DE602004009649T2

DE602004009649T2 - Verfahren zur Klonierung und Expression der SbfI Restriktionsendonuklease und der SbfI Methylase in E. coli

Info

Publication number: DE602004009649T2
Application number: DE602004009649T
Authority: DE
Inventors: Keith Essex Lunnen; Theodore Boxford Davis; Geoffrey South Hamilton Wilson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-21
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2024-09-22
Also published as: US6958230B2; DE602004009649D1; US20050064433A1; EP1516927A1; EP1516927B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Ausgestaltungen der Erfindung betreffen rekombinante DNA, die die SbfI Restriktionsendonuclease (SbfI Endonuclease; R.SbfI) sowie die SbfI Modifikationsmethyltransferase (SbfI Methyltransferase; M.SbfI) kodiert, sowie die Expression der SbfI Endonuclease und Methyltransferase in E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, die natürlich in bestimmten einzelligen Mikroben, hauptsächlich Bakterien und Archaea, vorkommen und die Aufgabe haben, diese Organismen vor Infektionen durch Viren und andere parasitische DNA-Elemente zu schützen. Restriktionsendonucleasen binden sich an spezifische Sequenzen von Nucleotiden ('Erkennungssequenz') in doppelsträngigen DNA-Molekülen (dsDNA) und spalten die DNA gewöhnlich in oder nahe der Sequenz, wobei sie die DNA sprengen und ihre Zerstörung bewirken. Restriktionsendonucleasen treten gewöhnlich mit einem oder mehreren Begleitenzymen mit der Bezeichnung Modifikationsmethyltransferasen auf. Methyltransferasen binden sich an die gleichen Sequenzen in der dsDNA wie die Restriktionsendonucleasen, die sie begleiten, anstatt aber die DNA zu spalten, verändern sie sie durch Hinzufügen einer Methylgruppe zu einer der Basen in der Sequenz. Diese Methylierung ('Modifikation') verhindert, dass sich die Restriktionsendonuclease anschließend an diesen Ort bindet, so dass der Ort gegen eine Spaltung resistent gemacht wird. Methyltransferasen fungieren als zelluläre Antidote gegen die Restriktionsendonucleasen, die sie begleiten, und schützen die zelleigene DNA vor einer Zerstörung durch ihre Restriktionsendonucleasen. Zusammen bilden eine Restriktionsendonuclease und ihre begleitende(n) Modifikationsmethyltransferase(n) ein Restriktions-Modifikations-(R-M)-System, eine enzymatische Partnerschaft, die für Mikroben das leistet, was das Immunsystem in gewisser Hinsicht für vielzellige Organismen leistet.
Eine große und vielfältige Klasse von Restriktionsendonucleasen ist als Restriktionsendonucleasen des 'Typs II' eingestuft. Diese Enzyme spalten DNA an definierten Positionen und können in gereinigter Form dazu verwendet werden, DNA-Moleküle in präzise Fragmente zur Genklonierung und -analyse zu schneiden. Die biochemische Präzision von Restriktionsendonucleasen des Typs II übertrifft bei weitem alles, was mit chemischen Verfahren erreichbar ist, so dass diese Enzyme unerlässliche Reagenzien in Molekularbiologielabors sind. In dieser Funktion als molekulare Instrumente für die Gendissektion hatten Restriktionsendonucleasen des Typs II in den letzten 25 Jahren einen tief greifenden Einfluss auf die Lebenswissenschaften und haben sowohl die akademische als auch die kommerzielle Bühne umgestaltet. Ihre Nützlichkeit ist ein Ansporn für die kontinuierliche Suche nach neuen Restriktionsendonucleasen gewesen, und es wurde eine große Zahl gefunden. Heute sind mehr als 200 Endonucleasen des Typs II bekannt, die jeweils unterschiedliche DNA-Spaltungscharakteristiken besitzen (Roberts and Macelis, Nucl. Acids Res. 29: 268–269 (2001)). (REBASE^®, http://rebase.neb.com/rebase). Gleichzeitig wurden die Produktion und Reinigung dieser Enzyme durch die Klonierung und Überexpression der Gene, die sie kodieren, in nicht natürlichen Produktionsstamm-Wirtszellen wie E. coli verbessert.
Da die verschiedenen Restriktionsenzyme ähnliche biologische Rollen auf größtenteils die gleiche Weise zu spielen scheinen, könnte man davon ausgehen, dass sie sich im Hinblick auf Aminosäuresequenz und Verhalten sehr ähnlich sind. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass dies nicht so ist. Überraschenderweise scheinen die meisten Restriktionsenzyme des Typs II einzigartig zu sein und ähneln weder anderen Restriktionsenzymen noch irgendeiner anderen bekannten Proteinart, so dass sie weit davon entfernt sind, sich ähnlich zu sein. Restriktionsendonucleasen des Typs II scheinen über den größten Teil der Evolution unabhängig voneinander entstanden zu sein, und dies hunderte von Malen, so dass die heutigen Enzyme eine heterogene Sammlung anstatt eine eigenständige Familie darstellen. Einige Restriktionsendonucleasen fungieren als Homodimere, einige als Monomere, andere als Heterodimere. Einige binden symmetrische Sequenzen, andere asymmetrische Sequenzen; einige binden kontinuierliche Sequenzen, andere diskontinuierliche Sequenzen; einige binden einmalige Sequenzen, andere Mehrfachsequenzen. Einige werden von einer einzelnen Methyltransferase begleitet, andere von zwei und wieder andere von überhaupt keiner. Sind zwei Methyltransferasen vorhanden, dann handelt es sich manchmal um separate Proteine und manchmal sind sie fusioniert. Reihenfolge und Orientierung von Restriktions- und Modifikationsgenen variieren, wobei alle möglichen Organisationen vorkommen. Es existieren verschiedene Arten von Methyltransferasen, wobei einige Adenine methylieren (m6A-MTasen) und andere Cytosine an der N-4-Position (m4C-MTasen) oder an der Position 5 methylieren (m5C-MTasen). Gewöhnlich gibt es keine Möglichkeit, um a priori vorherzusagen, welche Modifikationen eine spezielle Restriktionsendonuclease blockieren werden, welche Art(en) von Methyltranserase(n) diese Restriktionsendonuclease in jedem beliebigen speziellen Fall begleiten wird/werden oder wie ihre Genreihenfolge oder -orientierung aussehen wird.
Im Hinblick auf die Klonierung einer Restriktionsendonuclease des Typs II bedeutet die große Variabilität, die unter den Restriktions-Modifikationssystemen besteht, dass für Versuchszwecke jede einzigartig ist. Jedes Enzym ist hinsichtlich Aminosäuresequenz und katalytischem Verhalten einzigartig; jedes kommt in einer einzigartigen enzymatischen Assoziation vor, angepasst an einzigartige mikrobielle Umstände; und jedes stellt den Experimentator vor eine einzigartige Herausforderung. Manchmal kann eine Restriktionsendonuclease auf eine einfache Art und Weise kloniert und überexprimiert werden, meistens ist dies jedoch nicht der Fall, und was für ein Enzym gut funktioniert, funktioniert beim nächsten vielleicht überhaupt nicht. Erfolg mit einem ist keine Garantie für den Erfolg mit einem anderen.
Die US 5,200,333 betrifft Verfahren zum Klonieren von Restriktionsenzymen und ihren entsprechenden Modifikationsenzymen durch Selektieren von Klonen, die gegen einen Verdau durch das Restriktionsenzym resistent sind, und die anschließende Selektion von Klonen, die das Restriktionsgen enthalten.
In Wilson, G. G. (Cloned Restriction-Modifikation Systems – A Review, Gene, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, NL, Bd. 74, Nr. 1, Januar 1988) wurden die Gene für zahlreiche Restriktionsendonucleasen und Modifikationsmethylasen in E. coli kloniert und es wurde eine Zusammenfassung im Hinblick auf die isolierten Klone und die Verfahren gegeben, die angewendet wurden, um sie zu erhalten. Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren konnten für die Isolierung von DNA, die SbfI kodiert, nicht ohne Modifikation angewendet werden. Dies wird an späterer Stelle unter dem Abschnitt mit der Überschrift „Hürden beim Klonieren der SbfI Restriktionsendonuclease" demonstriert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Segment bereit, das die SbfI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von Streptomyces species Bf-61 erhältlich ist.
In einer zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung wird ein rekombinanter DNA-Vektor bereitgestellt, der einen Vektor beinhaltet, in den ein DNA-Segment, das die SbfI Restriktionsendonuclease kodiert, eingefügt wurde. Ferner wird eine durch den rekombinanten Vektor transformierte Wirtszelle bereitgestellt.
In einer zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung wird eine isolierte DNA bereitgestellt, die die SbfI Restriktionsendonuclease und SbfI Methylase kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-5371 erhältlich ist.
Ferner werden ein Vektor, der diese isolierte DNA umfasst, und eine durch den Vektor transformierte Wirtszelle bereitgestellt.
In einer zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter SbfI Restriktionsendonuclease bereitgestellt, das das Kultivieren einer mit einem beliebigen der oben beschriebenen Vektoren transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der Endonuclease beinhaltet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Genorganisation des SbfI R-M-Systems. SbfI R, SbfI Restriktionsendonucleasegen; SbfI M, SbfI Methylasegen.
2: Die SbfI Methylasegensequenz (SbfIM, 1460 bp) (SEQ ID Nr. 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3: Die SbfI Endonucleasegensequenz (SbfIR, 971 bp) (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4: Eine Plasmidkarte des pACYC184-PstIM Klons.
5: Eine Plasmidkarte des pACYC184-SbfIM Klons.
6: Eine Plasmidkarte von pCAB16.
7: Eine Plasmidkarte des pLT7K-SbfIR Endonucleaseklons.
8: Rekombinante SbfI Endonucleaseaktivität in Zellextrakt. I-DNA wurde als Substrat verwendet. Bahnen 2–8, Zugaben von 1x, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 verdünntem Zellextrakt in den Restriktionsverdaus. Bahn 1, I-DNA, verdaut mit nativer SbfI.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die SbfI Endonuclease und Methyltransferase sind Enzyme, die im Bakterium Streptomyces species Bf-61 (New England Biolabs Stammsammlung) vorkommen. Die SbfI Endonuclease bindet sich an die symmetrische Nucleotid-(nt)-Sequenz 5'-CCTGCAGG-3' in doppelsträngigen DNA-Molekülen (dsDNA) und spaltet die DNA zwischen A und G in jedem Strang, also 5'-CCTGCA/GG-3', so dass DNA-Fragmente mit 4-nt kohäsiven Enden produziert werden (/ gibt die Position der Strangspaltung an). Viele in der Natur vorkommende Restriktionsendonucleasen werden von schützenden Modifikationsmethyltransferasen begleitet. Restriktionsendonucleasen, die lange, selten vorkommende Sequenzen erkennen und spalten, wie R.SbfI, werden jedoch nicht immer von einer schützenden Methyltransferase begleitet. Zu Beginn dieser Experimente war nicht bekannt, ob R.SbfI tatsächlich von einer Modifikationsmethyltranserase begleitet wird.
Hürden beim Klonieren der SbfI Restriktionsendonuclease
(a) Erfolglose Methylaseselektion
Das im US-Patent Nr. 5,200,333 beschriebene Methylaseselektionsverfahren ist das bevorzugte Verfahren zum Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen. Die Methylaseselektion brachte jedoch nicht das SbfI Methylasegen (M.SbfI) hervor. Dieser Misserfolg kann in beliebigen der folgenden technischen Schwierigkeiten begründet sein: Konstruktion von Ausgangsbibliotheken, bei denen potentielle Klonierungsorte möglicherweise das Methylasegen auseinander reißen; Misserfolg beim Klonieren des richtigen Fragments aus den Bibliotheken aufgrund der Größe des DNA-Fragments; Gentoxizität; geringe Expression des Methylasegens oder völlige Abwesenheit des begleitenden Methylasegens, wie bei bestimmten anderen 8-Nucleotid-spezifischen Restriktionsendonucleasen wie Pacl 5-TTAAT/TAA-3' ( US-Patent Nr, 5,098,839 ).
(b) Abwesenheit von SbfIM stromabwärts von SbfIR
Obwohl die Möglichkeit bestand, dass keine M.SbfI vorhanden war, wurden alternative Ansätze zum Klonieren des Gens ausprobiert. Anschließend wurde eine SbfI Methyltransferase tatsächlich durch eine PCR-Reaktion auf der ursprünglichen pUC19-Sau3AI-partiellen SbfI DNA-Bibliothek identifiziert, die kein selektierbares sbfIM Gen hervorbrachte. Die PCR-Reaktion zeigte die Anwesenheit eines Sau3AI-partiellen Fragments, das die sbfIM Region enthielt. Was den Standort der sbfIM Region auf chromosomaler DNA betrifft, so wurde schließlich durch inverse PCR ermittelt, dass er nicht stromabwärts des sbfIR Gens war, wie zuerst angenommen, sondern stromaufwärts des sbfIR Gens. Die Sequenz von sbfIM wurde anschließend erhalten.
Das SbfI Methylasegen wurde durch PCR von S. Bf-61 Chromosomen-DNA in pACYC184 kloniert und in E. coli transformiert. Die klonierte SbfI Methyltransferase band sich an die gleiche Nucleotid-(nt)-Sequenz in dsDNA wie R.SbfI und katalysierte die Zugabe einer Methylgruppe zum Adeninrest in jedem Strang (5'-CCTGCmAGG-3'), wobei modifizierte DNA-Moleküle produziert wurden, die gegen eine Spaltung durch R.SbfI resistent waren (mA gibt die modifizierte Base an).
Das SbfI Restriktionsendonucleasegen (sbfIR) wurde unter Verwendung von PCR-Primern auf der Basis der SbfI Endonuclease-(R.SbfI)-Aminosäuresequenz vom N-terminalen Ende und den Cyanogenbromid-verdauten Enden des Proteins identifiziert. Das Gen wurde anschließend durch inverse PCR von SbfI Chromosomen-DNA kloniert.
(c) Nicht eindeutige Expressionsniveaus für Endonuclease
Das durch inverse PCR erhaltene PCR-Fragment, das das sbfIR Gen enthielt, wurde in die Plasmidvektoren pRRS und pLT7K eingefügt und zum Transformieren von mit M.PstI zuvor modifiziertem E. coli verwendet. Eine M.PstI-Prämodifikation wurde angewendet, da M.SbfI bislang noch nicht identifiziert worden war und PstI Methylase (M.PstI) erwiesenermaßen SbfI Orte zusätzlich zu PstI Orten sowohl vor PstI als auch SbfI Endonucleaseverdau von gereinigter PstI-methylierter DNA schützte.
Keine Klone mit Inserts wurden mit pRRS gefunden; einige Klone wurden mit pLT7K gefunden, wobei der regulierte T7 Expressionsvektor pLT7K einen konstitutiven Antisense-Promotor stromabwärts von sbfIR enthielt, um basale Expression zu reduzieren. Einige pLT7K Klone enthielten die korrekte DNA-Sequenz, allerdings produzierten sie eine sehr geringe SbfI Endonucleaseaktivität auf eine Induktion hin. Dieses negative Ergebnis legte den Schluss nahe, dass es einen Selektionsdruck zur Isolierung von Endonucleasemutanten mit reduzierter Aktivität gab. Dieses enttäuschende Ergebnis legte nahe, dass im Hinblick auf hoch exprimierende Klone selektiert wurde, vielleicht aufgrund einer Untermethylierung der Wirtschromosomen-DNA durch M.PstI.
Da die Expression anhand eines T7 Vektor mittlerer Kopiezahl in mit M.PstI zuvor modifiziertem E. coli keinen stabilen hoch exprimierenden Klon hervorbrachte, wurden Anstrengungen unternommen, das sbfIR Gen in M.SbfI-methyliertem E. coli unter Verwendung von pLT7K zu exprimieren. Als das SbfI Endonucleasegen in mit M.SbfI zuvor modifiziertem E. coli kloniert wurde, wurde ein stabiler und überexprimierender Klon gebildet. Mit Überexpression eines Enzyms sind im Allgemeinen wenigstens 10⁵ Einheiten/g, einschließlich 10⁶ oder 10⁷ Einheiten/g, gemeint. Eine geringe Expression liegt bei weniger als 10³ Einheiten/g. Niedrige Expressionsniveaus einer angeblichen klonierten Restriktionsendonuclease können in Spaltungsprofilen von DNA resultieren. Dies ist jedoch kein stichhaltiger Beweis dafür, dass das gewünschte Enzym erhalten wurde. Der Enzymverdau kann z. B. partiell oder unvollständig sein, so dass es unklar ist, ob die Produkte lediglich das Ergebnis einer zufälligen Spaltung sind.
(d) Erlangen eines überexprimierenden Klons
Ein stabiler überexprimierender Klon von R.SbfI wurde wie folgt erhalten: das sbfIR Gen wurde durch PCR von genomischer DNA amplifiziert. Nach der Reinigung wurde das resultierende PCR-Fragment in pCAB16 an einem BsaAI Ort Blunt-End-ligiert. pCAB16 ist ein pUC18-Derivat, das das mspIR Gen im Polylinker von pUC18 in einer Reihe mit dem Plac Promotor enthält. pCAB16 enthält einen einzelnen BsaAl Ort innerhalb des mspIR Gens. Insertionen an diesem Ort unterbrechen die mspIR Expression (die sonst tödlich wäre), so dass Plasmide, die Inserts enthalten, selektiv mit hoher Effizienz gewonnen werden können (6). Das sbfIR PCR-Fragment wurde in den BsaAl Ort von pCAB16 ligiert und in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli transformiert. Klone, die das sbfIR PCR-Insert trugen, wurden kultiviert. Assays zufolge hatten diese Klone jedoch keine nachweisbare SbfI Endonucleaseaktivität. Eine DNA-Sequenzierung dieser Klone ergab, dass ein intaktes sbfIR Gen in entgegengesetzter Orientierung zu Plac und mspIR anwesend war, was eine Erklärung für den Mangel an R.SbfI Aktivität sein könnte.
In einem alternativen Ansatz wurde das SbfIR Gen vom pCAB16-SbfIR Plasmid durch Gelreinigung gereinigt. Das resultierende DNA-Fragment wurde in pLT7K ligiert und in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli transformiert. Klone, die das PCR-Insert trugen, wurden mit IPTG induziert und im Hinblick auf SbfI Aktivität auf λ-DNA untersucht. Die Extrakte erzeugten ein partielles SbfI-Verdaumuster. Die DNA-Sequenz von einem dieser Klone zeigte, dass er ein intaktes sbfIR Gen trug. Da die DNA-Sequenz für dieses pLT7K-sbfIR Plasmid korrekt war, wurde höchstwahrscheinlich im Hinblick auf hoch exprimierende Klone im Laufe der Induktion selektiert. Als das sbfIM Gen anschließend identifiziert und in pACYC184 kloniert wurde, wurde eben dieser pLT7K-SbfIR Klon anschließend in mit M.SbfI zuvor modifizierten E. coli transformiert. Transformanten, in denen das sbfIM Gen anhand eines Plasmids geringer Kopiezahl, pACYC184, exprimiert wurde und das sbfIR Gen mit pLT7K mittlerer Kopiezahl im selben E. coli-Wirt exprimiert wurde, wurden kultiviert und ihre Zellextrakte wurden im Hinblick auf SbfI Aktivität auf λ DNA untersucht. Die Ausbeute von rekombinanter SbfI-Endonuclease betrug ~10⁵ Einheiten/g nasser Zellen von dem überproduzierenden Stamm.
Zusammengefasst, letztendlich wurde eine Expressionsstrategie entwickelt, die eine Reihe von Hürden überwand und sich schließlich bei der Gewinnung von überexprimierter R.SbfI als erfolgreich erwies. Diese Strategie war in einer Ausgestaltung auf die Expression von R.SbfI und M.SbfI unter Promotoren unterschiedlicher Stärke angewiesen, und zwar jeweils einem Promotor mittlerer Kopiezahl und einem Promotor geringer Kopiezahl. In alternativen Ausgestaltungen können jedoch das sbfIM und das sbfIR Gen unter demselben Promotor exprimiert werden.
Ferner kann das sbfIM Gen in einem einzelnen Plasmid zusammen mit dem sbfIR Gen unter demselben Promotor oder unter unterschiedlichen Promotoren kloniert werden, oder sie können in getrennten Plasmiden unter demselben Promotor oder unter unterschiedlichen Promotoren kloniert werden.
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem die Gene sbfIM und sbfIR vorzugsweise kloniert und exprimiert werden in E. coli, beinhaltet die folgenden Schritte:
Präparation genomischer DNA und Konstruktion einer SbfI Genom-DNA-Bibliothek
Genomische DNA wurde von Streptomyces species Bf-61 mit der 2× Kirby-Methode präpariert (Hopwood et al. Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich, S. 77 (1985)).
Teilweise verdaute genomische DNA-Präparate wurden mit einem verdauten, CIP-behandelten pUC19-Vektor ligiert, in den zwei SbfI Orte zuvor konstruiert worden waren. Die ligierten DNA-Gemische wurden zum Transformieren von E. coli verwendet. Transformanten von jeder Bibliothek wurden gepoolt und amplifiziert und Plasmid-DNA wurde präpariert, um Primärplasmidbibliotheken zu erzeugen.
Methylaseselektion
Die Primärplasmidbibliotheken wurden durch einen Verdau mit SbfI angeregt. Diese DNA-Verdaus wurden dann zurück in E. coli transformiert und Plasmid-DNA wurde von einigen dieser ersten Überlebenden von jeder selektierten Primärbibliothek präpariert. Der SbfI Verdau von diesen zeigte, dass keine davon gegen einen Verdau resistent war, was den Schluss nahe legte, dass keine das sbfIM Gen trug. Restliche überlebende Kolonien von einigen der angeregten Primärbibliotheken wurden ebenfalls gepoolt, um eine Sekundärbibliothek zu bilden, und ein zweites Mal mit SbfI in Kontakt gebracht. Plasmid-DNA von diesen Überlebenden hatte wieder keine Resistenz gegen SbfI Endonucleaseverdau.
Die nicht rekombinante SbfI Endonuclease wurde gereinigt und die N-terminale Aminosäuresequenz dieses Proteins wurde zusammen mit der Aminosäuresequenz von Cyanobromid-verdauten R.SbfI Fragmenten ermittelt. Auf der Basis dieser Aminosäuresequenzen wurden konvergierende Sätze degenerierter und nicht degenerierter Primer synthetisiert. Diese wurden zum Ankurbeln von PCR-Reaktionen auf SbfI-Chromosomen-DNA verwendet, wobei DNA-Fragmente erzeugt wurden, die das 5'-Ende des sbfIR Gens enthielten. Eine DNA-Sequenzierung brachte ein offenes Leseraster (ORF) von 555 bp hervor, das eine umfassende Homologie zur R.PstI Endonuclease und zu ihren Isoschizomeren BsuBI und XphI hatte. Die PstI Erkennungssequenz 5'-CTGCA/G-3' wird von der SbfI Erkennungssequenz 5'-CCTGCA/GG-3' umschlossen. Diese Ähnlichkeiten bei den Erkennungssequenzen und Aminosäuresequenzen legten dringend nahe, dass das 555-bp-ORF das 5'-Ende des sbfIR Gens umfasste.
Inverse PCR-Amplifikation von DNA stromabwärts des 5'-Endes des SbfI-Endonucleasegens
Nach dem Klonieren und Identifizieren des N-terminalen Abschnitts des sbfIR Endonucleasegens wurden Anstrengungen unternommen, das 3'-Ende von sbfIR und die angrenzende stromabwärtige DNA zu klonieren.
Genomische DNA wurde mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut und selbstligiert. Die resultierenden zirkulären DNA-Moleküle wurden als Matrize für die inverse PCR verwendet. Die DNA-Sequenz am N-Terminus des sbfIR Gens wurde zum Entwerfen von Primern für die inverse PCR von SbfI Chromosomen-DNA verwendet.
Nicht alle inversen PCR-Reaktionen von selbstligierter genomischer DNA brachten inverse PCR-Fragmente hervor. Nur die HincII und HpyCH4HIV Matrizen erzeugten PCR-Fragmente, die zum Klonieren gereinigt werden konnten. Die HincII und HpyCH4HIV inversen PCR-Fragmente wurden in pUC19 ligiert und in E. coli transformiert. Klone mit PCR-Inserts wurden direkt mit pUC19 Universalprimern sequenziert.
Anhand dieser DNA-Sequenz in der Nähe des neu gefundenen HincII Ortes wurde ein neuer Primer entworfen, der in einer PCR-Reaktion mit einem Primer von der N-terminalen SbfI Endonucleasesequenz verwendet wurde, um ein Fragment zu erzeugen, dass die N-terminale Sequenz mit der inversen PCR-Seqeunz stromabwärts von 5' sbfIR verknüpfte. Das PCR-Fragment wurde gereinigt, verdaut und in pUC19 ligiert. Diese ligierte DNA wurde in E. coli transformiert und Klone mit PCR-Inserts wurden direkt mit pUC19 Universalprimern sequenziert.
Die HincII und HpyCH4HIV PCR-Überlappungsfragmente erzeugten jeweils ~900 bp und ~500 bp neuer Sequenzen. Durch Kombinieren dieser Sequenzen mit der 5' sbfIR Sequenz wurde ein komplettes ORF von 969 bp gefunden, das höchstwahrscheinlich das sbfIR Restriktionsgen repräsentierte. Zusätzliche ~700 bp sequenzierter SbfI Chromosomen-DNA stromabwärts von sbfIR wurden mit den bekannten Genprodukten in der GenBank unter Verwendung von BLAST verglichen und schienen nicht das SbfI Methylasegen zu enthalten.
Inverse PCR-Amplifikation von DNA stromaufwärts von SbfI Endonuclease und Identifizierung von SbfI Methylase
Da das sbfIM Gen nicht durch Methylaseselektion isoliert und außerdem das sbfIM Gen stromabwärts der SbfI Endonuclease nicht identifiziert werden konnte, bemühte man sich, DNA stromaufwärts des sbfIR Gens zu klonieren.
PCR-Reaktionen wurden auf den SbfI Primär-pUC19-Bibliotheken, die in der anfänglichen Methylaseselektion verwendet wurden, mit zwei konvergierenden Primern innerhalb des sbfIR Gens durchgeführt. Die PCR ergab, dass die SbfI Primärbibliotheken wenigstens einen Abschnitt des sbfIR Gens enthielten. Zum Identifizieren jeglicher größerer stromaufwärtiger DNA-Fragmente, die in den Ausgangsprimärbibliotheken möglicherweise enthalten sind, fand eine zweite PCR auf den Bibliotheken mit pUC19 Universalprimern und einem Primer statt, der aus dem sbfIR Gen entworfen wurde und in Richtung auf das stomaufwärtige oder 5' Ende von sbfIR orientiert war. Diese atypischen PCR-Reaktionen erzeugten Fragmente von den BglII, BclI und Sau3AI Primärbibliotheken, die größer als 1,6 kb und möglicherweise groß genug waren, um stromaufwärtige DNA für das sbfIM Gen zu enthalten. Diese bibliothekerzeugten PCR-Fragmente wurden gereinigt und DNA wurde direkt unter Verwendung der PCR-Primer sequenziert.
Die einzige lesbare Sequenz stammte vom SbfI Sau3AI-Bibliothek-PCR-Fragment. Diese DNA-Sequenz wurde benutzt, um einen Satz neuer PCR-Primer zu entwerfen, die in der PCR mit einem konvergierenden Primer aus dem sbfIR Gen verwendet werden sollten, um hoffentlich die DNA stromaufwärts relativ zum sbfIR Gen von SbfI Chromosomen-DNA direkt zu klonieren. Diese PCR-Fragmente wurden gereinigt, verdaut und in pUC19 mit kompatiblen Enden ligiert, worauf eine Transformation in E. coli folgte. Mit einer Kolonie-PCR identifizierte PCR-Inserts und Klone, die ein Fragment mit etwa der korrekten Größe enthielten, wurden durch CsCl-Reinigung gereinigt und mit pUC19 Universal- und Spezialprimern sequenziert.
Die DNA-Sequenzierung brachte ein neues stromaufwärtiges ORF zum Vorschein, das als das 3' Ende des sbfIM Gens ermittelt wurde, das in Kopf-Schwanz-Manier mit dem sbfIR Gen gekoppelt und arrangiert war. Man fand, dass das sbfIM Transkriptions-(TGA)-Stoppcodon das GTG-Startcodon für das SbfI Endonucleasegen überlappte. Eine DNA-Sequenzierung über die Junktion deckte auf, dass zusammen mit dem GTG-Start für das sbfIR Gen eine zusätzliche translatierte Aminosäure, Serin (S), vorhanden war, wodurch R.SbfI eine Aminosäure langer war, als anhand der N-terminalen Aminosäuresequenz vorhergesagt wurde. Tatsächlich hat SbfI eine Länge von 323 Aminosäuren und nicht von 322 Aminosäuren. Mit dem zusätzlichen Serin umfasst das vollständige sbfIR Gen 971 bp (3).
Die DNA-Sequenzierung deckte infolge eines im PCR-Primer konstruierten HindIII Ortes einen unbekannten HindIII Ort innerhalb des sbfIM Gens auf, was während der Klonierung unvorhersehbar war. Dadurch wurde das PCR-Fragment während der Klonierung verkürzt und das 5' Ende des sbfIM Gens tatsächlich abgeschnitten. Anschließend wurden Anstrengungen unternommen, das 5' Ende von sbfIM unter Anwendung einer inversen PCR mit neuen Primern zu klonieren, die aus dem verkürzten sbfIM Gen entworfen wurden. Die inverse PCR fand auf genomischer DNA statt, verdaut mit HincII und selbstligiert. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden gereinigt, in pCAB16 ligiert und in E. coli transformiert. Plasmid-DNAs wurden gereinigt und sequenziert. Durch eine Kombination dieser DNA-Sequenz mit der verkürzten 3' sbfIM Gen-DNA-Sequenz wurde die volle Länge des sbfIM Gens von 1460 bp aufgedeckt, das eine translatierte SbfI Methylase von 496 Aminosäuren kodiert (2).
Isolation des intakten SbfIR Gens in E. coli
Da das sbfIM Gen anfänglich nicht isoliert wurde, bestand die Klonierungs-/Expressionsstrategie darin, M.PstI zu verwenden, um E. coli zuvor zu modifizieren, indem das pstIM Gen in einem Plasmid geringer Kopiezahl, nämlich pACYC184, und das sbfIR Gen in einem konstitutiven Vektor hoher Kopiezahl, pRRS, oder in einem regulierten Vektor mittlerer Kopiezahl, pLT7K, exprimiert wurde.
Das sbfIR Gen wurde von genomischer DNA durch PCR mit Deep Vent^® DNA-Polymerase amplifiziert. Nach der Reinigung und dem Verdau wurde das PCR-Fragment jeweils in pRRS und pLT7K ligiert, verdaut mit den gleichen Enzymen, um kompatible Enden zu erzeugen. Die pRRS-SbfIR-Ligation wurde in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli transformiert und Plasmide wurden gereinigt und im Hinblick auf Inserts gescreent. Es wurden keine pRRS-SbfIR Klone gefunden. Die pLT7K-SbfIR-Ligation wurde in E. coli ER2502 (ohne T7 RNA-Polymerase) transfomiert. Positive Klone wurden identifiziert und diese wurden dann in M.PstI E. coli ER2744 (mit T7 RNA-Polymerase) transferiert. Zellkulturen wurden von individuellen pLT7K-SbfIR Transformanten hergestellt und mit IPTG induziert. Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf SbfI Endonucleaseaktivität untersucht, wobei keiner nachweisbare SbfI Endonuclease produzierte.
In einem anderen Versuch wurde ein größeres PCR-Fragment, das das sbfIR Gen plus 600 bp stromabwärtige DNA (1500 bp) enthielt, verdaut und in pLT7K ligiert und in E. coli transformiert. Positive Klone wurden identifiziert und dann in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli ER2744 transferiert und mit IPTG induziert, im Hinblick auf SbfI-Aktivität untersucht, wobei keine nachweisbare Aktivität hervorgebracht wurde. Eben diese pLT7K-SbfIR-Ligation des sbfIR Gens, einschließlich 600 bp stromabwärtiger DNA, wurde auch direkt in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli ER2744 transformiert. Positive pLT7K-SbfIR-Klone wurden durch PCR identifiziert, kultiviert, mit IPTG induziert und dann wieder untersucht, wobei keine nachweisbare SbfI Aktivität hervorgebracht wurde. Dieses negative Ergebnis zeigte, dass es einen Selektionsdruck zur Isolierung von Endonucleasemutanten gab.
Zum Isolieren eines Klons, der das sbfIR Gen mit der korrekten DNA-Sequenz enthielt, vom nativen Streptomyces species Bf-61 Stamm wurde sbfIR-Gen-PCR in pCAB16 am BsaAI-Ort Blunt-End-ligiert, woraufhin eine Transformation in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli folgte. Klone, die das sbfIR Genfragment trugen, wurden kultiviert und im Hinblick auf SbfI Aktivität auf λ DNA untersucht. Die Extrakte erzeugten kein SbfI Verdaumuster, allerdings wies die DNA-Sequenz von diesen Klonen ein intaktes sbfIR Gen in entgegengesetzter Orientierung zu Plac und mspIR auf.
Expression des SbfIR Gens in E. coli
Das sbfIR-Gen wurde von dem pCAB16-SbfIR-Plasmid gelgereinigt, in pLT7K ligiert und in mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli transformiert. Klone die, die das sbfIR-Gen trugen, wurden im Hinblick auf SbfI-Aktivität auf λ DNA untersucht. Die Extrakte erzeugten ein partielles SbfI-Verdaumuster. Eine DNA-Sequenzierung von pLT7K-SbfIR-Klonen ergab, dass jeder ein intaktes sbfIR-Gen trug. Da die DNA-Sequenz für das Plasmid pLT7K-SbfIR Nr. 12 korrekt war, als das sbfIM-Gen identifiziert und in pACYC184 kloniert wurde, wurde der Klon pLT7K-SbfIR Nr. 12 dann in mit M.SbfI zuvor modifizierten E. coli transformiert. Alle Transformanten wurden kultiviert, mit IPTG induziert und dann im Hinblick auf SbfI-Aktivität auf λ DNA untersucht, wobei ~10⁵ Einheiten/g nasser Zellen von dem überproduzierenden Stamm hervorgebracht wurden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele illustriert. Diese Beispiele sollen zum Verständnis der Erfindung beitragen und sind nicht als sie begrenzend aufzufassen.
Alle oben und im Folgenden genannten Quellenangaben sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
1. BEISPIEL Klonierung des SbfI Restriktionsmodifikationssystems in E. coli
1. Herstellung genomischer DNA
Genomische DNA wurde von 2 g Streptomyces species Bf-61 durch die folgenden Schritte hergestellt:

a. Zellwandverdau durch Zugabe von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1% Endkonz.) und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0.
b. Zelllyse durch Zugabe von 8 ml eines 2× Kirby-Gemischs (2 g Natrium-tri-isopropylnaphthalensulfonat, 12 g 4-Amino-salicylat, 10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8, 6 ml Phenol, gesättigt mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, gebildet in 100 ml dH₂O), Verwirbelung 1 Minute.
c. Entfernung von Proteinen durch Phenol-CHCl₃-Extraktion von DNA, zweimal (gleiches Volumen).
d. Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, viermal Pufferwechsel.
e. RNase-A-Behandlung zum Entfernen von RNA.
f. Präzipitation genomischer DNA in 0,4 M NaCl und einem 0,55 Volumen von 100%igem Isopropanol, Spulung, Trocknung und Resuspension in TE-Puffer.

2. Restriktionsverdau von genomischer DNA und Konstruktion einer genomischen DNA-Bibliothek
Unterschiedliche Einheiten der Restriktionsenzyme Sau3AI, BclI, BstYI, BglII, XbaI und NheI wurden für den Verdau von 10 μg genomischer DNA verwendet, um einen kompletten und einen begrenzten partiellen Verdau zu erreichen. Die verdaute DNA wurde durch Phenol-CHCl₃-Extraktion und Isopropanolpräzipitation gereinigt. Die mit Sau3AI, BclI, BstYI und BglII verdauten DNAs wurden mit BamHI-verdautem und CIP-behandeltem pUC19-Vektor ligiert, der 2 SbfI Orte enthielt. XbaI- und NheI-verdaute DNAs wurden mit dem gleichen Vektor ligiert, der mit XbaI verdaut und CIP-behandelt worden war. Nach einer Übernachtligation wurde die DNA zum Transformieren eines endA^–-Wirts (ER2502, ER2683, New England Biolabs' Sammlung (Beverly, MA)) verwendet, der mit dem CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht wurde. Etwa 2–5000 Ap^R Transformanten wurden von jeder Bibliothek erhalten. Für jedes Enzym wurden Kolonien gepoolt und über Nacht in 500 ml LB + Amp amplifiziert. Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Gradientenreinigung präpariert, woraus sich eine Primärbibliothek ergab.
3. Versuch zur Klonierung des SbfIM Gens durch Methylaseselektion
Die Primärplasmid-DNA-Bibliothek (1 μg DNA) wurde durch einen Verdau mit ~30 Einheiten SbfI bei 37°C 1 Stunde lang angeregt. Die verdaute DNA wurde in ER2502 oder ER2683 durch Transformation transferiert, woraus sich ~750 Ap^R Überlebende von allen Bibliotheken ergaben. Plasmid-DNA von ~120 Überlebenden wurde mit dem Compass-Mini-Plasmid-Kit-Verfahren präpariert, woraufhin ein SbfI Verdau folgte. An keiner der Bibliotheken wurden resistente Klone gefunden. Einige restlichen Überlebenden (Sau3AI, BstYI, XbaI und NheI) wurden außerdem separat gepoolt, um Sekundärbibliotheken zu bilden, mit SbfI ein zweites Mal in Kontakt gebracht, gefolgt von der gleichen Überlebenden-Plasmid-DNA-Reinigung, wobei wieder keine resistenten Klone gefunden wurden.
4. Identifizierung der SbfI-Endonuclease
Die nicht rekombinante SbfI Endonuclease wurde auf nahezu Homogenität gereinigt und das gereinigte Protein wurde einer SDS-PAGE unterzogen. Es wurde eine Proteinbande von ~36 kDa nachgewiesen. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde als (MN)SDGIDGTV ASIDTARALLKRFGFDAQRYNV (SEQ ID NR. 5) ermittelt. Das 36-kDa-Protein wurde mit Cyanogenbromid verdaut und eine 4,5-kDa-Fragment-Aminosäuresequenz wurde als (M)VEEFVPRFAPRSTV LYLGDTRGKHSLFEEEI (SEQ ID NR. 6) ermittelt. Mit diesen beiden Aminosäuresequenzen wurden konvergierende Sätze degenerierter und nicht degenerierter Primer entworfen, um den Beginn des sbfIR Gens von chromosomaler DNA einer PCR zu unterziehen.
Zwei Primersätze wurden mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
Die Primer wurden in zwei separaten PCR-Reaktionen verwendet: sbfN-1 + sbf45a, sbfN-1b + sbf45a-2. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen mit Deep Vent^® DNA-Polymerase. Die PCR von SbfI Chromosomen-DNA mit den obigen Primern brachte ein ~550 bp DNA-Fragment hervor. Die PCR-Fragmente wurden gelgereinigt, mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert. Das resuspendierte PCR-Fragment wurde in pCAB16 am BsaAI-Ort Blunt-End-ligiert, woraufhin eine Transformation in E. coli ER2502 folgte. pCAB16-Klone mit PCR-Inserts wurden mit den folgenden Sequenzierungsprimern sequenziert:
Die DNA-Sequenzierung identifizierte ein offenes Leseraster (ORF) mit 555 bp DNA-Fragment, das das 5'-Ende des sbfIR Gens enthielt.
5. Inverse PCR-Amplifikation von DNA stromabwärts des 5'-Endes des SbfI Endonucleasegens
Nach der Identifikation des N-Terminus des Endonucleasegens wurden Anstrengungen zum Klonieren angrenzender stromabwärtiger DNA unternommen. DNA-Sequenz am N-Terminus des sbfIR-Gens wurde als Matrize für den Primerentwurf verwendet.
Es wurden vier Primer synthetisiert:
Als eine positive Kontrolle wurden die konvergierenden Primer 3A und 5C auf SbfI Chromosomen-DNA verwendet. Für die inverse PCR wurde genomische DNA individuell mit BstBI, BstUI, DraI, HincII, HpyCH4IV, RsaI und ScaI verdaut. Die Verdaus wurden bei 65°C 20 min lang inaktiviert. Die Selbstligation wurde bei einer geringen DNA-Konzentration von 2 μg/ml über Nacht bei 17°C hervorgerufen. Die resultierenden zirkulären DNA-Preps wurden als Matrize für die inverse PCR verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 62°C, 1 min, 72°C, 2 min, 25 Zyklen. Die konvergierenden Primer 3A und 5C erzeugten das sbfIR Kontrollfragment mit ~400 bp. Inverse PCR-Produkte wurden in den HincII und HpyCH4IV Matrizen gefunden. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit Phenol/CH₃Cl extrahiert und mit Ispopropanol präzipitiert. Unmittelbar stromabwärts des 3B-Primers innerhalb des sbfIR N-Terminus befindet sich ein ApoI Ort. Dieser ApoI Ort wurde zum Verdauen der inversen PCR-Produkte an diesem Ort verwendet, gefolgt von einer Übernachtligation in EcoRI- und HincII-verdauten pCU19. Die ligierte DNA wurde durch Transformation in ER2502 und ER2683 tranferiert. Es wurden Plasmide identifiziert, die das inverse PCR-Fragment enthielten, und direkt mit den pUC19-Universalprimern 1233 und 1224 sequenziert. Mit dieser DNA-Sequenz fand eine weitere direkte PCR mit 3B und einem neu entworfenen konvergierenden Primer, Sb-3, mit der folgenden Sequenz statt:
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 2 min, 25 Zyklen. Ein PCR-Fragment, das ~1200 bp des C-terminalen Endes von sbfIR und stromabwärtiger DNA enthielt, wurde durch Phenol/CH₃Cl-Extraktion und Isopropanolpräzipitation gereinigt. Das PCR-Fragment wurde mit ApoI verdaut und in mit EcoRI und HincII verdauten pUC19 ligiert. Die ligierte DNA wurde in ER2683 transformiert und Plasmid-DNA wurde gereinigt. Plasmide mit dem PCR-Fragment wurden mit den pUC19-Universalprimern 1233 und 1224 sequenziert. Nach dem Klonieren und anschließenden Sequenzieren wurde ein ORF mit einer Länge von 969 bp gefunden. Man befand, dass dieses Gen wahrscheinlich das sbfIR Restriktionsgen war, das die SbfI-Endonuclease kodierte, wie anhand der N-terminalen R.SbfI Aminosäureproteinsequenz vorhergesagt. Zusätzliche ~700 bp sequenzierter SbfI Chromosomen-DNA stromabwärts von sbfIR schienen das SbfI Methylasegen nicht zu enthalten.
6. PCR-Amplifikation von DNA stromaufwärts der SbfI-Endonuclease
Nachdem das sbfIM-Gen stromabwärts des Endonucleasegens nicht identifiziert werden konnte, wurden Anstrengungen unternommen, angrenzende DNA stromaufwärts von sbfIR zu klonieren. Eine PCR-Reaktion wurde auf den ursprünglichen pUC19-Primärbibliotheken von Sau3AI, BclI, BstYI, BglII, XbaI und NheI durchgeführt, um die Anwesenheit von sbfIR unter Verwendung der konvergierenden Primer 5C und 3A zu überprüfen:
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 62°C, 1 min, 72°C, 2 min, 25 Zyklen. Alle Bibliotheken, außer der XbaI Bibliothek, enthielten das ~400 bp sbfIR-Fragment, das von diesen beiden Primeren von sbfIR DNA-Sequenz erzeugt werden sollte. Zwei separate PCR-Reaktionen wurden mit den pUC19-Universalprimern 1233 und 1224 mit Primer 5B in Richtung auf das 5' Ende von sbfIR durchgeführt, um zu ermitteln, ob einige dieser pUC19-Bibliotheken möglicherweise DNA stromaufwärts der Sequenz sbfIR enthalten, die vielleicht das SbfI-Methylasegen enthält. Die getesteten Bibliotheken waren die BglII, BclI und Sau3AI pUC19-Bibliotheken. Die PCR-Primer haben die folgende Sequenz:
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 62°C, 1 min, 72°C, 8 min, 25 Zyklen. Die PCR-Primer 1233 und 5B erzeugten ein prädominantes Fragment von ~1,6 kb für die BglII und Sau3AI Bibliotheken und ein ~4,0-kb-Fragment von der BclI Bibliothek, die beide vielleicht groß genug waren, um das ganze SbfI-Methylasegen (sbfIM) aufzunehmen. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert, gefolgt von einer direkten Sequenzierung der PCR-Produkte. Nur das PCR-Fragment von der SbfI Sau3AI-pUC19-partiellen Bibliothek erzeugte eine DNA-Sequenz, die ausreichend lesbar war, um neue PCR-Primer für eine direkte PCR der stromaufwärtigen Region in ihrer Gesamtheit zu entwerfen. Die Sau3AI-Bibliothek-DNA-Sequenz stromaufwärts des sbfIR-Gens wurde als Matrize für den Primerentwurf verwendet und ein neuer konvergierender Primer, 5B-2, wurde von sbfIR DNA-Sequenz in Richtung auf die stromaufwärtige DNA-Sequenz hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus, 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen. PCR-Fragmente von ~1550 bp wurden mit den beiden Primern 5B-2 + S3-2 und 5B-2 + S3-3 auf SbfI Chromosomen-DNA gefunden. Die PCR-Fragmente wurden gelgereinigt, mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert und anschließend mit EcoRI und HindIII verdaut. Die verdaute PCR DNA wurde 15 min lang auf 65°C erhitzt und über Nacht bei 17°C in mit EcoRI und HindIII verdauten pUC19 ligiert. Die ligierte DNA wurde in ER2744 transformiert und eine Kolonie-PCR wurde jeweils an 10 Kolonien mit den pUC19-Universalprimern 1233 und 1224 durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94°C, 1 min, 1 Zyklus; 94°C, 10 sec, 62°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen. Die meisten Kolonien enthielten ein PCR-Fragment von etwa 1500 bp. Plasmid-DNA wurde für 6 Klone, 3 für jedes PCR-Fragment, mit dem CsCl-Verfahren gereinigt und dann mit den Primern 1233 und 1224 sequenziert. DNA-Sequenz wurde nur vom Klon Nr. 5 erhalten, der das durch die Primer 5B-2 + S3-3 erzeugte PCR-Fragment enthielt. Klon Nr. 5 enthielt ein HindIII bis EcoRI Fragment von ~1200 bp, etwas weniger als das ursprüngliche PCR-Fragment. Das gesamte Fragment wurde mit sieben zusätzlichen Primern sequenziert. Die Sequenzierungsprimer haben die folgenden Sequenzen:
Nach dem Sequenzieren von etwa 1,2 kb wurde ein verkürztes ORF mit einer Länge von 1040 bp stromaufwärts des sbfIR Gens gefunden. Diese Sequenz kodierte höchstwahrscheinlich das 3 Ende des SbfI Methylasegens. Als die Aminosäuresequenz dieses ORF mit den bekannten Genprodukten in der GenBank unter Verwendung von BLAST verglichen wurde, wies sie eine sehr hohe Homologie zu N6-Methyladeninmethyltransferasen auf, vor allem zu solchen, die zur PstI-Erkennungsfamilie gehören. Man fand, dass das sbfIM-Transkriptions-(TGA)-Stoppcodon das (GTG)-Startcodon für das SbfI Endonucleasegen (sbfIR) überlappte. Eine DNA-Sequenzierung über die Junktion deckte auf, dass zusammen mit dem GTG-Start eine zusätzliche Aminosäure, nämlich Serin (S), vorhanden war, die R.SbfI eine Aminosäure länger machte als anhand der N-terminalen Aminosäure vorhergesagt. Die ursprüngliche inkorrekte Sequenz ist (MN)SDGIDGTVASIDTARALLKRFGFDAQRYNV (SEQ ID Nr. 36). Tatsächlich hat R.SbfI eigentlich eine Länge von 323 Aminosäuren und nicht von 322 Aminosäuren, und die N-terminale Sequenz ist MNSSDGIDGTVASIDTARALLKRFGFDAQ RYNV (SEQ ID Nr. 37). Mit dem zusätzlichen Serin umfasst das vollständige SbfI Endonucleasegen (sbfIR) 971 bp. Die DNA-Sequenzierung von Nr. 5 brachte außerdem einen unbekannten HindIII Ort innerhalb sbfIM zum Vorschein, der das ursprüngliche 5B-2 + S3-3 PCR-Fragment verkürzte. DNA zwischen dem S3-3 Primer und diesem HindIII Ort ging bei der Klonierung verloren.
7. Inverse PCR-Amplifikation von DNA stromaufwärts von SbfI-Endonuclease und Identifizierung von SbfI-Methylase
Nach der Identifizierung des verkürzten Methylasegens wurden Anstrengungen unternommen, um angrenzende DNA, die das 5' Ende von sbfIM kodierte, unter Verwendung von inverser PCR zu klonieren. Mit dieser sbfIM DNA-Sequenz wurden neue Primer mit der folgenden Sequenz entworfen:
Die genomische DNA wurde mit HincII in einem geeigneten Restriktionspuffer verdaut und 20 min lang bei 65°C inaktiviert. Eine Selbstligation wurde bei einer geringen DNA-Konzentration von 2 μg/ml über Nacht bei 17°C hervorgerufen. Das zirkuläre DNA-Produkt wurde als Matrize für die inverse PCR verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94°C, 5 min, 1 Zyklus; 94°C, 30 sec, 62°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen. Das PCR-Fragment wurde von einem Agarosegel gelgereinigt, mit Phenol/CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert. Das resuspendierte PCR-Fragment wurde bei 17°C über Nacht Blunt-End-ligiert in pCAB16, verdaut am BsaAI-Ort, gefolgt von einer Transformation in ER2502 E. coli-Zellen. Plasmid-DNA wurde von zwölf Kolonien gereinigt. Zehn schienen das PCR DNA-Fragment zu enthalten. Vier Klone wurden direkt mit den folgenden Primern sequenziert:
Mit der DNA-Sequenzierung wurde ein offenes Leseraster (ORF) mit einem 495 bp DNA-Fragment identifiziert, das das 5' Ende von sbfIM enthielt. Die kombinierte DNA-Sequenz stromaufwärts des sbfIR-Gens deckte das gesamte SbfI-Methylasegen (sbfIM) auf. Das sbfIM Gen umfasst 1460 bp und kodiert eine translatierte SbfI Methylase von 486 Aminosäuren. Eine Transkription von M- und R-Genen ist in die gleiche Richtung orientiert. Sie sind in einer Kopf-Schwanz-Weise angeordnet (1).
2. BEISPIEL
Expression des SbfIR Gens in E. coli
Da mit dem bevorzugten Methylaseselektionsverfahren kein SbfI-Methylasegen hervorgebracht werden konnte, wurden zunächst Anstrengungen unternommen, das sbfIR-Gen in einen mit M.PstI zuvor modifizierten E. coli-Stamm zu klonieren, um einen sbfIR-Klon mit der korrekten DNA-Sequenz zu bilden. Das pstIM Gen wurde zuerst von pBEA-14 Plasmid amplifiziert, das die PstI-Methylase enthielt (bereitgestellt von Bill Jack und Lucia Greenough, New England Biolabs (Beverly, MR)). Das pstIM Gen wurde in ein Plasmid geringer Kopiezahl, pACYC184, mit p15A Ursprung und Cm^R Selektionsmarker kloniert. Die PCR-Primer haben die folgenden Sequenzen:
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen mit Deep Vent^® DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt wurde mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert, gefolgt von einem BamHI- und SphI-Verdau über Nacht bei 37°C. Verdaute DNA wurde mit pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Nach der Übernachtligation wurde die DNA in ER2744 durch Transformation transferiert. Nach dem Screenen von 10 Plasmiden, die von individuellen Cm^R (33 mg/ml) Transformanten isoliert wurden, enthielt ein Klon, pACYC184-PstIM Nr. 4, das korrekte pstIM-Fragment, wie anhand BamHI- und SphI-Verdau gezeigt wurde. ER2744 [pACYC184-PstIM Nr. 4] wurde mit dem CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht. Der zuvor modifizierte Wirt ER2744 [pACYC184-PstIM] wurde zur Bildung der SbfI-Endonuclease verwendet.
Zwei PCR-Primer wurden zur PCR-Amplifikation des sbfIR Gens synthetisiert.
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen mit Deep Vent^® DNA-Polymerase. PCR DNA, die das sbfIR-Gen enthielt, wurde von genomischer DNA amplifiziert und durch Phenol/CH₃Cl-Extraktion und CH₃Cl-Extraktion gereinigt, mit Isopropanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die PCR DNA wurde mit pCAB16 am BsaAI Ort Blunt-End-ligiert. Die ligierte DNA wurde in mit M.PstI zuvor modizierten E. coli ER2744 [pACYC184-PstIM] transformiert und Ap^R Cm^R Transformanten wurden bei 37°C selektiert [Ap^R Cm^R: (100 mg/ml) und (33 mg/ml)]. Nach dem Screenen von 12 Plasmiden wurden 4 Klone gefunden, die Inserts enthielten. 500 ml LB + Amp Kulturen der Klone Nr. 1 und Nr. 7 wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde von 450 ml jeder Zellkultur durch das CsCl-Verfahren gereinigt und die jeweils anderen 50 ml der Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 2 ml Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. Zellen wurden durch Beschallung lysiert und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Das Zelllysat wurde auf I-DNA im Hinblick auf SbfI Aktivität untersucht. Weder für den pCAB16-SbfIR Klon Nr. 1 noch für Nr. 7 wurde SbfI Aktivität nachgewiesen. Beide pCAB16-SbfIR Klone wurden direkt mit den folgenden Primern sequenziert:
Die DNA-Sequenz wies eine intakte sbfIR in entgegengesetzter Orientierung zu Plac und mspIR auf. Die pCAB16-sbfIR Klone Nr. 1 und Nr. 7 enthielten die korrekte DNA-Sequenz für sbfIR, so dass ein Versuch unternommen wurde, das SbfI Endonucleasegen von pCAB16-sbfIR Nr. 1 und Nr. 7 in pLT7K zu subklonieren und dann in ER2744 [pACYC184-PstIM] zu transformieren. Unter Verwendung der flankierenden BamHI und XhoI Orte, die innerhalb der PCR-Primer konstruiert waren, wurden 10 μg von jedem pCAB16-sbfIR Plasmid mit BamHI und XhoI 2 Stunden lang bei 37°C verdaut und das sbfIR Fragment wurde von einem Agarosegel gelgereinigt, mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert. Das resuspendierte PCR-Fragment wurde über Nacht bei 17°C in pLT7K mit kompatiblen Enden ligiert, gefolgt von einer Transformation in ER2744 [pACYC184-PstIM], und auf Ap^R CM^R Platten bei 37°C plattiert. Plasmid-DNAs wurden von 18 Kolonien (jeweils 9 von gelreinem pCAB16-sbfIR Nr. 1 und Nr. 7) gereinigt, 6 Klone wurden gefunden, die das PCR-Insert trugen. pLT7K-SbfIR Nr. 5, Nr. 12 und Nr. 14 wurden in vorgewärmte 10-ml-Kulturen inokuliert, die LB + Ap^R CM^R enthielten, und über Nacht bei 37°C ohne Schütteln wachsen gelassen. 2 ml der Übernachtkulturen wurden in vorgewärmten 50-ml-Kulturen verdünnt, die LB + Ap^R Cm^R enthielten, und bei 37°C auf eine OD590 zwischen 0,8 und 1,0 wachsen gelassen. IPTG wurde zu 85 mg/l gegeben und induzierte etwa 2 Stunden lang bei 30°C. Zellen wurden geerntet und durch Beschallung lysiert. Geklärte Zelllysate wurden im Hinblick auf SbfI-Aktivität auf I-DNA untersucht. Die Extrakte erzeugten ein partielles SbfI Verdaumuster. pLT7K-SbfIR Nr. 12 wurde mit den folgenden Primern sequenziert:
Die DNA-Sequenz von pLT7K-SbfIR Nr. 12 zeigte, dass er ein intaktes sbfIR Gen trug. Kurz nach diesem Ergebnis wurde das SbfI Methylasegen (sbfIM) vollständig durch inverse PCR identifiziert und sequenziert. Es wurde eine letzte Strategie angewendet, bei der das sbfIM Gen von einem Plasmid geringer Kopiezahl exprimiert wurde und das Endonucleasegen von pLT7K-SbfIR Nr. 12 dann in diesen mit SbfI zuvor modifizierten E. coli Wirt transferiert wurde. Das sbfIM Gen wurde zuerst von genomischer DNA in einer PCR-Reaktion amplifiziert und in ein Plasmid geringer Kopiezahl, pACYC184, mit p15A Ursprung und CM^R Selektionsmarker kloniert. Die PCR-Primer haben die folgenden Sequenzen:
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°, 1 min, 72°C, 1 min, 30 Zyklen mit Deep Vent^® DNA-Polymerase. PCR DNA, die das sbfIM-Gen enthielt, wurde von genomischer DNA amplifiziert und durch Phenol/CH3Cl-Extraktion gereinigt, mit Isopropanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die PCR DNA wurde mit pCAB16 am BsaAI Ort Blunt-Endligiert. Die ligierte DNA wurde in ER2502 transformiert und CM^R Transformanten wurden bei 37°C selektiert. Nach dem Screenen von 12 Plasmiden wurden zwei pCAB16-sbfIM Klone, Nr. 3 und Nr. 5, vollständig mit den folgenden Primern sequenziert:
Die DNA-Sequenz wies eine intakte sbfIM in beiden Orientierungen zu Plac und mspIR auf. Die pCAB16-sbfIR Klone Nr. 3 und Nr. 5 enthielten die korrekte DNA-Sequenz für das sbfIM Gen, so dass ein Versuch unternommen wurde, das SbfI Methylasegen von pCAB16-sbfIR Nr. 3 und Nr. 7 in das Plasmid geringer Kopiezahl, pACYC184, mit p15A Ursprung und Cm^R Selektionsmarker zu subklonieren. Mit den flankierenden BamHI und SphI Orten, die innerhalb der PCR-Primer konstruiert waren, wurden jeweils 5 μg pCAB16-SbfIM Plasmid mit BamHI und SphI 2 Stunden lang bei 37°C verdaut und die sbfIM-Fragmente wurden von einem Agarosegel gelgereinigt und kombiniert, mit Phenol-CH₃Cl extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert. Das resuspendierte PCR-Fragment wurde über Nacht bei 17°C in pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert, worauf eine Transformation in ER2848 folgte, und dann im Hinblick auf Cm^R Transformanten selektiert. Plasmid-DNA wurde von 8 Kolonien gereinigt und eine PCR wurde auf zwei Klonen, Nr. 6 und Nr. 7, mit den Primern sbf5M und sbfIM durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95°C, 5 min, 1 Zyklus; 95°C, 1 min, 54°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen mit Deep Vent^® DNA-Polymerase. pACYC184-SbfIM Nr. 6 und Nr. 7 enthielten das Insert korrekter Größe für sbfIM.
Das Plasmid pACYC184-SbfIM Nr. 7 wurde in ER2848 transferiert, um E. coli zuvor zu modifizieren. Zellen wurden mit dem CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht, und es wurde eine letzte Strategie angewendet, wobei das sbfIM-Gen von einem Plasmid geringer Kopiezahl, [pACYC184-SbfIM], und das Endonucleasegen von [pLT7K-SbfIR] exprimiert wurde. Das Isolat pLT7K-SbfIR Nr. 12 wurde in ER2848 [pACYC184-SbfIM] tansferiert und auf AP^R CM^R Platten über Nacht bei 37°C plattiert. Zwei individuelle Kolonien wurden in 10 ml LB + AP^R Cm^R inokuliert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. 1 ml jeder Übernachtkultur wurde in 50 ml LB + AP^R Cm^R inokuliert und bei 37°C auf eine OD590 von 0,8 bis 1,0 wachsen gelassen, anschließend wurde die Kulturtemperatur auf 30°C gesenkt, woraufhin eine IPTG-(85 mg/l)-Induktion bei 30°C über einen Zeitraum von 2 Stunden bis zur ganzen Nacht folgte. Beide individuellen Klone exprimierten R.SbfI zu mehr als ~10⁵ Einheiten/g nasser E. coli Zellen (8).
Der Stamm NEB Nr. 1500, ER2848 [pACYC184-SbfIM Nr. 7, pLT7K-SbfIR Nr. 12] wurde am 5. August 2003 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC Akzessionsnummer PTA-5371 hinterlegt. SEQUENZAUFLISTUNG
QUELLENANGABEN IN DER BESCHREIBUNG
Die von der Anmelderin angeführten Quellen werden lediglich der Information halber gegeben. Sie stellen keinen Bestandteil des europäischen Patentdokuments dar. Obschon größte Sorgfalt bei der Zusammenstellung der Quellenangaben angewendet wurde, können Fehler oder Auslassungen nicht ausgeschlossen werden. Das EPA übernimmt diesbezüglich keine Haftung.
In der Beschreibung werden die folgenden Patentdokumente genannt:

– US 5200333 A [0006] [0022]
– US 5098839 A [0022]
– EP 04077615 A [0083]

In der Beschreibung angeführte Nicht-Patentliteratur

– Cloned Restriction-Modification Systems – A Review. Wilson, G. G. Gene. Elsevier Biomedical Press, Januar 1988, Bd. 74 [0007]

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die SbfI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von ATCC Nr. PTA-5371 erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment nach Anspruch 1 eingefügt wurde, das die SbfI Restriktionsendonuclease kodiert.
Isoliertes DNA-Segment, das die SbfI Restriktionsendonuclease und SbfI Methylase kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von ATCC Nr. PTA-5371 erhältlich ist.
Vektor, der die isolierte DNA aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, transformiert durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 4.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanter SbfI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease beinhaltet.