CN118086157A - 生产阿卡波糖的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
生产阿卡波糖的工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供生产阿卡波糖的工程菌及其应用。本发明的生产阿卡波糖工程菌是将产阿卡波糖的游动放线菌中malL基因失活而得到，经发酵，得到的阿卡波糖的发酵单位较出发菌株提高了24.7％，杂质A的组分含量由0.42％下降至约0.06％。本发明获得的菌株稳定性好，阿卡波糖产量大幅度提高，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生产阿卡波糖的菌株。
背景技术
阿卡波糖(Acarbose)是一种理想的Ⅱ型糖尿病治疗药物。
通过微生物发酵法生产阿卡波糖是目前的主要生产方式，但有多种杂质伴随生成。其中，药典中对杂质A含量限度为0.6％。杂质A为阿卡波糖的同分异构体，与阿卡波糖结构极为接近。为达到标准，生产中需采用多步层析工艺去除，致使阿卡波糖纯化工艺复杂，收率低。专利CN108624544B公开了游动放线菌△MG-4，其发酵产物中杂质A含量为0.42％，在0.6％以内，但与药典规定的含量限度还是较为接近的。因此，进一步运用基因工程技术改造游动放线菌，提高阿卡波糖的产量、降低杂质A含量，从而降低成本，具有重要的意义。
发明内容
基于此，本发明申请人在专利CN108624544B的基础上，进一步对游动放线菌进行改造，获得了阿卡波糖高产菌株，提高阿卡波糖发酵单位的同时降低了杂质A的含量。
在第一个方面，本发明提供一种生产阿卡波糖的工程菌，所述工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌中malL基因失活，其中，所述产阿卡波糖的游动放线菌是CN108624544B中的△
MG-4，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些优选的实施方式中，所述malL基因失活指malL基因缺失。进一步优选地，所述缺失为全部基因缺失或部分基因缺失。
在一种优选的实施方式中，所述malL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述失活是SEQ ID NO:1所示序列中第111～1669位核苷酸缺失。
在一种优选的实施方式中，所述工程菌是游动放线菌△MG-4与片段P发生同源重组而形成，其中，片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在第二个方面，提供产阿卡波糖的工程菌的构建方法，包括将游动放线菌△MG-4中的malL基因失活，其中，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述malL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些优选的实施方式中，所述构建方法包括：将游动放线菌△MG-4与片段P发生同源重组，其中，片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述同源重组是通过将游动放线菌△MG-4的菌丝与含有片段P的重组菌共同培养进行接合转移而完成。
本发明中所述的片段P，自5’端到3’端分别为同源臂T1和同源臂T2，同源臂T1和同源臂T2能够与malL基因发生同源重组，从而失活malL基因。
优选地，所述同源臂T1由malL基因编码序列的5’端110bp核苷酸和malL基因上游片段组成，同源臂T2由malL基因编码序列的3’端32bp核苷酸和malL基因下游片段组成。
所述片段P分别在同源臂T1和同源臂T2包含malL基因编码序列的5’端和3’端序列，但缺失malL基因中间一部分编码序列。当T1、T2与出发游动放线菌的malL基因的上下游发生同源重组，所述片段P将被重组至游动放线菌的基因组中；因其缺失malL基因的部分序列，使malL基因无法表达正常产物或不表达，从而使构建的游动放线菌中的malL基因中断失活。本领域技术人员可以理解，当malL基因的5’端和3’端分别被扩增后，需要将二者连接起来以形成完整的DNA片段。通常情况下，本领域技术人员可使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段或者采用无缝克隆试剂盒进行无缝拼接。限制性内切酶的选择、无缝克隆引物设计、PCR扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领域技术人员根据所使用的质粒、菌株和实验条件可以选择和判断的。
本发明方法通过构建包含DNA片段P的质粒和重组菌，利用重组菌与出发游动放线菌同源重组而完成。本领域技术人员可以根据实验条件而选择合适的原始质粒和菌株，构建出合适的包含DNA片段P的质粒和重组菌。
优选地，包含片段P的质粒为SupAmT-malL-UD，其构建过程包括：
(1)将载体SupCosⅠ以HicⅡ+DraⅠ双酶切，与质粒pIJ773以XbaⅠ+BstBⅠ双酶切后连接，得到载体SupAmT；
(2)以△MG-4的基因组为模板，以引物malLU-F(SEQ ID NO:4)和malLU-R(SEQ IDNO:5)进行扩增，产物与以XbaⅠ酶切的载体SupAmT连接，得到重组质粒SupAmT-malL-U；
(3)以△MG-4的基因组为模板，以引物malLD-F(SEQ ID NO:6)和malLD-R(SEQ IDNO:7)进行扩增，产物与以XbaⅠ酶切的SupAmT-malL-U连接，得到重组质粒SupAmT-malL-UD。
优选地，包含片段P的重组菌是ET12567(pUZ8002,SupAmT-malL-UD)，其构建过程为：将质粒SupAmT-malL-UD转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)得到。
在一种优选的实施方式中，生产阿卡波糖的工程菌的构建方法包括将重组菌ET12567(pUZ8002,SupAmT-malL-UD)与△MG-4进行接合转移，使片段P与malL基因发生同源重组而得到。
在第三个方面，本发明提供生产阿卡波糖的工程菌在制备阿卡波糖中的应用。
在第四个方面，本发明提供一种制备阿卡波糖的方法，所述方法包括发酵本发明的生产阿卡波糖的工程菌。
在第五个方面，本发明提供片段P、包含所述片段P的重组质粒或重组菌在构建生产阿卡波糖的工程菌中的应用，所述片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在第六个方面，本发明提供malL基因在构建杂质A组分降低的阿卡波糖工程菌中的应用，其中，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。优选地，所述malL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的关键在于使氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质无法正常表达，从而降低杂质A的含量，提高阿卡波糖的产量。因此，任何编码SEQ ID NO:2所示序列的核苷酸序列都视为malL基因。在本发明中，malL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本领域技术人员应当理解，与SEQ ID NO:1序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性、且编码序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸片段的核苷酸片段，都属于本发明的malL基因范围内。
本发明通过同源重组中断失活malL基因，获得的生产阿卡波糖工程菌经发酵，得到的阿卡波糖的发酵单位相较于出发菌株游动放线菌△MG-4，提高了24.7％；杂质A组分的含量由0.42％下降至约0.06％。本发明采用基因工程技术突破了传统菌种选育的盲目性，获得的菌株稳定性好，阿卡波糖产量大幅度提高，降低了生产成本，保证了产品质量，提高了经济效益。
附图说明
图1：用于malL基因双交换的重组质粒SupAmT-malL-UD构建过程示意图；
图2：重组质粒SupAmT-malL-U的结构及酶切位点示意图；
图3：构建的质粒SupAmT-malL-U的酶切电泳检测图：其中M是DNA标记物(Fermentas#SM0333)，泳道1～2分别是质粒SupAmT-malL-U以XbaⅠ和HindⅢ双酶切、PstⅠ和KpnⅠ双酶切后的电泳图；
图4：重组质粒SupAmT-malL-UD的结构及酶切位点示意图；
图5：构建的重组质粒SupAmT-malL-UD的酶切电泳检测图：其中M是DNA Ladder，泳道1～4分别是质粒SupAmT-malL-UD以BglⅡ、XbaⅠ和SphI双酶切、ApaⅠ、XhoⅠ和SphⅠ双酶切后的电泳图；
图6：malL基因双交换原理及酶切位点示意图；
图7：malL基因中断重组子PCR筛选的电泳图：其中泳道1～6是待检测菌株游动放线菌△malL-1#～△malL-6#；7是质粒SupAmT-malL-UD(正对照)；8是出发菌游动放线菌△MG-4(负对照)；M是DNA标记物；
图8：阿卡波糖标准品的HPLC图谱；
图9：出发菌游动放线菌△MG-4发酵产物阿卡波糖的HPLC图谱；
图10：工程菌游动放线菌△malL-3#发酵产物阿卡波糖的HPLC图谱。
具体实施方式
以下将结合具体实施例说明本发明，本发明的内容不限于此。
如无明确说明，以下方法中使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例所描述的内容可以毫无疑义地施行所述方法并获得相应的结果。
所使用的工具酶均购自大连宝生物(TakaRa)公司；DNA分子量标记购自赛默飞世尔科技；胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自康宁生物技术有限公司；无缝克隆试剂盒采用生工生物工程(上海)股份有限公司；使用方法参考商品说明书。
引物和测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
质粒SupAmT为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，由载体SupCosⅠ(美国Stratagene公司)/HicⅡ+DraⅠ与质粒pIJ773/XbaⅠ+BstBⅠ双酶切后连接获得。
本发明出发菌株为游动放线菌△MG-4，根据CN108624544B的制备方法得到的，CN108624544B的全部内容通过引用的方式结合至本文。
具体地，游动放线菌△MG-4的构建过程为：保藏号为CGMCC No.7639的游动放线菌8-22与序列号如SEQ ID NO:11所示的DNA片段发生同源重组，获得△MG-4。
实施例1：用于中断malL基因的重组质粒SupAmT-malL-UD的构建
构建过程如图1所示，具体步骤如下：
a)游动放线菌基因组的提取：根据放线菌DNA提取试剂盒(北京三博远志生物技术有限公司)上的说明进行操作，提取△MG-4的基因组。
b)malL基因上游片段的扩增和克隆：引物为：
malLU-F：gatcttcacctagatcctttTCGCGTTCCGGCCAGCACCAGTC(SEQ ID NO:4)
malLU-R：tccgaagttcctattctctagaAGGTGGCCGATGATCCCGCGCAG(SEQ ID NO:5)按以下配比配制反应液：
(PrimeSTAR试剂盒，TaKaRa)
进行PCR反应，程序为：
95℃×5分钟，
(98℃×15秒、60℃×15秒、72℃×3分钟)×25个循环，
72℃×10分钟，
16℃×1分钟。
PCR产物以PCR产物回收试剂盒回收后，与以XbaⅠ酶切的载体SupAmT用无缝克隆试剂盒进行无缝拼接连接，得到重组质粒SupAmT-malL-U。
质粒SupAmT-malL-U的结构及酶切位点如图2所示。分别利用PstⅠ和KpnⅠ双酶切、以及XbaⅠ和HindⅢ双酶切构建的质粒以检测是否正确。质粒SupAmT-malL-U的酶切电泳图如图3所示。经验证，质粒构建正确。
c)malL基因下游片段的扩增和克隆：引物为：
malLD-F：cgggatcatcggccaccttctagaGGCAGGCCGTCGTCTACAAACGCACG(SEQ ID NO:6)
malLD-R：ctattccgaagttcctattcCGTACGTGCTGGCCGGTGAGCTGAGC(SEQ ID NO:7)按以下配比配制反应液：
进行PCR反应，程序为：
95℃×5分钟，
(98℃×15秒、65℃×15秒、72℃×3分钟)×25个循环，
72℃×10分钟，
16℃×1分钟。
PCR产物以PCR产物回收试剂盒回收后，与以XbaⅠ酶切的SupAmT-malL-U进行无缝拼接连接，得到重组质粒SupAmT-malL-UD。
重组质粒SupAmT-malL-UD的结构及酶切位点如图4所示。分别用BglⅡ、XbaⅠ和SphI双酶切、ApaⅠ、XhoⅠ和SphⅠ双酶切构建的质粒以检测是否正确。质粒SupAmT-malL-UD的酶切电泳图如图5所示。经验证，质粒构建正确。
进一步测序检验质粒SupAmT-malL-UD中引物malLU-F和malLD-R之间的序列，其中从序列TCGCGTTCCGGCCAGCACCAGTC(引物malLU-F部分序列)开始至序列GCTCAGCTCACCGGCCAGCACGTACG(引物malLD-R的反向互补部分序列)之间的序列即为SEQ IDNO:3所示的连接片段P的序列。
实施例2：将malL基因中断的重组质粒SupAmT-malL-UD转化到宿主菌游动放线菌△MG-4
a)将重组质粒SupAmT-malL-UD转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)：取1μl质粒SupAmT-malL-UD加入到100μl大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞(以CaCl2法制备)中，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，再迅速放到冰上冷却1分钟，加入900μl LB培养，37℃水浴50分钟。取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素(以下简称Cm)、50μg/ml卡那霉素(以下简称Km)、50μg/ml安普霉素(以下简称Am)的固体LB培养上，37℃培养过夜，长出转化子，挑选其中一个转化子并鉴定已转入质粒SupAmT-malL-UD，命名为ET12567(pUZ8002,SupAmT-malL-UD)。
b)大肠杆菌ET12567(pUZ8002,SupAmT-malL-UD)的培养：挑一个转化子单菌落于3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Am的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养过夜，菌液300μl接种于30ml含Cm、Km、Am的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养4-6h，至OD600为0.4～0.6之间。收集菌液，离心后，以LB培养基洗涤2遍，最后以3ml LB培养基悬浮，备用。
c)宿主菌△MG-4菌液的准备：从平板上刮游动放线菌△MG-4的菌丝，在30ml TSB培养基中，28℃培养至菌液黑色。取菌液3ml转接于30ml TSB培养基中，28℃培养6h。取500μl菌液，离心去上清后，以500μl的2×YT培养基悬浮，37℃水浴20min，冷却备用，得孢子悬液。
d)接合转移：取500μl b)的菌液加入到500μl c)的孢子悬液中，混匀后离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体，并涂布于STY平板(蔗糖3％、胰蛋白胨0.5％、酵母抽提粉0.5％、酸水解酪蛋白0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.005％、琼脂2％)。28℃培养16-20h后，以含有500μg Am和500μg甲氧苄啶(以下简称Tmp)的1ml无菌水覆盖，28℃培养5-7d，长出转化子。
双交换过程的原理图如图6所示。
实施例3：malL基因中断的游动放线菌工程菌的筛选培养及鉴定
a)挑一个转化子，在含有50μg/ml Am和50μg/ml Tmp的YMS培养基(酵母抽提物0.4％、可溶性淀粉0.4％、麦芽抽提粉1.0％、氯化钴0.0005％、琼脂2％)上划线，28℃培养5-6d。将生长的菌落在不含抗生素的YMS培养基上28℃连续培养2代后，再在不含抗生素的YMS培养基上划线分离单菌落，28℃培养5-6d。
b)用牙签将a)得到的单菌落分别于含和不含50μg/ml Am的YMS培养基上点种，28℃培养5-6d。挑选在含50μg/ml Am的YMS培养基上不生长而在不含Am的YMS培养基上生长的菌落，在不含抗生素的YMS培养基上进行放大培养。
c)利用PCR方法对放大培养的菌株进行筛选，所用的引物为：
malL-F3：GGCGAACAGGGTGACGTCCA(SEQ ID NO:8)
malL-R3：GGCCTGGAGACCGACCTGCT(SEQ ID NO:9)
按以下配比配制反应液：
15μl/管分装，分别用牙签挑取步骤b)所筛选的菌落为模版进行PCR反应，并以1.0μl△MG-4总DNA和重组质粒SupAmT-malL-UD分别为负对照和正对照。PCR反应程序为：
95℃×5分钟，
(94℃×30秒、55℃×30秒、72℃×2分钟)×25个循环，
72℃×5分钟，
16℃×1分钟。
PCR产物大小为2173bp的是回复突变；即其基因型与出发菌△MG-4相同；PCR产物大小为620bp的是malL基因中断的游动放线菌工程菌。图7是PCR筛选的电泳图。选择第3#菌，命名为△malL-3#，对该菌株进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO:10所示。PCR电泳结果与测序结果说明该菌株即是本发明预期的菌株。
实施例4：malL基因中断的游动放线菌工程菌△malL-3#的发酵检验
将malL基因中断的游动放线菌工程菌△malL-3#在YMS培养基上28℃培养6-7天后，将菌丝接种到30ml种子培养基(黄豆饼粉3.0％、玉米淀粉1.0％、葡萄糖1.0％、甘油2.0％、CaCO30.20％、pH自然)中，28℃，250rpm培养约42hr，以2ml的接种量转接到发酵培养基(葡萄糖3.0％，麦芽糖5.0％，黄豆饼粉1.2％，K2HPO4 0.10％，CaCl2·H2O 0.35％，FeCl30.05％，CaCO3 0.3％，谷氨酸钠0.1％)，28℃，250rpm培养7d。取发酵液5ml过滤离心后，取0.5ml滤液，加入4.5ml无水甲醇，浸泡过夜后，过滤。取滤液以HPLC检测阿卡波糖的含量。
其中HPLC方法为：色谱柱：5μm氨基柱(月旭科技，250×4.6mm)；流动相：0.6g磷酸二氢钾、0.35g磷酸氢二钠、1000ml水、3000ml乙腈；波长210nm；流速1.0ml/分钟。以同样的方法检测出发菌株△MG-4的发酵产物以进行对比。
检测结果如图8、9、10及表1所示。其中标准品购自中国食品药品检定研究院。
表1：工程菌△malL-3#与出发菌株△MG-4发酵液中阿卡波糖及杂质A的含量对比
从图8、图9和图10及表1可知，出发菌△MG-4发酵液样品中的阿卡波糖含量为5878mg/L，杂质A含量0.42％；malL基因中断后的工程菌△malL-3#发酵液样品中的阿卡波糖含量为7331mg/L，杂质A含量0.06％；相较于出发菌株，阿卡波糖发酵单位提升了24.7％，杂质A含量也大大降低。
序列表
SEQ ID NO:1malL基因的编码序列
atgacggattcgtggtggaagaaggcggtcgtctaccagatctatccgcggagcttcgcggactcggacggtgacggcatgggcgacctgcg
cgggatcatcggccacctcgaccatctcgccgaactcggcgtggacgtgctctggttgtcgccggtctatccctcgccgcaggacgacaacgg
ttacgacatcagcgactatcagaacatcgagccgatgttcggcaccctggagatcttcgacgagctgctcgccggtgcgcacgcccggggcat
gaaaatcgtgatggacctggtggtcaaccacagctcggacgagcacccgtggttcgccgagagccggtcgtcgcgggacaccccgaaacgg
gactggtactggtggcggccggcccgcgagggcatggagccgggcacgccgggcgccgagccgaccaactggggttcggtgttcggcgg
cccggcctgggagttcgacgagaagaccggcgagtactacctgcacctgttctcccgtaagcagcccgacctcaactgggagaacccggag
gtgcgccaggccgtctacgcgatgatgcggtggtggctggaccggggcgtggacggcttccggatggacgtgatcaacatgatctccaaggt
cacgccgctgccggacgggcggctgtcggccggcgccgcatacgcggacggctcggccggcttcgtcggtggcccgcgcctgcacgagtt
cctcaaggagatgtaccgcgaggtcttcgacggccgcggtgagctgctcaccgtcggcgagatgcccggcgtcacggtcgacgaggcccgg
gtgcacaccgacccggccgagcacgagatcgacatggtgttccagttcgaccacgtctgggccgaccgcggtcctgacccgtggctgctgca
gaaacttcagctgaccaacctcaaggcgatcctcggccggtggcaggccgggctcgccgaggtgggctggaacagcctgtactggaacaac
cacgaccagccgcggatcgtctcccgctacggcgacgactcaccggagcaccgggtcgcctcggccaagatgctcggcaccgtgctgcacc
tgcaccgcggcacgccctacgtctaccagggcgaggagctcgggatgacgaactacccgttccgcggcatcgaggacttccgcgacatcga
ggcgctcgggcagtacaagcaggccctggagttggaggggcgcagcgccgaggcggtgctgaccgtgctgcgcgcccgcggccgggac
aacgcgcgcaccccgatgcagtgggacgactcgccgcaggccgggttcaccaccggcacgccgtggctggcggtcaacccgaactatccg
cagatcaacgcggcggcgcagcgggccgacccggactcggtcttccactactaccgcagactgatcgagctgcggcacaccgagccggcc
gtcgccctgggcgacttcaccatgctgctgccgcacgacgagcggttgtacgccttcacccgccgcctggacgccaccgagctcctggtgatc
ggcaacttcaccggcgagaccgtccaggcggagatcgcggacgccgcgtcctgggcgcacgccgacgtgctgatcaccaacgtccccggc
gccaccccgcggaacctgaccctggccccctggcaggccgtcgtctacaaacgcacggtctga
SEQ ID NO:2malL基因编码的氨基酸序列
mtdswwkkav vyqiyprsfa dsdgdgmgdl rgiighldhl aelgvdvlwl spvypspqddngydisdyqn iepmfgtleifdellagaha rgmkivmdlv vnhssdehpw faesrssrdt pkrdwywwrparegmepgtp gaeptnwgsv fggpawefdektgeyylhlf srkqpdlnwe npevrqavya mmrwwldrgvdgfrmdvinm iskvtplpdg rlsagaayad gsagfvggprlheflkemyr evfdgrgell tvgempgvtvdearvhtdpa eheidmvfqf dhvwadrgpd pwllqklqlt nlkailgrwqaglaevgwns lywnnhdqprivsrygddsp ehrvasakml gtvlhlhrgt pyvyqgeelg mtnypfrgie dfrdiealgqykqalelegrsaeavltvlr argrdnartp mqwddspqag fttgtpwlav npnypqinaa aqradpdsvfhyyrrlielrhtepavalgd ftmllphder lyaftrrlda tellvignft getvqaeiad aaswahadvlitnvpgatpr nltlapwqav vykrtv
SEQ ID NO:3片段P
tcgcgttccggccagcaccagtccgggtcggacccgggcaggccgatcaccgtggccgcgtcgccgagcaggtcggcggcgagccggtc
gcgcgggtcggcgcggagcacctcggccgcgcccagtccggcgaaggccatcgcccgcggccaggtggagcggcgggtggctccgagg
tggaaggcgtaccgcgcctcacgccggatccagccggcggtgctgcgcgcggccgcggtgcccagcccccacagggcgcggccccacca
gtcgcccagcgacggctcgtcctgccagcgccggtcatagcccatccggttgcggaacgcgccgtcggcgtcctgggcgtgggtcaggaag
gccaggtagcgttcaccggcccggagcacctcgggggccggccggggctcccggctgaccaccagcaggccccgggacacgtcgtcgac
gcagtagccgtgctcgcgccggacgatcgcggtgcgcgcgtgttccagcagcccggtgtcgtcggagagccggagcacgtgatcgaagcg
cggctccggtacgtcggtgagccggaccggcggcggaatcagccgcagcccctggctcatgccgtgagggtcgcggccggcagcggcac
gcggtcggcgagcaggcgggcggccagcgactggtaccgggcggcgaccgccggccagcgcagggtcggcccgccggcgagcccgg
cgaggcgcccgggcagtccgggctcggccagcacgtgccggatcgcgcaggccatcgcctccgggtcctggtgcggcacgagcagcccg
gggccgctggccagcaactcgacggcgtgcgggaactcggtggcgaccaccggcaccccggcgcccaccgcctcgatcagcaccccgga
ggtgacctgctcggtcgagtcgtaggggagcaccaccgcgtccgccgaccggatcagccgggacagttcaccggcgtccaggtaggcatcg
agccagcggaccgatgcggtcacgtcgaggtcgtcggcgagcgacttgagcccgtcccggtacacgtcgccctgctgttcgagcaccttcgg
gtgggtgcggccggcgacggtgtagatcggggccgggctcaggtcgtcgagcagcgcgagggcccgcagcgcccattcgatgcccttgcc
cgggccgagcaggccccaggtgagcaggtgcggccggtcgtggtcctcgcggggcaccccggcgtggctgccggcgccgtgcgggatca
ccgtgatcttgcgagggttcaccgcgtagttcgtggtcagtcgctgccgggcggtgtcggtcatggtcaccacggcatcggcgacctcggcgat
ctgctccagcaccgcgcgctgcagggtgtcgggttgggtgaggacggtgtgcagcaccacgatggagggcaccttgagcgcgtgcagcagc
ggcagcacctcggcgccggcgtcacccgggtagatgccgtactcgtgctggatcaccgcgacgtcgaaccggttgagcgcggcggcggcc
cccgcccagccgccgggcagatcggtgtgccaggtgtgcaccacccggggcgcggcccggtcgagtgcgatgccgccgctggtgttgtcc
cgggcgagcagccgcaccaccccggatccggcggttgcgccgggcgttccggcggccagatgcatggcgagtgccgcattgaacgtcgcc
aaaccgcattgtgtgggcggataagtactcaaaaacccgtatgtcgcgggcatgactggcctttctctcctcggccggctgcctccggcgcagc
gcggacaccgcgcgcgggcatgactacgggcaccgcgcgtgaacggcgtagaggcgtttcgggaaatgtcccgtttaacgcgcaattcacat
ggggaccgtaacaagatcaagcttttcagcagacgatttttcggtaaatcgccaggtacgcgtcgaccatccgatccgcgccgaagcgttcccg
cgcccgggccgaacaaacccggcgatccagggcggcgacctcgtcgaccgcggccaccgcctcgtcgaccgagccgaccaggcgtccg
gtgacgccctcgtccaccacctcgggcatggagcccttccggtacgcgatcaccggcgtaccgcagatcatcgattccacgacggagagccc
gaacggctcggcgaaccggatcgggtgcagcagcgccgccccggagccgaggatcgcaccgcgctcctcggggccgaccgagccgaga
tagaccactcggtcgccgtcgatcagcggctcgaccttctcccggaagaatcgccggtcctggacgatcccgcagatcaccagccgccggcc
ggcccgtcgggcgatctcgacggccagatcggtgcccttgtccgggtggatccggccgaacaggatcagatcgtcgccgccggtggtgtgca
gcggcagtccgtccaggtcgacgccgtggtgcacggtggccacgtagtccagttccggcgaccggtcgctgtccgagatcgagacgaaccg
ggacttcgctctccggtacgccgggaggatgttcgccccggagaacccgtgcaccgtggtcagcatcggcgcggcgcagtgtgcggagaac
gccagtggtagccagtccaggtggttgtggatcaggtcgaactcgccggagcgggccagcgcgtggctgacgtggatcgcctcccagaccc
ggccgtcgaggctgtcgctctcctcgtacccggtcggcacgacgccgtccagggtggccttggtgaccgagtccagggtggcgaacagggt
gacgtccacgccgcgcgcggtcagcccctcggcgagcaggctggtgatcagttcccacgggccgtagtgcaccgggggagtgcgccaggc
gatcggcccgagcagcgcgatcttcacgacaaaacacacttttcggtaataagcacgtgatcagtatgcctctccgtcaccgcgcggaaccgcc
cgttctcgtgttagagaagaccaatgacggattcgtggtggaagaaggcggtcgtctaccagatctatccgcggagcttcgcggactcggacg
gtgacggcatgggcgacctgcgcgggatcatcggccaccttctagaggcaggccgtcgtctacaaacgcacggtctgatccgcgccgccga
cggtcaggtgcagcgtggagctgtgccggaccgtcgtgcgggtgggcaccagccgggtggcggtggcggccagtccggcaggtcgcgcc
actcgtcgacgccgccgacgtggacccggacccgccgctccggcgcgccgccccgcagccgccgcaacgcctgcccgaagacctcggtc
catcccgcgctgagcgtgctggtgtgggtccacggcccgatcagcaggtcggtctccaggccggcgtcccggcgtcgccgatagagcgtga
ctggcgggccgacctactcgcgctctgcgtcatgcagcgcgcgctgatgctggcccacccgtggctgcccggcgtgctggccgggcgccgg
ctgatcgggcgcaatctgctcggcttcctggagcacgggctgcgcgcgctgcagccggccgggctgcccggggtcgccgggatgaccctgc
tcggcctgctcaccggcttcgtggcgtcctacgtgaccagcgaactggccgacgcctcggacgcggtggcgcagatcggggcggcggtggc
gaccggggacttcccgctgctggcccggacgctcggcgagggcgggacgccgctggacttcccgcgcatcgcggactggatgatcaccgg
tctggtcgagcgggcggaacaccggtaatcgagcttttttcacagaaatggccacaagccactcctgtccccggcaaggtgacacatggtcgc
cggtacacacccgatctgacccctcccgccggcgcccggggagtaacgcatgcgccgcaaccggctcgccgcccgtctcgtcaccgccctg
gtcgccgtcaccccggcgatcgccctggccctggtcggtctcggcccggcgccggccggcggtgacccgctgctgcagaccttcgccctca
ccggcggcctgcggctggccgcggacggcgccggcgcggacgtcgagcggtccctcccggaacgcgacaccaaaccgttcagcctggtc
ggggtcacctgggacgacccgcgcgcggtggcggccgggaccatccaggtgcgcacccgcccggccggccgccgcacctggacgccgt
ggcgcgagctggagaccgacgcgcccgacgagtccggcggccaggccgtccggggcgccagcgacccgctctgggtgggcccgtcgga
cggtgtgcaggcccgggtgatcgccgccggcgcggcccgggcgctgccggccgggatgcgggtcgacctgatcaacccggacgcccggc
cggcgccggtggcggacgcgatggcgccggcggcggccgagcggctccgccggatcgccggggtggagatcccggaccggccggtgc
cgcggatgctgacccgggccgcctggggcgccgacgagcggatggtgcgggagaagcccgcgtacaccggtccggtccaggtgttcttcgt
gcaccacacggcgaccggcaacgactacagctgcgggtcgtcgaccagcgtggtccgcggtatccaggcgtaccaggtgaagagcaaggg
ctggaacgacatcggctacaacttcctggtcgacaagtgcggcaccatcttcgaggggcggcgcggcgggatcacccgcaatgtgctcggcg
cgcacaccctgggcttcaacaccgacgccagcgcggtcgcggtgatcggcgactaccgcggcaccgcggccggttcggccaccgaggtcg
cggtggcccagctcgccgcgtacaagctgggcgcggccgggaacgcgccggacggccgggtggtggtcacctccggtggtggaccgaaa
taccggcccggcacccgggtccggctgtaccggatctccggccaccgcgacgccggactcaccgaatgcccggggaccagcctgtatcgcc
ggctgccggcgatccgggcgctcgccggtggtgctccggccgggctgcgcttcgccaaactgaccggttcgacccgctggggcggcgccta
ctggacccgggggtcgctcaccccgctgtggtcgctgagcacccccgggcaactgctcaaccgattcgacgtgtacgtcgacggcgacctcg
tcctctcccgggcgtccaccgaacgtctcggtcagcttcagctgagtcccggcccgcacaccgtcacggtcaaggccctgcacctgtccgggc
gcagcgccaccgccaccgtcaaggtgatcgccgacgtcgagccgcccgccttcaccacgctgccgcaggcctcgctgagctccgggacgat
cgggaccagcaccccggtccgactggactggtcggccgacgacccggccgggatccgcgccgccgcgatcagcggggccagccgggcc
accctcgacggggcgatccgcagcctcaccggcaccgcaccggtgggcgccgcgtccagctggacggtggcggtcaccgaccatgccgg
caacgaacggacggcgtcgatcagtcgtaccccggcaatcgtcgcggacagcgacgcgacccggaccggaagctggcggacggtatcgg
acagccatcatctcggtggtgcggcgtccgccgccgccagcgacagcgcggcgttgagctggaccttcaccggccgctccgcggccgtcgt
ggcggcccgcaacccggcggcgggccggctcaagatctatctcgacggcgatttcctggggtacgtcgatctccgctccgccgcgccgcaat
accgccgcctggtctggacccaggcgtggagcaccgcgaacgagcacaccgtgaaggtcgtcccggaagccaccgccgggcgcccgacg
gtgaccgtggacgggctcgcctatctgcgctgagcgcccgccggggtcagcccgtagtccttcaggacgatcgcgtcggccttggcgaactg
gctcgccatcaggtcccggatcggccagcgggtcatcatgcccatcgtcttcgcccgggtcttgatccacagggcggacttcggggccatccc
ggccgcgccacccggcggcagcttcgtgccggtcgccacgtacccggccatctcgctctggtaggcggcgaacgcccgctccggatccccg
tgccggctcagctcaccggccagcacgtacg
SEQ ID NO:4引物malLU-F：
gatcttcacctagatcctttTCGCGTTCCGGCCAGCACCAGTC
SEQ ID NO:5引物malLU-R：
tccgaagttcctattctctagaAGGTGGCCGATGATCCCGCGCAG
SEQ ID NO:6引物malLD-F：
cgggatcatcggccaccttctagaGGCAGGCCGTCGTCTACAAACGCACG
SEQ ID NO:7引物malLD-R：
ctattccgaagttcctattcCGTACGTGCTGGCCGGTGAGCTGAGC
SEQ ID NO:8引物malL-F3：
GGCGAACAGGGTGACGTCCA
SEQ ID NO:9引物malL-R3：
GGCCTGGAGACCGACCTGCT
SEQ ID NO:10工程菌△malL-3#测序结果
Ggcgaacagggtgacgtccacgccgcgcgcggtcagcccctcggcgagcaggctggtgatcagttcccacgggccgtagtgcaccgggg
gagtgcgccaggcgatcggcccgagcagcgcgatcttcacgacaaaacacacttttcggtaataagcacgtgatcagtatgcctctccgtcacc
gcgcggaaccgcccgttctcgtgttagagaagaccaatgacggattcgtggtggaagaaggcggtcgtctaccagatctatccgcggagcttc
gcggactcggacggtgacggcatgggcgacctgcgcgggatcatcggccaccttctagaggcaggccgtcgtctacaaacgcacggtctgat
ccgcgccgccgacggtcaggtgcagcgtggagctgtgccggaccgtcgtgcgggtgggcaccagccgggtggcggtggcggccagtccg
gcaggtcgcgccactcgtcgacgccgccgacgtggacccggacccgccgctccggcgcgccgccccgcagccgccgcaacgcctgcccg
aagacctcggtccatcccgcgctgagcgtgctggtgtgggtccacggcccgatcagcaggtcggtctccaggcc
SEQ ID NO:11构建△MG-4的DNA片段
ttgaaaatcg cggtcgtggg tggcggatcc acctataccc cggagctggt ggacgggttcgcccggctcg gcaccatggtcaccgaactc gttctgatcg acccgtctag aactagtgga tcccccgggctgcaggaatt cgatatcaag cttcgcagta acatatctccgttaactagc ctcatgctcg catggcctgtgaagtcacta tttgtgcgtt gtgatccaca cgcgccataa attaacacgc gtgccacgctgaatatagtgaatcgatacg aggaactcgc cctcgacgcc gccctgcgcg gtggccgcga ccgtgtctaccgggcgctgctggcccaccc gctgatcggc cagcacgaaa gggccaccgc cctcaccgac aggctgatcgccgccggccg tgaccacctcgcgtgggccc gatga。
Claims (9)
1.一种生产阿卡波糖的工程菌，所述工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌中malL基因失活，其中，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述产阿卡波糖的游动放线菌是CN108624544B中的△MG-4；优选地，所述malL基因失活指malL基因缺失；进一步优选地，所述malL基因失活是SEQ ID NO:1所示序列中第111～1669位核苷酸缺失。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其中，所述工程菌是游动放线菌△MG-4与片段P发生同源重组而形成，其中，片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌的构建方法，包括将产阿卡波糖的游动放线菌中的malL基因失活，其中，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述产阿卡波糖的游动放线菌为△MG-4，所述malL基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，包括：将游动放线菌△MG-4与片段P发生同源重组，其中，片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；优选地，所述同源重组是通过将游动放线菌△MG-4的菌丝与含有片段P的重组菌共同培养进行接合转移而完成。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述含有片段P的重组菌是ET12567(pUZ8002,SupAmT-malL-UD)，其构建过程为：将质粒SupAmT-malL-UD转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)得到；
其中，质粒SupAmT-malL-UD的构建过程为：
(1)将载体SupCosⅠ以HicⅡ+DraⅠ双酶切，与质粒pIJ773以XbaⅠ+BstBⅠ双酶切后连接，得到载体SupAmT；
(2)以△MG-4的基因组为模板，以引物malLU-F(SEQ ID NO:4)和malLU-R(SEQ ID NO:5)进行扩增，产物与以XbaⅠ酶切的载体SupAmT连接，得到重组质粒SupAmT-malL-U；
(3)以△MG-4的基因组为模板，以引物malLD-F(SEQ ID NO:6)和malLD-R(SEQ ID NO:7)进行扩增，产物与以XbaⅠ酶切的SupAmT-malL-U连接，得到重组质粒SupAmT-malL-UD。
6.权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌在制备阿卡波糖中的应用。
7.一种制备阿卡波糖的方法，包括发酵权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌。
8.片段P、包含片段P的重组质粒或重组菌在构建生产阿卡波糖的工程菌中的应用，其中，所述片段P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
9.malL基因在构建杂质A组分降低的阿卡波糖工程菌中的应用，其中，所述malL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述malL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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| CN202211503813.3A CN118086157A (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 生产阿卡波糖的工程菌及其构建方法和应用 |
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2022
- 2022-11-28 CN CN202211503813.3A patent/CN118086157A/zh active Pending
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