記の式により求められる。 Tm=81. 5- 16. 6 (log_{1 0} [Na⁺ ]) +0. 41 (°/oG+C)一 (600/N) (式中、 Nはオリゴヌクレオチドプロ ^"ブまたはプライマーの鎖長であり、％G + Cはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグァニンおよびシトシン残基の含有量である。）

また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が 1 8塩基より短い場合、 T mは、例えば、 A+ T (アデニン +チミン）残基の含有量と 2 °Cとの積と、 G + C残基の含有量と 4 °Cとの積との和 C(A+T) X 2+ (G+C) X 4] により推定することができる。

本発明においては、本発明のポリぺプチドをコ一ドする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなくとも、それが耐熱性 R N a s e H活性を示すポリぺプチドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりである。

すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。したがつて、あるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。

例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変ィ匕を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（例えば、特公平 7— 102146号公報）。このように特定のァミノ酸配列をコ一ドする多種類の核酸は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。

本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列表の配列番号 7記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換え DNAを作成することができる。該組換え DNAの作成に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等を使用することができ、組換え D N Aの使用目的に応じて適当なべクターを選択すれば良い。さらに、当該組換え DN Aを適当な宿主に導入して形質転換体を作成することができる。形質転換体の作成に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリぺプチドを産生させることにより、本発明のポリぺプチドを大量に製造することが可能となる。実施例

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1

好熱菌バチルスカルドテナックス由来の RN a s e Hの調製

トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製） 0. 2 %、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製） 1. 5 %を含む培地（pH6. 5) 100mlにバチノレスカルドテナックス YT— G株（Bacillus caldotenax YT- G、ドイツチェザムルンクフォンミクロオルガエスメンより購入： DSM406) を植菌し、 6 0°Cで 140分間振とう培養し、この培養液を前培養液とした。ついで、同組成の培地 3 1に前培養液 30mlを接種し、通気量 2. 5 1 /分、攪拌数 250回転 Z分、温度 60°Cで 5時間培養した。

培養液を遠心分離（5000 X g、 15分）し、集菌した。湿菌重量 402 gの菌体を 1 OmMメルカプトエタノール、 0. 5M Na C l、 1 mM ED TA、 20 //M PAPMSFを含む 5 OmMトリス一 HC 1緩衝液（pH7. 5) 100 Om 1に懸濁し、 M I N I— L a b (APV GAUL I N/RAN NI E社製）にて菌体を破砕後、遠心分離で細胞残渣を除き、上清を回収した。得られた上清液に終濃度が 0. 1 %となるようにポリエチレンイミン溶液を加え、攪拌後、 1時間放置し、遠心分離にて上清を回収した。この上清液に 50% 飽和となるように硫酸ァンモェゥムを加え、遠心分離で得られた沈殿を 10 mM メルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C l、 10%グリセロールを含む 2 OmMトリスー HC 1緩衝液 (pH7. 5) に溶解し、同緩衝液に対して透析した。同緩衝液で平衡化した 280mlの DE 52カラム（ヮットマン社製）に透析試料を負荷し、非吸着画分を集めた。

さらに平衡化に用いた緩衝液 42 Om 1で洗浄し、洗浄画分を集めた。 DE 5 2カラムクロマトグラフィーでの非吸着画分と洗浄画分を混合し、 1 OmMメノレカプトエタノーノレ、 0. 1 mM EDTA、 5 OmM Na C l、 10%グリセロールを含む 2 OmMトリス一 HC 1緩衝液 (pH7. 5) で平衡化した 240 111 1の？一1 1カラム（ワットマン社製）に負荷した。その後、 0~0. 5M Na C 1を含む平衡化緩衝液で溶出させた。

得られた活性画分を透析チューブに入れ、固体のポリエチレンダリコーノレ 20 000上に置き、 4°Cで脱水濃縮した。次に、 5 mMメルカプトエタノール、 0. 5mM EDTA、 3 OmM Na C l、 10 %グリセロールを含む 25 mMトリス一 HC 1緩衝液（pH7. 5) で平衡ィ匕した 30 Om 1の S u p e r d e X

G_ 200カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に、この酵素濃縮液を負荷した。平衡化に用いた緩衝液で溶出させ、活性画分を得た。 10m Mメルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C l、 10% グリセロールを含む 2 OmMトリス一HC 1緩衝液 (pH7. 5) で平衡ィ匕した 15mlの H e p a r i n— S e p h a r o s eカラム (アマシャムファノレマシァバイオテク社製）に活 14画分を負荷し、 0〜0. 5M NaC lを含む平衡化緩衝液で溶出させた。

得られた活性画分を 1 OmMメルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C l、 10 %グリセロールを含む 2 OmMトリスー HC 1緩衝液 (pH7. 5) で平衡化した 5m 1の H i t r a p— S Pカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に負荷し、 0〜0. 5M Na C lを含む平衡化緩衝液で溶出させた。得られた活性画分を、再度 5 mMメルカプトエタノール、 0. 5mM EDTA、 3 OmM Na C l、 1 0 %グリセローノレを含む 25 m Mトリスー HC 1緩衝液 (pH7. 5) で平衡化した 300m lの S u p e r d e x G— 200カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に負荷し、得られた活性画分を RNa s eH標品（酵素液）とした。

耐熱性 RNa s eH活性は、次の方法により測定した。

ポリ (r A) 及びポリ (dT) (ともにアマシャムフアルマシアバイオテク製） lmgをそれぞれ ImM EDTAを含む 4 OmMトリスー HC 1 (p H

7. 7) 1m lに溶解し、ポリ（rA) 溶液及びポリ（dT) 溶液を調製した。次に、 4mM Mg C l₂、 ImM DTT、 0. 003%B SA、 4%グリセロールを含む 4 OmMトリス一 HC 1 (pH7. 7 ) に、終濃度 20 μ g Zm 1となるようポリ（rA) 溶液を、終濃度 3 Ο μ gZmlとなるようポリ（d T) 溶液を加え、 37°Cで 10分間反応後、 4°Cに冷却し、ポリ（rA) —ポリ

(dT) 溶液を調製した。

ポリ（ r A) —ポリ（ d T) 溶液 1 00 /i 1に酵素液 1 μ 1を加え、 40°Cで 10分間反応させ、 0. 5M EDTA 1 0 1を加えて反応を停止させた後、 260 n mの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に 0. 5 M EDTA 10 μ \を加えた後、 40°Cで 10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、 EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（rA) —ポリ（dT) ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。 RNa s eHの 1単位は、 l nmo 1のリボヌクレオチドが遊離したのに相当する A₂₆。を 10 分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。なお、酵素液を希釈した場合は、下記式の値を希釈率で補正した。

単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量（m 1 ) 〕 Ζθ. 0 1 52

実施例 2

バチルスカノレドテナックス RNa s e H I I遺伝子のクローニング (1) バチノレスカルドテナックスゲノム DNAの調製

バチルスカルドテナックス YT— G株（D SM406) を 60mlの LB 培地（ 1 %トリプトン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5%Na C l、 H 7. 2) に植菌し、 65°C、 20時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し集菌した。得られた菌体を 2m 1の 25%ショ糖、 50mMトリスー HC 1 (p H8.

0) に懸濁し、 0. 2mlの 1 Omg/ml塩化リゾチーム（ナカライテスタ社製'）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 1 2m lの 150mM Na C l、 1 mM EDTA、 20mMトリス _HC 1 (pH8. 0) 、 0. lm 1の 2 OmgZm 1プロティナーゼ K (宝酒造社製）及び 1 m 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37。じで 1時間保温した。

次いで 2. 1mlの 5M Na C 1と 2m 1の CTAB— Na C 1溶液〔1 0 %セチルトリメチルァンモニゥムブロミド (ナカライテスタ社製) 、 0. 7M Na C 1〕を加えてよく混合し、 65°Cで 10分間保温した。これに等量のクロ口ホルム/イソァミルアルコール混合液 (24 ： 1、 v/v) を加えて 10分間緩やかに混合した後、 10分間遠心（l O O O OXg) を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の 10 OmMトリス一HC 1 (pH8. 0) 飽和フエノール //クロ口ホルム/イソァミルアルコール混合液 (25 ： 24 ： 1、 v/v) を加えて 10分間緩やかに混合した後、更に 10分間遠心（ 10000 X g) を行つた。遠心終了後、得られた上清に 0. 6容の 2—プロパノールを加え、生じた糸状の沈殿をガラス棒で巻き取った。これを 70 %エタノ一ノレ水溶液で洗浄し、風乾した後に 0. 5 m 1の T E緩衝液に溶解してゲノム D N A溶液を得た。

(2) RN a s e H I I遺伝子中央部のクローユング

様々な生物由来の RN a s e H I Iのアミノ酸配列の間で保存されている部分の内、モチーフ Iとモチーフ I I I 〔バイオケミストリー（Biochemistry) 、第

38卷、第 605— 608頁（1999) 〕をもとにしてオリゴヌクレオチド B s u I 1— 3 (配列番号 1 ) とオリゴヌクレオチド B s u I I— 6 (配列番号 2) を合成した。

上記実施例 2— (1) で調製したバチルスカルドテナックスゲノム DNA 溶液 1 μ 1を鐯型にして、 l O Opmo 1の B s u l I - 3及び 100 p m o 1 の B s u I I— 6をプライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行った。 Ρ CRでの DNAポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 45°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとして、 50サイクル行った。反応終了後、反応液にフエノール処理とエタノール沈殿を行って DNAを精製した。得られた DNAを T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて DNAの末端を平滑化した後、ァガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約 0. 4 k bの DNA断片をゲルから回収した。得られた約 0. 4 k bの D N A断片を、 S m a I (宝酒造社製）で消化した p U C 1 19 (宝酒造社製）に T4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌 J M 109を形質転換した。

この形質転換体を培養し、約 0. 4 k bの DNA断片が揷入されたプラスミド 21-12を得た。

( 3 ) RN a s e H I I遺伝子上流部分のクローニング

上記実施例 2 _ ( 2 ) で得たプラスミド 21— 12の約 0. 4 kbの揷入断片の塩基配列を決定し、それをもとにォリゴヌクレオチド R N I I -S 1 (配列番号 3) とオリゴヌクレオチド RN I I—S 2 (配列番号 4) を合成した。

実施例 2— (1) で調製したバチルスカノレドテナックスゲノム DNAを B amH I (宝酒造社製）で消化し、得られた B a mH I消化物と S a u 3 A I力セット（宝酒造社製）を T4 DN Aリガーゼで連結し、これを鎵型とし RN I I一 S 2を 1次 PCRのプライマー、 RNI I _ S 1を 2次 P C Rのプライマーとして、タカラ LA PCR インビトロクローユングキット（宝酒造社製）に添付のプロトコールに従って操作を行った。フエノール処理とエタノール沈殿によって 2次 PC R液から DNAを精製し、 T4 DNAポリメラーゼを用いてこの DNAの末端を平滑化し、その後、ァガロースゲル電気泳動を行い、增幅した約 1. 5 k bの DNA断片をゲルから回収した。得られた約 1. 5 k b の DNA断片を、 Sma Iで消化した； pUC 1 19に T4 DNAリガーゼを用いて連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。

この形質転換体を培養し、約 1. 5 k bの DNA断片が揷入されたプラスミド B 25N 16を得た。

(4) RNa s eH I I遺伝子全域のクローニング

実施例 2— (3) で決定したプラスミド 21—12の約 0. 4kbの揷入断片の塩基配列をもとにォリゴヌクレオチド R N I I— S 5 (配列番号 5 ) とオリゴヌクレオチド R N I I— S 6 (配列番号 6 ) を合成した。

実施例 2— (2) で調製したプラスミド 21—12を鎵型に、 RNI I— S 5 と RN I I— S 6をプライマーとして PCRを行った。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラ Exタック (宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 P CRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒を 1サイクノレとして、 25サイクノレ行った。反応終了後、ァガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約

0. 3 k bの DNA断片をゲノレから回収した。得られた約 0. 3 kbの DNA断片を D I Gハイプライム（ロシュダイァグノスティックス社製) でジゴキシゲニン標識した。

上記のジゴキシゲニン標識 DNAをプローブとして、実施例 2_ (1) で調製したバチルスカノレドテナックスゲノム DNAを H i n d I I I (宝酒造社製）、 S a c I (宝酒造社製）による消化、及び H i n d l l lと S a c lの 2 重消化をそれぞれ行い、得られた消化物とサザンハイブリダィゼーションを行つ十

ハイブリダイゼーシヨンと検出は D I Gルミネッセントデテクシヨンキット (ロシュダイァグノスティックス社製）を添付のプロトコールに従って用いた。その結果、 H i n d I I I消化では約 4. 5 k bの DNA断片、 S a c l消化では約 5. 8 k bの DNA断片、 H i n d l l lと S a c lの 2重消化では約 1. 3 k bの DN A断片がプローブとハイブリダィズした。

上記結果に基づき、バチルスカルドテナックスゲノム DNAを H i n d i I I消化してァガロースゲル電気泳動を行い、約 4. 5 k b付近の DNA断片をゲルから回収した。得られた DNA断片を S a c Iで消化し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 1. 3 k b付近の DNA断片をゲルから回収した。この DNA断片を、 H i n d l l lと S a c lで消化した pUC 19 (宝酒造社製）に T4 DNAリガーゼを用いて連結し、大腸菌 HB 101を形質転換した。得られた形質転換体をハイボンド N (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）にレプリカし、上記のジゴキシゲニン標識プローブを用いて、常法に従つてコロニーハイプリダイゼーションを行った。こうして得られた陽性クローンからプラスミド p RHB lを調製した。

次に、 pRHB 1に揷入された DNAの塩基配列を決定し、それから予想されるァミノ酸配列を枯草菌の RNa s eH I Iのァミノ酸配列と比較したところ、 p RHB 1中の DNAは開始コドンから約 40 b pを欠いていることが予想された。そこで以下のようにして完全長の RNa s eHI I遺伝子を構築した。

実施例 2— ( 3) で調製した B 25N16を H i n d i I Iで消化し、ァガロースゲル電気泳動を行った後、約 160 b pの DNA断片をゲルから回収した。得られた約 160 b pの DNA断片を、上記で調製した p RHB 1の H i n d I I I消化物に T 4 DNAリガーゼを用いて連結し、大腸菌 HB 101を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製した。

次に、予想される開始コドン周辺の塩基配列をもとにしてオリゴヌクレオチド RN I I -Nd e (配列番号 7) を合成し、上記で得られた形質転換体から調製したプラスミドを鑤型とし、 RN I I— Nd eと RN I I— S 6をプライマーとして、 PCRを行った。この時に約 0. 7 k bの DN A断片が增幅するプラスミドを選択し、このプラスミドを pRHB 11とした。

こうして得られたプラスミド p RHB 1 1に揷入された DNAHf片の塩基配列を決定した。その結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（Open reading frame ;0RF) が見出された。このオープンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 8に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s eH I Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 9に示す。

なお、プラスミド: p R H B 11で形質転換された大腸菌 H B 101は、

Escherichia coli HBlOl/pRHBllと命名、表示され、平成 12年 9月 5 （原寄託日）より日本国〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F ERM B P— 7655として寄託されている。 ( 5 ) バチルスカルドテナックス R N a s e H I I遺伝子の発現

p RHB 1 1又は pRHB 1で形質転換された大腸菌 HB 1 0 1を 1 00 /i g /m 1のアンピシリンを含む 5 m 1の L B培地に植菌し、 37 で 1晚振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 0. 5m lの TE緩衝液に懸濁して超音波破砕し、遠心分離によって上清を得、これを菌体粗抽出液とした。

1 0mMトリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM DTT (ナカライテスタ社製）、 0. 003%B SA (フラクション V、シグマ社製）、 4%グリセロール、 20 g/m lポリ（dT) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）、 30 / g/m lポリ (r A) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を混合し、 37°Cで 10分間保温した。これを RNa s eH活性を測定するための基質液として使用した。

100 μ 1の基質液に 1 μ 1の 1M Mn C 1₂を加えて 40°Cで保温し、これに 10 μ 1の 10倍希釈した菌体粗抽出液を加えて反応を開始した。 40°Cで 30分間反応を行った後、 10 // 1の0. 5M EDT Aを加えて反応を停止し、 260 nmにおける吸光度を測定した。

その結果、 p RHB 1を保持する大腸菌 HB 1 0 1から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに比べて、 p RHB 1 1を保持する大腸菌 HB 10 1から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに明らかに 260 nmにおける吸光度の値が高かった。よって、 p RHB 1 1は RN a s e H I I遺伝子を含んでおり、この p RHB 1 1を保持する大腸菌で RN a s e H活性を発現することが明らかになつた。

( 6 ) 精製 RN a s eH I I標品の調製

実施例 2— (4) で得られた p R H B 1 1で形質転換された大腸菌 H B 101 を 1 00 // g/m 1のアンピシリンを含む 1 1の LB培地に植菌し、 3 7°Cで 1 6時間振擾培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 5 2. 3m l のソニケーシヨンバッファー〔50mMトリス _HC 1 (p H8. 0) 、 2mM 2—メノレカプトエタノーノレ、 1 0%グリセロール、 2 mMフエ二ノレメタンスノレフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破碎機にかけた。この破碎液を 1 200 0 r pmで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 60°C、 1 5分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、上清を集め、 50. Om 1の熱処理上清液を得た。

この溶液をバッファー C 〔5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 2mM 2—メルカプトエタノール、 10%グリセロール〕で平衡化した RESOURS E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FPLC システム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eH I Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。

素通りした RNa s e H I I画分 5 lmlをバッファー Cで平衡化した RE S OURSE Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、

F P LCシステムを用いて 0〜50 OmM Na C 1直線濃度勾配により溶出し、約 24 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得た。この RNa s eH I I画分 3. 0 m 1を 2回に分けて 50 mM N a C 1を含むバッファー Cで平衡化した PD— 10カラム（アマシャムフアルマシアバィォテク社製）に供し、得られた溶出液 7. Om 1を 5 OmM N a C 1を含むノッファー Cで平衡化した H i Tr a p-h e p a r i nカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製) に供し、 F P LCシステムを用いて 50-55 OmM Na C 1直線濃度勾配により溶出し、約 31 OmM NaC lのところに溶出された RNa s eH I I画分を得た。

この RNa s eH I I画分 4. 4 m 1をセントリコン一 10 (アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、 280 μ 1の濃縮液を 10 OmM N a C 1、 0. ImM EDTAを含む 5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) で平衡化した S u p e r d e x 200ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eH I Iは、 35キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RNa s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RN a s eHI Iを B c aRNa s eHI I標品とした。上記で得られた B c a RNa s eH I I標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。 B c a RNa s e H I I標品 1 μ 1に 40°Cであらかじめィンキュベーションした反応液〔 20 πιΜへぺス一水酸化力リウム（pH7. 8) 、 0. 0 1 %牛血清アルブミン（宝酒造社製）、 1%ジメチルスルホキシド、 1 0mM塩化マンガン、 20 gZmlポリ（dT) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）、 30 i g/mlポリ（rA) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）〕 Ι Ο Ο μ Ιを添加し、 40°Cで 1 0分間反応さた後、 0. 5M EDTA

( p H 8. 0 ) 10 μ 1で反応を停止し、 260 n mの吸光度を測定した。その結果、 B c a RNa s eH I I標品に RN a s e H活性が認められた。実施例 3

バチノレスカノレドテナックス RN a s e H I I I遺伝子のクローニング

(1) RNa s eH I I I遺伝子断片のクローニング

バチルスサブチリス（Bacillus subtilis) の RNa s eH I I Iのァミノ酸配列〔〇 t a n i Nら、バイオケミストリー、第 38卷、第 605— 608 頁（1 999) 〕について、他の生物由来の RN a s e H I I Iのアミノ酸配列とのホモロジ一を調べ、これらの間でよく保存されている領域のアミノ酸配列から RNa s e H I I Iをコードする遺伝子を探索するためのプライマー B s u I I I一 1 (配列番号 10) 、 B s u I I I— 3 (配列番号 1 1) 、 B s u I I I -6 (配列番号 1 2) 、 B s u I I I— 8 (配列番号 1 3) を合成した。

実施例 2— (1) で調製したバチルスカルドテナックスゲノム DNA 2 00 n gを铸型にし、 l O O pmo lの B s u I I I— 1及び 100 p m o 1の

B s u I I I一 8をプライマーにして、 50 /i 1の容量で 1回目の PC Rを行つた。更にその反応液 1 i 1を铸型として l O O pmo lの B s u I I I— 3及ぴ l O O pmo lの B s u I I I _6をプライマーに用いて 1 00 1の容量で 2 回目の PCRを行った。この 2回の PCRでの DNAポリメラーゼには、タカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 1回目の PCRは 9 4°Cで 30秒、 45°Cで 30秒、 72でで 1分を 1サイクルとして、 2 5サイクノレ行レヽ、 2回目は 30サイクノレ行なつた。

増幅して得られた約 450 b pの DNA断片を T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、ァガロースゲル電気泳動を行い、約 4 50 b pの DNA断片を回収した。得られた約 45 0 b pの DNA断片を、 Sm a I (宝酒造社製）で消化した pUC 1 1 9 (宝酒造社製）に T 4 D N Aリガ一ゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌 J Ml 0 9を形質転換した。

形質転換体を培養し、約 4 5 0 b pの DNA断片が挿入されたプラスミド p B CA 3 204を得た。

(2) サザンハイブリダィゼーシヨン法による RN a s e H I I I遺伝子のクロ一ユング

実施例 3— (1)で得られた p BCA 3 204に揷入された DN A断片の塩基配列を決定し、得られた配列もとにプライマー RN I I I— S 3 (配列番号 1 4) 及び B c a RN I I I— 3 (配列番号 1 5) を合成した。このプライマー RN I

I I — S 3及び B c a RN I I I - 3を用いて、： BCA3 204を鎵型にし、 1 0 0 μ 1の容量で P CRを行なった。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラ Ζタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 9 8°Cで 0秒、 5 5 °Cで 0秒、 7 2 °Cで 20秒を 1サイクルとして、 3 0サイクノレ行つた。反応終了後、フエノール一クロ口ホルム抽出、続いてエタノーノレ沈殿を行った。そして、ァガロースゲル電気泳動を行い、約 0. 4 k bの DNA断片をゲルから回収した。得られた約 0. 4 k bの DNA断片を D I G DNA標識キット（ベ一リンガーマンハイム社製）で標識し、プローブを調製した。

実施例 2—（1)で調製したバチルスカルドテナックスゲノム DNA 20 μ gを B amH I、 E c o R I、 H i n d i I I、 P s t l、 Xb a I (すべて宝酒造社製）で、それぞれ完全消化した後、その半分量をァガロース電気泳動した。ァガロースゲルから DNAを 0. 4N N a OHをもちいてナイロンメンブレンにトランスファーした後、 1 20°Cで 3 0分間固定した。次に、メンプレンを 3 0 m 1のハイブリダイゼーン 3ンバッファー〔4 3. 4 g/ 1塩化ナトリウム、 1 7. 6 g/ 1クェン酸ナトリウム、 1⁰/₀ブロッキング剤（ベーリンガーマンハイム社製）、 0. 1 % N—ラウロイルサルコシン、 0. 0 2%ラウリル硫酸ナトリウム（SD S) 〕の入ったシードバック中で、 6 0°C、 4時間プレインキュベーションした後、プローブを含むハイブリダィゼーションバッファー 5 m 1の入ったシーノレドバック中で、 6 0°C、 1 6時間インキュベーションした。次に、メンブランを 5 Om 1の 0. 1 % S D Sをふくむ 2 X S S C (17. 5 g/ l Na C 1、 7. 7 g/ 1クェン酸ナトリウム）中、室温で 2回、 50 mlの 0. 1%SDSを含む 0. 5 XSSC (4. 4 g Z 1塩ィヒナトリウム、 1. 9 g/lクェン酸ナトリウム）中、 45°Cで 2回洗浄した後、 D I G核酸検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて、プローブと相補的な酉己列を持った約 8 k bの E c o R I断片、約 4. 5 k bの P s t I断片、約 1 k bの H i n d I I I断片を検出した。

P s t Iで完全消化したバチルスカルドテナックスゲノム DNAの残り半分量をァガロース電気泳動し、約 4. 51^ 3の？ 3 t I断片をゲルから回収した。次に、この DNA断片と、 P s t I消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化したプラスミドベクター; TV 119 Nとをライゲーシヨンし、大腸菌 JM109を形質転換した。

プライマー RN I I I— S 3及び B c a RN I I 1—3を用いて、コロニーを铸型にし、 50 1の容量で PC Rを行ない、 RNa s eHI I I遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。この PC Rには、タカラ Zタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 98°Cで 0秒、 55°Cで 0秒、 72°Cで 20秒を 1サイクルとして、 30サイクル行った。この結果、 No. 8 8のコロニーに目的の遺伝子が含まれていることがわかった。

次に、この No.88のコロエーからプラスミドを調製し、これを铸型にプライマ一 RV— N (宝酒造社製）および B c a RNI I 1— 3又はプライマー M4 (宝酒造社製）及び RN I I I— S 3を用いて PCRを行い、 RNa s eHI I I遺伝子の全長が含まれているかどうかを調べた。その結果、増幅産物の鎖長より RNa s eHI I Iの全長が含まれていることが予想された。このプラスミドを PBCA3 P88とした。

(3) RNa s eHI I I遺伝子を含む D N A断片の塩基配列の決定

実施例 3— (2) で得られたプラスミド p BCA3 P 88の挿入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RN a s e H I I Iの N末端アミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリームの塩基配列を配列表の配列番号 16に、また、該塩基配列から推定される RN a s eH I I Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 17にそれぞれ示す。

(4) RNa s eH I I Iを発現させるためのプラスミドの構築

実施例 3 _ ( 2 ) に記載のプラスミド pBCA3 P88を铸型にし、上記で得られた RNa s eH I I Iのオープンリーディングフレームの周辺の酉己列を参考として設定した B c a RN I I I Nd e (配列番号 18) 及び Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製）を用いて、 100 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの D Ν Αポリメラーゼはパイ口べスト D N Aポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用レヽ、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 7

2°Cで 3分を 1サイクルとして、 30サイクル行った。この結果増幅した約 4 k bの DNA断片を Nd e l (宝酒造社製）で消化し、ァガロース電気泳動を行い、約 1. 4 k bの Nd e I断片をゲルから回収した。得られた約 1. 4k bの DN A断片を、 Nd e I消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化した p TV 119Nd (p T V 1 19 Nの N c o Iサイトを N d e I サイトに変換したもの）とライゲーシヨンを行い、大腸菌 J Ml 09を形質転換した。

次に、 Nd e I断片中の RNa s e H I I I遺伝子が p TV 1 19Ndベクタ一の 1 a cプロモーター下流につながったプラスミドをスクリーニングするため、コロニーを鏺型にし、プライマー RV— N (宝酒造社製）および B c a RNI I I一 3 (配列番号 15) を用いて、 50 1の容量で PCRを行ない、 RNa s eH I I I遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラ Zタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 P C Rは 98でで 0秒、 55 °Cで 0秒、 72 °Cで 20秒を 1サイクルとして、 3 0サイクノレ行った。この結果、 No. 2のコロエーが Nd e I断片中の RNa s eH I I I遺伝子が p TV 119 Ndベクターの 1 a cプロモーター下流につながったプラスミドを持つことが分かり、このプラスミドを p BCA3Nd 2とした。

さらに該プラスミド中の挿入 DN A断片の塩基配列をジデォキシ法で確認したところ、開始コドンを GTGから ATGに変換したこと以外、 PCRに起因する変異のないことを確^■した。

なお、プラスミド pBCA3Nd 2で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli J1109/pBCA3Nd2と命名、表示され、平成 12年 9月 5日（原寄託日）より日本国〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM BP— 7653として寄託されている。

(5) 精製 RNa s eHI I I標品の調製

実施例 3— (4)で得られた: BCA3Nd 2で形質転換された大腸菌 J M 10 9を 10 g/m 1のアンピシリンを含む 2 1の LB培地に植菌し、 37でで

16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 39. 6m 1のソニケーシヨンバッファー〔5 OmMトリス一HC 1 (ρ H8. 0) 、 1 m M EDTA、 2mMフエニルメタンスルフォュルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 60°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 1200 0 r p mで 10分間の遠心分離を行い、上清を集め、 39. 8mlの熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した R E S OU R S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F P LCシステム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eH I I Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I I画分 45 m 1をバッファー B 〔5 OmMトリス -HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 1を外液として、 2時間の透析を 3回行なつた。透析後の酵素液 55. 8 m 1をバッファー Bで平衡化した R E

SOURSE Sカラム（フアルマシアフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜50 OmM N a C 1直 ί泉濃度勾配により溶出し、約 105mM N a C 1のところに溶出された RN a s eHI I I画分を得た。この画分 7. Om 1に N a C 1濃度が 1 5 OmMになるように 1M N a C 1 を含むバッファー Bを添加し、 1 50 mM N a C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i T r a p— h e p a r i nカラム（アマシャムフアルマシアバイォテク社製）に供した。その結果、 RN a s e H I I Iは H i T r a p— h e p a r i nカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I I画分 7. 5 m 1をセントリコンー 1 0 (ミリポァ社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、 1 90 μ lの濃縮液を100mM N a C l、 0. 1 mM ED T Aを含む 5 0 mMトリスー HC 1 (pH 7. 0) で平衡化した S u p e r d e x 200ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RN a s e H I

I Iは、 3 3キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RN a s e H I I Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RN a s e H I I Iを B c a RN a s e H I I I標品とした。

上記で得られた B c a RN a s e H I I I標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。

B c a RN a s e H I I I標品 1 μ 1に 40°Cであらかじめインキュベーションした反応液〔2 OmMへぺス一水酸化カリウム（ρΗ7. 8) 、 0. 0 1 % 牛血清アルブミン（宝酒造社製）、 1 %ジメチルスルホキシド、 4mM酢酸マグネシゥム、 20 μ g/m 1ポリ (d T) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）、 30 i g / 1ポリ ( r A) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）〕 1 0 0 // 1を添カ卩し、 40°Cで 1 0分間反応さた後、 0. 5M ED TA (pH8. 0) 1 0 /iで反応を停止し、 260 nmの吸光度を測定した。その結果、 B c a RN a s e H I I I標品に RN a s e H活性が認められた。実施例 4

ピロコッカスフリオサスの RN a s e H I I遺伝子のクローユング

(1 ) ピロコッカスフリオサスゲノム DNAの調製

トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製） 1 %、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製） 0. 5%、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製） 1 %、ジャマリン S · ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5%、ジャマリン S - リキッド（ジャマリンラボラトリー社製） 0. 5⁰/₀ 、 Mg SO₄ 0. 003%、 N a C 1 0. 001 %、 F e S 0₄ · 7 H₂ O 0. 0001%, C o S O, 0. 0001 %、 C a C 1₂ · 7 H₂ O 0. 0001 %、 Z n S〇₄ 0. 00 01 %、 Cu S0₄ · 5H₂0 0. 1 pm_N KA 1 (S0₄)₂ 0. 1 pm_N H

3 B0₄ O. l p m, Na₂Mo0₄ - 2H₂O 0. 1 p p m、 N i C 1₂ · 6 H 20 0. 25 p pmの糸且成の培地 2 1を 2 1容のメジユウムポトルにいれ、 12 0°C、 20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカスフリオサス (Pyrococcus furiosus、ドイツチェザムノレンクフォンミクロオルガニスメンより購入： D SM3638) を接種して、 95°C、 1

6時間静置培養した後、遠心分離によつて菌体を得た。

次に、得られた菌体を 4 m 1の 25%ショ糖、 50mMトリスー HC 1 ( H 8. 0) に懸濁し、 0. 4m 1の 1 OmgZm 1塩ィヒリゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 24m lの 1 50mM Na C l、 1 mM EDTA、 20mMトリスー HC

1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 2 Omg/m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製）及び 2 m 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37 で 1時間 f承 i し 7

反応終了後、フエノールークロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約 lmgのゲノム DNAを調製した。

(2) RN a s e H I I遺伝子のクローニング

ピロコッカスホリコシ（Pyrococcus horikoshii) の全ゲノム配列が公開されており〔Kawa r a b a y a s i， Yら、 DNA リサーチ（DNA

Research) 、第 5巻、第 55— 76頁（1998) 〕、 RN a s e H I Iのホモログをコードする遺伝子（PH1650) 力つ存在することが明らかになっている（配列番号 19、 3本国独立行政法人製品評価技術基盤機構ホームべ ■ーシ： http： / /www. nite. go. jp/) ₀

そこで、この PHI 650遺伝子（配列番号 19) と一部公開されているピロコッカスフリオサスのゲノム配列（University of Utah, Utah Genome Center ホームページ： http://www. genome. Utah, edu/sequence. html) でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジ一の高い配列が見つかった。

得られた配列をもとにプライマー 1650Nd e (配列番号 20 ) 及び 165 OB am (配列番号 21 ) を合成した。

実施例 4一（1) で得たピロコッカスフリオサス DNA 200 n gを鏺型にして、 20 prao lの 1650Nd e及び 20 pmo lの 1650B a mをプライマーに用い、 100 1の容量で PCR行った。 PCRでの DNAポリメラ一ゼはタカラ Exタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 P CRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 30 サイクル行った。増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及び B amH I

(ともに宝酒造社製)で消化し、得られた DNA断片をプラスミドベクター pET 3 a (ノバジェン社製）の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミド p P FU220を作製した。

(3) RNa s eH I I遺伝子を含む D N A断片の塩基配列の決定

実施例 4一 (2) で得られた p PFU220の揷入 DNA断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。このオープンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 22に示す。また、該塩基配列から推定される RNa s eHI Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 23に示す。なお、プラスミド p P F U 220で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli JM109/pPFU220と命名、表示され、平成 12年 9月 5 S (原寄託日）より日本国〒 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 7654として寄託されている。

(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製

実施例 4一 (2) で得られた p PFU220で大腸菌 HMS 174 (DE3) (ノバジェン社製）を形質転換し、得られた p P F U 220を含む大腸菌 HM S 174 (DE 3) を 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 2 1の LB培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 66. Om 1のソニケーシヨンバッファー〔5 OmMトリス一 HC 1 ( H 8. 0) 、 ImM EDTA、 2 mMフエニルメタンスルフォニルフノレオライド〕に懸濁し、超音波破碎機にかけた。この破碎液を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行レ、、得られた上清を 80°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、上清を集め、 61. 5m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリス _HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した R E S OU R S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RN a s e H I Iは RE SOUR S E Qカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I画分 60. Omlをバッファー Aで平衡化した R E S OUR S E Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 0~50 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出し、約 15 OmM N a C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得この RN a s e H I I画分 2. 0 m 1をセントリコン一 10 (ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、 250 1の濃縮液を 10 OmM Na C l、 0. ImM EDTAを含む 5 OmMトリス _HC 1 (pH8. 0) で平衡化した S u p e r d e x 200ゲノレろ過カラム（アマシャムファノレマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eH I Iは、 17キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RNa s eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RN a s eHI Iを P f u RNa s eH I I標品とした。上記で得られた P i u RNa s eH I I標品を用いて、実施例 3 _ (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 P f u RN a s e H I I標品に RN a s e H活性が認められた。

実施例 5 サーモトガマリティマ RNa s eH I I遺伝子のクローニング

(1) サーモトガマリティマゲノム DNAの調製

トリプトン 1 %、酵母エキス 0. 5 %、可溶性でんぷん 1 %、ジャマリン S ■ ソリッド 3. 5%、ジャマリン S · リキッド 0. 5%、 Mg S0₄ 0. 00 3 %、 N a C 1 0. 00 1 %、 F e S 0₄ ■ 7 H₂ O 0. 0001 %、 C o S

0₄ 0. 000 1 %、 C a C 1₂ · 7 H₂ O 0. 000 1 %、 Z n S 0₄ 0. 000 1%、 C u S0₄ - 5H₂0 0. 1 pm KA 1 (S0₄) ₂ 0. 1 pm H₃ B0₃ 0. 1 p pm、 N a₂Mo 0₄ ■ 2H₂ O 0. 1 p p m、 N i C 1₂ - 6 H₂ O 0. 25 p pmの組成の培地 2 1を 2 1容のメディウムポトルにいれ、 1 20°C、 20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにサーモトガマリティマ（Thermotoga maritima、ドイツチェザムノレンクフォンミクロオノレガュスメンゥントツエノレタノレツレン GmbHより購入： DSM3 109) を接種して、 85°C、 1 6時間静置培養した。

次に、遠心分離によって培地 300m l相当分の菌体を集め、 31111の丁£緩衝液〔10mMトリス_HC l (pH7. 5) 、 1 mM EDTA] に懸濁し、

1 50 1の 1 0%ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスタ社製）水溶液及び 1 5 /i lの 20mg /m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製）をカロえて 3 7でで 1 時間保温した。

反応終了後、 0. 5m lの 5M Na C 1を加えてよく混合した後、 0. 4m 1の CTAB— N a C 1溶液〔 10 %セチルトリメチルアンモェゥムブロミド

(ナカライテスタ社製）、 0. 7M Na C l〕を加えてよく混合し、 65°Cで 10分間保温した。これに 1. 5m 1のクロロホルム Zィソァミルアルコール混合液（24 : 1、 v/v) を加えて 1 0分間緩やかに混合した後、 5分間遠心 (20000 X g) を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の 10 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 飽和フエノーノレ/クロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液（25 ： 24 ： 1、 v/v) を加えて 1 0分間緩やかに混合した後、更にで 5分間遠心（20000 X g) を行った。遠心終了後、得られた上清に 0. 6容の 2—プロパノールを加え、で 5分間遠心（1 0000 X g) して得られた沈殿を、 70 °/₀エタノール水溶液で洗浄し、風乾した後に 200 μ 1の Τ Eに溶解してゲノム D N A溶液を得た。

(2) RN a s e H I I遺伝子のクローニング

サーモトガマリティマゲノム DNAを铸型とした PC Rを行うことにより RNa s eH I I遺伝子を含む増幅 D N A断片を得るため、サーモトガマリテイマゲノム DN Aの塩基配列

(http:〃丽. tigr. org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage. html) のうち R N a s eH I I遺伝子と同定されている部分の塩基配列をもとにして、オリゴヌクレオチド 915— F 1 (配列番号 24) 、 915— F 2 (配列番号 25) 、 915- R 1 (配列番号 26) 及び 915—R 2 (配列番号 27) を合成した。

上記実施例 5— (1) で調製したサーモトガマリティマゲノム DN Aを铸型として、 915— F 1と 915— R 1、 915— F 1と 915—R 2、 915 — F 2と 915—R 1又は 915— F 2と 915—R 2をプライマ一対とし、それぞれ PCRを行った。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラ Exタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 95°Cで 0. 5分、 5 5°Cで 0. 5分、 72°Cで 1. 5分を 1サイクルとして、 25サイクル行った。反応終了後、各 P C R反応物をァガロースゲル電気泳動に供し、約 0. 7 k bの増幅された DNA断片を抽出精製した。

9 15— F 1と 915—R1及び 915— F 1と 915— R 2のプライマー対で増幅した DNAは H i n d I I Iと Xb a I (ともに宝酒造社製）で消化し、 H i n d l l lと Xb a lで消化した pUC 19 (宝酒造社製）に T4 DNA リガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。この形質転換体を培養し、約 0. 7 k bの DNA断片が揷入されたプラスミド DNAを調製した。その結果、 915— F 1と 915— R 1から増幅した DNA 断片が揷入されたプラスミド No. 1と No. 2、 915— F 1と 91 5—R 2 から増幅した DNAが揷入されたプラスミド No. 3と No. 4を得た。

また、 915— F 2と 915—R 1及び 915— F 2と 915—R 2のプライマー対で増幅した DNAを Nc o I (宝酒造社製）と Xb a Iで 2重消化し、 N c o Iと Xb a Iで 2重消化した p TV 1 1 9N (宝酒造社製）に T4 DNA リガーゼを用いて連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。この形質転換体を培養し、約 0. 7 k bの DNA断片が揷入されたプラスミド DNAを調製した。その結果、 9 1 5— F 2と 9 1 5—R 1から増幅した DNA 断片が揷入されたプラスミド No. 5と No. 6、 9 1 5— F 2と 9 1 5—R 2 力ら増幅した DN Aが揷入されたプラスミド No. 7を得た。

なお、プラスミド N o . 7で形質転換された大腸菌 J M 1 09は、

Escherichia coli JM109Z_PTM -薩と命名、表示され、平成 1 2年 9月 5日（原寄託 13) より日本国〒 305— 8 566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 76 52として寄託されている。

(3) サーモトガマリティマ RNa s eH I I遺伝子の発現

プラスミド No. 1〜7又は pUC 1 9で形質転換された大腸菌 JM109を 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 5m 1の LB培地（トリプトン 10 gZ 1、酵母エキス 5 g/l、 Na C l 5 g/ Κ ρΗ7. 2) に植菌し、 37°C で振盪培養した。 660 n mにおける吸光度が 0. 5になったときに終濃度が 1 mMになるようにイソプロピル一 j3_D_チォガラタトピラノシドを加え、更に

1晚振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集め、 1m lの TE緩衝液に懸濁し、超音波破碎した。これを 80 で 1 0分間熱処理し、遠心によつて得た上清を菌体粗抽出液とした。

得られた菌体粗抽出液を用いて、実施例 2— (5) に記載の方法で吸光度を測定した。

その結果、 UC l 9を保持する大腸菌 JM109から調製した粗抽出液で反応させたときに比べて、プラスミド No. 3、 5、 6及び 7を保持する大腸菌 J M 1 09から調製した菌体粗抽出液は、 M n C 1₂存在下で反応させたとき、明らかに 260 nmにおける吸光度の値が高かった。よって、プラスミド No. 3、 5、 6及び 7は RNa s e H I I遺伝子を含んおり、これらのプラスミドを保持する大腸菌で RN a s e H活性を発現することが明らかになった。

こうして大腸菌内で RNa s eH活性が発現していることが明らかとなったプラスミドに挿入された DNA断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 58に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s eH

1 Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 59に示す。このプラスミド N o . 7に挿入された DNA断片の塩基配列には P CR時に生じたと思われる塩基置換が 1 箇所みとめられ、その箇所のアミノ酸残基が変化していることが分かった。

(4) 精製 RNa s eH I I標品の調製

実施例 5— (2)で得られたプラスミド No. 7 (プラスミド pTM—RNH) で大腸菌 JM109を形質転換し、得られた p T M— R N Hを含む大腸菌 J M 1 09を 100 gZm 1のアンピシリンを含む 1 1の LB培地に植菌し、 37°C で 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 31. 0 _m 1のソニケーシヨンバッファー〔50mMトリスー HC 1 ( p H 8. 0) 、 2 mM 2—メルカプトエタノール、 10%グリセローノレ、 2mMフエ二ノレメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 1

2000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 70°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pm、 10分の遠心分離を行い、上清を集め、 32. 0mlの熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー C 〔5 OmMトリス _HC 1 (pH8. 0) 、

2 mM 2—メルカプトェタノール、 10 °/₀グリセ口ール〕で平衡化した R E S

OURSE Qカラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RN a s e H I Iは RE SOUR S E

Qカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I画分 32. 5mlをバッファー Cで平衡化した R

E S OUR S E Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜50 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出し、約 24 OmM N a C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得た。

この RN a s e H I I画分 2. 0 m 1を 50 mM Na C lを含むバッファー Cで平衡化した PD_ 10カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、得られた溶出液 3. 5m lを 50mM Na C lを含むバッファー Cで平後 ί化した H i T r a p— h e ρ a r i nカラム（アマシャムファノレマシァバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 50〜55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 295mM Na C lのところに溶出された RN a s eH I I画分を得た。

このようにして溶出された RN a s e H I Iを TmaRNa s e H I I標品とした。

上記で得られた Tma RNa s eH I I標品を用いて、実施例 2— (6) に記載の方法で酵素活性を測定した結果、 Tma RNa s eH I I標品に RNa s e H活性が認められた。

実施例 6

ピロコッカスホリコシィの RN a s e H I I遺伝子のクロー-ング

(1) ピロコッカスホリコシィゲノム DNAの調製

トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製） 1%、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製） 0. 5%、可溶' I、生でんぷん（ナカライテスタ社製） 1%、ジャマリン S ■ ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5%、ジャマリン S ' リキッド（ジャマリンラボラトリー社製） 0. 5%、 Mg S〇₄ 0. 003%、 N a C 1 0. 001%, F e S 0₄ ■ 7 H₂ O 0. 0001 %、 C o S 0₄ 0. 0001 %、 C a C 1₂ ■ 7 H₂ O 0. 0001%, Z n S 0₄ 0. 00 01%、 Cu S〇₄ · 5H₂0 0. 1 p pm、 KA 1 (S0₄)₂ 0. 1 pm H

3 B0₄ O. l p rn, Na₂Mo0₄ - 2H₂0 0. 1 p m_N N i C l₂ - 6H ₂ O 0.25 p pmの糸且成の培地 2 1を 2 1容のメジユウムボトノレにいれ、 12 0°C、 20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカスホリコシィ OT 3 (Pyrococcus horikoshii、理化学研究所より購入： J CM9974) を接種して、 95°C、 16時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。

次に、得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mMトリス一 HC 1 ( H 8. 0) に懸濁し、 0. 4m 1の 1 OmgZm 1塩化リゾチーム（ナカライテスク社製） 7]溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 24mlの 150mM Na C l、 1 mM EDTA、 20mMトリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 2 Omg/m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製）及び 2 m 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリゥム水溶液を加え、 37 °Cで 1時間保温した。

反応終了後、フエノールークロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約 1 m gのゲノム DN Aを調製した。

(2) RN a s e H I I遺伝子のクローニング

ピロコッカスホリコシィ（Pyrococcus horikoshii) は全ゲノム配列が公開されており〔DNA リサーチ（DNA Research) 、第 5卷、第 55— 76頁 (1998) ] RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子（PH165

0) が 1つ存在することが明らかになつている（配列番号 28、 B本国独立行政法人製品評価技術基盤機構ホームページ： http：〃 www. nite.go.jp/) 。そこで、この PH1650遺伝子（配列番号 28) の配列をもとにプライマー P h oNd e (配列番号 29 ) 及び P h o B am (配列番号 30 ) を合成した。実施例 6— ( 1 ) で得たピロコッカスホリコシィ DN A 100 n gを錶型にして、 20 pmo 1の Ph oNd eNd e及び 20 pmo 1の Ph o B amをプライマーに用い、 100 At 1の容量で PCR行った。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラ Exタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 4 0サイクル行った。増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及び B amH

I (ともに宝酒造社製)で消化し、得られた DNA断片をプラスミドベクター pE T 3 a (ノバジェン社製）の N d e I及ぴ B a mH I間に組込んだプラスミド； p PHO 238を作製した。

(3) RNa s eHI I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定

実施例 6— (2) で得られた p P HO 238の揷入 DN A断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RN a s e H I Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディ

'ームの塩基配列を配列表の配列番号 31に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s e H I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 32に示す。なお、プラスミド P PH0238で形質転換された大腸菌 JM 109は、 Escherichia coli JM109/pPH023⁸と命名、表示され、平成 13年 2月 22日 (原寄託日）より S本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 7692として寄託されている。

(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製

実施例 6— (2) で得られた p PHO 238で大腸菌 HMS 174 (DE3) (ノバジェン社製）を形質転換し、得られた p P HO 238を含む大腸菌 HM S 174 (DE 3) を 100 μ gZm Iのアンピシリンを含む 1 1の LB培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 34. 3m 1のソニケーシヨンバッファー〔5 OmMトリスー HC 1 (pH 8. 0) 、 1 mM EDTA、 2 mMフエニルメタンスルフォニルフルオラィド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破碎液を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 80°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、上清を集め、 33. 5m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリス _HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した R E S OUR S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製) に供し、 F P LCシステム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eH I Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。

素通りした RNa s eHI I画分 35. Omlををバッファー B [5 OmMトリス一 HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 Lを外液として、 2時間の透析を 3回行なつた。透析後の酵素液 34. 5 m 1をバッファー Bで平衡化した RESOURSE Sカラム（フアルマシアフアルマシアバイオテク社製）に供し、 FP LCシステムを用いて 0〜50 OmM Na C l直線濃度勾配により溶出し、約 155mM Na C 1のところに溶出された RN a s eH I I画分を得た。この画分 4. Om U Na C 1濃度が 50 mMになるようにバッファー Bを添カロし、 50mM N a C 1を含むバッファー Bで平衡ィ匕した H i T r a p— : h e a r i nカラム（アマシャムファノレマシアバイオテク社製）に供し、 FP LCシステムを用いて 50〜5 5 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 1 6 OmM Na C 1のところに溶出された RNa s eH I I画分を得た。

この RNa s eH I I画分 6. 9 m 1をセントリコン— 1 0 (ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、 25 Ο μ 1の濃縮^?夜を 2回に分けて 1 0 OmM Na C l、 0. ImM EDTAを含む 5 OmMトリスー HC 1 ( H 7. 0) で平衡化した S u p e r o s e 6ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eH I Iは、 24. 5キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RN a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RNa s eHI Iを Ph o RNa s e H I I標品とした。上記で得られた Ph o RNa s eH I I標品を用いて、実施例 3— (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 Ph oRNa s e H I I標品に RN a s e H活性が認められた。

実施例 7

ァノレカェォグロバスフノレギダスの RNa s e H I I遺伝子のクローニング (1) アルカェォグロバスフルギダスゲノム DNAの調製

アルカェォグロバスフルギダス（Archaeoglobus fulgidus、ドイツチェザムノレンクフォンミクロオ^/ガエスメンゥントツェルタノレツレン Gmb Hより購入： D SM41 3 9) 8 m 1相当分の菌体を集め、 100 1の 25 % ショ糖、

トリスー《[〇 1 (p H8. 0) に懸濁し、 20 1の0. 5M EDTA、 1 0 /z 1の 1 OmgZm 1塩化リゾチーム（ナカライテスタ社製）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 800 1の 1 50mM Na C l、 ImM EDTA、 20mMトリス _HC 1 (p H 8. 0) 、 1 0 μ 1の 2 OmgZm 1プロティナーゼ K (宝酒造社製）及び 50 /z 1の 1 0 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37 °Cで 1時間保温した。反応終了後、フエノールークロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に 5 0 μ 1の ΤΕに溶解してゲノム DNA溶液を得た。

(2) RNa s e H I I遺伝子のクローニング

アルカェォグロバスフルギダス（Archaeoglobus fulgidus) は全ゲノム配列が公開されており〔K1 e nk, HPら、ネイチヤー（Nature) 、第 390卷、第 364— 370頁（1997) 〕、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子（AF0621) が 1つ存在することが明らかになつている（配列番号 3 3、 http://www. tigr. org/tdb/CMR/btra/htmls/SplashPage. html)。

そこで、この AF0621遺伝子（配列番号 33) の配列をもとにプライマー A f uNd e (配列番号 34 ) 及び A f u B a m (配列番号 35 ) を合成した。実施例 7— (1) で得たアルカェォグロバスフルギダス 3 On gを铸型にして、 20 pmo 1の Af uN d e及び 20 pmo 1の A f u B amをプライマ一に用い、 100 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポリメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従つて用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 40サイクル行った。増幅した約 0. 6 k bの DNA断片を Nd e I及び B amHI (ともに宝酒造社製)で消化し、得られた DN A断片をプラスミドべクタ一 pTV1 19Nd (pTVl 19NのNc o Iサイトを N d e Iサイトに変換したもの）の N d e I及び B amH I間に組込んだプラスミド！) AFU20 4を作製した。

(3) RNa s eHI I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定

実施例 7 _ (2) で得られた p A F U 204の揷入 D N A断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 36に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s e H I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 37に示す。なお、プラスミド PAFU204で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli J¥109/pAFU204と命名、表示され、平成 13年 2月 22日 (原寄託日）より日本国〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 7691として寄託されている。

(4) 精製 RNa s eH I I標品の調製

実施例 7— (2) で得られた p AFU204で大腸菌 JM109を形質転換し、得られた: AFU 204を含む大腸菌 J Ml 09を 100 g/mlのアンピシリンを含む 21の L B培地に植菌し、 37 で 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 37. lm 1のソニケーシヨンバッファー〔5 OmMトリスー HC 1 (p H8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mMフエニルメタンスルフォュルフルオラィド〕に懸濁し、超音波破 |幾にかけた。この破砕液を 12000 r p mで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 70°C、 1 5分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、上清を集め、 40. 3 m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA〕で平衡化した R E S OUR S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F P LCシステム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RN a s e H I Iは RE S OUR S E Qカラムを素通りした。

バッファー Aで平衡化した RE SOUR S E Sカラム (アマシャムファノレマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシァバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RN a s eHI Iは RESOURSE Sカラムを素通りした。

素通りした RN a s e H I I画分 40. 0 m 1を 50 mM N a C 1を含むバッファー B 〔50mMトリスー HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA〕 2 1 を外液として、 2時間の透析を 3回行なつた。透析後の酵素液 40. 2 m 1を 5 0 mM N a C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i Tr a p-h e p a r i nカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステムを用いて 50〜550mM Na C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 240mM Na C 1のところに溶出された RN a s eHI I画分を得た。この RNa s e H I I画分 7. 8 m 1をセントリコン一 1 0 (ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約 6 00 μ 1の濃縮液を 4回に分けて 1 0 Om M Na C l、 0. ImM EDTAを含む 5 OmMトリス _HC 1 (pH7. 0) で平衡化した S u p e r o s e 6ゲルろ過カラム（アマシャムフアルマシァバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RN a s e H I Iは、 30. 0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RN a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。

こうして溶出された RN a s e H I Iを A f uRN a s e H I I標品とした。上記で得られた A f uRN a s e H I I標品を用いて、実施例 3— (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 A f uRN a s e H I I標品に R N a s e H活' I生が認、められた。

実施例 8

サーモコッカスリトラリス RN a s e H I I遺伝子のクローユング

(1) サーモコッカスリトラリスゲノム DN Aの調製

サーモコッカスリトラリス (Thermococcus litoralis、ドイツチェザムノレンクフォンミクロォ/レガニスメンゥントツエノレタノレツレン Gmb Hより購入： D SM5 47 3) 1 lm 1相当分の菌体を集め、 5 0 0 1の2 5%ショ糖、 5 0mMトリスー HC 1 (pH8. 0) に懸濁し、 1 0 0 1の 0. 5M EDTA、 50 μ 1の 1 Omg/m 1塩化リゾチーム（ナカライテスタ社製）水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。反応終了後、この反応液に 4m lの 1 5 OmM N a C l、 I mM EDTA、 20mMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 5 0 μ 1の 2 OmgZm 1プロティナ一ゼ K (宝酒造社製）及び 2 5 0 μ 1の 1 0 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 3 7 °Cで 1時間保温した。反応終了後、フエノール一クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に 1 0 0 μ 1の ΤΕに溶解してゲノム DNA溶液を得た。

(2) RN a s e H I I遺伝子中央部のクロー-ング

様々な耐熱性 RN a s e H I Iのァミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチド RN— F 1 (配列番号 3 8) とオリゴヌクレオチド RN-R O (配列番号 3 9) を合成した。上記実施例 8— ( 1 ) で調製したサーモコッカスリトラリスゲノム DNA 溶液 5 /z 1を鎵型にして、 100 pmo 1の RN— F 1及び 100 pmo 1の R N— R0をプライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行った。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従つて用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 45 °Cで 30秒、 72 °Cで 1分を 1サイクルとして、 50サイクル行った。反応終了後、マイクロコン一 100 (宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮した。

( 3 ) RN a s e H I I遺伝子上流および下流部分のクローニング

上記実施例 8— （ 2 ) で得た約 0. 5 k bの断片 T 1 i F 1ROの塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローユングするための特異的なオリゴヌクレオチド T 1 i RN- 1 (配列番号 40) と下流をクローユングするための特異的なオリゴヌクレオチド T l i RN-2 (配列番号 41) を合成した。さらに、表 1に示す 48種類のプライマーを合成した。表 1中のタグ配列を配列表の配列番号 60 に示す。

5，一タグ配列 _NN— S S S S S S S— 3，

(N ; G、 A、 T、 Cのミックス、 Sは下記に示す塩基配列である。）

塩基配列番号塩基配列番号塩基配列

1 ggagcag 19 gtaacgg 37 gcgcaag

2 ggcaaag 20 gtaagcg 38 gcgcttg

3 ggcaacg 21 gtacacg 39 gcggacg

4 ggcacag 22 gtagacg 40 gcgtaag

5 ggcattg 23 gtagcgg 41 gctacgg

6 ggccaag 24 gtcaacg 42 gctcacg

7 ggccttg 25 gcaccag 43 gctccag

8 ggctaag 26 gcagacg 44 gcttgcg

9 ggctacg 27 gcagcag 45 gcttggg

10 ggctcag 28 gcatggg 46 ggacacg

11 ggctttg 29 gccaaag 47 ggaccag

12 gggacag 30 gccacag 48 ggagacg

13 gggcaag 31 gccattg

14 gggcttg 32 gcccaag

15 gggtacg 33 gcccttg

16 ggtaacg 34 gcctacg

17 ggtacgg 35 gcctcag

18 ggtagcg 36 gcctttg 実施例 8— （1) で調製したサーモコッカスリトラリスゲノム DNA溶液 1 μ 1を铸型にして 20 pmo 1の Τ 1 i RN— 1または 20 pmo 1の T 1 i R N— 2と各 20 mo 1の表 1記載の 48種類のプライマーとの組み合わせで 2 OmM トリス酢酸（ρΗ8. 5) 、 50mM酢酸カリウム、 3mM酢酸マグネシゥム、 0. 01%B SA、各 30 M dNTP混合物、 2. 5単位のタカラ ExTa q DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液中で P C Rをおこなった。 PCRは 94°Cで 3分インキュベートした後、 98 °Cで 10秒、 50°C で 10秒、 72 で 40秒を 1サイクルとし、 40サイクル行つた。得られた P CR産物の一部をァガロース電気泳導し、シングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン一 100 (宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークェンスをおこない、 RNa s eHI I の上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、約 450 b pの P C R増幅断片 T 1 i N7に RNa s eHI I遺伝子の上流が、約 600 b pの〇1増幅断片丁 1 i C25、約 400 b ρの PCR増幅断片 T 1 i C 26に下流が含まれていることがわかった。

(4) RNa s eHI I遺伝子全域のクローニング

T 1 i RNa s eH I Iを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 42に示す。また、該塩基配列から推定される RNa s eHI Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 43に示す。上記塩基配列をもとにプライマー T 1 i Nd e (配列番号 44) 及び T 1 i B am (配列番号 45) を合成した。

実施例 8— （ 1 ) で得たサーモコッカスリトラリスゲノム DNA溶液 1 μ

1を錡型にして、 20 pmo 1の T 1 i N d e及び 2 O pmo lの T l i B am をプライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNA ポリメラーゼは E X T a q D N Aポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 40サイクノレ行った。増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を

Nd e I及び B amH I (ともに宝酒造社製）で消化し、得られた DNA断片をプラスミドベクター: TV 119Nd (p TV 1 19NのNc o Iサイトを Nd e Iサイトに変換したもの）または pET3 a (ノバジェン社製）の Nd e l及び B a mH I間に組込み、プラスミド: TL I 223Ndおよび pTL I 204を作製した。

(5) RNa s eHI I遺伝子を含む D N A断片の塩基配列の決定

実施例 8— (4) で得られた p TL I 223Ndおよび p TL I 204の揷入 D N A断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。 pTL I 204のォープンリ一ディングフレ^ "ムの塩基配列を配列表の配列番号 46に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s eH I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 4 7に示す。 TL I 223Ndのオープンリ一ディングフレームの塩基配列は、 pTL I 204とくらベて 484番目の Tが Cに置きかわっていた。また、アミノ酸配列では 162番目のフエ二ルァラニンがロイシンに置きかわっていた。なお、プラスミド； T L I 204で形質転換された大腸菌 HMS 174 (DE 3) は、 Escherichia coli HMS 174 (DE3) /pTLI204と命名、表示され、平成 1 3年 2月 22日（原寄託日）より日本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1 丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM B P— 7693として寄託されている。

(6) サーモコッカスリトラリス RNa s eHI I遺伝子の発現

p TL I 223N dで形質転換された大腸菌 JM109を 100/i g /m 1のアンピシリンおよび ImM I PTGを含む 10m 1の LB培地に植菌し、 3 7°Cで 1晚振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 196

1のバッファー Aに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000 r p mで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 70°C、 10分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行レ、、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様に； TL I 204で形質転換された大腸菌 HMS 17 4 (DE3) を 100 / g/m 1のアンピシリンを含む 1 Om 1の LB培地に植菌し、 37°Cで 1晚振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。

上記で得られた熱処理上清液を、実施例 3— (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においても RN a s eH活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。

(7) 精製 RNa s eHI I標品の調製

実施例 8— （4) で得られた p TL I 223Ndで大腸菌 JM109を形質転換し、得られた p TL I 223Ndを含む大腸菌 JM109を 100 g/m 1 のァンピシリンを含む 2 1の L B培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によつて集めた菌体を 38. 7 m 1のソニケーションバッファー〔5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mM フエニルメタンスルフォニルフルオラィド〕に懸濁し、超音波破 ϋにかけた。この破碎液を 12000 r p mで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 7 0°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 20.分の遠心分離を行い、上清を集め、 37. 2 m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔50mMトリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した R E S OU R S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F P LCシステム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eH I Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。

バッファ一 Aで平衡化した RESOURSE Sカラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F P LCシステム (アマシャムフアルマシァバイオテク社製）を用いて 0〜50 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 22 OmM NaC 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得た。

この RNa s e H I I画分 3 m 1に Na C 1濃度が 5 OmMになるようにバッファー Aを添加し、 5 OmM Na C 1を含むバッファー Aで平衡化した H i T r a p-h e p a r i nカラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製) に供し、 F P LCシステムを用いて 50〜55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 320mM N a C 1のところに溶出された RNa s e H I I画分を得た。

この RNa s e H I I画分 6mlをセントリコンー 10 (ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約 198 μ 1の濃縮液を 10 OmM Na C l、 0.

ImM EDTAを含む 5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) で平衡化した S u p e r o s e 6ゲルろ過カラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI Iは、 26. 5キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RNa s eH I Iが 1量体として存在する場合に相当する。こうして溶出された RN a s eH I IをT l i RNa s eHI I標品とした。

上記で得られた T 1 i RNa _S eHI I標品を用いて、実施例 3— (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 T 1 i RNa s eHI I標品に RNa s eH活性が認められた。

実施例 9

サーモコッカスセラー RNa s eH I I遺伝子のクローニング

(1) サーモコッカスセラーゲノム DNAの調製

サーモコッカスセラー (Thermococcus celer、ドイツチェザムノレンクフオンミク口オルガニスメンゥントツェルクルツレン GmbHより購入： D

SM2476) 1 lm 1相当分の菌体を集め、実施例 8_ (1) の記載の方法によりゲノム DN A溶液を得た。

(2) RNa s eHI I遺伝子中央部のクロー-ング

様々な耐熱性 RN a s e H I Iのァミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチド RN—F 1 (配列番号 48) とオリゴヌクレオチド RN-R0 (配列番号 49) を合成した。

上記実施例 9 _ (1) で調製したサーモコッカスセラーゲノム DNA溶液 5 μ 1を铸型にして、 l O O pmo 1の RN— F 1及び 1 O O pmo 1の RN_ ROをプライマーに用い、 100 Z 1の容量で PCRを行った。 PCRでの DN Aポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 45°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとして、 50サイクノレ行った。反応終了後、増幅して得られた約 500b pの DNA 断片を T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、ァガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約 500 b pの DNA断片を回収した。得られた約 500 b pDNA断片を、 Sma l (宝酒造社製）で消化した p UC 1 19 (宝酒造社製）に T 4 D N Aリガーゼ（宝酒造社製）を用レ、て連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。

形質転換体を培養し、約 500 b pの DNA断片が挿入されたプラスミド p T c e F 1 R 0を得た。 (3) RNa s eHI I遺伝子上流および下流部分のクローユング

上記実施例 9一 (2) で得られたプラスミド pTc e F I RO塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチド T c e RN— 1 (酉 S列番号 50) と下流をクローエングするための特異的なオリゴヌクレオチド T c eRN_2 (配列番号 51 ) を合成した。

実施例 9一（1) で調製したサーモコッカスセラーゲノム DNA溶液 1 /i 1を錄型にして 20 pmo 1の T 1 i RN— 1または 20 pmo 1の T 1 i RN —2と各 20 pmo 1の 48種類のプライマー（実施例 8表 1記載）との組み合わせで 2 OmMトリス酢酸（pH8. 5) 、 50mM酢酸カリウム、 3 mM酢酸マグネシウム、 0. 01⁰/₀Β SA、各 30 /iMdNTP混合物、 2. 5単位のタカラ E X T a q D N Aポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液中で P C Rをおこなった。 PCRは 94 °Cで 3分インキュベートした後、 98 °Cで 10秒、 5 0 °Cで 10秒、 72。Cで 40秒を 1サイクルとし、 40サイクル行つた。得られた P C R産物のうちシングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン一 100 (宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークェンスをおこない、 RNa s eHI Iの上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、約 450 b pの PCR増幅断片 T c eN 24に RNa s eHI I遺伝子の上流が、約 400 b pの P C R増幅断片 T c e C 29に下流が含まれていることがわかった。

(4) RNa s eHI I遺伝子全域のクローユング

Tc eRNa s eHI Iを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号 52に示す。また、該塩基配列から推定される RNa s eHI Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 53に示す。上記塩基配列をもとにプライマー T c eNd e (配列番号 54 ) 及び T c e B am (配列番号 55 ) を合成した。

実施例 9— (1) で得たサーモコッカスセラーゲノム DNA溶液 Ι μ ΐを鎊型にして、 20 pmo lの Tc eNd e及び 20 pmo 1の Tc e B amをプライマーに用い、 100 /i 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポリメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコ一ルに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1 サイクルとし、 40サイクル行った。増幅した約 0. 7k bのDNA断片をNd e I及び B amHI (ともに宝酒造社製)で消化し、得られた D N A断片をプラスミドベクター; p TV 119Nd (p TV 1 19NのNc o Iサイトを Nd e Iサイトに変換したもの）または pET3 a (ノバジェン社製）の Nd e l及び B a mH I間に組込み、プラスミド: TCE265Ndおよび pTCE207を作製した。

(5) RNa s eH I I遺伝子を含む DN A断片の塩基配列の決定

実施例 9— (4) で得られた; TCE 265Ndおよび pTCE207の揷入 D N A断片の塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。

得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RN a s e H I Iをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。 p TCE 207のォープンリ一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 56に示す。また、該塩基配列から推定される RN a s eH I Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 5 7に示す。 TCE 265Ndのオープンリ一ディングフレームの塩基配列は、 p TCE 207とくらべて 14番目の Aが Gに置きかわっており、 693から 6

96番目が欠失していた。また、アミノ酸配列では 5番目のグルタミン酸がダリシンに置きかわっており、 231番目のフエ-ルァラニンが欠失していた。

なお、プラスミド PTCE207で形質転換された大腸菌 HMS 174 (D E 3) は、 Escherichia coli HMS 174 (DE3) /pTCE207と命名、表示され、平成 1 3年 2月 22日（原寄託 3) より日本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1 丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM B P— 7694として寄託されている。

(6) サーモコッカスセラー RNa s eH I I遺伝子の発現

TCE265Ndで形質転換された大腸菌 JM109を 100/i g /m 1のアンピシリンおよび ImM I PTGを含む 10m 1の LB培地に植菌し、 3

7 °Cで 1晚振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 203 μ 1のバッファー Αに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000 r p mで 10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 70 °C、 10分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様に p T C E 207で形質転換された大腸菌 HMS 17 4 (DE3) を 100 μ gZm 1のアンピシリンを含む 1 Om 1の LB培地に植菌し、 37°Cで 1晚振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。

上記で得られた熱処理上清液を、実施例 3 _ ( 5 ) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においても RN a s eH活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換、欠失があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。

(7) 精製 RNa s eH I I標品の調製

実施例 9_ (4) で得られた pTCE 265Ndで大腸菌 JM109を形質転換し、得られた pTCE 265Ndを含む大腸菌 JMl 09を 100 g/m 1 のァンピシリンを含む 2 1の L B培地に植菌し、 37でで 16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を 39mlのソニケーションバッファ一 [5 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を 12000 r 111で10分間の遠心分離を行い、得られた上清を 7 0°C、 15分間の熱処理にかけた。その後、再度 12000 r pmで 20分の遠心分離を行い、上清を集め、 37. 5 m 1の熱処理上清液を得た。

この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡ィ匕した R E S OU R S E Qカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、 RNa s eH I Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。

バッファー Aで平衡化した RE SOUR S E Sカラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、 F PLCシステム（アマシャムフアルマシァバイオテク社製）を用いて 0〜 50 OmM Na C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 22 OmM N a C 1のところに溶出された RN a s eH I I画分を得た。

この RNa s e H I I画分 3 m 1に N a C 1濃度が 5 OmMになるようにバッファ一 Aを添加し、 50 mM N a C 1を含むバッファ一 Aで平衡化した H i T r a p-h e p a r i nカラム（アマシャムファノレマシアバイオテク社製）に供し、 FPLCシステムを用いて 50〜55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。その結果、約 415mM N a C 1のところに溶出された RNa s e H I I画分を得た。

この RN a s eH I I画分 6m 1をセントリコンー 10を用いた限外ろ過により濃縮し、約 178 1の濃縮液を 10 OmM Na C l、 0. 1 mM EDT Aを含む 5 OmMトリス一 HC 1 (p H8. 0 ) で平衡化した S u p e r o s e 6ゲルろ過力ラム (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に供し、同じノッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI Iは、 29. 5キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、 RNa _S eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。こうして溶出された RNa s eHI Iを T c e RN a s e H I I標品とした。

上記で得られた Tc e RNa s eHI I標品を用いて、実施例 3— (5) に記載の方法により酵素活性を測定した結果、 T c e R N a s e H I I標品に R N a s eH活性が認められた。

実施例 1◦

実施例 2から実施例 9において得られたバチルスカルドテナックス（以下 B CAとする）、ピロコッカスフリオサス（PFU) 、サーモトガマリティマ (TMA) 、アルカェォグロバスフルギダス (AFU) 、サーモコッカスリトラリス（TL I) 、サーモコッカスセラー（TCE) 、ピロコッカスホリコシィ（PHO) のアミノ酸配列と塩基配列について、ホモロジ一検索を行なつた。検索プログラムは、 DNAS I S-Ma c (宝酒造社製）の Ma x i mum Ma t c h i n gとコンピュータァノレゴリズム FA S T A (バージョン 3.0；ノヽ。一ソン（Pearson, W. R. )ら、 Pro. Natl. Acad. Sci. , 85:2444 - 2448， 1988)で算出した。

まず、 DNAS I Sにより P FUに対する PH〇、 AFU、 TL I、 TCEのァミノ酸配列の相同性はそれぞれ 69 %、 45 %、 65 %、 58 %、塩基配列の相同性はそれぞれ 68%、 60°/。、 65%、 61%であった。次にコンピュータアルゴリズム FAS TAで遺伝子データベースを PHO、 A FU、 TMAに関して検索した。その結果、 PHOのアミノ酸配列に対して、リポヌクレアーゼであると推定されているアミノ酸配列で最も相同性の高かったものは 70°/₀、最も低かったものは 20%の相同性を有していた。また、 AFUとは 50%、 TMAとは 35%の相同性を有していた。同様に、 AFUのアミノ酸配列に対して行なったところ、高かったものは 50%、低かったものは 25%、 TMAとは 32%の相同性を有していた。同様に、 TMAのアミノ酸配列に対して行なったところ、高かったものは 52%、低かったものは 22%の相同性を有していた。

コンピューターアルゴリズム B LASTで遺伝子データベースを BCA、 P F

U、 TCE、 TL Iに関して検索した。その結果、 BC Aのリポヌクレアーゼ H I Iのアミノ酸配列に対して、リボヌクレアーゼであると推定されているァミノ酸配列で最も相同性の高かったものは 43 %、 B CAのリポヌクレアーゼ H I I Iのァミノ酸配列で 46 %であった。同様に、 P FUのァミノ酸配列では 68 %、 TCEのアミノ酸配列では 70%、 TL Iのアミノ酸配列では 64%であった。また、 DNAS I Sによって PHOと AFUのアミノ酸配列の相同性を調べたところ 50%であった。上記のようにコンピュータアルゴリズム FAS TAでも

50%であったため、 DNAS I Sとコンピュータアルゴリズム FAS TAでは相同性として表示される数値に大きな違いがないことがわかった。

実施例 11

各種 RNa s eHの作用機作と性質

(l) B c a RNa s eHI I Iの作用機作

B c a RNa s eHI I Iと E. c o l i RNa s eHIの切断様式を比較するため以下のように基質を調製した。大腸菌 Ol 57熱抽出物を踌型に 3' 側から 3塩基が RNAである 5' 端 F I T C標識キメラプライマー VT 2— R 28 ON 3- I 7 (配列番号 61) と DNAプライマー VT 2— F 110 (配列番号

62) を用いて PCRを行い、 2本鎖の一方の鎖に RNAを 3つ含む DNA断片を得た。 PCR産物よりマイクロコン一 100 (ミリポア社製）によりプライマ一を除去して RNa s eHによる切断の基質とした。次に、上記の基質 0. 3 pmo 1を含む反応バッファー（20mM H e p e s -KOH (pH7. 8) 、 1% ジメチルスルホォキシド、 0. 01% ゥシ血清アルブミン、 l O OmM 酢酸カリウム、 4mM 酢酸マグネシウム、 0. 002% プロピレンジァミン） 39. 2μ 1を調製した。これに E. c o l i RNa s eH I 3 OU/μ 1 (宝酒造社製）または、実施例 3— （5) で得られた B c a RNa s eHI I I精製標品をバッファー Aで 10倍希釈した溶液を 0. 8 1カロえ、 55 °Cで 5分間及び 10分間で反応した。反応後、反応液の 2 μ 1を 10%変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、切断された DN Α断片のサイズを確認した。

E. c o l i RNa s e H Iの場合、 18 b a s eと 19 b a s eの位置にシグナルが現われ、経時的に 19 b a s eのシグナルは減少した。また、プライマーが完全に除けていないために現われる 20 b a s eのバックグランドも経時的に減少した。一方、 B c a RNa s eH I I Iの場合、 1 9 b a s eの位置にシグナルが現われ、プライマーのバックグランドの減少は見られなかった。以上のことより、 E. c o 1 i RNa s eHIは、 2ケ所の RNA間で切断した。また、 3' 側の RNAの 5，側を切断した後、 RNAが DNAに結合しない状態で、さらに 3' 側の RNAの 5' 側を切断する活性を有すると考えられる。一方、 B c a RNa s eHI I Iは 3' 側の RNAの 5 ' 側のみを切断し、 RNAの 3' 側に DNAが結合していない時には切断しないと考えられる。 E. c o l i RNa s eHIに比べ切断位置の選択性が高いと考えられる。

(2) P f u、 Ph o、 Af u RNa s eHI Iの作用機作

P f u (パイロコッカスフリオサス）、 Ph o (パイロコッカスホリコシィ）、 Af u (アルカェォグロバスフルギダス）の RNa s eHI Iの切断様式を解析するため、以下のように基質を調製した。大腸菌 O157熱抽出物を鍩型に 3' 側から 3塩基が RNAである 5' 端 F I T C標識キメラプライマー VT 2- I F 20N3 (配列番号 63) 、 2塩基が RNAである 5' 端 F I T C標識キメラプライマー VT 2— I F 19N2 (配列番号 64) 、 1塩基が RNAである 5' 端 F I TC標識キメラプライマ一 VT 2— I F 18N 1 (配列番号 65) と DNAプライマー VT 2 I R 20 (配列番号 66) を用いて PCRを行い、 2 本鎖の一方の鎖に RNAを 3つ、 2つ、あるいは、 1つ含む DNA断片、 VFN 3、 VFN2、 VFN1を得た。これらの P C R産物よりマイクロコン一 100 によりプライマーを除去して RN a s eHによる切断の基質とした。

次に、上記の基質 0. 3 pmo 1を含む反応バッファー（2 OmM He p e s—KOH (p H7. 8) 、 1% ジメチルスルホォキシド、 0. 01% ゥシ血清アルブミン、 l O OmM 酢酸カリウム、 4mM 酢酸マグネシウム、 0. 002% プロピレンジァミン） 39 μ 1を調製した。これに、各 RNa s eH の精製標品 37. 2υ/_μ 1を l i l加え、 55 °Cで 5分間及び 10分間反応した。反応後、反応液の 2 μ 1を 10 %変性ァクリルァミドゲルで電気泳動し、切断された DN Α断片のサイズを確認した。

V FN 3を基質にした場合、 P f u、 Ph o、 Af uの RNa s eHI Iに関して、 19 b a s eの位置にシグナルが得られ、 V F N 2を基質にした場合、 P f u、 Pho、 Af uの RNa s eH I Iに関して、 18 b a s eの位置にシグナルが得られ、 VFN 1を基質にした場合、 P f u、 Ph oの RNa s eH I I に関して、 17 b a s eの位置にシグナルが得られた。

以上のことより、 P f u、 Ph o、 Af uの RNa s eH I Iは 3，側の RN Aの 5' 側を切断した。 P f uと Ph oの RNa s e H I Iは RNAが 1つの場合でも RN Aの 5' 側を切断した。 RN Aが 1つでも切断する RNa s e Hは報告されていない。切断された場合のシグナル強度は RN Aの数にかかわらず同様の強さを示し、 RNAの数による切断効率に差がないことが示された。また、一旦現われたシグナルが経時的に減少したり、さらに短いシグナルが現われないことより、 RNAの 3' 側に DNAが結合していないと切断されないことが示された。

(3) B e aと Tm a R N a s e H I Iのイオン要求性

実施例 1で記載した R N a _S e H活性測定法にぉレ、て M n ² +要求性で M g ^{2 +} では全く活性を示さない B c a RNa s eHI IとTl a RNa s eHI I に関して、実施例 1 1— (2) に記載の VFN3を基質として Mg²⁺あるいは、 Mn ²⁺存在下での切断を比較した。

基質 0. 3 pmo 1を含む反応バッファー（2 OmM He p e s -KOH ( pH7. 8) 、 1 % ジメチルスルホォキシド、 0. 01% ゥシ血清アルブミン、 l O OmM 酢酸カリウム、 4mM 酢酸マグネシウム、 0. 002% プロピレンジァミン） 3 9. 2 1及び、基質0. 3 pmo 1を含む Mn+反応バッファー（20mM He p e s -KOH (pH7. 8) 、 1% ジメチノレスノレホォキシド、 0. 0 1% ゥシ血清アルブミン、 l O OmM 酢酸カリウム、 1

OmM 塩化マンガン、 0. 002% プロピレンジァミン） 39. 2 μ 1を調製した。これらに E. c o l i RNa s eH I 3 Ο /μ 1 (宝酒造社製）または、実施例 2— (6) で得られた B c a RNa s eH I I精製標品をバッファー Aで 10倍希釈した溶液、または、実施^ J 5— （ 3 ) で得られた T m a R N a s e H I I菌体粗抽出液をバッファ一 Aで 25倍希釈した溶液を 0. 8 μ 1 加え、 55°Cで 5分間及び 1 0分間で反応した。反応後、反応液の 2 / 1を 10 %変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、切断された DNA断片のサイズを確認した。

B c a RNa s eH I Iと Tma RN a s e H I Iに関して、ともに Mg ²⁺、 Mn ²⁺存在下のどちらにおいても 1 9 b a s eの位置にシグナルが現われた。そのシダナノレレべノレは同レベルであった。

実施例 1記載の R N a s e H活性測定法では全く活性を示さない M g ²⁺存在下で B e a RNa s eH I Iと Tma R N a s e H I Iは Mn ^{2 +}の場合と同等の切断活性を示した。

以上のことより、基質の形状によっては切断に Mn²⁺を要求せず、 Mg ²⁺でも代替可能であり、 Mn ²⁺や M g ²⁺を要求する酵素と同一反応液で作用させられる可能性が示された。

(4) RNa s e Hの耐熱性の検討

バチルスカルドテナツタス RN a s e Hとして実施例 2— (5) 、実施例 3— (4) で得られた: RHB l l、 BCA3Nd 2_N ピロコッカスフリオサス RNa s eHとして実施例 4一 (2) で得られた p P F U 22◦、サーモトガマリティマ RNa s eHとして実施例 5— (2) で得られた; TM— R NH、ピロコッカスホリコシィ RNa s e Hとして実施例 6— (2) で得られたわ PHO 2 38、ァ /レカェォグロバスフルギダス RNa s eHとして実施例 7_ (2) で得られた; AFU204、サーモコッカスリトラリス RN a s e Hとして実施例 8— (4) で得られた pTL I 204、 p TL I 223N d、サーモコッカスセラー RNa s eHとして実施例 9— (4) で得られた pTCE 207 pTCE 26 5Ndでそれぞれ形質転換された大腸菌を用いて耐熱性を調べた。すなわち、上記大腸菌を培養し、培養液から調製した素酵素抽出液を 60 °C、 1 5分の条件で熱処理を行ない、実施例 1と同様の方法で R N a s eH活性を調べた。その結果、どの菌株由来の RNa s e Hにおいても RNa s eH活†生が確認、できた。産業上の利用の可能性

本発明により、遺伝子工学において利用価値の高い RNa s eH活性を有するポリぺプチド、該ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子ならびに該ポリぺプチドの遺伝子工学的製造方法を提供される。また、本発明の RNa s eHは耐熱性を有しており、工業的に有利な RNa s eHの製造方法も提供される。

本発明によって、さまざまな用途で本発明の RNa s eHを用いることが可能となった。配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 1： PCR primer BsuII—3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 2： PCR primer BsuII - 6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 3: PCR primer 腿 I SI for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 4: PCR primer RNII-S2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 5: PCR primer 丽 I— S5 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 6: PCR primer R II-S6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 7 : PCR primer 丽1— Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 10 : PCR primer BsuIII- 1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 11 : PCR primer BsuIII- 3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 12 : PCR primer BsuIII- 6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 13 : PCR primer BsuIII- 8 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 14: PCR primer RNIII— S3 for cloning a gene encoding a . polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 15 : PCR primer BcaRNIII- 3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 18 : PCR primer BcaRNIIINde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.

SEQ ID NO: 20： PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.

SEQ ID NO: 21： PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.

SEQ ID NO : 24 : PCR primer 915-Fl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.

SEQ ID NO : 25 : PCR primer 915 - F2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritime.

SEQ ID NO: 26 : PCR primer 915— Rl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.

SEQ ID NO : 27 : PCR primer 915-R2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima. SEQ ID NO : 29 : PCR primer PhoNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii.

SEQ ID NO: 30 : PCR primer PhoBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikosnii. SEQ ID NO: 34 : PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO : 35 : PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.

SEQ ID NO: 38 : PCR primer RN-Fl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.

SEQ ID NO: 39 : PCR primer RN-RO for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.

SEQ ID NO: 0： PCR primer TliRN - 1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis. SEQ ID NO: 41 : PCR primer TliRN- 2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.

SEQ ID N0: 44 : PCR primer TliNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.

SEQ ID NO: 45 : PCR primer TliBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Thermococcus litoralis.

SEQ ID NO : 48 : PCR primer RN-Fl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.

SEQ ID NO : 49 : PCR primer RN-RO for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.

SEQ ID NO : 50 : PCR primer TceRN-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.

SEQ ID NO: 51 : PCR primer TceRN-2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.

SEQ ID NO: 54 : PCR primer TceNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.

SEQ ID NO: 55 : PCR primer TceBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Thermococcus celer,

SEQ ID NO: 61 : Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2 - R280N3- I 7 for amplifying a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorr hagic Escherichia coli 0-157. "Nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-o ther nucleotides are deoxyribonucleotides

SEQ ID NO: 62： Designed oligonucleotide primer as VT2-F110 for amplifyi ng a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escheric hia coli 0-157.

SEQ ID NO: 63 : Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2 - IF20N3 f or amplifying a VFN3 from hemorrhagic Escherichia coli 0 - 157. "Nucleotide s 17 to 19 are ribonucleotides-o ther nucleotides are deoxyribonucleotide s

SEQ ID N0: 64 : Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF19N2 f or amplifying VFN2 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "Nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO: 65 : Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF18N1 f or amplifying a VFNl from hemorrhagic Escherichia coli 0-157， "Nucleotide s 15 to 17 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotide s

SEQ ID NO: 66 : Designed oligonucleotide primer as VT21R20 for amplifyin g a portion of vero toxin 2— encoding sequence from hemorrhagic Escherich ia coli 0—157.

Claims

請求の範囲

1. 下記の群より選択され、かつ、耐熱性リポヌクレアーゼ H活性を有することを特徴とするポリペプチド：

(a) 配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 3 7、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるァミノ酸配列又はその一部を有するポリぺプチド；

(b) 配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 3 7、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換を有するポリペプチド；

(c) 配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 3 7、 47、 57又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも 7 1%の相同性を有するァミノ酸配列を有するポリぺプチド。

2. 下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼ H活性を有するポリぺプチドをコ一ドする核酸：

(a) 配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 37、 47、 5 7又は 59のいずれか 1つに示されるァミノ酸配列又はその一部を有するポリぺプチドをコードする核酸；

(b) 配列表の配列番号 9、 1 7、 23、 3 2、 37、 47、 5 7又は 59のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸；

(c) 配列表の配列番号 8、 1 6、 22、 3 1、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列を有する核酸；

(d) 配列表の配列番号 8、 1 6、 22、 3 1、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列において、少なくとも 1つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、揷入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；

(e) 前記 (a) 〜（d) のいずれか記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイプリダイズしうる核酸；

(f ) 配列表の配列番号 8、 1 6、 22、 3 1、 36、 46、 56又は 58のいずれか 1つに示される塩基配列に少なくとも 69 %の相同性を有する塩基配列である核酸。

3. 請求項 2記載の核酸を含んでなる組換え D NA。

4. 請求項 3記載の組換え DNAにより形質転換されてなる形質転換体。

5. 請求項 4記載の形質転換体を培養し、該培養物中より耐熱性リポヌクレアーゼ H活性を有するポリべプチドを採取することを特徴とする耐熱性リポヌタレァーゼ H活性を有するポリぺプチドの製造方法。

6. プラスミド pRHB 11 (FERM B P— 7655として寄託）、 B CA 3N d 2 (FERM B P _ 7653として寄託）、 P FU220 (FE RM B P_ 7654として寄託）、 p TM—RNH (FERM BP— 765 2として寄託）、 PHO 238 (FERM B P _ 7692として寄託）、 p AFU 204 (FERM B P— 7691として寄託）、 p TL I 204 (FE RM B P— 7693として寄託）又は p TCE 2◦ 7 (FERM BP—76 94として寄託）のいずれか 1つを導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リボヌクレアーゼ H活性を有するポリぺプチド。