JPS59162885A - 複合プラスミド - Google Patents
複合プラスミドInfo
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- JPS59162885A JPS59162885A JP58038040A JP3804083A JPS59162885A JP S59162885 A JPS59162885 A JP S59162885A JP 58038040 A JP58038040 A JP 58038040A JP 3804083 A JP3804083 A JP 3804083A JP S59162885 A JPS59162885 A JP S59162885A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- genus
- dna
- complex
- tetracycline
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、複合プラスミドｔこ関ｕ１詳しくは、エシ
ェリヒア属またはシュードモナス属に属する微生物の細
胞内で自律増殖し、かつ、シュードモナス属の微生物に
こアンピシリン、テトラサイクリンに対する耐性を行年
することができる遺伝子領域を含む複合プラスミドに関
する。
ェリヒア属またはシュードモナス属に属する微生物の細
胞内で自律増殖し、かつ、シュードモナス属の微生物に
こアンピシリン、テトラサイクリンに対する耐性を行年
することができる遺伝子領域を含む複合プラスミドに関
する。
組換えＤＮＡ技術におけるプラスミドベクターの有用性
はエンエリヒア・コリの宿主・ベクター系でよく知られ
ている。
はエンエリヒア・コリの宿主・ベクター系でよく知られ
ている。
一方、シュードモナス属の微生物は、種々の有機化合物
を単一炭素源として利用できる性質を持ち、またその生
息範囲は土壌中のみでなく、淡水中、海水中などと、極
めて広く、環境浄化の面で重要な役割を担っているが、
シュードモナス属の微生物の組換えＤＮＡ技術１こよる
育種、改良に用いられる有用なベクターは未だ開発され
ていない。
を単一炭素源として利用できる性質を持ち、またその生
息範囲は土壌中のみでなく、淡水中、海水中などと、極
めて広く、環境浄化の面で重要な役割を担っているが、
シュードモナス属の微生物の組換えＤＮＡ技術１こよる
育種、改良に用いられる有用なベクターは未だ開発され
ていない。
従来、エシェリヒア属およびシュードモナス属１こ属す
る微生物を宿主とすることができるべフターとしては、
Ｒ３ＦＩＯＩＯ（エシェリヒア属の微生物を宿主とした
とき、ストレプトマイシン耐性及び、スルホンアミド耐
性を発現する）が知られていたが、Ｒ３ＦＩＯＩＯのス
トレプトマイシン耐性は、ＤＮＡフラグメントを挿入す
ると耐性が発現しない場合があり、また、スルホンアミ
ド耐性１こりいては、シュードモナス属の微生物をスル
ホンアミドが生育を完全ｔこ阻害しないこと、及びＲ８
Ｆ ｌ Ｏ］ ０はＥｃｏＲＩ以外の有利なりローニ／
グザイトを有しない等のことがらＲ３ＦＩＱＩＯはシュ
ードモナス属の微生物の育種、改良１こ有効なベクター
とは言えなかった。
る微生物を宿主とすることができるべフターとしては、
Ｒ３ＦＩＯＩＯ（エシェリヒア属の微生物を宿主とした
とき、ストレプトマイシン耐性及び、スルホンアミド耐
性を発現する）が知られていたが、Ｒ３ＦＩＯＩＯのス
トレプトマイシン耐性は、ＤＮＡフラグメントを挿入す
ると耐性が発現しない場合があり、また、スルホンアミ
ド耐性１こりいては、シュードモナス属の微生物をスル
ホンアミドが生育を完全ｔこ阻害しないこと、及びＲ８
Ｆ ｌ Ｏ］ ０はＥｃｏＲＩ以外の有利なりローニ／
グザイトを有しない等のことがらＲ３ＦＩＱＩＯはシュ
ードモナス属の微生物の育種、改良１こ有効なベクター
とは言えなかった。
又、シュードモナス属の微生物を宿主とする複合ベクタ
ーとしては、ｐＴｓ］２０１（アンピシリン、カナマイ
シン、ストレプトマイシン、スルホンアミド耐性）、ｐ
Ｔｓ１０３６（アンピンリン、カナマイシン、ストレプ
トマイシン、スルホンアミド耐性）、ｐＴｓＩ２０８（
アノピシリン、カナマイシン耐性）等が中沢ら（第２回
遺伝子工学基盤技術研究シンポジウム要旨集、５０頁、
１９８３年）により報告されている。然し、シュードモ
ナス属の微生物は、これらの抗生物質Ｆこよりその生育
が完全？こ阻害されず、且つ自然復帰変異株が出現しや
すかった。
ーとしては、ｐＴｓ］２０１（アンピシリン、カナマイ
シン、ストレプトマイシン、スルホンアミド耐性）、ｐ
Ｔｓ１０３６（アンピンリン、カナマイシン、ストレプ
トマイシン、スルホンアミド耐性）、ｐＴｓＩ２０８（
アノピシリン、カナマイシン耐性）等が中沢ら（第２回
遺伝子工学基盤技術研究シンポジウム要旨集、５０頁、
１９８３年）により報告されている。然し、シュードモ
ナス属の微生物は、これらの抗生物質Ｆこよりその生育
が完全？こ阻害されず、且つ自然復帰変異株が出現しや
すかった。
そこで、本発明者らは、ンユードモナス属に属する微生
物ｒこついて使用できるより有用なベクターを開発すべ
く種々検討した結果、ついｔこンユードモナス属Ｐこ属
する微生物の細胞内で自律複製可能なプラスミド（ａ）
のドライブ・ユニットを含むＤＮＡ領域（Ａ）と、エシ
ェリヒア属Ｐこ属する微生物の細胞内で自律複製可能な
プラスミド（ｂ）のドライブ・ユニット領域を含むＤ
Ｎ Ａ （Ｂ）及びンユードモナス属？こ属する微生物
Ｆこアンピシリン及びテトラサイクリンｔこ対し耐性を
件部することができる遺伝子領域を含むＤＮ Ａ （Ｃ
）とよりなる複合プラスミドを得ることｔこ成功した。
物ｒこついて使用できるより有用なベクターを開発すべ
く種々検討した結果、ついｔこンユードモナス属Ｐこ属
する微生物の細胞内で自律複製可能なプラスミド（ａ）
のドライブ・ユニットを含むＤＮＡ領域（Ａ）と、エシ
ェリヒア属Ｐこ属する微生物の細胞内で自律複製可能な
プラスミド（ｂ）のドライブ・ユニット領域を含むＤ
Ｎ Ａ （Ｂ）及びンユードモナス属？こ属する微生物
Ｆこアンピシリン及びテトラサイクリンｔこ対し耐性を
件部することができる遺伝子領域を含むＤＮ Ａ （Ｃ
）とよりなる複合プラスミドを得ることｔこ成功した。
本発明の複合プラスミドは、より具体的には、分子量が
８．５メガダルトンであり、制限酵素？こより切断され
る個所がＰｓｔ ｌ、 Ｓａｌ Ｉ、 Ｐｖｕ （１、
ＥｃｏＲＩ及びＢａ’ｍＨＩｔこおいてそれぞれ２，１
゜１．１及び１である。
８．５メガダルトンであり、制限酵素？こより切断され
る個所がＰｓｔ ｌ、 Ｓａｌ Ｉ、 Ｐｖｕ （１、
ＥｃｏＲＩ及びＢａ’ｍＨＩｔこおいてそれぞれ２，１
゜１．１及び１である。
構築した複合プラスミドｐＭＦ３０（アンピシリン、テ
トラサイクリン耐性）をベクターとし、シュードモナス
属の微生物を宿主として形質転換を行ない、形質転換株
を得る際にこけ、選択培地中にアンピシリンとテトラサ
イクリンを含有せしめる。
トラサイクリン耐性）をベクターとし、シュードモナス
属の微生物を宿主として形質転換を行ない、形質転換株
を得る際にこけ、選択培地中にアンピシリンとテトラサ
イクリンを含有せしめる。
この場合ｒこ、宿主菌であるシュードモナス属の微生物
は、その生育が完全１こ抑制され、且つ抗生物質抵抗性
の自然復帰変異株の出現は殆んど認められないことから
、目的とする形質転換株を容易に得ることが出来、極め
て実用的なベクターである。
は、その生育が完全１こ抑制され、且つ抗生物質抵抗性
の自然復帰変異株の出現は殆んど認められないことから
、目的とする形質転換株を容易に得ることが出来、極め
て実用的なベクターである。
本発明の複合プラスミドは、エシェリヒア属の微生物及
びンユードモナス属の微生物を宿主として自律複製する
ことができ、また、これら宿主微生物１こアノピシリン
、クロラムフェニコール又ハテトラザイクリン１こ対す
る耐性を付与することができるので、いわゆる「シャト
ルベクター」として使用できる。従って特にシュードモ
ナス属の組換えＤＮＡ技術技術上り育種、改良するのし
こ、本発明のプラスミドベクターは有用である。
びンユードモナス属の微生物を宿主として自律複製する
ことができ、また、これら宿主微生物１こアノピシリン
、クロラムフェニコール又ハテトラザイクリン１こ対す
る耐性を付与することができるので、いわゆる「シャト
ルベクター」として使用できる。従って特にシュードモ
ナス属の組換えＤＮＡ技術技術上り育種、改良するのし
こ、本発明のプラスミドベクターは有用である。
本発明において「ドライブ・ユニット」とは、宿主細胞
の中で遺伝子が複製するためｅこ必要な遺伝子領域をい
う。
の中で遺伝子が複製するためｅこ必要な遺伝子領域をい
う。
本発明プラスミドの具体的であるプラスミドｐＭＦ３０
の性質を以下ｔこ示す。
の性質を以下ｔこ示す。
（１１分子量は８．５メガダルトンである（アガロース
ゲル電気泳動上の移動距離から計算した）。
ゲル電気泳動上の移動距離から計算した）。
（２） 制限酵素による切断部位数は以下のとおりで
ある。
ある。
Ｐｓｔ ｌ ２
Ｓａｌｌ １
Ｐｖｕ ［Ｉ
ＥｃｏＲｌ Ｉ
ＢａｍＨｌ １
（３） 制限酵素切断地図を第１図に示す。プラスミ
ドｐＭＦ３０の宿主菌としては、 エシェリヒア属の微
生物及びンユードモナス属の微生物のほかにエルビニア
属、セラチア属、プロテウス属およびサルモネラ属の微
生物がある。具体例を示せば以下のとおりである。
ドｐＭＦ３０の宿主菌としては、 エシェリヒア属の微
生物及びンユードモナス属の微生物のほかにエルビニア
属、セラチア属、プロテウス属およびサルモネラ属の微
生物がある。具体例を示せば以下のとおりである。
エシェリヒア・フリに一］ ２ （Ａ
ＴＣＣ＋０７９８）エシェリヒア・コリＢ
（ＡＴＣＣ１１３０３）ンユードモナス
・プチダ （ＡＴＣＣ＋２６３３）ン
ユードモナス・ブトレファーシェンス （ＡＴＣＣ＋
５９４６）／ニードモナス・ピロンニア
（ＡＴＣＣ１５’１５８）ンユードモナス・スタチェ
リー （ＡＴＣＣ１７５８８）ンユードモナ
ス・ベシキュラス （ＡＴＣＣＩ ＋４２ａ
）ンユードモナス・アントポランス （ＡＴＣ
Ｃ＋５６６８）ンユードモナス・アルカリゲネス
（ＡＴＣＣＩ４９０９）／ニードモナス・ジミヌタ
（ＡＴＣＣ１１５６８）ンユードモ
ナス・フルオレセンス （ＡＴＣＣ＋３５２５
）ンユードモナス・メラノゲラム （ＡＴＣ
Ｃ＋３６３７）ンユードモナス・ンユードアルカリゲネ
ス （ＡＴＣＣ１７４４０）エルビニア・ヘルビコーラ
（ＡＴＣＣ３３２４３）エルビニア・
カロトポーラ （ＡＴＣＣ３３２６０）
エルビニア・アロイデー （ＡＴＣＣ
＋５５８０）セラチア・リクイファーシエンス
（ＡＴＣＣ２７５９２）セラチア・マルセーセンス
（ＡＴＣＣ＋３８８０）プロテウス・し
ｌ・ゲリー （ＡＴＣＣ２９９０６）プ
ロテウス・ブルガリス （ＡＴＣＣ＋
３３＋５）サルモネラΦチフシューリマム
（ＡＴＣＣ１９５８５）（４１宿主菌に対し、アンビン
リン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性
を行年する。
ＴＣＣ＋０７９８）エシェリヒア・コリＢ
（ＡＴＣＣ１１３０３）ンユードモナス
・プチダ （ＡＴＣＣ＋２６３３）ン
ユードモナス・ブトレファーシェンス （ＡＴＣＣ＋
５９４６）／ニードモナス・ピロンニア
（ＡＴＣＣ１５’１５８）ンユードモナス・スタチェ
リー （ＡＴＣＣ１７５８８）ンユードモナ
ス・ベシキュラス （ＡＴＣＣＩ ＋４２ａ
）ンユードモナス・アントポランス （ＡＴＣ
Ｃ＋５６６８）ンユードモナス・アルカリゲネス
（ＡＴＣＣＩ４９０９）／ニードモナス・ジミヌタ
（ＡＴＣＣ１１５６８）ンユードモ
ナス・フルオレセンス （ＡＴＣＣ＋３５２５
）ンユードモナス・メラノゲラム （ＡＴＣ
Ｃ＋３６３７）ンユードモナス・ンユードアルカリゲネ
ス （ＡＴＣＣ１７４４０）エルビニア・ヘルビコーラ
（ＡＴＣＣ３３２４３）エルビニア・
カロトポーラ （ＡＴＣＣ３３２６０）
エルビニア・アロイデー （ＡＴＣＣ
＋５５８０）セラチア・リクイファーシエンス
（ＡＴＣＣ２７５９２）セラチア・マルセーセンス
（ＡＴＣＣ＋３８８０）プロテウス・し
ｌ・ゲリー （ＡＴＣＣ２９９０６）プ
ロテウス・ブルガリス （ＡＴＣＣ＋
３３＋５）サルモネラΦチフシューリマム
（ＡＴＣＣ１９５８５）（４１宿主菌に対し、アンビン
リン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性
を行年する。
ｐＭＦ３０ の製造法は実施例１１こて具体的？こ示
す。
す。
エシェリヒア属の微生物を宿主として自律複製すること
ができる性質をイ」饗するところのドライブ・ユニット
領域を含むＤ Ｎ Ａ （Ｂ）の供ケ、源となるエシェ
リヒア属の微生物で自律複製可能なプラスミド（ｂ）と
しては、具体的１こは、Ｒ８Ｆ２１２４、ｐｃＲｌ、ｐ
ＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐ Ｋ
Ｙ ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫＮ８０、ｐＫＣ７
、ｐＫＢ１５’８、ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃｌ？？
、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐｓｃ１０＋、ｐＲＫ６４６、ｐ
ＢＫ２４８等がある。
ができる性質をイ」饗するところのドライブ・ユニット
領域を含むＤ Ｎ Ａ （Ｂ）の供ケ、源となるエシェ
リヒア属の微生物で自律複製可能なプラスミド（ｂ）と
しては、具体的１こは、Ｒ８Ｆ２１２４、ｐｃＲｌ、ｐ
ＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐ Ｋ
Ｙ ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫＮ８０、ｐＫＣ７
、ｐＫＢ１５’８、ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃｌ？？
、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐｓｃ１０＋、ｐＲＫ６４６、ｐ
ＢＫ２４８等がある。
ソニートモナス属の微生物を宿主として自律複製するこ
とができる性質を付与するところのドライブ・ユニット
領域を含むＤ Ｎ Ａ （Ａ）の供与源となるソニート
モナス属の微生物で自律複製可能なプラスミド（ａ）と
しては、具体的！こは、Ｒ５Ｆ１０１０、Ｒ１１６２、
Ｒ３００Ｂ１ＲＰＩ。
とができる性質を付与するところのドライブ・ユニット
領域を含むＤ Ｎ Ａ （Ａ）の供与源となるソニート
モナス属の微生物で自律複製可能なプラスミド（ａ）と
しては、具体的！こは、Ｒ５Ｆ１０１０、Ｒ１１６２、
Ｒ３００Ｂ１ＲＰＩ。
ＲＰ４、Ｒ６８、ＰＫ２等がある。
尚、／ニードモナス属の微生物とエシェリヒア属の微生
物両方を宿主とできるようなプラスミドも知られている
ので、上記のプラスミド（ａ）とプラスミド（ｂ）は同
一のプラスミドであってもよく、従って、ドライブ・ユ
ニット領域を含むＤ Ｎ Ａ Ｇ６１）と（Ｂ）が同一
のフラグメントであってもよい。
物両方を宿主とできるようなプラスミドも知られている
ので、上記のプラスミド（ａ）とプラスミド（ｂ）は同
一のプラスミドであってもよく、従って、ドライブ・ユ
ニット領域を含むＤ Ｎ Ａ Ｇ６１）と（Ｂ）が同一
のフラグメントであってもよい。
ソニートモナス属の微生物にアンピシリン及びテトラサ
イクリンに対し耐性を付与することができる遺伝子領域
を含むＤ Ｎ Ａ （Ｃ）の供与源としては、プラスミ
ド（ａ）または、プラスミド（ｂ）またはその両方を用
いるのが都合がよいが要はシュードモナス属の微生物ｔ
こアンビンリン及びテトラサイクリン耐性なケえるよう
なりＮＡであればエシェリヒア属または／ニードモナス
属の微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、更にはこれ
ら微生物以外の微生物の染色体、ファージまたはプラス
ミドであってもよい。
イクリンに対し耐性を付与することができる遺伝子領域
を含むＤ Ｎ Ａ （Ｃ）の供与源としては、プラスミ
ド（ａ）または、プラスミド（ｂ）またはその両方を用
いるのが都合がよいが要はシュードモナス属の微生物ｔ
こアンビンリン及びテトラサイクリン耐性なケえるよう
なりＮＡであればエシェリヒア属または／ニードモナス
属の微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、更にはこれ
ら微生物以外の微生物の染色体、ファージまたはプラス
ミドであってもよい。
本発明の複合プラスミドをエシェリヒア属１こ属する微
生物またはシュードモナス属１こ属スる微生物へ導入す
る１こは、エシェリヒア・フリに一１２ｅこついて報告
されている様？こ（Ｍａｎｄｅｌ＋Ｍ、 ａｎｄ Ｈｉ
ｇａ＋ ’Ａ、＋ Ｊ、 Ｍｄ、 Ｂｉｏｌ、、 ５
３ ＋ １５９（＋９７９．））受容菌細胞を塩化力
ルンウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、あるい
はバチルス・ズブチルス放線菌および酵母Ｐこついて知
られている様に（Ｃｈａｎｇ＋ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ＋ Ｓ。
生物またはシュードモナス属１こ属スる微生物へ導入す
る１こは、エシェリヒア・フリに一１２ｅこついて報告
されている様？こ（Ｍａｎｄｅｌ＋Ｍ、 ａｎｄ Ｈｉ
ｇａ＋ ’Ａ、＋ Ｊ、 Ｍｄ、 Ｂｉｏｌ、、 ５
３ ＋ １５９（＋９７９．））受容菌細胞を塩化力
ルンウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、あるい
はバチルス・ズブチルス放線菌および酵母Ｐこついて知
られている様に（Ｃｈａｎｇ＋ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ＋ Ｓ。
Ｎ、＋ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋
１６８ ＋ Ｉ Ｉ １（＋ ９７ ’ｊ） ； Ｂ
ｉｂｂ、 Ｍ、 Ｊ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｍ、 ａ
ｎｄＨｏｐｗｏｏｄ＋ Ｏ，Ａ、＋ Ｎａｔｕｒｅ、＋
’２７４ ＋ ３９８（］ ９７８ ） ： Ｈ
ｉｎｎｅｎ＋ Ａ、＋ Ｈｉｃｋｓ＋ Ｊ、 ’Ｂ、
ａｎｄＦｉｎｋ＋ Ｇ、 Ｒ，＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、＋Ｌ土、 １
９２９（１９７Ｂ美）、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤ
ＮＡを容易にこ取り込むプロトプラストまたはスフェロ
プラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容菌１こ導入する
方法等が使用できる。
１６８ ＋ Ｉ Ｉ １（＋ ９７ ’ｊ） ； Ｂ
ｉｂｂ、 Ｍ、 Ｊ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｍ、 ａ
ｎｄＨｏｐｗｏｏｄ＋ Ｏ，Ａ、＋ Ｎａｔｕｒｅ、＋
’２７４ ＋ ３９８（］ ９７８ ） ： Ｈ
ｉｎｎｅｎ＋ Ａ、＋ Ｈｉｃｋｓ＋ Ｊ、 ’Ｂ、
ａｎｄＦｉｎｋ＋ Ｇ、 Ｒ，＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、＋Ｌ土、 １
９２９（１９７Ｂ美）、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤ
ＮＡを容易にこ取り込むプロトプラストまたはスフェロ
プラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容菌１こ導入する
方法等が使用できる。
本発明の複合プラスミドを有する宿主は以１０通り寄託
されている。
されている。
エシェリヒア・コリ ＡＪ１２００６（ＦＥＲＭ−
Ｐ （ｐ’ｌｓ”； ）シュードモナス・プチダ
ＡＪ］２００７（ＦＥＲＭ−Ｐ ｌ、、（（１−（４
，）本発明の複合プラスミドは、寄託されている微生物
細胞を対数増殖期後期まで生育させた俵リゾチーム及び
５ｏｓｔこより溶菌せしめ、３００００Ｘｒで遠心分離
して得られた上溝ｔこポリエチレングリコールを加え、
沈澱させたＤＮＡを塩化セシウム−エチジウムプロミド
平衡密度勾配遠心で分画すること？こより精製すること
ができる。
Ｐ （ｐ’ｌｓ”； ）シュードモナス・プチダ
ＡＪ］２００７（ＦＥＲＭ−Ｐ ｌ、、（（１−（４
，）本発明の複合プラスミドは、寄託されている微生物
細胞を対数増殖期後期まで生育させた俵リゾチーム及び
５ｏｓｔこより溶菌せしめ、３００００Ｘｒで遠心分離
して得られた上溝ｔこポリエチレングリコールを加え、
沈澱させたＤＮＡを塩化セシウム−エチジウムプロミド
平衡密度勾配遠心で分画すること？こより精製すること
ができる。
宿主微生物を得るために、以下のようｔこして寄託され
た微生物より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合
ブラスミ、ドな除去することが可能であるニブラスミド
は宿主より自然に失すわれることもあるし、「除去」操
作ｔこよって除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ
−＋ ａａ ＋ ｐ３６１〜４０５（１９７゛２））
。除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生育を不
完全ｒこ阻害する濃度（２−ｓｏμｆ／ｍｅ）のアクリ
ジンオレンジを含む培地に、Ｉ ｍｌ当り約１０’細胞
桿度ｒこなる様１こ少量の菌株を接種し宿主菌の生育を
不完全ｔこ阻害してから２７−３５Ｃで一夜培養する（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８８＋ ２６＋’（
＋９６４））。
た微生物より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合
ブラスミ、ドな除去することが可能であるニブラスミド
は宿主より自然に失すわれることもあるし、「除去」操
作ｔこよって除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ
−＋ ａａ ＋ ｐ３６１〜４０５（１９７゛２））
。除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生育を不
完全ｒこ阻害する濃度（２−ｓｏμｆ／ｍｅ）のアクリ
ジンオレンジを含む培地に、Ｉ ｍｌ当り約１０’細胞
桿度ｒこなる様１こ少量の菌株を接種し宿主菌の生育を
不完全ｔこ阻害してから２７−３５Ｃで一夜培養する（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８８＋ ２６＋’（
＋９６４））。
培養液を寒天培地Ｐこ塗布し、２７−４２ｃで一夜培養
する。培地上に出現したコｐ＋ニーの多くは、プラスミ
ドが除去されて可能性が高い。
する。培地上に出現したコｐ＋ニーの多くは、プラスミ
ドが除去されて可能性が高い。
実施例１
複合プラスミドｐＭＦ３０の調製過程を以下に示す。
、（１１）５ スミト（ａ）、：、して使用されたプラ
スミドＲ８Ｆ １０１０は、エシェリヒア・フリ内でス
トレプトマイシンおよびスルホンアミド耐性を発現する
分子量５．５メガダルトンのプラスミドである（ Ｎａ
ｇａｈａｒｉ＋ Ｋ、＋ ＳａＫａｇｕｃｈｉ＋ Ｋ、
＋ Ｊ。
スミドＲ８Ｆ １０１０は、エシェリヒア・フリ内でス
トレプトマイシンおよびスルホンアミド耐性を発現する
分子量５．５メガダルトンのプラスミドである（ Ｎａ
ｇａｈａｒｉ＋ Ｋ、＋ ＳａＫａｇｕｃｈｉ＋ Ｋ、
＋ Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｃａｌ＋ １３３’＋１５２７（１９
７８））。
７８））。
本実施例で用いたプラスミドＲ３ＦＩＯＩＯ）２次の方
法により調製した。
法により調製した。
蒸留水１ｔあたりバタトトリプトファン１Ｏ２１酵母エ
キス５ｆ、塩化ナトリウム５ｆを含むＬ−培地（ｐＨ７
，２）１ｔ１こプラスミドＲ３ＦＩＯＩＯを保有するエ
シェリヒア・コリの一種を対数増殖期後期まで培養し、
菌体な集めた。得られた菌体な、リゾチームとＳＤＳに
より溶菌させる簡便法？こより溶菌せしめた後、３０、
０００ ｘりで３０分間遠心分離し６４ｍ１の上澄液を
得た。上澄液中のプラスミドＤＮＡは、上澄液Ｐこポリ
エチレングリコール（最終濃度１ｏ−ｑｂ ）を添加し
沈降させた後、１０１１１１のＴＥＮ緩衝緩衝液溶解し
た。
キス５ｆ、塩化ナトリウム５ｆを含むＬ−培地（ｐＨ７
，２）１ｔ１こプラスミドＲ３ＦＩＯＩＯを保有するエ
シェリヒア・コリの一種を対数増殖期後期まで培養し、
菌体な集めた。得られた菌体な、リゾチームとＳＤＳに
より溶菌させる簡便法？こより溶菌せしめた後、３０、
０００ ｘりで３０分間遠心分離し６４ｍ１の上澄液を
得た。上澄液中のプラスミドＤＮＡは、上澄液Ｐこポリ
エチレングリコール（最終濃度１ｏ−ｑｂ ）を添加し
沈降させた後、１０１１１１のＴＥＮ緩衝緩衝液溶解し
た。
ＤＮＡをリボヌクレアーゼで処理した後（リボヌクレア
ーゼｌ ｓ ｏ μｔ／ｒｕｇで３７ｒ：、３０分間反
応）、フェノールｔこて抽出し、ついで２倍量のエタノ
ールを加え一２０ｎでＤＮＡを沈澱させ、沈澱をｌ ｍ
ｌのＴＥＮ緩衝緩衝液溶解した。
ーゼｌ ｓ ｏ μｔ／ｒｕｇで３７ｒ：、３０分間反
応）、フェノールｔこて抽出し、ついで２倍量のエタノ
ールを加え一２０ｎでＤＮＡを沈澱させ、沈澱をｌ ｍ
ｌのＴＥＮ緩衝緩衝液溶解した。
このＤＮＡ溶液を７ガロースゲル’を気泳動にかけ、ゲ
ルから約５４μ２の純粋なプラスミドＤＮＡを分離した
。
ルから約５４μ２の純粋なプラスミドＤＮＡを分離した
。
（２） プラスミド（ｂ）として使用したプラスミド
ｐＢＲ３１３はエシェリヒア・コリ内で４トラサイクリ
ンおよびアンピシリン耐性を発現する分子量５．８メガ
ダルトンのプラスミドである（ Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｆ
、＋ Ｒｏｄｒｉｇｕｃｚ＋ Ｒ，Ｌ、＋ Ｂｅｔｌａ
ｃｈ＋Ｍ、 Ｃ１Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，ｗ、ｌ Ｇｅｎａ
＋ ２ ＋ ７５（１９７７））。また、プラスミ
ド（ｂ）として使用したプラスミドｐＢＲ３２８は、エ
シェリヒア・コリ内でテトラサイクリン、アンピシリン
およびクロラムフェニコール耐性を発現する分子量３．
１５メガダルトンのプラスミドである（ Ｓｏｂｅｒｏ
ｍ＋ Ｘ、＋’Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ＋ Ｌ、＋ Ｂ
ｏｌｉｖａｒ＋Ｆ、＋Ｇｅｎｅ＋ ９． ２８７（＋
９８ｆＬ））。
ｐＢＲ３１３はエシェリヒア・コリ内で４トラサイクリ
ンおよびアンピシリン耐性を発現する分子量５．８メガ
ダルトンのプラスミドである（ Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｆ
、＋ Ｒｏｄｒｉｇｕｃｚ＋ Ｒ，Ｌ、＋ Ｂｅｔｌａ
ｃｈ＋Ｍ、 Ｃ１Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，ｗ、ｌ Ｇｅｎａ
＋ ２ ＋ ７５（１９７７））。また、プラスミ
ド（ｂ）として使用したプラスミドｐＢＲ３２８は、エ
シェリヒア・コリ内でテトラサイクリン、アンピシリン
およびクロラムフェニコール耐性を発現する分子量３．
１５メガダルトンのプラスミドである（ Ｓｏｂｅｒｏ
ｍ＋ Ｘ、＋’Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ＋ Ｌ、＋ Ｂ
ｏｌｉｖａｒ＋Ｆ、＋Ｇｅｎｅ＋ ９． ２８７（＋
９８ｆＬ））。
（３） 複合プラスミドの作成
第２図ンこ示すステップｔこより、プラスミドｐＭＦ３
０を構築した。
０を構築した。
（１） プラスミドＲ３ＦＩＯＩＯ０，２ｐｆ ｔ：
］ ユ＝７ ） （Ｄ 制限酵素ＥｃｏＲＩおよび１ユ
ニントのＰｖ’ｕ ＩＩを同時に３７ Ｃｔこて６０分
間作用せしめプラスミドＩ）ＮＡを充分分解した。
］ ユ＝７ ） （Ｄ 制限酵素ＥｃｏＲＩおよび１ユ
ニントのＰｖ’ｕ ＩＩを同時に３７ Ｃｔこて６０分
間作用せしめプラスミドＩ）ＮＡを充分分解した。
（ト） プラスミドｐＢＲ３１３０，２μ２に１ユニツ
トの制限酵素ＥｃｏＲｒおよび１ユニツトのＳｍａ ｌ
を同時に３？ｒにて６０分間作用せしめプラスミドＤＮ
Ａを充分分解した。
トの制限酵素ＥｃｏＲｒおよび１ユニツトのＳｍａ ｌ
を同時に３？ｒにて６０分間作用せしめプラスミドＤＮ
Ａを充分分解した。
（ｉｉｉ） （ｉ）と（１１）で得たＤＮＡを混合し
、制限酵素を不活化するため１こ６５Ｃ１こて１０分間
加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下に
２２ｒで２時間０．０１ユニツトのＴ、 −ＤＮＡ’）
ガーゼを作用させた。ついで反応液と６５０ｔこて１０
分間加熱してリガーゼな失活せしめた後、反応液１こ２
倍量のエタノールを加え、生成したＤＮＡの沈澱を１５
０００ｘ２．１５分間の遠心分離ｔこより回収した。こ
のようｔこして得られた複合プラスミドをトランスフオ
ーメイションＱｖ）ｒこ使用した。
、制限酵素を不活化するため１こ６５Ｃ１こて１０分間
加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下に
２２ｒで２時間０．０１ユニツトのＴ、 −ＤＮＡ’）
ガーゼを作用させた。ついで反応液と６５０ｔこて１０
分間加熱してリガーゼな失活せしめた後、反応液１こ２
倍量のエタノールを加え、生成したＤＮＡの沈澱を１５
０００ｘ２．１５分間の遠心分離ｔこより回収した。こ
のようｔこして得られた複合プラスミドをトランスフオ
ーメイションＱｖ）ｒこ使用した。
ＯＶ） エシェリヒア・コリＣ−６００（ｔｈｒ−。
ｌｅｕ ｒ ｔｈｉａｍｉｎｅ ＋ ｒ ＋ ｍ
−）（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ＋Ｍ’ａｎｄ Ｙｕａｎ＋Ｒ１
Ｎａｔｕｒｅ ２１ ？ ｒ ｌ １ ］ ０（＋
９６８））を２０ｍ１（ＱＬ−培地Ｋ ３ Ｑ ｔ：’
で対数増殖期中期まで培養し、菌体な集めた。
−）（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ＋Ｍ’ａｎｄ Ｙｕａｎ＋Ｒ１
Ｎａｔｕｒｅ ２１ ？ ｒ ｌ １ ］ ０（＋
９６８））を２０ｍ１（ＱＬ−培地Ｋ ３ Ｑ ｔ：’
で対数増殖期中期まで培養し、菌体な集めた。
Ｋｕｓｈｎｅｒ等（” Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ ” ｌ ｐ。
ｅｒｉｎｇ ” ｌ ｐ。
１ ？ （１９？’８ ）、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ／
Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｐｒｅｓｓ ）の方法ｔこ従って（Ｉｌｌ）で得ら
れたＤＮＡを用いてＣ−６００を形質転換した。
Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｐｒｅｓｓ ）の方法ｔこ従って（Ｉｌｌ）で得ら
れたＤＮＡを用いてＣ−６００を形質転換した。
形質転換株は２０μｔ ／ｍｌのテトラサイクリン２０
μ？およびスルホンアミド５０μ２ を含むし一培地で
３７０にて、２４時間培養し選択した。形質転換株の中
からＡＪ！２００４（ＦＥＲＭ７Ｐ ら９０ ）を選
択し、次の実験１こ用いた。
μ？およびスルホンアミド５０μ２ を含むし一培地で
３７０にて、２４時間培養し選択した。形質転換株の中
からＡＪ！２００４（ＦＥＲＭ７Ｐ ら９０ ）を選
択し、次の実験１こ用いた。
（ｖ） Ｏｖ）で得た形質転換株ＡＪ１２００４より
、テトラサイクリン耐性およびスルホンアミド耐性を発
現し、分子量６．２メガダルトンのプラスミドｐＭＦ１
０をｆｌ）と同様な方法？こより３５μｍ調製した。
、テトラサイクリン耐性およびスルホンアミド耐性を発
現し、分子量６．２メガダルトンのプラスミドｐＭＦ１
０をｆｌ）と同様な方法？こより３５μｍ調製した。
（ｖＤ プラスミドｐＭＦ １０ ０．２ ｐ？ ｔ
−制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔ ｌの１ユニツトを
同時ｔこ３７１１１？ｔこて６０分間作用せしめ、プラ
スミドＤＮＡを充分分解した。また、プラスミドｐＢＲ
３２８０，２，１ｌｆｔこＢａｍＨｌおよびＰｓｔ■を
各々１ユニツトを同時に３７１Ｚ’にて６０分間作用せ
しめプラスミドを充分分解した。
−制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔ ｌの１ユニツトを
同時ｔこ３７１１１？ｔこて６０分間作用せしめ、プラ
スミドＤＮＡを充分分解した。また、プラスミドｐＢＲ
３２８０，２，１ｌｆｔこＢａｍＨｌおよびＰｓｔ■を
各々１ユニツトを同時に３７１Ｚ’にて６０分間作用せ
しめプラスミドを充分分解した。
（ｕｉ 、（Ｖｌｌで得た両ＤＮＡを混合し、（１ｉｉ
）と同様の方法で複合プラスミドを得た。
）と同様の方法で複合プラスミドを得た。
９１ｉ） ６／ｌｌで得られた複合プラスミド翰と同
様の方法ｔこよりてＣ−６００を形質転換し、クロラム
フェニコール（２０μｔ／ｍｅ ） 、テトラサイクリ
ン（２０μｙ／ｍｌ ）耐性を有するＡＪ＋２００５（
ＦＥＲＭ−Ｐ ｆ）ｑｋ；、ｂ ）を得た。
様の方法ｔこよりてＣ−６００を形質転換し、クロラム
フェニコール（２０μｔ／ｍｅ ） 、テトラサイクリ
ン（２０μｙ／ｍｌ ）耐性を有するＡＪ＋２００５（
ＦＥＲＭ−Ｐ ｆ）ｑｋ；、ｂ ）を得た。
４Ｘ） ９１１で得た形質転換株ＡＪ＋２００５より
クロラムフェニコール耐性およびテトラサイクリン耐性
を発現し、分子量７．２メガダルトンのプラスミドＩ）
ＭＦ ２ｏを（＋１と同様な方法により３８μ２調製し
た。
クロラムフェニコール耐性およびテトラサイクリン耐性
を発現し、分子量７．２メガダルトンのプラスミドＩ）
ＭＦ ２ｏを（＋１と同様な方法により３８μ２調製し
た。
（×） プラスミドｐＭＦ２０ ０．２μ２に制限酵
素Ｐｓｔ ｌを１ユニット加え、３７Ｃにて６０分間作
用させ、プラスミドＤＮＡを充分ニ分解した。一方、プ
ラスミドｐＢＲ３１３０，２μ°２に同じ（Ｐｓｔ Ｉ
を１ユニット加え、同様１こプラスミドＤＮＡを充分に
分解した。
素Ｐｓｔ ｌを１ユニット加え、３７Ｃにて６０分間作
用させ、プラスミドＤＮＡを充分ニ分解した。一方、プ
ラスミドｐＢＲ３１３０，２μ°２に同じ（Ｐｓｔ Ｉ
を１ユニット加え、同様１こプラスミドＤＮＡを充分に
分解した。
伏Ｉｔ （Ｘ）で得た両ＤＮＡを混合し、（１１０と
同様の方法で複合プラスミドを得た。（ＸＤで得た複合
プラスミドをＯｖ）と同様な方法１こよってＣ−６００
を形質転換し、アンピンリン（１００ｐ ｆ ／ｍｅ
）、クロラムフｗ 二＝＋−ル（２０μｆ／ｍｅ ）お
よびテトラサイクリン（２０ｐｙ／ＩＩＩｔ）耐性のＡ
ＪＩ２００６を得た。
同様の方法で複合プラスミドを得た。（ＸＤで得た複合
プラスミドをＯｖ）と同様な方法１こよってＣ−６００
を形質転換し、アンピンリン（１００ｐ ｆ ／ｍｅ
）、クロラムフｗ 二＝＋−ル（２０μｆ／ｍｅ ）お
よびテトラサイクリン（２０ｐｙ／ＩＩＩｔ）耐性のＡ
ＪＩ２００６を得た。
ｋｌｌｌ 〆Ｄで得た形質転換株ＡＪ１２００６より
、アンピシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサ
イクリン耐性を発現し、分子量８．５メガダルトンの複
合プラスミドｐＭＦ３０を（１）と同様な方法を用いて
４２μ２調製した。このｐＭＦ３０が目的とする複合プ
ラスミドであり、この調製過程を第２図に示した。
、アンピシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサ
イクリン耐性を発現し、分子量８．５メガダルトンの複
合プラスミドｐＭＦ３０を（１）と同様な方法を用いて
４２μ２調製した。このｐＭＦ３０が目的とする複合プ
ラスミドであり、この調製過程を第２図に示した。
（４） ｐＭＦ３０のエシェリヒア・コリ、シュード
モナス・プチダ１こおける発現、プラスミドｐＭＦ３０
を届いてステップ（３）−（ＩＶ）に記載した方法に従
って、エシェリヒア。コリＣ−６ｏｏ１ンユードモナス
・プチダＰｐＹ−１０１を形質転換し、アンピシリンお
よびテトラザイクリンを各々１００ μ？／ｍｅ、
２０１ｉｆ／ｍｌ、 ２０ ｐ？／ｍｌ含むＬ−培地
ｅこ塗布し、３０ｔ：で３日間培養したところ、多数の
ニーニーが出現した。そこでこれらのフロニーＰこプラ
スミドが存在することを確認するためンこシュードモナ
スおよび工／エリヒアの耐性株を各々５株ずつ選択して
、溶菌上清を調製し、プラスミドの検出を行なったとこ
ろ、ｐＭＦ３０と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つ
プラスミドを認めた。
モナス・プチダ１こおける発現、プラスミドｐＭＦ３０
を届いてステップ（３）−（ＩＶ）に記載した方法に従
って、エシェリヒア。コリＣ−６ｏｏ１ンユードモナス
・プチダＰｐＹ−１０１を形質転換し、アンピシリンお
よびテトラザイクリンを各々１００ μ？／ｍｅ、
２０１ｉｆ／ｍｌ、 ２０ ｐ？／ｍｌ含むＬ−培地
ｅこ塗布し、３０ｔ：で３日間培養したところ、多数の
ニーニーが出現した。そこでこれらのフロニーＰこプラ
スミドが存在することを確認するためンこシュードモナ
スおよび工／エリヒアの耐性株を各々５株ずつ選択して
、溶菌上清を調製し、プラスミドの検出を行なったとこ
ろ、ｐＭＦ３０と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つ
プラスミドを認めた。
第１図は複合プラスミドｐＭＦ３０の制限酵素切断地図
を示す。 第２図は複合プラスミドｐＭＦ３０の調製過程を示す説
明図である。 特許出願人 味の素株式会社 第１図 Ｅｃｏ Ｒ工 第 ２ 図
を示す。 第２図は複合プラスミドｐＭＦ３０の調製過程を示す説
明図である。 特許出願人 味の素株式会社 第１図 Ｅｃｏ Ｒ工 第 ２ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１７ユードモナス属ｔこ属する微生物の細胞内で自
律複製可能なプラスミド（ａ）のドライブ・ユニット領
域を含むＤＮＡ（Ａ：とエシェリヒア属に属する微生物
の細胞内で自律複製可能なプラスミド（ｂ）のドライブ
・ユニット領域を含むＤＮＡ（Ｂ）及びシュードモナス
属１こ属する微生物にアンピシリン及びテトラサイクリ
ン１こ対し耐性を付与することができる遺伝子領域を含
むＤ Ｎ Ａ （Ｃ）とよりなる複合プラスミド。 （２）分子量が８．５メガダルトンであり、制限酵素１
こより切断される個所がＰｓｔ Ｔ、Ｓａｌ ｌ５Ｐｖ
ｕ ｆＪ、ＥｃｏＲｌおよび３ａｍＨＩにおいてそれぞ
れ２，１，１．１および１であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の複合プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038040A JPS59162885A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | 複合プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038040A JPS59162885A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | 複合プラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162885A true JPS59162885A (ja) | 1984-09-13 |
Family
ID=12514415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58038040A Pending JPS59162885A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | 複合プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162885A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6279786A (ja) * | 1985-10-01 | 1987-04-13 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− |
| US5292922A (en) * | 1990-08-22 | 1994-03-08 | Central Glass Company, Limited | N-acyl-N-phenyltetrahydrophthalamic acid derivatives, methods of producing same, and herbicides containing same as effective components |
-
1983
- 1983-03-08 JP JP58038040A patent/JPS59162885A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6279786A (ja) * | 1985-10-01 | 1987-04-13 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 安全性の高い多機能クロ−ニングベクタ− |
| EP0218468A2 (en) * | 1985-10-01 | 1987-04-15 | Banyu Seiyaku Kabushiki Kaisha | Safe, versatile cloning vector |
| EP0218468A3 (en) * | 1985-10-01 | 1988-08-10 | Banyu Seiyaku Kabushiki Kaisha | Safe, versatile cloning vector |
| US5292922A (en) * | 1990-08-22 | 1994-03-08 | Central Glass Company, Limited | N-acyl-N-phenyltetrahydrophthalamic acid derivatives, methods of producing same, and herbicides containing same as effective components |
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