JP2540677B2 - 新規なｄｎａ断片、これを組み込んだプラスミドｄｎａ及び微生物検出方法 - Google Patents
新規なｄｎａ断片、これを組み込んだプラスミドｄｎａ及び微生物検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセルロース分解菌である
中高熱性絶対嫌気性桿菌クロストリジウム・ジョースイ
の染色体ＤＮＡの一部であり、大腸菌等の微生物細胞中
で、４００ｎｍ付近の光を照射することにより蛍光を発
する物質の高度な生産又は蓄積をもたらす新規なＤＮＡ
断片、これを組み込んだプラスミドＤＮＡおよび前記Ｄ
ＮＡ断片またはプラスミドＤＮＡにより形質転換された
微生物体内に生産または蓄積された物質を標識とする微
生物検出方法に関するものである。
中高熱性絶対嫌気性桿菌クロストリジウム・ジョースイ
の染色体ＤＮＡの一部であり、大腸菌等の微生物細胞中
で、４００ｎｍ付近の光を照射することにより蛍光を発
する物質の高度な生産又は蓄積をもたらす新規なＤＮＡ
断片、これを組み込んだプラスミドＤＮＡおよび前記Ｄ
ＮＡ断片またはプラスミドＤＮＡにより形質転換された
微生物体内に生産または蓄積された物質を標識とする微
生物検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
子工学の分野において、種々の抗生物質耐性遺伝子やβ
−ガラクトシダーゼ等の酵素遺伝子を遺伝子組み換え菌
の検出マーカーとして使用する微生物検出方法が行われ
ている。これらの方法では、微生物生育用培地に標識物
質となる抗生物質又は発色基質を添加し、これらの物質
を微生物体内に取り込ませることが必須となっている。
また、これらの抗生物質または発色基質は、高価であ
り、毒性を持つものも多く危険であり、取扱が容易では
なかった。
子工学の分野において、種々の抗生物質耐性遺伝子やβ
−ガラクトシダーゼ等の酵素遺伝子を遺伝子組み換え菌
の検出マーカーとして使用する微生物検出方法が行われ
ている。これらの方法では、微生物生育用培地に標識物
質となる抗生物質又は発色基質を添加し、これらの物質
を微生物体内に取り込ませることが必須となっている。
また、これらの抗生物質または発色基質は、高価であ
り、毒性を持つものも多く危険であり、取扱が容易では
なかった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上述の状況を背景とし
て、本発明者らは、セルロース分解菌として本発明者ら
が発見した中高熱性絶対嫌気性桿菌クロストリジウム・
ジョースイが、波長４００ｎｍ付近の光の照射により蛍
光を発する物質を生産または蓄積していることを発見
し、クロストリジウム・ジョースイの培養液上清からこ
の蛍光物質を分離することに成功した。さらに、この蛍
光物質について、照射光の波長を様々に変化させての照
射−蛍光反応実験を繰り返し、蛍光を発生させる照射光
の良好な波長域が３６５ｎｍ〜４３０ｎｍであることを
確認するとともに、この蛍光物質を生産または蓄積し得
るポリペプチドの遺伝情報を担っているＤＮＡ断片を、
クロストリジウム・ジョースイから分離し、ベクターに
組み込むことに成功し、本発明を完成するに至った。
て、本発明者らは、セルロース分解菌として本発明者ら
が発見した中高熱性絶対嫌気性桿菌クロストリジウム・
ジョースイが、波長４００ｎｍ付近の光の照射により蛍
光を発する物質を生産または蓄積していることを発見
し、クロストリジウム・ジョースイの培養液上清からこ
の蛍光物質を分離することに成功した。さらに、この蛍
光物質について、照射光の波長を様々に変化させての照
射−蛍光反応実験を繰り返し、蛍光を発生させる照射光
の良好な波長域が３６５ｎｍ〜４３０ｎｍであることを
確認するとともに、この蛍光物質を生産または蓄積し得
るポリペプチドの遺伝情報を担っているＤＮＡ断片を、
クロストリジウム・ジョースイから分離し、ベクターに
組み込むことに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００４】なお、クロストリジウム・ジョースイの形
態学的性質、生理的性質は下記のとおりで、従来公知の
いかなるセルロース分解菌とも異なっているため新種と
同定したものであり、詳細は"International Journal o
f Systematic Bacteriology,1988,Vol.38,179-182"に発
表されている。 〈形態学的性質〉 菌形 ：短桿菌、または長桿菌（０．２〜０．３ｘ３〜５μｍ） 運動性 ：無し グラム染色：グラム陽性（ヤングセル） 胞子形成 ：有り（卵型、０．４〜０．５μｍ） 〈生理的性質〉 増殖温度 ：２５〜６０℃ 最適増殖温度 ：４５℃ 増殖ｐＨ ：４．５〜８．０ 最適増殖ｐＨ ：７．０ 酸素要求 ：絶対嫌気性 グアニン＋シトシン含有率：４０％ ゼラチンの液化：無し 澱粉分解性 ：無し アビセル分解性：有り 糖の発酵性 ： （１）アドニトール、アミグダリン、胆汁、ズルシトー
ル、デキストリン、 エリスリトール、フルクトース、ガ
ラクトース、グリセロール、グリ コーゲン、イノシトー
ル、イヌリン、ラムノース、サリシン、マンニ トール、
マンノース、メレジトース、ペクチン、ラフィノース、
ソル ビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース
から酸を生成しな い。
態学的性質、生理的性質は下記のとおりで、従来公知の
いかなるセルロース分解菌とも異なっているため新種と
同定したものであり、詳細は"International Journal o
f Systematic Bacteriology,1988,Vol.38,179-182"に発
表されている。 〈形態学的性質〉 菌形 ：短桿菌、または長桿菌（０．２〜０．３ｘ３〜５μｍ） 運動性 ：無し グラム染色：グラム陽性（ヤングセル） 胞子形成 ：有り（卵型、０．４〜０．５μｍ） 〈生理的性質〉 増殖温度 ：２５〜６０℃ 最適増殖温度 ：４５℃ 増殖ｐＨ ：４．５〜８．０ 最適増殖ｐＨ ：７．０ 酸素要求 ：絶対嫌気性 グアニン＋シトシン含有率：４０％ ゼラチンの液化：無し 澱粉分解性 ：無し アビセル分解性：有り 糖の発酵性 ： （１）アドニトール、アミグダリン、胆汁、ズルシトー
ル、デキストリン、 エリスリトール、フルクトース、ガ
ラクトース、グリセロール、グリ コーゲン、イノシトー
ル、イヌリン、ラムノース、サリシン、マンニ トール、
マンノース、メレジトース、ペクチン、ラフィノース、
ソル ビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース
から酸を生成しな い。
【０００５】（２）ラクトース、メリビオースから少量
の酸を生成する。 （３）アラビノース、セロビオース、エスキュリン、グ
ルコース、マルトー ス、リボース、キシロース、キシラ
ンから酸を生成する。 ブドウ糖から酸の生成：酢酸、エ
タノール、プロピオン酸、酪酸を生成する。
の酸を生成する。 （３）アラビノース、セロビオース、エスキュリン、グ
ルコース、マルトー ス、リボース、キシロース、キシラ
ンから酸を生成する。 ブドウ糖から酸の生成：酢酸、エ
タノール、プロピオン酸、酪酸を生成する。
【０００６】このクロストリジウム・ジョースイ由来の
ＤＮＡ断片に関わる本発明の要旨は、以下に記すところ
にある。 請求項１記載の発明は、クロストリジウム・ジ
ョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）（微
工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記の制
限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰｓｔ
Ｉサイト（１）および該ＰｓｔＩサイト（１）からＰｓ
ｔＩサイト（２）側へ１．１ｋｂｐの位置で切断して得
られる１．１ｋｂｐの断片と同じ塩基配列を含み、波長
３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により蛍光を発する
物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を担うＤＮＡ
断片である。
ＤＮＡ断片に関わる本発明の要旨は、以下に記すところ
にある。 請求項１記載の発明は、クロストリジウム・ジ
ョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）（微
工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記の制
限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰｓｔ
Ｉサイト（１）および該ＰｓｔＩサイト（１）からＰｓ
ｔＩサイト（２）側へ１．１ｋｂｐの位置で切断して得
られる１．１ｋｂｐの断片と同じ塩基配列を含み、波長
３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により蛍光を発する
物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を担うＤＮＡ
断片である。
【０００７】
【化４】
【０００８】ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
【０００９】請求項２記載の発明は、クロストリジウム
・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）
（微工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体
ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記
の制限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰ
ｓｔＩサイト（１）およびＰｓｔＩサイト（２）で切断
して得られる２．３ｋｂｐの断片と同じ塩基配列を含
み、波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により蛍光
を発する物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を担
うＤＮＡ断片である。
・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）
（微工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体
ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記
の制限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰ
ｓｔＩサイト（１）およびＰｓｔＩサイト（２）で切断
して得られる２．３ｋｂｐの断片と同じ塩基配列を含
み、波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により蛍光
を発する物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を担
うＤＮＡ断片である。
【００１０】
【化５】
【００１１】ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
【００１２】請求項３記載の発明は、クロストリジウム
・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）
（微工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体
ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記
の制限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片であ
って、波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により 蛍
光を発する物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を
担うＤＮＡ断片。
・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）
（微工研寄託 第ＦＥＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体
ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにて部分分解して分離される下記
の制限酵素地図を有する６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片であ
って、波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光の照射により 蛍
光を発する物質の生産または蓄積をもたらす遺伝情報を
担うＤＮＡ断片。
【００１３】
【化６】
【００１４】ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
制限酵素を示す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。
【００１５】請求項４記載のプラスミドＤＮＡは、請求
項１ないし３のいずれか記載のＤＮＡ断片をベクターに
組み込んだことを特徴とする。 請求項５記載のプラスミ
ドＤＮＡは、請求項４記載のプラスミドＤＮＡにおいて
ベクターがｐＢＲ３２２であることを特徴とする。
項１ないし３のいずれか記載のＤＮＡ断片をベクターに
組み込んだことを特徴とする。 請求項５記載のプラスミ
ドＤＮＡは、請求項４記載のプラスミドＤＮＡにおいて
ベクターがｐＢＲ３２２であることを特徴とする。
【００１６】請求項６記載の微生物検出方法は、請求項
１ないし３のいずれか記載のＤＮＡ断片または請求項４
もしくは請求項５記載のプラスミドＤＮＡで微生物を形
質転換することによりこの微生物体内に生産または蓄積
された物質で該微生物を標識し、該微生物に波長３６５
ｎｍ〜４３０ｎｍの光を照射し、該照射による蛍光によ
って前記物質で標識された微生物を検出することを特徴
とする。
１ないし３のいずれか記載のＤＮＡ断片または請求項４
もしくは請求項５記載のプラスミドＤＮＡで微生物を形
質転換することによりこの微生物体内に生産または蓄積
された物質で該微生物を標識し、該微生物に波長３６５
ｎｍ〜４３０ｎｍの光を照射し、該照射による蛍光によ
って前記物質で標識された微生物を検出することを特徴
とする。
【００１７】以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明で使用するクロストリジウム・ジョースイはＣｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の中高熱性絶対嫌気性桿菌であっ
て、その形態学的性質並びに生理的性質は前 述のとおり
である。
本発明で使用するクロストリジウム・ジョースイはＣｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の中高熱性絶対嫌気性桿菌であっ
て、その形態学的性質並びに生理的性質は前 述のとおり
である。
【００１８】クロストリジウム・ジョースイは、培地で
育成された後、集菌される。培地は、例えば、グルコー
ス、セロビオース、ボールミルドセルロース、稲わら、
とうもろこしの皮などを含む培地であれば特に限定され
ないが、染色体ＤＮＡ調製操作を容易にする為にはグル
コース培地が好ましい。
育成された後、集菌される。培地は、例えば、グルコー
ス、セロビオース、ボールミルドセルロース、稲わら、
とうもろこしの皮などを含む培地であれば特に限定され
ないが、染色体ＤＮＡ調製操作を容易にする為にはグル
コース培地が好ましい。
【００１９】集菌されたクロストリジウム・ジョースイ
から、染色体ＤＮＡが調製される。染色体ＤＮＡの調製
は、既知のいずれの方法によってもなすことができる。
調製された染色体ＤＮＡは、切断され、ＤＮＡ断片とさ
れる。該ＤＮＡ断片は、別途切断調製されたベクターと
混合されリゲーションされ、プラスミドＤＮＡが構築さ
れる。染色体ＤＮＡ及びベクターの切断方法は特に限定
されないが、リゲーションのためには、同一の制限酵素
を用いるのが好ましい。また、ベクターをアルカリフォ
スファターゼ処理をすると効率を上げることができる。
リゲーション反応は通常１２℃〜１６℃、３０分〜６０
分で完了する。
から、染色体ＤＮＡが調製される。染色体ＤＮＡの調製
は、既知のいずれの方法によってもなすことができる。
調製された染色体ＤＮＡは、切断され、ＤＮＡ断片とさ
れる。該ＤＮＡ断片は、別途切断調製されたベクターと
混合されリゲーションされ、プラスミドＤＮＡが構築さ
れる。染色体ＤＮＡ及びベクターの切断方法は特に限定
されないが、リゲーションのためには、同一の制限酵素
を用いるのが好ましい。また、ベクターをアルカリフォ
スファターゼ処理をすると効率を上げることができる。
リゲーション反応は通常１２℃〜１６℃、３０分〜６０
分で完了する。
【００２０】前記プラスミドＤＮＡを、別途調製された
コンピテントセルに受容させ、形質転換菌を得る。コン
ピテントセルは大腸菌、枯草菌、酵母などが使用でき
る。また、コンピテントセルの調製は、塩化カルシウム
処理法、プロトプラスト法など従来知られている如何な
る方法でも可能である。
コンピテントセルに受容させ、形質転換菌を得る。コン
ピテントセルは大腸菌、枯草菌、酵母などが使用でき
る。また、コンピテントセルの調製は、塩化カルシウム
処理法、プロトプラスト法など従来知られている如何な
る方法でも可能である。
【００２１】この形質転換菌の体内にて、前記プラスミ
ドＤＮＡは自己複製し、増殖する。前記形質転換菌か
ら、蛍光物質を生産または蓄積する形質を有する菌が検
出され、培養され、集菌される。蛍光物質を生産または
蓄積する形質転換菌の検出方法は特に限定されないが、
波長域に３６５ｎｍ〜４３０ｎｍを含む紫外線ランプに
よる照射にともなう蛍光で検出するのが簡便である。
ドＤＮＡは自己複製し、増殖する。前記形質転換菌か
ら、蛍光物質を生産または蓄積する形質を有する菌が検
出され、培養され、集菌される。蛍光物質を生産または
蓄積する形質転換菌の検出方法は特に限定されないが、
波長域に３６５ｎｍ〜４３０ｎｍを含む紫外線ランプに
よる照射にともなう蛍光で検出するのが簡便である。
【００２２】培養は、形質転換菌の生育に適した種々の
培地で可能である。コンピテントセルが大腸菌の場合
は、その後の操作が容易であることから、ＬＢ（Ｌｕｒ
ｉａＢｅｒｔａｎｉ）培地でなされるのが望ましい。ま
た、集菌は遠心法によるのが簡便である。
培地で可能である。コンピテントセルが大腸菌の場合
は、その後の操作が容易であることから、ＬＢ（Ｌｕｒ
ｉａＢｅｒｔａｎｉ）培地でなされるのが望ましい。ま
た、集菌は遠心法によるのが簡便である。
【００２３】集菌された形質転換菌からプラスミドＤＮ
Ａが抽出・精製される。この抽出・精製は、溶菌−遠心
分離−塩化セシウム密度勾配遠心分離の常法によって行
うことができる。こうして得られたプラスミドＤＮＡを
受容させ形質転換した大腸菌に、波長３６５ｎｍ〜４３
０ｎｍの紫外線を照射し、これにより大腸菌が蛍光を発
することで、該プラスミドＤＮＡが、蛍光物質の生産ま
たは蓄積をもたらす遺伝情報をになっていることが確認
される。
Ａが抽出・精製される。この抽出・精製は、溶菌−遠心
分離−塩化セシウム密度勾配遠心分離の常法によって行
うことができる。こうして得られたプラスミドＤＮＡを
受容させ形質転換した大腸菌に、波長３６５ｎｍ〜４３
０ｎｍの紫外線を照射し、これにより大腸菌が蛍光を発
することで、該プラスミドＤＮＡが、蛍光物質の生産ま
たは蓄積をもたらす遺伝情報をになっていることが確認
される。
【００２４】前記プラスミドＤＮＡにより形質転換され
た形質転換菌においては、該ＤＮＡの関与により該形質
転換菌が生産または蓄積した物質が、波長３６５ｎｍ〜
４３０ｎｍの光の照射によって蛍光を発するため、この
物質を標識として、他の菌と区別が可能となる。
た形質転換菌においては、該ＤＮＡの関与により該形質
転換菌が生産または蓄積した物質が、波長３６５ｎｍ〜
４３０ｎｍの光の照射によって蛍光を発するため、この
物質を標識として、他の菌と区別が可能となる。
【００２５】照射する光の波長が３６５ｎｍ〜４３０ｎ
ｍの範囲外となることで、直ちに蛍光を発しなくなるわ
けではないが、蛍光は微弱なものとなり検知が困難とな
ってくる。
ｍの範囲外となることで、直ちに蛍光を発しなくなるわ
けではないが、蛍光は微弱なものとなり検知が困難とな
ってくる。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明のＤＮＡ断片、プラスミドＤ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡによる形質転換菌並びにこれら
の調製および前記ＤＮＡにより形質転換された微生物の
体内に生産または蓄積された蛍光物質を標識とする微生
物検出方法について、本発明の一実施例により説明す
る。 （１）クロストリジウム・ジョースイからの染色体ＤＮ
Ａの調製。
ＮＡ、プラスミドＤＮＡによる形質転換菌並びにこれら
の調製および前記ＤＮＡにより形質転換された微生物の
体内に生産または蓄積された蛍光物質を標識とする微生
物検出方法について、本発明の一実施例により説明す
る。 （１）クロストリジウム・ジョースイからの染色体ＤＮ
Ａの調製。
【００２７】クロストリジウム・ジョースイを、下記の
グルコース培地をｐＨ７．０に調製して、ＣＯ2 ガスを
３０分間通気した後、１１０℃、１０分間オートクレー
ブにて加熱処理した培地５００ｍｌに植菌し、４５℃で
８時間培養し、対数増殖前期の菌体約０．５ｇを冷却遠
心分離機にて集菌した。
グルコース培地をｐＨ７．０に調製して、ＣＯ2 ガスを
３０分間通気した後、１１０℃、１０分間オートクレー
ブにて加熱処理した培地５００ｍｌに植菌し、４５℃で
８時間培養し、対数増殖前期の菌体約０．５ｇを冷却遠
心分離機にて集菌した。
【００２８】 ＤＮＡ分離用グルコース培地 培地組成 １００ｍｌ中 ミネラル溶液Ｉ ７．５ｍｌ ミネラル溶液ＩＩ ７．５ｍｌ ＶＦＡ ０．３１ｍｌ ０．１％レサズリン溶液 ０．１ｍｌ 酵母エキス ０．１ｇ グルコース １．０ｇ Ｎａ2ＣＯ3 ０．５ｇ ２．５％システイン溶液 １．０ｍｌ ミネラル溶液Ｉ組成 成分 ５００ｇ中 Ｋ2ＨＰＯ4 ３．０ｇ Ｈ2Ｏ ４９７ｍｌ ミネラル溶液ＩＩ組成 成分 ５００ｇ中 ＫＨ2ＰＯ4 ３．０ｇ ＮａＣｌ ６．０ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ６．０ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．６ｇ ＣａＣｌ2 ０．６ｇ Ｈ2Ｏ ４８３．８ｍｌ ＶＦＡ組成 成分 ３１ｍｌ中 酢酸 １７ｍｌ プロピオン酸 ６ｍｌ ｎ−酪酸 ４ｍｌ ｉｓｏ−酪酸 １ｍｌ ｎ−バレリン酸 １ｍｌ ＤＬ−２−メチル酪酸 １ｍｌ ｉｓｏ−バレリン酸 １ｍｌ 集菌された菌体をｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ（０．５Ｍ
ＮａＣｌ，０．１ＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０ ）で洗浄し
た後、０．５ｍｌのｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡに懸濁し
た。この懸濁液に１ｍｇのリゾチームを加え攪拌し、３
７℃で１０分間静置した後、１０ｍｌのトリス−ＳＤＳ
−バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，１％ＳＤＳ，０．
１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ９．０）を加え６０℃で５分間保
持し溶菌させた。
ＮａＣｌ，０．１ＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０ ）で洗浄し
た後、０．５ｍｌのｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡに懸濁し
た。この懸濁液に１ｍｇのリゾチームを加え攪拌し、３
７℃で１０分間静置した後、１０ｍｌのトリス−ＳＤＳ
−バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，１％ＳＤＳ，０．
１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ９．０）を加え６０℃で５分間保
持し溶菌させた。
【００２９】これにトリス−ＳＤＳ−フェノール（再蒸
溜フェノールをトリス−ＳＤＳ−バッファーに飽和させ
たもの）を１０．５ｍｌ加え、０℃で２０分間静置した
後、１５００×ｇ、１０分間遠心分離してクリアードラ
イゼートを得た。このクリアードライゼートに２１ｍｌ
の冷エタノールを加えた後、糸状の染色体ＤＮＡを減菌
したガラスロッドでまきとり減菌水に溶かし、濃度５０
０μｇ／ｍｌとした。
溜フェノールをトリス−ＳＤＳ−バッファーに飽和させ
たもの）を１０．５ｍｌ加え、０℃で２０分間静置した
後、１５００×ｇ、１０分間遠心分離してクリアードラ
イゼートを得た。このクリアードライゼートに２１ｍｌ
の冷エタノールを加えた後、糸状の染色体ＤＮＡを減菌
したガラスロッドでまきとり減菌水に溶かし、濃度５０
０μｇ／ｍｌとした。
【００３０】このＤＮＡ溶液に、１００℃で１５分間加
熱しデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を失活さ
せた、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａを最終濃度５
０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間保持
し、共存するＲＮＡを分解した。
熱しデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を失活さ
せた、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａを最終濃度５
０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間保持
し、共存するＲＮＡを分解した。
【００３１】その後、トリス−ＳＤＳ−フェノールで処
理してリボヌクレアーゼＡの反応を止め、エタノール沈
澱を行い、更にエタノールリンスした後、沈澱を真空乾
燥し、適当量の減菌水に溶かして純粋な染色体ＤＮＡを
得た。 （２）染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの切断 （１）で得られた染色体ＤＮＡにＳａｕ３ＡＩを加え、
３７℃で１時間反応させ部分分解した後、０．８％アガ
ロースゲルで電気泳動し、その約３〜１０ｋｂｐの断片
を、透析チューブ内にて溶出後、フェノール処理、エー
テル処理、エタノール沈澱し回収した。回収した染色体
ＤＮＡは、１２０℃で１０分間オートクレーブ処理した
蒸留水に溶解させた。
理してリボヌクレアーゼＡの反応を止め、エタノール沈
澱を行い、更にエタノールリンスした後、沈澱を真空乾
燥し、適当量の減菌水に溶かして純粋な染色体ＤＮＡを
得た。 （２）染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの切断 （１）で得られた染色体ＤＮＡにＳａｕ３ＡＩを加え、
３７℃で１時間反応させ部分分解した後、０．８％アガ
ロースゲルで電気泳動し、その約３〜１０ｋｂｐの断片
を、透析チューブ内にて溶出後、フェノール処理、エー
テル処理、エタノール沈澱し回収した。回収した染色体
ＤＮＡは、１２０℃で１０分間オートクレーブ処理した
蒸留水に溶解させた。
【００３２】染色体ＤＮＡの切断は、Ｓａｕ３ＡＩの
他、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素によってもよ
く、また、ホモジナイザー等で物理的に切断してもよ
い。染色体ＤＮＡとは別に、ベクターＤＮＡの切断も行
われた。本実施例ではベクターとして大腸菌内で複製可
能なプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いた。このｐＢ
Ｒ３２２をＢａｍＨＩで同様に完全分解し、アルカリフ
ォスファターゼで処理後、フェノール処理、エーテル処
理、エタノール沈澱し回収した。回収したベクターＤＮ
Ａは、１２０℃で１０分間オートクレーブ処理した蒸留
水に溶解させた。
他、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素によってもよ
く、また、ホモジナイザー等で物理的に切断してもよ
い。染色体ＤＮＡとは別に、ベクターＤＮＡの切断も行
われた。本実施例ではベクターとして大腸菌内で複製可
能なプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いた。このｐＢ
Ｒ３２２をＢａｍＨＩで同様に完全分解し、アルカリフ
ォスファターゼで処理後、フェノール処理、エーテル処
理、エタノール沈澱し回収した。回収したベクターＤＮ
Ａは、１２０℃で１０分間オートクレーブ処理した蒸留
水に溶解させた。
【００３３】ベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＡＣＹＣ１８４等、公知のいかなるプラスミドも
使用できる。また、ベクターＤＮＡの切断は、ＢａｍＨ
Ｉの他、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素によっても
よい。アルカリフォスファターゼ処理は不可欠ではない
が、これを行うと効率を上げることができる。 （３）ベクターへの染色体ＤＮＡ断片の組み込み （２）で得られた染色体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮ
Ａを、およそ１：２の重量比で混合し、Ｔ4 リガーゼを
用い１６℃で１時間反応させた。リゲーション反応が完
全に行われ、ＤＮＡサイズが約７〜１４ｋｂとなったこ
とが、アガロースゲル電気泳動により確認された。 （４）コンピテントセルの調製 本実施例ではコンピテントセルとして大腸菌ＨＢ１０１
株を用いた。ＨＢ１０１をＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔ
ａｎｉ）培地に植菌し３７℃で一晩培養した。これより
１ｍｌを採り、新たなＬＢ培地１００ｍｌに植菌した。
培養液の濁度がＯＤ600 ＝０．４となったところで冷却
遠心分離機で集菌し塩化カルシウム処理を行い、８ｍｌ
のコンピテントセルを得た。
９、ｐＡＣＹＣ１８４等、公知のいかなるプラスミドも
使用できる。また、ベクターＤＮＡの切断は、ＢａｍＨ
Ｉの他、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素によっても
よい。アルカリフォスファターゼ処理は不可欠ではない
が、これを行うと効率を上げることができる。 （３）ベクターへの染色体ＤＮＡ断片の組み込み （２）で得られた染色体ＤＮＡ断片およびベクターＤＮ
Ａを、およそ１：２の重量比で混合し、Ｔ4 リガーゼを
用い１６℃で１時間反応させた。リゲーション反応が完
全に行われ、ＤＮＡサイズが約７〜１４ｋｂとなったこ
とが、アガロースゲル電気泳動により確認された。 （４）コンピテントセルの調製 本実施例ではコンピテントセルとして大腸菌ＨＢ１０１
株を用いた。ＨＢ１０１をＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔ
ａｎｉ）培地に植菌し３７℃で一晩培養した。これより
１ｍｌを採り、新たなＬＢ培地１００ｍｌに植菌した。
培養液の濁度がＯＤ600 ＝０．４となったところで冷却
遠心分離機で集菌し塩化カルシウム処理を行い、８ｍｌ
のコンピテントセルを得た。
【００３４】コンピテントセルとしては、大腸菌の他に
枯草菌、酵母などが使用できる。また、コンピテントセ
ルの調製は、塩化カルシウム処理法に限らず、プロトプ
ラスト法など、従来知られている方法でも可能である。 （５）コンピテントセルの形質転換 （４）にて調製されたコンピテントセルとしての大腸菌
ＨＢ１０１から２００μｌを採り、５０ｍＭＣａＣｌ
2 、２０％グリセロール溶液に懸濁したものに、（３）
で得られた組み換えプラスミド０．１μｇを加え氷水中
で３０分間保持した。その後４２℃で１分間保持し、更
に氷水中で２分間保持した。これにＬＢ培地１ｍｌを加
え３７℃で１時間振とう培養した。 （６）蛍光物質を生産又は蓄積する組み換え菌の検出方
法 （５）で得られた形質転換菌を、選択圧として０．００
０１％Ｄ−アミノベンジルペニシリン（商品名アンピシ
リン）を含むＬＢ寒天培地にまいて３７℃で１２時間培
養した。この寒天培地に形成されたコロニーを波長３７
５ｎｍの紫外線ランプで照射して、これに反応する蛍光
物質の有無を調べた。その結果、１株のオレンジ色の蛍
光を発する組み換え菌を得た。 （７）組み換え菌のプラスミドの確認 オレンジ色の蛍光を発する組み換え菌の菌体よりプラス
ミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法で抽出、精製した。つ
まり、組み換え菌を０．０００１％Ｄ−アミノベンジル
ペニシリン（商品名アンピシリン）を含むＬＢ培地で３
７℃にて１２時間培養後、７，７００×ｇ、１０分間の
遠心分離により集菌した。菌体ペレットを２ｍｇ／ｍｌ
リゾチーム溶液に懸濁後、氷水中で３０分間保持し、１
％ＳＤＳ、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え溶菌さ
せた。これに、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８をくわえ
２０，０００×ｇ、３０分間遠心分離後、クリアードラ
イゼートを得た。このクリアードライゼートをエタノー
ル沈澱し、この沈澱をＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
し、塩化セシウム密度匂配遠心分離によりプラスミドＤ
ＮＡを単離した。 （８）組み換えプラスミドＤＮＡの制限酵素地図の作成 （７）によって得られたプラスミドＤＮＡの主な制限酵
素切断部位を図１に示した。１株の組み換え菌から単離
されたプラスミドＤＮＡは約６．２ｋｂｐのＳａｕ３Ａ
Ｉ断片を含んでおり、このＤＮＡ断片上に蛍光物質の生
産または蓄積をもたらす遺伝子がコードされていた。そ
こで、このプラスミドＤＮＡをｐＯＲＡＮＧＥＩと命名
した。ｐＯＲＡＮＧＥＩの蛍光物質の生産または蓄積活
性は、波長３７５ｎｍの光の照射にて蛍光を発すること
によって確認された。 （９）プラスミドｐＯＲＡＮＩの構築 （８）のプラスミドＤＮＡにおいて蛍光物質の生産また
は蓄積活性に必要な部分を限定するため、約６．２ｋｂ
ｐのＤＮＡを種々の制限酵素で切断後ベクターｐＵＣ１
１８にサブクローニングした。その結果約２．３ｋｂｐ
のＰｓｔＩ断片上にこの遺伝子がコードされていること
がわかった。これをｐＯＲＡＮＩと命名した。ｐＯＲＡ
ＮＩの活性は（８）と同様に確認された。 （１０）プラスミドｐＯＲＩの構築 （９）のプラスミドＤＮＡにおいて蛍光物質の生産また
は蓄積活性に必要なＰｓｔＩ断片（２．３ｋｂｐ）をｐ
ＵＣ１１９に組みこんだ後にディレーションを行いＤｒ
ａＩサイトを越えて短縮してもなおかつ上記活性を発現
できる約１．１ｋｂｐの断片を保有するプラスミドＤＮ
Ａを構築し、ｐＯＲＩと命名した。このｐＯＲＩ上の約
１．１ｋｂｐ断片は図１及び図２の斜線を施した部分に
相当する。
枯草菌、酵母などが使用できる。また、コンピテントセ
ルの調製は、塩化カルシウム処理法に限らず、プロトプ
ラスト法など、従来知られている方法でも可能である。 （５）コンピテントセルの形質転換 （４）にて調製されたコンピテントセルとしての大腸菌
ＨＢ１０１から２００μｌを採り、５０ｍＭＣａＣｌ
2 、２０％グリセロール溶液に懸濁したものに、（３）
で得られた組み換えプラスミド０．１μｇを加え氷水中
で３０分間保持した。その後４２℃で１分間保持し、更
に氷水中で２分間保持した。これにＬＢ培地１ｍｌを加
え３７℃で１時間振とう培養した。 （６）蛍光物質を生産又は蓄積する組み換え菌の検出方
法 （５）で得られた形質転換菌を、選択圧として０．００
０１％Ｄ−アミノベンジルペニシリン（商品名アンピシ
リン）を含むＬＢ寒天培地にまいて３７℃で１２時間培
養した。この寒天培地に形成されたコロニーを波長３７
５ｎｍの紫外線ランプで照射して、これに反応する蛍光
物質の有無を調べた。その結果、１株のオレンジ色の蛍
光を発する組み換え菌を得た。 （７）組み換え菌のプラスミドの確認 オレンジ色の蛍光を発する組み換え菌の菌体よりプラス
ミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法で抽出、精製した。つ
まり、組み換え菌を０．０００１％Ｄ−アミノベンジル
ペニシリン（商品名アンピシリン）を含むＬＢ培地で３
７℃にて１２時間培養後、７，７００×ｇ、１０分間の
遠心分離により集菌した。菌体ペレットを２ｍｇ／ｍｌ
リゾチーム溶液に懸濁後、氷水中で３０分間保持し、１
％ＳＤＳ、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え溶菌さ
せた。これに、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８をくわえ
２０，０００×ｇ、３０分間遠心分離後、クリアードラ
イゼートを得た。このクリアードライゼートをエタノー
ル沈澱し、この沈澱をＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
し、塩化セシウム密度匂配遠心分離によりプラスミドＤ
ＮＡを単離した。 （８）組み換えプラスミドＤＮＡの制限酵素地図の作成 （７）によって得られたプラスミドＤＮＡの主な制限酵
素切断部位を図１に示した。１株の組み換え菌から単離
されたプラスミドＤＮＡは約６．２ｋｂｐのＳａｕ３Ａ
Ｉ断片を含んでおり、このＤＮＡ断片上に蛍光物質の生
産または蓄積をもたらす遺伝子がコードされていた。そ
こで、このプラスミドＤＮＡをｐＯＲＡＮＧＥＩと命名
した。ｐＯＲＡＮＧＥＩの蛍光物質の生産または蓄積活
性は、波長３７５ｎｍの光の照射にて蛍光を発すること
によって確認された。 （９）プラスミドｐＯＲＡＮＩの構築 （８）のプラスミドＤＮＡにおいて蛍光物質の生産また
は蓄積活性に必要な部分を限定するため、約６．２ｋｂ
ｐのＤＮＡを種々の制限酵素で切断後ベクターｐＵＣ１
１８にサブクローニングした。その結果約２．３ｋｂｐ
のＰｓｔＩ断片上にこの遺伝子がコードされていること
がわかった。これをｐＯＲＡＮＩと命名した。ｐＯＲＡ
ＮＩの活性は（８）と同様に確認された。 （１０）プラスミドｐＯＲＩの構築 （９）のプラスミドＤＮＡにおいて蛍光物質の生産また
は蓄積活性に必要なＰｓｔＩ断片（２．３ｋｂｐ）をｐ
ＵＣ１１９に組みこんだ後にディレーションを行いＤｒ
ａＩサイトを越えて短縮してもなおかつ上記活性を発現
できる約１．１ｋｂｐの断片を保有するプラスミドＤＮ
Ａを構築し、ｐＯＲＩと命名した。このｐＯＲＩ上の約
１．１ｋｂｐ断片は図１及び図２の斜線を施した部分に
相当する。
【００３５】なお、（９）プラスミドｐＯＲＡＮＩの構
築および（１０）プラスミドｐＯＲＩの構築において、
サブローニングに用いるプラスミドベクターは特に限定
されない。また、挿入サイトも特に限定されない。
築および（１０）プラスミドｐＯＲＩの構築において、
サブローニングに用いるプラスミドベクターは特に限定
されない。また、挿入サイトも特に限定されない。
【００３６】
【発明の効果】本発明で得られるＤＮＡ断片上にコード
されている遺伝子は、菌細胞内において、波長３６５ｎ
ｍ〜４３０ｎｍの光を照射することにより蛍光を発する
物質を生産又は蓄積し得る。このため、本発明のＤＮＡ
断片で形質転換された微生物は、体内に生産または蓄積
された蛍光物質を標識として、波長３６５ｎｍ〜４３０
ｎｍの光を照射することで容易に検出できる。また、照
射する光も波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍと微生物に対し
て変異を誘発しにくい波長である為、微生物試料に影響
を与えにくく安全である。
されている遺伝子は、菌細胞内において、波長３６５ｎ
ｍ〜４３０ｎｍの光を照射することにより蛍光を発する
物質を生産又は蓄積し得る。このため、本発明のＤＮＡ
断片で形質転換された微生物は、体内に生産または蓄積
された蛍光物質を標識として、波長３６５ｎｍ〜４３０
ｎｍの光を照射することで容易に検出できる。また、照
射する光も波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍと微生物に対し
て変異を誘発しにくい波長である為、微生物試料に影響
を与えにくく安全である。
【００３７】さらに、従来公知の標識遺伝子が必要とし
た、高価で、しばしば有毒である基質物質の培地への添
加は不要となるので、通常の生育用培地で経済的にかつ
安全に、しかも簡便に培養選択できる。
た、高価で、しばしば有毒である基質物質の培地への添
加は不要となるので、通常の生育用培地で経済的にかつ
安全に、しかも簡便に培養選択できる。
【図１】 蛍光物質を生産又は蓄積させる遺伝情報をコ
ードするプラスミドｐＯＲＡＮＧＥＩの制限酵素地図で
ある。
ードするプラスミドｐＯＲＡＮＧＥＩの制限酵素地図で
ある。
【図２】 活性発現に必要なＰｓｔＩ断片を組み込んだ
プラスミドｐＯＲＡＮＩの制限酵素地図である。
プラスミドｐＯＲＡＮＩの制限酵素地図である。
【図３】 第２図に示したＰｓｔＩ断片のＤｒａＩサイ
トを越えて短縮した断片を保有するプラスミドｐＯＲＩ
の制限酵素地図である。
トを越えて短縮した断片を保有するプラスミドｐＯＲＩ
の制限酵素地図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 クロストリジウム・ジョースイ（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）（微工研寄託 第ＦＥ
ＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
にて部分分解して分離される下記の制限酵素地図を有す
る６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰｓｔＩサイト（１）お
よび該ＰｓｔＩサイト（１）からＰｓｔＩサイト（２）
側へ１．１ｋｂｐの位置で切断して得られる１．１ｋｂ
ｐの断片と同じ塩基配列を含み、波長３６５ｎｍ〜４３
０ｎｍの光の照射により蛍光を発する物質の生産または
蓄積をもたらす遺伝情報を担うＤＮＡ断片。 【化１】 ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の制限酵素を示
す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。 - 【請求項２】 クロストリジウム・ジョースイ（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）（微工研寄託 第ＦＥ
ＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
にて部分分解して分離される下記の制限酵素地図を有す
る６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰｓｔＩサイト（１）お
よびＰｓｔＩサイト（２）で切断して得られる２．３ｋ
ｂｐの断片と同じ塩基配列を含み、波長３６５ｎｍ〜４
３０ｎｍの光の照射により蛍光を発する物質の生産また
は蓄積をもたらす遺伝情報を担うＤＮＡ断片。 【化２】 ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の制限酵素を示
す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。 - 【請求項３】 クロストリジウム・ジョースイ（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）（微工研寄託 第ＦＥ
ＲＭ Ｐ−９６８４号）の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
にて部分分解して分離される下記の制限酵素地図を有す
る６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片であって、波長３６５ｎｍ
〜４３０ｎｍの光の照射により蛍光を発する物質の生産
または蓄積をもたらす遺伝情報を担うＤＮＡ断片。 【化３】 ただし、制限酵素地図上の記号は、以下の制限酵素を示
す。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｄ：ＤｒａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖ：ＥｃｏＲＶ、 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓａ：Ｓａｕ３Ａ
Ｉ、Ｓｌ：ＳａｌＩ、 Ｘ：ＸｂａＩ。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか記載のＤＮ
Ａ断片をベクターに組み込んだことを特徴とするプラス
ミドＤＮＡ。 - 【請求項５】 ベクターがｐＢＲ３２２であることを特
徴とする請求項４記載 のプラスミドＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１ないし３のいずれか記載のＤＮ
Ａ断片または請求項４もしくは請求項５記載のプラスミ
ドＤＮＡで微生物を形質転換することによりこの微生物
体内に生産または蓄積された物質で該微生物を標識し、
該微生物に波長３６５ｎｍ〜４３０ｎｍの光を照射し、
該照射による蛍光によって前記物質で標識された微生物
を検出することを特徴とする微生物検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29170391A JP2540677B2 (ja) | 1991-11-07 | 1991-11-07 | 新規なｄｎａ断片、これを組み込んだプラスミドｄｎａ及び微生物検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29170391A JP2540677B2 (ja) | 1991-11-07 | 1991-11-07 | 新規なｄｎａ断片、これを組み込んだプラスミドｄｎａ及び微生物検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123172A JPH05123172A (ja) | 1993-05-21 |
| JP2540677B2 true JP2540677B2 (ja) | 1996-10-09 |
Family
ID=17772310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29170391A Expired - Fee Related JP2540677B2 (ja) | 1991-11-07 | 1991-11-07 | 新規なｄｎａ断片、これを組み込んだプラスミドｄｎａ及び微生物検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2540677B2 (ja) |
-
1991
- 1991-11-07 JP JP29170391A patent/JP2540677B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05123172A (ja) | 1993-05-21 |
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Legal Events
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