JPH02119778A - ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子dna、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 - Google Patents

ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子dna、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法

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JPH02119778A
JPH02119778A JP63202779A JP20277988A JPH02119778A JP H02119778 A JPH02119778 A JP H02119778A JP 63202779 A JP63202779 A JP 63202779A JP 20277988 A JP20277988 A JP 20277988A JP H02119778 A JPH02119778 A JP H02119778A
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    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はロドコッカスsp、 (Rhodococcu
s sp、)N−774株由来であり、二1〜リル類を
対応するアミド類に変換する能力を有するニトリルヒド
ラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
DNA、これを含有する形質転換体によりニトリル類か
らアミド類を製造する方法に関する。
〔従来の技術〕
ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成させる酵
素はニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼとして知
られており、該酵素を産生ずる微生物として、例えばバ
チルス属、バクテリジュム属、マイクロコカス属及びブ
レビバクテリウム属(特公昭62−21519号公報参
照)、コリネバクテリウム属及びノカルジア属(特公昭
56−17918号公報参照)、シュードモナス属(特
公昭59−37951号公報参胎)及びロドコッカス属
、アルスロバクタ属及びミクロバクテリウム属等の微生
物を挙げることができる。
〔発明が解決しようとする課題〕 遺伝子組換えの方法でクローン化された二l−リルヒド
ラターゼ遺伝子によるニトリル類の水和では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法に比して飛曜的に増大させる
ごとが期待できる。
そこで、本願発明者らは鋭意研究を行い、ロドコッカス
属の微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するポリ
ペブチ[をコードするD N A配列を取り出し、これ
をベクターに組め込んで組換え体DNAとし、さらに微
生物に形質転換して、より高二トリルヒドラターセ活性
を有する形質転換体を調製し、これを使用してアミド類
を効率的に製造することを試み本発明を完成Jるに至っ
た。
(課題を解決するだめの1段] 本発明は、(1)次のサシユニ71・α及びサブユニッ
トβのアミノ酸配列を有する二l・リルヒ[ラーtヒ活
性を有するポリペブチ]・をニノー1ζする遺伝子DN
A。
サブユニットα AspG IyThrA l aA 1aVa l A
 IaG InTyrG l yTyrLeuG I 
yProG l n世フ゛−ツモームhJL GlyLysGlyLeuValProAspGlyT
yrVaIGltiGlyTrpLysLysGlyT
hrllcsertlisArgThrThrGluL
ysTrpProPheProAspGGGAACCG
AGATCGCGTCGGACATCGAGATTCG
CGTCTACIIi sVa I LysPheA 
l aA I aG I uG I uLcuPheG
 1yScrAspTbrAspGTCCCGCCGG
CACCG八ΔGGCTGGAGCCAGGAACAA
CTGCACCGCAGGTTCCCACCGTCブユ
ニノI−βをコー ドするDNA配列がそれぞれ次に示
されるものである上記(1)の遺伝子DNA、1」゛−
ブ子−丑−ンー1=−μ 八CCACCTTCG八八GTCGGGCAGCGAG
TACGCGTACGCGACGGGAATTGTTC
GGTAGCGACACCGACGGTGGAAGCG
TCGTT(3)上記(1)又は(2)の遺伝子DNA
をベクターに組み込んだ組換え体DNA、(4)上記(
3)の組換え体DNAで形質転換された形質転換体、(
5)上記(4)の形質転換体からニトリルヒドラターゼ
の製造法、及び(6)上記(4)の形質転換体を培養し
、得られるニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル
類をアミド類に転換するアミド類の製造法及び(7)上
記(4)記載の形質転換体を培養し、得られる形質転換
体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこれらの固定化
物をニトリル類に作用させ対応するアミド類を製造する
アミド類の製造法に関する。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明は、下記(1)〜(8)の工程により実施される
ものである。
〔1)ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の部分的決
定とそれによるDNAプローブの作成:培養集菌したロ
トコンカスsp、N−774株からニトリルヒドラター
ゼを抽出精製し、これを高速液体クロマトグラフィーを
用いて二つのサブユニットに分離する。そしてこのサプ
ユニッI〜のアミノ酸配列の一部を決定し、そのアミノ
酸配列から予想される塩基配列をもったプローブを作製
する(第1図)。
(2)ニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含むDNA
断片の調製: ロドコッカスsp、 N−774株から染色体DNAを
分離し、これを制限酵素で切断後、サチンハイブリダイ
ゼーション法(Southern、 E、M−+ J。
Mo1. Biol、98.503(1975) 、以
下同様〕により目的遺伝子を含有するDNA断片を上記
(1)のプローブを用いて検出する。
(3)染色体DNA断片のへフタ−への挿入:工程(2
)で調製した染色体DNA断片をベクターに挿入し、組
換え体DNAのライブラリーを作製する。
(4)形質転換体の作製及び組換え体DNAの選別;工
程(3)で調製した組換え体DNAライブラリによる形
質転換体を作製し、その中から工程(1)で作製したプ
ローブを用いてコロニーハイブリダイゼイション法(R
,Bruce Wallace+et alNuc、 
Aci、 Res、 9 、879(1981) 、以
下同様〕により目的の組換え体DNAを含む形質転換体
を選別する。更にサザンハイブリダイゼーションにより
、目的組換え体DNAの再確認を行う・。
この工程で選別された組換え体DNAはpY[lK12
0 と称する。
(5)組換え体DNAの精製と制限酵素地図の作成:工
程(4)で得られたpYUK120を精製した後、それ
を用いて制限酵素地図(第2図)を作成し、目的遺伝子
の含まれている箇所を決める。
(6)塩基配列の決定: pYIIK120の親株由来の染色体DNA断片から不
要部分を制限酵素を用いて除去し、得られたDNA断片
の全塩基配列(第3図)を決定し、工程(1)で決定し
たアミノ酸配列から予想される塩基配列を含むことを再
確認する。
(7)発現プラスミドの調製と形質転換体の作製二工程
(6)で作製した目的遺伝子を含有するDNA断片をl
acプロモーターを有するpUc19 (全酒造■製)
上のプロロモーター下流に連結して発現プラスミドを作
製し、これをpYtlK121と称する(第4図)。こ
のプラスミドをIE、coli JM105株(Ame
rsham社製)に形質転換させる。
(8)形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼ生産と
ニトリル類のアミド類への変換: 工程(6)で作製したpYUK121を含有する形質転
換体を培養し、その培養菌体から粗酵素標品を調製し、
この粗酵素標品をニトリル類を含有する基質溶液と混合
し、アミド類を生成させる。
なお、ロドコッカスSp、 N−774株〔本菌株は、
バージ−の細菌分類書(Bergy’s Manual
 ofDeterminative Bacterio
logy)第8版(1974)ではコリネバクテリウム
属に分類されていたものであり、微工研に微工研菌寄第
4446号(FERM−PNo、4446 )として寄
託されている〕は微工研に微工研条寄第1936号(F
ERM BP−1936)として、及び工程(7)で作
製したpYUK121を含有する形質転換体JMI05
/pYIIK121は微工研に微下研条寄第1937号
(FERM BP−1937)として寄託されている。
また、上記工程では、ベクターとしてはプラスミトベク
ター(例えばpAcYc177、 psclol等)、
ファーシヘククー(例えばλgtll (東洋紡績■製
) + Charon4A (へmersham社製)
等)のいずれでも良く、またIac  以外の制御可能
なゾロモターを使用することかできる。形質転換に用い
る宿主もE、coli JMI05株に特に限定される
ものではない。
ニトリル類のアミF類への変換には、粗酵素標品以外に
、精製酵素は勿論のこと、形質転換の培養液、分離菌体
、菌体処理物、さらにこれらの固定化物等も使用できる
ニトリル類は一般に式R−(CN)、、で表わされ、n
の値によって千ノ二トリル(n = 1. )およびボ
リニ(・リル(n≧2)があるうえ、Rは水素あるいは
種々の炭素数の、直鎖状、分岐鎖状、または環状の飽和
または不飽和の炭化水素残基、およびアミノ基、ヒ]・
ロキシル基、ハロゲン基、カルボキシルキ基、その他の
置換基を有する炭化水素残基であって、広範囲の化合物
が包含される。
具体的には、例えばアセトニトリル、プロヒオニトリル
、n−ブチロニトリル、1−ブチロニトリル、n−バレ
ロニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、
ヘンヅニトリル、シアノピリジン、マロノニトリル、サ
クシノニトリル、フマロニトリル、クロロアセトニ]・
リル、β−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノアセト
ニトリルおよびβ−アミノプロピオニトリル等が挙げら
れる。
以下に本発明の実施例を挙げる。
なお、実施例において下記の略語を用いた。
TE  :  Tris−HCI (10+nM、pH
7,8)、EDTA (1mM、pH8,0)TNE:
Tris−HCI (50mM、pH18,0)、ED
TA(1mM、pH8,0)NaCI (50mM) STE :Tris −11CI (50mM、pH8
,0)、EDTfl (5mM、pH8,0)Sucr
ose (35mM) 2xYT培地:1.6!トリプトン、1.0χ酵母工;
);ス0.5ZNaC1 〔実施例〕 (1)ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の部分的決
定とそれによるDNAプローブの合成:ロトコッカスs
p、N−774株を培地(グルコース10g#!、ベプ
ト75g/42、酵母エキス3g/I2.、麦芽エキス
3g/!、硫酸第1銖0.01g#!、水ip!、pH
7,2))に30°Cで48時間培養した後、集菌し、
細胞を破砕し、硫安分画し、透析後遠心して上清めをと
り、DEAE・セルロファインクロマトグラフィー、フ
ェニル・セファロースクロマトグラフィ、セファデック
スG−150クロマトグラフイーオクチル・セファロー
ス・クロマトグラフィーにかけ、活性画分を得、これを
透析して酵素液を得た。この酵素液を高速液体クロマト
グラフィーで逆相カラム(Senshu Pak VP
−304−1251) (■センシュウ科学製〕を用い
て二つのサブユニット (αβ)に分離した。このサブ
ユニットのN末端がらのアミノ酸配列(β1.β1)及
びリジルエンドペプチダーゼ消化により得たペプチド断
片のN末端がらのアミノ酸配列(β2.β2)をアミノ
酸シーケンザー〔アプライドバイオシステム社製47〇
八〕を用いて決定した。次いで、このアミノ酸配列から
予想される塩基配列をもったプローブ4種(αα2.β
、β2)をDNA自動合成装置〔へツクマン社製Sys
tem 1 plus)を用いて合成した。
このアミノ酸配列の結果とプローブ合成に用いた配列及
びプローブのDNA配列は第1図に示した通りである。
(2)ニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含むDNA
断片の調製: ロドコッカスsp、N−774株を培地(MY培地にグ
リシン1%又はアンピシリン0.2μg7mlヲ添加)
100mRに植菌して培養後、集菌し、TNriで洗浄
後、TE 10mRに懸濁し、0.25M EDTA 
4 rrdl、リゾチーム10〜20■、アクロモプロ
テアーゼ10〜20mg及び10XSDS 10m1を
加え、37°Cで3時間放置した。次にフェノール(6
0°C)を15m1加え、60’Cで15分間放置し、
遠心し、その上層を採った。そして2.5M酢酸ナトリ
ウム溶液0.1mfl、ジエチルエーテルを加B え遠心し、その上層を捨て、下層に2容量のエタノール
を加え、棒でDNAを巻き取った。これをTE:エタノ
ールの2:8,1:9及び0 :10の各溶液に5分間
づつひたし、2〜4 mlのTE (37°C)に?容
かし、37°CでRNase AとT+の7昆合物を1
0μ2カロえた。次にフェノールを等量加え、遠心後そ
の上層を採り、エーテルを等量販上加え、また遠心し上
層を捨て、下層をクロロホルムを少量添加した2!のT
Eで一晩透析した。更に2回目の透析を3〜4時間かけ
て行い、粗染色体DNA標品約4 ml。
を得た。
次に、粗染色体DNA標晶15μiに制限酵素sph 
T 2μ!、該酵素用緩衝液(10倍濃度)3μ!及び
TE 10μlを加え37°Cで1時間反応させた後、
アガロースゲル電気泳動(60V、3時間)に供した。
そして工程(1)で合成したDNAプローブをzzpで
放射能ラヘルしたものを用いてサザンハイプリダイゼー
ションを行った。その結果約4.4Kbの位置に上記合
成プローブα1、α2及びβ2が強くハイブリダイズす
るDNA断片があることが見出された。
そこで、粗染色体DNA標晶15μ2を前述と同様の方
法で制限酵素5phl(宝酒造■製)で切断した後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、4.4KbのDNA断片
を含むゲルを切り出した。これを、3倍容量の3 M 
 NaCl0n溶液を加えて可溶化した後、6mm径の
GF/C濾紙(Wha tman製)の上にDNAを吸
着させ、次いで6 M NaC]04含有TE 100
,1/ρを10回、更に95%エタノール100μ!を
10回滴下し、3分間風乾させた。そして、これを0.
5mlエッペンドルフのチューブに移しTE 40μρ
を添加し、37°C130分間 放置した後、遠心して
その」二澄み約40μlを分取した。この溶液の中に目
的のニトリルヒドラターゼ遺伝子DNAを含む4.4K
bDNA断片が回収されたことになる。
(3)染色体DNA断片のベクターへの挿入ニブラスミ
ドpBR322(宝酒造■製)10μρに対し、制限酵
素5ph12μ!、該酵素用緩衝液(10倍濃度)3μ
!及びTE 10μ!を加え30°Cで1時間反応させ
、次に0.25M EDTA 2μPを添加して反応を
とめ、更にI M Tris−11CI (p H9)
を7μ!、BAP(細菌性 アルカリホスファターゼ)
3μ!加えて65°Cで1時間反応させた。これにTE
を加えて全体を100μ!とし、等量のフェノールで3
回抽出し、これにエーテルを等量加えて、下層を採り、
これに針酢酸ナトリウム溶液10μiとエタノール25
0μlを加え、−80“Cで30分放置後遠心し、乾燥
してTHに溶解した。
この様にsph +で切断し、BAP処理したpBR3
225μ!と工程(2)で回収した4、4KbDNA断
片の溶液40μlとを混合し、連結緩衝液6μ!、6m
g7m1ATP溶液6μ2及びT4− D N Aリガ
ーゼ(宝酒造■製)3μlとを加え、4°Cで一夜(1
2時間)反応させることによって目的遺伝子を含有する
4、4KbDNA断片をpBR322に挿入した組換え
体プラスミド約60μ2を作製してDNAライブラリー
とした。
(4)形質転換体の作製及び組換え体DNAの選別:E
、coli TGI株(Amersham社製)を2X
YT培地10m1に37°Cで植菌して12時間培養後
、それを新規な2xYT培地に1%植菌し、37°Cで
2時間培養した。
そして遠心集菌後、冷50mM CaC1g溶液を5 
ml加え、0°Cで40分放置後、再度遠心して、冷5
0mMCaCIg 溶液0.25d及び工程(3)で調
製した組換え体プラスミドを含有する溶液60μ!を加
え、0″Cで40分放置後、42°Cで2分間ヒートシ
ョックを与え0°Cで5分放置して、2xYT培地10
m1を加え、37°Cで90分間振とう培養した後、遠
心集菌した。これに2xYT培地1ml添加し菌体を充
分懸濁させた後、その懸濁液を10μCずつアンピシリ
ン50μg7ml含有2xYT培地寒天2プレートに分
注し、37°Cで培養した。そして、プレート上に生育
した形質転換体コロニーをコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法にてニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つ形質転換
体を選抜した。すなわちプレート中に培養した形質転換
体をニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶か
してDNAを固定した後、これに合成プローブで処理し
、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含む
コロニーを選択した。更にこの選択したコロニーから組
換え体プラスミドを抽出し、ザザンハイプリダイゼーシ
ゴンによって4種類の合成プローブの全てとハイブリダ
イズさ一ロ、選抜したて10ニーがLj的遺伝子を含む
形質転換体であることを111確認した。
(5)  4fl換え体プラスミドの精製と制限酵素地
図の作成: ]「程(4)で選択した形質転換体を2xYT(50l
t B/mf!アンピシリン含有)培地100mfに植
菌し2.37°Cで夜(12時間)培養後、集菌し、T
Nliを加え再度集菌し7、STEを8 mfl、リゾ
チームを]Omg加え、o’cで5分間反応さ−U、0
.25M l!DTA 4 ml、加えて、更に室温で
10%SO52ml、5M NaC15mlを加え、0
〜4°Cで3時間放置した。それを超遠心し、その−1
−澄みに30%のP E G 6000を1/2 当量
加え、0〜4°Cで一夜(12時間)放置し、再度遠心
した後TNEに溶解し2て7.5 mEとし、CsCl
を加えて遠心して除蛋白後、臭化エチシウ1.溶液を3
00〜500mg/m1加えシールチューブに移し、熱
シールし超遠心した。
そして、ペリスタポンプでccc I″IINAを取り
出し水飽和イソプロピルアルコールを等量以十加えて臭
化エチジウムを除き、TEで透析し、精製したX、■換
え体プラスミI・約3 mlを得た。これをpYtlK
120と命名した。
この組換え体プラスミドを、制限酵素EcoRl、11
indlll、KpnlXPstI、 Sal I及び
5phI(いずれも宝酒造■製)等を用いて切断し、第
2図に示される制限酵素地図を作成した。
(6)塩基配列の決定: pYUK120の親株由来のI) N A断片のどの部
分に目的遺伝子が位置しているかを工程(5)で作成し
た制限酵素地図とサザンハイプリダイゼーションによっ
て決め、不要部分を制限酵素sph Iと5allにて
切り縮め、4.4Kbの鎖長を2.07Kbとした。そ
してこの得られたDNA断片の全塩基配列をM13ファ
ージベクターを用いたサンガー法[Sanger、F。
5cience 2141205−1210 (198
1)] により決定した。
その結果、この親株由来の2.07KbのI) N A
断片の塩基配列は第3図に示す通りであった。
なお、この塩基配列の中には、工程(1)で決定したア
ミノ酸配列から予想される塩基配列の全てが含まれるこ
とが確認され、ごのDNA断片にαβザゾユニソト遺伝
子の両方が存在することが明らかとなった。
(7)発現プラスミ]の調製と形質転換体の作製:工程
(6)で作製した2、07KbのDNA断片を制限酵素
sph lと5allで切断したプラスミドpUc19
と連結してpYIIKI21 と称する発現プラスミド
約3 mflを作成した(第4図)。
このプラスミドpYUM121を用いて工程(4)と同
様な方法でE、coli J旧05株を宿主とする形質
転換体JM105/pYUK121 (微工研条寄第1
937号(FERM BP−1937)〕を作製した。
(8)形質転換体を用いたニトリルヒドラーゼ生産とニ
トリル類のアミド類への変換: pYUK121を含有するli、coli JM105
株を2xYT (5011g/mlアンピシリン含有)
培地10滅で30°Cで一夜(12時間)培養し、この
培養物を2xYT(50pg/mflアンピシリン、1
.0mg/ l Fe5On ・7u2o、ピロロキロ
リンキノン含有)培地100滅に1%宛接種し、30°
Cで2時間培養し、これに終濃度が2mMとなるように
II)TGを添加し、更に30°Cで15時間培養した
集菌後1/20M リン酸緩衝液(0,35% n酪酸
ナトリウム含有、pH7,1)3mlに懸濁し、超音波
処理した後遠心して沈渣を8M尿素を含む」二記リン酸
緩衝溶液20m1に溶解し、塩化す1〜リウム0.58
5gを添加した。そして、これをpH]、O,Oにし、
50 mMTris−HCI緩衝溶液(pH10,0)
  3 Nで3時間透析した後、1/20Mリン酸緩衝
液(p H7,7) 3 P、で−晩透析し、粗酵素標
品約35m2とした。
粗酵素標品2 mlを基質溶液(アクリロニトリル5%
、旧醋酸ナトリウム0.35%、 FeSO4・711
□010mg/ I!、 PQQ  1 ugH,及び
50mMリン酸緩衝液、 tilll、1)2mp、と
混合し、光照射下20°Cで20分反応後IN IIc
I  2 ml添加して反応を停止さ−V、反応液中の
生成アクリルアミドと未反応アクリロニトリルを高速液
体クロマトグラフィーを用いて検出した。
その結果、宿主IE、coli JM105株からの粗
抽出液ではアクリルアミドが検出できなかったが、本件
pYUK121含有するE、coli JM105株で
はアクリルアミl−が検出され、その比活性は培地1!
当り13.2Uと計算された。なお、IUは1分間に生
成するアクリルアミドのpmol数である。
〔発明の効果〕
本発明により、サブユニットα及びサブユニットβのア
ミノ酸配列を有し、ニトリル上1−ラターゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするDNA配列が明らかにされ
た。そして、このDNAを含む発現プラスミド及び該プ
ラスミドで形質転換された形質転換体が作出された。ま
た、この形質転換体を培養してニトリルヒドラターゼを
製造し、更に該形質転換体をニトリル類に作用させてア
ミド類を製造することができた。
【図面の簡単な説明】
第1図は(1) D N Aプローブ作成におりるアミ
ノ酸配列の結果とプローブの合成に用いた同配列(下線
部)ならびに(2)プローブのDNA配列、第2図は組
換え体プラスミドpY[lK120の制限酵素地図、第
3図はpYtLK12]に含まれるN−774株由来の
DNA断片の塩基配列ならびにそれから予想されるアミ
ノ酸配列、及び第4図は発現プラスミドpYUK121 の調製法をそれぞれ示す。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)次のサブユニットα及びサブユニットβのアミノ
    酸配列を有しニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペ
    プチドをコードする遺伝子DNA。 ¥サブユニットα¥ 【遺伝子配列があります】 ¥サブユニットβ¥ 【遺伝子配列があります】
  2. (2)サブユニットαをコードするDNA配列及びサブ
    ユニットβをコードするDNA配列がそれぞれ次に示さ
    れるものである請求項1記載の遺伝子DNA。 ¥サブユニットα¥ 【遺伝子配列があります】 ¥サブユニットβ¥ 【遺伝子配列があります】
  3. (3)請求項1又は2記載の遺伝子DNAをベクターに
    組み込んだ組換え体DNA。
  4. (4)請求項3記載の組換え体DNAで形質転換された
    形質転換体。
  5. (5)請求項4記載の形質転換体を培養し、その培地中
    に蓄積したニトリルヒドラターゼを採取することを特徴
    とするニトリルヒドラターゼの製造法。
  6. (6)請求項4記載の形質転換体を培養し、得られるニ
    トリルヒドラターゼの作用によりニトリル類を対応する
    アミド類に転換することを特徴とするアミド類の製造法
  7. (7)請求項4記載の形質転換体を培養し、得られる形
    質転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこれらの
    固定化物をニトリル類に作用させ対応するアミド類を製
    造することを特徴とするアミド類の製造法。
JP63202779A 1988-07-06 1988-08-16 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子dna、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 Expired - Lifetime JP2840253B2 (ja)

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