KR100460579B1

KR100460579B1 - 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법

Info

Publication number: KR100460579B1
Application number: KR1019960706294A
Authority: KR
Inventors: 아끼오 오자끼; 히데오 모리; 다께시 시바사끼
Original assignee: 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2005-01-15
Also published as: CA2189682C; ES2176441T3; CN1132938C; CN1150821A; WO1996027669A1; EP0759472B1; DE69621714T2; JP3440100B2; EP0759472A4; DE69621714D1; HK1000712A1; EP0759472A1; CA2189682A1; ATE219142T1; KR970702921A

Abstract

본 발명은 의약품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조법 및 이 효소에 관한 것이다.

Description

트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING TRANS-4-HYDROXY-L-PROLINE}

미생물을 사용하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법으로서,

1)에스케리키아속에 속하는 미생물을 사용하여, 4-히드록시-2-옥소글루타르산으로 부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법 (일본 특개평 3-266995),

2) 세균이나 곰팡이류를 사용하여 직접 발효 생산하는 방법 (유럽 특허 출원 EP 0 547 898 A2, 특개평 5-236980, 특개평 6-245782),

3)스트렙토마이세스속에 속하는 미생물을 사용하여, L-프롤린으로 부부터 제조하는 방법 [참조 : J. of Biol. Chem. vol. 254, 6684-6690 (1979),Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 120, 45-51 (1984), Tetrahedron Letters., vol 34, 7489-7492 (1993), Tetrahedron Letters., vol 35, 4649-4652 (1994)] 이 알려져 있다.

종래의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법은,

(1) 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하기 위한 4-히드록시-2-옥소글루타르산 등의 기질이 값이 비싸 입수가 곤란하고,

(2) 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산성이 낮고,

(3) 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조에 관여하는 효소의 활성이 극히 미약한 등의 이유 때문에 공업화가 곤란하였다.

트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조에 관여하는 효소에 대하여는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 상기의스트렙토마이세스속에 속하는 미생물로 부터 정제한 것이 보고되어 있으나, 이 효소의 취득 방법 및 이화학적 성질은 개시되어 있지 않다. 더욱이, 2-케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하에서, 유리된 L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시키는 활성을 갖는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다는 보고는 없다.

활성이 높은 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 사용하여 공업적으로 유리하게 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법도 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 사용하여 값이 싸고 입수가 용이한 L-프롤린으로부터 효율적으로 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을제조하는 방법에 있어서, 보다 공업적으로 유리하게 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조하기 위하여 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자 및 이 유전자를 함유하는 형질전환체를 제공하고, 이 유전자 및 형질전환체를 사용하여 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 대량으로 생산시켜, 이 형질전환체 또는 효소를 사용하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 값싸게 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 의약품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 (이하, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자라고 약기한다). 이 유전자를 함유하는 형질전환체 및 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1 은 플라스미드 pRH71 의 제한효소 지도 및 플라스미드 pYan10 및 pYan13 의 조성공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 클론화된닥틸로스포란기움종 RH1 의 염색체 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관계되는 제한효소 부위만을 표시하고 있다.

도 2 는 플라스미드 pTr14 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 클론화된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Ptrp는 대장균 트립토판 오페론의 프로모터를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한 도중, 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시되어 있다.

도 3 은 플라스미드 pTc4OH 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 포함한 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Ptac는tac프로모터를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 나타낸다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시된다.

도 4 는 플라스미드 pTr2-4OH 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유한 부분을 나타내며, Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Ptrp× 2 는 대장균 유래의 트립토판 오페론의 프로모터를 2개 직렬시킨 프로모터 (탄뎀(tandem) 트립토판 프로모터) 를 나타낸다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시되어 있다.

도 5 는 플라스미드 pTr2-4OH△ 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 표시한다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Ptrp× 2 는 대장균 유래의 트립토판 오페론의 프로모터를 2 개 직렬시킨 프로모터 (탄뎀 트립토판 프로모터) 를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만을 표시하고 있다.

도 6 은 플라스미드 pWFH1 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 굵은 선으로 표시한 부분이HindIII 및SalI 처리한 PCR 증폭 단편의 삽입 부분을 표시한다. 검은칠의 굵은 선으로 표시한 부분이닥틸로스포란기움종 RH1 유래의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Ptrp× 2 는 대장균 유래의 트립토판 오페론의 프로모터를 2 개 직렬시킨 프로모터 (탄뎀 트립토판 프로모터) 를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시되어 있다.

도 7 은 플라스미드 pES1-23a 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유한 부분을 나타낸다.lacZ 는 대장균 β-갈락토시다제 유전자를, Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를, Plac는lac프로모터를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시되어 있다.

도 8 은 플라스미드 pMc4OH 의 조성 공정을 나타낸다. 도중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유한 부분을 나타낸다.malE 는 대장균 말토스 결합 단백질 유전자를,lacZ 는 대장균 β-갈락토시다제 유전자를, Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를,lacI^q는 대장균 락토스 오페론의 리프레서 유전자를,rrnB 터미네이터는rrnB 유전자의 터미네이터를, Ptac는tac프로모터를 표시한다. 화살 표시는 유전자의 전사 및 번역의 방향을 표시한다. 또한, 도중에는 플라스미드의 조성에 관련된 제한효소 부위만이 표시되어 있다.

본 발명은 미생물 유래의 신규한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조 방법, 이 효소 및 형질전환체 또는 이 효소를 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법에 관한 것이다.

하기에, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 관한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소는 2-케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하에 있어서, 유리된 L-프롤린을 수산화하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소이다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질로서는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들면 서열번호 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이 단백질 또는 이 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 단백질과 대장균 유래의 β-갈락토시다제 단백질의부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 결합된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 및 서열 번호 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질 혹은 이 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 단백질과 대장균 유래의 말토스 결합 단백질의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 결합된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 등을 들 수가 있다. 융합 단백질의 구체적인 예로서는 서열번호 18 또는 19 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질 등을 들 수가 있다.

또한, 서열 번호 1, 18 또는 19 에서 나타나는 아미노산 서열은 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수가 있다. 여기서, 아미노산의 치환, 결실 또는 부가는 문헌 [Nucl. Acid Res., vol. 10, 6487-6500 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 79, 6409-6413 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 81, 5662-5666 (1984), Science, vol. 224, 1431-1433 (1984), PCT WO85/00817 (1985), Nature, vol. 316, 601 - 605 (1985), Gene, vol. 34, 315 - 323 (1985), Nucleic Acid Research, vol. 13, 4431-4442 (1985), Current Protocols in Molecular Biology, 8 장, Mutagenesis of Cloned DNA, John Willey & Sons, Inc. (1989)] 등에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다.

본 발명에 관한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자로서는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들면 서열 번호 1, 18 또는 19 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자로, 서열 번호 1, 18 또는 19 에 나타낸 아미노산 서열이란 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 들 수가 있다. 구체적으로는 서열 번호 2, 8 및 15 로 표시되는 DNA 를 들 수가 있다.

또한, 본 발명에 관한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자로서, 상기에서 정의되는 DNA 에 대하여 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 잃치 않는 범위 내에서 치환 변이, 결실 변이, 삽입 변이 등의 변이가 도입된 DNA, 예를 들면 서열 번호 2, 8 또는 15 와 상동성을 갖는 DNA 등을 들 수가 있다. 이 상동성을 갖는 DNA 란 서열 번호 2, 8 또는 15 에 나타낸 염기 서열을 함유하는 DNA 를 프로브로하여, 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 플라크 하이브리다이제이션법을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미한다. 이들의 조작은 공지의in vitro재조합 기법 [Moleclar Clonning, A Laboratory Manual, 제2판, Sambrook, Fritsch, Maniatis 편집, Cold Spring Harbor Labor- atory Press (1989)] 에 준하여 실시할 수가 있다.

이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편은 L-프롤린을 수산화하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 능력을 갖는 미생물로부터 취득할 수가 있다. 이와같은 미생물로서는 L-프롤린을 수산화하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 능력을 갖는 미생물이면 어느 것이라도 좋으나 바람직하기는닥틸로스포란기움(Dactylosporangium) 속,아미콜라토프시스(Amycolatopsis) 속 또는스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하며, 또한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 미생물을 들 수가 있다. 더욱 바람직하기는,닥틸로스포란기움종 RH1 (FERM BP-4400),아미콜라토프시스종 (Amycolatopsissp.) RH2 (FERM BP-4581),스트렙토마이세스 그리세오비리디스(Streptomyces griseovivides) JCM 4250,스트렙토마이세스 다그헤스타니쿠스(Streptomyces daghestanicus) JCM 4365, 혹은 이들의 돌연변이주 또는 유도체를 들 수가 있다.

닥틸로스포란기움종 - RH1 및아미콜라토프시스종 RH2 는 본 발명자들이 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물로서 분리한 미생물이며,스트렙토마이세스 글리제오비리디스JCM 4250 및스트렙토마이세스 다그헤스타미쿠스JCM 4365 는 본 발명자들이 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 새로이 발견한 미생물이다.

하기에 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물 유래의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 취득방법에 관하여 나타낸다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물로부터 통상의 DNA 단리법, 예를 들면 페놀법 [Biochim. Biophys. Acta, vol. 72, 619- 629 (1963)] 에 의해, 이 미생물의 염색체 DNA 를 제조한다. 수득된 염색체 DNA 를 적당한 제한효소로 절단하고, 이 제한효소 절단 단편을 벡터 DNA 에 도입함으로써 이 미생물 염색체의 염색체 DNA 라이브러리를 구축한다. 이 염색체 DNA 라이브러리를 사용하여 숙주 미생물을 형질전환한다. 수득된형질전환체로부터 하이브리다이제이션법에 의해 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 형질전환체의 선별을 수행한다. 선별된 형질전환체로부터 목적으로 하는 유전자를 함유하는 DNA 를 수득할 수가 있다.

이 일련의 조작은 공지의in vitro재조합 기법 [Molecular Clonning, A Laboratory Manual, 제2판, Sambrook, Fritsch, Maniatis 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] 에 준하여 실시할 수가 있다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 염색체 DNA 라이브러리를 구축하는 벡터 DNA 로서는 대장균 K12 균주중에서 자가복제할 수 있는 것이면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이라도 사용할 수 있다. 적합한 예로는 λZAPII, pUC18, pBluescript (스트라타겐 사에서 시판) 등을 들 수가 있다.

숙주 미생물로서는에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물이라면 어느 것이라도 사용할 수가 있다. 적합하기로는,에스케리키아 콜리XL1-Blue,에스케리키아 콜리XL2-Blue,에스케리키아 콜리DH1,에스케리키아 콜리MC 1000 등을 들 수가 있다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소 중의 아미노산 서열의 정보를 토대로 하여, DNA 프라이머를 제작하고, 이 DNA 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 중합 반응 (이하, PCR 이라고 약기한다) 을 실시하여 수득된 DNA 단편을 사용하여 하이브리다이제이션법을 수행함으로, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 형질전환체를 선별할 수 있다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 아미노산 서열 정보는 통상 사용되는 아미노산 서열 분석 장치, 예를 들면 시마즈 세이사꾸쇼 사제 단백질 서열분석기 model PPSQ-10 등을 사용하여, 정제된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 분석함으로써 얻을 수 있다. 이와같이 해서 얻어진 아미노산 서열 정보로서 예를 들면 서열 번호 1 에 나타낸 아미노산 서열중의 부분 아미노산 서열을 들 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 1 에 나타낸 아미노산 서열의 N 말단에서 24 번째 까지의 아미노산 서열을 갖는 부분 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

DNA 프라이머의 합성은 통상 사용되는 DNA 합성기, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템 사제, 380 A·DNA 합성기 등을 사용하여 실시할 수가 있다.

하이브리다이제이션법에 사용하는 프로브로는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 부분 단편을 사용할 수 있다. L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 부분 단편은 PCR 을 이용하여 수득할 수가 있다. 구체적으로는 서열 번호 3 (서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 1 - 6 번째의 아미노산을 코딩하는 센스 사슬 DNA 에 대응하는) 에 표시한 DNA 와 서열 번호 4 (서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 19 내지 24 번째의 아미노산을 코딩하는 안티센스 사슬 DNA 에 대응하는) 에 표시한 DNA 를 화학 합성하고, 이들을 DNA 프라이머로 사용하여 PCR 을 실시하고 수득된 서열번호 5 에 나타낸 71 bp 의 DNA 단편 등을 프로브로 들 수 있다.

하이브리다이제이션법에 의해 선별된 형질전환체로 부터 수득된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 를 적당한 제한 효소, 예를 들면XhoI 등으로 절단한 후, pBluescript KS(+) (스트라타겐사에서 시판) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상적인 방법에 따라 사용되는 염기 서열 분석 방법, 예를 들면 생거 등의 디데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 74, 5463, (1977)] 등에 의해 분석함으로써, 이 유전자의 염기 서열을 결정할 수 있다. 염기 서열의 분석은 염기 서열 자동분석 장치, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템 사제 373A·DNA 서열분석기 등을 사용하여 실시할 수 있다. 이와같이 해서 결정된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 염기 서열로는 예를 들면 서열번호 2 및 8 에 나타낸 염기 서열을 들 수 있다.

본 발명의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 코딩하는 DNA 를 함유하는 플라스미드로는 예를 들면 pRH71 을 들 수 있다. pRH71 을 함유하는 대장균인에스케리키아 콜리SOLR/pRH71 은 평성 7 년 3 월 2 일자로 공업기술원 생명 공학 공업기술 연구소, 일본 이바라끼껭 쓰구바시 히가시 1쵸메 1방 3고 (우편번호 305) 에 FERM BP-5025 로서 기탁되어 있다.

상기에서 수득된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 숙주중에서 발현시키기 위해서 먼저 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소 혹은 DNA 절단효소로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 절단한 후에, 발현 벡터 중 프로모터의 하류에 삽입하고, 이어서 상기 DNA 를 삽입한 발현 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주에 도입한다. 숙주로는 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것을 모두 사용할 수 있다. 예를 들면에스케리키아속,세라티아속,코리네박테리움속,브레비박테리움속,슈도모나스속,바실러스속 등에 속하는 미생물 균주 이외에 효모 균주나 동물 세포 숙주 등을 들 수 있다.

발현 벡터로서는 상기 숙주에 있어서 자가복제 가능 또는 염색체로의 도입이 가능하고, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

대장균 등의 미생물을 숙주로서 사용하는 경우에, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 발현 벡터는 미생물 중에서 자가 복제 가능한 동시에 프로모터, 리보솜 결합 서열, L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자, 전사 종결 서열로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유되어 있어도 좋다.

발현 벡터로서는 예를 들면 pBtrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거 멘하임사 시판), pKYP10 (일본 특개소 제 58-110600 호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., vol. 48, 669-675 (1984)], pLSA1 [Agric Biol. Chem., vol. 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 82, 4306, (1985)], pBluescript (스트라타겐사), pTrs30 (에스케리키아 콜리JM 109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로부터 제조] 및 pTrs32 [에스케리키아 콜리JM 109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 제조] 등을 예시할 수가 있다.

프로모터로는 대장균 등의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면,trp프로모터 (Ptrp),lac프로모터 (Plac), P_L프로모터, P_R프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또 Ptrp를 2 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrpx 2),tac프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리보솜 결합 서열로서는 대장균 등의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋으나, 리보솜 결합 서열과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리 (예를 들면 6 - 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 코딩하는 유전자면 어느 것이라도 사용할 수가 있으나, 이 유전자의 DNA 서열을 숙주 미생물에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환하여 사용하는 것이 바람직하다. 대장균을 숙주로 하여 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 구체적인 예로서 서열 번호 15 에 나타낸 염기서열 등을 들 수 있다.

본 유전자의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않으나, 적합하기로는 구조 유전자 바로 밑에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.

숙주로서는에스케리키아 콜리XL1-Blue,에스케리키아 콜리XL2-Blue,에스케리키아 콜리DH1,에스케리키아 콜리MC1000,에스케리키아 콜리KY3276,에스케리키아 콜리W1485,에스케리키아 콜리JM109,에스케리키아 콜리HB101,에스케리키아 콜리49번,에스케리키아 콜리W3110,에스케리키아 콜리NY49,바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis),바실러스 아밀로쿠에파시네스(Bacillus amyloquefacines),브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068,브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium Saccharolyticum) ATCC14066,브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869,코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032,코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354 등을 들수가 있다.

효모 균주를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들면 YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) 등을 예시할 수가 있다.

프로모터로서는 효모 균주의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면 헥토스키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 열 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.

숙주로서는사카로마이세스 세레비사에(Saccharomyces cerevisiae),시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe),클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis),트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans),슈바니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들면 pcDNA I/Amp, pcDNA I, pcDM 8 (모두 프라코시사에서 시판) 등을 예시할 수가 있다. 프로모터로는 동물세포의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면 사람 CMV 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다. 또한, 사람 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용하여도 좋다. 숙주로서는 나마루바 세포, HBT 5637 (일본 특개소 제 63-299 호), COS 세포, CHO 세포 등을 들 수 있다.

동물세포로의 DNA 도입법으로서는, 동물세포에 DNA 를 도입할 수가 있으면 어떤 방법도 사용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 [Miyaji 등, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 [특개평 제 2-227075 호], 리포펙션법 [Philip L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 등을 사용할 수가 있다. 형질전환 균주의 취득 및 배양은 특개평 제 2-227075 호 또는 특개평 제 2-257891 호에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다.

상기와 같이 수득된 형질전환체의 배양은 통상적인 배양 방법에 따라 실시된다.

대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지라면, 천연배지, 합성배지 어느 것이라도 좋다.

탄소원으로는 각각의 미생물이 자화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산등의 유기산, 에탄올, 프로판올등의 알코올류가 사용된다.

질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 함질소 화합물 및 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 콘스티프리퀴, 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효 균체 및 그의 소화물 등이 사용된다.

무기물로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼륨 등이 사용된다.

배양은 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15 - 40 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 16 - 96 시간이다. 배양중 pH 는 3.0 - 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.

L-프롤린을 5 - 1000, 바람직하게는 20 - 200 mM 의 농도가 되도록, 적시에 배지에 첨가함으로써 보다 효율적으로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 제조할 수 있다.

또한, 필요에 따라, 배양중에 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 좋다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라, 인듀서를 배지에 첨가하여도 좋다. 예를 들면,lac프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 등을,trp프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌 아크릴산 (IAA) 등을 배지에 첨가하여도 좋다.

동물세포를 숙주로 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지, 이글 (Eagle) 의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소태아 혈청 등을 첨가한 배지등이 사용된다.

배양은 5 % CO₂존재하 등의 조건에서 실시한다. 배양 온도는 35 - 37 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 3 - 7 일간이다.

L-프롤린을 5 - 1000, 바람직하게는 20 - 200 mM 의 농도가 되도록, 적시에 배지에 첨가함으로써 보다 효율적으로 L-프롤린 4 위치 수산화효소를 제조할 수가 있다.

또한, 배양중 필요에 따라, 배지에 카나마이신이나 페니실린 등의 항생물질을 첨가해도 좋다.

이와 같이 배양하여 수득한 형질전환체중에는 유전자 원으로서 사용한 미생물 균주, 예를 들어,닥틸로스포란기움종-RH1 등과 비교하여 L-프롤린 4위치 수산화 효소가 대량 생성되어 축적되고, 효소의 단리, 정제 또는 이 효소를 사용한 L-프롤린으로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 제조를 유전자 원으로 사용한 미생물 균주, 예를 들어,닥틸로스포란기움종-RH1 등을 사용한 경우와 비교하여, 훨씬 효율적으로 수행할 수 있다.

형질전환체중에 L-프롤린 4 위치 수산화효소가 생성되어 있는 것은 배양물, 균체, 또는 균체 처리물을 효소 반응에 적합한 수성 매질중에서 L-프롤린, 2 가 철이온, 2-케토글루타르산과 동시에 가하고, 또한 필요에 따라 계면활성제나 유기 용제를 첨가함으로써 생성되는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 검출함으로써 알 수 있다. 생성된 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 활성은 하기 측정조건하에서, 1분간 1nmol 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 활성을 1 단위 (U) 로 표시한다. 또한 여기서는 미생물 균체에 더하여 동물세포를 포함해서 균체라고 부른다.

L-프롤린 4 위치 수산화효소 활성의 측정 :

12 mM L-프롤린, 24 mM 2-케토글루타르산, 4 mM 황산제1철 및 8 mM L-아스코르브산을 함유하는 240 mM 의 MES [2-(N-몰포리노) 에탄술폰산] 완충액 (pH 6.5) 에 균체, 균체처리물 또는 효소 정제품 등을 첨가하여 합계 250 ㎕ 로 하고, 35 ℃ 에서, 10 분간 반응시킨다. 반응액을 100 ℃ 에서, 2 분간 가열하여 반응을 정지시킨 후에, 반응액중에 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 고속 액체 크로마토그래피 (이하, HPLC 라고 약기한다) 를 사용하여 정량한다.

정량에는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 정량할 수 있는 방법이면 어떤 방법을 사용하여도 좋으나, 예를 들면 반응액중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 배위자 교환 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면, (주) 주까분세끼 센터 제 SUMICHIRAL OA 5000 등을 사용하여 HLPC 로 분리 용출후, 7-클로로-4-니트로벤즈-2-옥사-1, 3-디아졸 (이하, NBD 라고 약기한다) 에 의해서 포스트 칼럼 유도체화하여 검출하는 방법 (포스트 칼럼 유도체화법), 혹은 반응액 중의 목적 화합물을 미리 NBD 유도체화 해놓고, 이것을 HLPC 를 사용한 역상 크로마토그래피에 걸어서 NBD 유도체화물을 분리한 후 검출하는 방법 [William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, Analytical Biochemistry, vol. 138, 390-395, 1984] (프리칼럼 유도체화 방법) 등을 들 수 있다. NBD 유도체화물의 검출은 어느 것이나 그의 형광 (여기 파장 503 ㎚, 형광 파장 541 ㎚) 측정에 의하여 실시된다.

상기와 같이 해서 배양 균체중에 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생성이 확인된 형질전환체의 배양물로부터 효소를 단리, 정제하는데는 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용하면 좋다. 예를 들면, 형질전환체의 배양액을 원심분리함으로써, 배양액중의 균체를 모아, 이 균체를 세척한 후에, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가우린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 균체를 파쇄하여, 무세포 추출액을 수득한다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 수득된 상층액을 황산암모늄 등에 의한 염석, 디에틸 아미노에틸 (DEAE)-세파로스 등의 음이온 교환 크로마토그래피, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 소수성 크로마토그래피, 분자체를 사용한 겔 여과법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 사용하여 효소 정제품을 수득할 수 있다.

배양 균체 중에 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생성이 확인된 형질전환체를 상기의 형질전환체의 배양조건과 동일한 조건으로 배양하고, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 채취함으로써, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조할 수 있다.

L-프롤린을 당원으로부터 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체를 사용함으로써, 배양중에 L-프롤린을 첨가하지 않더라도 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조할 수 있으나, L-프롤린을 5 - 1000, 바람직하기는 20 - 200 mM 의 농도가 되도록, 적시에 배지에 첨가함으로써, 보다 효율적으로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 제조할 수 있다.

2-케토글루타르산을 당원으로부터 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체를 사용함으로써, 배양중에 2-케토글루타르산을 첨가하지 않더라도 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조할 수가 있다. 이 형질전환체를 사용하는 경우에는 글루코오스 등의 당원을 적시에 배지에 첨가하여, 2-케토글루타르산을 배양액 중에 생성, 축적시킴으로서, 보다 효율적으로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 제조할 수 있다. 2-케토글루타르산을 당원으로부터 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 없는 형질전환체를 사용하는 경우에는 필요에 따라 2-케토글루타르산을 배양시에 첨가한다.

또한, 필요에 따라 2-케토글루타르산 및 2 가 철이온을 배양시에 첨가하여도 좋다.

트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생성이 확인된 형질전환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체 또는 균체 처리물을 효소원으로 사용하여 하기의 방법에 의해 실시할 수도 있다.

즉, 이 형질전환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체 또는 균체 처리물을 효소반응에 적합한 수성 매질 중에, L-프롤린, 2 가 철이온, 2-케토글루타르산과 함께 가하고, 또 필요에 따라 계면활성제나 유기용제를 첨가함으로써, L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시키고, 이어서 반응액으로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 채취함으로써, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 제조할 수 있다.

균체 처리물로서는 균체의 건조물, 균체의 동결 건조물, 균체의 계면활성제 처리물, 균체의 효소 처리물, 균체의 초음파 처리물, 균체의 기계적 파쇄 처리물, 균체의 용매 처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물 등을 들 수 있다. 또한 이 균체로부터 추출하여 수득되는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 효소, 이 효소의 정제품, 고정화물 등도 사용된다.

수성매질로서는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산 에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수있다.

계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌·스테아릴아민 (예를 들면, 나이민-S- 215, 닛뽕 유우지사 제 등), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 양이온 FB, 양이온 F2-40E 등의 양이온성 계면활성제, 나트륨 올레일아미드 황산, 뉴렉스 TAB, 라비졸 80 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 소르비탄·모노 스테아레이트 (예를 들면 비이온 ST221) 등의 양성 계면활성제, 기타 3 급 아민 PB, 헥사데실디메틸아민 등을 들 수 있고, 반응을 촉진시키는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 이들은 통상 0.1 - 50 ㎎/l, 바람직하기는 1 - 20 ㎎/l 의 농도로 사용된다.

유기용제로서는 톨루엔, 크실렌, 지방족 알콜, 벤젠, 아세트산에틸 등이 사용된다. 통상 0.1 - 50 ㎕/ml, 바람직하기는 1 - 20 ㎕/ml 의 농도로 사용된다.

반응은 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 형질전환체를 배양후, 이 형질전환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체, 균체 처리물을 효소원으로 사용하여 수성매질 중에서 실시한다.

이들 효소원의 반응액 중에 있어서의 효소 활성은 사용하는 기질량 등에 의해 결정되나, 통상 1,000 - 10,000,000 U/l, 바람직하기는 10,000 - 3,000,000 U/l 이다. 미생물의 균체 및 균체 처리물을 사용하는 경우, 그 농도는 통상 습균체로 1 - 300 g/l 이다.

반응은 통상 온도 15 - 50 ℃, pH 6.0 - 9.0 으로 1 - 96 시간 실시한다. 반응에 사용되는 L-프롤린의 농도는 1 mM - 2 M 이다. L-프롤린은 단품을 반응액에 직접 첨가하여 사용하여도 좋고, L-프롤린을 당원으로부터 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 미생물의 배양액 등을 사용하여 공급하여도 좋다. 더 나아가서는 L-프롤린을 당원으로부터 생성하는 능력이 있는 미생물을 형질전환체의 숙주 미생물로서 사용함으로써, 이 숙주 미생물이 생성하는 L-프롤린을 반응에 이용할 수도 있다.

반응에는 2 가 철이온이 필요하게 되어, 통상 1 - 100 mM 의 농도로 사용된다. 2 가 철이온으로서는, 2 가 철을 함유하고, 반응을 저해하지 않는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 황산 제1철 등의 황화물, 염화 제1철 등의 염화물, 탄산 제1철 등 이외에, 시트르산염, 유산염, 푸마르산염 등과 같은 유기산염을 들 수 있다. 사용하는 형질전환체의 배양물, 그 배양물에서 분리한 균체, 균체처리물 혹은 반응액 성분 중에 2 가 철이온이 함유되어 있으면 특별히 2 가 철이온을 첨가하지 않아도 좋다.

2-케토글루타르산은 반응액에 단품을 첨가하여도 좋고, 사용하는 균체 및 균체 처리물이 갖는 대사 활성에 의해서, 2-케토글루타르산으로 전환시킬 수 있는 화합물을 사용하여도 좋다. 이와 같은 화합물로서는 글루코오스와 같은 당원, 글루타민산 등의 아미노산, 숙신산 등의 유기산 등을 들 수 있다. 이들의 화합물은 단독으로 사용하여도 좋고, 복수를 병용하여도 좋다.

배양물 또는 수성 매질로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 회수하는방법으로서는 이온 교환 수지 등을 사용하는 칼럼 크로마토그래피, 혹은 정출법 등 통상의 분리방법이 사용된다. 회수된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은¹³C-NMR 스펙트럼,¹H-NMR 스펙트럼, 질량 스펙트럼, 비선광도 등의 통상의 분석 수단에 의하여, 그 구조를 확인할 수 있다.

본 발명에 의해 제조된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은 상술한 포스트칼럼 유도체화법이나 프리칼럼 유도체화법에 의해서 정량분석할 수 있다.

실시예 1

닥틸로스포란기움 종 - RH1 의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 단백질을 코딩하는 유전자의 부분 DNA 의 제조

(1)닥틸로스포란기움종 - RH1 염색체 DNA 의 단리

닥틸로스포란기움종 - RH1 의 염색체 DNA 는 통상적인 방법에 따라 하기와 같이 단리한다. 마니톨 5 %, 글리신 0.05 % 를 첨가한 SK #2 배지 (글루코스 0.25 %, 가용성 전분 1.0 %, 효모 추출물 0.25 %, 펩톤 0.25 %, 고기 추출물 0.15 %, 인산제일칼륨 0.01 %, 황산마그네슘 0.03 % 를 함유하며, 6 N NaOH 로 pH 7.6 으로 조정한 배지) 를 시험관에 10 ml 분주하여, 120 ℃ 로 20 분간 살균하였다. 이것에 HT 한천 평판 배지 (가용성 전분 1 %, NZ 아민 0.2 %, 효모 추출물 0.1 %, 고기 추출물 0.1 %, 한천 1.5 % 를 함유하며, 6 N NaOH 로 pH 7.2 로 조정 후, 120 ℃ 에서 20 분간 살균한 배지) 에 생육한닥틸로스포란기움종 - RH1 을 백금이로 식균하여 28 ℃ 로 3일간 진탕 배양하였다.

그 배양액을 원심 분리하여 얻어진 균체를 10 ml 의 10.3 % 수크로스 용액으로 세척한 후, 6 ml 의 TS [10.3 % 수크로스, 50 mM 트리스 HCl (pH8.0), 25 mM EDTA] 에 현탁하여, 리소자임 용액 (50 mg/ml TS) 1 ml 을 가하여 37 ℃ 에서 60 분간 반응한다. 이어서, 이 리소자임 처리액에 프로테나제 K (시그마사 제) 용액 (2 mg/ml TS) 0.6 ml 을 가하여 평온하게 혼합하고, 또한 3.6 ml 의 3.3 % (w/v) SDS 용액을 평온하게 혼합하면서 첨가하여, 37 ℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 이 혼합액을 50 ℃ 에서, 30 분간 가열 후, 물로 냉각하고, TE [10 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] 포화 페놀/클로로포름 (1/1, v/v) 를 등량 첨가하여 30 분간 평온하게 진탕하였다. 원심 분리 후, 상층을 취하여, 다시 TE 포화 페놀/클로로포름에 의한 추출 조작을 수행하고, 원심 분리 후 얻어진 상층에 등량의 클로로포름을 첨가하여 혼합 후 다시 원심 분리한다. 상층을 취하여, 이 상층을 100 ℃ 로 10 분간 가열 처리한 RNase A 수용액 (10 mg/ml) 을 20 ㎕ 가하여, 37 ℃ 로 45 분간 반응한다. 그 RNase A 처리액에 1/10 용량의 5 M 식염수 및 1/4 용량의 50 % PEG 6000 을 가하여 평온하게 혼합 후, 빙냉하에 밤새 방치한다. 이 혼합액을 12,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리한 후 상층을 완전히 버리고, 남은 침전물을 5 ml 의 TE 에 용해한다. 1/10 용량의 3 M 아세트산나트륨 용액 및 1/30 용량의 66 mM 염화마그네슘 용액을 가하여 혼합한 후, 2.2 배 용량의 에탄올을 첨가하여 평온하게 혼합한다. 이 혼합액을 10,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리한 후 상층액을 버리고, 얻어진 침전물을 70 % 빙냉의 에탄올로 2 회 세척한다. 이 침전물 (250 ㎍ 의 염색체 DNA 를 함유) 을 TE 에 용해하여, 염색체 DNA 로서 이후의 실험에 사용하였다.

(2)닥틸로스포란기움종 - RH1 유래의 L-프롤린 4 위치에 수산화 효소 단백질의 부분 아미노산 서열의 결정

닥틸로스포란기움종 - RH1 이 생산하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 참조예 1 의 방법에 따라 단리 정제하고, 이 정제 효소 단백질의 N 말단 아미노산 서열을 시마즈 세이사쿠쇼 사 제의 단백질 서열분석기 모델 PPSQ-10 을 사용하여 분석하여 서열 번호 1 에 나타낸 서열의 N 말단 24 아미노산 잔기의 서열을 결정하였다.

(3) L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자의 부분 DNA 의 제조

서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 번호 1 내지 6 에 대응하는 서열 번호 3 기재의 센스사슬 믹스 DNA 프라이머와, 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열의 아미노산 번호 19 내지 24 에 대응하는 서열 번호 4 기재의 안티센스 사슬 믹스 DNA 프라이머를 어플라이드 바이오시스템 사제의 380A DNA 합성기를 사용하여 합성한다.

이 합성 DNA 를 프라이머로 하여,닥틸로스포란기움종 - RH1 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 수행하였다. PCR 은 가부시끼 가이샤 아스텍 사 프로그램, 주형, 콘트롤, 시스템 PC-700 을 사용하여 실시하였다. 반응은 하기 조성의 반응액 20 ㎕ 를 사용하여 행하였다.

반응액 조성 :닥틸로스포란기움종 - RH1 염색체 DNA 22 ng/㎕, 센스 사슬 믹스 DNA 프라이머 및 안티센스 사슬 믹스 DNA 프라이머 각 10 μM,PfuDNA 폴리머라제 (스트라타겐사 제), 0.125 U/㎕, DMSO 10 %, 트리스 HCl (pH 8.2) 20 mM, KCl 10 mM, 황산암모늄 6 mM, 염화마그네슘 2 mM, 트리톤-X 100 0.1 %, 소태아 혈청 알부민 10 ng/㎕.

반응은 96 ℃ 에서 5 분간의 반응 후, 96 ℃ 에서 2 분간, 37 ℃ 에서 1 분간, 72 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 5 회 반복하고, 또한 96 ℃ 에서 2 분간, 50 ℃ 에서 1 분간, 72 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 35 회 반복한다. 반응액을 15 % 폴리아크릴아미드 (아토 가부시끼가이샤 제, 파젤 NPU-15L) 전기영동을 수행한 후, 71 bp 의 밴드를 닛뽄 에이드 가부시끼가이샤 제, 다빈치군 (펜터치 회수 - NB-7000 형)을 사용하여 회수한다. 회수한 71 bp 의 DNA 단편을 파마시아 사제의 슈어 클론 리게이션 키트를 사용하여 pUC 18 의SmaI 부위에 삽입하여, 어플라이드 바이오시스템사 제의 염기 서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxy^TM터미네이터 사이클 서열분석기 키트) 를 사용하여 그 염기 서열을 결정하였다. 결정한 71 bp 의 DNA 단편의 염기서열을 서열 번호 5 에 나타낸다. 이 71 bp 의 DNA 단편의 염기 서열에서 추정되는 아미노산 서열은 서열 번호 1 기재의 정제 효소의 N 말단 아미노산 서열가 완전하게 일치한다.

실시예 2

L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편의 취득

(1) DIG 화 프로브의 제작

71 bp 의 DNA 단편의 디그옥시게닌 (Digoxigenin, DIG) 화는 베링거 맨하임사 제 PCR DIG Labelling 키트를 사용하여 실시한다.

PfuDNA 폴리머라제 (스트라타겐사 제) 2.5 U,PfuDNA 폴리머라제 용 ×10 완충액 (스트라타겐사 제) 5 ㎕, DMSO 5 ㎕, ×10 PCR DIG 믹스 (베링거 멘하임사 제) 5 ㎕, 실시예 1 (3) 에서 PCR 에 의하여 제작된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 회수한 71 bP 의 단편을 포함하는 DNA 용액을 10 배 희석하여 얻어진 희석액 1 ㎕, 서열 번호 3 기재의 센스 사슬 합성 DNA 와 서열 번호 4 기재의 안티센스 사슬 합성 DNA 를 각각 10 μM 을 포함하는 반응액 50 ㎕ 를 사용하여 PCR 을 행하였다. 반응은 96 ℃ 에서 5 분간의 반응 후, 96 ℃ 에서 2 분간, 50 ℃ 에서 1 분간, 72 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 35 회 반복하였다. 이 반응액을 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 걸어, 71 bp 의 증폭 단편의 생성을 확인하고, 겔로 부터 실시예 1 (3) 과 동일한 조작에 의하여 이 단편을 회수하여 이것을 프로브로 사용하였다.

(2) 서던 하이브리다이제이션

닥틸로스포란기움종 - RH1 의 염색체 DNA 10 ㎍ 에 제한효소XhoI (다까라 슈조오사 제) 36 U 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 2 시간 반응시켜 DNA 를 절단한 후, 이 DNA 로 아가로스 겔 전기 영동을 수행하였다. 실시예 2 (1) 에서 얻은 프로브를 사용하고, 베링거 멘하임사 제의 DIG Luminescent 탐지 키트를 사용하여 첨부 설명서에 기재된 방법에 따라 서던 하이브리다이제이션을 실시하였다.

즉, 아가로스 겔 전기영동 후, 아가로스 겔을 0.25 N 염산중에서 20 분간 완만하게 진탕하고, 이어서 0.5 M 수산화나트륨, 1.5 M 염화나트륨 중에 50 분간 침지하였다. 또한, 2 M 염화나트륨 - 1 M 트리스 HCl (pH 5.0) 에서 25 분간 침지하였다. 아토사 제의 제노피레이터 펌프 AE-6680P 및 아토사제 제노피레이터 AE-6680C 를 사용하여 7.5 mmHg 로 흡입하면서 하이본드-N+ 막 (아머샴사 제) 에, 20 배 농도의 SSC (1 배 농도의 SSC 의 조성은 150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨이다) 중에서, 블러팅 하였다. 블러팅 후, 80 ℃ 에서 10 분간 건조하고, 더욱이 FUNA-UV-LINKER FS-800 (후나코시사 제) 를 사용하여 크로스링크를 실시하였다. 이와 같이 하여 얻은 막을 DIG Luminescent 탐지 키트의 하이브리다이제이션 완충액 (포름아미드 50 % v/v, 블록킹 시약 2 %, N-라우릴사르코신 0.1 % w/v, SDS 0.02 % w/v 를 5 배 농도의 SSC 중에 함유시킨 용액) 10 ml 중에서 42 ℃에서 1 시간동안 침지한 후, 프로브 용액 [실시예 2 (1)에서 얻은 프로브 3 ㎕ 를 200 ㎕ 의 하이브리다이제이션 완충액에 첨가하여 95 ℃에서 2 분간 처리한 후 하이브리다이제이션 완충액을 첨가하여, 1.5 ml 로 제조한 용액] 중에 42 ℃ 로 밤새 침지하였다. 또한 이 막을 0.1 % SDS 를 포함하는 2 배 농도의 25 ml SSC 를 사용하여 실온에서 5 분씩 2 회 세정한 후, 0.1 % SDS 를 함유하는 0.1 배 농도의 25 ml SSC 를 사용하여 68 ℃ 로 15 분간 씩 2 회 세정하였다.

그 세정막을 세정 완충액 [0.3 % w/v 트윈-20 을 함유하는 완충액-1(0.1 M 말레인산, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.5)] 를 사용하여 실온에서 1 내지 5 분, 50 ml 의 완충액-2 (1 % 블록킹 시약을 포함하는 완충액-1) 를 사용하여 실온에서 30 분간, 1 ㎕ 의 항-디그옥시게닌-AP Fab 를 포함하는 10 ml 의 완충액-2 를 사용하여 실온에서 30 분간, 50 ml 의 완충액-2 를 사용하여 실온에서 30 분간씩 2 회, 10 ml 의 완충액-3 (0.1 M 트리스 HCl, 0.1 M 염화나트륨, 50 mM 염화 마그네슘, pH 9.5) 를 사용하여 실온에서 2 내지 5 분, Lumigen PPD 50 ㎕를 포함하는 5 ml의 완충액-3 을 사용하여 실온에서 5 분간 순차적으로 처리한 후, 필터상에서 빨리 수분을 제거하고, 서란랩에 싼 후 37 ℃ 에서 15 분간 방치한다. 이것을 Hyperfilm-ECL (아머샴 사제) 를 사용하여 실온에서 30 분간 노광하였다.

약 5.5 kb 의 위치에 프로브와 강하게 하이브리다이제이션하는 DNA 단편이 존재하는 것이 확인되었다.

(3) 염색체 DNA 의 분획

닥틸로스포란기움종 - RH1 의 염색체 DNA 100 ㎍ 에 제한 효소XhoI (다까라 쥬조오사 제) 360 U 를 처리하여 37 ℃ 에서 2 시간 반응시켜, 그 DNA 를 절단한 후, 등량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 가하여 혼합한다. 원심 분리 후, 상층을 취하여 2.2 배 용량의 냉에탄올을 가하여 평온하게 혼합하였다. 10,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상층을 버린 후, 침전을 70 % 냉에탄올로 2 회 세정하여 에탄올 침전물을 얻었다. 이후, TE 포화페놀/클로로포름, 냉에탄올을 사용하여 에탄올 침전을 얻는 조작을 에탄올침전법이라 부른다. 그 침전을 120 ㎕ TE 에 용해하여, 아가로스 겔 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동 후, 5.5 kb 부근의 DNA 분획을 Prep-A gene (바이오 래드사 제조) 를 사용하여 아가로스 겔로 부터 추출 정제하여 약 7 ㎍ 의XhoI 절단 염색체 DNA 분획을 얻었다.

(4) 파지 라이브러리의 제작

스트라타겐사 제조의 미절단 λZAPII 클로닝 키트를 사용하여 하기와 같이 파지 라이브러리를 제작한다. λZAPII DNA 5 ㎍ 에 제한 효소XhoI (다까라 슈조오사 제) 36 U 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 반응시켜, 그 DNA 를 절단한 후, 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻는다. 이 에탄올 침전을 35 ㎕ 의 TE 에 용해후 다까라 슈조오사 제조의 알칼리 포스파타제 [Alkaline phosphatase (Calf Intestine)] 을 사용하여 첨부된 설명서의 기재 방법에 따라 탈인산화 반응을 수행한다. 반응 후, 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻는다. 이 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해한다. 이와 같이 하여 얻은XhoI 절단 λZAPII DNA 0.36 ㎍과 실시예 2 (3) 에서 얻은XhoI 절단 염색체 DNA 0.35 ㎍ 을 리게이션 키트 (다까라 리게이션 키트, 다까라 슈조오 사 제) 를 사용하여 26 ℃ 에서 2.5 시간 반응시켜 연결한다. 그 반응액에 에탄올을 첨가하여 생긴 DNA 침전을 4 ㎕ 의 TE 에 용해하였다. 이 DNA 를 기가팩 II 골드 패키징 익스트랙트 (스트라타겐 사제) 를 사용하여 λ 파지 입자 중에 패키징 하였다.

한편,이. 콜리XL1-Blue MRF' 균주 (스트라타겐사 제) 를 0.2 % (w/v) 말토스 및 10 mM 황산마그네슘을 함유한 LB 배지 (박토트립톤 10 g, 박토이스트 추출물 5 g, 식염 5 g 을 증류수 1 리터에 포함시켜, 120 ℃ 에서 20 분간 멸균) 3 ml 에 식균하여 30 ℃ 에서 16 시간 동안 배양한다. 배양 후, 원심분리로 집균하여 얻은 균체를, 600 nm 에서의 흡광도가 약 0.5 가 되도록 10 mM 멸균 황산마그네슘 용액에 현탁한다.

상기의 균액 200 ㎕ 와 패키징 액 10 ㎕를 혼합한 후, 37 ℃ 에서 15 분간 반응시킨다. 이 혼합액에 LB 연한천 배지 (LB 배지에 한천을 0.6 % 되도록 가한 것) 3 ml, 0.5 M IPTG 수용액 15 ㎕, X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드) 용액 (250 mg X-Gal/ml 디메틸포름아미드) 50 ㎕ 를 첨가 혼합하여 LB 한천 배지 (LB 배지에 한천을 1.8 % 가 되도록 가한 것) 상에 중층 후 37 ℃ 로 밤새 배양한다.

약 5000 개의 무색의 플라크를 얻어 이를 파지 라이브러리로 사용한다.

(5) 목적 클론의 선별

상기 파지 라이브러리 중에서 목적으로 하는 클론을 가지는 플라크를 하기의 방법으로 선별한다.

LB 한천 배지상에 출현한 플라크를 5 배 농도의 SSC 로 세정한 나일론 막 (슈라이허 앤 슈엘 사제, Nytran) 에 옮긴 후, 이 막을 0.5 M 수산화나트륨 - 1.5 M 염화나트륨을 넣은 여과지 상에 5 분간 정치하였다. 더욱이 이막을 1.5 M 염화나트륨 - 0.5 M 트리스 HCl (pH 8.0) 의 여과지 상에 2 분간씩 2 회, 2 배 농도의 SSC 의 여과지 상에 2 분간씩 2 회 방치한 후 80 ℃ 에서 30 분간 건조시킨다. 건조시킨 막을 0.1 % SDS 를 함유하는 2 배 농도의 SSC 로 세척한 후, 2 배 농도의 SSC 로 세척하고 공기 건조하였다.

실시예 2 (1) 에서 얻은 DIG 화 프로브 및 베링거 맨하임 사제의 DIG Luminescent 감지 키트를 사용하여, 실시예 2 (2) 기재의 방법에 따라 검출을 행한 결과, 목적으로 하는 클론을 갖는 포지티브 플라크를 하나 검출하였다.

(6) 클론의 확인

그 포지티브 클론의 주변 약 1 cm²를 잘라내어, 1 ml 의 SM (5.8 g/l 의 염화나트륨, 2 g/l 의 염화마그네슘, 0.01 % 겔라틴, 50 mM 트리스 HCl, pH 7.5) 및 20 ㎕ 의 클로로포름을 첨가하여 충분히 교반한 후 원심 분리하여 얻어진 상층액을 파지 추출액으로 한다.

서열 번호 5 에 기재된 염기 서열의 13 내지 32 에 대응하는 서열 번호 6 기재의 센스 사슬 DNA 프라이머와, 서열 번호 5 에 기재된 염기 서열의 53 내지 71 에 대응하는 서열번호 7 기재의 안티센스 사슬 DNA 프라이머 (단, 서열 번호 5 기재의 66 번째 염기에 대응하는 염기를 G 로 한) 를 어플라이드 바이오시스템사 제 380A DNA 합성기를 사용하여 합성한다.

상기의 파지 추출액 5 ㎕ 및 서열 번호 6 기재의 센스 사슬 DNA 프라이머 및 서열 번호 7 기재의 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 사용하여, 실시예 1 (3) 기재의 방법에 준하여 PCR 을 실시하여, 59 bp DNA 단편을 얻었다.이 DNA 단편을 12.5 % 폴리아크릴아미드 전기 영동으로 해석하여 목적으로 하는 클론인 것을 확인 하였다.

실시예 2 (4) 에 표시한 팩키징 액 대신에 상기 파지 추출액을 사용하여 재차 실시예 2 (4) - (6) 을 반복하여 목적으로 하는 클론을 순화하였다.

(7) 파지 DNA 의in vivo절단 (excision) 에 의한 플라스미드화

실시예 2 (6) 에서 얻어진 추출액중의 파지 DNA 의in vivo절제에 의한 플라스미드화를 스트라타겐사제의 미절단 λZAPII 클로닝 키트를 사용하여 첨부된 설명서에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실시하였다.

실시예 2 (4) 의 방법에 따라,이. 콜리XL1-Blue MRF' 균주를 0.2 % (w/v) 말토스 및 10 mM 황산마그네슘을 함유하는 LB 배지 3 ml 에 식균하여, 30 ℃ 에서 16 시간 배양한다. 배양 후, 원심 분리하여 얻어진 균체를 600 nm 의 흡광도가 약 1.0 이 되도록 10 mM 황산마그네슘 용액에 현탁하였다. 이 균액 200 ㎕ 에 실시예 2 (6) 에서 얻은 파지 추출액 100 ㎕ 및 Ex Assist 헬퍼 파지 (스트라타겐사 제) 1 ㎕ 를 가하여 37 ℃ 에서 15 분간 반응한다. 이것에 3 ml 의 2 ×YT (10 g 염화나트륨, 10 g 효모 추출물, 16 g 박토트립톤을 1 리터의 증류슈에 용해하여 120 ℃ 에서 20 분간 멸균한다) 를 가하여 37 ℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 이를 70 ℃ 에서 20 분간 가열 후, 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액 1 ㎕ 를이. 콜리XLI-Blue MRF' 균주와 동일한 방법으로 배양하여 얻은이. 콜리SOLR 균주의 현탁액 200 ㎕ 에 가하여, 37 ℃ 에서 15 분간 반응시킨 후, 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 밤새 배양시켰다. 한천 배지상에 생육한 콜로니를 사용한 것 이외는 실시예 2 (6) 기재의 방법에 준하여 포지티브 콜로니를 선별하였다.

이와 같이 하여 얻은 포지티브 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 그의 구조를 제한 효소를 사용하여 확인 하였다. 얻어진 플라스미드 pRH71 은 PBluescript SK (-) 의XhoI 부위에 약 5.5 kb 의XhoI 절단 DNA 단편이 삽입된 구조를 가지고 있었다 (도 1).

(8) 염기 서열의 결정

상기에서 얻어진 pRH71 에 삽입되어 있는 약 5.5 kb 의XhoI 단편으로 부터 약 2.4 kb 의SacI-XhoI 단편 (도 1 중,XhoI-1 및SacI-1 에서 절단되는 단편) 과, 약 2 kb 의SalI 단편 (도 1 중SalI-1 및SalI-2 로 절단되는 단편) 을 각각 제한 효소로 절단 후 취득하고, pBIuescript II KS (+) 의SacI-XhoI 절단 부위 및SalI 절단부위에 각각 서브클론하여, 플라스미드 pYan 10 및 pYan 13 을 얻었다 (도 1).

다까라 슈조오사 제 킬로시퀀스용 결실 키트를 사용하여 pYan 10 으로 부터 결실 변이 플라스미드를 제작 하였다. 구체적인 시약 및 방법은 키트에 첨부된 설명서에 따랐다.

다음에, 어플라이드 바이오시스템사 제의 염기 서열 결정키트 (Taq Dye Deoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 이 결실 플라스미드 중약 2.4 kb 의SacI-Xho-I 단편의 염기 서열을 결정하였다.

pYan 13 에 대하여서도 동일하게 결실 변이 플라스미드를 제작한 후 염기 서열의 분석을 행하여, 약 2 kb 의SalI 단편중의SalI-SacI 단편 (도 1 에서SalI-1 및SacI-2 로 절단되는 단편) 의 염기서열을 결정하였다.

SacI-XhoI 단편 ( 도 1 중,XhoI-1 및SacI-2 로 절단되는 단편) 2707 bp 의 염기 서열을 서열 번호 8 에 나타내었다.

이와 같이하여 결정된 염기 서열에는 서열번호 1 에 표시된 272 아미노산으로 구성되는 단백질을 코딩하는 서열 번호 2 에 표시한 염기 서열 (서열 번호 8 이 염기 서열 264 에서 1079 에 대응) 이 존재하고 있었다. 이 아미노산 서열중에는 정제 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 사용하여 결정된 서열 번호 1 에 나타내는 N 말단 아미노산 서열이 포함되어 있으며, 취득한 약 5.5 kb 의XhoI 단편중에 목적으로 하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 유전자가 존재하는 것이 확인되었다.

실시예 3

L-프롤린 4 위치 수산화 효소 발현 플라스미드의 구축

(1)trp플라스미드 (Ptrp) 를 사용한 발현 플라스미드의 구축

서열 번호 9 기재의 센스 사슬 DNA 프라이머와, 서열번호 10 에 기재된 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 어플라이드 바이오시스템사 제조의 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 이 합성 DNA 를 프라이머로, pRH71 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하였다. 반응은 pRH71 을 0.1 ㎍, 센스 사슬 및 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 각 2 ㎕ 함유하는 반응액 20 ㎕ 를 사용하여 실시예 1 과 동일하게 수행하였다. 반응은 96 ℃ 에서 5 분간의 반응 후, 96 ℃ 에서 2 분간, 58 ℃ 에서 1 분간, 75 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 30 회 반복하였다. 반응액으로 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 L-프롤린 4 위치 수산화효소의 구조 유전자를 코딩하는 844 bp 의 증폭 단편이 생성된 것을 확인하고, 아가로스 겔로 부터 이 증폭 단편을 통상적인 방법으로 추출하여 바이오래드사 제의 Prep-A-gene 을 사용하여 단편을 회수하였다. 회수한 844 bp 의 DNA 단편의 양 말단을HindIII 및BamHI 로 절단하고, 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻었다. 이 에탄올 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해하였다.

Ptrp를 포함하는 플라스미드 pTrS30 DNA 를HindIII 및BamHI 으로 절단하였다. 그 절단 부위에HindIII 및BamHI 을 처리한 상기의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 구조 유전자 단편을 다까라 슈조오사 제조의 리게이션 키트를 사용하여 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 사용하여이. 콜리XLI-Blue MRF' 균주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 포함하는 LB 한천 배지에 도포 후, 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 생육한 형질전환체의 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한 효소 절단에 의해 확인하였다.

상기의 결과, Ptrp의 전사 방향과 동방향으로 L-프롤린 4 위치의 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTr 14 (도 2) 를 얻었다.

(2)tac프로모터 (Ptac) 를 사용한 발현 플라스미드의 구축

실시예 3 (1) 과 동일한 방법으로 Ptac를 사용한 발현 플라스미드를 구축하였다. 서열 번호 11 기재의 센스 사슬 DNA 프라이머와, 서열 번호 12 에 기재된 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 합성하고, 그 합성 DNA 를 프라이머로, pRH71을 주형으로 하여 PCR 을 수행하여, L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 846 bp 의 증폭 단편을 얻었다. 이 단편을EcoR1 및HindIII 절단 후 Ptac를 포함하는 플라스미드Ptac(베링거 멘하임 사제) 의EcoRI-HindIII 절단 부위에 삽입하여이. 콜리XL1-Blue MRF' 균주를 형질전환하였다.

얻어진 형질전환체에서 Ptac의 전사 방향과 동방향으로 L-프롤린 4 위치 수산화효소의 구조 유전자를 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTc 4OH 를 얻었다 (도 3).

(3) Ptrp×2 를 사용한 발현 플라스미드의 구축

실시예 3 (1) 과 동일한 방법에 의해 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 증폭 단편을 회수하여 제한 효소 처리 후, 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻었다. 이 에탄올 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해하였다.

pBR322 를 기본으로 하여, Ptrp를 2 개 직렬시킨 프로모터 Ptrp×2 를 갖는 플라스미드 pKYP 200 과 합성 링커를 조합하여 제작된 ATG 벡터PTrS DNA 를HindIII 및BamHI 으로 절단하였다. 이 절단 부위에HindIII 및BamHI 으로 절단처리한 상기의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 구조 유전자 단편을 다까라 슈조오사 제조의 리게이션 키트를 사용하여 삽입하였다.

얻어진 플라스미드를 사용하여이. 콜리XL1-Blue MRF' 균주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도포 후, 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 생육한 형질전환체의 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 그의 구조를 제한 효소로 확인하였다. 구조 유전자 부분에 대하여는 어플라이드 바이오시스템사 제조의 염기 서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 염기 서열을 결정하고, 서열 번호 2 로 표시한 염기 서열인 것을 확인하였다.

이 방법에 의해 Ptrp×2 의 전사 방향과 같은 방향으로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTr2-4OH (도 4) 를 얻었다.

서열 번호 13 에 기재된 DNA 와, 서열 번호 14 에 기재된 DNA 를 어플라이드 바이오시스템사 제 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 이 합성 DNA 의 3' 말단 25 bp 는 서로 상보적인 서열이 되도록 설계되어 있다. 더욱이, 이 합성 DNA 는닥틸로스포란기움종 RH1 유래의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 단백질의 N 말단 부분을 코딩하는 염기 서열이 함유되어 있으나, 이 염기 서열에는닥틸로스포란기움종 RH1 유래의 염기 서열을 대장균에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 부위 특이적인 염기 치환이 시행되어 있다.

이 합성 DNA 를 프라이머로, 또한 주형으로 하여 PCR 을 수행하였다. 반응은PfuDNA 폴리머라제 (스트라타겐사제) 0.5 U,PfuDNA 폴리머라제용 ×10 완충액 (스트라타겐사제) 2 ㎕, DMSO 2 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 액 1 ㎕, 서열 번호 13 기재의 합성 DNA 와 서열 번호 14 기재의 합성 DNA 각 2 μM 을 함유하는 반응액 20 ㎕ 를 사용하여 수행하였다. 반응은 96 ℃ 에서 5 분간의 반응 후, 96 ℃ 에서 2 분간, 50 ℃ 에서 1 분간, 75 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 35 회 반복하였다. 이 반응액으로 15 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 107 bp 의 증폭 단편의 생성을 확인하고, 겔로 부터 실시예 1 (3) 과 동일한 조작으로 이 단편을 회수하였다. 회수한 107 bp 의 DNA 단편의 양말단을HindIII 및SalI 으로 절단 후 바이오 래드 사 제 MERmaid 키트를 사용하여 회수하였다. 회수 액량은 16 ㎕ 였다.

플라스미드 pTr 2-4OH DNA 를BamHI 및PvuII 로 절단하였다. 반응 용액을 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 2 개의 단편이 생성되어 있는 것을 확인하였다. 그리고, L-프롤린 수산화 효소의 구조 유전자를 함유한 긴 단편의 쪽을 바이오래드사 제의 Prep-A-gene 을 사용하여 회수하고, 다까라 슈조오 사제의 블런팅 키트를 사용하여 말단을 평활화한 뒤, 다까라 슈조오사제의 리게이션 키트를 사용하여 리게이션하였다. 얻어진 플라스미드를사용하여이. 콜리JM 109 균주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하여 그 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도포한 후, 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 생육된 형질전환체의 콜로니로 부터, 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 그 구조를 제한 효소 절단에 의하여 확인하였다. 이상의 결과, pTr2-4OH 의 일부의 서열을 삭제한 플라스미드 pTr2-4OH△ (도 5) 를 얻었다.

플라스미드 pTr2-4OH DNA 를HindIII 및SalI 으로 절단하였다. 이 절단 부위에HindIII 및SalI 처리한 상기 PCR 증폭 단편을 다까라 슈조오사 제조의 리게이션 키트를 사용하여 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 사용하여이. 콜리XL1-Blue MRF' 균주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도포 후, 37 ℃ 로 밤새 배양하였다. 생육된 형질전환체의 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 그 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다. PCR 증폭 단편 삽입 부분에 대하여는 어플라이드 바이오시스템사 제의 염기 서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 번호 15 로 표시한 염기 서열이 확인되었다.

상기의 결과, Ptrp×2 의 전사 방향과 같은 방향으로 구조 유전자의 N 말단의SalI 부위 까지가닥틸로스포란기움종 RH1 유래의 염기 서열과는일부 다르나,닥틸로스포란기움종 RH1 유래의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소와는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 구조 유전자 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pWFH1 (도 6) 을 얻었다.

실시예 4

형질전환체에 의한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생산

실시예 3 에서 얻은 플라스미드 pTr14, pTc4OH 및 및 pWFH1 을 사용하여이. 콜리ATCC 12435 를 형질전환하여 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pTr14,이. 콜리ATCC 12435/pTc4OH,이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 를 취득하였다.이. 콜리ATCC 12435/pTr14 및이. 콜리ATCC 12435/pTc4OH 균주를 각각 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 3 ml 의 LB 배지에 식균하여 30 ℃ 에서 밤새 진탕 배양하였다.

형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pWFHI 은 암피실린 100 ㎍/ml 을 함유하는 50 ml Med 4 배지 [폴리펩톤 (닛뽄 세이야꾸) 1 %, 효모 추출물 (딥코) 0.5 %, NaCl 1 %] 에 식균하여 30 ℃ 에서 16 시간 진탕 배양하고, 또한 그 배양액을 종 배양액으로 하여 2 리터의 MED 6 배지 (글루코스 2 %, 황산암모늄 1 %, K₂HPO₄0.1 %, NaCl 0.2 %, MgSO₄0.05 %, FeSO₄0.0278 %, CaCl₂0.0015 %, 폴리펩톤 0.4 %) 를 넣은 5 리터의 단지 발효기에 식균한 후 L-Pro 를 200 mM 첨가하고, 배양 온도 30 ℃, 교반 속도 400 회전수/분, 통기량 1 리터/배양액 1 리터/분 의 조건에서 48 내지 72 시간 배양하였다.

배양중, 글루코스가 없어지지 않도록 L-프롤린을 약 50 mM 이 되도록 적절히 첨가하고, NH₄OH 를 사용하여 pH 6.5 를 하한 값으로 하였다.

상기 형질전환체의 배양에 의해 얻어진 배양액을 원심분리하여, 균체를 취득하였다.

이 균체의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 하기 조건하에서 측정하였다. 이 균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 동결 보존하는 것이 가능하며, 사용할 때에 해동하여 효소 활성의 측정에 사용할 수 있다.

반응액 [240 mM 의 MES 완충액 (pH 6.5) 중에, 12 mM L-프롤린, 24 mM 2-케톤글루타르산, 4 mM 황산제일철 및 8 mM L-아스코브산을 함유] 250 ㎕ 에 습균체량으로서 4 % (w/v) 가 되도록 가하고, 35 ℃ 에서 10 분간 반응시켰다. 반응액을 100 ℃, 2 분간 가열함으로서 반응을 정지하였다.

이 반응 정지액을 원심분리하여 얻어진 상층액 100 ㎕ 에, 0.3 M 붕산 완충액 (pH 10.7) 100 ㎕, 10 % (v/v) 메르캅토에탄올 수용액 4 ㎕ 및 5 % (w/v) o-프탈 알데히드의 에탄올 용액 16 ㎕ 를 첨가하여 60 ℃ 에서 30 초간 방치한 후, 2 % (w/v) NBD 의 에탄올 용액 50 ㎕ 를 가하여 60 ℃ 에서 40 분간 반응하였다. 이 반응액에 1 N 염산 30 ㎕ 를 가하여 반응을 정지하였다. 이 반응 정지액을 원심 분리한 후, 필터 여과하여 침전을 제거한 후, 고속 액체 크로마토그래피에 의하여 분석하고, 생성된 트랜스-4-히드록시-L -프롤린을 정량하였다.

고속 액체 크로마토그래피는 하기의 조건으로 수행하였다.

용리액 : 10 mM 시트르산 (pH 4.0) / 메탄올 = 3/1 (v/v)

유속 : 1 ml/분

칼럼 : YMC Pack ODS AQ-312 (YMC 사제, 6 × 150 mm)

칼럼 온도 : 50 ℃

검출 : 형광 검출, 여기 파장 503 nm, 형광 파장 541 nm

표 1 에 나타낸 바와 같이, 형질전환체는 유전자 원으로 사용한닥틸로스포란기움종 - RH1 균주와 비교하여 균체당 210 내지 1420 배의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산한다.

형질전환체가 생산하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성

균주	균체 활성¹⁾	상대 활성²⁾
이. 콜리ATCC12435/pWFH1이. 콜리ATCC12435/pWFH1³⁾ 이. 콜리ATCC12435/pTr14이. 콜리ATCC12435/pTc4OH이. 콜리ATCC12435/pTrS30이. 콜리ATCC12435/pBTac1닥틸로스포란기움종 RH1⁴⁾ 스트렙토마이세스 그리세오비리디스JCM4250⁵⁾ 스트렙토마이세스 다그헤스타니쿠스JCM4365⁵⁾	40.004.9610.685.98검출되지 않음검출되지 않음0.0280.0200.009	1428177381213--10.70.3

1) : 균체 활성은 습균체 1 mg 당의 효소 활성 (U/mg wet cells) 으로 표시하였다. 1 U 는 1 분간 1 nmol 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소 활성으로 한다.

2) : 상대 활성은닥틸로스포란기움종 RH1 균주가 생산하는 효소 활성을 1 로 하여 표에 나타내었다.

3) : 실시예 4 와 동일한 실험에서 5 리터의 단지 발효기를 사용한 배양시에 L-프롤린을 첨가하지 않고 실시한 결과를 표시하였다.

4) 참고예 2 에 기재

5) 참고예 3 에 기재

실시예 5

융합 단백질 발현 플라스미드의 구축

(1) β-갈락토시다제 단백질 단편과의 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축

플라스미드 pBluescript II KS (+) DNA 2.4 ㎍ 에 제한 효소EcoRV 를 첨가하여 이 DNA 를 절단한 후, 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻었다. 이 에탄올 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해하였다.

플라스미드 pRH71 DNA 4 ㎍ 에 제한 효소SacI 을 첨가하여 이 DNA 를 절단한 후, 상기와 동일한 방법으로 에탄올 침전을 얻었다. 이 에탄올 침전 (DNA 단편) 을 36 ㎕ 의 TE 에 용해후, 다까라 슈조오사 제조의 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여 이 DNA 단편의 양 말단을 블런팅화하였다. 이 처리된 DNA 를 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 약 2.4 kb 의 DNA 단편을 통상적인 방법에 따라 겔로부터 추출하고 바이오 래드사 제조의 Prep-A-gene 를 사용하여 회수하였다. 회수한 그 DNA 를 Xba I 으로 절단하고 상기와 동일한 방법으로 에탄올 침전을 얻었다. 그 에탄올 침전을 10 ㎕ 의 TE 에 용해하였다.

상기EcoRV -XbaI 로 절단한 pBluescript II KS (+) DNA 와,SacI 절단 후 블런트화하여XbaI 으로 절단하여 회수한 DNA 를 다까라 슈조오사 제조의 다까라 리게이션 키트를 사용하여 연결하였다.

이 연결 DNA 를 사용하여,이. 콜리XL2-Blue MRF' 균주(스트라타겐사 제조) 를 형질전환한 후, 그 형질전환 균주를 50 ㎍/ml 의 암피실린, 0.2 mM IPTG, 40 ㎍/ml X-Gal 을 함유하는 LB 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 로 밤새 배양하였다.

생육된 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 그의 구조를 제한효소 절단으로 확인하였다.

또한, 이 플라스미드를 주형으로, 서열 번호 16 기재의 DNA 를 센스 사슬 프라이머로, 서열 번호 7 기재의 DNA 를 안티센스 사슬 프라이머로 하여PCR 을 수행하였다. 이 반응에 의하여 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 N 말단 아미노산 서열에 대응하는 50 bp 의 DNA 단편이 생성됨으로서 플라스미드에 목적으로 하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

상기의 방법에 의하여lac프로모터의 전사 방향과 같은 방향으로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자가 β-Gal 의 N 말단 34 아미노산과 융합한 형태로 삽입된 플라스미드 pES1-23 을 얻었다 (도 7). 구축한 융합 단백질 아미노산 서열을 서열 번호 18 로 나타내었다.

(2) 말토스 결합 단백질과의 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축

서열 번호 17 기재의 DNA 를 센스 사슬 프라이머로, 서열 번호 12 에 기재된 DNA 를 안티센스 사슬 프라이머로, pRH71 을 주형으로하여 실시예 1 (3) 의 방법에 따라 PCR 을 행하였다. 즉, pRH 71 을 0.1 ㎍, 센스 사슬 및 안티센스 사슬 DNA 프라이머를 각 2 μM 을 함유하는 반응액 20 ㎕ 를 사용하여 96 ℃ 에서 5 분간의 반응 후, 96 ℃ 에서 2 분간, 58 ℃ 에서 1 분간, 75 ℃ 에서 1 분간의 반응 공정을 30 회 반복하였다.

이 반응액으로 아가로스 겔 전기영동을 수행한 후, L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 833 bp 의 증폭 단편을 통상적인 방법에 따라 추출하여, 바이오래드사의 Prep-A-gene 을 사용하여 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 833 bp 의 DNA 단편을HindIII 로 절단한 후 에탄올 침전법에 의하여 에탄올 침전을 얻었다. 이 에탄올 침전을 5 ㎕ 의 TE 에용해하여 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 구조 유전자 단편으로서 사용하였다.

tac프로모터 (Ptac) 제어하에 말토스 결합 단백질의 구조 유전자만을 갖는 (시그널 서열을 갖지 않는) 플라스미드 pMAL-c2 (뉴 잉글랜드 바이오랩사 제의 Protein Fusion & Purification System) 를XmnI 및HindIII 으로 절단하였다.

상기 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 구조 유전자 단편을 pMAL-c2 의 XmnI 및HindIII 절단 부위에 다까라 슈조오사제의 DNA 리게이션 키트를 사용하여 삽입하고,이. 콜리XL2-Blue MRF 균주에 통상적인 방법에 따라 형질전환하였다. 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 이와 같이하여 얻은 콜로니로 부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 그의 구조를 제한 효소 절단에 의하여 확인하였다.

상기의 방법에 따라 Ptac지배하의 말토스 결합 단백질의 구조 유전자와 융합한 형태로 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 구조 유전자를 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pMc4OH 를 얻었다 (도 8). 구축한 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 19 로 표시한다.

실시예 6

융합 단백질 발현 플라스미드를 포함하는 형질전환체에 의한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생산

실시예 5 에서 얻은 플라스미드 pES1-23a 및 pMc4OH 를 사용하여이.콜리DH1 을 형질전환하였다. 실시예 4 에 따른 방법으로 얻어진 형질전환체의 배양 및 그 형질전환체의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생산성을 조사하였다. 이때, 배양에 있어서는 IPTG 를 0.1 mM 첨가한 배지를 사용하였다.

표 2 에 표시한 바와 같이 그 형질전환체는 유전자 원으로 사용한닥틸로스포란기움종 - RH1 균주와 비교하여 균체당 29 내지 298 배의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산하였다.

형질전환체가 생산하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성

균주	균체 활성¹⁾	상대 활성³⁾
이. 콜리DH1/pES1-23a이. 콜리DH1/pMc4OH이. 콜리DH1/pBluescript IIKS (+)이. 콜리DH1/pMAL-c2닥틸로스포란기움종 RH1²⁾	0.808.35검출되지 않음검출되지 않음0.028	29298--1

2) : 참고예 2 에 기재.

3) : 상대 활성은닥틸로스포란기움종 RH1 균주가 생산하는 효소 활성을 1 로 하여 표에 나타내었다.

실시예 7

형질전환체에 의한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

(1) 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pTr14 를 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

실시예 4 에서 얻은 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pTr14 를 암피실린 100 ㎍/ml 을 함유하는 3 ml 의 LB 배지에 식균하고, 30 ℃ 에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 이 배양액을 원심 분리하여 얻어진 상층액중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 량을 정량하였다. 그 결과이. 콜리ATCC 12435/pTr14 의 배양 상층액중에 381 μM (50.0 mg/리터) 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린이 생성되었다.

한편, 숙주로서 사용한이. 콜리ATCC 12435 의 배양 상층액중에 유리된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은 검출되지 않았다.

(2) 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 을 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

이 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 을 암피실린 100 ㎍/ml 및 글루코스 2 % 를 첨가한 50 ml 의 Med 4 배지에 식균하여 30 ℃ 에서 16 시간 동안 진탕배양 하였다. 이 배양액을 종배양액으로 하여 폴리펩톤 대신에 펩톤 0.8 % 를 첨가한 2 리터의 Med 6 배지를 넣은 5 리터의 단지 발효기에 식균하였다. 배양온도를 33 ℃, 교반수를 400 회전/분으로, 통기량을 1 리터/배양액 1 리터/분의 조건하에서 배양하였다.

배양중 글루코스가 없어지지 않도록 적절히 첨가하고, NH₄OH 를 사용하여 pH 6.5 를 하한 값으로 하였다.

이 배양액을 원심 분리하여, 얻어진 상층액중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 정량한 결과, 배양 52 시간에 10.7 mM (1.4 g/리터) 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린이이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 의 배양 상층액중에 생성 축적되었다.

한편, 숙주로서 사용한이. 콜리ATCC 12435 의 배양 상층액중에서 유리된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린은 검출되지 않았다.

(3) 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 을 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

이 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 을 암피실린 100 ㎍/ml 을 함유하는 50 ml 의 Med 4 배지에 식균하여 30 ℃ 에서 16 시간 진탕배양 하였다. 이 배양액을 종배양액으로 하여 2 리터의 Med 6 배지를 넣은 5 리터의 단지 발효기에 식균하였다. 또한, L-프롤린을 200 mM 을 첨가하고, 배양 온도를 30 ℃, 교반수를 400 회전/분, 통기량을 1 리터/배양액 1 리터/분 의 조건하에서 배양하였다.

배양중 글루코스가 없어지지 않도록 L-프롤린을 약 50 mM 로 적절히 첨가하고, NH₄OH 를 사용하여 pH 6.5 를 하한 값으로 하였다.

이 배양액을 원심 분리하여, 얻어진 상층액중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 정량한 결과, 배양 72 시간내에 185 mM (24 g/리터) 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린이이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 의 배양 상층액중에 생성 축적되었다.

(4) 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pMc4OH 을 사용한 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 생산

이 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pMc 4OH 을 암피실린 100 ㎍/ml 을 함유하는 50 ml 의 Med 4 배지에 식균하여 30 ℃ 에서 16 시간 진탕배양 하였다. 이 배양액을 종배양액으로 하여 2 리터의 Med 6 배지를 넣은 5 리터의 단지 발효기에 식균하였다. 또한, L-프롤린을 200 mM 첨가하고, 배양 온도를 30 ℃, 교반수를 400 회전/분, 통기량을 1 리터/배양액 1 리터/분 의 조건하에서 배양하였다.

배양중 글루코스가 없어지지 않도록 L-프롤린이 약 50 mM 이 되도록 적절히 첨가하고, NH₄OH 를 사용하여 pH 6.5 를 하한 값으로 하였다.

이 배양액을 원심 분리하여, 얻어진 상층액중의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 정량한 결과, 배양 72 시간에서 85.4 mM (11.2 g/리터) 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린이이. 콜리ATCC 12435/pWFH1 의 배양 상층액중에 생성 축적되었다.

실시예 8

형질전환체를 사용하는 L-프롤린의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로의 전환

이 형질전환체이. 콜리ATCC 12435/pTr14 를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 10 ml LB 배지에 식균하여 30 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 취득하였다. 이 균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 동결 보존하고 사용할 때에 해동하여 사용하였다.

반응액 (240 mM 의 MES 완충액, pH 6.5, 20 mM L-프롤린, 24 mM 2-케토글루타르산, 4 mM 황산제일철 및 8 mM L-아스코르브산을 함유) 250 ㎕ 에 습균체량으로 10 % (w/v) 가 되도록 가하여, 35 ℃ 에서 60 분간 반응하였다. 반응액중에 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 양을 정량한 바, 11.5 mM (1.5 g/리터) 의 트랜스-4-히드록시-L-프롤린이 생성되었다.

참고예 1

L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 단리 및 정제

(1)닥틸로스포란기움종 RH1 의 동결 균체의 제조

SR3 배지 (글루코스 1.0 %, 가용성 전분 1.0 %, 효모 추출물 0.5 %, 트립톤 0.5 %, 고기 추출물 0.3 % 및 인산마그네슘 0.05 % 를 함유, 6 N NaOH 로 pH 7.2 로 조정한 배지) 를 2 리터의 삼각 플라스크에 200 ml 씩 분주하고 120 ℃ 에서 20 분간 살균하였다. 이 배지에 HT 한천 평판 배지 (가용성 전분 1 %, NZ 아민 0.2 %, 효모 추출물 0.1 %, 고기 추출물 0.1 % 및한천 1.5 % 를 함유하며, 6 N NaOH 로 pH 7.2 로 조정후 120 ℃ 에서 20 분간 살균한 배지) 에 생육한닥틸로스포란기움종 RH1 을 식균하여 28 ℃ 에서 2 일간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다.

Df1 배지 (가용성 전분 5 %, 소이빈 밀 1.5 %, 인산제일칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 7수화물 0.05 % 및 탄산칼슘 0.5 % 를 함유하고, 6 N NaOH 로 pH 7.0 으로 조정한 배지) 를 5 리터의 단지 발효기에 2 리터 분주한 후 120 ℃ 에서 20 분간 살균하였다. 이 배지에 상기 종배양액을 무균적으로 접종하고, 700 rpm, 1 vvm 조건하에서 28 ℃ 로 2 일간 배양하였다. 배양중의 pH 는 조정하지 않았다. 얻어진 배양액을 7,000×g 로 10 분간 4 ℃ 에서 원심분리하여 습균체를 배양액 1 리터 당 75 g 을 얻었다. 습균체는 4 ℃ 에서 생리 식염수로 세척하여, 원심 분리후 사용할 때까지 -80 ℃ 로 동결 보존하였다.

(2) 무세포 추출액의 제조

참고예 1 (1) 에서 얻은 동결 균체 600 g 을 융해 후, 3 리터의 완충액 A [2mM DTT, 0.2 mM EDTA 및 20 % (v/v) 글리세롤을 함유하는 50 mM TAPS [N-트리스 (히드록시메틸) 메틸-3-아미노프로판술폰산] 완충액 (pH 9.0) 에 빙냉하에서 현탁하였다. 현탁액을 다이노밀 (DYNOMILL, WILLY A BACHOFEN MASCHINENFABRIK, BASEL, 스위스) 로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 이 처리액을 4 ℃ 에서 6,500×g 로 30 분간 원심 분리하여 상층액을 얻었다.

이후의 조작은 모두 빙냉하 또는 4 ℃ 에서 행하였다.

(3) 칼럼 크로마토그래피에 의한 단리 및 정제

(3) - 1 스트림 라인

상기 공정에서 얻은 상층액을 완충액 A 로 평형시킨 DEAE 흡착체 300 ml 을 충전한 파마시아제 스트림라인 (STREAMLINE^TM) 에 부과하고, L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 함유하는 분획을 0.3 M 의 식염을 함유하는 완충액 A 로 용출하였다.

(3) - 2 DEAE 세파로스 칼럼 크로마토그래피

상기 공정에서 얻은 활성 분획을 완충액 A 로 3 배 로 희석한 후, 미리 완충액 A 로 평형시킨 DEAE 세파로스 칼럼 (5cm × 15 cm) 에 부과하였다. 칼럼을 완충액 A 로 세척한 후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 A 로 제조한 0 - 0.3 M 까지의 식염의 직선 농도 구배를 사용하여 용출하였다.

(3) - 3 부틸 세파로스 컬럼 크로마토그래피

상기 공정에서 얻은 활성 분획에 3 M 농도가 되도록 식염을 첨가 용해하고, 미리 3 M 식염을 함유하는 완충액 A 로 평형하여 둔 부틸 세파로스 칼럼 (부틸 세파로스 4 패스트 플로우, 2.6 cm × 13 cm) 을 수행하였다. 효소를 3 M 의 식염을 함유하는 완충액 A, 1.98 M 의 식염을 함유하는 완충액 A, 0.99 M 의 식염을 함유하는 완충액 A 및 완충액 A 의 식염 농도가 다른 4 종류의 완충액으로 식염 농도가 높은 쪽에서 낮은 쪽으로 단계적으로 용출하였다.

(3) - 4 페닐 세파로스 칼럼 크로마토그래피

상기 공정에서 얻은 활성 분획에 3 M 의 농도가 되도록 식염을 첨가 용해하고, 미리 3 M 의 식염을 함유하는 완충액 A 로 평형시킨 페닐 세파로스 칼럼 (Phenyl sepharose HP HiLoad 16/10, 1.6 cm × 10 cm) 에 부과하였다. 3 M 의 식염을 포함하는 완충액 A 로 세척 후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 A 로 용출하였다.

(4) - 5 색소 친화성 칼럼 크로마토그래피

상기 공정에서 얻은 활성 분획을 파마시아사 제의 PD-10 칼럼을 사용하여 탈염 후, 미리 완충액 A 로 평형시킨 리액티브 레드 120 칼럼 (시그마사 제, REACTIVE RED 120, 1 cm × 12.7 cm) 에 부과하였다. 완충액 A 로 세척한 후, 그 효소를 함유한 분획을 완충액 A 로 제작한 0 내지 1.5 M 까지의 식염의 직선 농도 구배를 사용하여 용출 하였다.

(3) - 6 리소스 Q 칼럼 크로마토그래피

상기 공정에서 얻은 활성 분획을 완충액 B [2 mM DTT, 0.1 % (v/v) 트윈 20 및 20 % (w/w) 글리세롤을 함유하는 50 mM TAPS 완충액 (pH 8.0)] 으로 평형 시킨 파마시아사 제의 PD-10 칼럼을 사용하여 탈염 후, 미리 완충액 B 로 평형시킨 리소스 Q 칼럼 (파마시아사 제, RESOURCE^TMQ, 1 ml) 에 부과하였다. 완충액 B 로 제조한 0 에서 0.2 M 까지의 식염의 직선 농도 구배를 사용하여 용출하였다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 단리 및 정제의 개요를 표 3 에 요약하였다.

L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 단리 및 정제의 개요

분획	총 단백질(mg)	총 활성(U)	비활성(U/mg 단백질)	수율 (%)
무세포 추출액스트림 라인DEAE 세파로스부틸 세파로스페닐 세파로스색소 친화성리소스 Q	13,3304,87535335.11.440.2120.100	11,0004,8803,8201,310814366384	0.831.0010.837.3565.31,7263,840	10044.434.711.97.43.33.5

참고예 2

닥틸로스포란기움 종에 의한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생산

SR3 배지를 시험관에 10 ml 씩 분주하고 120 ℃ 에서 20 분간 살균하였다. 이 배지에 MT 한천 평판 배지에 생육한닥틸로스포란기움종 RH1 을 백금이로 식균하여 28 ℃ 에서 2 일간 진탕 배양하고 종 배양액으로 사용하였다.

Df1 배지를 시험관에 10 ml 씩 분주하고 120 ℃ 에서 20 분간 살균하였다. 이 배지에 상기 종 배양액 1 ml 을 무균적으로 접종하여 28 ℃ 에서 2 일간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액을 8000 rpm으로 10 분간 4 ℃ 에서 원심 분리하였다. 얻어진 균체를 80 mM TES [N-트리스 (히드록시메틸) 메틸-2-아미노에탄술폰산] 완충액 (pH 7.5) 로 세척한 후 원심 분리하였다. 얻어진 습균체 150 mg 을 1.5 ml 의 반응액 [4 mM L-프롤린, 8 mM α-케토글루타르산, 4 mM L-아스코르브산, 2 mM 황산제일철을 함유하는 80 mM TES 완충액 (pH 7.5) 에 나이민 용액 (나이민-S-215, 니뽄 유우시 가부시끼가이샤 제) 4 g 을 크실렌 10 ml에 용해) 를 1.4 % (v/v) 첨가] 에 현탁하여 30 ℃ 에서 30 분간 반응을 실시하였다. 반응 후, 균체 반응액으로 부터 균체를 원심 분리하여 제거한 상층액 중에 생성된 히드록시프롤린에 대하여 분석을 실시하여닥틸로스포란기움종 균체의 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 측정하였다.

결과를 표 1 에 표시하였다.

참고예 3

스트렙토마이세스 그리세오비리디스 에 의한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 생산

스트렙토마이세스 그리세오비리디스JCM 4250 및스트렙토마이세스글리다제에스타직스 JCM 4365 를 사용하여 참고예 2 와 동일하게 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 측정하였다. 단 Df1 대신에 Df4 배지 [글리세롤 2.5 %, 글루코스 2.5 %, 소이빈 밀 1.5 %, 인산제일칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 7 수화물 0.05 %, 탄산칼슘 0.5 % 를 함유하며, 6 N NaOH 로 pH 7.0 으로 조정한 배지] 를 사용하였다.

결과를 표 1 에 표시하였다.

[산업상이용가능성]

본 발명에 의하면, 의약품의 합성 원료 또는 식품 첨가물로서 유용한트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조법 및 이 효소가 제공될 수 있다.

서열 목록

서열 번호 : 1

서열 길이 : 272

서열 형 : 아미노산

사슬의 수 : 직쇄상

서열의 종류 : 단백질

기원

생물명 :닥틸로스포란기움종 (Dactylosporangiumsp.)

세포주명 : RH1

[서열표 1a]

[서열표 1b]

서열 번호 : 2

서열 길이 : 816

서열 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

서열의 종류 : 게놈 DNA

기원

생물명 :닥틸로스포란기움종 (Dactylosporangiumsp.)

세포주명 : RH1

특징을 결정한 방법 : E

[서열표 2]

서열 번호 : 3

서열 길이 : 17

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 3]

서열 번호 : 4

서열 길이 : 17

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 4]

서열 번호 : 5

서열 길이 : 71

서열 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 5]

서열 번호 : 6

서열 길이 : 20

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 6]

서열 번호 : 7

서열 길이 : 19

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 7]

서열 번호 : 8

서열 길이 : 2707

서열 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

서열의 종류 : 게놈 DNA

기원

생물명 :닥틸로스포란기움종 (Dactylosporangiumsp.)

세포주명 : RH1

[서열표 8a]

[서열표 8b]

[서열표 8c]

서열 번호 : 9

서열 길이 : 37

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 9]

서열 번호 : 10

서열 길이 : 36

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 10]

서열 번호 : 11

서열 길이 : 37

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 11]

서열 번호 : 12

서열 길이 : 38

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 12]

서열 번호 : 13

서열 길이 : 64

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 13]

서열 번호 : 14

서열 길이 : 66

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 14]

서열 번호 : 15

서열 길이 : 816

서열 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 15a]

[서열표 15b]

[서열표 15c]

서열 번호 : 16

서열 길이 : 20

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 16]

서열 번호 : 17

서열 길이 : 21

서열 형 : 핵산

토폴로지 : 단일 사슬

서열의 종류 : 다른 핵산, 합성 DNA

[서열표 17]

서열 번호 : 18

서열 길이 : 299

서열 형 : 아미노산

사슬의 수 : 직쇄상

서열의 종류 : 단백질

기원

생물명 :닥틸로스포란기움종 (Dactylosporangiumsp.)

세포주명 : RH1

서열의 특징

특징을 표시하는 기호 : 펩티드

존재 위치 : 35..299

특징을 결정한 방법 : S

기원

생물명 :에스케리키아 콜리(Escherichia coli)

직접 기원

pBluescriptIIKS+

서열의 특징

특징을 표시하는 기호 : 펩티드

존재 위치 : 1..34

특징을 결정한 방법 : S

[서열표 18a]

[서열표 18b]

서열 번호 : 19

서열 길이 : 659

서열 형 : 아미노산

사슬의 수 : 직쇄상

서열의 종류 : 단백질

기원

생물명 :닥틸로스포란기움종 (Dactylosporangiumsp.)

세포주명 : RH1

서열의 특징

특징을 표시하는 기호 : 펩티드

존재 위치 : 389..659

특징을 결정한 방법 : E

기원

생물명 :에스케리키아 콜리(Escherichia coli)

직접 기원

pMAL-c2

서열의 특징

특징을 표시하는 기호 : 펩티드

존재 위치 : 1..387

특징을 결정한 방법 : S

[서열표 19a]

[서열표 19b]

[서열표 19c]

[서열표 19d]

Claims

서열 번호 1, 18 및 19 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 DNA.
서열 번호 2, 8 및 15 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 에서 선택되는 DNA.
제 1 항에 있어서, DNA 가닥틸로스포란기움속,아미콜라토프시스속 및스트렙토마이세스속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물 유래인 DNA.
제 1 항에 있어서, DNA 가닥틸로스포란기움종 RH1 (FERM BP-4400),아미콜라토프시스종 RH2 (FERM BP-4581),스트렙토마이세스 그리세오비리디스JCM 4250 및스트렙토마이세스 다그헤스타니쿠스JCM 4365 에서 선택되는 미생물 유래인 DNA.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 갖는 단편을 벡터에 도입하여 얻은 재조합 DNA.
제 5 항에 기재된 재조합 DNA를 함유하는 형질전환체.
제 6 항에 있어서, 형질전환체가에스케리키아 콜리SOLR/pRH71 인 형질전환체.
서열 번호 1, 18 및 19 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 단백질.
제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하여, L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성 축적시켜, 이 배양물에서 L-프롤린 4 위치 수산화 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는, L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린을 첨가하는 것을 특징으로 하는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소의 제조 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 생성 축적시켜 이 배양물로부터 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 채취하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로부터 L-프롤린을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로 부터 2-케토글루타르산을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린을 첨가하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린, 2-케토글루타르산 및 2 가 철 이온을 첨가하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배양하여, 그 배양물, 균체 또는 균체 처리물을 효소원으로 하여, 2-케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하에서 배양액 중 또는 수성 매질 중에서 L-프롤린을 트랜스-4-히드록시-L-프롤린으로 변환시켜 생성된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 이 배양물 또는 이 수성 매질로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 16 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로부터 L-프롤린을 생산하여 배양액중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 16 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로 부터 2-케토글루타르산을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
제 16 항에 있어서, 균체 처리물이 균체 건조물, 균체의 동결 건조물, 균체의 계면 활성제 처리물, 균체의 효소 처리물, 균체의 초음파 처리물, 균체의 기계적 파쇄처리물, 균체의 용매 처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물, 균체로부터 추출하여 수득되는 L-프롤린 4 위치 수산화 효소 활성을 갖는 효소, 이 효소의 정제품 및 이 효소의 고정화물에서 선택되는 균체 처리물임을 특징으로 하는 트랜스-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.