JPH05236988A - ポリペプチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポリペプチドの製法 【構成】 ポリペプチドを発現させることのできる宿主
を生長培地中で培養し、この方法の間に生長培地のｐＨ
を調節し、場合により、温度をこの培養の終末部の間で
低下させ、この培養の間に酵母エキスを添加することも
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオ技術の分野に関
し、特に可溶性組換え分子の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、組換え蛋白質は、細菌宿主例え
ばＥ．コリー中で製造され、この発酵は、生長に好適な
条件下で、即ち約３７℃の温度及び約６.８のｐＨで実
施される。

【０００３】この発酵法は、通例、宿主の細胞生長要件
を満たす栄養物を含有する培地中で実施される。典型的
な培地には、細胞成分の合成及び熱量のための炭素及び
窒素源、イオン例えばスルフェート、ホスフェート、マ
グネシウム、カルシウム、鉄及び種々の微量元素を含有
する。この生長培地の成分として、酵母エキスもしばし
ば存在する。例えば、ルリアブイヨン（Luria Broth)
は、トリプトン及び塩化ナトリウムに加えて、酵母エキ
ス約０.５％を含有する。最近、ルリアブイヨンに酵母
エキスを富化させると、これは、酵母エキスバイオマス
１〜３％を含有し、β−ガラクトシダーゼ発現が増加さ
れることが報告された（X Li、J．W．Robbins及びK．
B．Taylor；Journal of Industrial Microbiology
５、８５−９４、１９９０参照）。更に、流加培養法
（fed−batch process）で酵母エキス及びグルコース
を発酵ブイヨン中に供給することにより、組換えヒトイ
ンシュリン類似生長因子を封入体として製造できること
も報告されている（L．B．Tsai等のJournal of Indus
trial Microbiology ２、１８１−１８７、１９８７
参照）。

【０００４】米国特許第４８９４３３４号明細書には、
培養を３７℃でかつ６.８のｐＨで実施し、かつ生長培
地の濁りが約１０のＯＤ₆₈₀である場合には、カサミノ
酸（casamino acid）の２％溶液を添加することよりな
るレシチンＡの製法が記載されている。

【０００５】Ｅ．コリー中で組換えＤＮＡ技術により多
くのポリペプチドを製造する場合には、このポリペプチ
ドは不溶性の形で、例えば不溶性集合物又は封入体とし
て得られる。この物質を使用すべき際には、これを生物
学的に活性な形に再生することを可能にするため、可溶
性にすべきである。この可溶化工程は、一般に、化学品
例えば、界面活性剤又はカオトロピック剤（これらは、
使用のためには煩雑かつ高価であり、蛋白質を化学的に
変性する）の使用を必要とする。

【０００６】組換えリシンＡを製造する際に、不溶性物
質が形成される傾向がある。例えば、欧州特許（ＥＰ）
第２３７６７６号明細書中には、Ｅ．コリー中、３７
℃、ｐＨ６.８でのリシンＡの発現は、不溶性物質をも
たらし、これは、尿素とＳＤＳとの混合物での処理によ
り可溶化すべきであることが報告されている。欧州特許
第３７６７６号明細書は、リシンＡに関する暗号配列
が、Ｅ．コリーＫ１２のアルカリホスファターゼ構造遺
伝子（phoＡ）のリーダー配列を暗号化するＤＮＡと共
に直接読取りフレーム中に配置されている場合に、可溶
性リシンＡが製造されることを報告している。

【０００７】リシン及びリシン型分子例えばアブリン
（abrin）は、植物細胞により製造され、細胞毒特性を
有する公知化合物である。この型のトキシンは、ジサル
ファイド橋を介して連結されている２個のポリペピチド
鎖より成る。このポリペプチド鎖の１方（Ａ−鎖）は、
トキシン分子の細胞毒特性に第１に責任があり、他方の
ポリペプチド鎖（Ｂ−鎖）は、トキシン分子を細胞表面
に結合可能にする。

【０００８】リシンのこの毒性は、識別可能な次の３つ
の条件に依存する： （ｉ） Ｂ鎖上のガラクトース結合部位と細胞表面上に
露呈されている糖蛋白質又は糖脂質との相互作用による
細胞表面へのリシン分子の結合； （ii） 細胞の細胞質ゾル内への少なくともＡ鎖の侵
入；及び （iii) ＲＮＡの酵素的分解により蛋白質合成及び最終
的細胞死を阻止するリボソームの６０Ｓ−サブユニット
になる。

【０００９】Ｂ鎖は、リシン分子を細胞表面に結合する
その１次機能は別として、ここで細胞内へのリシンの吸
収を促進する重要な２次機能をすると信じられてもい
る。従って、分離されたＡ鎖及びＢ鎖は、実質的に無毒
性である。それというのも、Ｂ鎖は細胞毒性ではなく、
Ａ鎖は細胞表面への結合能力に欠け、Ｂ鎖の不存在では
細胞の細胞質ゾル内に侵入する能力に欠けるからであ
る。

【００１０】リシンのＡ鎖の毒性は、無差別に結合する
Ｂ鎖を正常細胞の存在で腫瘍細胞への結合能を有する種
々のキャリアで換えることができる場合には、抗腫瘍治
療に有用であることが既に暗示されている。従って、リ
シンＡ及び腫瘍特異性抗体より成る免疫毒素が抗腫瘍治
療で使用できることが提案されている。

【００１１】天然源例えばヒマ（Ricinus communsa）
の種子からのリシンのＡ鎖の製造は困難である。特に、
特に、リシンＡの精製即ちＢ鎖からＡ鎖を分離すること
は困難である。

【００１２】組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチド例
えばリシンＡを製造することは可能であるが、なお、可
溶性ポリペプチドを製造する改良法は必要である。特
に、可溶性リシンＡを製造するための改良法は必要であ
る。

【００１３】

【発明の構成】本発明によれば、ポリペプチドを製造す
る方法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発
現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、かつ
（ａ） 生長培地のｐＨを、この方法の間中調節し、場
合により、この生長培地の温度をこの方法の間に低下さ
せるか又は、（ｂ） ｐＨを、この宿主の生長に好適な
値に保持し、かつこの方法の間に、生長培地の温度を低
下させ、こうして可溶性ポリペプチドを得ることより成
る。

【００１４】特に、本発明の方法は、少なくとも部分的
に、不溶性の形で製造される傾向を有するポリペプチド
を製造するために使用できる。

【００１５】本発明を用いて製造することのできるポリ
ペプチドの特別な例には、例えばリシンＡ又はその類縁
体が包含される。

【００１６】本発明の１実施態様では、前記ポリペプチ
ドを発現させることのできる宿主を培養し、かつこの方
法の間に、可溶性ポリペプチドが得られるようにｐＨを
調節することより成る、ポリペプチドの製法が提供され
る。特に、前記ポリペプチドを発現させることのできる
宿主を第１期間の間、この宿主の生長に好適な第１ｐＨ
値で、生長培地中で培養し、ｐＨを可溶性ポリペプチド
の蓄積に好適な第２の値に調節し、かつ、この宿主を、
この第２のｐＨ値で更なる期間の間培養することよりな
る、ポリペプチドの製造法が提供される。

【００１７】本発明のもう１つの態様では、前記ポリペ
プチドを発現させることのできる宿主を培養し、この間
の温度を可溶性ポリペプチドが得られるように低下させ
ることより成る、ポリペプチドの製法が提供される。

【００１８】温度が低下される方法において、この方法
は、一般に、宿主細胞の生長及び可溶性ポリペプチドの
生成に好適な温度で、宿主細胞を培養し、この培養の終
末部の間に生長培地（及び従って宿主）を冷却し、か
つ、前記終末部の間に宿主を収穫することよりなる。

【００１９】温度は、ポリペプチドを可溶性の形に保持
するのに好適な温度が有利である。

【００２０】細菌細胞例えばＥ．コリーの生長に好適で
ある温度は、約２５℃〜約３９℃（例えば３７又は３８
℃）であり、至適温度は、約３７℃である。この温度
は、可溶性ポリペプチドを生成させる温度であるのが有
利であり、一般に、この温度は４０℃を下まわる。一般
に、この温度が低下すると、宿主細胞は約２５℃を下ま
わる温度まで例えば、約１０℃（又はそれ以下）〜約２
５℃の範囲の温度まで冷却されることが有利である。

【００２１】細胞内での可溶性ポリペプチド（例えばレ
シンＡ）の蓄積が高い場所で、かつ最も有利には、最大
特異活性の所で又はその付近で冷却を行なうのが有利で
ある。

【００２２】ｐＨを調節する際に、ポリペプチドを発現
させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長
に好適である第１のｐＨ値で第１期間の間培養し、かつ
このｐＨを第２の値に調節し、かつこの宿主を、この第
２値で更なる期間培養することが一般に有利である。こ
のｐＨは、多くの方法で調節でき、例えば１工程で又は
１連の工程で調節することができる。第２のｐＨは、例
えば、可溶性ポリペプチドの蓄積に好適である値より成
り、ここで、これは、ポリペプチドを可溶性形に保持
し、回収することを促進する。

【００２３】従って、特別な１態様で、ポリペプチドの
製法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発現
させることのできる宿主を、第１のｐＨ値及びこの宿主
の生長及び可溶性ポリペプチドの生成に好適である温度
で培養し、この方法の間にｐＨ値を第２のｐＨ値に調節
し、かつ場合により、この宿主を、培養の終末部の間に
冷却し、かつ可溶性ポリペプチドを含有する宿主を前記
の終末部の間に収穫することよりなる。

【００２４】リシンＡの場合に、ｐＨを一般的に調節す
ると、前記の第２ｐＨ値は、第１ｐＨ値よりも低くな
る。他のポリペプチドを得るために、前記の第２ｐＨ値
は、ポリペプチドの種類に応じて、第１の値より大きい
か又は低くてよい。

【００２５】特別な１態様において、ｐＨを調節する際
に、このｐＨ値は、第１の値から第１の値より低い第２
の値に変えられる。前記のように、このｐＨは、多くの
方法で低められ、例えば、１工程で又は一連の工程で低
下されうる。

【００２６】一般に、例えば、短時間でｐＨを第１の値
から第２の値に調節することが有利であり、特に、この
ｐＨは、直接的に、第１の値から第２の値に調節するこ
とができる。

【００２７】この培養の第１期間の間のｐＨの特別な値
には、例えば、約６〜８の範囲内の値が包含される。第
１期間の間のｐＨの有利な値は、例えば６.７又は約６.
７である。約６.７であるｐＨ値には、例えば６.７±
０.１従って、６.８の値も包含される。

【００２８】培養の更なる期間の間のｐＨの特別な値
は、約５.５〜８の範囲特に約６〜８の範囲内の値であ
る。例えば、第１期間の間のｐＨ（即ち前記の第１の
値）は、約６.７であり、更なる期間の間の特別なｐＨ
値は、６.７より低く、約５.５よりは大きい（殊に約
６.０以上）の値である。

【００２９】特に、本発明は、リシンＡ又はその類縁体
の製法を提供する。従って、本発明によれば、リシンＡ
又はその類縁体の製法が提供され、この方法は、リシン
Ａ又はその類縁体を発現させることのできる宿主を栄養
培地中で、宿主の生長に好適である第１ｐＨで第１期間
の間培養し、かつ、この宿主を、前記第１ｐＨ値よりも
低いｐＨで、更なる期間の間培養し、かつ、場合によ
り、この宿主をこの培養の終末部の間に冷却し、かつ前
記終末部の間にこの宿主を収穫することより成る。

【００３０】リシンＡの類縁体には、細胞毒活性を示
し、１個以上のアミノ酸変更（欠失、付加、置換）によ
りリシンＡの構造とは異なっているリシンＡと関連して
いる１次構造を有し、細胞毒活性の欠如の結果をもたら
さない、ポリペプチドが包含される。リシンＡを発現さ
せることのできる宿主の製造は、例えば、欧州特許（Ｅ
Ｐ）第１４５１１１号、国際特許（ＷＯ）第８５／３５
０８号明細書及びLamb等によるEur．J．Biochem．１９
８５、１４８、２６５−２７０頁に記載されている。

【００３１】前記のように、細胞毒特性を有するポリペ
プチド例えばリシンＡは、腫瘍の治療に使用するための
免疫毒素の製造に使用できる。一般に、このような免疫
毒素は、処置されるべき腫瘍およびトキシンに対して特
異的な抗体よりなる。免疫毒素の製造の例は、公開され
たＰＣＴ特許出願（ＷＯ）第８５／００３５０８号明細
書中に記載されている。

【００３２】一般に、例えば、この宿主は、細菌細胞例
えばＥ．コリー細胞より成るのが有利である。リシンＡ
の場合には、この宿主はＥ．コリー菌株例えばＤＳ４１
０より成るのが有利である。

【００３３】この宿主を、一般に、宿主の細胞生長要件
を満たす栄養を含有する培地中で培養する。従って、こ
の培地は、一般に、細胞成分の合成及びエネルギーのた
めの炭素及び窒素源、イオン例えば、スルフェート、ホ
スフェート、マグネシウム、カルシウム、鉄及び微量元
素を含有する。

【００３４】この発酵の過程の間に、この発酵培地に酵
母エキスを添加するのが有利である。この酵母エキスの
添加の方法は、以下の記載に包含される。

【００３５】宿主は、ポリペプチド（例えばリシンＡ又
はその類縁体）に関してコードし、適当なコントロール
配列例えばプロモータ配列、リボソーム結合部位及び転
写ターミネーター配列のコントロール下にあるＤＮＡ配
列を含有する。適当なプロモータ配列の特別な例は、ト
リプトファン（trp）プロモータ配列及びＴ７Ａ３プロ
モータである。他のプロモータ例えばlac又はtac−プロ
モータも使用できる。従って、例えば、この宿主は、リ
シンＡに関してコード化し、trp又はＴ７Ａ３プロモー
タのコントロール下にあるＤＮＡ配列を有していてよ
い。

【００３６】特に有利な１態様において、本発明の方法
は、流加培養型（fed−batch type）の発酵より成る。

【００３７】ここで使用されている、流加培養−型（fe
d−batch type）の方法とは、栄養例えば炭素源又は消
耗時に微生物の生長を限定する多くの栄養を含有するバ
ッチ生長培地を使用する発酵法である。この栄養が消耗
されると、その栄養（nutrient／nutrients）の供給が
開始される。この栄養の供給が必要になる時点は、流加
培養条件の開始に一致する。この発酵培地には、全搬的
に、又はこの発酵の間の段階で他の栄養を供給すること
ができる。

【００３８】この方法が流加培養発酵法より成る場合に
は、流加培養条件に達する時点又はそれ以前に、有利に
は流加培養地条件に達する前にｐＨを低めることができ
る。

【００３９】有利な１態様では、リシンＡを製造するた
めの流加培養型の発酵法が提供され、この方法は、リシ
ンＡを発現させることのできるＥ．コリー宿主を、約
６.７のｐＨ値で第１期間の間培養し、かつ、この宿主
を、前記の６.７より低いｐＨで更なる期間培養するこ
とよりなる。

【００４０】本発明の有利な１態様によれば、リシンＡ
又はその類縁体を製造するための流加培養型の発酵法が
提供され、この方法は、リシンＡ又はその類縁体を発現
させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長
及び可溶性リシンＡ又はリシンＡ類縁体の生成に好適な
第１のｐＨ値及び温度で第１期間の間培養し、流加培養
条件が達成される前に前記第１の値より低い第２の値ま
でｐＨを調節し、場合により、培養の終末部の間に、こ
の生長培地を、リシンＡを可溶性形に保持するのに好適
な温度まで冷却し、前記終末部の間に細胞を収穫するこ
とより成る。

【００４１】本発明で特許請求されている方法の実施に
先立ち、流加培養型の発酵法は、この発酵法の終りに回
収されうる可溶性リシンＡの収率を減少させる結果をも
たらすことが判明した。意外にも、流加培養条件の達成
の前に冷却を行なう場合に、ポリペプチドの高水準が可
溶性形に保持でき、従って、可溶性ポリペプチドの収穫
を促進することが発見された。

【００４２】従って、本発明のもう１つの態様では、次
の方法よりなるリシンＡ又はその類縁体を製造する方法
が提供される： （ａ） リシンＡ又はその類縁体を発現させることので
きる宿主を、生長培地中で、この宿主の生長及び可溶性
リシンＡ又はその類縁体の生成に好適である温度で培養
し、 （ｂ） この生長培地を、この宿主の生長に必須の栄養
の消耗に達する（即ち流加培養条件に達する）前に、こ
の宿主の生長に好適でない温度まで冷却し、かつ （ｃ） 前記栄養の消耗に達する前に細胞を収穫する。

【００４３】この方法は、この方法が流加培養相に入る
前に収穫を行なう流加培養法に類似していることが明ら
かである。従って、宿主の生長のために必須の栄養の消
耗が起る時点は、流加培養条件に達する時点と等しい。
栄養消耗に達する前に冷却を行ない、有利に、例えば栄
養消耗に達する直前に行なう。

【００４４】宿主はＯＤ₅₅₀＝約５０で炭素限定されて
処方されている培地中で生長させることができ、ＯＤ
₅₅₀が約５０の場合又はＯＤ₅₅₀が５０に達する前に、こ
の宿主を含有する発酵培地を冷却する。

【００４５】特に、リシンＡの製造のための流加培養法
で温度を低めることが望ましい場合には、この方法は次
の工程を包含していてよい： （ａ） リシンＡを発現させることのできるＥ．コリー
宿主を栄養培地中で、約３７℃〜３９℃の範囲の温度で
培養し、 （ｂ） この発酵培地を、流加培養条件に達する前に約
２５℃より下まわる温度まで冷却し （ｃ） 宿主細胞を流加培養条件に達する前に収穫す
る。

【００４６】特別な温度の例は、前記のものである。従
って、約１０℃（又はそれ以下）から約２５℃の範囲の
温度まで冷却することができる。

【００４７】本発明によれば、リシンＡ又はその類縁体
を発現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、
この培養の間に酵母エキスを含有する補充物をこの生長
培地に添加する方法によりリシンＡ又はその類縁体を製
造する方法も提供される。

【００４８】酵母エキスは、単一バッチ法、一連のアリ
コート又は実質的な連続的供給の方法で添加することが
できる。この酵母エキスは、一般に、宿主の生長相の間
に添加する。例えば、酵母エキスを含む補充物の添加
は、培養の開始後の予め決められた時間で開始するのが
有利である。この時間の特別な例は、流加培養条件が達
成される前の時点である。

【００４９】酵母エキスを含む補充物の添加速度は、こ
の生長培地の酵母エキスが消耗されないようにするのが
有利である。従って、この生長培地の当初組成物中に酵
母エキスが含有される場合には、補充物の添加を、当初
組成物中に存在する酵母エキスが消費される前に開始す
るのが有利である。酵母エキス供給の好適な速度には、
例えば約０.８５〜３.４ｇ／ｌ・ｈの範囲の供給速度が
包含される。供給の特別な速度は、１〜２ｇ／ｌ・ｈの
範囲殊に１.７ｇ／ｌ・ｈである。

【００５０】前記のように、宿主細胞は、一般に、細菌
細胞例えばＥ．コリーより成っていてよく、例えば、こ
の宿主細胞がリシンＡを発現させることのできるもので
あるのが有利である。

【００５１】発酵は、一般に、宿主の生長に好適である
温度で実施される。細菌細胞例えばＥ．コリーの生長に
特に好適である温度は、約３７℃である。この温度は、
培養の間に（殊に、培養の終末部の間に）、前記のよう
に低下させることができる。

【００５２】本発明の有利な１態様によれば、リシンＡ
又はその類縁体を発現させることのできる宿主を生長培
地中で培養し、かつこの生長培地に、流加培養条件に達
する時点より前に、酵母エキスを含有する補充物を添加
することより成る、リシンＡ又はその類縁体を製造する
ための流加培養型の方法が提供される。

【００５３】Ｅ．コリー菌株ＤＳ４１０は、可溶性リシ
ンＡ製造時に意想外に有効であることも判明した。従っ
て、本発明は、リシンＡを発現させることのできる宿主
を培養し、ここで宿主はＥ．コリーＤＳ４１０であるこ
とより成るリシンＡの製法をも提供する。前記のよう
に、一般に、ｐＨを調節しかつ／又は温度を低めるのが
有利である。

【００５４】収穫の後に、細胞を処理してリシンＡを回
収する。この処理は、通例、細胞を崩壊させ、他の蛋白
質物質から、１以上の抽出工程で粗製リシンＡポリペプ
チドを分離し、かつ更に、ゲル濾過、高速液体クロマト
グラフィ又は他の慣用の精製法により、リシンＡを精製
することよりなる。

【００５５】本発明の方法は、可溶性ポリペプチドの製
造に有利であることが判明した。

【００５６】一般に、本発明の方法は、可溶性形のポリ
ペプチドの生成及び／又は回収に有利である。殊に、こ
の方法の間に、生長培地のｐＨを調節することにより、
可溶性ポリペプチドの高収率が得られることが判明し
た。意想外に、培養の終末部の間に生長培地を冷却し、
この終末部の間に細胞を収穫すると、可溶性ポリペプチ
ドの高収率が回収されうることも判明した。この冷却工
程は、特に有利であることが判明した。それというの
も、これは、収穫の前に遅延があっても、可溶性ポリペ
プチドの高収率が得られる大きな処理範囲をもたらすか
らである。

【００５７】ｐＨを調節し任意の冷却工程を行なう流加
培養法が特に有利であることが判明した。

【００５８】ポリペプチドがリシンＡである方法におい
て、本発明の方法は、特に有利であることが判明した。

【００５９】得られる可溶性リシンＡの収率は、この方
法の間に酵母エキスを添加する際に高められることが判
明した。ｐＨも調節される方法殊に、ｐＨが調節される
流加培養法は、予想外に、可溶性リシンＡの高収率を与
えることが判明した。

【００６０】Ｅ．コリーＤＳ４１０も、予想外に、可溶
性リシンＡの製造に有利であることが判明した。この方
法の間に酵母エキスを添加すると、この収率は高められ
ることも判明した。

【００６１】

【実施例】次に、実施例を用い、図面と関連させて、本
発明を詳説する：図１は、ｐＩＣＩ００２０の構成を説
明している図であり；図２は、ｐＴＢ３４４の構成を説
明している図であり；図３は、ｐＩＣＩ００４２の構成
を説明している図であり；図４は、ｐＩＣＩ１０７９の
構成を説明している図であり；図５は、ｐＩＣＩ１１８
７の構成を説明している図であり、図６は、Ｅ．コリー
リゼートのクマシーブルー染色ＳＤＳゲルを示す図であ
り、ここでトラックＡは、ｐＩＣＩ１１０２、ＢはｐＩ
ＣＩ００２０であり、Ｃは分子量マーカーであり；図７
は、ピークＲがリシンＡを示しているｐＩＣＩ１１０２
のゲルプロフィルを示す図であり、図８は、ｐＩＣＩ１
１０２により産生されたリシンＡのウエスタンブロット
であり、ここでトラック１は分子量マーカーであり、２
及び３は、非−リシン産生クローンであり、４はｐＩＣ
Ｉ１１０２であり、５はｐＩＣＩ００２０（対照プラス
ミド−非リシンＡ配列）であり；図９は、ｐＩＣＩ１１
０２の部分配列であり；図１０は、ｐＩＣＩ１１０２の
構成を説明している図であり；図１１は、プラスミドの
製造で用いられているフラグメントを示す図であり、図
１２は、ｐＩＣＩ００４２のプラスミド地図であり、図
１３は、転写ターミネーターの配列を示す図であり、図
１４は、ｐＩＣＩ１０７９のプラスミド地図であり、図
１５、図１６及び図１７は、それぞれＤＳ４１０に関す
るバイオマス、全リシンＡ蓄積及び可溶性フラクション
中のリシンＡの分配率に及ぼす流加培養発酵の影響を示
す図であり；図１８、図１９、図２０及び図２１は、そ
れぞれ、バイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラ
クション中の可溶性リシンＡ分配率及び可溶性リシンＡ
の収率に及ぼすｐＨの影響を示す図であり；図２２は、
使用ｐＨプロフィルを示す図であり；図２３、図２４及
び図２５は、冷却の影響を示す図である。

【００６２】 生長培地 ＬＣＭ５０の組成 蒸留水中の量（ｇ／ｌ） ＫＨ₂ＰＯ₄ ３.０ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６.０ ＮａＣｌ ０.５ カゼイン加水分解生成物（Oxoid L41） ２.０ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０.０ 酵母エキス（Difco） 詳述量 グリセロール ３５.０ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.５ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０.０３ チアミン ０.００８ ＦｅＳＯ₄／クエン酸 ０.０４／０.０２ 微量元素溶液（ＴＥＳ） （０.５ｍｌ／ｌ） テトラサイクリン （１０ｍｇ／ｌ） このＬＣＭ５０生長培地中の酵母エキスの濃度は各々の
例中に詳述する。

【００６３】微量元素溶液（ＴＥＳ）は次の組成を有す
る： 菌株 ここで使用されるＥ．コリー菌株は、自由に入手可能で
ある。例えばＥ．コリーＭＭ２９４及びＷ３１１０は、
自由に入手可能である。ＭＭ２９４及びＷ３１１０は、
例えば、Ｅ．コリー・ジエネティック・ストック・セン
ター（E．coligenetic Stock Centre、Yele Univers
ity、ＵＳＡ）から入手できる。Ｗ３１１０の△lac誘導
体は、当業者により容易に製造される。

【００６４】Ｅ．コリーＤＳ４１０は、公知であり（Do
ugan及びSherratt、Molecular andGeneral Genetic
s，Vol．１５１、ｐ１５１−１６０、１９７７）、公開
されたゲノタイプＦ^- ara azi tonＡ lacＹ minＡ
minＢ rpsＬ malＡ xyl mtl thiを有する。この菌株
は、一般的に自由に入手可能であり、更に、本発明者に
より１９８５年６月７日に、ブダペスト条約のもとで、
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
＆・マリン・バクテリアLtd．アバディーン・スコット
ランド（National Collection of Industrial＆Mari
ne BacteriaLtd，Aberdeen，Scotland）に寄託番号１
２１００で寄託されている。

【００６５】例１ Ｅ．コリー 菌株 MM294, DS410, およびW3110Δlacと呼
ばれるW3110のΔlac誘導体を、pICI 1187を用いて形質
転換した。

【００６６】生じた菌株 MM294（pICI 1187）、DS410
（pICI 1187）およびW3110Δlac（pICI 1187）を精製
し、グリセロールストック中で−８０℃で維持した。そ
れぞれの培養基のアリコートをストックから除去し、Ｌ
−テトラサイクリンの寒天プレートに画線培養し、単一
コロニーを３７℃で一晩中生長させた後に分離した。

【００６７】DS410（pICI 1187）、W3110Δlac（pICI 1
187）およびMM294（pICI 1187）の単一コロニーを除去
し、別々にＬ−テトラサイクリンブイヨン１０ｍｌに再
懸濁させ、１００μｌをただちに、Ｌ−テトラサイクリ
ンブイヨン７５ｍｌを含有する１０個の２５０ｍｌの三
角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪機で３７℃で
１６時間生長させた後、１０個のそれぞれのセットのフ
ラスコの内容物を集め、LCM50（酵親エキス１０ｇ／
ｌ）を含有する３つの別々の発酵槽に接種するために使
用した。

【００６８】発酵は３７℃の温度で、２Ｍ硫酸および６
Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節してｐＨ
６で実施した。溶存酸素圧（ｄＯＴ）設置点は５０％の
空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の自動調整に
より制御した。発酵槽への空気流は常に、１容量容量／
分（ＶＶＭ）に相当する２０Ｌ／分である。

【００６９】発酵は１４．２５時間行なわれ、この時間
の間に光学密度（ＯＤ₅₅₀）、細胞乾燥重量、細胞中の
リシンＡの蓄積および分配率を測定するためにサンプル
を取った。リシンＡ蓄積は、公知のように、試料採取し
た細菌の全ての細胞リゼイトのクーマシーブルー（Coom
assie blue）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査すること
により測定した。細胞の細胞質（可溶性）および封入体
（不溶性）フラクション中のリシンＡの分配率は、公知
のように、試料採取した細菌を音波処理溶菌にかけるこ
とにより測定した。

【００７０】プラスミドpICI 1187に対する Ｅ．コリー
宿主菌株の変化は、可溶性の細胞質フラクション中に
分配されたリシンＡの水準における予想外の変化を引き
起こした。第１表は、DS410（pICI 1187）、W3110Δlac
（pICI 1187）およびMM294（pICI 1187）の菌株につい
て、発酵の終了（１４．２５時間）での、得られたバイ
オマス、全リシンＡ蓄積および可溶性フラクション中に
分配しているリシンＡのパーセンテージを表わした。

【００７１】 第１表 菌株 バイオマス gl^-1 全リシンＡ リシンＡ ％ 発酵 可溶性フラクション TMP ％* 中の分配率 ──────────────────────────────────── DS410 ９．３ ５．９ ＞８０ （pICI 1187） W3110Δlac １４．４ ７．５ 約４０ （pICI 1187） MM294 １０．４ ７．６ 約４０ （pICI 1187） ──────────────────────────────────── * ＴＭＰは全微生物タンパク質を表わす Ｅ．コリー 宿主菌株の変化により、リシンＡの分配率
における劇的変化を引き起こすことができる。

【００７２】例２ 菌株 DS410（pICI 1187）、W3110Δlac（pICI 1187）お
よびMM294（pICI 1187）を用いるLCM50増殖培地（酵親
エキス２０ｇ／ｌ）を用いて、例１に記載した発酵工程
を繰り返した。酵親エキスの溶液（３３３ｇｌ^-1）を、
発酵槽に接種した後４．２５ｈから、０．８５ｇｌ^-1ｈ
^-1で発酵槽中に供給した。この酵親エキスの供給速度
を、酵親槽に接種した後５．７５ｈで、１．７ｇｌ^-1ｈ
^-1に増大させた。発酵槽中の炭素源が枯渇した場合（ｄ
ＯＰ中の急速増加を引き起こす）、グリセロール（７１
４ｇｌ^-1）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ^-1）を
含んだ飼料を、発酵槽中に細菌の酸素取り上げ速度を制
限する速度でポンプ輸送した。

【００７３】高めたバッチ酵親エキス濃度および発酵の
間の酵親エキス溶液の供給を除いて、３つの発酵槽の培
地および発酵条件は、例１に記載された工程と同様であ
る。

【００７４】この実施例に記載した発酵工程は、例１と
比較して、全て３つの菌株のバイオマスにおける改良、
菌株 DS410（pICI 1187）、W3110Δlac（pICI 1187）お
よびMM294（pICI 1187）の可溶性フラクション中に分配
されたリシンＡの量の改良および、全菌株の可溶性リシ
ンＡの全収量における改良を生じさせた。第２表は、最
終的なバイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラク
ション中に分配されたリシンＡのパーセンテージ、およ
び発酵の終了時（１６．２５時間）の可溶性リシンＡの
計算された収量を表わす。

【００７５】 第２表 菌株 バイオマス 全リシンＡ リシンＡ％ 可溶性リシ gl^-1 発酵 可溶性フラ ンＡの収量 TMP ％* クション中 ｍｇｌ^-1* の分配率 ──────────────────────────────────── DS410 ２４．３ ７．０ ８０ 約６００（１） （pICI 1187） W3110Δlac ２３．１ ８．４ ８０ 約６００（１） （pICI 1187） MM294 １９．３ ９．７ ５０ 約４００（１） （pICI 1187） ──────────────────────────────────── * 発酵ブイヨン１リットルあたり可溶性リシンＡの計算した収量ｍｇ （１）は、約１５０〜２００ｍｇ^-1の例１に記載した発
酵工程での３つの菌株に対する可溶性リシンＡの計算し
た収量と比較した。

【００７６】ＬＣＭ５０中の酵親エキス濃度が１０ｇ／
Ｌであり、酵親エキスを発酵槽中に供給するおよび／ま
たは酵親エキスを０．８５ｇｌ^-1ｈ^-1、１．７ｇｌ^-1ｈ
^-1または３．４ｇｌ^-1ｈ^-1で発酵槽中にポンプ供給する
場合に、同じ結果が得られた。

【００７７】酵親エキスの供給は、このように、可溶性
フラクション中に分配されたリシンＡの％および発酵ブ
イヨン１リットルあたりの可溶性リシンの収量を増大さ
せることができる。

【００７８】例３ Ｅ．コリー 菌株 MM294（pICI 1187）、W3110Δlac（pI
CI 1187）およびDS410（pICI 1187）を用いて、Ｌ−ト
リプトファン１００ｍｇｌ^-1を追加したLCM50増殖培地
（酵親エキス１０ｇ／ｌ）を用いて、例１に記載した発
酵工程を繰り返した。Ｌ−トリプトファン溶液（１０ｇ
ｌ^-1）は、発酵の間中、９０ｍｇｌ^-1ｈ^-1で発酵槽中に
ポンプ供給される。

【００７９】第３表は、３つの菌株について発酵の終了
時（１４．２５ｈ）で、バイオマス濃度、全リシンＡ蓄
積および可溶性フラクション中に分配されたリシンＡの
パーセンテージを比較している。Ｌ−トリプトファンの
補充および供給は、公知のようにトリプトファンプロモ
ータの活性に影響を及ぼすために実施した。例１および
特に例２に記載した発酵工程と比較して、不利な効果が
全般的に観察された。菌株MM294（pICI 1187）はより高
いバイオマスを製造するが、可溶性フラクション中に分
配するリシンＡのパーセンテージは減少した。菌株DS41
0（pICI 1187）およびW3110Δlac（pICI 1187）はリシ
ンＡの分配率において変化を示さなかったが、製造され
たバイオマスの水準は減少した。例２に記載した酵親エ
キスを用いて達成された結果は、添加した酵親エキスが
著しい量のトリプトファンを含有するため、最も意想外
であった。

【００８０】 第３表 菌株 バイオマス 全リシンＡ 全リシンＡ ％ gl^-1 発酵 可溶性フラクション TMP ％ 中の分配率 ──────────────────────────────────── DS410 ７．６ ６．８ ＞８０ （pICI 1187） W3110Δlac １１．０ ７．２ 約４０ （pICI 1187） MM294 ２０．８ ７．２ 約４０ （pICI 1187） ──────────────────────────────────── 例４ 例２の発酵工程を、ＬＣＭ５０（酵親エキス２０ｇ／
ｌ）中のＥ．コリー 菌株DS410（pICI 1187）を用いて
繰り返した。

【００８１】この発酵は、３７℃の温度で、２Ｍ硫酸お
よび６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節さ
れたｐＨ６．７で実施した。溶存酸素圧（ｄＯＴ）設置
点は５０％空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の
自動調節により制御した。発酵槽への空気流は、最初
に、１容量容量／分（ＶＶＭ）に相当する２０Ｌ／分で
あり、発酵槽の攪拌速度が最大に達した場合に手作業で
４５Ｌ／分に増大させた。この発酵は、３４時間実施さ
れ、この時間の間に光学密度（ＯＤ₅₅₀）、細胞乾燥重
量、細菌細胞中のリシンＡの蓄積および分配率を測定す
るためにサンプルを取った。リシンＡの蓄積は、公知の
ように、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクー
マシーブルー（Coomassie blue）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質（可
溶性）および封入体（不溶性）フラクション中のリシン
Ａの分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波
処理溶菌にかけることにより測定した。酵親エキス（３
３３ｇｌ^-1）の溶液は、接種の後４．５時間に、発酵槽
へ１．７ｇｌ^-1ｈ^-1でポンプ供給された。

【００８２】接種の後の１２〜１３時間の間に、発酵に
おける炭素源の供給は枯渇し、５０％空気飽和からｄＯ
Ｔにおいて急速増加を引き起こす。この時点から、グリ
セロール（７１４ｇｌ^-1）および硫酸アンモニウム（１
４３ｇｌ^-1）を含有する飼料を、細菌の酸素取り込み速
度（ＯＵＲ）を発酵槽の最大酸素移動速度の約８０％ま
でに制限する速度で、発酵槽へポンプ供給し、その間に
ｄＯＴは５０％空気飽和に戻り、次いでこれを維持し
た。

【００８３】バイオマス製造での流加発酵（fed-batch
fermentation）、全リシンＡ蓄積および可溶性フラクシ
ョン中でのリシン分配率への影響は、図１５、１６およ
び１７にそれぞれ表わした。流加発酵を開始した時点
は、それぞれの図に表示した（ＦＢ）。可溶性フラクシ
ョン中でのリシン分配率に関する流加発酵の効果は明ら
かである。

【００８４】例５ DS410（pICI 1187）のシングルバイアルをストックから
除去し、この培養１００μｌを除去し、即座にＬ−テト
ラサイクリンブイヨン６００ｍｌを含有する３つの２リ
ットルの三角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪機
上で３７℃で１６時間培養した後、フラスコの内容物
を、ＬＣＭ５０増殖培地（酵親エキス２０ｇ／ｌ）を含
有する３つの発酵槽に接種するために用いた。

【００８５】この発酵は３７℃で、２Ｍ硫酸および６Ｍ
水酸化ナトリウム溶液の自動添加により制御するつぎの
ｐＨで実施した。

【００８６】（Ａ） 発酵の間じゅうｐＨ６．７ （Ｂ） 接種後１０時間までｐＨ６．７、その後ｐＨ
６．０に調節 （Ｃ） 接種後１０時間までｐＨ６．７、その後ｐＨ
７．６に調節 この溶存酸素圧（ｄＯＴ）設定点は５０％空気飽和であ
り、最初に発酵槽攪拌速度を自動調節することにより制
御した。発酵槽への空気流は、最初に１容量容量／分に
相当して２０Ｌ／分であり、発酵槽攪拌速度が最大（１
０００ｒｐｍ）にたした場合に４５Ｌ／分に手作業で増
大させた。この発酵槽への空気流は、発酵の後半に向か
う場合、手作業で２０Ｌ／分に減少させ、攪拌速度は自
動的に約５００ｒｐｍに減少した。

【００８７】この発酵は２３時間実施され、この時間の
間に、光学密度（ＯＤ₅₅₀）、細胞乾燥重量、可溶性フ
ラクション中のリシンＡの蓄積および分配率を測定する
ためにサンプルを取った。リシンＡの蓄積は、公知のよ
うに、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクーマ
シーブルー（Coomassie blue）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルを走査することにより測定した。細胞の細胞質（可溶
性）および封入体（不溶性）フラクション中のリシンＡ
の分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波処
理溶菌にかけることにより測定した。

【００８８】酵親エキス（３３３ｇｌ^-1）の溶液は、接
種の後４．５時間から、発酵槽へ１．７ｇｌ^-1ｈ^-1でポ
ンプ供給された。

【００８９】発酵において炭素源が枯渇する場合（５０
％空気飽和からｄＯＴにおいて急速増加が引き起こされ
る）、グリセロール（７１４ｇｌ^-1）および硫酸アンモ
ニウム（１４３ｇｌ^-1）を含有する飼料を、細菌の最大
炭素需要に適合するために十分な速度で、発酵槽にポン
プ供給した。この制限された炭素源および硫酸アンモニ
ウムの供給速度は、次いで発酵の残りの間、変化させな
かった。

【００９０】３つの異なるｐＨ制御体系（Ａ、Ｂおよび
Ｃ）の効果を図１８、１９、２０および２１に示し、こ
れはバイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラクシ
ョン中に分配するリシンＡのパーセンテージおよび可溶
性リシンＡの計算された収量をそれぞれ示す。図２２は
発酵の間の増殖培地のｐＨを表わす。ｐＨ６．７〜ｐＨ
６．０への変更の可溶性リシンの収量に関する有利な効
果が明らかに示されている。

【００９１】例６ 例４に記載した発酵工程を繰り返すが、発酵槽の接種後
１１．５時間に、発酵温度を次第に減少させた。

【００９２】リシン可溶性の意想外な持続が観察され
た。図２３、２４および２５は得られた結果を示した。
図２５は工程中の発酵温度を表わした。

【００９３】プラスミドの製造 次に、先に使用したpICI 1187の製造を表わした。組換
えリシンＡを製造するために使用したベクターの誘導に
おける多様な中間工程を記載した。

【００９４】実験手順 １． 合成オリゴヌクレオチド 合成オリゴヌクレオチドは、リシン遺伝子の特異的ＤＮ
Ａ変更を導くために使用した。引き続き記載した全ての
オリゴヌクレオチドは Applied Biosystems 380A のＤ
ＮＡ合成装置で、Applied Biosystems Inc.により提供
された手引書に従って、５′−ジメトキシトリチル塩基
保護されたヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホラミジットおよび制御孔ガラス担
体に連結させた保護されたヌクレオシドから０．２マイ
クロモル規模で製造した。

【００９５】それぞれのオリゴヌクレオチドを、固体担
体から切り離し、全ての保護基を除去した後に、水（１
ｍｌ）に溶かし、濃度の測定のために２６０ｎｍでの吸
光度の測定を使用した。

【００９６】２． 酵素 多様な制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ変性酵素
は、次に記載する操作において使用される。これらは多
くの供給元（Amersham International, BethesdaResear
ch Laboratories, Boehringer Mannheim または New En
gland Biolabs）の一つから得られ、反応条件に関する
製造説明書に従って使用した。

【００９７】３． ジェネクリーン（Geneclean (TM)） このキットは１） ６Ｍヨウ化ナトリウム、２） 塩化
ナトリウム／水 エタノール／水洗浄を製造するための
塩化ナトリウム、トリスおよびＥＤＴＡの濃溶液；３）
グラスミルク（Glassmilk(TM)）−水中のシリカマト
リックスの懸濁液１．２５ｍｌを含有する１．５ｍｌバ
イアルからなる。

【００９８】これは、Vogelstein および Gillespie の
方法（National Academy of Sciences USAの会報(1979)
７６版、６１５頁に公開）を基礎とするＤＮＡ精製の
ための技術である。

【００９９】もう一つは、"Molecular Cloning - a lab
oratory manual" Second Edition,Sambrook, Fritsch
および Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 19
89)に記載された方法のいくつかが使用できる。

【０１００】４． シーケナーゼ（Sequenase(TM)） 化学的に変成したＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ Tabor および Richardsonの方法（"Proceedings of the
National Academy ofScience USA (1987) vol 84 pp 4
767-4771に公開）を基礎とする。

【０１０１】５． ｐＩＣＩ発現ベクターの組み立て ５．ａ） ｐＩＣＩ ００２０ プラスミドベクターｐＩＣＩ ００２０は、ｐＡＴ１５
３ベースのプラスミドであり、この中で、６５１ ｂｐ
ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ領域は、 （１） 合成Ｅ．コリー ｔｒｐ プロモータおよびｔｒ
ｐリーダーリボソーム結合部位 （２） 翻訳開始コドン （３） ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、
ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含有するＭ
１３ｍｐ１８から誘導された多重制限酵素認識配列 （４） 合成転写末端配列 からなる１６７ ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントに置き換えられる。

【０１０２】この領域のＤＮＡ配列は図１１に表わし
た。

【０１０３】合成ｔｒｐプロモータ配列を含有するプラ
スミドベクターの組み立て法は公開されている（Windas
s et al Nuc. Acids Res. 10 p6639-6657, 1982）。プ
ロモータフラグメントは、酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｐａ
Ｉを用いた消化および電気溶離（"Molecular Cloning -
A Laboratory Manual" Maniatis, Fristsch およびSam
brook, CSH laboratoryにより出版, 第２版１９８９お
よび後に "Maniatis"として報告）によりアガロースゲ
ルからの適当なバンドの精製の後で、このようなベクタ
ーから単離される。

【０１０４】本来のｔｒｐリーダーリボソーム結合部
位、翻訳開始コドンおよび３′ＫｐｎＩクローニング部
位を提供するプロモータフラグメントのＨｐａＩ末端に
リゲートすることとなる相補性合成オリゴヌクレオチド
のペアが製造される。このようなオリゴヌクレオチド
は、等モル濃度で混合され、１００℃に加熱されること
によりアニーリングし、引き続きゆっくりと室温に冷却
される。

【０１０５】このプロモータフラグメントおよびアニー
リングしたオリゴヌクレオチドを、次にリゲートし、適
当なバンドをポリアクリルアミドゲルから電気溶離によ
り単離した。次に、このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位中にクローンしたｔｒｐアテニュエーター配列
（合成オリゴヌクレオチドから生成した）を含有し、か
つアテニュエーターに対して３′に付加的ＣｌａＩ制限
部位を導入しているＭ１３ｍｐ１８ベクター誘導体とリ
ゲートさせた。このリゲートしたＤＮＡを、ＣａＣｌ₂
法（Maniatis, chapter 1p82）によりコンピテントにし
たＥ．コリー菌株ＪＭ１０９へトランスフェクションし
た。平板培養し、このプレートをインキュベートした
後、プラークを、あらかじめ単離したＥｃｏＲＩ−Ｈｐ
ａＩプロモータフラグメントのニックトトランスレーシ
ョン法により生成した³²Ｐ標識プローブを用いるBenton
および Davies (Maniatis, chapter 4p41) の方法によ
りスクリーニングした。一本鎖ＤＮＡはポジティブのハ
イブリット形成プラークから、標準方法（Maniatis, ch
apter 4p29）により製造し、いくつかのサプライヤー、
たとえばシークエナーゼ（United States Bioscience）
によりキットの形で提供されているように、Ｍ１３万能
プライマーおよびサンガーダイデオキシチェインターミ
ネーター法（Sanger dideoxy chain termination metho
d）を用いて配列決定させた。

【０１０６】ＲＦ ＤＮＡは、プロモータ／リポソーム
結合部位／アテニュエーターが確認された一つの単離物
から製造された。このＤＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＣｌ
ａＩを用いて消化され、適当なフラグメントが、前記し
たようにポリアクリルアミドゲルから単離される。プラ
スミドｐＡＴ１５３は酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩを
用いて消化され、単離したプロモータフラグメントとリ
ゲートされた。リゲートされたＤＮＡは、コンピテント
Ｅ．コリー ＨＢ１０１（Bethesda Research Laborator
ies）を形質転換するために用いられ、およびアンピシ
リン耐性コロニーが選択された。

【０１０７】多数のクローンからなるプラスミドＤＮＡ
が製造され、ＤＮＡ配列はＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ部
位の間の領域から誘導される。正確なプロモータ／アテ
ニュエーター領域を含有すると確認されたクローンは、
ｐＩＣＩ ００２０と命名した。

【０１０８】この組み立て法は図１に略述した。

【０１０９】５．ｂ） ｐＩＣＩ ００４２ ｐＩＣＩ ００４２（図１２）はプラスミドであり、そ
の中で、ｐＡＴ１５３の抗生物質耐性マーカーは、プラ
スミドＲＰ４からの単一な誘導テトラサイクリン耐性遺
伝子により置き換えられる（遺伝子ｔｅｔＡによりコー
ド化され、ｔｅｔＲ遺伝子の製造により調節される）。
この遺伝子は、Klock et al (J. Bacteriol. 161 p326-
332, 1985)により特徴が示された。プラスミド安定機能
（ｃｅｒ）も組み込まれていた。これは、製造工程の全
てのパートにおいて、β−ラクタム抗生物質にとっての
必要物を除き、最終生成物においてこれについて分析さ
せる。この新規の耐性マーカーは抗生物質の存在でのみ
表現されるため、ｔｅｔＡ遺伝子生成物は、プラスミド
をテトラサイクリンの不在で維持する培養中の組換えリ
シンＡの潜在的汚染物ではない。

【０１１０】このベクターの生成における最初の段階は
ｐＡＴ１５３の誘導体を製造することであり、これから
テトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子を完全に除
去された。合成オリゴヌクレオチドの相補性ペアは、ｐ
ＡＴ１５３からのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩフラグメント
を、その後のクローニングのための多様なユニーク制限
エンドヌクレアーゼを含有する短い配列に置き換えるた
めに設計された。

【０１１１】ｐＡＴ１５３プラスミドＤＮＡは酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＡｖａＩにより消化され、２．１７５Ｋｂ
ｐプラスミドＤＮＡフラグメントは Geneclean（Bio 10
1, California）を用いる０．７％アガロースゲルか
ら、製造説明書に従って単離した。テトラサイクリン耐
性遺伝子を含有する１．４２５Ｋｂｐフラグメントはこ
のようにして除去される。

【０１１２】このオリゴヌクレオチド（ｅｘｐ７９およ
び８０）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホ
スホリレート化され、等モル量を一緒にアニーリングさ
せた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドのサンプル
を、次いで、ｐＡＴ１５３からのプラスミドフラグメン
トとリゲートした。リゲートしたＤＮＡをＥ．コリーＨ
Ｂ１０１（ＢＲＬ）中へ形質転換させ、アンピシリン耐
性コロニーを選択した。

【０１１３】多様なコロニーを、小規模プラスミドＤＮ
Ａ製造のために取り（Maniatis, chapter 1p25 に明ら
かにされたようなBirnboim および Doly の方法）、所
望の組み立てを、適当な酵素、たとえばＥｃｏＲＩ、Ａ
ｖａＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限分析により確認し
た。正確な制限パターンを有するものとして確認された
３つの単離物の構造は、ｐＢＲ３２２ ＥｃｏＲＩ部位
右回りプライマー（New England Biolabs）を用いるＤ
ＮＡ配列分析により確認された。単離物をｐＩＣＩ００
１９と命名した。

【０１１４】ＲＰ４プラスミドＤＮＡは、現存のストッ
クから、Holmes および Quigley (Maniats, chapter 1p
29)の方法により単離した。このＤＮＡは、ＢｇｌＩＩ
を用いて、次いで部分的にＸｍａＩ（２５℃で、３５分
まで）を用いて、多様な時点でサンプルを取りながら、
ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡを含有する２．４５Ｋｂｐフラ
グメントが明らかに確認されるまで完全に切断した。ｐ
ＵＣ８ ＤＮＡのサンプル（Amersham International）
はＢａｍＨＩおよびＸｍａＩを用いて完全に消化させ
た。リゲーションは、テトラサイクリン耐性遺伝子をｐ
ＵＣ８へ挿入するために行なった。リゲートしたＤＮＡ
は、ＣａＣｌ₂法（Maniatis, chapter 1p82）によりコ
ンピテントにしたＥ．コリー Ｃ６００（Appleyard, R.
K. Genetics39 p440, 1954）を形質転換するために用ら
れ、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。プラス
ミドＤＮＡは８クローンから製造され（Holmes および
Quigley）、ＲＰ４ ｔｅｔＲおよびＡ遺伝子の存在は、
制限分析により確認された。これらの単離物の一つをｐ
ＴＢ３４４と命名した。

【０１１５】テトラサイクリン耐性遺伝子を、次に、ｐ
ＩＣＩ ００１９からのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメ
ントをｐＴＢ３４４からの相応するフラグメントに置き
換えることにより、ｐＩＣＩ ００１９（前記した）中
に挿入した。これは、結果として、ｐＩＣＩ ００１９
中のアンピシリン耐性遺伝子の大半がテトラサイクリン
耐性遺伝子に置き換えられることになる。プラスミドＤ
ＮＡの消化およびリゲート、引き続きＥ．コリー Ｃ６
００の形質転換の後、コロニーを、表現形、つまりＴｃ
^RおよびＡｐ^Sに基づき選択した。プラスミドＤＮＡをこ
のような４つのクローンから製造し、酵素、たとえばＢ
ａｍＨＩ／ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＳｔｙＩ／ＳａｌＩおよびＡｖａＩ／Ｐ
ｓｔＩの組み合わせを用いて消化させた。制限パターン
を製造した全ての４つのクローンは所望の組み立てと一
致している。これらの一つをｐＴＢ３５１と表わした。

【０１１６】Summers および Sherratt（Cell 36 p1097
-1103, 1984）は、ＣｏｌＥＩ（たとえばｐＡＴ１５
３）から誘導されたプラスミドの不安定性が、親プラス
ミド中に存在する２８３ｂｐ配列、ｃｅｒの損失を引き
起こすことを明らかにした。この配列は、プラスミドオ
リゴマーの形成の妨害を補助し、後者は、いまだ不確定
の方法で分配されるプラスミドを崩壊させると思われ
る。このｃｅｒ配列（Summers, D. et al MGG 201, p33
4-338, 1985）は、Prof. d. Scherrattにより、ｐＵＣ
１８（ｐＫＳ４９２）中にクローンされたフラグメント
の形で、念入りに製造された。ｐＫＳ４９２プラスミド
ＤＮＡは、ＢａｍＨＩおよびＴａｑＩを用いて消化さ
せ、２８９ｂｐのｃｅｒ含有フラグメントを放出させ
た。プラスミドｐＴＢ３５１ＤＮＡ（ｄａｍ^-宿主Ｅ．
コリー ＧＭ４８から単離、Arraj, J. A.および Marin
us, M. G. J.Bact. 153 p562-565, 1983）を、Ｂａｍ
ＨＩおよびＣｌａＩで完全に消化させ、所望のｐＫＳ４
９２ＤＮＡとリゲートさせた。コンピテントＥ．コリー
Ｃ６００のリゲートしたＤＮＡを用いた形質転換の
後、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。推定ク
ローンから酵素、ＡｖａＩ、ＭｌｕＩおよびＰｖｕＩを
用いたプラスミドＤＮＡの制限分析は、ｃｅｒの存在の
確認のために用いられた。正確な構造を有する単離物の
一つをｐＩＣＩ００４２と命名した。

【０１１７】このようなプラスミドの組み立ては、図２
および図３に概略した。

【０１１８】５．ｃ） ｐＩＣＩ １０７９ プラスミドベクターｐＩＣＩ １０７９は、アンピシリ
ン耐性のｐＡＴ１５３誘導プラスミドであり、これは、
ＥｃｏＲＩおよびＳｔｙＩ制限部位の間に次の要素： （ｉ） ファージλからのＣＩ８５７遺伝子 （ｉｉ） λＰ_Lプロモータ （ｉｉｉ） 合成リボソーム結合部位 （ｉｖ） 合成インターフェロンα２遺伝子配列 （ｖ） ファージＴ４からＳａｌＩおよびＳｔｙＩ
制限部位の間に誘導された合成転写ターミネーター配列
を含有する。この転写ターミネーターのＤＮＡ配列は図
１３に記載した。ｐＩＣＩ １０７９は図１４に示し
た。

【０１１９】ｐＩＣＩ １０７９は、ブタペスト条約に
基づき寄託されている。この寄託はNCIMB, 23 St Macha
er Drive, Aberdeen, Scotland で行なわれた。

【０１２０】このプラスミドは、リシンＡ発現クローン
ｐＩＣＩ １１８５（下記の７．ｄ参照）の生成のため
のＴ４転写ターミネーターの供給源を提供するために用
いられた。このプラスミドの生成のための出発点は、ｐ
ＩＣＩ １０４３である。ｐＩＣＩ １０４３はｐＩＣＩ
００２０（前記の３．ａ参照）をベースとしたプラス
ミドであり、この中で、λＰ_Lプロモータおよびインタ
ーフェロンα２遺伝子を含有する発現カセット（Edge e
t al Nuc. Acids Res. 11 p6419-6435, 1983）はＥｃｏ
ＲＩおよびＳａｌＩ部位の間に存在する。

【０１２１】オリゴヌクレオチドの相補的ペアは、５′
ＳａｌＩおよび３′ＳｐｈＩ付着末端を有するバクテリ
オファージＴ４の遺伝子３２から転写ターミネーターの
生成のために合成される。このフラグメントを、Ｓａｌ
ＩおよびＳｐｈＩで完全に消化したｐＩＣＩ １０４３
から単離したプラスミドフラグメントとリゲートした。
このように製造した中間プラスミド（ｐＩＣＩ １０７
８）は、Ｔ４ターミネーターおよびｔｒｐアテニュエー
ター配列の両方を連結して含有する。

【０１２２】相補的オリゴヌクレオチドの第２のペア
は、次に、ｐＩＣＩ １０７８のＳｐｈＩおよびＳｔｙ
Ｉ部位の間へ挿入することにより、ｔｒｐアテニュエー
ター配列（およびテトラサイクリン耐性遺伝子の残りの
部分）を置き換えるために使用した。ユニークＢａｍＨ
Ｉ部位は、この合成フラグメントの中で導入された。

【０１２３】この操作を、図４に概略した。

【０１２４】６． リシンＡ発現クローンの生成 ６．ａ） ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡの製造 リシンＡに対するｃＤＮＡを含有するクローン（ｐＵＣ
８ＲＡ）を生成した。このクローンは、プラスミドｐＵ
Ｃ８（Vieria, J and Messing, J. Gene, 19,p259, 198
2）中の公開されたｃＤＮＡ配列（Lamb, I. F., Robert
s, L. M., Lord, J.M. Eur. J. Biochem, 1985, 148, p
265-279）に従って、リーダー配列中の塩基番号−７４
からＢ−鎖内（塩基番号８５７）でＢａｍＨＩ部位まで
Ａ鎖ｃＤＮＡを含有する。さらに、部位突然変異は、成
熟リシンＡの最終コドンに対して３′付近の翻訳終止コ
ドンを生成するために用いられた（O' Hare, M et al F
EBS Letters, 1987, 216, p73-78に報告）。全体のＡ鎖
をコード化する領域はこのクローンからＢａｍＨＩフラ
グメントに含まれる。

【０１２５】少量のｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡは、
創作者から得られた。後の保存のために、このＤＮＡの
希釈液を、Ｅ．コリー ＤＨ５αコンピテント細胞（Be
thesda Research Laboratories）の形質転換のために使
用し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。このク
ローンからのプラスミドＤＮＡは変更 Birnboim-Doly法
（Maniatis, chapter 1p25）により製造した。このＤＮ
Ａのサンプルは、ＢａｍＨＩおよびＢａｎＩを用いて別
々に消化し、アガロースゲル上で電気泳動の後に、ＤＮ
Ａのオリジナルサンプルの相応する消化物と比較した。
制限パターンにおける差異は観察されず、これに基づき
２つのＤＮＡサンプルは同一と断定された。

【０１２６】６．ｂ） Ｍ１３へのサブクローニング ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物およ
びファージＭ１３菌株Ｋ１９（Anglian Biotechnolog
y）からのＲＦ（複製型）ＤＮＡは、標準の条件（Mania
tis, chapter 1p68）を用いて「ショットガン」リゲー
トした。対照リゲーションも実施される。これらのリゲ
ートされたＤＮＡは、ＣａＣｌ₂法（Maniatis, chapter
1p82）によりコンピテントにしたＥ．コリー菌株ＴＧ
１（Gibson,1984/Anglian）を形質転換するために用い
られた。

【０１２７】有効リゲーションおよび組換えファージを
表わす形質転換頻度は子孫に現われた。組換えファージ
は、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の破壊の
ためＩＰＴＧ＋Ｘ−ｇａｌ（ＢＲＬ）含有プレート上に
透明プラークを生じることが予想される。野生型ファー
ジは、βガラクトシダーゼによるＸ−ｇａｌの転換のた
め青色プラークを生じる。

【０１２８】多数の透明プラークを一本鎖ＤＮＡの製造
のために取った。溶菌したファージ懸濁液の直接ゲル電
気泳動は、ファージクローンが、リシンＡ鎖コード化配
列を配列決定により確認されたかなりの大きさの挿入物
を含有することを示した。成熟リシンＡコード化配列の
１８２塩基だけが確認されたが、これは完全なリシンＡ
遺伝子の存在についての十分な形跡として受け取られ
た。このクローンはＭ１３Ｋ１９ＲＡと命名した。

【０１２９】６．ｃ） Ｍ１３Ｋ１９ＲＡの突然変異誘
発 成熟リシンＡの開始部でｐＩＣＩ発現ベクターと一致す
るＫｐｎＩ部位の生成のために、次の変化（アンダーラ
インで示した）が必要である：

【０１３０】

【化１】

【０１３１】を次のように変化させ：

【０１３２】

【化２】

【０１３３】ＡＴＧコドンがオーバーラップするＫｐｎ
Ｉ部位が生じる。ＫｐｎＩフラグメントを含有するリシ
ンＡを、突然変異体から取り出し、一連のＩＣＩ発現ベ
クター中に挿入することができる。２つのＮ末端アミノ
酸修飾が行なわれた（ｉｌｅ−ｐｈｅからｍｅｔ−ｖａ
ｌ）。

【０１３４】Ｍ１３Ｋ１９ＲＡから製造した一本鎖ＤＮ
Ａは、それぞれの突然変異戦略のための突然変異誘発工
程のための鋳型である。この戦略のための突然変異的な
全ての変化を誘導する一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＴ
Ｒ１６）が合成された。

【０１３５】

【化３】

【０１３６】多様な手引書が、部位突然変異による特異
的ＤＮＡ配列変化の導入のために存在する。以下に概略
したこれらの手引書は 、キットの形で提供されている
ような、Eckstein et al（Nuc. Acid Res., 1985, 13 p
8749-8764 および 1986, 14,p9679-9698）の方法を用い
て達成され、その製造手引書に従って使用した。

【０１３７】この方法の原則は、一本鎖ＤＮＡ鋳型に突
然変異オリゴヌクレオチドを挿入し、ｄＡＴＰの代わり
にｄＡＴＰαＳを組み込んだ相補的鎖を合成することで
ある。このヌクレオチドの使用は、ホスホロチオエート
結合の形成を生じさせ、この結合は特定の制限酵素（た
とえばＮｃｉＩ）により分解されない。第２の鎖の合成
の後に、ＮｉｃＩは親鎖の切開のために用いられ、エキ
ソヌクレアーゼＩＩＩは突然変異点を過ぎて後方を消化
させるために添加した。ＤＮＡポリメラーゼＩは親鎖を
最合成させる。結果として、この突然変異オリゴヌクレ
オチドは最合成の鋳型として行動し、この突然変異は、
形質転換する前に双方の鎖に導入される。全子孫の９６
％までの突然変異頻度が要求され、スクリーニングはＤ
ＮＡ配列分析のためランダムでプラークをピッキングす
ることにより簡単に行なわれた。

【０１３８】ここでの実験において、４つのプラークの
中の４つが正確に突然変異を起こしていた。

【０１３９】突然変異体（ＭＲＡ１６）が選択されてか
ら、ＲＦ ＤＮＡが製造され、新たに生成された制限フ
ラグメント、たとえばＫｐｎＩの存在について確認し
た。

【０１４０】６．ｄ） クローニング、発現および最初
の特性表示 発現ベクター（セクション５参照）の一連のｐＩＣＩ
は、Ｔｒｐプロモータに隣接したユニークＫｐｎＩ制限
部位中に、クローンされたＤＮＡフラグメントを受け入
れることができる。ＫｐｎＩ部位は翻訳開始コドン（Ａ
ＴＧ）をオーバーラップし、これはこのプロモータの S
hine-Dalgarno 部位（ＡＧＧＡ）から８ｂｐ下方に位置
している。

【０１４１】ＭＲＡ１６の配列の確認の後、大規模の
（-５μｇ ＲＦ ＤＮＡ）ＫｐｍＩ消化を行ない、関連
するリシンＡコード化ＤＮＡフラグメントを、製造手引
書に従って、アガロースゲル（Nu-Sieve GTG アガロー
ス、FMC Bio-生成物）から、切除したゲルスライスのフ
ェノール抽出により単離した。

【０１４２】ｐＩＣＩ ００２０（５ａ参照）は、Ｋｐ
ｎＩで消化され、次に、子牛腸アルカリ性ホスファター
ゼ（ＣＩＰ−Boehringer Mannheim）を用いて脱ホスホ
リレートした。後の処理は、リゲーションの際のベクタ
ーの再環化を防ぎ、これは形質転換子孫中の親の高い割
合を導く。

【０１４３】リゲーションは、多様な戦略のために、
８：１（ｗ／ｗ）〜１：３のプラスミドベクター対単離
したフラグメントの割合で始めた。ホスファターゼ処
理、リガーゼ活性等の効果を試験するための対照リゲー
ションを包含した。このリゲーション条件は、使用した
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs or Amersh
am）の供給源にとって適当であった。反応物は一般に１
５℃で一晩中インキュベートした。

【０１４４】それぞれのリゲーション（５μｌ）反応物
の５０％を１００μｌまで１×ＴＮＥ（トリス５０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）で希釈し、コ
ンピテントＥ．コリー ＤＳ４１０２００μｌを添加し
た。標準の形質転換手引書（Maniatis, chapter 1p74）
に従って、細胞を、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍ
ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加さ
れたＬ寒天上にプレートし、３７℃で一晩中インキュベ
ートした。Ｅ．コリー ＤＳ４１０は染色体ストレプト
マイシン耐性遺伝子を有している。

【０１４５】形質転換プレートはインキュベートの後に
試験された。一般に、５〜１０倍以上のクローンが、リ
ガーゼなしの対照と比較したリゲーションにおいて見ら
れた。これらのいくつかの場合、リガーゼの存在または
不在で産生されるクローンの数においてわずかな差異が
生じ、ベクターの不完全な消化または乏しいリガーゼ活
性を示す。

【０１４６】形質転換体、さらに関連する対照を、ハイ
ブリダイゼーションスクリーニングのためのＬ寒天プレ
ート上に置いたニトロセルロースフィルターに取った
（Maniatis, chapter 1p98に記載されたように、Grunst
ein および Hognessの方法を基礎とする）。インキュベ
ートの後、コロニーを１０％ＳＤＳおよび１ＭＮａＯＨ
を用いてその場で溶菌し、１Ｍトリス（ｐＨ７．５）を
用いて中和し、真空中で８０℃で３時間乾燥した。

【０１４７】ハイブリダイゼーションプローブを、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いる突然変異オリゴヌク
レオチドの³²Ｐ標識により生成した。このフィルター
は、室温で試験され、次いで、５５〜６５℃までの範囲
内で洗浄し、オートラジオグラフィーの前に、非特異的
結合カウントを除去した。特異的ハイブリダイゼーショ
ンは推定のリシンＡＤＮＡ含有クローンを示す。

【０１４８】小規模ＤＮＡ製造（Maniatis, chapter 1p
25に特徴付けられたように、Holmesおよび Quigley ま
たは Birnboim-Dolyの方法による）はポジティブな雑種
形成クローンから作られた。このＤＮＡは、関連する制
限酵素、たとえばＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩ
Ｉを用いて消化され、アガロースゲル上での電気泳動に
より分析した。ベクターＤＮＡおよび突然変異ＲＦ Ｄ
ＮＡは、これらの酵素により切断され、正確なクローン
について予想されるフラグメントサイズが立証された。

【０１４９】それぞれのクローンの大規模プラスミドＤ
ＮＡ製造（Birnboim-Doly）は、より詳細な制限分析、
たとえばＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩおよびＳｃａＩのために
使用された。アガロースゲル上で、これらの消化物は挿
入されたフラグメントのサイズ、この配向の表示、およ
びいくつかのユニークリシンＡ−鎖酵素部位の獲得を示
した。

【０１５０】６．ｅ） 発現調査 ハイブリダイゼーションおよび制限スクリーニングによ
りポジティブと同定されたこれらのクローンは、全細胞
リゼイトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりリシンＡの発現
について試験した。発現調査のための標準条件を次に示
す：１） Ｌ−ブイヨン＋抗生物質１０ｍｌに単一コロ
ニーを接種し、温和に振盪させながら一晩中３７℃で生
長させた。

【０１５１】２） 一晩たったＬ−ブイヨン７５０μｌ
を取り、マイクロフュージ（microfuge）中で、（６５
００ｒｐｍで１分）細胞をペレット化させた。

【０１５２】３） ペレットをＭ９培養基（Maniatis,
appendix A.3）３００μｌ＋０．０２％のカゼイン水解
物＋０．２％グルコース＋チアミン５０μｇ／ｍｌに再
懸濁させ、同様のもの１０ｍｌへ接種した。

【０１５３】４） 温和に振盪させながら７時間または
一晩中３７℃でインキュベートした。

【０１５４】５） インキュベートの後、ＯＤ₅₄₀を測
定し、セルをペレット化させ、ＯＤ₅₄₀＝１０ｐｅｒ
ｍｌまで、Ｌｅａｍｍｌｉ試料緩衝液（Maniatis, chap
ter 18p53）中に再懸濁させた。１５分間煮沸した。

【０１５５】６） 全細胞リゼイト２０μｌをＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル上に移し、電気泳動し、クーマシ
ーブルーで染色し、脱色し、可視化した。

【０１５６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調査したクローン
の中の一つだけは、^-２９ＫＤの等しい分子量を有する
付加的バンドを示した（非グリコシル化した、成熟リシ
ンＡに対して評価されたものと同じ）。ゲル走査は、全
細胞タンパク質の５〜１０％の範囲内までの発現レベル
を示した。このクローンはｐＩＣＩ １１０２と命名し
た。

【０１５７】ｐＩＣＩ １１０２の組み立ては図５に概
略した。発現調査の結果は図６および図７に示した。

【０１５８】６．ｆ） 組換えリシンＡのウエスタント
ランスファーおよび免疫検出 組換えリシンＡ−鎖タンパク質の確認は、まず、ＳＤＳ
−ポリアクリレートアミドゲルのクーマシーブルー染色
により観察し、ウエスタンブロットにより確認された。
タンパク質バンドはニトロセルロースフィルターに移さ
れ、リシンＡに特異的な抗体、引き続きペルオキシダー
ゼにより標識付けしたアンチグロブリンを用いて検出し
た。

【０１５９】１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、８ｍＡで
一晩中経過させ、少なくとも３０分間トランスファー緩
衝液中で平衡させた。

【０１６０】次に、ゲル上のタンパク質バンドを、Bio-
Rad Trans Blot 装置中で７０Ｖで電気泳動により、ニ
トロセルロース膜に移した。このフィルターは、乾燥し
た後、封止したプラスチックバック中で−２０℃で貯蔵
することができる。

【０１６１】リシンＡ．１は、ウサギにおいて、リシン
Ａの合成ペプチドフラグメントに対抗する多クローン性
抗体である。予備の調査はリシンＡについての良好な親
和性を示すが、多数のＥ．コリータンパク質とのかなり
の交差反応性を示す。この交差反応性により引き起こさ
れる高いバックグラウンドを克服するため、抗体はＥ．
コリーリゼイトで予備インキュベートした。

【０１６２】このように、Ｅ．コリー菌株ＤＳ４１０の
Ｌ−ブイヨン一晩培養液１０ｍｌを、４０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離し、細胞をペレット化させた。このペ
レットを細菌緩衝液５ｍｌに再懸濁させ、氷上で３０秒
間隔で冷却しながら、４〜６μで６×１０秒バーストで
音波処理した。

【０１６３】音波処理物０．５ｍｌを、次に、リシン
Ａ．１抗血清０．５ｍｌと混合し、室温で９０分間イン
キュベートした。細胞の残骸は５分間１３０００ｒｐｍ
でスピンダウンし上澄みを−２０℃で貯蔵した。

【０１６４】ウエスタントランスファーからのニトロセ
ルロースフィルターは、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン
中で室温での一晩のインキュベーションによりブロック
した。（ＰＢＳ ツイーン＝ＰＢＳ１リットルあたりツ
イーン２０ ５ｍｌ）。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分
間洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中のブ
ロックされたリシンＡ．１抗体の１／４０００希釈液を
用いて、室温で２時間（または一晩中）インキュベート
した。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。０．
５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中のヤギ−抗−ウサギ抗
血清の１／１０００希釈液を用いて１時間インキュベー
トした。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。
０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ツイーン中のウサギペルオキ
シダーゼ−抗−ペルオキシダーゼ抗血清の１／５０００
希釈液と共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢ
Ｓ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。ＰＢＳで１２０
ｍｌにし、過酸化水素１２μｌを含有するメタノール２
０ｍｌ中の４−クロロナフトール（６０ｍｇ）の溶液中
で浸漬することにより展開した。バンドが可視化すると
すぐにこの膜を溶液から除去し、乾燥し、撮影した。

【０１６５】典型的なウエスタンブロット分析を図８に
示した。

【０１６６】６．ｇ） 組換えリシンＡタンパク質の生
物学的アッセイ この目的は、Ｅ．コリー細胞からリシンＡ鎖精製の間に
生成した試料を、無細胞試験管内タンパク質合成アッセ
イにおける生物学的活性についての試験を行なうことが
できる条件を確定することであった。

【０１６７】ウサギの網状赤血球リゼイトを、Allen お
よび Schweet（J Biol Chem (1962), 237, 760-767）の
方法により製造した。このアッセイは、新規に合成され
たタンパク質中へ¹⁴Ｃ標識ロイシンの組み込みの欠乏に
より、無細胞系におけるタンパク質合成の阻害を証明し
た。

【０１６８】６．ｇ ｉ） アッセイ手引書 ストック溶液：１ｍＭアミノ酸混合物−ロイシン。ロイ
シンを除く全てのＬ−アミノ酸を１ｍＭで含有する溶液
（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節し、−７０℃で貯蔵）。

【０１６９】溶液Ａ 酢酸マグネシウム ４０ｍＭ 酢酸アンモニウム ２Ｍ トリス ０．２Ｍ （ＨＣｌでｐＨ７．４、４℃で貯蔵） 溶液Ｂ ＡＴＰ（シグマ Ａ５３９４） ２４６ｍｇ／ｍｌ ＧＴＰ（シグマ Ｇ８７５２） ２４．４ｍｇ／ｍｌ アッセイ混合物：アミノ酸混合物 １ｍｌ 溶液Ａ １ｍｌ 溶液Ｂ ０．１ｍｌ クレアチンホスフェート １０３ｍｇ クレアチンキナーゼ １ｍｇ Ｈ₂Ｏ ５１０μｌ Ｌ−¹⁴Ｃ−ロイシン（New England Nuclear, NEC-279
E） ６００μｌ（６０μＣｉ） 反応混合物：テストサンプル ２５μｌ アッセイ混合物 １２．５μｌ ウサギ網状赤血球リゼイト ２５μｌ ブランク溶液はＰＢＳ中のＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌ 全てのアッセイは２重で行なった。

【０１７０】アッセイ混合物１２．５μｌを無菌ガラス
管に置いた。ブランクのために最初の４つにＰＢＳ中の
ＢＳＡ ２５μｌを添加した。テストサンプル２５μｌ
を残りの試験管に添加した。０．１Ｍ ＫＯＨ １ｍｌ
を最初の２つの試験管に添加した（バックグラウンドブ
ランク）。これらの試験管を水浴中で２８℃に平衡させ
た。ウサギ網状赤血球リゼイト（液体窒素温度から溶か
した）２５μｌを、２０秒間隔でそれぞれの試験管に添
加した。最初の試験管を１２分間インキュベートした際
に、０．１Ｍ ＫＯＨ １ｍｌを、再び２０秒間隔でそれ
ぞれの試験管に添加し、全ての試験管を１２分間インキ
ュベートさせた。２０％の過酸化水素を２滴、それぞれ
の試験管に添加し、引き続き２０％ＴＣＡ１ｍｌを添加
した。試験管内容物を混合し、少なくとも１時間、また
は一晩中４℃で放置した。沈殿物を、２．５ｃｍのＧＦ
Ｃディスクで濾過し、５％ＴＣＡ３×４ｍｌで洗浄し、
シンチレーションバイアルに移し、シンチラント（Read
y-Solv. MP, Beckman）１０ｍｌを添加した。１時間後
にこのバイアルを振盪し、計測した。

【０１７１】６．ｇ．ｉｉ） Ｅ．コリーリゼートを用
いるための技術の確立 Ｌ−ブイヨン一晩培養液１０ｍｌを３７℃で生長させ
た。アリコート４００μｌを１３０００ｒｐｍで３０秒
間ペレット化させ、上澄み液の大半をデカントした。

【０１７２】このペレットに、ドライアイス／ＥｔＯＨ
中での急速冷凍、引き続き３７℃で解凍を２回行なっ
た。トリスＨＣｌ ｐＨ８．０ ５０ｍＭ中の２５％の
スクロース１２μｌを添加し、引き続きリゾチームの１
０ｍｇ／ｍｌ溶液４μｌを添加した。

【０１７３】１５分間氷上でインキュベートした後、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ８μｌを添加し、１５分間インキ
ュベートを続けた。サンプルを水で４００μｌに希釈す
ることにより、浸透圧により溶菌を起こさせた。この方
法は１ｍｌあたり８０〜１００のバイアル細胞数を製造
した。

【０１７４】このリゼイトのアリコート２５μｌをアッ
セイ反応混合物に添加する場合、新たに合成されたタン
パク質への¹⁴Ｃ−ロイシンの組み込みのレベルは、リゼ
ートを除いてブランクの-１０％であった。これは、リ
シンＡ８ｎｇ／ｍｌにより製造されたものと同様の阻害
のレベルであった。Ｅ．コリーリゼイトの希釈物を、次
に製造し、このアッセイを繰り返した。この結果は、ブ
ランクのものと等しくなるまで、最小の１６−倍の希釈
物がリゼイトの効果の減少のために必要であったことを
明らかに示した。

【０１７５】Ｅ．コリーの溶菌およびＥ．コリーリゼイ
トはリシンＡ毒性に影響を及ぼさないことを可能なかぎ
り確実にするため、２対照アッセイを行なった。最初
は、植物由来のリシンＡを、１６倍希釈Ｅ．コリー細胞
ペレットに添加し、細胞溶菌後のアッセイ混合物中の８
ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。双方のこの対照は、リシ
ンＡの阻害活性に関してリゼイトまたは溶菌手順からの
有害な影響を示さなかった。

【０１７６】これらの技術は、生化学的活性、ｐＩＣＩ
１１０２からの組換えリシンＡおよび次に記載するク
ローンの合成を確認するために用いた。

【０１７７】６．ｈ） ＤＮＡ配列分析 プラスミドＤＮＡ配列決定は、ｐＩＣＩ １１０２の分
析のために用いた。この選択した手引書は Zagursky et
al（Gene Analysis Techniques Vol 2, No.5）から修
正され、プライマーのアニーリングの前の二本鎖プラス
ミドＤＮＡのアルカリ性変性および多様な製造元からキ
ッドの形（たとえばシーケナーゼ（United States Bios
cience）で提供されるような標準の手順による配列決定
を包含する。β−ラクタマーゼの３′末端で取り付ける
ためのオリゴヌクレオチドおよび多数のＡ鎖中間プライ
マーを使用する際に、プロモータおよびリシンＡ遺伝子
の双方の鎖の配列決定が可能であった。

【０１７８】この最初の配列決定データは、付加的Ｋｐ
ｎＩフラグメントがプロモータとリシンＡをコード化す
る配列との間に存在するという意想外の結果を示した。
すなわち：

【０１７９】

【化４】

【０１８０】付加的ＫｐｎＩフラグメントは、Ｍ１３Ｋ
１９ＲＡから得られ、制限酵素部位に加えてｐＵＣ８Ｒ
Ａからクローンしたリシンリーダー配列を含む。リシン
Ａ鎖の５′領域は突然変異誘発の間に誘導される塩基変
化を含む。

【０１８１】この配列の調査は、最初の翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）がリシンＡをコード化する領域の枠外にある
ことを表わす。さらに、枠内の終止コドン（ＴＡＧ）は
リシンＡ開始コドンおよび第２のＡＴＧからの翻訳の再
開始することができる推定 Shine-Dalgarno 配列（ＡＧ
ＧＡ）の前にある。

【０１８２】その後の調査は、意想外に、Ｅ．コリー中
のリシンＡ鎖の蓄積レベルに関して、この付加的ＤＮＡ
フラグメントが、これを削除してあるものからのクロー
ンと比較して明らかな利点を与えたことを表わした。

【０１８３】ｐＩＣＩ １１０２に含まれるリシンＡ遺
伝子の完全ＤＮＡ配列は図９に示した。

【０１８４】７． 引き続くリシンＡ発現クローンの生
成 ７．ａ） サブクローニングさせるためのリシンＡクロ
ーンｐＩＣＩ １１０２の突然変異 リシンＡ発現について完全な方向で、偶発的に生成した
ｐＩＣＩ １１２０からの２つのＫｐｎＩフラグメント
をサブクローニングすることは困難である。従って、単
一塩基置換（ＡからＴ）により、最初のＫｐｎＩ認識部
位を変更することを計画した。これは、この部位でのＫ
ｐｎＩ開裂を妨げ、単一のＫｐｎＩフラグメントのｔｒ
ｐ／ＲＢＳベクターへの部位へサブクローニングさせ
る。ＫｐｎＩ認識部位（ＧＧＴＡＣＣ）のアデニンを、
チミン（たとえばＧＧＴＴＣＣ）に置換する際に、リシ
ンＡの最初の残基は変更しない（ＧＴＡ／ＧＴＴ＝Ｖａ
ｌ）。たとえば：

【０１８５】

【化５】

【０１８６】を次の用の変化させる：

【０１８７】

【化６】

【０１８８】この変化を製造するために合成したオリゴ
ヌクレオチドが、アンダーラインで示した塩基は突然変
異的変化を表わす次の配列： 5′ ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3′ を有する。

【０１８９】比較による発現調査のために、突然変異し
たリシンＡフラグメントをｔｒｐ発現ベクターの部位へ
クローンすることを計画した。ｐＩＣＩ ００２０への
クローニングは、単一塩基置換が合った場合に、発現に
関する効果を測定するために、ｐＩＣＩ １１０２との
比較を提供する。

【０１９０】７．ｂ） 突然変異誘発 突然変異誘発のための鋳型はＭＲＡ１６であり、これは
ｐＩＣＩ １１０２中に存在する２つのＫｐｎＩフラグ
メントを含むＭ１３クローンである。突然変異誘発の後
に、所望の突然変異を有する単離体は、ランダムサンプ
リングおよび突然変異オリゴヌクレオチドが特異的に結
合する部位にわたるＤＮＡ配列測定により確認された。

【０１９１】突然変異した鋳型は、ＭＲＡ２２と命名さ
れた。これは、さらに、非特異的突然変異の不在の確認
のために、完全なリシンＡをコード化する配列のＤＮＡ
配列測定により分析された。

【０１９２】７．ｃ） サブクローニング 突然変異した一本鎖ＤＮＡは、単一プラークを製造する
コンピテントＥ．コリーＴＧ１細胞に形質転換するため
に用いられた。次に、個々のプラークをピッキングし、
複製型（ＲＦ、二本鎖）ＤＮＡを、塩化セシウム／エチ
ジウムブロミド浮遊密度勾配でバンド形成させることに
より精製した。精製したＲＦＤＮＡはＫｐｎＩにより完
全に消化された。クローニングは、適当なＫｐｎＩ切断
により消化したＲＦ ＤＮＡと、ホスファターゼ処理し
た発現ベクターとのショットガンリゲーションにより、
またはアガロースゲルからのその精製後のリシンＡの特
異的リゲーションにより行なわれた。リゲートしたＤＮ
ＡはＥ．コリーＴＧ１またはＨＢ１０１へ形質転換され
た。

【０１９３】リシンＡを含有するクローンは、他のリシ
ンＡを含有するクローン（ｐＩＣＩ１１２１）から単離
したＫｐｎＩフラグメントのランダムヘキサヌクレオチ
ドプライミングにより製造した³²Ｐ標識リシンＡプロー
ブを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングによ
り同定された。ポジティブなハイブリダイゼーションを
示すコロニーは、さらにＫｐｎＩ単一消化およびＥｃｏ
ＲＩ／ＢｇｌＩＩ二重消化を用いるプラスミドＤＮＡの
制限分析によりスクリーニングした。ＫｐｎＩは挿入さ
れたフラグメントのサイズを同定し、ＥｃｏＲＩ／Ｂｇ
ｌＩＩはフラグメントの配向を測定する。

【０１９４】発現のための完全な配向においてリシンＡ
フラグメントを有しているとして確認されたクローン
は、クローン選択成長およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
析、引き続きクーマシー染色および複製ゲルのウエスタ
ンブロッティングにかけられる。これらのクローン中の
リシンＡ蓄積のレベルは、ｐＩＣＩ １１０２から検出
したものと同様であった。

【０１９５】単離物を選択し、ｐＩＣＩ １１３１と命
名した。

【０１９６】７．ｄ） 択一的転写ターミネータ要素の
使用 これら実験において、ｔｒｐプロモータおよびリシンＡ
フラグメントは、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用い
た消化により切り取られる。後者の酵素は、リシンＡを
コードする配列の３′末端およびｔｒｐＡ転写ターミネ
ータとの間を開裂する。生じたフラグメントは、アガロ
ースゲル（２％ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース、FM
C Bioproducts）から切り取られ、フェノールおよびク
ロロホルム抽出により、引き続きエタノール沈殿により
精製した。この精製したフラグメントは、ＥｃｏＲＩお
よびＳａｌＩにより切断されたｐＩＣＩ １０７９とリ
ゲートされた。後者のプラスミドはユニークＳａｌＩと
ＳｐｈＩ部位との間にＴ₄ターミネータを有する。

【０１９７】リゲートしたＤＮＡは、コンピテントＥ．
コリーＨＢ１０１（ＢＲＬ）を形質転換するために用い
られ、ハイブリダイゼーションスクリーニングは、先の
実験においてと同様に、リシンＡ ＤＮＡの存在を検出
するために用いられた。ポジティブにハイブリッドした
クローンはプラスミドＤＮＡ製造のために、引き続いて
適当なサイズのフラグメントの存在を確認すると共に、
ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いた制限分析のために選
択される。

【０１９８】完全な組み立てを有する単離物を同定し、
ｐＩＣＩ １１８５と命名した。

【０１９９】７．ｅ） 択一的プラスミドバックグラウ
ンドの使用 プラスミドＤＮＡは、ｐＩＣＩ １１８５から製造さ
れ、ｔｒｐプロモータ／ＲＢＳ１／リシンＡ（ＭＲＡ２
２）フラグメント／Ｔ₄ターミネータを有する発現カセ
ットを切り取ると共に、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用
いて消化した。このフラグメントは、６．ｄに概略した
方法により単離され、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにより
切断したｐＩＣＩ ００４２とリゲートさせた。

【０２００】リゲートしたＤＮＡは、Ｅ．コリーＨＢ１
０１を形質転換するために用いられた。ＨＢ１０１形質
転換は、Ｌ寒天＋テトラサイクリンにプレートし、３７
℃で一晩中インキュベートし、コロニーを³²Ｐ標識リシ
ンＡ ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション
によりスクリーニングした。

【０２０１】両方の場合において、ポジティブに同定さ
れたクローンは、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ／ＢｇｌＩＩ消化を用いるプラスミドＤＮＡの制限分
析により確認した。３つの単離物が同定され、この一つ
（ｐＩＣＩ １１８７）は前記した形質転換において用
いられた。図１０にｐＩＣＩ １１８７の組み立てを概
略した。

【０２０２】次のものは、本発明において参照された配
列のリストである。この配列は、通常５′から３′の方
向で記載されている。

【０２０３】配列ＩＤ番号 １ 配列長さ： ２１塩基 配列タイプ： ヌクレオチド 鎖の形態： 一本鎖 トポロジー： 直線 GATAACAACA TATTCCCCAA A 21 配列ＩＤ番号 ２ 配列長さ： ２１塩基 配列タイプ： ヌクレオチド 鎖の形態： 一本鎖 トポロジー： 直線 GATAACAACA TGGTACCCAA A 21 配列ＩＤ番号 ３ 配列長さ： ２１塩基 配列タイプ： ヌクレオチド 鎖の形態： 一本鎖 トポロジー： 直線 AACAACATGG TACCCAAACA A 21 配列ＩＤ番号 ４ 配列長さ： ８６塩基 配列タイプ： ヌクレオチド 鎖の形態： 一本鎖 トポロジー： 直線 AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC ACATTAGAGG 60 ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC ８６

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＩＣＩ００２０の構成を説明する図；

【図２】ｐＴＢ３４４の構成を説明する図；

【図３】ｐＩＣＩ００４２の構成を説明する図；

【図４】ｐＩＣＩ１０７９の構成を説明する図；

【図５】ｐＩＣＩ１１８７の構成を説明する図、

【図６】Ｅ．コリーリゼートのクマシーブルー染色ＳＤ
Ｓゲルを示す図、

【図７】ピークＲがリシンＡを示しているｐＩＣＩ１１
０２のゲルプロフィルを示す図、

【図８】ｐＩＣＩ１１０２により産生されたリシンＡの
ウエスタンブロットを示す図、

【図９】ｐＩＣＩ１１０２の部分配列を示す図、

【図１０】ｐＩＣＩ１１０２の構成を説明する図、

【図１１】プラスミドの製造で用いられるフラグメント
を示す図、

【図１２】ｐＩＣＩ００４２のプラスミド地図、

【図１３】転写ターミネーターの配列を示す図、

【図１４】ｐＩＣＩ１０７９のプラスミド地図、

【図１５】ＤＳ４１０に関するバイオマスに及ぼす流加
培養の影響を示す図；

【図１６】ＤＳ４１０に関する全リシン蓄積に及ぼす流
加培養の影響を示す図、

【図１７】ＤＳ４１０に関する可溶性フラクション中の
リシンＡの分配率に及ぼす流加培養の影響を示す図

【図１８】バイオマス濃度に及ぼすｐＨの影響を示す図

【図１９】全リシンＡ蓄積に及ぼすｐＨの影響を示す図

【図２０】可溶性フラクション中の可溶性リシンＡ分配
率に及ぼすｐＨの影響を示す図

【図２１】可溶性リシンＡの収量に及ぼすｐＨの影響を
示す図

【図２２】使用ｐＨプロフィルを示す図

【図２３】可溶性リシンの収率（％）に及ぼす冷却の影
響を示す図

【図２４】可溶性リシンの収量（ｍｇ／ｌ）に及ぼす冷
却の影響を示す図、

【図２５】発酵温度と時間の関係を示す図

フロントページの続き (72)発明者 ロバート クライグ ホックニー イギリス国 チェシャー マックレスフィ ールド オールダリー パーク （番地な し) (72)発明者 ジョン エドワード フィットン イギリス国 チェシャー マックレスフィ ールド オールダリー パーク （番地な し)

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドの製法において、この方法
   は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を
   生長培地中で培養し、かつ、（ａ） この方法の間に生
   長培地のｐＨを調節し、場合により、この方法の間に生
   長培地の温度を低下させるか又は、（ｂ） ｐＨを宿主
   の生長に好適な値に保持し、この方法の間に生長培地の
   温度を低下させ、こうして可溶性ポリペプチドを得るこ
   とを特徴とする、ポリペプチドの製法。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドを発現させることので
   きる宿主を、生長培地中でこの宿主の生長に好適な第１
   のｐＨで当初期間の間培養し、このｐＨを第２の値に調
   節し、かつこの宿主を、前記の第２ｐＨ値で更なる期間
   培養することを特徴とする、ポリペプチドの製法。
3. 【請求項３】 この方法は、流加培養型の発酵であり、
   ここで、ｐＨを、流加培養条件に達する前に調節する、
   請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 培養の終末部の間に、温度を低下させ
   る、請求項２又は３記載の方法。
5. 【請求項５】 温度を、最初の約３７℃の値から約２５
   ℃以下の値まで低下させる、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 ｐＨを、最初の値から第２の値まで低め
   ることにより調節する、請求項１から５までのいずれか
   １項記載の方法。
7. 【請求項７】 宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチ
   ドは、リシンＡ及びその類縁体より成る、請求項６記載
   の方法。
8. 【請求項８】 宿主は、Ｅ．コリーＤ４１０より成る、
   請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 ｐＨを約６.７の値から約５.５〜６.７
   の値まで調節する、請求項７又は８記載の方法。
10. 【請求項１０】 リシンＡの製法において、この方法
    は、リシンＡを発現させることのできる宿主を培養し、
    ここで宿主はＥ．コリーＤＳ４１０より成ることを特徴
    とするリシンＡの製法。
11. 【請求項１１】 ポリペプチドの製法において、この方
    法は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主
    を、生長培地中で、この宿主の生長及び可溶性ポリペプ
    チドの形成に好適な温度で培養し、この生長培地をこの
    培養の終末部の間に冷却し、この終末部の間にこの宿主
    を収穫することより成ることを特徴とする、ポリペプチ
    ドの製法。
12. 【請求項１２】 ポリペプチドはリシンＡより成る、請
    求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 リシンＡ又はその類縁体の製法におい
    て、この方法は、リシンＡ又はその類縁体を発現させる
    ことのできる宿主を、生長培地中で培養し、かつ酵母エ
    キスを含有する補充物を、この培養の間に生長培地に添
    加することより成ることを特徴とする、リシンＡの製
    法。
14. 【請求項１４】 リシンＡの製法において、これは、流
    加培養型の発酵より成り、ここでリシンＡを発現させる
    ことのできるＥ．コリー宿主を、生長培地中で約６.７
    のｐＨで培養し、このｐＨを約５.５〜６.７の値に低下
    させ、かつ更なる期間培養し、場合により、この培養の
    終末部の間に、生長培地の温度を低下させ、かつこの終
    末部の間にリシンＡを収穫することより成ることを特徴
    とするリシンＡの製法。