JPH10136987A - ピコリン酸類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 医・農薬の合成中間体として有用なピコリン
酸類の製造方法を提供する。 【解決手段】 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株由
来のアミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ等の
酵素を２−アミノフェノール類に作用させることにより
ピコリン酸類を製造する。また、該酵素をコードするＤ
ＮＡを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素反応によるピ
コリン酸（２−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ
ａｃｉｄ）類の製造方法に関し、詳しくは、２−アミ
ノフェノール類を１，６−ジオキシゲナーゼ等の酵素に
接触させることにより、ピコリン酸類を製造する方法に
関する。また、本発明は、ピコリン酸類の製造方法で使
用するのに適する２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼ及びそれをコードするＤＮＡに関し、詳し
くは、シュードモナス（Pseudomonas）属由来であり、
２−アミノフェノール類を酸化反応してピコリン酸類を
生成する活性を有する酵素及びそれをコードするＤＮ
Ａ、このＤＮＡを保持する形質転換体、及びこの形質転
換体を用いた前記酵素の製造法並びにピコリン酸類の製
造法に関する。

【０００２】ピコリン酸及びその誘導体などのピコリン
酸類は、医薬あるいは農薬の合成中間体として有用な物
質である。

【０００３】

【従来の技術】従来、ピコリン酸誘導体の製造方法とし
ては、例えば、３−ヒドロキシピリジンに二酸化炭素を
反応させて５−ヒドロキシ−２−ピリジンカルボン酸を
合成する方法〔ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、１９巻、５１０
頁、１９５４年〕が知られている。しかし、この方法は
高温高圧（１７０℃、８５〜１７０ｋｇ／ｃｍ²）の条
件を必要とする反応であると共に、収率も低く、工業的
な製造方法としては適さないのが実状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、より温和な条
件下で効率的に５−ヒドロキシ−２−ピリジンカルボン
酸を得る方法の更なる改良が望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
ピコリン酸類を製造する方法を確立すべく鋭意検討を行
った結果、ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物又はそ
の処理物と、２−アミノフェノール類を水性溶液中で混
合し、酵素反応を行なうことにより、高収率で効率よく
ピコリン酸類が生成することを見い出し、本発明を完成
させるに至った。

【０００６】かくして本発明は、下記一般式（Ｉ）

【０００７】

【化３】

【０００８】（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞ
れ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水
酸基、アミノ基、ニトロ基またはカルボキシル基であ
る。）で表される２−アミノフェノール類を酵素と反応
させることを特徴とする下記一般式（II）

【０００９】

【化４】

【００１０】（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は上記の通
りである。）で表されるピコリン酸類の製造方法を提供
する。好ましくは、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれ
独立して、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ₁₀の
アルキル基であり、さらに好ましくは、それぞれ独立し
て、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ₃のアルキル
基である。

【００１１】酵素は、１，６−ジオキシゲナーゼであ
り、さらに好ましくは、２−アミノフェノール １，６
−ジオキシゲナーゼである。２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼは、好ましくは、シュードモ
ナス・エスピーＡＰ−３株由来であり、具体的には、下
記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと下記（Ｃ）又
は（Ｄ）に示すポリペプチドとを含むものである。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
ブユニットのポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド。 （Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
ブユニットのポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド。

【００１２】また、さらに、上記の好ましい２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤ
ＮＡを取得し、これを適当なベクターを用いて微生物に
導入し、菌体内に同ＤＮＡを保持する形質転換体を得る
ことができれば、微生物の触媒能力を従来の方法に比し
て飛躍的に増大させたり、該酵素を大量に製造したりす
ることが可能となる。

【００１３】このために、本発明は、２−アミノフェノ
ール １，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ、
及びそれを用いたピコリン酸類の製造方法も提供する。
すなわち、本発明は、（１）上記の２−アミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼのサブユニットのポリペ
プチドをコードするＤＮＡ、（２）上記（１）のＤＮＡ
がベクターに連結されてなる組換えベクター、（３）上
記（１）のＤＮＡが導入されて形質転換された形質転換
体、及び、（４）上記（３）の形質転換体を培地で培養
し、その培養物から２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼを採取することを特徴とする２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼの製造法も提供
する。

【００１４】上記（１）のＤＮＡは、具体的には、下記
（ｉ）〜（iv）の通りである。 （ｉ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、 （ii）上記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、 （iii）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列を
含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
であって、かつ、配列表の配列番号３に示すアミノ酸配
列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノール
を酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタンパ
ク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。 （iv）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡ。 （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１１１３〜１９２５からなる塩基配列
を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１１１３〜１９２５からなる塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａであって、かつ、配列表の配列番号２に示すアミノ酸
配列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノー
ルを酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタン
パク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 ＜１＞ピコリン酸類の製造方法 上記一般式（Ｉ）及び（II）で表される化合物の置換基
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれ独立して、水素原
子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、アミノ基、ニ
トロ基またはカルボキシル基である。好ましくは、それ
ぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ
₁₀のアルキル基であり、さらに好ましくは、それぞれ独
立して、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ₃のアル
キル基である。アルキル基は、直鎖及び分岐のいずれで
もよい。

【００１６】本発明のピコリン酸類の製造方法に用いら
れる酵素としては、一般式（Ｉ）で表される２−アミノ
フェノール類に作用して、一般式（II）で表されるピコ
リン酸類を生成する酵素であれば特に制限されない。な
お、本明細書では、「ピコリン酸類を生成する」という
用語を、ピコリン酸類に自発的に変換される中間体を生
成することも包含する意味で用いる。このような酵素の
例としては、１，６−ジオキシゲナーゼが挙げられ、よ
り具体的には、２−アミノフェノール １，６−ジオキ
シゲナーゼが挙げられる。

【００１７】本発明のピコリン酸類の製造方法におい
て、２−アミノフェノール類を酵素と反応させる態様に
は特に制限はなく、上記酵素を産生する微生物の菌体又
はその処理物を２−アミノフェノール類に作用させるな
どの方法を採用することができる。より具体的には、上
記微生物の菌体又は上記微生物の培養物から採取した２
−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼの粗精
製画分若しくは精製酵素等のその処理物を２−アミノフ
ェノール類を含有する水性溶液に加えることにより、２
−アミノフェノール類を酵素と反応させる方法が挙げら
れる。ここで、培養物とは、微生物の菌体及び／又は培
養後の培地（培養に液体培地を用いた場合にはその培養
上清）をいう。また、微生物の菌体を２−アミノフェノ
ール類に作用させる場合には、通常、上記酵素を菌体外
に産生する微生物を用いる。

【００１８】上記微生物としては、上記酵素を産生する
微生物であれば特に制限はないが、具体的には、２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼを産生する
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)ＡＰ−３
株が挙げられる。シュードモナス・エスピーＡＰ−３株
は、生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７７５が付与されている。

【００１９】上記微生物の培養は、一般に、炭素源、窒
素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で
行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、シ
ョ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール
等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マ
レイン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００２０】培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、微生物の生育し得る温度で
あれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについて
も宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はな
い。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して
行うことができる。

【００２１】また、上記微生物が２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼを産生するものである場合
には、その活性を高めるために、培地中に２−アミノフ
ェノール類を添加して培養をすることが好ましい。２−
アミノフェノール類の添加濃度は、通常、１〜１００ｍ
Ｍ、好ましくは３〜３０ｍＭである。

【００２２】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼを含有する菌体を取得するこ
とができる。

【００２３】菌体は、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ約
７．５）等で洗浄してから用いてもよい。洗浄用のリン
酸緩衝液の濃度としては、０．０５Ｍ〜０．２Ｍの濃度
が好適に用いられる。また、菌体は、予め菌体を凍結し
たり、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗ
ｅｅｎ ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２％添加
した液中、１５〜４０℃で、１０〜１２０分間、菌体を
処理したりすることにより菌体の透過性を高めてから用
いることもできる。

【００２４】処理物とは、菌体を超音波破砕等で処理し
て得られる菌体破砕物、該破砕物を遠視分離して得られ
る無細胞抽出物、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマ
トグラフィー等で精製して得られる粗精製画分または精
製酵素、これらの菌体や精製物等をアクリルアミドモノ
マー、アルギン酸等の担体に固定化して得られる固定化
物等である。

【００２５】上記微生物の菌体を担体に固定化する場合
には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝
液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができ
る。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾
等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で
抽出して得られる２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼを含有する抽出物、該抽出物を更に硫安分
画、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られ
る２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼの
部分精製画分等を担体に固定化したものも、本発明のピ
コリン酸類の製造方法に使用することができる。

【００２６】これら菌体、及び、菌体破砕物、抽出物、
精製物等の処理物の固定化は、それ自体既知の通常用い
られている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アル
ギン酸、カラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化
させる方法により行うことができる。

【００２７】反応に用いる水性溶液は、2-アミノフェノ
ール類を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば
０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１
０）とすることができる。この水性溶液には、更に菌体
の細胞膜の物質透過性を高める目的で、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。

【００２８】反応の条件としては、通常４〜１０好まし
くは７．５〜９のｐＨ、通常１０〜５０℃好ましくは２
０〜３０℃の温度、通常５分間〜１２０時間の時間が採
用される。本反応液には、酵素の安定化のため、必要に
より、エタノール、Ｌ−アスコルビン酸、ジチオスレー
トール等を添加することができる。

【００２９】反応に用いるアミノフェノール類水性溶液
のアミノフェノール類の濃度は、通常、０．０１ｍＭ〜
２０ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭであるが、例え
ば連続反応等においては、アミノフェノール類の濃度が
０．０１〜１ｍＭ程度に維持される事もある。

【００３０】反応に用いる菌体またはその処理物の添加
量は、特に制限されるものではないが、水性溶液重量に
対し菌体重量（湿菌体）として１〜３０％が好適に用い
られる。

【００３１】本発明のピコリン酸類の製造方法において
好ましい酵素は、シュードモナス・エスピーＡＰ−３株
由来であり、具体的には、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す
ポリペプチドと下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチ
ドとを含む２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲ
ナーゼである。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
ブユニットのポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド。 （Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
ブユニットのポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド。

【００３２】＜２＞２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ 本発明の２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナ
ーゼをコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号
２（配列番号１に示す塩基配列中の塩基番号１６３〜塩
基番号１０７７に相当）に示すアミノ酸配列（以下、β
サブユニットともいう）及び配列番号３（配列番号１に
示す塩基配列中の塩基番号１１１３〜塩基番号１９２５
に相当）に示すアミノ酸配列（以下、αサブユニットと
もいう）をコードし得る塩基配列が挙げられる。これら
のＤＮＡは、２−アミノフェノール １，６−ジオキシ
ゲナーゼのサブユニットのポリペプチドをコードしてお
り、両サブユニットの会合によって２−アミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
が構成される。従って、本明細書では、２−アミノフェ
ノール １，６−ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパ
ク質の構成に寄与するポリペプチドをコードする限り、
これらのＤＮＡを２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼをコードするＤＮＡと言うことにする。ま
た、本発明のＤＮＡは、この配列に限定されるものでは
なく、前記アミノ酸配列のうち、２−アミノフェノール
類を酸化してピコリン酸類を生成する活性を実質的に害
さない１以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を
有する２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼ
のポリペプチドをコードするＤＮＡ、更にまた、これら
のＤＮＡにハイブリダイズし得る２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼのポリペプチドをコードす
るＤＮＡのいずれもが本発明のＤＮＡに包含されるもの
である。

【００３３】すなわち、本発明のＤＮＡは、下記（ｉ）
〜（iv）のＤＮＡを包含する。 （ｉ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、 （ii）上記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、 （iii）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列を
含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
であって、かつ、配列表の配列番号３に示すアミノ酸配
列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノール
を酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタンパ
ク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。 （iv）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡ。 （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１１１３〜１９２５からなる塩基配列
を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１１１３〜１９２５からなる塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａであって、かつ、配列表の配列番号２に示すアミノ酸
配列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノー
ルを酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタン
パク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【００３４】本発明の２−アミノフェノール １，６−
ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、本発明により
その塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合
成することが可能である。また、シュードモナス・エス
ピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＰ−３株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７５）から、以下の手順により
単離することができる。すなわち、概略的に示すと、シ
ュードモナス・エスピーＡＰ−３株の菌体より直接全Ｄ
ＮＡを常法により抽出し、これを適切なベクターに導入
する。次いで、その導入ベクターを当該ベクターの種類
に対応した宿主に導入して、全ＤＮＡについて遺伝子ラ
イブラリーを調製する。次いで、当該遺伝子ライブラリ
ーから、２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナ
ーゼのＮ−末端アミノ酸配列からその塩基配列を推定し
て調製した合成ＤＮＡプローブを用いて本発明ＤＮＡを
含むクローンを選択する。そして、得られたクローンか
ら目的ＤＮＡを単離する。あるいは、本発明によって明
らかにされた塩基配列に基づいて作製した当該塩基配列
の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いたＰＣＲ法に従って、目的ＤＮＡを増幅させ
ることにより上記クローニングをすることもできる。な
お、配列表１に示すシュードモナス・エスピーＡＰ−３
株の２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ
をコードするＤＮＡの塩基配列は実施例に詳述する方法
によって初めて明らかにされたものである。

【００３５】アミノ酸残基の置換、欠失または挿入は、
部位特異的突然変異などの公知の方法によって塩基配列
にヌクレオチドの置換、欠失、挿入などの変異を導入す
ることによって生じさせることができる。２−アミノフ
ェノール類を酸化してピコリン酸類を生成する活性の測
定方法は後記実施例１に示す通りであり、２−アミノフ
ェノール類を酸化してピコリン酸類を生成する活性を実
質的に害さない１以上のアミノ酸残基の置換、欠失また
は挿入を当業者は容易に選択することができる。

【００３６】配列番号２又は３に示すアミノ酸配列を有
するポリペプチドとともに２−アミノフェノールを酸化
してピコリン酸類を生成する活性を有するタンパク質を
構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明
のＤＮＡ又はこれを有する細胞に変異処理を行い、これ
らのＤＮＡ又は細胞から、例えば配列番号１に記載の塩
基配列のうち、少なくとも塩基番号１６３〜１０７７又
は１１１３〜１９２５からなる塩基配列を有するＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａを選択することによっても得ることができる。ここで
いう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的
なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが
形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化する
ことは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸
同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ±１
５℃、あるいは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士
がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士が
ハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、「ポリ
ペプチドをコードする」とは、ＤＮＡの相補２本鎖のい
ずれか一方がポリペプチドをコードする塩基配列を有す
ることを意味する。

【００３７】以下の（１）〜（３）に、上記微生物から
２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコ
ードするＤＮＡを取得する方法の一例を説明する。 （１）２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナー
ゼの精製及びそのアミノ酸配列の部分的決定とそれに基
づくＤＮＡプローブの作製 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株の菌体から２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼを抽出・精
製する方法は、公知の酵素の精製に関するいずれの方法
も使用できる。

【００３８】例えば菌体の破壊法としては、超音波破
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼは、この菌体破壊物より可溶性画分を分離
することにより、粗酵素液として得ることができる。

【００３９】得られた粗酵素液からの２−アミノフェノ
ール １，６−ジオキシゲナーゼの精製法としては、通
常、（イ）沈澱法による分離、例えば硫安沈澱法、
（ロ）クロマトグラフィーによる分離法、例えばイオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティ吸着クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等、（ハ）電気
泳動による分離法等を組み合わせることによって実施す
ることができ、その一例を後記実施例１に詳述する。

【００４０】精製された２−アミノフェノール １，６
−ジオキシゲナーゼを、Davis法［B.J.Davis, Ann.N.Y.
Acad.Sci., Vol.121, p.404 (1964)］またはLaemmli法
［U.K.Laemmli, Nature, Vol.227, p.680 (1970)］によ
るポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブ
ルー色素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリ
アントブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、
１０％（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット（和光
純薬製）等を用いて酵素タンパク質を染色することによ
り、精製純度及び２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼの分子量等を知ることができる。

【００４１】精製された２−アミノフェノール １，６
−ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列の部分的決定は、同
酵素をこれを構成するサブユニットに分離後、各サブユ
ニットのＮ末端からのアミノ酸配列、あるいは適当なタ
ンパク質分解酵素により各サブユニットを消化して得ら
れるペプチド断片のＮ末端からのアミノ酸配列を、エド
マン分解法によるアミノ酸シーケンサー（アプライドバ
イオシステムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定するこ
とにより、行うことができる。

【００４２】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用いて合成
する。

【００４３】上記のようにして得られる２−アミノフェ
ノール １，６−ジオキシゲナーゼの部分アミノ酸配列
の一例を、配列番号３及び５に示す。また、該アミノ酸
配列より推定されるプライマーＤＮＡの配列の一例を配
列番号６及び７に示す。

【００４４】（２）２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡ
断片の単離 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株の菌体から、２−
アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコード
するＤＮＡを含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、ＤＮ
Ａの単離に関する公知のいずれの方法もが使用できる。
以下（ｉ）〜（ii）にその一例を説明する。

【００４５】（ｉ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。

【００４６】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）等の宿主−ベクター系を用
いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に
使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸII（東洋
紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１
１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミ
ドｐＷＥ１５（Stratagene社製）等のプラスミドベクタ
ーが挙げられる。

【００４７】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸII（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制
限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部分
分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結す
ることにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡ
ライブラリーが得られる。

【００４８】（ii）２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡを含むベクターの選
別 上記（ｉ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリーから
２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼをコー
ドするＤＮＡを含むベクターを選別するには、この染色
体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）の形質導入あるい
は形質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転
換体から、適当な手段により２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを保持す
るクローンを選別すればよい。

【００４９】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）、例えばＰ２３９
２株［Ausubel et al., Nucleic Acid Res.Vol.7, p.15
13 (1979)］に感染させ、これを寒天培地上に重層する
ことによりプラークを形成させる。

【００５０】また、前記（１）項で作製したプライマー
ＤＮＡ、例えば配列番号６及び７に示す塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドを用いたポリマラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）を、上記染色体ＤＮＡを鋳型として行い、
２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコ
ードするＤＮＡの部分断片を得ることができる。

【００５１】ＰＣＲで得られた２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡの部分断
片を鋳型として、上記遺伝子ライブラリーからプラーク
ハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press (1989)］で、該断片を
含むファージを単離する。

【００５２】こうして、シュードモナス・エスピーＡＰ
−３株の染色体ＤＮＡ由来の２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを有する
ファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別する
ことが可能である。

【００５３】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵
素、例えばＥｃｏＲＩあるいはＳａｃＩでベクターから
切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができ
る。

【００５４】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、上記ＰＣＲで得られた部分断片をプローブとし
て用いてサザンハイブリダイゼーション［E.M.Souther
n, J.Mol.Biol., Vol.98, p.503 (1975)］を行うことに
より、２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼ
をコードするＤＮＡが挿入ＤＮＡ断片内に存在すること
を再確認できる。

【００５５】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記シュードモナス・エスピーＡＰ−３株染色
体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切断し
て得られる、大きさが約１．３ｋｂのＤＮＡ断片、及
び、制限酵素ＳａｃＩの完全分解により切断して得られ
る、大きさが約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることが
できる。

【００５６】（３）塩基配列の決定 前記（２）項で得られたＥｃｏＲＩの１．３ｋｂ ＤＮ
Ａ断片、及び、ＳａｃＩの１．６ｋｂ ＤＮＡ断片の全
塩基配列は、例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−
（宝酒造(株)製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素
法［dideoxy chain termination法 Sanger,F.et.al.，P
roc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.74, p.5463(1977)］によ
り決定することができる。

【００５７】このようにして決定された上記の両ＤＮＡ
断片の塩基配列には、０．８ｋｂの重なりが見られた
（図１）。重ね合わせた全長約２．１ｋｂの塩基配列の
中には、２つのオープンリーデイングフレームの存在が
確認され、シュードモナス・エスピーＡＰ−３株の２−
アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコード
するＤＮＡは、配列番号２（配列番号１に示す塩基配列
中の塩基番号１６３〜塩基番号１０７７に相当）に示す
アミノ酸配列（βサブユニット）をコードする９１５塩
基対、及び、配列番号３（配列番号１に示す塩基配列中
の塩基番号１１１３〜塩基番号１９２５に相当）に示す
アミノ酸配列（αサブユニット）をコードする８１３塩
基対の２つのオープンリーデイングフレームから構成さ
れることがわかった。また、得られた塩基配列（配列番
号１）には、前記（１）で決定した配列番号４及び５に
示すアミノ酸配列から予想される塩基配列に相当する配
列を含むことが再確認された。

【００５８】上記の塩基配列を包含する本発明の２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコードす
るＤＮＡは、天然のシュードモナス属細菌の染色体ＤＮ
Ａから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮ
Ａ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(App
lied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザーを用いて合成されたものであってもよい。

【００５９】＜３＞組換えベクター、形質転換体および
２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ又は
そのサブユニットの製造方法 本発明は、本発明の２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡがベクターに連結さ
れてなる組換えベクター、本発明の２−アミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導
入されることにより形質転換された形質転換体、及び、
この形質転換体を培地で培養し、その培養物から２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ又はそのサ
ブユニットを採取することを特徴とする２−アミノフェ
ノール １，６−ジオキシゲナーゼ又はそのサブユニッ
トの製造方法も提供する。

【００６０】本発明の２−アミノフェノール １，６−
ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、これを適当な
ベクターに連結して組換えベクターを調製し、この組換
えベクターで適当な宿主微生物を形質転換することによ
り、２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼを
発現させることができる。

【００６１】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結した２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直接導入する相
同組換え技術［A.A.Vertes,et al., Biosci.Biotechno
l.Biochem., Vol.57, p.2036 (1993)、等］、あるいは
トランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術［A.
A.Vertes et al., Molecular Microbiol., Vol.11, p.7
39 (1994)、等］によっても発現させることができる。

【００６２】組換えベクターを調製する際には、通常、
２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコ
ードするＤＮＡを宿主微生物に適したプロモーターとと
もに、このプロモーターの下流に該ＤＮＡのコード領域
の５’末端側が連結されるようにして、ベクターに挿入
する。あるいはプロモーターを含む発現ベクターを用
い、これに２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲ
ナーゼをコードするＤＮＡを挿入してもよい。

【００６３】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰL-La
mbda Inducible Expression Vector（以上は、例えばフ
ァルマシア社から購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲ
Ｙ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２
６２号明細書）、あるいはこれらの誘導体等を挙げるこ
とができる。また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Stratagene社から購入できる）等を
挙げることができる。

【００６４】２−アミノフェノール １，６−ジオキシ
ゲナーゼをコードするＤＮＡを転写さるためのプロモー
ターは、宿主微生物が保有するプロモーターを一般に用
いることができるが、それに限られるものではなく、２
−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコー
ドするＤＮＡの転写を開始させるための原核生物由来の
塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良
い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、
トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由
来のＰLプロモーター、トリプトファンラクトース雑種
（ｔａｃ）プロモーター［H.A.Bose et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げら
れる。また、バチルス属細菌由来のプロモーターが機能
可能な微生物を宿主として用いる場合には、得られた２
−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ遺伝子
固有のプロモーターを使用してもよい。更には、通常用
いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシ
ステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮ
Ａシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよ
い。

【００６５】これらのプローモーターのうち、誘導性の
あるプロモーターでは、その誘導因子（物質あるいは温
度等の生育環境、等）により発現効率を向上させること
もできる。たとえば、上記ラクトースオペロンのプロモ
ーターの場合には、ラクトースやイソプロピル-β-D-チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより遺伝
子発現を誘導することができる。

【００６６】２−アミノフェノール １，６−ジオキシ
ゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する宿主としては、
特に限定されるものではないが、エシェリヒア（Eschei
chia）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、セラチア
（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）
属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細
菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、ロ
ドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラクトバチルス（L
actobacillus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptom
yces）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、ストレプ
トコッカス（Streptococcus）属細菌等を好適に用いる
ことができる。

【００６７】具体的には、エシェリヒア・コリ（Esheri
chia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtili
s）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus）、セラチア・マーセッセンス（Seratia marcesc
ens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aer
uginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Coryn
ebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermen
tum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus e
rythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus t
hermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Str
eptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lacto
bacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス
（Streptomyces lividans）等を用いることができる。

【００６８】上記宿主微生物へのＤＮＡの導入法として
はコンピテントセル法［Journal ofMolecular Biolog
y，Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法[J.Indus
t.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)]等による形質転換
法、ファージを用いた形質導入法［E.Ohtsubo, Genetic
s, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J.G.C.Otto
w, Ann.Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975) ］、細
胞融合法［M.H.Gabor, J.Bacteriol., Vol.137, p.1346
(1979)］等を用いることができる。

【００６９】形質転換体の培養に用いる培地や培養の条
件は、宿主にあわせて適宜選択される。例えば、シュー
ドモナス属の微生物の場合には、上記＜１＞に記載した
ような微生物の培養に用いる培地及び条件が採用でき
る。

【００７０】培養物からの２−アミノフェノール １，
６−ジオキシゲナーゼ又はそのサブユニットの採取は、
例えば、上記＜２＞に記載した、２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼの精製方法によって行うこ
とができる。

【００７１】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げるものであり、
これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。

【００７２】

【実施例１】 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株由来の２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼの精製及び精製
酵素を用いた２−アミノフェノールからのピコリン酸の
生成 アミノフェノール培地ＡＰ−３（溶液Ａ〔ＫＨ₂ＰＯ₄
２０ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ２．５ｇ、ＮａＣｌ
１ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．４ｇ、ポリペプ
トン ２０ｇ、脱イオン水 １Ｌ、ｐＨ５．５に調整後、
１２０℃、１５分間滅菌〕と溶液Ｂ〔ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ １ｇ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １ｍｇ、ＣｕＳＯ₄・５
Ｈ₂Ｏ １ｍｇ、ＺｎＣｌ₂ １ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１ｍｇ、脱イオン水 ３００ｍｌ、１２０℃、１５分間
滅菌〕と溶液Ｃ〔２−アミノフェノール ２．４ｇ、Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ６ｇ、脱イオン水 ７００ｍｌ、ｐＨ５．５に
調整後、濾過滅菌〕を室温にて混合）１０００ｍｌを５
Ｌ容の三角フラスコ、６本に分注し、シュードモナス・
エスピーＡＰ−３株を植菌し、３０℃にて２４時間振と
う培養した。培養後の培養液を遠心分離（３，５００×
ｇ、４℃、２０分間）し、菌体３０ｇを回収し、−２０
℃にて保存した。

【００７３】得られた菌体からの２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼの抽出は、菌体を緩衝液Ａ
〔１０％（ｖ／ｖ）エタノール、１ｍＭ ジチオスレイ
トール、０．５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含むトリス
−塩酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）〕に懸濁し、超
音波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕するこ
とにより行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，０００
×ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を粗酵素
液として得た。

【００７４】次に、この粗酵素液を、常法に従いストレ
プトマイシン硫酸塩水溶液（１％（ｗ／ｖ））で処理し
た後、硫安分画（４２〜５７％飽和）し、上記緩衝液Ａ
に対して４℃で８時間透析した。この透析液をアセトン
分画（５０〜６５％飽和）し、上記緩衝液Ａに対して４
℃で８時間透析した。次いで、ＤＥ−５２セルロースカ
ラム（ワットマン社製）クロマトグラフィー及びセルロ
ファイン Ａ−５００（生化学工業（株）社製）クロマ
トグラフィーにかけ、２−アミノフェノール１，６−ジ
オキシゲナーゼの精製画分（精製酵素）を得た。２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼの活性の検
出は、２−アミノフェノールの減少を２８２ｎｍの吸光
度変化として測定した。

【００７５】上記２−アミノフェノール １，６−ジオ
キシゲナーゼの精製画分をポリアクリルアミドゲル（４
〜２０％グラジエントゲル）電気泳動〔２５ｍＭ トリ
ス−１９２ｍＭ グリシンからなる緩衝液（ｐＨ８．
４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時間泳動〕により分離
し、クマシーブルー色素〔組成：０．２％（ｗ／ｖ）ク
マシーブリリアントブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）
メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸〕によって染色した
ところ、分子量約１４０ｋＤａの単一バンドが検出され
た。

【００７６】更に同精製画分をドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）処理液〔組成：６２．５ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、
５％２−メルカプトエタノール、０．００１％ ブロモ
フェノールブルー（ＢＰＢ）〕に溶解し、９５℃にて３
分間熱変性処理後、ポリアクリルアミドゲル（１０〜２
０％グラジエントゲル）電気泳動〔２５ｍＭ トリス−
１９２ｍＭ グリシン−０．１％ ＳＤＳからなる緩衝液
（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時間泳動〕
により分離し、上記と同様に染色したところ、分子量約
４０ｋＤａのバンド及び約３２ｋＤａのバンドを検出し
た。これらの結果より、該２−アミノフェノール １，
６−ジオキシゲナーゼの構成は、分子量約４０ｋＤａと
３２ｋＤａの２つのサブユニットから成る分子量約１４
０ｋＤａのヘテロ４量体であることが推定された。

【００７７】さらに精製酵素０．２ｍｇを反応液〔０．
４ｍＭ ２−アミノフェノール〕１ｍｌに添加後、２４
℃で３０分間反応させた。反応終了後、煮沸処理により
反応を停止させた後、反応液を遠心分離（８，０００×
ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上清液を、逆相カラ
ム（ウォーターズ社製Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラ
ム）及びＵＶ検出器（２６４ｎｍ）を用いた高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析（日立社製、Ｌ−６
２００）に供した。その結果、原料の２−アミノフェノ
ールのピークの他にピコリン酸のピークの生成を検出
し、また、原料２−アミノフェノールが減少しているこ
とが確認された。

【００７８】また、反応液の吸収スペクトル（２２０〜
４５０ｎｍ）を日立社製・Ｕ−２０００スペクトロフォ
トメーターを用いて分析したところ、図１に示すとお
り、反応開始前においては２−アミノフェノールの特徴
的な２８３ｎｍの吸収ピークが観察され（）、反応開
始３０秒後には２−アミノムコン酸６−セミアルデヒド
に特徴的な３８２ｎｍの吸収ピークが観察され（）、
反応開始１５０時間後にはピコリン酸に特徴的な２６４
ｎｍの吸収ピークが観察された（）。

【００７９】以上の結果より、２−アミノフェノール
は、下記反応式で表されるように、２−アミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼにより２−アミノムコン
酸６−セミアルデヒドに変換された後、自発的にピコリ
ン酸に変換されていることが明らかになった。

【００８０】

【化５】

【００８１】

【実施例２】 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株由来の２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼを用いた２−ア
ミノ−ｐ−クレゾールからの４−メチルピコリン酸の生
成 実施例１において精製した酵素と、０．４ｍＭ ２−ア
ミノフェノールの代わりに０．４ｍＭ ２−アミノ−ｐ
−クレゾールを含む反応液とを用いて実施例１と同様に
反応をさせ、反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣ分析し
た。その結果、原料の２−アミノ−ｐ−クレゾールのピ
ークの他に４−メチルピコリン酸と考えられるピークの
生成が検出され、また、原料の２−アミノ−ｐ−クレゾ
ールが減少していることが確認された。

【００８２】また、反応液の吸収スペクトル（２２０〜
４５０ｎｍ）を日立社製・Ｕ−２０００スペクトロフォ
トメーターを用いて分析したところ、実施例１と同様
に、反応開始前においては２−アミノフェノール類の特
徴的な２８３ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、反応開
始３０秒後には２−アミノムコン酸６−セミアルデヒド
類に特徴的な３８２ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、
反応開始１５０時間後にはピコリン酸類に特徴的な２６
４ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。

【００８３】反応終了後の反応液をエバポレーターを用
いて濃縮し、濃縮液を塩酸で酸性にした後、遠心分離し
て上清を得、上清を酢酸エチルで抽出した。抽出液を酢
酸エチルで平衡化したシリカゲルカラムにアプライし、
酢酸エチル、酢酸エチル−メタノール（１：１）、メタ
ノールの順に溶媒を変えて溶出させた。その結果、酢酸
エチル−メタノール（１：１）の画分に生成物が溶出し
た。得られた生成物をＮＭＲ及びマススペクトルにより
同定した。

【００８４】¹Ｈ ＮＭＲは、日本電子製ＧＳＸ４００を
用いて測定した。¹ Ｈ ＮＭＲ（ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ₆、５０℃）７．３
１（１Ｈ，ｓ）、７．８６（１Ｈ，ｓ）、８．０５（１
Ｈ，ｂｒ） 一方、マススペクトルは、上記生成物にシリル化試薬Ｂ
ＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ−ＴＭＳ−ｔｒｉｆｌｕｏｒ
ｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を加え、約３０分間加熱して酸
の部分をＴＭＳ（トリメチルシリル）化してからＧＣ／
ＭＳ（ＪＯＥＬＪＭＳ−ＳＸ−１０２／ＤＡ６０００）
で分析した。その結果、４−メチルピコリン酸（分子量
＝１３７）＋ＴＭＳ基−メチル基と考えられる、ｍ／ｚ
１９４のフラグメントイオンが見られた。

【００８５】

【実施例３】 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株由来の２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼを用いた２−ア
ミノ−ｍ−クレゾールからの５−メチルピコリン酸の生
成 実施例１において精製した酵素と、０．４ｍＭ ２−ア
ミノフェノールの代わりに０．４ｍＭ ２−アミノ−ｍ
−クレゾールとを含む反応液を用いて実施例１と同様に
反応をさせ、反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣ分析し
た。その結果、原料の２−アミノ−ｍ−クレゾールのピ
ークの他に５−メチルピコリン酸と考えられるピークの
生成が検出され、また、原料２−アミノ−ｍ−クレゾー
ルが減少していることが確認された。

【００８６】また、反応液の吸収スペクトル（２２０〜
４５０ｎｍ）を日立社製・Ｕ−２０００スペクトロフォ
トメーターを用いて分析したところ、実施例１と同様
に、反応開始前においては２−アミノフェノール類の特
徴的な２８３ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、反応開
始３０秒後には２−アミノムコン酸６−セミアルデヒド
類に特徴的な３８２ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、
反応開始１５０時間後にはピコリン酸類に特徴的な２６
４ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。

【００８７】反応終了後の反応液をエバポレーターを用
いて濃縮し、濃縮液を塩酸で酸性にした後、遠心分離し
て上清を得、上清を酢酸エチルで抽出した。抽出液を酢
酸エチルで平衡化したシリカゲルカラムにアプライし、
酢酸エチル、酢酸エチル−メタノール（１：１）、メタ
ノールの順に溶媒を変えて溶出させた。その結果、酢酸
エチル−メタノール（１：１）の画分に生成物が溶出し
た。得られた生成物をＮＭＲ及びマススペクトルにより
同定した。

【００８８】¹Ｈ ＮＭＲは、日本電子製ＧＳＸ４００を
用いて測定した。¹ Ｈ ＮＭＲ（ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ₆、５０℃）７．７
８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、７．９３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、８．０７（１Ｈ，ｂｒ） 一方、マススペクトルは、上記生成物にシリル化試薬Ｂ
ＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ−ＴＭＳ−ｔｒｉｆｌｕｏｒ
ｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を加え、約３０分間加熱して酸
の部分をＴＭＳ（トリメチルシリル）化してからＧＣ／
ＭＳ（ＪＯＥＬＪＭＳ−ＳＸ−１０２／ＤＡ６０００）
で分析した。その結果、５−メチルピコリン酸（分子量
＝１３７）＋ＴＭＳ基−メチル基と考えられる、ｍ／ｚ
１９４のフラグメントイオンが見られた。

【００８９】

【実施例４】 シュードモナス・エスピーＡＰ−３株由来の２−アミノ
フェノール １，６−ジオキシゲナーゼを用いた２−ア
ミノ−４−クロロフェノールからの４−クロロピコリン
酸の生成 実施例１において精製した酵素と、０．４ｍＭ ２−ア
ミノフェノールの代わりに０．４ｍＭ ２−アミノ−ｐ
−クロロフェノールを含む反応液を用いて実施例１と同
様に反応をさせ、反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣ分
析した。その結果、原料の２−アミノ−４−クロロフェ
ノールのピークの他に４−クロロピコリン酸と考えられ
るピークの生成が検出され、また、原料２−アミノ−４
−クロロフェノールが減少していることが確認された。

【００９０】また、反応液の吸収スペクトル（２２０〜
４５０ｎｍ）を日立社製・Ｕ−２０００スペクトロフォ
トメーターを用いて分析したところ、実施例１と同様
に、反応開始前においては２−アミノフェノール類の特
徴的な２８３ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、反応開
始３０秒後には２−アミノムコン酸６−セミアルデヒド
類に特徴的な３８２ｎｍ付近に吸収ピークが観察され、
反応開始１５０時間後にはピコリン酸類に特徴的な２６
４ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。

【００９１】反応終了後の反応液をエバポレーターを用
いて濃縮し、濃縮液を塩酸で酸性にした後、遠心分離し
て上清を得、上清を酢酸エチルで抽出した。抽出液を酢
酸エチルで平衡化したシリカゲルカラムにアプライし、
酢酸エチル、酢酸エチル−メタノール（１：１）、メタ
ノールの順に溶媒を変えて溶出させた。その結果、酢酸
エチル−メタノール（１：１）の画分に生成物が溶出し
た。得られた生成物をＮＭＲ及びマススペクトルにより
同定した。

【００９２】¹Ｈ ＮＭＲは、日本電子製ＧＳＸ４００を
用いて測定した。¹ Ｈ ＮＭＲ（ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ₆、５０℃）７．６
４（１Ｈ，ｓ）、８．０１（１Ｈ，ｓ）、８．５４（１
Ｈ，ｂｒ） 一方、マススペクトルは、上記生成物にシリル化試薬Ｂ
ＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ−ＴＭＳ−ｔｒｉｆｌｕｏｒ
ｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を加え、約３０分間加熱して酸
の部分をＴＭＳ（トリメチルシリル）化してからＧＣ／
ＭＳ（ＪＯＥＬＪＭＳ−ＳＸ−１０２／ＤＡ６０００）
で分析した。その結果、４−クロロピコリン酸（分子量
＝１５７）＋ＴＭＳ基−メチル基と考えられる、ｍ／ｚ
２１４のフラグメントイオンが見られた。

【００９３】

【実施例５】 ２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼをコ
ードするＤＮＡの取得 （１）シュードモナス・エスピーAP-3株の染色体ＤＮＡ
断片の調製 シュードモナス・エスピーAP-3株を実施例１のアミノフ
ェノール培地ＡＰ−３を用いて３０℃で対数増殖期後期
まで振とう培養し、菌体を集めた。

【００９４】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８.０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒造
製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるように添
加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。この溶菌液
に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室
温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離
（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、上清
を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.３Ｍとな
るよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加
えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラ
ス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾
した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、
４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ断片の溶液を得た。

【００９５】（２）２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡの一部を含むＤＮＡ
断片の取得 実施例１で得られた精製２−アミノフェノール １，６
−ジオキシゲナーゼ（αサブユニット：３２ｋＤａ、β
サブユニット：４０ｋＤａ）のＮ末端からのアミノ酸配
列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシステム
ズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定した。その結果を配
列番号４及び５に示す。

【００９６】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる配列番号６及び７に示した塩基配列を有する２−ア
ミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ遺伝子クロ
ーニング用のＰＣＲプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成装置
（アプライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用い
て合成した。

【００９７】ポリメラーゼ連鎖反応の反応液は以下の組
成（総容量１００μｌ）で行った。濃度は最終濃度を表
す。［２５ユニット／ｍｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ，１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５
０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．２５ｍＭ
ｄＡＴＰ，０．２５ｍＭ ｄＣＴＰ，０．２５ｍＭ ｄＧ
ＴＰ，０．２５ｍＭ ｄＴＴＰ，０．５μｇ／ｍｌ 染色
体ＤＮＡ，１μＭ プライマーＤＮＡ１ CATNACYTTRAANS
WYTCCCA（Nはイノシン、Yは(TC)、Rは(AG)、Sは(GC)、W
は(AT)を示す。）（配列番号４記載のアミノ酸配列にお
けるアミノ酸番号２３〜３０を元にして設計した配列：
配列番号６）、１μＭ プライマーＤＮＡ２ TTYATNGCNC
CNCAYCCNCCNCA（Nはイノシン、Yは(TC)を示す。）（配
列番号５記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１０
〜１６を元にして設計した配列：配列番号７）］

【００９８】ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は、９４
℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分を１サイクルと
する２５サイクルであった。そして上記反応で増幅され
たＤＮＡ断片を以下の方法に従い、プラスミドｐＧＥＭ
−Ｔにクローニングした。即ち、５０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，２０
ｍＭ ジチオスレイトール，１ｍＭ ＡＴＰ，１００ｕｎ
ｉｔ／ｍｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，５μｇ／ｍｌ ｐＧＥ
Ｍ−Ｔベクター，１μｇ／ｍｌ ＰＣＲ産物（各濃度は
最終濃度）の反応液（総容量１０μｌ）となるように各
成分を添加し、１６℃で３時間反応させて、ＰＣＲ産物
ＤＮＡを結合させた。ついで、常法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，５３，１５９（１９７０）参照］に従って、得
られた溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ１０９を形
質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：ト
リプトン １０ｇ，酵母エキス ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ，
寒天 １５ｇ，アンピシリン ５０ｍｇ，イソプロピオチ
オガラクトシド ０．２３８ｇ，Ｘ−ｇａｌ ０．２ｇ及
びジメチルホルムアミド ２ｍｌを蒸留水に溶解して１
リットルとする］に塗抹し、３７℃で２０時間培養し
た。こうして得られたコロニーを青／白カラースクリー
ニングした。選択培地上に生育した白いコロニーを、ア
ンピシリンを最終濃度で５０μg/ml含有するＬ培養液
［トリプトン １０ｇ，酵母エキス ５ｇ，ＮａＣｌ ５
ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］に植菌し、こ
れを３０℃で１２時間培養した。培養液を４℃で１０分
間８,０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収した。
回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［Ｔ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｐ．９
０−９１（１９８２）参照］によりプラスミドを抽出し
た。

【００９９】次に、得られた該プラスミドに挿入された
染色体ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオチド
酵素法により決定した。具体的には、上記培養物より抽
出したプラスミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタ
リスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステー
ション（ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｓｔａｔｉｏｎ； Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてプロトコールに従い反応さ
せた後、パーキン・エルマー社製３７３Ａ ＤＮＡシー
クエンサーによりプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。

【０１００】決定した塩基配列を翻訳して得られるタン
パク質のアミノ酸配列と、上記２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼのＮ末アミノ酸配列との相同
性の比較により、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片は、
シュードモナス・エスピーAP-3株由来のアミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼのβサブユニットほぼ全
域とαサブユニットの上流部分をコードするもの（配列
番号１記載の塩基配列中の１９３番目から１２０５番
目）であることが判明した。

【０１０１】次に、上記（１）で得た染色体ＤＮＡ溶液
の９０μｌに制限酵素ＥｃｏＲＩあるいはＳａｃＩ、５
０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１時間反応させ完
全分解し、アガロース電気泳動に供した。このアガロー
スゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移し取り、Ramdom P
rimer DNA Labeling Kit Ver.2（宝酒造製）及び[α- ³²
Ｐ]ｄＣＴＰを用いてラジオアイソトープラベル[Anal.B
iochem., 158, 307-315 (1986)]した上記ＰＣＲ増幅断
片をＤＮＡプローブとして用い、常法[Molecular Cloni
ng, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]に
従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。

【０１０２】その結果、上記ナイロン膜上、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで処理した場合は約１．３ｋｂの位置に、制限
酵素ＳａｃＩで処理した場合は約１．６ｋｂの位置に、
上記合成プローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片
の存在を確認した。

【０１０３】（３）シュードモナス・エスピーAP-3株の
染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記（１）項で得たシュードモナス・エスピーAP-3株の
染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応させて部分
分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡと、制限酵
素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラ
グメント（Klenow fragment）を用いてＴ（チミジ
ン）、Ｃ（デオキシシトシン）を埋めたファージベクタ
ーλＦＩＸII（λＦＩＸII／ＸｈｏＩ−partial fill-i
n treated DNA：東洋紡績（株）製）とを混合し、５０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）,１０ｍＭジチオスレイ
トール,１ｍＭ ＡＴＰ,１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔ／１０μｌの各成分を添加し
（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間
反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染
色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。

【０１０４】（４）形質転換体の作製及び目的組換え体
ＤＮＡの選別 上記（３）で作製したλＤＮＡライブラリーファージ溶
液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ;ＳＭ緩衝液希釈）と、エシェ
リヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３７℃
で１５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた
３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.５％
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０.５％ＮａＣｌ，０.２
％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０.５％Ａｇａｒ）を加え、λ
プレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.５％ ＮａＣｌ，
０.２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，１％Ａｇａｒ）に均一に
塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。

【０１０５】この培地上にニトロセルロースフィルター
を載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸
着させ、順次５分間ずつ以下 イ)〜ハ)の試薬に浸した
濾紙上にフィルターをのせて処理した。 イ)０.５Ｍ ＮａＯＨ，１.５Ｍ ＮａＣｌ ロ)０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．５
Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ)２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）

【０１０６】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（２）で得た
ＰＣＲ増幅断片をＤＮＡプローブとして用い、上記で作
製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーショ
ンを常法［Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
boratory Press(1989)］に従って行った。

【０１０７】この結果、上記プローブについてハイブリ
ダイゼーション陽性のプラークを選択し、そこからファ
ージＤＮＡを抽出して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出さ
れる長さ約１．３ｋｂの挿入断片、及び、制限酵素Ｓａ
ｃＩで切り出される長さ約１．６ｋｂの挿入断片をアガ
ロースゲル電気泳動により確認した。

【０１０８】（５）２−アミノフェノール １，６−ジ
オキシゲナーゼをコードするＤＮＡのサブクローニング
及びＤＮＡ塩基配列の決定 上記（４）で得られた、制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出さ
れる長さ約１．３ｋｂの挿入断片、及び、制限酵素Ｓａ
ｃＩで切り出される長さ約１．６ｋｂの挿入断片に存在
する２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ
をコードするＤＮＡの全塩基配列を決定するために、該
ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝
酒造（株）製）へサブクローニングした。

【０１０９】上記ＥｃｏＲＩまたはＳａｃＩで切り出さ
れるＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造（株）製）を、各々制限酵素ＥｃｏＲＩまたは
ＳａｃＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６），１０ｍＭジ
チオスレイトール，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂及びＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔ／１０μｌの各成
分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃
で１０時間反応させ、上記ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片
またはＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片とベクターを連結させ
た。

【０１１０】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Journal of Molecular Biology，Vol.53, p.159
(1970)］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒
造社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌ
を含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキストラク
ト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに
溶解］に塗抹した。

【０１１１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＳａｃＩにより切断し、
上記（２）で得られたＰＣＲ増幅断片をＤＮＡプローブ
としたハイブリダイゼーション法を用いて挿入断片を調
べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．２ｋｂ
のＤＮＡ断片に加え、長さ約１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片、及び、長さ約１．６ｋｂのＳａｃＩ断片が確認され
た。

【０１１２】上記で得られた長さ約１．３ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＥと命名し、該プラ
スミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９
株（宝酒造（株）製）をＥＣＡＰＥと命名し、長さ約
１．６ｋｂのＳａｃＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＳ
と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア
・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）をＥＣＡＰＳと
命名した。

【０１１３】上記で得られた２−アミノフェノール
１，６−ジオキシゲナーゼコードするＤＮＡを含む長さ
が約１．３ｋｂのＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）断
片、及び、長さが約１．６ｋｂのＤＮＡ（ＳａｃＩ−Ｓ
ａｃＩ）断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８
（宝酒造（株）製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵
素法（dideoxychain termination法）［Sanger，F.et a
l.，プロシ−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ・
オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）Vol.74,p.5
463,(1977)］により決定した。

【０１１４】このようにして決定された上記の両ＤＮＡ
断片（長さが約１．３ｋｂのＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ）断片、及び、長さが約１．６ｋｂのＤＮＡ（Ｓ
ａｃＩ−ＳａｃＩ）断片）の塩基配列には、０．８ｋｂ
の重なりが見られた（図１）。重ね合わせた全長約２．
１ｋｂの塩基配列の中には、２つのオープンリーデイン
グフレームの存在が確認され、シュードモナス・エスピ
ーＡＰ−３株の２−アミノフェノール １，６−ジオキ
シゲナーゼをコードするＤＮＡは、後記配列表の配列番
号２（配列番号１に示す塩基配列中の塩基番号１６３〜
塩基番号１０７７に相当）に示すアミノ酸配列（βサブ
ユニット）をコードする９１５塩基対、及び、配列番号
３（配列番号１に示す塩基配列中の塩基番号１１１３〜
塩基番号１９２５に相当）に示すアミノ酸配列（αサブ
ユニット）をコードする８１３塩基対の２つのオープン
リーデイングフレームから構成されることがわかった。
また、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記
（１）で決定した配列番号４及び５に示すアミノ酸配列
から予想される塩基配列に相当する配列が含まれること
が再確認された。

【０１１５】

【発明の効果】本発明の方法により２−アミノフェノー
ル類からピコリン酸類を簡便に得ることができる。ま
た、本発明のＤＮＡによれば、微生物の触媒能力を従来
の方法に比して飛躍的に増大させたり、２−アミノフェ
ノール １，６−ジオキシゲナーゼを大量に製造したり
することが可能となる。

【０１１６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２１３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.) 株名：ＡＰ−３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：163..1077 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1113..1925 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTCAATG CCGTATGGGA TGAGTATTTC AAAGACCAAA CGCCTCCGGC GCGAACGTCT 60 ATAGGAGTAT CAGCGCTTCC GCTGGGTGCG CTGATTGAGA TGGAGTTCCA ATTCGCAATC 120 GATTGATCCT GCCTTCAAAA AACAAATACT AGGAGAAGCG AT ATG GCA AAC GGT 174 Met Ala Asn Gly 1 GAA ATT ATC AGC GGC TTC ATT GCC CCC CAT CCA CCT CAC TTG GTT TAT 222 Glu Ile Ile Ser Gly Phe Ile Ala Pro His Pro Pro His Leu Val Tyr 5 10 15 20 GGC GAA AAC CCT CCG CAG AAT GAG CCT AAG TCT ACG GGC GGT TGG GAG 270 Gly Glu Asn Pro Pro Gln Asn Glu Pro Lys Ser Thr Gly Gly Trp Glu 25 30 35 CAG TTA CGG TGG GCC TAT GAG CGT GCC AGG GCC AGT ATC GAG GAA CTG 318 Gln Leu Arg Trp Ala Tyr Glu Arg Ala Arg Ala Ser Ile Glu Glu Leu 40 45 50 AAA CCA GAT GTT CTT CTG GTG CAC TCG CCT CAC TGG ATC ACC TCG GTT 366 Lys Pro Asp Val Leu Leu Val His Ser Pro His Trp Ile Thr Ser Val 55 60 65 GGT CAT CAT TTC ATC GGC GTC GAC CAT CTT CAG GGG CGG TCG GTC GAT 414 Gly His His Phe Ile Gly Val Asp His Leu Gln Gly Arg Ser Val Asp 70 75 80 CCC ATT TTT CCG AAC CTG TTC CGT TTT GAC TAT TCG ATC AAT TTC GAC 462 Pro Ile Phe Pro Asn Leu Phe Arg Phe Asp Tyr Ser Ile Asn Phe Asp 85 90 95 100 GTC GAG CTC TCT GAG GCC TGT TGC GAG GAA GGC CGC AAG GCC GGG CTT 510 Val Glu Leu Ser Glu Ala Cys Cys Glu Glu Gly Arg Lys Ala Gly Leu 105 110 115 GTT ACG AAG ATG ATG CGT AAC CCC CGA TTC CGG CCT GAT TAT GGA ACG 558 Val Thr Lys Met Met Arg Asn Pro Arg Phe Arg Pro Asp Tyr Gly Thr 120 125 130 ATC ACT ACC CTG CAC ATG ATA CGC CCG CAA TGG GAT ATT CCG GTC GTG 606 Ile Thr Thr Leu His Met Ile Arg Pro Gln Trp Asp Ile Pro Val Val 135 140 145 TCG ATT TCC GCG AAC AAT ACG CCG TAC TAC CTG AGT ATG GAA GAG GGG 654 Ser Ile Ser Ala Asn Asn Thr Pro Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Glu Gly 150 155 160 CTT GGG GAA ATG GAC GTG CTC GGT AAG GCG ACC CGT GAA GCC ATT CTG 702 Leu Gly Glu Met Asp Val Leu Gly Lys Ala Thr Arg Glu Ala Ile Leu 165 170 175 180 AAA TCT GGA AAG CGT GCG GTT TTG CTC GCT TCT AAT ACG TTA TCC CAT 750 Lys Ser Gly Lys Arg Ala Val Leu Leu Ala Ser Asn Thr Leu Ser His 185 190 195 TGG CAC TTC CAC GAG GAA CCC GTG CCG CCA GAG GAT ATG TCC AAA GAG 798 Trp His Phe His Glu Glu Pro Val Pro Pro Glu Asp Met Ser Lys Glu 200 205 210 CAT CCC CAG ACC AAG ATC GGC TAC GAA TGG GAC ATG CGC ATG ATT GAG 846 His Pro Gln Thr Lys Ile Gly Tyr Glu Trp Asp Met Arg Met Ile Glu 215 220 225 TTG ATG CGG CAA GGG CGT ATG GAG GAA GTT TTC CAA CTT CTC CCT CAG 894 Leu Met Arg Gln Gly Arg Met Glu Glu Val Phe Gln Leu Leu Pro Gln 230 235 240 TTT ATT GAG GAA GCT TTT GCT GAG GTC AAA TCG GGC GCG TTC ACC TGG 942 Phe Ile Glu Glu Ala Phe Ala Glu Val Lys Ser Gly Ala Phe Thr Trp 245 250 255 260 ATG CAT GCC GCC ATG CAG TAT CCG AAC CTC CCT GCG GAG TTG CAT GGC 990 Met His Ala Ala Met Gln Tyr Pro Asn Leu Pro Ala Glu Leu His Gly 265 270 275 TAC GGA ACG GTG ATC GGT ACC GGA AAT GCC GTA GTG GAG TGG AAT TTG 1038 Tyr Gly Thr Val Ile Gly Thr Gly Asn Ala Val Val Glu Trp Asn Leu 280 285 290 GTC AAG GCG GGC CTA GCC AGA GTG GCA GGA AAA GCA GCC TAACCGTCCC 1087 Val Lys Ala Gly Leu Ala Arg Val Ala Gly Lys Ala Ala 295 300 305 TTTTTCCCAA TCAGGTATTA AGTCC ATG ACC ATT GTT TCC GCC TTC CTT GTT 1139 Met Thr Ile Val Ser Ala Phe Leu Val 1 5 CCC GGT AGC CCT CTG CCT CAT TTG CGC CCA GAT GTC AAA AGC TGG GAA 1187 Pro Gly Ser Pro Leu Pro His Leu Arg Pro Asp Val Lys Ser Trp Glu 10 15 20 25 AGC TTC AAA GTT GCT ATG CAA AAC GTG GGC GAA AAG CTG CGC GCC TCG 1235 Ser Phe Lys Val Ala Met Gln Asn Val Gly Glu Lys Leu Arg Ala Ser 30 35 40 AAG CCC GAC GTA GTT TTA ATT TAT TCA ACT CAA TGG TTT GCA GTG CTG 1283 Lys Pro Asp Val Val Leu Ile Tyr Ser Thr Gln Trp Phe Ala Val Leu 45 50 55 GAT GAG ATC TGG CTA ACA CGC CAG CGC AGC CTG GAT ATT CAT GTT GAT 1331 Asp Glu Ile Trp Leu Thr Arg Gln Arg Ser Leu Asp Ile His Val Asp 60 65 70 GAG AAC TGG CAT GAA TTC GGA GAG TTG CCC TAT GAT ATT TAT TCA GAT 1379 Glu Asn Trp His Glu Phe Gly Glu Leu Pro Tyr Asp Ile Tyr Ser Asp 75 80 85 GTC GAC CTC GCT AAT GCC TGT ATT GAA AGC TGC CGT GCT GCG GGG GTG 1427 Val Asp Leu Ala Asn Ala Cys Ile Glu Ser Cys Arg Ala Ala Gly Val 90 95 100 105 AAC GCG CGG GGT GCT GAC TAC GAG AGC TTC CCG ATT GAT ACC GGG ACA 1475 Asn Ala Arg Gly Ala Asp Tyr Glu Ser Phe Pro Ile Asp Thr Gly Thr 110 115 120 ATC GTA GCC TGC AAT GCA CTC AAG GTC GGT ACT TCA GAT CTG CCA GTT 1523 Ile Val Ala Cys Asn Ala Leu Lys Val Gly Thr Ser Asp Leu Pro Val 125 130 135 GTG GTG GCA TCT AAC AAT CTT TAT GAC GAT CAA GCC GCT ACC GAG AGG 1571 Val Val Ala Ser Asn Asn Leu Tyr Asp Asp Gln Ala Ala Thr Glu Arg 140 145 150 CTT GCG GCT CTT GCA GTC GCC TGT ATT TCG GAA AAA GGT AAG CGG ATT 1619 Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Cys Ile Ser Glu Lys Gly Lys Arg Ile 155 160 165 GCT GTC ATT GGC GTC GGT GGC CTG TCC GGC AGC GTT TTC ACC ACC GCC 1667 Ala Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Ser Gly Ser Val Phe Thr Thr Ala 170 175 180 185 ATC GAT CCC GCT GAA GAC CGC GTA GTG AAA GCG GTC GAA GAC GAC TGC 1715 Ile Asp Pro Ala Glu Asp Arg Val Val Lys Ala Val Glu Asp Asp Cys 190 195 200 AAC AAG AAC ATT CTC AGT TTG ATG GAG TCT GGG AAT ATC CAG GCT TTG 1763 Asn Lys Asn Ile Leu Ser Leu Met Glu Ser Gly Asn Ile Gln Ala Leu 205 210 215 AGG GAG GCA CTC AAA TCT TAT TCT AAA GAG GCG AGA GCG GAA ATG GGG 1811 Arg Glu Ala Leu Lys Ser Tyr Ser Lys Glu Ala Arg Ala Glu Met Gly 220 225 230 TTC AAA CAT TTC CAC TGG TTA CTA GGT GCA TTG GAT GGG CAT TTC AAA 1859 Phe Lys His Phe His Trp Leu Leu Gly Ala Leu Asp Gly His Phe Lys 235 240 245 GGT GCC ACA GTT CAT CAC TAC GGT GCT CTT TAT GGT AGC GGC GCT GCA 1907 Gly Ala Thr Val His His Tyr Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Ala Ala 250 255 260 265 GTG GTT GAG TTT TCA ATC TGACAACGTT TCGCTGACTG TATTAGATGC 1955 Val Val Glu Phe Ser Ile 270 AGTGAATCTT CGCTAGTTTT CTTGTCACGA TGGCCCCCTT ACATGTCGGG GGGACGGGTT 2015 ACTGCGCTTT TTATTCGGCT TGGCCCGTCA TGCCCGACAG CCAGCACCAA TGTATGAATG 2075 TTTTATCGAG GTAGTTTATG AAGCAATATC GAAACTTTGT GGATGGCAAG TGGGTCGAGA 2135 GCTC 2139

【０１１７】配列番号：２ 配列の長さ：３０５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Asn Gly Glu Ile Ile Ser Gly Phe Ile Ala Pro His Pro Pro 1 5 10 15 His Leu Val Tyr Gly Glu Asn Pro Pro Gln Asn Glu Pro Lys Ser Thr 20 25 30 Gly Gly Trp Glu Gln Leu Arg Trp Ala Tyr Glu Arg Ala Arg Ala Ser 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Lys Pro Asp Val Leu Leu Val His Ser Pro His Trp 50 55 60 Ile Thr Ser Val Gly His His Phe Ile Gly Val Asp His Leu Gln Gly 65 70 75 80 Arg Ser Val Asp Pro Ile Phe Pro Asn Leu Phe Arg Phe Asp Tyr Ser 85 90 95 Ile Asn Phe Asp Val Glu Leu Ser Glu Ala Cys Cys Glu Glu Gly Arg 100 105 110 Lys Ala Gly Leu Val Thr Lys Met Met Arg Asn Pro Arg Phe Arg Pro 115 120 125 Asp Tyr Gly Thr Ile Thr Thr Leu His Met Ile Arg Pro Gln Trp Asp 130 135 140 Ile Pro Val Val Ser Ile Ser Ala Asn Asn Thr Pro Tyr Tyr Leu Ser 145 150 155 160 Met Glu Glu Gly Leu Gly Glu Met Asp Val Leu Gly Lys Ala Thr Arg 165 170 175 Glu Ala Ile Leu Lys Ser Gly Lys Arg Ala Val Leu Leu Ala Ser Asn 180 185 190 Thr Leu Ser His Trp His Phe His Glu Glu Pro Val Pro Pro Glu Asp 195 200 205 Met Ser Lys Glu His Pro Gln Thr Lys Ile Gly Tyr Glu Trp Asp Met 210 215 220 Arg Met Ile Glu Leu Met Arg Gln Gly Arg Met Glu Glu Val Phe Gln 225 230 235 240 Leu Leu Pro Gln Phe Ile Glu Glu Ala Phe Ala Glu Val Lys Ser Gly 245 250 255 Ala Phe Thr Trp Met His Ala Ala Met Gln Tyr Pro Asn Leu Pro Ala 260 265 270 Glu Leu His Gly Tyr Gly Thr Val Ile Gly Thr Gly Asn Ala Val Val 275 280 285 Glu Trp Asn Leu Val Lys Ala Gly Leu Ala Arg Val Ala Gly Lys Ala 290 295 300 Ala 305

【０１１８】配列番号：３ 配列の長さ：２７１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Thr Ile Val Ser Ala Phe Leu Val Pro Gly Ser Pro Leu Pro His 1 5 10 15 Leu Arg Pro Asp Val Lys Ser Trp Glu Ser Phe Lys Val Ala Met Gln 20 25 30 Asn Val Gly Glu Lys Leu Arg Ala Ser Lys Pro Asp Val Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Gln Trp Phe Ala Val Leu Asp Glu Ile Trp Leu Thr Arg 50 55 60 Gln Arg Ser Leu Asp Ile His Val Asp Glu Asn Trp His Glu Phe Gly 65 70 75 80 Glu Leu Pro Tyr Asp Ile Tyr Ser Asp Val Asp Leu Ala Asn Ala Cys 85 90 95 Ile Glu Ser Cys Arg Ala Ala Gly Val Asn Ala Arg Gly Ala Asp Tyr 100 105 110 Glu Ser Phe Pro Ile Asp Thr Gly Thr Ile Val Ala Cys Asn Ala Leu 115 120 125 Lys Val Gly Thr Ser Asp Leu Pro Val Val Val Ala Ser Asn Asn Leu 130 135 140 Tyr Asp Asp Gln Ala Ala Thr Glu Arg Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala 145 150 155 160 Cys Ile Ser Glu Lys Gly Lys Arg Ile Ala Val Ile Gly Val Gly Gly 165 170 175 Leu Ser Gly Ser Val Phe Thr Thr Ala Ile Asp Pro Ala Glu Asp Arg 180 185 190 Val Val Lys Ala Val Glu Asp Asp Cys Asn Lys Asn Ile Leu Ser Leu 195 200 205 Met Glu Ser Gly Asn Ile Gln Ala Leu Arg Glu Ala Leu Lys Ser Tyr 210 215 220 Ser Lys Glu Ala Arg Ala Glu Met Gly Phe Lys His Phe His Trp Leu 225 230 235 240 Leu Gly Ala Leu Asp Gly His Phe Lys Gly Ala Thr Val His His Tyr 245 250 255 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Ala Ala Val Val Glu Phe Ser Ile 260 265 270

【０１１９】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Ile Val Ser Ala Phe Leu Val Pro Gly Ser Pro Leu Pro His Leu 1 5 10 15 Arg Pro Asp Val Lys Ser Trp Glu Ser Phe Lys Val Ala Met 20 25 30

【０１２０】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Asn Gly Glu Ile Ile Ser Gly Phe Ile Ala Pro His Pro Pro His 1 5 10 15 Leu Val Tyr Gly 20

【０１２１】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 CATNACYTTR AANSWYTCCC A 21

【０１２２】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 TTYATNGCNC CNCAYCCNCC NCA 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 ２−アミノフェノールに２−アミノフェノー
ル １，６−ジオキシゲナーゼを作用させた場合のＵＶ
スペクトルの経時変化を示す図である。

【図２】 アミノフェノール １，６−ジオキシゲナー
ゼをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片
（約２．１ｋｂ）の制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれ独立して、
   水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、アミノ
   基、ニトロ基またはカルボキシル基である。）で表され
   る２−アミノフェノール類を酵素と反応させることを特
   徴とする下記一般式（II） 【化２】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は上記の通りである。）
   で表されるピコリン酸類の製造方法。
2. 【請求項２】 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄が、それぞれ独立
   して、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ₁₀のアル
   キル基である請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄が、それぞれ独立
   して、水素原子、ハロゲン原子またはＣ₁〜Ｃ₃のアルキ
   ル基である請求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】 前記酵素が１，６−ジオキシゲナーゼで
   ある請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 前記酵素が２−アミノフェノール １，
   ６−ジオキシゲナーゼである請求項４に記載の製造方
   法。
6. 【請求項６】 前記２−アミノフェノール １，６−ジ
   オキシゲナーゼが、シュードモナス・エスピーＡＰ−３
   株由来である請求項５に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 前記２−アミノフェノール １，６−ジ
   オキシゲナーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペ
   プチドと下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドとを
   含む請求項５に記載の製造方法。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
   ブユニットのポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
   号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
   に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
   成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
   ド。 （Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
   る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
   ブユニットのポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
   号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
   に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
   成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
   ド。
8. 【請求項８】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチ
   ドと下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドとを含む
   ２−アミノフェノール １，６−ジオキシゲナーゼ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
   ブユニットのポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
   号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
   に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
   成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
   ド。 （Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
   る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
   ブユニットのポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
   号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
   に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
   成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
   ド。
9. 【請求項９】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
   ブユニットのポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
   号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
   に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
   成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
   ド。
10. 【請求項１０】 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプ
    チドをコードするＤＮＡ。 （Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
    る２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼのサ
    ブユニットのポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
    て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
    加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列表の配列番
    号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドととも
    に、２−アミノフェノールを酸化してピコリン酸類を生
    成する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
    ド。
11. 【請求項１１】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡで
    ある請求項９記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列を
    含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号１６３〜１０７７からなる塩基配列と
    ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
    であって、かつ、配列表の配列番号３に示すアミノ酸配
    列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノール
    を酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタンパ
    ク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡで
    ある請求項１０記載のＤＮＡ。 （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号１１１３〜１９２５からなる塩基配列
    を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号１１３〜１９２５からなる塩基配列と
    ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
    であって、かつ、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配
    列を有するポリペプチドとともに２−アミノフェノール
    を酸化してピコリン酸類を生成する活性を有するタンパ
    ク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 請求項９〜１２のいずれか一項に記載
    のＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクター。
14. 【請求項１４】 請求項９〜１２のいずれか一項に記載
    のＤＮＡが導入されることにより形質転換された形質転
    換体。
15. 【請求項１５】 請求項９又は１１に記載のＤＮＡ及び
    請求項１０又は１２に記載のＤＮＡが導入されることに
    より形質転換された形質転換体。
16. 【請求項１６】 請求項１４又は１５記載の形質転換体
    を培地で培養し、その培養物から２−アミノフェノール
    １，６−ジオキシゲナーゼ又はそのサブユニットを採
    取することを特徴とする２−アミノフェノール １，６
    −ジオキシゲナーゼ又はそのサブユニットの製造法。