KR100460580B1 - 시스-3-히드록시-l-프롤린의 제조법 - Google Patents

시스-3-히드록시-l-프롤린의 제조법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의약품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 시스-3-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 제조법 및 이 효소에 관한 것이다.

Description

시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법 {PROCESS FOR PRODUCING CIS-3-HYDROXY-L-PROLINE}
종래의 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법으로서는 화학적으로 합성하는 방법 [참조 : J. Amer. Chem. Soc., 84 권, 3980 페이지 (1962), J. Amer. Chem. Soc., 85 권, 2824 페이지 (1963), Nature, 289 권, 310 페이지 (1981), J. Org. Chem., 54 권, 1866 페이지 (1989), Acta Chemica Scandinavica, 43 권, 290 페이지 (1989)] 이 알려져 있다.
L-프롤린을 직접, 위치 및 입체 선택적으로 수산화하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법은 합성화학적 방법 및 생물기능을 이용한 방법 모두 지금까지 보고되어 있지 않다.
종래의 화학합성에 의한 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조방법은,
(1) 원료가 고가이다,
(2) 반응공정이 길다,
(3) 분리정제 공정이 복잡하다,
(4) 생산 효율이 낮다
등의 이유 때문에 공업화는 곤란하였다.
활성이 높은 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 사용하여 공업적으로 유리하게 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 사용하여 값이 싸고 입수가 용이한 L-프롤린으로부터 효율적으로 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조하는 방법에 있어서, 보다 공업적으로 유리하게 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조하기 위하여 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자 및 이 유전자를 함유하는 형질전환체를 제공하고, 이 유전자 및 이 형질전환체를 사용하여 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 대량으로 생산시켜, 이 형질전환체 또는 이 효소를 사용하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 값싸게 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 의약품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 시스-3-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자 (이하, L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자라고 약기한다), 이 유전자를 함유하는 형질전환체 및 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 제조법에 관한 것이다.
도 1 은 플라스미드 pTH30 및 플라스미드 pTH40 의 조성공정을 나타낸다.
도면중 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 클론화된스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 는 멀티 클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부위만을 표시하고 있다.
도 2 는 플라스미드 pTH71 및 플라스미드 pTH75 를 나타낸다.
도면중 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이 클론화된스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분을 나타낸다. 또 화살표를 병기한 부분이 서열번호 14 에 해당하는 염기서열을 갖는 부분이다. 화살표의 방향은 서열번호 14 의 선두로부터 말단으로 향하는 방향이다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 는 멀티 클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부위만을 표시하고 있다.
도 3 은 플라스미드 pTH50 의 조성공정을 나타낸다.
도면중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분 유래의 L-프롤린 3위치 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 는 멀티클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부위만을 표시하고 있다.
도 4 는 플라스미드 pEX1-5 의 조성공정을 나타낸다.
도면중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분 유래의 L-프롤린 3위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 는 멀티클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의조성에 관계하는 제한효소 부위만을 표시하고 있다.
도 5 는 플라스미드 pTH60 의 조성공정을 나타낸다.
도면중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분 유래의 L-프롤린 3위치 수산화효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 멀티클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부분만을 표시하고 있다.
도 6 은 플라스미드 pTH70 의 조성공정을 나타낸다.
도면중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분 유래의 L-프롤린 3위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 멀티클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부분만을 표시하고 있다.
도 7 은 플라스미드 pTH80 의 조성공정을 나타낸다.
도면중, 흑색 도포한 굵은 선으로 표시한 부분이스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 부분 유래의 L-프롤린 3위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 부분을 나타낸다. Ap 는 pBR322 유래의 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. Plac는 대장균 락토오스 프로모터를,lacZ 는 β-갈락토시다아제 구조유전자를, MCS 멀티클로닝 부위를 나타낸다. 또한, 도면중에는 플라스미드의 조성에 관계하는 제한효소 부분만을 표시하고 있다.
발명의 개시
본 발명은 미생물 유래의 신규 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이형질전환체를 사용한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 제조법, 이 효소 및 이 형질전환체 또는 이 효소를 사용한 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법에 관한 것이다.
이하에 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소는, 2-케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하에, 유리의 L-프롤린을 수산화하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소이다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질로는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 서열번호 1 또는 2 로 표시한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이 단백질 또는 이 단백질의 부분 아미노산 배열을 갖는 단백질과 대장균 유래의 β- 갈락토시다제 단백질의 부분 아미노산 배열을 갖는 펩티드가 결합한 아미노산 배열을 갖는 융합 단백질, 및 배열 번호 1 또는 2 에 표시한 아미노산 배열을 갖는 단백질 혹은 이 단백질의 부분 아미노산 배열을 갖는 단백질과 대장균 유래의 말토오스 결합 단백질의 부분 아미노산 배열을 갖는 펩티드가 결합한 아미노산 배열을 갖는 융합 단백질 등을 들 수가 있다. 융합 단백질의 구체예로서는 배열번호 15, 16 또는 17 에 표시한 아미노산 배열을 갖는 단백질 등을 들 수가 있다.
또한 배열 번호 1, 2, 15, 16 또는 17 에 표시한 아미노산 배열과는 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수가 있다. 여기서, 아미노산의 치환, 결실 또는 부가는 문헌 [Nucleic Acids Research, 10권, 6487 ∼ 6500 페이지 (1982), Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 79 권, 6409 ∼ 6413 페이지 (1982), Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 81 권, 5662 ∼ 5666 페이지 (1984), Science, 224 권, 1431 ∼ 1433 페이지 (1984), PCT WO 85/00817 (1985), Nature, 316 권, 601 ∼ 605 페이지 (1985), Gene, 34 권, 315 ∼ 323 페이지 (1985), Nucleic Acid Research, 13 권, 4431 ∼ 4442 페이지 (1985), Current Protocols in Molecular Biology, 8 장, Mutagenesis of Cloned DNA, Jhon Willey & Sons, Inc. (1989)} 등에 기재된 방법에 준하여 실시할 수가 있다.
본 발명에 관한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자로서는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 서열 번호 1, 2, 15, 16 또는 17 에 표시한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자, 혹은 서열 번호 1, 2, 15, 16 또는 17 에 표시한 아미노산 서열과는 1 개 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가한 아미노산 서열을 가지며 또한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 들 수가 있다. 구체적으로는 서열 번호 3, 4, 13 및 14 로 표시되는 DNA 를 들 수가 있다.
또 본 발명의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자로는, 상기에서 정의되는 DNA 에 대하여 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 잃치 않는 범위 내에서 치환 변이, 결실 변이, 삽입 변이 등의 변이가 도입된 DNA, 예를 들면 서열 번호 3, 4, 13 또는 14 와 상동성을 갖는 DNA 등을 들 수가 있다. 이 상동성을 갖는 DNA 란 서열 번호 3, 4, 13 또는 14 에 표시한 염기 서열을 함유하는 DNA 를 탐침으로하여 콜로니 혼성화법 또는 플라크 혼성화법을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미한다. 이것들의 조작은 공지의 in-vitro 재조합 기법 [Moleclar Clonning A Laboratory Manual, 제 2 판 Sambrook, Fritsch, Maniatis 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 에 준하여 실시할 수가 있다.
이 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편은 L-프롤린을 수산화하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 능력을 갖는 미생물로부터 취득할 수가 있다. 이와같은 미생물로서는 L-프롤린을 수산화하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 능력을 갖는 미생물이면 어느 것이라도 좋으나 바람직하게는스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 또는바실루스(Bacillus) 속에 속하고 또한 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 활성을 갖는 미생물을 들 수가 있다. 또한, 바람직하게는,스트렙토마이세스카누스 (Streptomyces canus) ATCC 12647,스트렙토마이세스카누스 (Streptomyces canus) ATCC 12646,스트렙토마이세스sp. TH1 (FERM BP-4399),바실루스sp. TH2 (FERM BP-4397),바실루스sp. TH3 (FERM BP-4398) 혹은 이들의 돌연변이주 또는 유도체를 들 수가 있다.
이하에 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물 유래의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자의 취득방법에 관하여 나타낸다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물로부터 통상의 DNA 단리법, 예를 들면 페놀법 [Biochim. Biophys. Acta, 72 권, 619 ∼ 629 페이지 (1963)] 에 의해 이 미생물의 염색체 DNA 를 조제한다. 수득된 염색체 DNA 를 적당한 제한효소에 의해 절단하여 이 제한효소 절단 단편을 벡터 DNA 에 편입함으로써 이 미생물 염색체의 염색체 DNA 라이브러리를 구축한다. 이 염색체 DNA 라이브러리를 사용하여 숙주 미생물을 형질전환한다. 수득된 형질전환체로부터 혼성화법에 의해 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 형질전환체를 선택한다. 선택된 형질전환체로부터 목적으로 하는 유전자를 함유하는 DNA 를 수득할 수가 있다.
이 일련의 조작은 공지의 in vitro 재조합기법 [Moleclar Clonning A Laboratory Manual, 제 2 판, Sambrook, Fritsch, Maniatis 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] 에 준하여 실시할 수가 있다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 염색체 DNA 라이브러리를 구축하는 벡터 DNA 로서는 대장균 K12 주중에서 자율복제할 수 있는 것이면 파아지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이라도 사용할 수 있다. 적합한 예로는 λZAPII, pUC18, pBluescript (STRATAGENE 사에서 시판) 등을 들 수가 있다.
숙주 미생물로서는 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물이라면 어느 것이라도 사용할 수가 있다. 적합하기로는에스케리키아 콜리(Escherichia coli) XL1-Blue,에스케리키아 콜리XL2-Blue,에스케리키아 콜리DH1,에스케리키아 콜리MC1000 등을 들 수가 있다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소 중의 아미노산 서열의 정보를 토대로, DNA 프라이머를 제작하고, 이 DNA 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응 (이하, PCR 이라고 약기한다) 을 실시하고, 수득된 DNA 단편을 사용하여 혼성화법을 실시하여 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 형질전환체를 선택할 수 있다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 아미노산 서열정보는 통상 사용되는 아미노산 서열분석 장치, 예를 들어 시마쓰세이사꾸쇼사제 단백질 서열분석기 모델 PPSQ-10 등을 사용하여 정제된 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 분석함으로써 수득할 수가 있다. 이와같이 수득된 아미노산 서열정보로서 구체적으로는 서열번호 5 ∼ 7 에 표시한 아미노산 서열 등을 들 수가 있다.
DNA 프라이머의 합성을 통상 사용되는 DNA 합성기, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템 (Applied Biosystems) 사제, 380A·DNA 합성기 등을 사용하여 실시할 수가 있다.
혼성화법에 사용하는 탐침으로서는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자의 부분 단편을 사용할 수가 있다. L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자의 부분 단편은 PCR 을 이용하여 수득할 수가 있다. 예를 들어 서열표의 서열번호 8 (서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 1 ∼ 6 번째의 아미노산을코드하는 센스사슬 DNA 에 대응한다) 에 표시한 DNA 와, 서열표의 서열번호 10 (서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 21 ∼ 25 번째의 아미노산을 코드하는 안티센스 사슬 DNA 에 대응한다) 에 표시한 DNA 를 화학 합성하고, 이것들을 DNA 프라이머로서 사용하여 PCR 을 실시하고, 수득된 서열번호 11 에 표시한 74bp 의 DNA 단편 등을 탐침으로서 들 수가 있다.
혼성화법에 의해 선택된 형질전환체에 의해 수득된 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유함으로써 DNA 를 적당한 제한 효소, 예를 들어 PstI 등으로 절단한 후, pBluescript KS(+) (STRATAGENE사에서 시판) 등의 플라스미드에 클로닝하고 통상 사용되는 염기 서열 분석 방법, 예를 들어 생거 (Sanger) 등의 다이데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 권, 5463 페이지, (1977)] 등에 의해서 분석함으로써 이 유전자의 염기 서열을 결정할 수가 있다. 염기 서열의 분석은 염기서열자동분석장치, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템 사제 373A·DNA 시퀀서 (Sequener) 등을 사용하여 실시할 수가 있다.
이와같이 결정된 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자의 염기서열로는, 예를 들어, 서열번호 3, 4, 13 또는 14로 표시된 염기 서열을 들 수가 있다.
본 발명의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드로는, 예를 들어, pTH30, pTH71 및 pTH75 등을 들 수가 있다. pTH30 을 함유하는 대장균인에스케리키아 콜리XL2-Blue/pTH30 은 평성 7 년3 월 2 일자로, pTH75 를 함유하는 대장균인에스케리키아 콜리XL2-Blue/ pTH75 는 평성 8 년 2 월 22 일자로, 고교기쥬쓰인 세이메이고가꾸고교 기쥬쓰겡뀨쇼, 일본국 이바라끼껭 쓰꾸바시 하가시 1쵸메 1방 3고 (우편번호 305) 에 각각 FERM BP-5026, FERM BP-5409 로서 기탁되어 있다.
상기와 같이 수득된 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 숙주중에서 발현시키기 위해서는 먼저 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소류 혹은 DNA 분해효소류로 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 한 후에, 발현 벡터 중 프로모터의 하류에 삽입하고, 이어서 상기 DNA 를 삽입한 발현 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 중에 도입한다. 숙주로서는 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것을 모두 사용할 수가 있다. 예를 들어 에스케리키아속, 세라티아속, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 슈도모나스속,바실루스속 등에 속하는 미생물균주 외에 효모균주나 동물세포 숙주 등을 들 수가 있다.
발현 벡터로서는 상기 숙주에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 내로의 삽입이 가능하고 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
대장균 등의 미생물들을 숙주로서 사용하는 경우에는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 발현 벡터가 미생물 중에서 자립 복제 가능한 동시에 프로모터, 리보솜 결합 서열, L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자 전사 종결 서열로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유되어 있어도 좋다.
발현 벡터로는, 예를 들어, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (어느 것이나 뵈링거 만하임사에서 시판), pKYP10 (일본국 특개소 제 58-110600 호), pKYP200 [Agric Biol. Chem., 48권, 669 ∼ 675 페이지 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53 권, 277 페이지 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82권, 4306 페이지, (1985)], pBluescript (STRATAGENE사), pTrs30 (에스케리키아 콜리JM 109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로부터 조제] 및 pTrS32 [에스케리키아 콜리JM 109/pTrS30 (FERM BP-5408) 으로부터 조제] 등을 예시할 수가 있다.
프로모터로는 대장균 등의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들어trp프로모터 (Ptrp),lac프로모터 (Plac), PL프로모터, PR프로모터 등의 대장균이나 파아지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수가 있다. 또 Ptrp를 2 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrpx 2), tac 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 서열로는 대장균 등의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋으나 리보솜 결합 서열과 개시 코돈과의 사이를 적당한 거리 (예를 들어 6 ∼ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 코드하는 유전자면 어느 것이라도 사용할 수가 있으나 이 유전자의 DNA 서열을 숙주 미생물에서의 발현에 최적한 코돈으로 되도록 염기를 치환하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 유전자의 발현에는 전사 종결 서열이 반드시 필요하지는 않으나 적합하게는 구조 유전자 바로 밑에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.
숙주로서는에스케리키아 콜리XL1-Blue,에스케리키아 콜리XL2-Blue,에스케리키아 콜리DH1,에스케리키아 콜리MC1000,에스케리키아 콜리KY3276,에스케리키아 콜리W1485,에스케리키아 콜리JM109,에스케리키아 콜리HB101,에스케리키아 콜리49 번,에스케리키아 콜리W3110,에스케리키아 콜리NY49,바실루스섭틸리스 (Bacillus subtilis),바실루스아밀로쿠에파시네스 (Bacillus amyloquefacines), 브레비박테리움 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카로리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354 등을 들수가 있다.
효모 균주를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들어, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) 등을 예시할 수가 있다.
프로모터로서는 효모 균주의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들어 헥소스키나제 등의 해당계 유전자의 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 히트쇽 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP1 프로모터 등의 프로모터를 들 수가 있다.
숙주로서는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 슈바니오마이세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius) 등을 들수가 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들어 pcDNA I/Amp, pcDNA I, pcDM8 (어느 것이나 프라코시사에서 시판) 등을 예시할 수가 있다. 프로모터로서는 동물세포의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들어 사람 CMV 의 IE (immediate errly) 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용하여도 좋다. 숙주로서는 나마루바 세포, HBT5637 (일본국 특개소 제 63-299 호), COS 세포, CHO 세포 등을 들 수가 있다.
동물세포에의 DNA 도입법으로는, 동물세포에 DNA 를 도입할 수가 있으면 어떤 방법도 사용할 수가 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 [Miyaji 등, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 [특개평 제 2-227075 호], 리포펙션법 [Philip L. Felgner : Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 등을 사용할 수가 있다. 형질전환주의 취득 및 배양은 특개평제 2-227075 호 또는 특개평 제 2-257891 호에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수가 있다.
상기와 같이 수득된 형질전환체의 배양은 통상의 배양방법에 따라 실시된다.
대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는 비생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하여, 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지의 어느 것이라도 좋다.
탄소원으로서는 각각의 미생물이 자화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당밀 및 전분 또는 전분 가수분해 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산등의 유기산, 에탄올, 프로판올등의 알코올류가 사용된다.
질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산이나, 유기산의 암모늄염, 기타 함질소화합물 및 펩톤, 고기추출물, 효모추출물, 콘스팁리쿼, 카세인가수분해물, 대두백 및 대두백가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등이 사용된다.
무기물로서는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산동, 탄산칼슘 등이 사용된다.
배양은 진탕배양 또는 심부통기교반배양등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15 ∼ 40℃가 좋고, 배양시간은 통상 16 ∼ 96 시간이다.배양중 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
L-프롤린을 5 ∼ 1000, 바람직하게는 20 ∼ 200mM 의 농도가 되도록, 적시에 배지에 첨가함으로써 보다 효율적으로 L-프롤린 3위치 수산화효소를 제조할 수 있다.
또한, 필요에 따라, 배지에 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 첨가해도 좋다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라, 인듀서를 배지에 첨가하여도 좋다. 예를 들면,lac프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전화한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 등을,trp프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌 아크릴산 (IAA) 등을 배지에 첨가하여도 좋다.
동물세포를 숙주로 사용한 형질전환체를 배양하는 배지는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지, 이글 (Eagle) 의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소태아혈청등을 첨가한 배지등이 사용된다.
배양은 5% CO2존재하 등의 조건하에서 실시한다. 배양온도는 35 ∼ 37℃가 좋고, 배양시간은 통상 3 ∼ 7 일간이다.
L-프롤린을 5 ∼ 1000, 바람직하게는 20 ∼ 200mM 의 농도가 되도록,적시에 배지에 첨가함으로써 보다 효율적으로 L-프롤린 3위치 수산화효소를 제조할 수가 있다.
또한, 배양중 필요에 따라, 배지에 가나마이신이나 페니실린 등의 항생물질을 첨가해도 좋다.
이와 같이 배양하여 수득한 형질전화체내에는 유전자원으로서 사용한 미생물 균주, 예를 들어,스트렙토마이세스sp. TH1 등과 비교하여 L-프롤린 3위치 수산화효소가 현저한 양으로 생성, 축적되어 있고, 효소의 단리 정제 또는 이 효소를 사용하여 L-프롤린으로부터의 시스-3-히드록시-L-프롤린 제조를, 유전자원으로 사용한 미생물 균주, 예를 들어,스트렙토마이세스sp. TH1 등을 사용한 경우와 비교하여, 훨씬 효율적으로 실시할 수가 있다.
형질전환체중에 L-프롤린 3위치 수산화효소가 생성되어 있는 것은 배양물, 균체, 또는 균체처리물을 효소반응에 적합한 수성매체중에, L-프롤린, 2가 철이온, 2-케토글루타르산을 함께 가하고, 또한 필요에 따라 계면활성제나 유기용제를 첨가하여, 생성되는 시스-3-히드록시-L-프롤린을 검출함으로써 알수가 있다. 이와 같이하여 균체중에 생성이 확인되는 L-프롤린 3위치 수산화효소의 활성은, 하기 측정조건하에서, 1분간 1nmol 의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 활성을 1 단위 (U) 로 표시한다. 또한 여기서는 미생물 균체와 동물세포를 포함해서 균체라고 부른다.
L-프롤린 3위치 수산화 효소 활성의 측정 :
12mM L-프롤린, 24mM 2-케토글루타르산, 4mM 황산제1철 및 8mM L-아스코르브산을 함유하는 200mM 의 TES [N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산] 완충액 (pH 7.5) 에 균체, 균체처리물 또는 효소표품 등을 첨가하여 합계 250 ㎕ 로 하고, 35 ℃, 10 분간 반응시킨다. 반응액을 100 ℃, 2 분간 가열하여 반응을 정지시킨 후에, 반응액중에 생성된 시스-3-히드록시-L-프롤린을 고속액체크로마토그래피 (이하 HPLC 라고 약기한다) 를 사용하여 정량한다.
정량에는 시스-3-히드록시-L-프롤린을 정량할 수 있는 방법이면 어떤 방법을 사용하여도 좋으나, 예를 들면 반응액중의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 배위자 교환 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면, (주) 스미까 분세끼 센타 사제 SUMICHIRAL OA5000 등을 사용하여 HLPC 로 분리용출후, 7-클로로-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸 (이하 NBD 라고 약기한다) 에 의해서 포스트 칼럼 유도체화하여 검출하는 방법 (포스트 칼럼 유도체화법), 혹은 반응액 중의 목적 화합물을 미리 NBD 유도체화 해놓고, 이것을 HLPC 를 사용한 역상 크로마토그래피에 걸어서 NBD 유도체화물을 분리후 검출하는 방법 [William J. Lindblad 및 Robert F. Diegelmann, Analytical Biochemistry, 138 권, 390 ∼395 페이지, 1984 년] (프레칼럼 유도체화방법) 등을 들 수 있다. NBD 유도체화물의 검출은 어느 것이나 그의 형광 (여기파장 503 ㎚, 형광파장 541 ㎚) 측정에 의해서 실시된다.
상기와 같이, 배양균체중에 L 프롤린 3 위치 수산화효소의 생성이 확인된 형질 전환체의 배양물로부터 효소를 단리정제하는 데에는 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용하면 좋다. 예를 들면, 형질전환체의 배양액을 원심분리함으로써, 배양액 중의 균체를 모아, 이 균체를 세정한 후에, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가우린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 균체를 파쇄하고, 무세포 추출액을 수득한다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 수득된 상등액으로부터 황산암모늄 등에 의한 염석, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세팔로스 등의 음이온 교환 크로마토그래피, 부틸 세팔로스, 페닐 세팔로스 등의 소수성 크로마토그래피, 분자체를 사용한 겔 여과법, 등전점전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 사용하여 정제효소표품을 수득할 수 있다.
배양균체 중에 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생성이 확인된 형질 전환체를 상기의 형질 전환체의 배양조건과 동일한 조건으로 배양하고, 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 시스-3-히드록시-L-프롤린을 채취함으로써 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조할 수가 있다.
당원으로부터 L-프롤린을 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체를 사용함으로써, 배양중에 L-프롤린을 첨가하지 않더라도 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조할 수가 있으나, L-프롤린을 5 ∼ 1000, 바람직하게는 20 ∼ 200 mM 의 농도로 되도록, 적시에 배지에 첨가함으로써, 보다 효율적으로 L-프롤린 3위치 수산화효소를 제조할 수 있다.
당원으로부터 2-케토글루타르산을 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체를 사용함으로써, 배양 중에 2-케토글루타르산을 첨가하지 않더라도 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조할 수가 있다. 이 형질전환체를 사용하는 경우에는 글루코오스 등의 당원을 적시에 배지에 첨가하여, 2-케토글루타르산을 배양액 중에 생성, 축적시킴으로써, 보다 효율적으로 L-프롤린 3위치 수산화효소를 제조할 수 있다. 당원으로부터 2-케토글루타르산을 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 없는 형질전환체를 사용하는 경우에는 필요에 따라 2-케토글루타르산을 배양시에 첨가한다.
또한 필요에 따라 2가 철이온을 배양시에 첨가하여도 좋다.
시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조는 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생성이 확인된 형질전환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체 또는 균체 처리물을 효소원으로서 사용하여 하기의 방법에 의해 실시할 수도 있다.
즉, 이 형질전환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체 또는 균체처리물을 효소반응에 적합한 수성매체 중에, L-프롤린, 2가 철이온, 2-케토글루타르산과 함께 가하고, 또 필요에 따라 계면활성제나 유기용제를 첨가함으로써 L-프롤린을 시스-3-히드록시-L-프롤린으로 변환시키고, 이어서 반응액으로부터 시스-3-히드록시-L-프롤린을 채취함으로써, 시스-3-히드록시-L-프롤린을 제조할 수가 있다.
균체처리물로서는 균체의 건조물, 균체의 동결 건조물, 균체의 계면활성제 처리물, 균체의 효소처리물, 균체의 초음파 처리물, 균체의 기계적 마쇄 처리물, 균체의 용매 처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물 등을 들수가 있다. 또한, 이 균체로부터 추출하여 수득되는 L-프롤린 3위치 수산화 효소 활성을 갖는 효소, 이 효소의 정제표품, 고정화물 등도 사용된다.
수성매체로서는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산 에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트 아미드 등의 아미드류 등을 들 수가 있다.
계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌·스테아릴아민 (예를 들면, 나이민 S-215, 닛뽕 유시사제 등), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드, 양이온 FB, 양이온 F2-40E 등의 양이온성 계면활성제, 나트륨 올레일 아미도 황산, 뉴렉스 TAB, 라비졸 80 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 소르비탄·모노 스테아레이트 (예를 들면 노니온 ST221) 등의 양성 계면활성제, 기타 3 급 아민 PB, 헥사데실 디메틸아민 등을 들 수가 있고, 반응을 촉진시키는 것이면 어느 것이라도 사용할 수가 있다. 이것들은 통상 0.1 ∼ 50 mg/l, 바람직하게는 1 ∼ 20 mg/l 의 농도로 사용된다.
유기용제로서는 톨루엔, 크실렌, 지방족 알콜, 벤젠, 아세트산에틸 등이 사용된다. 통상 0.1 ∼ 50 ㎕/ml, 바람직하게는 1 ∼ 20 ㎕/ml 의 농도로 사용할 수 있다.
반응은 L-프롤린 3위치 수산화 효소 활성을 갖는 형질전환체를 배양후, 이 형질환체의 배양물, 이 배양물로부터 분리한 균체, 균체의 처리물을 효소원으로서 사용하여 수성매체 중에서 실시한다.
이것들의 효소원의 반응액 중에 있어서의 효소 활성은 사용하는 기질량등에 의해 결정되나, 통상 1,000 ∼ 10,000,000 U/l, 바람직하게는 10,000∼ 3,000,000U/l 이다. 미생물의 균체 및 균체 처리물을 사용하는 경우, 그 농도는 통상 습균체로 1 ∼ 300 g/l 이다.
반응은 통상 온도 15 ∼ 50℃, pH6.0 ∼ 9.0 으로 1 ∼ 96 시간 실시한다. 반응에 사용되는 L-프롤린의 농도는 1mM ∼ 2M 이다. L-프롤린은 단품을 반응액에 직접 첨가하여 사용하여도 좋고, 당원으로부터 L-프롤린을 생성하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 미생물의 배양액 등을 사용하여 공급하여도 좋다. 더 나아가서는 당원으로부터 L-프롤린을 생성하는 능력이 있는 미생물을 형질전환체의 숙주 미생물로서 사용함으로써, 이 숙주 미생물이 생성하는 L-프롤린을 반응에 이용할 수도 있다.
반응에는 2가 철이온이 필요케 되고, 통상 1 ∼ 100mM 이 사용된다. 2가 철이온으로서는, 2가 철을 함유하고 반응을 저해하지 않는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수가 있다. 예를 들어, 황산 제1철 등의 황화물, 염화 제1철 등의 염화물, 탄산 제1철 등외에, 시트르산, 유산염, 푸마르산염 등과 같은 유기산염을 들 수 있다. 사용하는 균체, 균체처리물, 또는 반응액 성분 중에 2가 철이온이 함유되어 있으면 특히 2가 철이온을 첨가하지 않아도 좋다.
2-케토글루타르산은 반응액에 단품을 첨가하여도 좋고, 사용하는 균체 및 균체처리물이 갖는 대사활성에 의해서, 2-케토글루타르산으로 전환시킬 수 있는 화합물을 사용하여도 좋다. 이와 같은 화합물로는 글루코오스와 같은 당질, 글루타민산 등의 아미노산, 숙신산 등의 유기산 등을 들 수 있다. 이것들의 화합물은 단독으로 사용하여도 좋고, 복수를 병용하여도 좋다.
배양물 또는 수성매체로부터 시스-3-히드록시-L-프롤린을 회수하는 방법으로서는 이온교환수지 등을 사용하는 칼럼 크로마토그래피, 또는 정출법 등 통상의 분리방법이 사용된다. 회수된 시스-3-히드록시-L-프롤린은13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼, 질량스펙트럼, 비선광도 등의 통상의 분석수단에 의해서 그 구조를 확인할 수가 있다.
본 발명에 의해 제조된 시스-3-히드록시-L-프롤린은 상술한 포스트칼럼 유도체화법 이나 프리칼럼 유도체화법에 의해서 정량분석 할 수가 있다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
실시예 1 스트렙토마이세스 sp. TH1 의 L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질을 코드하는 유전자부분 DNA 의 조제
(1)스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 DNA 의 단리
스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 DNA 는, 상법에 따라, 이하와 같이 단리하였다. 만니톨 5%, 글리신 0.05% 를 첨가한 SK#2 배지 (글루코스 0.25%, 가용성전분 1.0%, 효모 추출물 0.25%, 펩톤 0.25%, 고기추출물 0.15%, 인산 1 칼륨 0.01%, 황산마그네슘 0.03% 를 함유하고, 6 N NaOH 로 pH 7.6 으로 조정한 배지) 를 시험관에 10 ㎖ 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이것에 HT 한천 평판배지 (가용성전분 1%, NZ 아민 0.2%, 효모추출물 0.1%, 고기추출물 0.1%, 한천 1.5% 를 함유하고, 6N NaOH 로 pH 7.2 로 조정후, 120 ℃, 20 분간 살균한 배지) 에 생육한 스트렙토 마이세스 sp. TH1 을 백금이로 식균하고, 28℃, 3 일간 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 수득된 균체를 10 ml 의 10.3% 수크로스 용액으로 세정후, 6 ml 의 TS [10.3 % 수크로스, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA] 로 현탁하고, 리소자임 용액 (50 mg/ml, TS) 1 ml 을 가하고, 37 ℃, 60 분간 배양하였다.
이이서, 이 리소자임 처리액에 프로티나아제 K (시그마사제) 용액 (2mg/ml TS) 0.6 ml을 가하여 부드럽게 혼합하고, 다시 3.6 ml 3.3 % (w/v) SDS 용액을 부드럽게 혼합하면서 가하고 37 ℃, 60 분간 배양하였다. 이 혼합액을 50 ℃, 30 분간 가열후 수냉하고, TE [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] 포화 페놀/클로로포름 (1/1, v/v) 을 등량 가하고, 30 분간 부드럽게 진탕하였다. 원심분리후, 상층을 취하여, 재차 TE 포화 페놀/클로로포름에 의한 추출 조작을 하고, 원심분리후, 수득된 상층에 등량의 클로로포름을 가하고, 혼합 후 재차 원심분리하였다.
상층을 취하여, 이 상층에 100 ℃, 10 분간의 가열처리를 한 RNaseA 수용액 (10 mg/ml)을 20 ㎕ 가하고, 37 ℃, 45 분간 배양하였다. 이 RNaseA 처리액에 1/10 용량의 5 M 식염수 및 1/4 용량의 50 % PEG 6000을 가하고, 부드럽게 혼합한 후, 빙냉하 하루밤 방치하였다. 이 혼합액을 12,000 rpm, 10 분간 원심분리후, 상등액을 완전히 버리고, 남은 침전을 5 ml 의 TE 에 용해시켰다. 1/10 용량의 3M 아세트산나트륨 용액 및 1/30 용량의 66 mM 염화마그네슘 용액을 가하여 혼합후, 2.2 배 용량의 냉에탄올을 가하여 부드럽게 혼합하였다. 이 혼합액을 10,000 rpm, 10 분간 원심분리후, 상등액을 버리고 수득된 침전을 70 % 냉에탄올로 2 회 세정하였다. 이 침전 (250 ??g 의 염색체 DNA 를 함유) 을 TE 에 용해시켜, 염색체 DNA 로 이후의 실험에 사용하였다.
(2) 스트렙토마이세스 sp. TH1 유래의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소 단백질의 부분 아미노산 서열의 결정
스트렙토마이세스sp. TH1 가 생산하는 L-프롤린 3 위치 수산화효소를 참고예 1 의 방법에 준하여 단리 정제하고, 이 정제효소 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 시마쓰세이사꾸쇼사제 단백질 서열분석기 모델 PPSQ-10을 사용하여 분석하고, 서열번호 5 로 표시되는 N-말단아미노산 서열을 결정하였다.
또한, 정제효소품에 용균성 엔도펩티다아제를 0.1M Tris-HCl, 4M Urea (pH9) 중에서, 37℃, 6 시간 작용시킨 후, HPLC 에 의해 펩티드단편을 취득하고, 그 아미노산 서열을 동일하게 분석함으로써, 서열번호 6 및 7 로 표시되는 내부 아미노산 서열을 결정하였다.
(3) L-프롤린 3 위치 수산화 효소 유전자의 부분 DNA 의 조제
서열번호 5 기재의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1 ∼ 6 에 대응하는 서열번호 8 기재의 센스사슬 믹스 DNA 프라이머와, 서열번호 5 기재의 아미노산 서열의 아미노산 번호 24 ∼ 28 에 대응하는 서열번호 9 기재의 안티센스 사슬믹스 DNA 프라이머를 어플라이드 바이오시스템 사제 380A·DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.
이 합성 DNA를 프라이머로하고스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하였다. PCR 을 퍼킨엘머사제 DNA Thermal Cycler 480 을 사용하여 실시하였다. 반응은 이하의 조성의 반응액 20 ㎕ 을 사용하여 실시하였다.
반응액조성 :스트렙토마이세스sp. TH1 염색체 DNA 21 ng/㎕, 센스사슬믹스 DNA 프라이머 및 안티센스 사슬믹스 DNA 프라이머 각 10 μM, Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE 사제) 0.125U/㎕, DMSO 10 %, Tris-HCl (pH8.2) 20mM, KCl 10mM, 황산암모늄 6mM, 염화마그네슘 2mM, Triton X-100 0.1%, 소혈청 알부민 10 ng/㎕.
반응은 95 ℃, 5 분간의 배양후, 95 ℃ ∼ 0.5 분간, 25 ℃ ∼ 0.5 분간, 75 ℃ ∼ 1 분간의 배양 공정을 40 회 반복하였다. 반응액을 15 % 폴리아크릴아미드겔 (아토(주)제, 파젤 NPu-15L) 전기영동에 걸은 후, 증폭한 83 bp 의 밴드를 닛뽕에이도(주)제의 다빈치군 (펜타치디카바리 NB-7000 형) 을 사용하여 회수하였다.
회수한 83 bp 의 DNA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 8 기재의 센스사슬믹스 DNA 와 서열번호 5 기재의 아미노산 서열의 아미노산번호 21 ∼ 25 에 대응하는 서열번호 10 기재의 안티센스 사슬믹스 DNA 를 프라이머로 하여, 재차 상기와 동일하게 PCR 을 실시하고, 증폭된 74 bp 의 밴드를 회수하였다. 회수한 단편을 팔마시아사제 Sure 클론 라이게이션 키트를 사용하여 pUC18 의 SmaI 부위에 삽입하고, 어플라이드 바이오시스템사의 염기 서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 그의 염기 서열을 결정하였다.
결정된 염기 서열을 서열번호 11 및 서열번호 12 에 표시하였다. 2 종류의 염기 서열이 결정되고, 서열번호 11 의 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열은, 서열번호 5 기재의 정제효소의 N 말단아미노산 서열과, N 말단아미노산 서열로 결정할 수 없었던 2 번째의 아미노산을 제외하고 완전히 일치하였다. 또 서열번호 12 의 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 서열번호 5 기재의 정제효소의 N 말단 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타낸다.
실시예 2 L - 프롤린 3 위치 수산화 효소유전자를 함유하는 DNA 단편의 취득
(1) DIG 화 탐침의 제작
실시예 1 (3) 에서 취득한 서열번호 11 및 서열번호 12 로 표시된 2 종류의 74bp 의 단편을 각각 pUC18 의 SmaI 부위에 삽입하고, 수득된 2 종류의 플라스미드를 주형으로 하고, 각각에 관하여 서열번호 8 기재의 센스사슬 합성 DNA 와 서열번호 10 기재의 안티센스사슬합성 DNA를 각 10 μM 함유하는 반응액 50 ㎕을 사용하여 실시예 1 (3) 과 동일한 조작에 의해 PCR 을 실시하였다. 이 반응액을 각각 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 걸어, 각각에 관하여 74 bp 의 증폭단편의 생성을 확인하고, 겔로부터 실시예 1 (3) 과 동일한 조작에 의해 이 증폭 단편을 회수하였다.
이 74 bp 단편의 디그옥시게닌 (Digoxigenin, DIG) 화는 뵈링거 만하임사제 PCR DIG 표지 키트를 사용하여 실시하였다.
회수된 이 2 종류의 74 bp 단편을 주형으로 하고, 각각에 관하여 Pfu DNA 폴리머라제 (STRATAGENE사) 2.5 U, Pfu DNA 폴리머라제용 × 10 완충액 (STRATAGENE사) 5 ㎕, DMSO 5 ㎕, ×10 PCR DIG 믹스 (뵈링거 만하임사제) 5 ㎕, 서열번호 8 기재의 센스사슬합성 DNA 와 서열번호 10 기재의 안티센스사슬합성 DNA를 각 10 μM 함유하는 반응액 50 ㎕ 을 사용하여 PCR 을 실시하였다.
반응은 95 ℃, 5 분간의 배양후, 95 ℃ - 0.5 분간, 50 ℃ - 0.5 분간, 75 ℃ - 1 분간의 배양공정을 40 회 반복하고, 각각 12.5 % 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 걸어, 각각에 관하여 74 bp 의 증폭 단편의 생성을 확인하고, 겔로부터 실시예 1 (3) 과 동일한 조작에 의해, 이 증폭 단편을 회수하고, 이 2 종류의 증폭 단편을 탐침으로서 사용하였다. 이하 서열번호 11 에 표시된 염기 서열 유래의 탐침을 탐침 A, 서열번호 12 에 표시된 염기 서열 유래의 탐침을 탐침 B 라고 부른다.
(2) 서던 혼성화
스트렙토마이세스sp. TH1 의 염색체 DNA 20 ㎍ 에, 제한효소 PstI (다까라슈조사제) 20 U 를 첨가하여, 37℃, 2 시간 반응시키고, 이 DNA 를 절단후, 이 DNA 를 아가로스 겔 전기 영동에 걸었다.
실시예 2 (1) 에서 수득된 탐침 A 를 사용하여 뵈링거 만하임사제의 DIG 형광 검출 키트를 사용하여 첨부한 설명서 기재의 방법에 따라 서던 혼성화를 실시하였다.
즉, 아가로스겔 전기영동후, 아가로스겔을 0.25 N 염산중에서 20 분간 완만하게 진탕하고, 아토사제 디에노피레이타펌프 AE-6680P 및 아토사제 디에노피레이타 AE-6680C를 사용하여 7.5 mmHg 로 흡인하면서, 0.4 M 수산화나트륨 용액중에서 Hybond-N+막 (에머샴사제) 에 블로팅하였다. 블로팅후, 막을 바람에 건조시켰다. 이와같이 수득된 막을 DIG 형광 검출 키트의 혼성화 완충액 [포름아미드 50 % v/v, 블로킹시약 2 %, N-라우릴살르크신 0.1 % (w/v), SDS 0.02 % (w/v) 를 5 배 농도의 SSC (1 배 농도의 SSC 의 조성은 150 mM 의 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨이다) 중에 함유된 용액] 10 ml 중에 42 ℃, 1 시간 침지한 후, 탐침용액 [실시예 2 (1)에서 수득한 탐침 A 3 ㎕ 을 200 ㎕ 의 혼성화 완충액에 첨가하고, 95 ℃, 2 분간 처리후, 혼성화 완충액을 첨가하여, 1.5 ml 에 조제한 것] 중에, 42 ℃, 하루밤 침지하였다. 이 막을 또 0.1 % SDS 를 함유하는 2배 농도의 25 ml SSC 로 실온에서 5 분간씩 2회 세정후, 0.1 % SDS 를 함유하는 0.1 배 농도의 25ml SSC 로 68 ℃에서 15 분간씩, 2 회 세정하였다.
이 막을 세정 완충액 [0.3 % w/v Tween - 20을 함유하는 버퍼 1 (0.1 M 말레산, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.5)] 으로 실온에서 1 ∼ 5분, 50 ml 의 완충액 2 (1 % 블록킹 시약을 함유하는 완충액 1) 로 실온에서 30 분간, 1 ㎕ 의 anti- digoxigenin-AP Fab 를 함유하는 10 ml 의 완충액 2 로 실온에서 30 분간, 50 ml 의 완충액 2 로 실온에서 30 분간씩 2 회, 10 ml 의 완충액 3 (0.1 M Tris-Hcl, 0.1 M 염화나트륨, 50 mM 염화마그네슘, pH 9.5) 로 실온 2 ∼ 5 분, 루미겐 (Lumigen) PPD 50 ㎕ 을 함유하는 5 ml 완충액 3 으로 실온에서 5 분간, 순차적으로 처리한 후, 여지위에서 재빨리 수분을 제거하고, 사란랩(폴리비닐리덴 클로라이드 필름)에 싼 후 37 ℃, 15 분간 정치하였다. 이것을 Hyperfilm-ECL (에머샴사제) 를 사용하여 실온에서 30 분간 노광하였다.
약 6 kb 의 위치에 탐침과 혼성화하는 DNA 단편을 검출하였다.
또한, 이 실시예 2 (2) 와 같은 조작을 실시예 2 (1) 에서 수득한 탐침 B를 사용하고, 또 제한효소 PstI 를 사용하는 대신에 KpnI (다까라슈조사제) 20 U를 사용하여 실시하고, 약 5 kb 의 위치에 탐침과 강하게 혼성화하는 DNA 단편을 검출하였다.
(3) 염색체 DNA 의 분획
스트렙토마이세스sp. TH1 의 염색체 DNA 20 ㎍ 에, 제한효소 PstI (다까라슈조사제) 20 U 를 첨가하고, 37 ℃, 2 시간 반응시켜, 이 DNA 를 절단후, 등량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 가하여 혼합하였다. 원심분리후, 상층을 취하여, 2.2 배 용량의 냉에탄올을 가하고, 부드럽게 혼합하였다. 10,000 rpm, 10 분간 원심분리하고 상등액을 버린후, 침전을 70 % 냉에탄올로 2 회 세정하고, 에탄올 침전을 수득하였다. 이 후 TE 포화 페놀/클로로포름, 냉에탄올을 사용하여 에탄올 침전을 얻는 조작을 에탄올 침전법이라고 부른다. 이 에탄올 침전을 120 ㎕ TE 에 용해하고, 아가로스겔 전기 영동에 걸었다. 영동후, 6 kb 부근의 DNA 분획을 Prep-A-gene (바이오라드사제)를 사용하여 아가로스겔로부터 추출정제하여, 약 0.5 ㎍ 의 PstI-절단 염색체 DNA 분획을 수득하였다.
또한, 이 실시예 2 (3) 과 같은 조작을 제한효소 PstI 을 사용하는 대신에 KpnI 20 U 를 사용하여 실시하고, 약 5 kb 부근의 KpnI 절단 염색체 DNA 분획을 약 0.5 ㎍ 수득하였다.
(4) 플라스미드 라이브러리의 제작
① pBluescriptII KS (+) (STRATAGENE 사) 1 ㎍을 제한효소 PstI (다까라슈사제)를 사용하여 절단후, 다까라슈조사제의 알칼리포스포타아제 [Alkaline Phosphatase (소내장)] 을 사용하여, 첨부한 설명서 기재의 방법에 따라 탈인산화 반응을 실시하였다. 반응후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전을 수득하였다. 이 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 이와 같이 해서 수득한 PstI 절단 pBluescript II KS(+) DNA 와 실시예 2 (3)에서 수득한 PstI-절단 염색체 DNA 0.1㎍ 을 라이게이션키트 (다까라 라이게이션 키트, 다까라슈조사제) 를 사용하여 26 ℃, 2.5 시간 반응시켜, 연결하였다. 이 연결 DNA를 사용하여 상법에 따라서 E. Coli XL 2-Blue를 형질전환후, 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포하고, 37 ℃에서 하루밤 배양하고, 약 240 개의 콜로니를 수득하였다.
② pBluescript II KS(+) (STRATAGENE사) 1 ㎍ 을 제한효소 KpnI (다까라슈조사제)를 사용하여 다까라슈조사제의 알칼리포스파타아제 [Alkaline Phosphatase (소내장)]을 사용하여 첨부한 설명서 기재의 방법에 따라 탈인산화 반응을 시켰다. 반응후 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전을 수득하였다. 이 침전을 5 ㎕ 의 TE 에 용해하였다. 이와같이 수득한 KpnI-절단 pBluescript II KS(+)DNA 와 실시예 2 (3) 에서 수득한 KpnI-절단 염색체 DNA 0.1 ㎍ 을 라이게이션키트 (다까라 라이게이션 키트, 다까라슈조사제) 를 사용하여 26 ℃, 2.5 시간을 반응시키고, 연결하였다. 이 연결 DNA 를 사용하여 상법에 따라 E. Coli XL2-Blue를 형질전환후, 이 형질전환체를 50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포하고, 37 ℃에서 하루밤 배양하고, 약 200 개의 콜로니를 수득하였다.
(5) 목적 클론의 선택
상기 콜로니중에서 목적으로 하는 클론을 갖는 콜로니를 이하와 같이 선택하였다.
LB 한천배지상에 출현한 콜로니를 5 배 농도의 SSC 로 세정한 나일론막 (Schleicher & Schull 사제 나일론막 Nytran) 에 옮긴 후, 그 막을 0.5 M 수산화나트륨을 염색시킨 여과지위에 5분간 정치하였다. 계속해서 1.0M Tris-HCl (pH 8.0) 을 염색시킨 여과지위에 5 분간 정치하고, 또 1.5M 염화나트륨 - 1.0M Tris-HCl (pH8.0) 을 염색시킨 여과지위에 5분간 정치하고 2배 농도의 SSC 로 가볍게 씻은 후, 자외선 (120mJ/㎠) 에 의해서 가교결합시켰다. 이어서, 0.1% SDS 를 함유하는 2배 농도의 SSC 로 막표면을 닦아낸 후, 바람에 건조시켰다.
실시예 2 (1) 에서 수득한 DIG 화 탐침을 사용하여, 베링거 만하임사제의 DIG 형광 검출 키트를 사용하여 실시예 2 (2) 기재의 방법에 따라 검출하였다.
실시예 2 (4) ① 에서 취득한 약 240 개의 콜로니와 실시예 2 (1) 에서 취득한 탐침 A 와의 콜로니 혼성화에 의해, 목적으로 하는 클론을 갖는 양성 콜로니를 1 개, 실시예 2 (4) ② 에서 취득한 약 200 개의 콜로니와 실시예 2 (1) 에서 취득한 탐침 B 와의 콜로니 혼성화에 의해 목적으로 하는 클론을 갖는 양성 콜로니를 5 개 검출하였다.
이 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 pTH30, pTH71 및 pTH75를 취득하였다.
이 플라스미드의 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다. pTH30 은 pBluescriptⅡKS(+) 의 PstI 부위에 약 6kb 의 PstI 절단 DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있고 (도 1), pTH71 및 pTH75 는 pBluescriptⅡKS(+) 의 KpnI 부위에 약 5kb 의 KpnI 절단 DNA 단편이 각각 반대 방향으로 삽입된 구조를 갖고 있었다 (도 2).
(6) 염기서열의 결정
① 플라스미드 pTH30 에 관하여, 다까라 슈죠사제 킬로시퀀스용 결실(deletion) 키트를 사용하여 여러가지의 결실돌연변이 플라스미드를 만들었다. 구체적인 시약 및 방법은 키트에 첨부된 설명서에 따랐다. 이 결실 플라스미드의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템사의 염기서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 분석하고 서열번호 13 에 표시한 1081 bp 의 KpnI-EcoRI 단편의 염기서열을 결정하였다.
이 염기서열에는 서열번호 1 에 표시된 290 아미노산 잔기로부터 구성되는 단백질을 코드하는 서열번호 3 에 표시한 염기서열이 존재하고 있었다. 이 아미노산 서열중에는 정제 L-프롤린 3위치 수산화효소를 사용하여 결정된 서열번호 5 에 표시되는 N말단 아미노산 서열, 서열번호 6 및 7 에 표시되어있는 내부 아미노산 서열이 함유되어 있고, 취득한 약 6kb 의 PstI 단편중에 목적으로 하는 L-프롤린 3위치 수산화효소 유전자가 존재하는 것이 확인되었다. 이후, 이 유전자를 L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자라고 부른다.
② 플라스미드 pTH71 및 pTH75 의스트렙토마이세스유래 삽입 단편말단의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템사의 염기서열 결정 키트 (Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit) 를 사용하여 분석하였다. 이 분석에 의해 수득된 염기서열을 바탕으로 시퀀스용 프라이머를 어플라이드 바이오시스템사의 380A.DNA합성기를 사용하여 합성하고, 이 프라이머를 사용하여 pTH71 및 pTH75 의스트렙토마이세스유래 삽입 단편의, 또한 하류의 염기서열을 해석하였다. 이 해석에 의해 수득된 염기서열을 바탕으로 시퀀스용 프라이머를 합성하고, 이 프라이머를 사용하여 또 하류의 염기서열을 해석하였다. 이 염기서열해석 조작을 반복함으로써 서열번호 14 에 표시한 NruI-KpnI 단편 1826bp 의 서열을 결정하였다.
이 염기서열에는 서열번호 2 에 표시된 290 아미노산 잔기로부터 구성되는 단백질을 코드하는 서열번호 4 에 표시한 염기서열이 존재하고 있었다. 서열번호 4 에 표시한 염기서열중에는 서열번호 12 에 표시한 서열이 존재하였다. 또한, 이 서열번호 4 에 표시한 염기서열은 L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자와 78.5%의 상동성을 나타내었다. 이후 서열번호 4 에 표시한 유전자를 L-프롤린 3위치 수산화효소 II형 유전자라고 부른다.
실시예 3 L-프롤린 3위치 수산화효소 발현 플라스미드의 구축
① L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자 발현 플라스미드의 구축
실시예 2 에서 수득된 플라스미드 pTH30 을 제한효소 EcoRI 으로 절단하고 다까라 슈죠사제 라이게이션 키트를 사용하여 셀프라이게이션시켰다. 이 셀프라이게이션에 의해 수득된 DNA 를 사용하여 상법에 따라 E. coli XL1-Blue MRF' 균주를 형질전환시켰다. 이 형질전환균주로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다.
상기한 결과, L-프롤린 3위치 수산화효소 유전자의 3'측에 존재하는 약 3 kb 의 EcoRI 단편이 제거된 플라스미드 pTH40 을 취득하였다 (도 1).
이어서, 플라스미드 pTH40 을 KpnI 및 SmaI 으로 절단하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자를 함유하는 약 0.95 kb 의 단편을 확인한 후, 아가로스 겔로부터 상법에 따라 이 단편을 회수하였다. 이 KpnI-SmaI 절단 단편을 pBluescriptⅡKS(+) 의 KpnI-SmaI 절단부위에 다까라 슈조사제의 라이게이션 키트를 사용하여 삽입하고, 이 DNA 를 사용하여 상법에 따라 E. coli XL1-Blue MRF' 주를 형질전환시켰다. 이 형질전환체를 50㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 37℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. 생육되어진 이 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다.
상기한 결과,lac프로모터의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자를 코드하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTH50 (도 3) 을 수득하였다.
② L-프롤린 3위치 수산화효소 II형 유전자 발현 플라스미드의 구축
실시예 2 에서 수득된 플라스미드 pTH75 를 제한효소 NruI 과 SacI 으로 절단하고, L-프롤린 3위치 수산화효소 II형 유전자를 함유하는 약 1900 bp 의 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로 회수하였다. 이 NruI-SacI 절단 단편을 pBluescriptⅡKS(+) 의 HincII-SacI 절단부위에 다까라 슈조사제의 라이게이션 키트를 사용하여 삽입하고, 이 DNA 를 사용하여 상법에 따라 E. coli XL2-Blue MRF' 주를 형질전환시켰다. 이 형질전환체를 50㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 37℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. 생육되어진 이 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다.
상기한 결과,lac프로모터의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 3위치 수산화효소 II형 유전자를 코드하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pEX1-5 (도 4) 를 수득하였다.
실시예 4 형질전환체에 의한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생산
① L-프롤린 3위치 수산화효소 I형 유전자를 함유하는 형질전환체에 의한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생산
실시예 3 에서 수득한 플라스미드 pTH50 을 사용하여 E. coli ATCC 12435 를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체를 각각 50㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 3ml 의 LB 배지에 식균하여 30℃ 에서 하룻밤동안 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여, 수득된 균체를 -20℃에서 동결시켰다.
이 동결균체를 용해후, 반응액 [200mM 의 TES 완충액 (pH7.5) 중에 12 mM L-프롤린, 24mM 2-케토글루타르산, 4mM 의 황산제1철, 8mM 의 L-아스코르브산을 함유하는] 250㎕ 에 습균체량으로서 4 % (w/v) 로 되도록 가하고, 35 ℃ 에서 10 분간 반응시켰다. 반응액을 100℃ 에서 2 분간 가열함으로써 반응을 정지시켰다.
이 반응 정지액을 원심분리하고, 수득된 상등액 100㎕ 에, 0.3 M 붕산 완충액 (pH 10.7) 100㎕, 10 % (v/v) 메르캅토에탄올 수용액 4㎕ 및 5 % (w/v) o - 프탈알데히드의 에탄올 용액 16㎕ 을 첨가하여 60 ℃에서 30 초 방치후, 2 % (w/v) NBD 의 에탄올 용액 50㎕ 을 가하여 60℃ 에서 40 분간 반응시켰다. 이 반응액에 1N 염산 30㎕ 을 가하여 반응을 정지시켰다. 이 반응 정지액을 원심분리후, 필터여과하고, 침전을 제거한 후, 고속액체크로마토그래피에 의해 분석을 하고, 생성된 시스-3-히드록시-L-프롤린을 정량하였다.
고속 액체크로마토그래피는 이하의 조건으로 실시하였다.
이동상 : 10 mM 시트르산 (pH 4.0) / 메탄올 = 3/1 (v/v)
유속 : 1 ml/분
칼럼 : YMC Pack ODS AQ-312 (YMC 사제, 6 × 150 mm)
칼럼온도 : 50 ℃
검출 : 형광검출, 여기 파장 503 nm, 형광파장 541 nm.
표 1 에 표시한 바와 같이 형질전환체 E.coli ATCC 12435/pTH50 은 유전자원으로서 사용한스트렙토마이세스sp. TH1 주와 비교하여, 균체당 약 34 배의 L-프롤린 3 위치 수산화 효소를 생산하고 있다.
형질전환체가 생산하는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 활성
균주 균체활성1) 상대활성2)
E.coliATCC12435/pTH50 1.94 34.0
E.coliATCC12435/pBluescriptIIKS(+) 검출되지 않음 -
스트렙토마이세스 sp. TH13) 0.057 1
1) 균체활성은 습균체 1mg 당 효소 활성 (U/mg 습균체) 로 표시하였다. 1U 는 1 분간당 1nmol 의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소 활성으로 하였다.
2) 상대 활성은스트렙토마이세스sp. TH1 주가 생산하는 효소 활성을 1 로서 표시하였다.
3) 참고예 2 에 기재
② L-프롤린 3위치 수산화효소 II형 유전자를 함유하는 형질전환체에 의한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생산
실시예 3 에서 수득한 플라스미드 pEX1-5 를 사용하여, E.coli ATCC12435 를 형질전환하였다. 수득된 형질전환체를 각각 50㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 3ml TB 배지에 식균하여 30℃에서 하룻밤동안 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 취득하였다. 이 집균체는 필요에 따라 -20℃에서 동결보존하고, 사용시에 해동하여 사용하였다. 이 집균체를 반응액 [200mM 의 TES 완충액 (pH7.5) 중에 25mM L-프롤린, 50mM 2-케토글루타르산, 4mM 황산제1철 및 8mM C-아스코르브산을 함유] 500㎕ 에 습균체량으로서 2.2% (w/v) 로 되도록 가하고, 35℃에서 15분간 반응시켰다. 반응액을100℃에서 2분간 가열함으로써 반응을 정지시켰다.
이 반응정지액을 원심분리하여 수득된 상등액 100㎕ 에 0.3M 붕산완충액 (pH10.7) 100㎕, 10 %(v/v) 메르캅토에탄올 수용액 4㎕ 및 5% (w/v) o-프탈알데히드 (OPA) 의 에탄올 수용액 16㎕ 을 첨가하여 60℃에서 30초간 방치후, 용액을 중화시켰다. 이 조작으로 1급의 아미노산은 OPA화 되나, 2급 아미노산인 히드록시프롤린은 변형되지 않는다. 이와 같이 처리한 반응액을 고속액체크로마토그래피에 의해 분석을 한 바, 시스-3-히드록시-L-프롤린이 정제되어 있는 것이 판명되었다. 고속액체크로마토그래피는 이하의 조건으로 실시하였다.
이동상 : 1mM 황산동 수용액
유속 : 1ml/분
칼럼 : 스미키랄 OA-5000 (스미까가가꾸분세끼 서비스 사제, 4.6 X 250 mm)
칼럼온도 : 38℃
상기 조건으로 광학분할한 용리액을 온라인으로 이하의 조건하에서 반응액과 혼합하여 반응조 CRB-6A (시마쓰 사제) 로 NBD 화를 실시하고 형광에 의해서 NBD화 2급 아미노산을 정량하였다.
반응액 및 첨가량 :
300mM 붕산, 25mM EDTA 수용액 (pH9.6) - 0.2ml/분
1g/ℓ NBD 메탄올 용액 - 0.5ml/분
반응온도 : 60℃
검출 : 형광검출, 여기파장 503nm, 형광파장 541nm
표 2 에 표시한 바와 같이 형질전환체 E. coli ATCC12435/pEX1-5 는 유전자원으로서 사용한스트렙토마이세스sp. TH1 주와 비교하여 균체당 약 77 배의 L-프롤린 3위치 수산화효소를 생산하고 있었다.
형질전환체가 생산하는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 활성
균주 균체활성1) 상대활성2)
E.coliATCC12435/pEX1-5 4.42 77.5
E.coliATCC12435/pBluescriptIIKS(+) 검출되지 않음 -
스트렙토마이세스 sp. TH13) 0.057 1
1) 균체활성은 습균체 1mg 당 효소 활성 (U/mg 습균체) 로 표시하였다. 1U 는 1 분간당 1nmol 의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소 활성으로 하였다.
2) 상대 활성은스트렙토마이세스sp. TH1 주가 생산하는 효소 활성을 1 로서 표시하였다.
3) 참고예 2 에 기재
실시예 5 β-갈락토시다아제 단백질과의 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축
(1) pTH60 플라스미드의 구축
pTH40 DNA 4㎍ 을 MluI 으로 절단한 후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 에탄올 침전물을 36㎕ 의 TE 에 용해후, 다까라슈죠 사제 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여, 이 DNA 의 양말단을 블런트화하였다. 이 DNA 단편을 에탄올 침전법에 의해 회수하였다. 이 DNA 를EcoRI 으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동에 걸어 아가로스 겔로부터 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자를 함유하는 약 1 kb 의 단편을 상법에 의해 추출하고 Prep-A-gene (바이오라드 사제) 를 사용하여 회수하였다. 이 DNA 단편을 10㎕의 TE 용액에 용해시켰다.
한편, 플라스미드 pBluescriptⅡKS(+) DNA 2.4㎍을 ApaI 으로 절단하고 아가로스 겔 전기영동후, DNA 단편을 겔로부터 상법에 의해 회수, 정제하였다. 다까라슈죠 사제 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여, 이 DNA 의 양말단을 블런트화하고, EcoRI 으로 절단후 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 에탄올 침전물을 5㎕의 TE 용액에 용해시켰다.
상기에서 수득된 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자를 함유하는 약 1 kb 의 MluI-EcoRI 단편을 ApaI-EcoRI 처리한 pBluescriptⅡKS(+) 에 다까라슈죠 사제의 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다. 이 연결 DNA 를 사용하여 상법에 따라 E. coli XL1-Blue MRF' 주에 형질전환하고, 이 형질전환체를 50㎍/ml 의 암피실린을 함유한 LB 한천배지에 도포후, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 생육되어진 이 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 절단법에 의해 확인하였다.
상기한 결과,lac프로모터의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자가 β-Gal 의 N-말단 아미노산 서열과 융합된 형태로 삽입된 플라스미드, pTH60 을 수득하였다 (도 5). 구축한 융합 단백질의 아미노산 서열을 DNA 의 연결부분에 새로이 생성된 알기닌 (22번째) 을통하여 β-Gal 의 N-말단 21 아미노산과 L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질이 융합된 구조를 갖고 있다. 단, L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질의 최초의 아미노산인 메티오닌 (GTG) 는 발린으로 번역된다. 융합단백질의 아미노산 서열을 서열번호 15 에 표시하였다.
(2) pTH70 플라스미드
pBluescriptⅡKS(+) DNA 2.4㎍을 AccI 으로 절단하고, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물 (DNA 단편) 을 수득하였다. 다까라슈조 사제 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여 이 DNA 단편의 양말단을 블런트화하고, EcoRI 으로 절단후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 에탄올 침전물을 5㎕의 TE 용액에 용해시켰다.
실시예 5 (1) 에서 수득한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자를 함유하는 약 1 kb 의 MluI-EcoRI 단편을 AccI-EcoRI 처리한 pBluescriptⅡKS(+) 에 다까라슈조 사제의 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다.
이 연결 DNA 를 사용하여, 상법에 따라 E. coli XL1-Blue MRF' 주를 형질전환시키고, 이 형질전환체를 50㎍/ml 의 암피실린을 함유한 LB 한천배지에 도포후, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 생육되어진 이 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 절단법에 의해 확인하였다.
상기한 결과,lac프로모터의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자가 β-Gal 의 N-말단 아미노산 서열과 융합된 형태로 삽입된 플라스미드, pTH70 을 수득하였다 (도 6). 구축한 융합 단백질의 아미노산 서열을 DNA 의 연결부분에 새로이 생성된 알기닌 (28번째) 을 통하여 β-Gal 의 N-말단 27 아미노산과 L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질이 융합된 구조를 갖고 있다. 단, L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질의 최초의 아미노산인 메티오닌 (GTG) 는 발린으로 번역된다. 융합단백질의 아미노산 서열을 서열번호 16 에 표시하였다.
(3) pTH80 플라스미드의 구축
pTH40 DNA 4㎍ 을 MluI 으로 절단한 후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 에탄올 침전물을 36㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 다까라슈죠 사제 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여, 이 DNA 의 양말단을 블런트화하고, SacII 로 절단후, 아가로스 겔 전기영동에 걸었다. 전기영동후, L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자를 함유하는 약 0.95 kb 의 단편을 상법에 의해 추출하고 Prep-A-gene (바이오라드 사제) 에 의해 회수하고, 10㎕의 TE 용액에 용해시켰다.
한편, 플라스미드 pBluescriptⅡKS(+) DNA 2.4㎍을 PstI 으로 절단후, 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 DNA 단편을 36㎕ 의 TE 에 용해시키고 다까라슈죠 사제 다까라 DNA 블런팅 키트를 사용하여, 이 DNA 의 양말단을 블런트화하고, SacII 으로 절단후 에탄올 침전법에 의해 에탄올 침전물을 수득하였다. 이 에탄올 침전물을 5㎕의 TE 용액에 용해시켰다.
상기에서 수득된 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자를 함유하는 약 1 kb 의 MluI-SacII 단편을 PstI-SacII 처리한 pBluescriptⅡKS(+) 에 다까라슈죠 사제의 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다.
이 연결 DNA 를 사용하여, 상법에 따라 E. coli XL1-Blue MRF' 주에 형질전환하고, 이 형질전환체를 50㎍/ml 의 암피실린을 함유한 LB 한천배지에 도포후, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 생육되어진 이 형질전환체의 콜로니로부터 상법에 따라 플라스미드를 추출하고 그 구조를 제한효소 절단법에 의해 확인하였다.
상기한 결과,lac프로모터의 전사방향과 같은 방향으로 L-프롤린 3위치 수산화효소의 구조유전자가 β-Gal 의 N-말단 아미노산 서열과 융합된 형태로 삽입된 플라스미드, pTH80 을 수득하였다 (도 7). 구축한 융합 단백질의 아미노산 서열을 DNA 의 연결부분에 새로이 생성된 알기닌 (38번째) 을 통하여 β-Gal 의 N-말단 37 아미노산과 L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질이 융합된 구조를 갖고 있다. 단, L-프롤린 3위치 수산화효소 단백질의 최초의 아미노산인 메티오닌 (GTG) 는 발린으로 번역된다. 융합단백질의 아미노산 서열을 서열번호 17 에 표시하였다.
실시예 6 융합단백질 발현 플라스미드를 함유하는 형질전환체에 의한 L-프롤린 3 위치 수산화효소의 생산
실시예 5 에서 수득한 플라스미드 pTH60, pTH70 및 pTH80 을 사용하여 E. coli ATCC12435를 형질전환시켰다. 실시예 4 에 준한 방법으로 수득된형질전환체의 배양 및 이 형질전환체의 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생산성을 조사하였다.
표 3 에 표시한 바와 같이, 이 형질전환체는 유전자원으로서 사용한스트렙토마이세스sp. TH1 주와 비교하여 균체당 46 - 121 배의 L-프롤린 3위치 수산화효소를 생산하였다.
형질전환체가 생산하는 L-프롤린 3 위치 수산화 효소의 활성
균주 균체 활성1) 상대 활성2)
E. coli ATCC12435/pTH60E. coli ATCC12435/pTH70E. coli ATCC12435/pTH80E. coli ATCC12435/pBluescriptⅡKS(+)스트렙토마이세스 sp. TH13) 5.196.902.63검출되지 않음0.057 91.1121.146.1-1.0
1) 균체활성은 습균체 1mg 당 효소 활성 (U/mg 습균체) 로 표시하였다. 1U 는 1 분간당 1nmol 의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성하는 효소 활성으로 하였다.
2) 상대 활성은스트렙토마이세스sp. TH1 주가 생산하는 효소 활성을 1 로서 표시하였다.
3) 참고예 2 에 기재
실시예 7 형질전환체에 의한 시스-3-히드록시-L-프롤린의 생산
(1) 형질전환체 E. coli ATCC12435/pTH70 을 사용한 시스-3-히드록시-L-프롤린의 생산
실시예 6 에서 수득된 형질전환체 E. coli ATCC12435/pTH70 을 사용하여 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생산하였다.
이 형질전환체를 암피실린 100㎍/ml 을 함유하는 3ml TB 배지 (박토 트립톤 12g, 박토 효모추출물 24g, 글리세롤 4g, 인산1칼륨 2.3g, 인산2칼륨 12.5g 을 증류수 1ℓ 에 함유시키고, 120℃에서 20분간 멸균) 에 식균하고, 30℃에서 16시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 수득된 상등액중의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 정량하였다.
그 결과, E. coli ATCC12435/pTH70 의 배양액 상등액중에 620μM (81.2 mg/ℓ) 의 시스-3-히드록시-L-프롤린이 생성되었다. 한편, 숙주로서 사용한 E. coli ATCC12435 의 배양액 상등액중에는 시스-3-히드록시-L-프롤린이 검출되지 않았다.
(2) 형질전환체 E. coli ATCC12435/pTH70 을 사용한 시스-3-히드록시-L-프롤린의 생산
형질전환체 E. coli ATCC12435/pTH70 을 암피실린 100㎍/ml 을 함유하는 50ml MED4 배지에 식균하고, 30℃에서 16시간 진탕배양하였다.
이 배양액을 종배양액으로 하고, 2 리터의 MED6 배지를 넣은 5 리터들이 단지 발효기(jar fermenter)에 식균하였다. 또 L-프롤린을 200mM, 암피실린을 100㎍/ml 로 되도록 첨가하고, 배양온도 30℃, 교반수 400 회전/분, 통기량 1 리터/배양액1리터/분의 조건으로 운전하였다.
배양중 글루코스는 없어지지 않도록, L-프롤린은 약 50 mM 로 되도록적시 첨가하고, NH4OH 를 사용하여 pH6.5 로 하한조정하였다.
이 배양액을 원심분리하여 수득된 상등액중의 시스-3-히드록시-L-프롤린을 정량한 바, 배양 72 시간에서 115mM (15g/ℓ) 의 시스-3-히드록시-L-프롤린이 E. coli ATCC12435/pTH70 의 배양액 상등액중에 생성, 축적되어 있었다.
한편, 숙주로서 사용한 E. coli ATCC12435 의 배양액 상등액중에는 시스-3-히드록시-L-프롤린이 검출되지 않았다.
실시예 8 형질전환균체를 사용한 L-프롤린으로부터 시스-3-히드록시-L-프롤린으로의 전환
실시예 6 에서 수득된 형질전환체 E. coli ATCC12435/pTH70 을 사용하여 L-프롤린을 시스-3-히드록시-L-프롤린으로 전환시켰다.
이 형질전환체를 50㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 10ml LB 배지에 식균하여 30℃에서 하룻밤동안 진탕배양하였다. 이 배양액 7ml 을 원심분리하여 균체를 취득하였다. 이 균체는 필요에 따라 -20℃에서 동결보존하고, 사용시에 해동하여 사용하였다. 이 균체를 반응액 [200mM 의 TES 완충액 (pH7.5) 중에 24mM L-프롤린, 24mM 2-케토글루타르산, 4mM 황산제1철 및 8mM L-아스코르브산을 함유] 500㎕ 에 습균체량으로서 10% (중량/부피) 로 되도록 가하고, 35℃에서 60분간 반응시켰다. 반응액중에 생성된 시스-3-히드록시-L-프롤린양을 정량한 결과 17.7mM (2.3g/ℓ) 의 시스-3-히드록시-L-프롤린이 생성되어 있었다.
참고예 1 L-프롤린 3위치 수산화 효소의 단리 및 정제
(1)스트렙토마이세스sp. TH1 의 동결균체의 제조
SR3 배지 (글루코스 1.0%, 전분 1.0%, 효모 추출물 0.5%, 트립톤 0.5%, 고기추출물 0.3% 및 인산마그네슘 0.05% 를 함유하고, 6N NaOH 로 pH7.2 로 조정한 배지) 를 시험관에 10 ㎖ 씩 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 HT 한천평판배지 (가용성 전분 1%, NZ 아민 0.2%, 효모추출물 0.1%, 고기추출물 0.1% 및 한천 1.5% 를 함유하고, 6N NaOH 로 pH7.2 로 조정한 배지) 에 생육한스트렙토마이세스sp. TH1 를 백금이로 식균하고, 28 ℃, 2 일간 진탕배양하고, 종 배양액으로서 사용하였다. 본 종 배양액을 다시 2 리터 삼각 플라스크에 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균한 200ml 의 SR3 배지에 식균하고, 28 ℃, 2 일간 진탕배양하였다. 이 배양액을 5 리터 단지 발효기에 분주한 2 리터의 Df3 배지 (가용성 전분 5%, 콘스팁리쿼 3.0%, 인산칼륨 0.05%, 황산마그네슘 7수염 0.05% 및 탄산칼슘 0.5% 를 함유하고, 6N NaOH 로 pH7.0 으로 조정한 배지) 에 무균적으로 접종하고, 700 rpm, 1 vvm 의 조건으로 28 ℃, 2 일간 진탕배양하였다. 배양중의 pH 는 무조정으로 실시하였다. 수득된 배양액을 15,000 x g, 10 분간 4 ℃ 에서 원심분리하고, 습균체를 배양액 1 리터당 75g 을 수득하였다. 습균체는 4℃에서 생리식염수로 세정하고, 원심분리후, 사용할 때까지 -80℃ 에서 동결보존하였다.
(2) 무세포 추출액의 조제
(1) 에서 수득한 동결균체 30 g 을 용해후, 200 ㎖의 완층액 (A) [1mM 의 디티오트레이톨 (DTT), 0.2 mM EDPA, 0.1% (v/v) 트윈 20 (Tween20) 및 10% (v/v) 글리세롤을 함유하는 20 mM 피페라진 완충액 (6N HCl 로 pH를 5.3 으로 조정)] 에 빙냉하 현탁하였다. 현탁액중의 균체를 빙냉하 초음파 파쇄하고, 4℃, 30,000 × g, 30 분간 원심분리한 후, 상등액을 수득하였다.
이 이후의 조작은 모두 빙냉하 내지는 4℃ 에서 실시하였다.
(3) 칼럼 크로마토그래피에 의한 단리 및 정제
(3)-1. 산처리
상기 공정에서 수득한 상등액의 pH를 6N 염산으로 4.5 로 조정후, 생긴 침전을 15,000g, 30분간 원심제거하여 상등액을 수득하였다.
(3)-2. 리소스 Q 칼럼크로마토그래피 (I)
상기 공정에서 수득한 상등액을 완충액 (A) 로 평형화한 팔마시아사 제의 리소스 Q 칼럼 (RESOURCETMQ, 6 ㎖) 에 부과하였다. 완충액 (A) 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 (A) 중에 만든 0 부터 0.3 M 사이에서의 식염의 직선농도구배를 사용하여 용출시켰다.
(3)-3. 리소스 Q 칼럼크로마토그래피 (II)
상기 공정에서 수득한 활성분획을 완충액 (B) [1mM DTT, 0.2mM EDTA 및 10% (v/v) 글리세롤을 함유하는 20 mM TES 완충액 (pH를 7.5 로 조정)] 으로 3 배 희석후, 완충액 (B) 으로 평형화한 팔마시아사 제의 리소스 Q 칼럼 (RESOURCETMQ,1㎖) 에 부과하였다. 완충액 (B) 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 (B) 중에 만든 0 부터 0.3 M 사이에서의 식염의 직선농도구배를 사용하여 용출시켰다.
(3)-4. 페닐 세팔로오스 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획에 식염을 2 M로 되도록 첨가용해시키고, 2 M 식염을 함유하는 완충액 (B) 로 평형화시킨 페닐 세팔로오스 칼럼 (Phenyl Sepharose HP HiLoad, 1㎖) 에 부과하였다. 2 M 식염을 함유하는 완충액 (B) 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 0.1% (v/v) 투윈 20 (Tween 20) 을 함유하는 완충액 (B) 를 사용하여 용출시켰다.
(3)-5. 리소스 Q 칼럼 크로마토그래피 (III)
상기 공정에서 수득한 활성분획을 완충액 (A) 로 평형화시킨 팔마시아사 제 PD-10 칼럼을 사용하여 탈염후, 완충액 (A) 로 평형화한 팔마시아사제의 리소스 Q 칼럼 (RESOURCETMQ, 1㎖) 에 부과하였다. 완충액 (A) 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 (A) 중에 만든 0 부터 0.3 M 사이에서의 식염의 직선농도구배를 사용하여 용출시켰다.
(3)-6. 리소스 Q 칼럼 크로마토그래피 (IV)
상기 공정에서 수득한 활성분획을 0.1% (v/v) 투윈 20 (Tween 20) 을 함유하는 완충액 (B) 로 3 배로 희석후, 완충액 (B) 로 평형화 시킨 팔마시아사 제의 리소스 Q 칼럼 (RESOURCETMQ, 1 ㎖) 에 부과하였다. 완충액 (B) 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 (B) 중에 만든 0 부터 0.3 M 사이에서의 식염의 직선농도구배를 사용하여 용출시켰다.
L-프롤린 3위치 수산화효소의 단리 및 정제의 개요를 표 4 에 종합하였다.
L-프롤린 3위치 수산화효소의 단리 및 정제의 개요
분획 총단백 (㎎) 총활성 (U) 활성비(U/㎎ 단백) 수득량 (%)
무세포 추출액 542 3540 6.5 100
pH 4.5 처리상등액 106 1800 17 56
리소스 Q(Ⅰ) pH 5.3 7.5 1553 207 44
리소스 Q(Ⅱ) pH 7.5 3.3 1036 306 29
페닐세팔로스 0.43 188 437 5.3
리소스 Q(Ⅲ) pH 5.3 0.16 90.5 566 2.6
리소스 Q(Ⅳ) pH 7.5 0.035 60.3 1723 1.7
참고예 2 스트렙토마이세스 sp.에 의한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 생산
SR3 배지를 시험관에 10 ㎖씩 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 HT 한천평판배지에 생육한스트렙토마이세스sp. TH1 를 백금이로 식균하고, 28 ℃, 2 일간 진탕배양하고, 종 배양액으로서 사용하였다.
한편, Df3 배지를 시험관에 10 ㎖ 씩 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 종 배양액 1 ㎖ 을 무균적으로 접종하고, 28 ℃, 2 일간 진탕배양하였다. 수득된 배양액을 8000 rpm, 10 분간 4 ℃ 에서 원심분리하였다. 수득된 균체를 80 mM TES [N-트리스(히드록시메틸) 메틸 2-아미노에탄술폰산] 완충액 (pH 7.5) 에 현탁하여 세정후, 원심분리하고 습균체를 수득하였다. 이 습균체 1.0 g 를 10 ㎖ 의 반응액 [5mM L-프롤린, 5mM α-케토글루타르산, 5mM L-아스코르브산, 1mM 황산제1철을 함유하는 100 mM TES 완충액 (pH 7.5) 에 나이민 용액 (나이민 S-215 (닛뽕유시 (주) 제) 4 g 을 크실렌 10 ㎖ 에 용해) 을 1.4 % (v/v) 첨가] 에 현탁하고, 30℃, 30 분간 반응시켰다. 반응후, 균체 반응액으로부터 균체를 원심분리 제거하고, 상등액 중에생성된 시스-3-히드록시-L-프롤린의 양을 정량하였다.
결과를 표 1 에 표시하였다.
[산업상의 이용가능성]
본 발명에 의하면, 의약품의 합성원료 또는 식품첨가물로서 유용한 시스-3-히드록시-L-프롤린을 공업적으로 제조하는 방법, 이 방법에 유용한 L-프롤린 3위치 수산화효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 L-프롤린 3위치 수산화효소의 제조법 및 이 효소를 제공할 수 있다.
서열표
서열번호 : 1
서열의 길이 : 290
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 단백질
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 1a]
[서열표 1b]
[서열표 1c]
서열번호 : 2
서열의길이 : 290
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 2a]
[서열표 2b]
[서열표 2c]
서열번호 : 3
서열의길이 : 870
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 게놈 DNA
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 3]
서열번호 : 4
서열의길이 : 870
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 게놈 DNA
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 4]
서열번호 : 5
서열의길이 : 29
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 펩티드
단편형 : N-말단 단편
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 5]
서열번호 : 6
서열의길이 : 25
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 펩티드
단편형 : 중간부 단편
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 6]
서열번호 : 7
서열의길이 : 25
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 펩티드
단편형 : 중간부 단편
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 7]
서열번호 : 8
서열의길이 : 17
서열유형 : 핵산
토폴로지 : 단일
서열의종류 : 다른 핵산, 합성 DNA
[서열표 8]
서열번호 : 9
서열의길이 : 14
서열유형 : 핵산
토폴로지 : 단일
서열의종류 : 다른 핵산, 합성 DNA
[서열표 9]
서열번호 : 10
서열의길이 : 14
서열유형 : 핵산
토폴로지 : 단일
서열의종류 : 다른 핵산, 합성 DNA
[서열표 10]
서열번호 : 11
서열의길이 : 74
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 다른 핵산, 합성 DNA
[서열표 11]
서열번호 : 12
서열의길이 : 74
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 다른 핵산, 합성 DNA
[서열표 12]
서열번호 : 13
서열의길이 : 1081
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 게놈 DNA
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 13]
서열번호 : 14
서열의길이 : 1826
서열유형 : 핵산
사슬의수 : 이중
서열의종류 : 게놈 DNA
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
[서열표 14a]
[서열표 14b]
서열번호 : 15
서열의길이 : 312
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 단백질
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
서열의특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 23..312
특징결정방법 : S
기원
생물명 :에스케리키아 콜리
직접의기원 : pBluescriptⅡKS+
서열의특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 1..21 (22 는 DNA 연결부)
특징결정방법 : S
[서열표 15a]
[서열표 15b]
서열번호 : 16
서열의길이 : 318
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 단백질
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
서열의특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 29..318
특징결정방법 : S
기원
생물명 :에스케리키아 콜리
직접의기원 : pBluescriptⅡKS+
서열의특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 1..27 (28 는 DNA 연결부)
특징결정방법 : S
[서열표 16a]
[서열표 16b]
[서열표 16c]
서열번호 : 17
서열의 길이 : 328
서열유형 : 아미노산
사슬의수 : 직쇄상
서열의종류 : 단백질
기원 :
생물명 :스트렙토마이세스sp.
균주명 : TH1
서열의 특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 33..328
특징결정방법 : S
기원
생물명 :에스케리키아 콜리
직접의기원 : pBluescriptⅡKS+
서열의특징
특징표시기호 : 펩티드
존재위치 : 1..37 (38 은 DNA 연결부)
특징결정한방법 : S
[서열표 17a]
[서열표 17b]
[서열표 17c]

Claims (19)

  1. 서열번호 1, 2, 15, 16 및 17 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 DNA.
  2. 서열번호 3, 4, 13 및 14 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA에서 선택되는 DNA.
  3. 제 1 항에 있어서, DNA 가 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 및 바실루스 (Bacillus) 속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물 유래인 DNA.
  4. 제 1 항에 있어서, DNA 가 스트렙토마이세스 카누스 ATCC12647, 스트렙토마이세스 카누스 ATCC12646, 스트렙토마이세스 sp. TH1 (FERM BP-4399), 바실루스 sp. TH2 (FERM BP-4397) 및 바실루스 sp. TH3 (FERM BP-4398) 에서 선택되는 미생물 유래인 DNA.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 갖는 단편을 벡터에 도입하여 얻은 재조합 DNA.
  6. 제 5 항에 기재된 재조합 DNA를 함유하는 형질전환체.
  7. 제 6 항에 있어서, 형질전환체가 에스케리키아 콜리 XL2-Blue/pTH30 (FERM BP-5026) 또는 에스케리키아 콜리 XL2-Blue/pTH75 (FERM BP-5409) 인 형질전환체.
  8. 서열번호 1, 2, 15, 16 및 17 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 단백질.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하여, L-프롤린 3위치 수산화효소를 생성 축적시켜, 이 배양물에서 L-프롤린 3위치 수산화효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 L-프롤린 3위치 수산화효소의 제조법.
  10. 제 9 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린을 첨가하는 것을 특징으로 하는 L-프롤린 3위치 수산화효소의 제조법.
  11. 제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하여, 시스-3-히드록시-L-프롤린을 생성 축적시켜, 이 배양물에서 시스-3-히드록시-L-프롤린을 채취하는 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  12. 제 11 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로부터 L-프롤린을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  13. 제 11 항에 있어서, 형질전환체가 배지중의 당원으로부터 2-케토글루타르산을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  14. 제 11 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린을 첨가하는 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  15. 제 11 항에 있어서, 배지 중에 L-프롤린, 2-케토글루타르산 및 2가 철이온을 첨가하는 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  16. 제 6 항 또는 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배양하여, 이 배양물, 균체 또는 균체처리물을 효소원으로 하여 2-케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하에, 배양액 중 또는 수성 매질 중에서, L-프롤린을 시스-3-히드록시-L-프롤린으로 변환시켜 생성된 시스-3-히드록시-L-프롤린을 이 배양물 또는 이 수성 매질로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  17. 제 16 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로부터 L-프롤린을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  18. 제 16 항에 있어서, 형질전환체가 배지 중의 당원으로부터 2-케토글루타르산을 생산하여 배양액 중에 축적하는 능력이 있는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
  19. 제 16 항에 있어서, 균체 처리물이 균체의 건조물, 균체의 동결건조물, 균체의 계면활성제 처리물, 균체의 효소 처리물, 균체의 초음파 처리물, 균체의 기계적 파쇄 처리물, 균체의 용매 처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물, 균체로부터 추출하여 수득되는 L-프롤린 3위치 수산화효소 활성을 갖는 효소, 이 효소의 정제품 및 이 효소의 고정화물에서 선택되는 균체 처리물임을 특징으로 하는 시스-3-히드록시-L-프롤린의 제조법.
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