HU216645B - Eljárások dezacetiláz-gének izolálására és alkalmazására - Google Patents

Eljárások dezacetiláz-gének izolálására és alkalmazására Download PDF

Info

Publication number
HU216645B
HU216645B HU9202582A HU9202582A HU216645B HU 216645 B HU216645 B HU 216645B HU 9202582 A HU9202582 A HU 9202582A HU 9202582 A HU9202582 A HU 9202582A HU 216645 B HU216645 B HU 216645B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
ptc
deacetylase
ptt
plant
Prior art date
Application number
HU9202582A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT62656A (en
HU9202582D0 (en
Inventor
Klaus Bartsch
Inge Broer
Günter Donn
Doris Hillemann
Stefan Müllner
Alfred Pühler
Wolfgang Wohlleben
Original Assignee
Hoechst Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6438019&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU216645(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoechst Ag. filed Critical Hoechst Ag.
Publication of HU9202582D0 publication Critical patent/HU9202582D0/hu
Publication of HUT62656A publication Critical patent/HUT62656A/hu
Publication of HU216645B publication Critical patent/HU216645B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás dezacetiláz-gén főszfinőtricin vagyfőszfinőtricil-alanil-alanin előállítására történő alkalmazására. Atalálmány a dezacetiláz-gének izőlálására és egyéb alkalmaz saira iskiterjed. A találmány szerint izőlált dezacetiláz-gének alkalmasaktranszgenikűs növények, előnyösen hímsteril növények létrehőzására is.A dezacetiláz-gén izőlálása úgy történik, hőgy pat-g nt tartalmazódezacetiláz-műtánsban génbankőt létesítenek, majd a dezacetilázttartalmazó klónőkat PTT- vagy PTC-érzékenység alapján azőnősítják. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás dezacetiláz-gén alkalmazására, foszfinotricin vagy foszfinotricil-alanil-alanin előállítására. A találmány a dezacetiláz-gének elkülönítésére és egyéb alkalmazására is kiterjed. A találmány szerinti dezacetiláz-gének főleg transzgén növények létrehozására alkalmazhatók szövetre fajlagos promotorok felhasználásával. Az ilyen növényekben bizonyos növényi részek kifejlődését lehet gátolni. A dezacetiláz-gének segítségével továbbá transzgén növényekben lévő szövetspecifikus promotorok azonosíthatók és izolálhatok.
Foszfinotricin (PTC, l-amino-4-metil-foszfino-vajsav) gátolja a glutamin-szintetáz (GS) enzimet. A PTC a foszfinotricil-alanil-alanin antibiotikum egyik „építőkockája”. Ez a tripeptid (PTT) Gram-pozitív és Gramnegatív baktériumok, valamint a Botrytis cinerea gomba ellen aktív. PTT-t a Streptomyces viridochromogenes TÜ494 számú törzs termel; ez a törzs DSM 40736 és DSM 4112 szám alatt letétben van a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen gyűjteményben.
A 2 717 440 számú német szabadalmi leírásból ismert, hogy PTC-nek totál herbicid hatása van. Az EP-A-0 257 542 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés szerint foszfinotricin-N-acetil-transzferáz(pat)-gén segítségével herbicidekkel szemben rezisztens növényeket lehet előállítani. A pat-gén által kódolt foszfinotricin-N-acetil-transzferáz enzim az intracellulárisan fellépő PTC-t módosítja és a herbicidet detoxifikálja.
A jelen találmány dezacetiláz-génekre (dea) vonatkozik, amelyek expressziós termékei sejten belül az Nacetil-foszfinotricint (N-Ac-PTC), illetve az N-AcPTT-t dezacetilezni, így biológiailag újból aktiválni képesek.
Egy találmány szerinti N-acetil-foszfinotricintripeptid-dezacetiláz-gén az S. viridochromogenes TÜ494 számú törzsből izolálható. A már ismert, 4,0 kbnyi BamHI fragmensen (EP-A-0257 542) olvasási irányban a pat-gén után a dea-gén helyezkedik el, mégpedig BglII-BamHI fragmensen. Szekvenciája az 1. táblázatban megadottaknak, szerkezete az 1. ábrán bemutatottaknak felel meg. A DNS-szekvencia a proteinszekvenciát határozza meg. A transzláció kezdetét ATG-kodon jelzi, ezt a kodont növényekben és baktériumokban ismerik fel. A Shine-Dalgamo-szekvenciát aláhúzással kiemeltük. Ez a gén a PTT-bioszintézisben az utolsó lépést, az inaktív N-acetil-foszfinotricin-tripeptid aktív PTT-vé történő dezacetilezését kódolja.
Sok enzimről ismert, hogy nemcsak egy szubsztrátumra fajlagos. A pat-gén által kódolt foszfinotricin-Nacetil-transzferáz például a PTT-bioszintézisben tulajdonképpen a dezmetil-PTC acetilezését szolgálja, a nem specifikus jellege következtében azonban PTC detoxifikálására is alkalmazható. A dea-gén túlexprimálásával (amely alkalmas promotorok és high copy vektorokon történő klónozással érhető el) egy nem kellően fajlagos N-acetil-PTT-dezacetiláz felhasználható az Nacetil-foszfinotricin aktiválásához.
1. táblázat
Bgl II
agatctgagc GGAGAGCGCA TGGCATCGTC GGAGTTGGAG CTGGTGCGGG AACTGATCGG
GCTCAACTGG CACACCCGCA ACGGCGATGT GGAGCCACGC CGGGTGGCCT ACGACCGAGC
CCAGGAGGCC TTCGGGCACC TGGGCCTGCC CCCCGGCGAG ACCGTCGTGA TCGGCGACTG
CTCGGCGGAG TGGGTACGGC CCGCCCAGGA GGACGGCAGG ACCCTGCTGT ACCTGCACGG
CGGTTCGTAC GCCCTCGGAT CGCCGCAGTC GCACCGCCAT CTGTCCAGCG CGCTGGGCGC
GGCGGCCGGG GCGGCGGTGC TCGCCCTGCA CTACCGCAGG CCGCCCGAGT CTCCCTTCCC
GGCGGCGGTG GAGGACGCCG TGGCGGCCTA CCGGATGCTG CGGGAGCGGG GCCTGCCGCC
GGGGCGGATC ACCTTCGCCG GTGACTCGGC CGGCGCGGGC CTCGCCGTCG CCGCCCTCCA
GGTGCTGCGC GACGCCGGGG ACCCGCTGCC GGCCGCCGCG GTGTGCATCT CGCCCTGGGC
CGACCTGGCC TGCGAGGGCG CCTCGCACGT CACCCGCAAG GAGCGCGAGA TCCTCCTGGA
CACCGAGGAC CTGCTCCGCA TGGCGGGGCG CTACCTGGCC GGCACCGATC CCAGGAACCC
CCTGGCCTCG CCCGCCCACG GCGATCTGAC CGGTCTGCCG CCGCTGCTCA TCCAGGTCGG
TTCCGAGGAA GTCCTGTACG ACGACGCCCG GGCGCTGGAA CAGGCGGCGC TCAAGGCGGG
CGTACCGGTC ACCTTCGACG AGTGGCCGGA GATGTTCCAC GTCTGGCACT GGTACCACCC
GGTGCTCCCC GAGGGGCGTGC CGCCGTCGAG ACGGCGGGCG TGTTCCTGCG CCGCGCCACC
GAGGAGGGCG AGCGGTGACC GACTGGATCC T
Stop BamHI
HU 216 645 Β
Egy további dea-gén E. coliból nyerhető. Azt találtuk ugyanis, hogy - más baktériumokkal (például rizóbiákkal és streptomycetesszel szemben - E. coliban, miután a patogént alkalmas expressziós vektorba klónoztuk (Strauch és munkatársai, Gene, 63, 65-74, 1988; Wohlleben és munkatársai, Gene, 70, 25-37, 1988) az úgynevezett PAT-assay tesztben (Inge Broer doktori disszertációja, a Bielefeldi Egyetem Biológiai Fakultása, Expression des Phosphintricin-N-acetyltransferase-Gens aus Streptomyces viridochromogenes in Nicotiana tabacum, S 42-43, 1989) nem mutat aktivitást. Ezenkívül alacsony másolatszám esetén a patgén E. coliban nem képes PTT-rezisztencia kialakítására, mert az endogén dezacetiláz hatása a foszfinotricinN-acetiltranszferáz hatását kompenzálja. Végül ezt a dezacetiláz-aktivitást a GS-aktivitás N-acetil-foszfinotricin adagolása után bekövetkező hatásos gátlása alapján közvetlenül lehet kimutatni. N-Ac-PTC a dezacetiláz hatására PTC-vé alakul, amely ismert módon a GS-t gátolja, ez a γ-glutamil-transzferáz-assay tesztben (Bender és munkatársai, J. Bacteriol. 129, 1001-1009, 1977) mérhető. Az egésznek az alapja az E. coli endogén dezacetiláz-aktivitása.
Az irodalomból ismert argE-mutánsban ez az aktivitás állítólag nincs még (Baumberg, Molec. Gén. Genetics 106, 162-173, 1970). Egyéb dezacetiláz-mutánsok is könnyen szelektálhatok: klasszikus (Delic és munkatársai, Műt. Rés. 9, 167-182, 1970; Drake és Baltz, Ann. Rév. Biochem. 45, 11-38, 1976), illetve Tn5-mutagén kezelése (Kleckner, Ann. Rév. Génét. 15, 341-404, 1981) után PTT-vel kiegészített minimális közegen az ilyen mutánsok abból ismerhetők fel, hogy alacsony másolatszámot adó vektorba klónozott pat-génnel végzett transzformálás után kizárólag ők képesek a növekedésre.
Ennek alapján az E. coliból vett dezacetiláz-gén hagyományos módon (Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1982) izolálható oly módon, hogy az E. coli argE-mutánsában, illetve valamilyen új mutánsban génbankot létesítünk.
Egyéb dezacetiláz-gének izolálása a fentiekből következik : például olyan új szervezetek izolálása, amelyek alacsony másolatszámot biztosító vektoron elhelyezkedő pat-gén jelenlétének ellenére PTT-érzékenyek, és a dezacetiláz-gén ezt követő izolálása.
A találmány egy másik szempontja szerint pat- és dea-gének szövetspecifikus promotorokkal együtt alkalmazhatók bizonyos növényi szövetek kifejlődésének gátlására. Ennek egy speciális alkalmazása hímnemű növények sterilizálása.
A növénytenyésztés területén a hibrid vetőmag előállítása azon múlik, hogy az anyanövény önbeporzását nagy valószínűséggel megakadályozzák. Számos növényfaj esetén a tenyésztésben alkalmazható hímsteril mutánsok a természetben fordulnak elő. A citoplazmás hímsterilitás (cms) molekuláris mechanizmusa a mai napig sem teljesen tisztázott. Számos kultúrnövény (például Béta vulgáris) esetén nem létezik természetes cms-változat. Ezért a mezőgazdaság érdeke, hogy genetikai úton az összes fontos kultúrnövény hímsteril változata (cms-mutánsa) jöjjön létre. A belgiumi PGS cég a közzétett PCT/EP 89/00495 számú szabadalmi bejelentésben olyan eljárást ismertet, amely a hímpor anyasejtjeit körülvevő szövet (Tapetum) elpusztításán alapul. E célból RNAz-gént Tapetum-fajlagos promotorral (Mariani és munkatársai; Natúré 347, 737-741, 1990) fuzionálnak. A kizárólag a Tapetum-sejtekben kifejeződő gén e szövet pusztulását okozza, így az érett hímpor képződését megakadályozza. A fuzionált gént hordozó növény csak idegen beporzás nyomán termékenyülhet meg. A rendszer lényeges hátránya, hogy egy ilyen növény utódjai szintén hímsterilek, azaz kint a szántófoldön, ahol önbeporzásra szorulnak, nem képezhetnek termést. Termést csak akkor képezhetnek, ha a keresztezés hím partnere olyan gént hordoz, amely az RNAz hatását az utódokban megszüntetheti. A fent említett bejelentés szerint ez a megszüntetés a barstar-génnel sikerül. Tény, hogy a keresztezéshez csak genetikailag megváltoztatott, azaz transzgén partnereket lehet felhasználni.
Az alábbiakban olyan eljárásokat mutatunk be, amelyekkel transzgén anyanövényeket azonos fajú tetszőleges partnerekkel lehet keresztezni. Ezt dea-gén és alkatilag kötelezően kifejezett pat-gén, például Tapetum-promotor ellenőrzése alatt álló kombinációjával érjük el. PTC, illetve PTT alkalmazásával a Tapetum-sejtekben a glutamin-szintetázt gátoljuk, így ezek a sejtek elpusztulnak. Még egyszerűbb, ha csupán egyetlenegy idegen gént, mégpedig szövetre fajlagos promotor, itt Tapetumpromotor ellenőrzése alatt álló dea-gént tartalmazó transzgén növényt állítunk elő és ezt a növényt N-Ac-PTC-s vagy N-Ac-PTT-s kezelésnek vetjük alá.
Általánosítva dezacetiláz-gén, előnyösen az említett, E. coliból vagy S. viridochromogenes Tü494-ből izolált dea-gén segítségével végzett szövetfajlagos gátlásra a találmány értelmében az alábbi eljárásokat alkalmazzuk :
1) Pat-aktivitásuk alapján PTT-, illetve PTC-rezisztens növényeket (amelyet például az EP 0257542 szerint állítunk elő) a Streptomycetesből származó, növényekben szövetspecifikus promotor ellenőrzése alatt álló dezaciláz-génnel transzformálunk. PTT-s vagy PTC-s kezelés után a dezacetiláz-gén kifejeződése a megfelelő szövetekben a foszfinotricin-N-acetiltranszferáz-aktivitás megszűnését eredményezi. Ezek a szövetek szelektíve elpusztulnak, míg a maradék növény rezisztens marad.
2) PTT-, illetve PTC-rezisztens növényeket az E. coliból származó, szövetspecifikus promotor ellenőrzése alatt álló dezacetiláz-génnel transzformálunk. PTT-s vagy PTC-s kezelés után a dezacetiláz-gén kifejeződése a megfelelő szövetekben a foszfinotricin-N-acetiltranszferáz-aktivitás megszűnését eredményezi. Ezek a szövetek szelektíve elpusztulnak, míg a maradék növény rezisztens marad.
N-acetil-foszfonotricin, illetve N-acetil-foszfinotricin-tripeptid alkalmazásával a fenti rendszert egyszerűsíthetjük. Mindkét vegyület herbicidként inaktív, a növények azonban felveszik és transzportálják őket, nem
HU 216 645 Β bontják le azonnal. N-acetil-foszfonotricin és N-acetilfoszfíno-tricin-tripeptid dezacetilezése irányú aktivitást eddig növényekben nem mutattak ki. Ezért a fent leírt 2-gén-rendszert 1-gén-rendszerré redukálhatjuk, azaz döntően egyszerűsíthetjük, ahogy ezt az alábbiakban még bővebben kifejtjük.
3) Tetszőleges növényeket a Streptomycetesből származó, szövetfajlagos promotor ellenőrzése alatt álló dezacetiláz-génnel transzformálunk. N-acetil-foszfonítrícines, illetve N-acetil-foszfinotricin-trípeptides kezelés után a szövetspecifikus exprimálás a megfelelő szövet azonnali pusztulásához vezet.
4) Tetszőleges növényeket az E. coliból származó, szövetspecifikus promotor ellenőrzése alatt álló dezacetiláz-génnel transzformálunk. N-acetil-foszfonotricines, illetve N-acetil-foszfinotricin-tripeptides kezelés után a szövetspecifikus exprimálás a megfelelő szövet azonnali pusztulásához vezet.
Tekintettel arra, hogy a Streptomycesből származó dezacetiláz specifikussága az N-acetil-foszfinotricin-tripeptid iránt erősebb, a 3. esetben előnyösen n-acetilfoszfinotricin-tripeptidet, a 4. esetben N-acetil-foszfinotricint alkalmazunk, ha nagy aktivitás szükséges. Szövetfajlagos promotorként minden olyan promotor alkalmazható, amelyről ismert, hogy bizonyos szövetekben szelektív módon fejeződik ki (például Koltunow és munkatársai, The Plánt Cell, Vol. 2. 1201-1224, 1990). Természetesen hasonló tulajdonságú új promotor is alkalmazható. Végül olyan promotor is alkalmazható, amely nem szövetfaj lagosan, hanem másmilyen módon (például időtől, stressztől, környezettől függően) szabályozott, feltéve, hogy ez a szabályozás szövetfajlagos.
A fenti eljárások a sejtszabályozás differenciálódásának elemzésére is alkalmasak, továbbá olyan növények előállítására is, amelyekben bizonyos növényi részek fejlődését szándékosan elnyomtuk. Előnyösen hímsteril növényeket állítunk elő.
A találmány egy további alkalmazási területe szelektíve kifejeződő promotorok felkutatása dea-gén segítségével. Ha promotoraktivitású DNS-fragmenst a dea-gén elé klónozunk, az N-acetil-foszfinotricin, illetve N-acetil-foszfinotricin-tripeptid alkalmazása után fellépő szövetpusztulás a promotor specifikusságát mutatja.
Végül a találmány pozitív szelektáló rendszerekre is vonatkozik. Vagy a pat-gén, PTT (ill. PTC) és egy deagén kombinálásával, vagy N-acetil-foszfinotricin (ill. N-acetil-foszfinotricin-tripeptid) és egy dea-gén kombinálásával az összes olyan sejtet szelektálhatjuk, amelyekben a dea-gén inaktiválódott. Ezzel a módszerrel például sikeres klónozást (beépítéssel elért inaktiválódás), de ritka eseményeket (például transzpozicionálás) is közvetlenül szelektálhatunk. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.
1. példa
A dezacetiláz-kódoló szakasz és eukarióta transzkripció-jel fuzionáltatása
E. coli törzsből a pPRI-plazmidot (EP-0257 542) izoláljuk, majd BamHI és BglII enzimmel vágjuk.
A kapott fragmenseket agaróz-gélen szétválasztjuk, a 0,9 kb-os fragmenst a gélből izoláljuk. A pROKI vektort (Baulcombe és munkatársai, Natúré 321, 446-449, 1986) szintén BamHI enzimmel vágjuk, a két restrikciós elegyet egyesítjük és Egáljuk. A ligációs elegyet az E. coli S17.1 törzsbe (Simon és munkatársai, Bio/Technology 1, 784-791, 1983) transzformáljuk. A transzformált törzs kanamicin-tartalmú táptalajon fejlődő telepeit nitrocellulóz-szűrőre visszük, 37 °C-on 12 órán át inkubáljuk, utána lizáljuk. A baktériumok DNS-ét a szűrőn rögzítjük, az agaróz-gélből izolált, 0,9 kb-os fragmenst 100 °C-on inkubálva egyszálúvá tesszük, utána Klenow-polimeráz segítségével a hiányzó szálat digoxigeninnel jelzett nukleotidekkel újraépítjük. A jelzett szál arra való, hogy a szűrőn rögzített baktérium-DNS-sel történő hibridizálást ki lehessen mutatni. A hibrid-DNS antitest-reakció segítségével mutatható ki. A pozitív kiónok DNS-ét Qiagenlízissel izoláljuk, BamHI/EcoRI, valamint BamHI/ HindlII enzimekkel emésztjük. Ez a restrikció a beépített 0,9 kb-os fragmens orientációjának meghatározását teszi lehetővé. Az I. orientációjú plazmidot pIB 17.1-nek, a II. orientációjú plazmidot pIB17.2-nek nevezzük (lásd 2. ábra).
2. példa
N-Acetil-PTC és N-acetil-PTT dezacetiláz-génnel végzett dezacetilezésének kimutatása
Bebizonyosodott, hogy a pROKI vektorban klónozott eukarióta transzkripcio-jelek a kifejezést R. melíloti, A. tumefaciens és E. coli törzsekben is lehetővé teszik. Ezért a pIB17.1 és pIB17.2 plazmidot a kétfaktor-keresztezés módszerével a Rhizobium meliloti 2011 törzsbe transzformáljuk.
Vad, nem kezelt R. meliloti törzseket radioaktív jelzéssel ellátott N-acetil-PTC-vel inkubálva azt tapasztaltuk, hogy ez a mikroorganizmus az N-acetil-PTC-t nem dezacetilezi. A pIB17.1 plazmidot hordozó R. meliloti törzset N-acetil-PTC-vel vagy N-acetil-PTT-vel inkubálva a dezacetilezést vékonyréteg-kromatográfiásan ki lehet mutatni.
Tekintve, hogy R. meliloti nagyon érzékenyen reagál PTC-re és PTT-re, a mikroorganizmus glutaminszintetázának szabaddá vált PTC okozta gátlásán keresztül is ki lehet mutatni.
3. példa
A módosított dezacetiláz-gén bevitele Nicotiana tabacumba
Az 1. példa szerint módosított dezacetiláz-gént kétfaktor-keresztezéssel A. tumefaciens LBA4404 törzsbe transzformáljuk. Az így kapott LBA4404/17.1 és LBA4404/17.2 törzset Nicotiana tabacum levélszeletkékkel inkubáljuk, utána a levélszeletkéket kanamicintartalmú, hajtásindukáló tápközegre helyezzük. A kisaijadó kanamicin-rezisztens hajtások Southem-hibridizálása útján kimutatjuk a dezacetiláz-gén jelenlétét. Ha a növényeket N-acetil-PTC-vel vagy N-acetil-PTTvel kezeljük, a szabaddá váló PTC, illetve PTT hatására elpusztulnak.
HU 216 645 Β
4. példa
A módosított dezacetiláz-gén E. coliban és dohányprotoplasztokban történő átmeneti kifejezéséhez használható vektor szerkesztése
A módosított dezacetiláz-gént EcoRI/HindlII enzimekkel kivágjuk a pIB17.1 és pIB17.1 plazmidból, a kapott fragmenseket agaróz-gélen szétválasztjuk, és a 0,9 kb-os fragmenst izoláljuk. A pSVB28 vektort (Arnold és Pühler, Gene 70, 171-179, 1988) szintén EcoRI/HindlII enzimekkel emésztjük, a két restrikciós elegyet egyesítjük és Egáljuk, majd a β-galaktozidáznegatív E. coli JM83 törzsbe transzformáljuk. A vektort tartalmazó kiónok kék festést adnak, míg a dezacetilázgént beépítve tartalmazó vektort hordozó kiónok fehérek maradnak. Az ilyen módon azonosított kiónokból a DNS-t izoláljuk és EcoRI/HindlII enzimekkel emésztjük. A restrikciós helyek alapján a módosított dezacetiláz-gént tartalmazó kiónokat felismerjük. A szerkesztett vektort pIB27.1-nek, illetve pIB27.2-nek nevezzük (2. ábra). A vektorok E. coliban nagyszámú másolattal vannak jelen.
5. példa
A módosított dezacetiláz-gén dohány-protoplasztokban történő kifejezése
A 4. példa szerint kapott E. coli törzsekből a plazmid-DNS-t izoláljuk. Fiatal dohányleveleket emésztőenzimekkel 20 órán át inkubálunk. A levél erezetéből kihulló protoplasztokat tisztítjuk és polietílénglikolt, valamint az izolált plazmid-DNS-t tartalmazó transzferpufferban inkubáljuk. Utána a protoplasztokat mossuk és tenyésztőközegben (K3-közeg) felvesszük. Gyenge világítás alatt a tenyészetet 3 napon át inkubáljuk, utána a regenerált protoplasztokat feltáquk. A nyers extraktumot N-acetil-PTC-vel és N-acetíl-PTT-vel inkubáljuk. A dezacetilezett PTC, illetve PTT vékonyréteg-kromatográíiásan kimutatható.
6. példa
Eljárás hímsteril kultúrnövények létrehozására S. virido-chromogenes-ből származó, Tapetum-szövetre specifikus promotor ellenőrzése alatt álló dezacetilázgén segítségével
A Streptomyces viridochromogenesből származó dezacetiláz-gént Nicotiana tabacumból származó, Tapetum-szövetre specifikus promotorral fuzionáltatjuk és agrobaktériumok közvetítésével végzett levélszelet-transzformálással dohánysejtekbe juttatjuk. Az ezekből a sejtekből regenerálódó növényeket tetszőleges, de virágzás előtti időpontban N-acetil-PTC-vel vagy N-acetil-PTT-vel permetezzük. Az N-acetil-PTC a növényi sejtben stabil, a növényi transzportutakon terjed. Mindkét vegyület a nem módosított dohánynövényre semmilyen hátrányos hatással nincs.
Amikor az első Tapetum-sejtek kialakulnak, a dezacetiláz-gén kifejezése kezdődik. A sejtben felhalmozódott N-acetil-PTC-t vagy N-acetil-PTT-t az enzim dezacetilezi, azaz hatásos formájába alakítja. A sejtek glutaminszintetázát gátolja, így gyors pusztulásukat eredményezi. Érett hímpor nem fejlődhet már ki, emellett a dezacetiláz képződése is megszűnik, ami azért fontos, hogy a szomszédos sejteket ne érje károsodás. Ha a növényt nem kezeljük N-acetil-PTC-vel vagy Nacetil-PTT-vel, szaporodóképessége teljes mértékben megmarad. Ezzel a cms-nek a keresztezés hímnemű partnerének egyik génjével elért megszüntetése feleslegessé válik. Pontosan körülhatárolt mutációt hoztunk létre, amely a növény növekedését és hasznosíthatóságát nem befolyásolja.
7. példa
Szövetre specifikus promotorok azonosítása transzgén növényekben
A Streptomyces viridochromogenesből származó dezacetiláz-gén segítségével szövetspecifikus promotorokat közvetlenül a növényben azonosíthatunk.
A dezacetiláz-gént promotor nélkül úgy klónozzuk lefegyverezett T-DNS jobb vagy bal végére, hogy egy, a növénygenomban, a T-DNS beépítési helyén lévő promotor beleolvasható a génbe, így annak kifejezését téve lehetővé. A transzgén növényt dugványokkal szaporítjuk, majd a növények egy részét N-acetil-PTC-vel vagy N-acetil-PTT-vel kezeljük, utána pusztuló szövetet keresünk rajta. Fordított PCR segítségével az adott gént N-acetil-PTC-vel vagy N-acetil-PTT-vel nem kezelt kiónban szaporíthatjuk, majd izolálhatjuk (Kahl és Weising, Gentransfer bei Pflanzen, Biologie unserer Zeit, Nr. 6, 181, 1988).
8. példa
N-Acetil-foszfinotricin-dezacetiláz- (PPT) -aktivitás kimutatása talajmintákban
500-500 mg tömegű talajmintákat (homokos agyag, a Schwanheimi dűnéből) a maximális vízkapacítás 40%-ára beállítunk, majd ,4[C]-L-N-acetil-PTT 15 mM törzsoldatának 5 μΐ-jét adagoljuk hozzá. A mintákat 28 °C-on különböző időre (0 óra, 4, 7, 11, illetve 14 napig) inkubáljuk, utána 500 μΐ vízzel, majd 250 μΐ vízzel extraháljuk. Az egyesített vizes felülúszókból 14-14 μΐ-vékonyréteg-kromatográfiás lemezekre (HPTLC-cellulóz, Merck) viszünk. A lemezeket n-propanol és 25 t%-os ammóniaoldat 3:2 tf-arányú elegyével kétszer kromatografáljuk. A kiértékelés autoradiográfiás módszerrel történik. Az N-acetil-PPT és PPT azonosítására a radioaktív foltok Rrértékeit a megfelelő referenciaanyagok rrértékeivel hasonlítjuk össze. Bebizonyosodott, hogy az N-acetil-PPT a talajban 14 nap alatt majdnem teljesen PPT-vé metabolizálódik. Steril talajmintában (a talajt 4 órán át 200 °Con tartottuk) az anyag teljesen stabil.
9. példa
N-acetil-PPT-re fajlagos dezacetiláz-aktivitással rendelkező talajmikroorganizmusok izolálása és azonosítása
1-1 g tömegű talajmintákat 10 ml pufferrel (10 mM NaCl, 10 mM Na-foszfát-puffer, pH=7,0) szobahőmérsékleten 1 órán át extraháljuk. A mikroorganizmusok különböző csoportjainak szelektálása érdekében a felülúszót különböző tápagarlemezeken széleszt5
HU 216 645 Β jük, illetve az így nyert oltóanyagot Erlenmeyer-lombikban különböző közegekben dúsítjuk.
(1) MSl-közeg (eubaktériumok számára):
mM glükóz 5 mM szukcinát 10 mM glicerin 1 g/1 NH4C1 50 ml/1 A-oldat 25 ml/1 B-oldat
A-oldat: 50 g/1 K2HPO4
B-oldat: 2,5g/lMgSO4 0,5 g/1 NaCl 25 mg/1 nyomelemek (2) Kitinközeg (actino- és Streptomyces, valamint kitinovor-baktériumok számára) g/1 tarisznyarák-kinin 1 g/1 (NH4)2SO4 0,5 g/1 A-oldat ml/1 nyomelemek (3) Antibiotikum-közeg (magasabbrendű gombák számára) g/1 malátakivonat 10 g/1 glükóz g/1 élesztőkivonat 0,5 g/1 (NH4)2SO4 50 pg/ml tetraciklin
Mindegyik közeg 5 nM N-acetil-PPT-t tartalmaz. Az agarlemezeket és a süllyesztett tenyészeteket 28 °Con 3-5 napon át inkubáljuk.
Mindegyik szelektív agarlemezről 20-20 telepet leveszünk, mindegyik telepet külön-külön a megfelelő folyékony közegből 5 ml-t tartalmazó lombikba viszünk át. 3-5 nap elteltével a sejteket 10000perc-1 fordulatszám mellett lecentrifugáljuk, és a felülúszót aminosav-elemzőben (Biotronic LS 5001) vizsgáljuk. A kitintartalmú tenyészetből egy PPT-pozitív tenyészetet (CB 10) sikerül elkülöníteni.
A tenyészet sejtjeinek dezacetiláz-aktivitását 14[C]-LN-acetil-PPT-tartalmú szubsztrátumon végzett biotranszformációval is vizsgáljuk az alábbiak szerint. A tenyészet 1,5 ml-jét centrifugáljuk, a sejteket pufferrel (10 mM NaCl, 10 mM Na-foszfát-puffer, pH=7,0) mossuk, majd 100 μΐ ugyanilyen pufferben szuszpendáljuk. 10 μΐ szuszpenzióhoz 10 μΐ 0,25 mM l4[C]-L-N-acetil-PT-oldatot adunk, és az elegyet 28 °C-on 15 órán át inkubáljuk. A baktériumokat lecentrifugáljuk és a felülúszóból 7 μΐ-t a 8. példában leírtak szerint vékonyréteg-kromatográfiásan és autoradiográfiásan elemezünk. Az Nacetil-PPT majdnem teljesen átalakul PPT-vé. A kísérlet azt is mutatja, hogy a talált dezacetiláz az acetilezett PPT L-enantiomeijét szubsztrátumként elfogadja.
A kívánt dezacetiláz-aktivitású törzsek további tisztítása érdekében a CB jelű tenyészetet LB-agaron (10 g/1 tripton, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 agar) szélesztjük és 28 °C-on 2 napon át inkubáljuk. A lemezről 10 telepet izolálunk, ezeket folyékony kitinközegbe oltjuk és a tenyészeteket a fent leírtak szerint N-acetilPPT-dezacetiláz-aktivitásra vizsgáljuk. A dezaciláz-pozitív tenyészetet újból szélesztjük, hogy a tenyészet egyneműségéről győződjünk meg. A legmagasabb dezacetiláz-aktivitású törzset Xanthomonas maltophilia törzsként azonosítjuk (DSM 7192 szám alatt letétben).
A talajminták különböző folyékony közegekben dúsított tenyészeteit a fentiekben leírtak szerint vizsgáljuk arra nézve, hogy képesek-e N-acetil-PPT dezacetilezésére. Kiderült, hogy csak a kitines közegben lévő tenyészetek dezacetiláz-pozitívak. Kitines agaron végzett szélesztés után összesen 40 telepet izolálunk, ezeket kitines folyékony tápközegben tenyésztjük, majd a dezacetilázaktivitást vizsgáljuk. Hat izolátum pozitívnak bizonyult (BoKl, BoK5, BoK9, BCÜ1, BCÜ2, BCÜ3), amelyekből többszörös szélesztéssel és a kapott telepek elkülönített továbbtenyésztésével aktív, tiszta törzset nyerünk. A legnagyobb dezacetiláz-aktivitást a Microbacterium imperiale (DSM 7191 szám alatt letétben) mutatja.
! 0. példa
Az izolált mikroorganizmusokkal végzett N-acetilPPT-dezacetiláz-enzimtesztek
A BoKl és BoK5 törzsekből 5 ml LB-közegben egy éjszakán át 28 °C-on előtenyészetet készítünk, ennek 0,5 ml-jével egy 20 ml-es LB-közeget, illetve 20 ml-es kitinközeget oltunk. Mindkét közeg 1 mM Nacetil-PPT-t tartalmaz. Az LB-tenyészeteket 15 órán át, a kitines tenyészeteket 4 napon át 28 °C-on és 150 perc-1 rázófrekvencián inkubáljuk. Utána a sejteket 10 perc alatt 10 000 perc-1 fordulatszám mellett lecentrifugáljuk, a sejteket 10 ml pufferrel (10 mM NaCl, 10 mM Na-foszfát-puffer, pH=7,0) mossuk, és annyi 100 mM trisz/HCl-pufferban (pH=8,0) szuszpendáljuk, hogy a koncentráció 100 mg/ml legyen. A szuszpenziókat azonos térfogatú 100 mM N-acetil-PPT-oldattal keverjük és 50 ml-es Erlenmeyer-lombikokban 28 °C-on és 220 perc-' rázófrekvencia mellett 24 órán át inkubáljuk. A sejteket lecentrifugáljuk (10 perc 5000 perc-' mellett), és a felülúszó PPT-tartalmát az aminosavelemzőben (9. példa) meghatározzuk. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.
2. táblázat
N-Acetil-PPT-dezacetiláz-teszt talajmikroorganizmusokkal
Törzs Közeg PPT-koncentráció a felülúszóban
(mM) (%)·
BoKl LB 0,7 2,7
BoKl kitin 13,9 55,5
BoK5 LB 6,0 23,9
BoK5 kitin 14,3 57,2
*: az N-acctil-PPT racemátban lévő L-enantiomcrre vonatkoztatva.
11. példa
Actinomycetesszel végzett N-acetil-PPT-dezacetilázenzimteszt
Az Actinoplanes liguriae (IFO Nr. 13 997) és Actinoplanes sp. (Stammsammlung Zentralforschung
HU 216 645 Β
Nr. A 1015) törzseket N-acetil-PPT jelenlétében fermentálva, majd l4[C]-L-N-acetil-PPT-t szubsztrátumként biotranszformálva szintén találtunk N-acetil-PPTre specifikus dezacetiláz-aktivitást.
Az átalakulás mértékének meghatározására a 9. példában leírtak szerint biotranszformációt végeztünk az alábbi tápközegek alkalmazásával:
A-közeg: 0,2% élesztőkivonat 0,2% húskivonat 0,4% polipepton (szójalisztből)
1% glükóz
B-közeg: 20 g/1 zabpehely mg/1 nyomelemek
Az eredményeket az alábbi 3. táblázatban adjuk meg.
3. táblázat
Actinomycetesszel végzett N-acetil-PPT-dezacetiláz-teszt
Törzs Közeg PPT-koncentráció a felülúszóban
(mM) (%)*
Actinoplanes liguriae (IFO Nr. 13 997) A 3,3 13,2
Actinoplanes liguriae (IFO Nr. 13 997) B 7,6 30,4
Actinoplanes sp. (NR. A 1015) A 11,0 44,0
Actinoplanes sp. (Nr. A 1015) B 2,7 10,8
*: az N-acctil-PPT raccmátban levő L-enantiomerre vonatkoztatva.

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás dezacetiláz-gén izolálására mikroorganizmusból, azzal jellemezve, hogy pat-gént tartalmazó dezacetiláz-defektív (dea-) mutánsban a mikroorganizmusból génbankot hozunk létre, a dezacetilázt tartalmazó kiónokat PTT- vagy PTC-érzékenység alapján azonosítjuk, majd az azonosított kiónokban található inszertből a dezacetiláz-gént önmagában ismert módon izoláljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génbankot E. co/zból hozzuk létre.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génbankot S. viridochromogenesből hozzuk létre, és az izolált dezacetiláz-gén 1. táblázat szerinti nukleotidszekvencia által meghatározott aminosav-szekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  4. 4. Eljárás szelektíven elpusztítható részeket tartalmazó transzgenikus növények előállítására, és adott esetben az elpusztítható részek szelektív elpusztítására, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-gént a növényben szövetspecifikus promoter szabályozása alá helyezünk, és adott esetben az adott szövet kívánt részét alkalmas időben végzett N-acetil-PTC-s vagy N-acetil-PTT-s kezeléssel elpusztítjuk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-génként E. coliból származó dezacetiláz-gént alkalmazunk, és adott esetben a növényt Nacetil-PTC-vel kezeljük.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-génként 5. viridochromogenesből származó dezacetiláz-gént alkalmazunk, és adott esetben a növényt N-acetil-PTT-vel kezeljük.
  7. 7. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímsteril növényeket állítunk elő.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dezacetiláz-gént Tapetum-specifikus promoter szabályozása alá helyezzük.
  9. 9. Eljárás szelektíven elpusztítható részeket tartalmazó transzgenikus növények előállítására, és adott esetben az elpusztítható részek szelektív elpusztítására, azzal jellemezve, hogy PTC-rezisztens növényben dezacetiláz-gént szövetspecifikus promoter szabályozása alá helyezünk, és adott esetben, az adott szövet kívánt részét alkalmas időben végzett PTC-s vagy PTT-s kezeléssel elpusztítjuk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-génként E. co/zból származó dezacetiláz-gént alkalmazunk, és adott esetben a növényt PTC-vel kezeljük.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-génként S. viridochromogenesből származó dezacetiláz-gént alkalmazunk, és adott esetben a növényt PTT-vel kezeljük.
  12. 12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímsteril növényeket állítunk elő.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dezacetiláz-gént Tapetum-specifikus promoter szabályozása alá helyezzük.
  14. 14. Eljárás szövetspecifikus promoteraktivitás kimutatására növényben, azzal jellemezve, hogy dezacetiláz-gént feltételezhetően szövetspecifikus promoterszekvenciát tartalmazó DNS-szekvencia szabályozása alá helyezünk, és a promoteraktivitást közvetve - a növény N-acetil-PTT-vel vagy N-acetil-PTC-vel, illetve pat-gént tartalmazó növény esetén PTT-vel vagy PTC-vel történő kezelését követően — bizonyos szövetek elpusztulása alapján detektáljuk.
  15. 15. Eljárás kiónok vagy transzpozíciók inszerciós inaktiválódás útján történő azonosítására szolgáló pozitív szelekciós rendszer előállítására, azzal jellemezve, hogy egy pat-gén és a dea-gén együttes alkalmazásával és PTT-s vagy PTC-s kezeléssel, vagy pedig csak a dea-gén alkalmazásával és N-acetil-PTC-s vagy Nacetil-PTT-s kezeléssel azokra a sejtekre szelektálunk, amelyekben a dea-gén inaktiválódott.
  16. 16. Eljárás meghatározott növényi részek működésének célzott megakadályozására, azzal jellemezve, hogy a növényi részek működését szövetspecifíkus promoter szabályozása alá helyezett dezacetiláz-gén alkalmazásával akadályozzuk meg.
HU9202582A 1991-08-09 1992-08-07 Eljárások dezacetiláz-gének izolálására és alkalmazására HU216645B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4126414A DE4126414A1 (de) 1991-08-09 1991-08-09 Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9202582D0 HU9202582D0 (en) 1992-10-28
HUT62656A HUT62656A (en) 1993-05-28
HU216645B true HU216645B (hu) 1999-07-28

Family

ID=6438019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202582A HU216645B (hu) 1991-08-09 1992-08-07 Eljárások dezacetiláz-gének izolálására és alkalmazására

Country Status (14)

Country Link
US (4) US5767370A (hu)
EP (2) EP0531716B1 (hu)
JP (1) JPH05199875A (hu)
AT (2) ATE368119T1 (hu)
AU (1) AU653845B2 (hu)
CA (1) CA2075560A1 (hu)
DE (3) DE4126414A1 (hu)
DK (2) DK0869182T3 (hu)
ES (2) ES2128331T3 (hu)
GR (1) GR3029769T3 (hu)
HU (1) HU216645B (hu)
MX (1) MX9204610A (hu)
SG (1) SG46682A1 (hu)
ZA (1) ZA925935B (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0628635A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-14 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
EP0701619A1 (en) * 1993-06-08 1996-03-20 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
DE19639463A1 (de) * 1996-09-26 1998-04-02 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen
DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1998-06-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung
US6555733B2 (en) 1996-12-16 2003-04-29 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Genes coding for amino acid deacetylases with specificity for N-acetyl-L-phosphinothricin, their isolation and use
US6815577B1 (en) 1997-03-03 2004-11-09 Syngenta Participations Ag Method of hybrid seed production using conditional female sterility
TR199902113T2 (xx) * 1997-03-03 1999-12-21 Novartis Ag �artl� di�i k�s�rl��� kullan�m�yla melez tohum �retimi metodu.
EP1894467A3 (en) 1997-04-03 2008-07-16 DeKalb Genetics Corporation Use of glyphosate resistant maize lines
US7001733B1 (en) 1998-05-12 2006-02-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for screening for modulations of IgE synthesis, secretion and switch rearrangement
EP0987331A1 (en) * 1998-09-01 2000-03-22 Hoechst Schering AgrEvo GmbH Plant pathogenicity control by use of a pathogen inducible expression of deac gene
EP0987330A1 (en) * 1998-09-01 2000-03-22 Hoechst Schering AgrEvo GmbH Modification of plant development and plant differentiation by use of tissue specific Deac gene expression system
US6384304B1 (en) 1999-10-15 2002-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Conditional sterility in wheat
CA2440745A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Bayer Bioscience N.V. Novel genes for conditional cell ablation
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
WO2013006472A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
CN112111506B (zh) * 2020-09-23 2022-03-25 江南大学 一种RBS优化提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE75776T1 (de) * 1986-08-23 1992-05-15 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung.
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
ATE294872T1 (de) * 1989-02-02 2005-05-15 Pioneer Hi Bred Int Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten
US5212296A (en) * 1989-09-11 1993-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Expression of herbicide metabolizing cytochromes

Also Published As

Publication number Publication date
ZA925935B (en) 1993-04-28
US5668297A (en) 1997-09-16
AU2089092A (en) 1993-02-11
ATE368119T1 (de) 2007-08-15
DE59210006D1 (de) 2007-09-06
ES2290974T3 (es) 2008-02-16
EP0869182B1 (de) 2007-07-25
US5767370A (en) 1998-06-16
DE4126414A1 (de) 1993-02-11
DK0531716T3 (da) 1999-08-23
AU653845B2 (en) 1994-10-13
GR3029769T3 (en) 1999-06-30
HUT62656A (en) 1993-05-28
EP0531716A2 (de) 1993-03-17
EP0531716B1 (de) 1998-12-23
US5767371A (en) 1998-06-16
ES2128331T3 (es) 1999-05-16
ATE174964T1 (de) 1999-01-15
SG46682A1 (en) 1998-02-20
US5650310A (en) 1997-07-22
EP0531716A3 (en) 1994-05-11
DK0869182T3 (da) 2007-11-26
EP0869182A1 (de) 1998-10-07
HU9202582D0 (en) 1992-10-28
DE59209598D1 (de) 1999-02-04
JPH05199875A (ja) 1993-08-10
CA2075560A1 (en) 1993-02-10
MX9204610A (es) 1993-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6177616B1 (en) Genes coding for amino acid deacetylases with specificity for N-acetyl-L-phosphinothricin, their isolation and their use
JP2749424B2 (ja) ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用
US5648477A (en) Genetically engineered plant cells and plants exhibiting resistance to glutamine synthetase inhibitors, DNA fragments and recombinants for use in the production of said cells and plants
CA2106718C (en) Methods for the production of hybrid seed
HU216645B (hu) Eljárások dezacetiláz-gének izolálására és alkalmazására
JP2659459B2 (ja) 生物学的に安全な植物形質転換システム
US5077399A (en) Phosphinothricin-resistance gene
US6852909B2 (en) Process for producing female-sterile plants
Meredith Selecting better crops from cultured cells
SK43196A3 (en) Fragment dna, vector and microorganism containing genes for butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine metabolism and process for producing of l-carnitine
CA2062095C (en) Process for the genetic manipulation of myxobacteria
Watanabe et al. Detection and molecular analysis of plant-and insect-associated bacteria harboring aconitate isomerase involved in biosynthesis of trans-aconitic acid as antifeedant in brown planthoppers
IE83441B1 (en) Process for the genetic manipulation of myxobacteria
JP3234534B2 (ja) 形質転換されたホモノ科植物
US6555733B2 (en) Genes coding for amino acid deacetylases with specificity for N-acetyl-L-phosphinothricin, their isolation and use
Palmer Regulation and mode of action of the polyketide phytotoxin coronatine
Djordjevic A Genetic and Molecular Characterisation of Plasmid Genes Inolved in the Early Nodulation Steps of Rhizobium Trifolii
NZ205895A (en) Replicon containing hydrogen-uptake gene; identification of bacterial colonies with hydrogen-uptake activity; and enhancement of nitrogen fixation in leguminous plants

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG, DE

Free format text: FORMER OWNER(S): HOECHST AG., DE