JP2003210176A - ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents
５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法Info
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- JP2003210176A JP2003210176A JP2002013552A JP2002013552A JP2003210176A JP 2003210176 A JP2003210176 A JP 2003210176A JP 2002013552 A JP2002013552 A JP 2002013552A JP 2002013552 A JP2002013552 A JP 2002013552A JP 2003210176 A JP2003210176 A JP 2003210176A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 従来にない新規５置換ヒダントインラセマー
ゼを単離し、当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造
方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質。(a)Ｆｌａｖｏｂｃｔｅｒｉｕｍ由来の特定のア
ミノ酸配列(b)上記のアミノ酸配列において１または数
個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位
を含むアミノ酸配列
ゼを単離し、当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造
方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質。(a)Ｆｌａｖｏｂｃｔｅｒｉｕｍ由来の特定のア
ミノ酸配列(b)上記のアミノ酸配列において１または数
個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位
を含むアミノ酸配列
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規５置換ヒダン
トインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換え
ＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の
製造方法に関し、特に、ラセミ化反応を効率的に触媒す
る新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードす
るＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および
光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
トインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換え
ＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の
製造方法に関し、特に、ラセミ化反応を効率的に触媒す
る新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードす
るＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および
光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】５置換ヒダントインラセマーゼ（以下
「ＨＲａｓｅ」とも記す）は、光学活性な５置換ヒダン
トイン化合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダント
イン化合物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒す
る酵素である。
「ＨＲａｓｅ」とも記す）は、光学活性な５置換ヒダン
トイン化合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダント
イン化合物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒す
る酵素である。
【０００３】５置換ヒダントイン化合物は、下記反応式
（I）に示すように、、の酵素による加水分解反応
を経てアミノ酸となる。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ、以下「ＨＨａ
ｓｅ」とも記す）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ、以下「ＣＨａｓｅ」とも記す。また、一般にカ
ルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはカルバミラーゼと略
称される場合がある）。
（I）に示すように、、の酵素による加水分解反応
を経てアミノ酸となる。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ、以下「ＨＨａ
ｓｅ」とも記す）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ、以下「ＣＨａｓｅ」とも記す。また、一般にカ
ルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはカルバミラーゼと略
称される場合がある）。
【０００４】
【化１】
【０００５】５置換ヒダントイン化合物から光学活性ア
ミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、
少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従
来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と
化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この
５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製
造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製
造に重要である。
ミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、
少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従
来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と
化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この
５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製
造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製
造に重要である。
【０００６】微生物酵素系あるいは微生物酵素系と化学
反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイ
ン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性
アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマ
ーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに
変化させる必要がある。ところが、基質とならない光学
活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめ
て遅いものもあり、ラセミ化が律速となって効率的に光
学活性アミノ酸に変換することができないといった問題
があった。
反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイ
ン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性
アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマ
ーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに
変化させる必要がある。ところが、基質とならない光学
活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめ
て遅いものもあり、ラセミ化が律速となって効率的に光
学活性アミノ酸に変換することができないといった問題
があった。
【０００７】そこで、中性条件下での光学活性５置換ヒ
ダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅ
の検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属
細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.
Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４
６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由
来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７
４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されてい
る。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反
応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter
sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.
Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアース
ロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００
株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５
９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomon
as sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。これら
の菌株はいずれもＬ−アミノ酸生産菌である。
ダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅ
の検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属
細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.
Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４
６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由
来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７
４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されてい
る。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反
応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter
sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.
Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアース
ロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００
株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５
９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomon
as sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。これら
の菌株はいずれもＬ−アミノ酸生産菌である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、工業
的応用の観点から、ＨＲａｓｅは有用である。従って、
本発明の目的は、従来にない新規ＨＲａｓｅを単離し、
当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供す
ることにある。
的応用の観点から、ＨＲａｓｅは有用である。従って、
本発明の目的は、従来にない新規ＨＲａｓｅを単離し、
当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供す
ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】５置換ヒダントイン化合
物からＤ−アミノ酸を生産する菌株については既に報告
があるものの、Ｄ−アミノ酸生産菌の中でＨＲａｓｅ活
性を有するものについては報告がなく、また、上記のよ
うにＨＲａｓｅはＬ−アミノ酸生産菌に由来するものし
か見出されていなかった。しかしながら、本発明者ら
は、Ｌ−アミノ酸生産菌に限らずＤ−アミノ酸生産菌に
ついても幅広く探索を続けたところ、初めてＤ−アミノ
酸生産菌の中からＨＲａｓｅ活性を有する菌を見出し、
本発明を完成させるに至った。
物からＤ−アミノ酸を生産する菌株については既に報告
があるものの、Ｄ−アミノ酸生産菌の中でＨＲａｓｅ活
性を有するものについては報告がなく、また、上記のよ
うにＨＲａｓｅはＬ−アミノ酸生産菌に由来するものし
か見出されていなかった。しかしながら、本発明者ら
は、Ｌ−アミノ酸生産菌に限らずＤ−アミノ酸生産菌に
ついても幅広く探索を続けたところ、初めてＤ−アミノ
酸生産菌の中からＨＲａｓｅ活性を有する菌を見出し、
本発明を完成させるに至った。
【００１０】即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 〔２〕 フラボバクテリウム属細菌を培養して得た菌体
を破砕または溶菌後、精製処理を行うことにより取得さ
れるフラボバクテリウム属細菌由来の５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ画分。 〔３〕 請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダ
ントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 〔４〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒ
ダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素また
は当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用
させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造
方法。 〔５〕 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が
光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物
であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダント
イン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミ
ノ酸の製造方法。 (i)上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 〔６〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダント
イン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該
酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水
分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化
合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の
製造方法。 〔７〕 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒ
ダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 〔８〕 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、５置
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 〔２〕 フラボバクテリウム属細菌を培養して得た菌体
を破砕または溶菌後、精製処理を行うことにより取得さ
れるフラボバクテリウム属細菌由来の５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ画分。 〔３〕 請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダ
ントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 〔４〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒ
ダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素また
は当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用
させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造
方法。 〔５〕 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が
光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物
であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダント
イン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミ
ノ酸の製造方法。 (i)上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 〔６〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダント
イン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該
酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水
分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化
合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の
製造方法。 〔７〕 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒ
ダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 〔８〕 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、５置
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列
〔９〕 上記〔７〕または〔８〕のいずれかに記載のＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 〔１０〕 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミ
ド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体である
ことを特徴とする上記
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 〔１０〕 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミ
ド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体である
ことを特徴とする上記
〔９〕に記載の組み換えＤＮＡ。
〔１１〕 上記
〔９〕または〔１０〕に記載の組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 〔１２〕 前記細胞は、エシェリヒア コリであること
を特徴とする上記〔１１〕に記載の細胞。 〔１３〕 上記〔１１〕または〔１２〕に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 〔１２〕 前記細胞は、エシェリヒア コリであること
を特徴とする上記〔１１〕に記載の細胞。 〔１３〕 上記〔１１〕または〔１２〕に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明について、
［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製造
方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以
下本明細書においては、特に断る場合を除き、「ＨＲａ
ｓｅ」には５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質を含めるものとする。
方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以
下本明細書においては、特に断る場合を除き、「ＨＲａ
ｓｅ」には５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質を含めるものとする。
【００１２】［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
５置換ヒダントイン化合物から、酵素を用いてアミノ酸
を製造するに際しては、上記反応式(I)に示したように
２種の酵素が用いられる。したがって、ＨＲａｓｅを探
索する場合、原料となる所定の光学活性５置換ヒダント
イン化合物から目的の光学活性を有するアミノ酸が得ら
れないからといってＨＲａｓｅ活性がないとは限らな
い。たとえＨＲａｓｅ活性が存在していたとしても、Ｈ
ＨａｓｅやＣＨａｓｅの活性不良による場合も考えられ
るからである。また、原料となる５置換ヒダントイン化
合物自体が自発的にラセミ化するような条件下で試験を
するのもＨＲａｓｅ活性の有無の検索としては不適当で
ある。
を製造するに際しては、上記反応式(I)に示したように
２種の酵素が用いられる。したがって、ＨＲａｓｅを探
索する場合、原料となる所定の光学活性５置換ヒダント
イン化合物から目的の光学活性を有するアミノ酸が得ら
れないからといってＨＲａｓｅ活性がないとは限らな
い。たとえＨＲａｓｅ活性が存在していたとしても、Ｈ
ＨａｓｅやＣＨａｓｅの活性不良による場合も考えられ
るからである。また、原料となる５置換ヒダントイン化
合物自体が自発的にラセミ化するような条件下で試験を
するのもＨＲａｓｅ活性の有無の検索としては不適当で
ある。
【００１３】そこで、本発明者らは、光学活性ベンジル
ヒダントインは酵素反応が行われるような中性条件下で
は、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことを確認す
ると共に、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅの活性が十分にある
実験系を確立した上で幅広くＨＲａｓｅ活性を有する菌
体を探索したところ、Ｄ−アミノ酸生産菌であるフラボ
バクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１
１９９株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考えるに至っ
た。この考えに基づき、本発明者らは、新規ＨＲａｓｅ
の存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からＨＲ
ａｓｅを精製単離するとともに、新規ＨＲａｓｅである
ことを見いだした。
ヒダントインは酵素反応が行われるような中性条件下で
は、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことを確認す
ると共に、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅの活性が十分にある
実験系を確立した上で幅広くＨＲａｓｅ活性を有する菌
体を探索したところ、Ｄ−アミノ酸生産菌であるフラボ
バクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１
１９９株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考えるに至っ
た。この考えに基づき、本発明者らは、新規ＨＲａｓｅ
の存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からＨＲ
ａｓｅを精製単離するとともに、新規ＨＲａｓｅである
ことを見いだした。
【００１４】また、本発明者らは、フラボバクテリウム
エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株由
来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列を
決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列から演繹
した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これをプロ
ーブとして利用しフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属
細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功
した。
エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株由
来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列を
決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列から演繹
した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これをプロ
ーブとして利用しフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属
細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功
した。
【００１５】すなわち、本発明のＨＲａｓｅをコードす
る代表的なＤＮＡは、特公昭５６−０２５１１９号に記
載のフラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium s
p.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色
体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、フラ
ボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１
１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株はアルカリゲネス
アクアマリヌス(Alcaligenes aquamarinus)として通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
た微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム
エスピー(Flavobacterium sp.)に分類されることが判
明した。現在では、フラボバクテリウムエスピー(Flavo
bacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２
９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物
寄託センターに寄託されている。
る代表的なＤＮＡは、特公昭５６−０２５１１９号に記
載のフラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium s
p.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色
体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、フラ
ボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１
１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株はアルカリゲネス
アクアマリヌス(Alcaligenes aquamarinus)として通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
た微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム
エスピー(Flavobacterium sp.)に分類されることが判
明した。現在では、フラボバクテリウムエスピー(Flavo
bacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２
９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物
寄託センターに寄託されている。
【００１６】上記微生物について、細菌の分類学書であ
るバージェーズ マニュアル オブデターミネイティブ
バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウイリ
アム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわせて
生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
るバージェーズ マニュアル オブデターミネイティブ
バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウイリ
アム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわせて
生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
【００１７】フラボバクテリウム エスピー(Flavobact
erium sp.)ＡＪ１１１９９の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 − インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 ＋ ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
erium sp.)ＡＪ１１１９９の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 − インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 ＋ ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
【００１８】以上の菌学的性質より、ＡＪ１１１９９菌
をフラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)
と同定した。
をフラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)
と同定した。
【００１９】図１に示すように、上記菌株で見出された
本発明のＨＲａｓｅは、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａ
ｓｅ遺伝子とともにオペロンを形成していると考えられ
る。図１中、はＳａｕ３Ａ Ｉ／Ｓａｕ３Ａ Ｉ断片で
あり、はＳｐｈ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ断片である。
本発明のＨＲａｓｅは、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａ
ｓｅ遺伝子とともにオペロンを形成していると考えられ
る。図１中、はＳａｕ３Ａ Ｉ／Ｓａｕ３Ａ Ｉ断片で
あり、はＳｐｈ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ断片である。
【００２０】なお、添付した本発明の配列表において、
上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１２に示し、ＣＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１４に示す。また、ＨＲａｓｅ遺
伝子、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子を含む
構造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号１１に示
す。配列番号１１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３
８１７〜４５４８が本発明のＨＲａｓｅをコードし、塩
基番号２３４１〜３７９８がＨＨａｓｅをコードし、塩
基番号３０６〜１２２０がＣＨａｓｅをコードしてい
る。
上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１２に示し、ＣＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１４に示す。また、ＨＲａｓｅ遺
伝子、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子を含む
構造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号１１に示
す。配列番号１１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３
８１７〜４５４８が本発明のＨＲａｓｅをコードし、塩
基番号２３４１〜３７９８がＨＨａｓｅをコードし、塩
基番号３０６〜１２２０がＣＨａｓｅをコードしてい
る。
【００２１】これらのＤＮＡは、フラボバクテリウム
エスピー（Flavobacterium sp. ）ＡＪ１１１９９株の
染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれもＤ−
アミノ酸の製造に用いることができるタンパク質をコー
ドするものである。
エスピー（Flavobacterium sp. ）ＡＪ１１１９９株の
染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれもＤ−
アミノ酸の製造に用いることができるタンパク質をコー
ドするものである。
【００２２】また、配列表の配列番号２に、配列表の配
列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸
配列を示し、配列表の配列番号１３に、配列表の配列番
号１２の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配
列を示し、配列表の配列番号１５に、配列表の配列番号
１４の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列
を示す。
列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸
配列を示し、配列表の配列番号１３に、配列表の配列番
号１２の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配
列を示し、配列表の配列番号１５に、配列表の配列番号
１４の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列
を示す。
【００２３】配列表の配列番号２に記載のＨＲａｓｅ
は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に用いられて、下
記反応式（II）に例示するように、５−ベンジルヒダン
トインに代表される５置換ヒダントイン化合物から、Ｄ
−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生
成する反応を触媒する。
は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に用いられて、下
記反応式（II）に例示するように、５−ベンジルヒダン
トインに代表される５置換ヒダントイン化合物から、Ｄ
−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生
成する反応を触媒する。
【００２４】
【化２】
【００２５】次に、本発明の新規ＨＲａｓｅについて、
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅ
の活性測定等、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細
に説明する。
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅ
の活性測定等、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細
に説明する。
【００２６】(1)ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＨＲａ
ｓｅ遺伝子は、前述したようにフラボバクテリウム エ
スピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９株の染色体
ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１
の塩基配列は、本発明をなす以前に本発明者らが既に見
いだしていた、マイクロバクテリウムリクエファシエン
ス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２株由来
のＨＲａｓｅ（特願２００１−２７８７３９号記載）
と、アミノ酸配列において４３％の相同性を示す。
ｓｅ遺伝子は、前述したようにフラボバクテリウム エ
スピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９株の染色体
ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１
の塩基配列は、本発明をなす以前に本発明者らが既に見
いだしていた、マイクロバクテリウムリクエファシエン
ス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２株由来
のＨＲａｓｅ（特願２００１−２７８７３９号記載）
と、アミノ酸配列において４３％の相同性を示す。
【００２７】なお、マイクロバクテリウム リクエファ
シエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１
２は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavobact
erium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）と
して１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オー
レオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacteriu
m liquefaciens ）に分類されることが判明した。さら
に現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム
リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）
はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１
３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
寄託されている。
シエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１
２は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavobact
erium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）と
して１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オー
レオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacteriu
m liquefaciens ）に分類されることが判明した。さら
に現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム
リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）
はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１
３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
寄託されている。
【００２８】次にフラボバクテリウム属細菌からＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡを取得する方法について説明す
る。
ｓｅをコードするＤＮＡを取得する方法について説明す
る。
【００２９】はじめに、精製されたＨＲａｓｅのアミノ
酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem.
Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定
することができる。またApplied Biosystems社製のシー
クエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができ
る。本発明のフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅ
について、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定
し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基
配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem.
Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定
することができる。またApplied Biosystems社製のシー
クエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができ
る。本発明のフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅ
について、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定
し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基
配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３０】演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基
対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成す
る方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示
されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサ
イザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分
子は、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属細菌染色体
遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして
利用できる。あるいは、フラボバクテリウム属細菌由来
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際
に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を
用いて増幅されるＤＮＡはフラボバクテリウム属細菌由
来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を含んでいないの
で、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとし
て用いて、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅを
コードするＤＮＡ全長をフラボバクテリウム属細菌染色
体遺伝子ライブラリーから単離する。
対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成す
る方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示
されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサ
イザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分
子は、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属細菌染色体
遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして
利用できる。あるいは、フラボバクテリウム属細菌由来
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際
に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を
用いて増幅されるＤＮＡはフラボバクテリウム属細菌由
来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を含んでいないの
で、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとし
て用いて、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅを
コードするＤＮＡ全長をフラボバクテリウム属細菌染色
体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３１】ＰＣＲ法の操作については、White, T.J.
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
【００３２】単離されたフラボバクテリウム属細菌由来
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方
法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John
Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、
Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用い
て、塩基配列を決定することができる。フラボバクテリ
ウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表
配列番号１に示す。
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方
法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John
Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、
Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用い
て、塩基配列を決定することができる。フラボバクテリ
ウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表
配列番号１に示す。
【００３３】なお、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲ
ａｓｅをコードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示さ
れるＤＮＡだけではない。すなわち、フラボバクテリウ
ム属に属する細菌の種および株ごとに、塩基配列の違い
が観察されるはずだからである。
ａｓｅをコードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示さ
れるＤＮＡだけではない。すなわち、フラボバクテリウ
ム属に属する細菌の種および株ごとに、塩基配列の違い
が観察されるはずだからである。
【００３４】また、本発明のＤＮＡは単離されたＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、フ
ラボバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡから単離された
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えた
ＤＮＡであっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、
本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法とし
て頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,
154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法があ
る。
ｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、フ
ラボバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡから単離された
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えた
ＤＮＡであっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、
本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法とし
て頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,
154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法があ
る。
【００３５】また、配列表配列番号１に記載の塩基配列
とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
ＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６
０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０
℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましく
は６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、
「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。た
だし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合に
は、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
ＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６
０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０
℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましく
は６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、
「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。た
だし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合に
は、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３６】さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮ
ＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわ
ち、（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、（b）配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を
有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ、も本発明のＤＮＡに含まれ
る。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質
の立体構造や、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を大
きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５
０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１
０個である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活
性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下
で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していること
が望ましい。
ＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわ
ち、（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、（b）配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を
有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ、も本発明のＤＮＡに含まれ
る。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質
の立体構造や、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を大
きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５
０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１
０個である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活
性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下
で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していること
が望ましい。
【００３７】（2）ＨＲａｓｅの活性測定等
つぎに、精製されたフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲ
ａｓｅの活性測定等について説明する。
ａｓｅの活性測定等について説明する。
【００３８】本発明のＨＲａｓｅは前述した遺伝子の単
離と解析より明らかにされるように、代表的には配列表
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本
発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同
じアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質も含むものである。より具
体的には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有
し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタ
ンパク質をも含むものである。さらに、配列表配列番号
２のアミノ酸配列およびこれと実質的に同じアミノ酸配
列を有するタンパク質であれば、複数の酵素活性を有す
る複合的なタンパク質であってもよい。
離と解析より明らかにされるように、代表的には配列表
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本
発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同
じアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質も含むものである。より具
体的には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有
し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタ
ンパク質をも含むものである。さらに、配列表配列番号
２のアミノ酸配列およびこれと実質的に同じアミノ酸配
列を有するタンパク質であれば、複数の酵素活性を有す
る複合的なタンパク質であってもよい。
【００３９】すなわち、本発明のＨＲａｓｅは、下記
(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質である。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性」の定義は上記（1）ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡの項の説明と同義である。
(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質である。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性」の定義は上記（1）ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡの項の説明と同義である。
【００４０】本発明のＨＲａｓｅは、５置換ヒダントイ
ン化合物のラセミ化反応を触媒する。
ン化合物のラセミ化反応を触媒する。
【００４１】本発明のＨＲａｓｅのＨＲａｓｅ活性の測
定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン
化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化
を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することに
より行うことが可能である。
定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン
化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化
を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することに
より行うことが可能である。
【００４２】具体的には、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−また
はＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸
−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液
を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした
後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ4、１１．１ mM Ｈ3Ｐ
Ｏ4溶液を添加することにより反応を停止させる。２
０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた
後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ
化活性を見積もる。なお、酵素活性の単位として、この
条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活
性をもって１Ｕと定義する。
はＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸
−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液
を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした
後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ4、１１．１ mM Ｈ3Ｐ
Ｏ4溶液を添加することにより反応を停止させる。２
０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた
後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ
化活性を見積もる。なお、酵素活性の単位として、この
条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活
性をもって１Ｕと定義する。
【００４３】ＨＰＬＣを用いた分析光学活性ＢＨの定量
分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６
ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行うことができる。分析条件
の具体例は以下の通り。 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ4カラム 温度：５０℃ 流速：１．５ ml/分 検出：ＵＶ210 この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．
２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出する。
分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６
ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行うことができる。分析条件
の具体例は以下の通り。 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ4カラム 温度：５０℃ 流速：１．５ ml/分 検出：ＵＶ210 この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．
２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出する。
【００４４】（3）ＨＲａｓｅの製造方法
次に本発明のＨＲａｓｅの製造方法について説明する。
本発明のＨＲａｓｅの製造方法としては、(3-1) 微生物
培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(3-2)
組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅを生成する形質転
換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当
該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
本発明のＨＲａｓｅの製造方法としては、(3-1) 微生物
培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(3-2)
組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅを生成する形質転
換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当
該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
【００４５】(3-1) 微生物培養により生成蓄積する方法
微生物培養により生成蓄積する方法において、ＨＲａｓ
ｅの取得源となる微生物としてはフラボバクテリウム(F
lavobacterium)属に属する微生物があげられる。好適な
ものとしては、フラボバクテリウム エスピー(Flavoba
cterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）
株などがあげられる。
ｅの取得源となる微生物としてはフラボバクテリウム(F
lavobacterium)属に属する微生物があげられる。好適な
ものとしては、フラボバクテリウム エスピー(Flavoba
cterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）
株などがあげられる。
【００４６】フラボバクテリウム属に属する微生物の培
養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工
業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養
培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭
素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用
できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを
使用できる。
養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工
業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養
培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭
素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用
できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを
使用できる。
【００４７】通気条件としては、好気条件を採用する。
培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産され
る範囲であればよい。従って、厳密な条件は無いが、通
常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養
時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、
ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すればよく、
通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度
である。
培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産され
る範囲であればよい。従って、厳密な条件は無いが、通
常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養
時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、
ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すればよく、
通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度
である。
【００４８】培養後菌体を遠心分離（たとえば、１０，
０００×ｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体
中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させる
ことにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音
波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白
リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組
み合わせた方法が用いられる。
０００×ｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体
中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させる
ことにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音
波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白
リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組
み合わせた方法が用いられる。
【００４９】フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅ
を精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製す
ることになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在する
ようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈
殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
を精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製す
ることになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在する
ようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈
殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
【００５０】酵素の精製には、通常酵素の精製を行うた
めに用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマト
グラフィー法等を採用することができる。その結果、よ
り比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができ
る。
めに用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマト
グラフィー法等を採用することができる。その結果、よ
り比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができ
る。
【００５１】(3-2)組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってＨＲａｓｅを製造す
る方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用し
て酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例
は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いるこ
とで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産
できる。
る方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用し
て酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例
は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いるこ
とで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産
できる。
【００５２】図２は、本発明のＨＲａｓｅの製造工程の
フローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製
したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡ
を作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細
胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ
３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中
および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる
(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素
を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造す
る。
フローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製
したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡ
を作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細
胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ
３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中
および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる
(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素
を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造す
る。
【００５３】また、ステップＳ５で生産した精製ＨＲａ
ｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地
をアミノ酸の合成に用いることで、目的とする光学活性
アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ
６)。
ｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地
をアミノ酸の合成に用いることで、目的とする光学活性
アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ
６)。
【００５４】なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡ
は、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
は、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
【００５５】ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＨＲ
ａｓｅ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的
な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、などを使用できる。
ａｓｅ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的
な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、などを使用できる。
【００５６】タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて
大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体
内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（incl
usion body）を形成させることが好ましい。この発現生
産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在する
プロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタ
ンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に
精製できる点等である。
大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体
内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（incl
usion body）を形成させることが好ましい。この発現生
産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在する
プロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタ
ンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に
精製できる点等である。
【００５７】このようにして得られるタンパク質封入体
は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性
剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく
折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。
例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭
６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性
剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく
折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。
例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭
６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００５８】タンパク質封入体から活性型タンパク質を
得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要
であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操
作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすよ
うなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不
活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させること
により、その影響を抑えることができる。
得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要
であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操
作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすよ
うなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不
活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させること
により、その影響を抑えることができる。
【００５９】目的タンパク質を封入体として大量生産さ
せる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタ
ンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現するこ
とが知られているタンパク質との融合タンパク質として
発現させる方法がある。
せる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタ
ンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現するこ
とが知られているタンパク質との融合タンパク質として
発現させる方法がある。
【００６０】さらに、融合タンパク質として発現させた
後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテア
ーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効で
ある。
後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテア
ーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効で
ある。
【００６１】タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて
大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、
細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細
胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸
菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸
菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多く
の知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌
を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、
細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細
胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸
菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸
菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多く
の知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌
を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
【００６２】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを発現させ
るプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパ
ク質生産に用いられるプロモータを使用することがで
き、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａ
ｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の
強力なプロモータが挙げられる。
るプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパ
ク質生産に用いられるプロモータを使用することがで
き、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａ
ｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の
強力なプロモータが挙げられる。
【００６３】ＨＲａｓｅを融合タンパク質封入体として
生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは
下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺
伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺
伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変
性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるもの
であればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、イ
ンターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝
子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは
下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺
伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺
伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変
性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるもの
であればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、イ
ンターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝
子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００６４】これらの遺伝子とＨＲａｓｅをコードする
遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレーム
が一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する
か、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよ
い。
遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレーム
が一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する
か、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよ
い。
【００６５】また、生産量を増大させるためには、融合
タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネ
ーターを連結することが好ましい。このターミネータと
しては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネー
タ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子の
ターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等
が挙げられる。
タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネ
ーターを連結することが好ましい。このターミネータと
しては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネー
タ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子の
ターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等
が挙げられる。
【００６６】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
ク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に
導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピ
ー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を
有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施
したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異
剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。
ク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に
導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピ
ー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を
有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施
したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異
剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。
【００６７】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力な
プロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐ
ＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテ
ック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほ
か）。
クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力な
プロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐ
ＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテ
ック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほ
か）。
【００６８】プロモータ、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ
と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝
子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクタ
ーＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝
子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクタ
ーＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６９】該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転
換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲ
ａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産
される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通
常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒ
ア コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株
が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲ
ａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産
される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通
常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒ
ア コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株
が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００７０】融合タンパク質として発現させた場合、血
液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に
存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用
いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に
存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用
いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
【００７１】生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。
【００７２】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
ク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法な
どがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌
体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を
破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さ
らに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマ
トグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融
合タンパク質を精製して用いることも可能である。この
場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用
した精製法も利用できる。
ク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法な
どがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌
体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を
破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さ
らに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマ
トグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融
合タンパク質を精製して用いることも可能である。この
場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用
した精製法も利用できる。
【００７３】タンパク質封入体が形成される場合には、
変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可
溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入
体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入
体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよ
い。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封
入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性
剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜
８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可
溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入
体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入
体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよ
い。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封
入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性
剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜
８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００７４】これらの変性剤を透析等により除くと、活
性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる
透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液な
どを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、
ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる
透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液な
どを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、
ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００７５】再生工程時のタンパク質濃度は、５００μ
ｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲ
ａｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は
５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方
法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法など
があり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
ｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲ
ａｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は
５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方
法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法など
があり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００７６】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして、配
列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産
される。
列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産
される。
【００７７】［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性ア
ミノ酸の製法 次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイ
ン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について
述べる。
ミノ酸の製法 次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイ
ン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について
述べる。
【００７８】光学活性アミノ酸製造反応に用いる本発明
のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配
列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質が挙げられる。 （a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、（b）
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1ま
たは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加また
は逆位を含むアミノ酸配列。
のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配
列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質が挙げられる。 （a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、（b）
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1ま
たは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加また
は逆位を含むアミノ酸配列。
【００７９】上記ＨＲａｓｅとしては、（１）フラボバ
クテリウム属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いても
よいし、（２）組み換えＤＮＡ技術によりフラボバクテ
リウム属細菌由来のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を
作成し、当該形質転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用
いてもよい。
クテリウム属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いても
よいし、（２）組み換えＤＮＡ技術によりフラボバクテ
リウム属細菌由来のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を
作成し、当該形質転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用
いてもよい。
【００８０】フラボバクテリウム属細菌または組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓ
ｅを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質
を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄
菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あ
るいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよい
し、当該菌体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液
として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用い
てもよい。すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であ
れば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能
である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むも
のであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌
体、菌体を破砕あるいは、溶菌させた菌体処理物、粗酵
素液、精製酵素などを含む。
ＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓ
ｅを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質
を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄
菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あ
るいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよい
し、当該菌体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液
として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用い
てもよい。すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であ
れば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能
である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むも
のであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌
体、菌体を破砕あるいは、溶菌させた菌体処理物、粗酵
素液、精製酵素などを含む。
【００８１】本発明のＨＲａｓｅの他、
５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
（ＣＨａｓｅ）、 の２つの酵素を用いることにより、光学活性アミノ酸を
製造することができる。光学活性アミノ酸を製造するに
あたっては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なく
とも一方に、光学選択的に基質に作用するものを用いれ
ばよい。
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
（ＣＨａｓｅ）、 の２つの酵素を用いることにより、光学活性アミノ酸を
製造することができる。光学活性アミノ酸を製造するに
あたっては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なく
とも一方に、光学選択的に基質に作用するものを用いれ
ばよい。
【００８２】例えば、５置換ヒダントイン化合物を加水
分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学
選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置
換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができ
る。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含
有物を作用させることにより光学活性を維持したまま光
学活性アミノ酸を製造することができる。なお、光学選
択的ＨＨａｓｅと共に光学選択的ＣＨａｓｅを用いる場
合には、Ｌ−またはＤ−について同じ光学選択性を有す
るものを用いる。また、光学選択的ＨＨａｓｅによって
生成したＮ−カルバミルアミノ酸に、亜硝酸などの化学
的加水分解剤を用い、化学的に加水分解処理を施すこと
により、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性ア
ミノ酸を製造することもできる（微生物酵素系と化学反
応系との組み合わせによる方法）。なお、化学的加水分
解剤というときの「化学的加水分解」とは、酵素ではな
い化学薬品の作用によって加水分解するという意味であ
る。
分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学
選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置
換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができ
る。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含
有物を作用させることにより光学活性を維持したまま光
学活性アミノ酸を製造することができる。なお、光学選
択的ＨＨａｓｅと共に光学選択的ＣＨａｓｅを用いる場
合には、Ｌ−またはＤ−について同じ光学選択性を有す
るものを用いる。また、光学選択的ＨＨａｓｅによって
生成したＮ−カルバミルアミノ酸に、亜硝酸などの化学
的加水分解剤を用い、化学的に加水分解処理を施すこと
により、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性ア
ミノ酸を製造することもできる（微生物酵素系と化学反
応系との組み合わせによる方法）。なお、化学的加水分
解剤というときの「化学的加水分解」とは、酵素ではな
い化学薬品の作用によって加水分解するという意味であ
る。
【００８３】５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に
加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。
たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ
−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐
熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａ
ｓｅ含有画分を調製すればよい(Appl.Microbiol. Biot
echnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ
３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection、住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U
nited States of America）から入手することができ
る。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用する
Ｌ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus
sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特
開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー
ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２
７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。
たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ
−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐
熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａ
ｓｅ含有画分を調製すればよい(Appl.Microbiol. Biot
echnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ
３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection、住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U
nited States of America）から入手することができ
る。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用する
Ｌ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus
sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特
開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー
ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２
７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８４】ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がな
くとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ
酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、
反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバ
ミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させ
る場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆に
Ｄ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。し
かしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残
存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミ
ルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化
合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するの
で、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａ
ｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、
高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）
で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
くとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ
酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、
反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバ
ミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させ
る場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆に
Ｄ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。し
かしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残
存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミ
ルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化
合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するの
で、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａ
ｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、
高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）
で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
【００８５】光学選択性のないＨＨａｓｅは、マイクロ
バクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium l
iquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロ
バクター オーレセンス（Arthrobacter aurescens）に
その存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ペ
ージ、１９９８年）。
バクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium l
iquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロ
バクター オーレセンス（Arthrobacter aurescens）に
その存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ペ
ージ、１９９８年）。
【００８６】Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加
水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エ
スピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその
存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公
報)。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Pseud
omonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウ
ム エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判
明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１
２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−
カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａ
ｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー.（Fla
vobacterium sp.）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００
８７４９号公報）、バチルスエスピー.(Bacillus sp.)
ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバ
クテリウム エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り
現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２株（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年
６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与
され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づ
き移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ-７６４３が付与さ
れた微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２
９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
ブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エ
スピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその
存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公
報)。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Pseud
omonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウ
ム エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判
明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１
２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−
カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａ
ｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー.（Fla
vobacterium sp.）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００
８７４９号公報）、バチルスエスピー.(Bacillus sp.)
ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバ
クテリウム エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り
現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２株（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年
６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与
され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づ
き移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ-７６４３が付与さ
れた微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２
９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
ブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８７】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ含有画分の基
質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化で
きる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるもの
も使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例として
は、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベン
ジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒ
ダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−
（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（３'−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチル
チオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイ
ン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチル
ヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５
−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブ
チル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイ
ンなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５
置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイ
ン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５
−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチ
ルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベン
ジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表され
るような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応
する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化で
きる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるもの
も使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例として
は、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベン
ジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒ
ダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−
（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（３'−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチル
チオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイ
ン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチル
ヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５
−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブ
チル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイ
ンなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５
置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイ
ン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５
−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチ
ルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベン
ジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表され
るような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応
する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
【００８８】なお、好ましいＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅお
よびＣＨａｓｅの組み合わせとして、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列
番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、配
列表配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａ
ｓｅの組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれ
も、フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium s
p.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株由来の
酵素である。
よびＣＨａｓｅの組み合わせとして、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列
番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、配
列表配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａ
ｓｅの組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれ
も、フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium s
p.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株由来の
酵素である。
【００８９】配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号１３に記載のアミノ
酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号１５に
記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて
用いる場合、これらのＤ−アミノ酸の製造に係わるタン
パク質のすべてをコードする配列表の配列番号１１に記
載の構造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組
み換えＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養するこ
とによって得られたＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨ
ａｓｅからなる混成タンパク質を用いることもできる。
当該混成タンパク質を用いた場合、下記反応式（II）に
示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセ
マーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒す
るので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的
にはモル収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが
可能となる。
有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号１３に記載のアミノ
酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号１５に
記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて
用いる場合、これらのＤ−アミノ酸の製造に係わるタン
パク質のすべてをコードする配列表の配列番号１１に記
載の構造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組
み換えＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養するこ
とによって得られたＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨ
ａｓｅからなる混成タンパク質を用いることもできる。
当該混成タンパク質を用いた場合、下記反応式（II）に
示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセ
マーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒す
るので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的
にはモル収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが
可能となる。
【００９０】
【化３】
【００９１】また、下記反応式（III）に例示するよう
に、Ｌ−ＣＨａｓｅを用いることにより、ＤＬ体の５置
換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％
でＬ−アミノ酸を製造することも可能である。
に、Ｌ−ＣＨａｓｅを用いることにより、ＤＬ体の５置
換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％
でＬ−アミノ酸を製造することも可能である。
【化４】
【００９２】なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カ
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパク質に、Ｌ−又はＤ−ＣＨａｓｅの
阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミ
ノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製
造できる。
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパク質に、Ｌ−又はＤ−ＣＨａｓｅの
阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミ
ノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製
造できる。
【００９３】フラボバクテリウム属細菌または組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌
体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られ
る粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を
進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養
液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、また
は精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に
調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置また
は攪拌すればよい。
ＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌
体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られ
る粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を
進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養
液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、また
は精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に
調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置また
は攪拌すればよい。
【００９４】また、フラボバクテリウム属細菌または組
み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体
中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合
には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換
された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオン
などの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビ
タミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ま
しい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化
合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜
９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時
間〜５日培養することが好ましい。
み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体
中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合
には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換
された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオン
などの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビ
タミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ま
しい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化
合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜
９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時
間〜５日培養することが好ましい。
【００９５】生成したアミノ酸は、公知の手法により分
離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接
触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析
する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析
する方法等が挙げられる。
離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接
触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析
する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析
する方法等が挙げられる。
【００９６】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
【００９７】（実施例１）ＡＪ１１１９９菌におけるヒ
ダントインラセマーゼ活性の検出 １．菌体の培養 フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）
ＡＪ１１１９９株およびシュードモナス エスピー（Pse
udomonas sp.）ＡＪ１１２２０株（現在は、アグロバク
テリウム エスピー ＡＪ１１２２０（ＦＥＲＭ ＢＰ
−７６４５）株として寄託）を、それぞれＣＭ２Ｇ寒天
培地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプ
トン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ
７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュし
た。これらをそれぞれ５０ｍｌの誘導培地（グルコース
０．５％、硫酸アンモニウム０．５％、ＫＨ2ＰＯ4
０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4 ０．０５
％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＦｅＳＯ
4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、ＤＬ−５−
シアノエチルヒダントイン０．２％、炭酸カルシウム
２．０％、ｐＨ７．０）を張り込んだ５００ ｍｌ容の
坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気
的に振とう培養した。培養終了後、集菌、洗浄を行い、
菌体をそれぞれ５ｍｌの０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．
５)に懸濁した。
ダントインラセマーゼ活性の検出 １．菌体の培養 フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）
ＡＪ１１１９９株およびシュードモナス エスピー（Pse
udomonas sp.）ＡＪ１１２２０株（現在は、アグロバク
テリウム エスピー ＡＪ１１２２０（ＦＥＲＭ ＢＰ
−７６４５）株として寄託）を、それぞれＣＭ２Ｇ寒天
培地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプ
トン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ
７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュし
た。これらをそれぞれ５０ｍｌの誘導培地（グルコース
０．５％、硫酸アンモニウム０．５％、ＫＨ2ＰＯ4
０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4 ０．０５
％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＦｅＳＯ
4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、ＤＬ−５−
シアノエチルヒダントイン０．２％、炭酸カルシウム
２．０％、ｐＨ７．０）を張り込んだ５００ ｍｌ容の
坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気
的に振とう培養した。培養終了後、集菌、洗浄を行い、
菌体をそれぞれ５ｍｌの０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．
５)に懸濁した。
【００９８】２．洗浄菌体法によるヒダントインラセマ
ーゼ活性の検出 上記のように調製して得られた洗浄菌体を、０．１２ｇ
／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）も
しくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）を含
む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に、それぞれの洗
浄菌体が１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応
させた。反応２２時間後にサンプリングし、２０，００
０ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた
後、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成し
たＤ−フェニルアラニンを定量した。
ーゼ活性の検出 上記のように調製して得られた洗浄菌体を、０．１２ｇ
／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）も
しくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）を含
む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に、それぞれの洗
浄菌体が１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応
させた。反応２２時間後にサンプリングし、２０，００
０ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた
後、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成し
たＤ−フェニルアラニンを定量した。
【００９９】なお、上記フラボバクテリウム エスピー
（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株はＤ−ヒダン
トイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ活性を有する菌株であり、シュードモナス エス
ピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株は、ヒダン
トイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ活性を有する菌株である。
（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株はＤ−ヒダン
トイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ活性を有する菌株であり、シュードモナス エス
ピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株は、ヒダン
トイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ活性を有する菌株である。
【０１００】その結果を表１に示した。この表に示され
るように、シュードモナス エスピー（Pseudomonas s
p.）ＡＪ１１２２０株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ
−５−ベンジルヒダントインからのみＤ−フェニルアラ
ニンを生成させることができ、Ｌ−５−ベンジルヒダン
トインからはほとんどＤ−フェニルアラニンが生成しな
かった。この結果より、自発的なベンジルヒダントイン
のラセミ化はごくわずかであることが示された。これに
対して、フラボバクテリウム エスピー（Flavobacteri
um sp.）ＡＪ１１１９９株の洗浄菌体を用いた場合に
は、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみならず、Ｌ
−５−ベンジルヒダントインからも効率良くＤ−フェニ
ルアラニンを生成させることができた。以上の結果よ
り、フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium s
p.）ＡＪ１１１９９株がヒダントインラセマーゼ活性を
有することが示された。
るように、シュードモナス エスピー（Pseudomonas s
p.）ＡＪ１１２２０株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ
−５−ベンジルヒダントインからのみＤ−フェニルアラ
ニンを生成させることができ、Ｌ−５−ベンジルヒダン
トインからはほとんどＤ−フェニルアラニンが生成しな
かった。この結果より、自発的なベンジルヒダントイン
のラセミ化はごくわずかであることが示された。これに
対して、フラボバクテリウム エスピー（Flavobacteri
um sp.）ＡＪ１１１９９株の洗浄菌体を用いた場合に
は、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみならず、Ｌ
−５−ベンジルヒダントインからも効率良くＤ−フェニ
ルアラニンを生成させることができた。以上の結果よ
り、フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium s
p.）ＡＪ１１１９９株がヒダントインラセマーゼ活性を
有することが示された。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】（実施例２）ＡＪ１１１９９菌由来のヒダ
ントインラセマーゼ遺伝子の単離 １．菌体の取得 フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）
ＡＪ１１１９９株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．
５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣ
ｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２
４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣ
Ｍ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラ
スコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振と
う培養した。
ントインラセマーゼ遺伝子の単離 １．菌体の取得 フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）
ＡＪ１１１９９株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．
５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣ
ｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２
４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣ
Ｍ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラ
スコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振と
う培養した。
【０１０３】２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１０４】３．ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離
まず、フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium
sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡ２００μｇに制
限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃にて１５分
間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡからアガ
ロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収し、ここ
で取得された約４．１ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片（図１の
）に、Ｄ−ＣＨａｓｅおよびＤ−ＨＨａｓｅをコード
する遺伝子が含まれることを確認した。この約４．１ｋ
ｂの断片のうち、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子の下流領域約２
５０塩基について相同性検索を行ったところ、Ｄ−ＨＨ
ａｓｅ遺伝子の終止コドンより数えて１９番目の塩基か
らＳａｕ３Ａ Ｉサイトまでにわたり、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ
（特願２００１−２７８７３９号記載）との相同性が確
認された。そこで、この配列がヒダントインラセマーゼ
遺伝子の一部であると考え、この配列を用いてヒダント
インラセマーゼ遺伝子全長を取得することを試みた。
sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡ２００μｇに制
限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃にて１５分
間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡからアガ
ロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収し、ここ
で取得された約４．１ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片（図１の
）に、Ｄ−ＣＨａｓｅおよびＤ−ＨＨａｓｅをコード
する遺伝子が含まれることを確認した。この約４．１ｋ
ｂの断片のうち、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子の下流領域約２
５０塩基について相同性検索を行ったところ、Ｄ−ＨＨ
ａｓｅ遺伝子の終止コドンより数えて１９番目の塩基か
らＳａｕ３Ａ Ｉサイトまでにわたり、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ
（特願２００１−２７８７３９号記載）との相同性が確
認された。そこで、この配列がヒダントインラセマーゼ
遺伝子の一部であると考え、この配列を用いてヒダント
インラセマーゼ遺伝子全長を取得することを試みた。
【０１０５】まず、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の全
長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium s
p.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として用
い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして
ＰＣＲにより増幅した断片（約４００ｂｐ）を、プロー
ブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌに調整
し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime（Boehri
nger Mannheim）のプロトコールに準じて３７℃で２４
時間インキュベートすることによりDIG標識し、プロー
ブとした。
長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。フラボバクテリウム エスピー（Flavobacterium s
p.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として用
い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして
ＰＣＲにより増幅した断片（約４００ｂｐ）を、プロー
ブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌに調整
し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime（Boehri
nger Mannheim）のプロトコールに準じて３７℃で２４
時間インキュベートすることによりDIG標識し、プロー
ブとした。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】染色体ＤＮＡ １μgを各種制限酵素の組合
わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動
した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim,
Nylon membranes positively charged）にブロッティ
ングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb
（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０
分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブ
を添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーション
させた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehri
nger Mannheim）を用いて行った。
わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動
した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim,
Nylon membranes positively charged）にブロッティ
ングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb
（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０
分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブ
を添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーション
させた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehri
nger Mannheim）を用いて行った。
【０１０８】その結果、Ｓｐｈ Ｉの切断物（図１の
）において約２．４ｋｂの位置にバンドが検出され
た。そこで、該切断物より２．４ｋｂ付近の断片を回収
してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に
てライブラリー（４００株）を作製した後、コロニーハ
イブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメ
ンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon mem
branes for colony and plaque hybridization）に転写
し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイ
ブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後
に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時
間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleoti
de Detection Kitを用いて行い、２株のポジティブクロ
ーンを選抜した。
）において約２．４ｋｂの位置にバンドが検出され
た。そこで、該切断物より２．４ｋｂ付近の断片を回収
してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に
てライブラリー（４００株）を作製した後、コロニーハ
イブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメ
ンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon mem
branes for colony and plaque hybridization）に転写
し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイ
ブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後
に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時
間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleoti
de Detection Kitを用いて行い、２株のポジティブクロ
ーンを選抜した。
【０１０９】選抜したクローンが保有するプラスミドを
Molecular Cloning, 2nd edition,Cold Spring Harbor
press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿
入断片の塩基配列を決定した。その結果、Ｄ−ＨＨａｓ
ｅ遺伝子の下流に、約０．７ｋｂからなるオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダント
インラセマーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントイ
ンラセマーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号
１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
した。得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子は、マイ
クロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacteri
um liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントイン
ラセマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）とア
ミノ酸配列において４３％の相同性を示した。
Molecular Cloning, 2nd edition,Cold Spring Harbor
press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿
入断片の塩基配列を決定した。その結果、Ｄ−ＨＨａｓ
ｅ遺伝子の下流に、約０．７ｋｂからなるオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダント
インラセマーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントイ
ンラセマーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号
１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
した。得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子は、マイ
クロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacteri
um liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントイン
ラセマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）とア
ミノ酸配列において４３％の相同性を示した。
【０１１０】（実施例３）ヒダントインラセマーゼ遺伝
子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現 １．発現プラスミドの構築 取得した遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にヒダントインラ
セマーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＲ１を以
下のようにして構築した。まず、フラボバクテリウム
エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染
色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてＰＣＲによりヒダントインラセマー
ゼ遺伝子を増幅した。この断片をＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａｍ
Ｈ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的
のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドｐＵ
ＣＨＲ１と命名した。また、発現プラスミドｐＵＣＨＲ
１を有するＥ．Ｃｏｌｉ形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵ
ＣＨＲ１と命名した。
子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現 １．発現プラスミドの構築 取得した遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にヒダントインラ
セマーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＲ１を以
下のようにして構築した。まず、フラボバクテリウム
エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染
色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてＰＣＲによりヒダントインラセマー
ゼ遺伝子を増幅した。この断片をＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａｍ
Ｈ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的
のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドｐＵ
ＣＨＲ１と命名した。また、発現プラスミドｐＵＣＨＲ
１を有するＥ．Ｃｏｌｉ形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵ
ＣＨＲ１と命名した。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】２．無細胞抽出液の調製
ｐＵＣＨＲ１を持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＪＭ１０９
／ｐＵＣＨＲ１を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培
地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこ
のシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行
った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、
終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体
を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁し、
０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６
回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕し
た。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離
操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
／ｐＵＣＨＲ１を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培
地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこ
のシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行
った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、
終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体
を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁し、
０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６
回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕し
た。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離
操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
【０１１３】３．ヒダントインラセマーゼ活性測定
ヒダントインラセマーゼ活性の測定は、０．１２ｇ／ｄ
ｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしく
はＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）、５０ｍ
Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液
を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．
１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、
２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取
り除いた上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて解析することによった。なお酵素溶液として上
記のようにして得た無細胞抽出液を用いた。また、酵素
活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌ
のベンジルヒダントインをラセミ化する酵素活性をもっ
て１Ｕと定義した。
ｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしく
はＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）、５０ｍ
Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液
を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．
１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、
２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取
り除いた上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて解析することによった。なお酵素溶液として上
記のようにして得た無細胞抽出液を用いた。また、酵素
活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌ
のベンジルヒダントインをラセミ化する酵素活性をもっ
て１Ｕと定義した。
【０１１４】その結果を表４に示す。ｐＵＣＨＲ１を用
いて形質転換した株においてベンジルヒダントインのラ
セミ化活性が確認されたことより、この遺伝子がフラボ
バクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１
１１９９株由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子であ
り、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で効率良く発現されているこ
とを確認した。
いて形質転換した株においてベンジルヒダントインのラ
セミ化活性が確認されたことより、この遺伝子がフラボ
バクテリウム エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１
１１９９株由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子であ
り、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で効率良く発現されているこ
とを確認した。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たベンジルヒダントインのラセミ化反応 ０．１２ｇ／ｄｌ (６．３ｍＭ) Ｄ-５-ベンジルヒダン
トインもしくはＬ-５-ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、０．０１ｇ／ｄｌのＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ１洗浄菌体を混合し、３７℃で反応させ
た。反応液の一部を経時的にサンプリングし、遠心上清
をＨＰＬＣで解析した。
たベンジルヒダントインのラセミ化反応 ０．１２ｇ／ｄｌ (６．３ｍＭ) Ｄ-５-ベンジルヒダン
トインもしくはＬ-５-ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、０．０１ｇ／ｄｌのＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ１洗浄菌体を混合し、３７℃で反応させ
た。反応液の一部を経時的にサンプリングし、遠心上清
をＨＰＬＣで解析した。
【０１１７】その結果を表５に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、効率良くベ
ンジルヒダントインをラセミ化させることができた。
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、効率良くベ
ンジルヒダントインをラセミ化させることができた。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】（実施例５）Ｄ−ヒダントイナーゼおよび
Ｄ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼとの組み合わせ
によるＤ−フェニルアラニンの生産 Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子の両
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラ
スミドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃを以下のよ
うにして構築した。まず、フラボバクテリウム エスピ
ー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とし、表６に示すオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。これら
の断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とライゲー
ションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。
アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った
株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミドｐ
ＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃと命名した。
Ｄ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼとの組み合わせ
によるＤ−フェニルアラニンの生産 Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子の両
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラ
スミドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃを以下のよ
うにして構築した。まず、フラボバクテリウム エスピ
ー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とし、表６に示すオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。これら
の断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とライゲー
ションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。
アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った
株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミドｐ
ＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃと命名した。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子搭載プラスミドｐＵ
Ｃ６３２Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９
／ｐＵＣ６３２Ｈ）、およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子搭載
プラスミドｐＵＣ６３２Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換
体（ＪＭ１０９／ｐＵ６３２Ｃ）を０．１ｍｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培
養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂
口フラスコにこれらのシード培養液を１ｍｌ添加し、３
７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終
濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄
菌体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ１の洗浄菌体を調製し、上記Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子発現株およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子発現株の
洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダ
ントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそ
れぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３７℃で反応さ
せた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨ
ＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルア
ラニンを定量した。
Ｃ６３２Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９
／ｐＵＣ６３２Ｈ）、およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子搭載
プラスミドｐＵＣ６３２Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換
体（ＪＭ１０９／ｐＵ６３２Ｃ）を０．１ｍｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培
養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂
口フラスコにこれらのシード培養液を１ｍｌ添加し、３
７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終
濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄
菌体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ１の洗浄菌体を調製し、上記Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子発現株およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子発現株の
洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダ
ントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそ
れぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３７℃で反応さ
せた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨ
ＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルア
ラニンを定量した。
【０１２２】その結果を表７に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベ
ンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニン
を生成させることができた。
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベ
ンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニン
を生成させることができた。
【０１２３】
【表７】
【０１２４】
【発明の効果】本発明によって、新規なヒダントインラ
セマーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大
量に発現させることが可能である。このような形質転換
体から該酵素を容易に調製することができ、該形質転換
体やその抽出液、精製酵素等を用いることによって各種
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を効率良く行うこ
とができる。また、各種ヒダントイナーゼ、カルバミル
アミノ酸ハイドロラーゼなどと組み合わせて用いること
により、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有
用なＤ−アミノ酸やＬ−アミノ酸を効率良く生産でき
る。
セマーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大
量に発現させることが可能である。このような形質転換
体から該酵素を容易に調製することができ、該形質転換
体やその抽出液、精製酵素等を用いることによって各種
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を効率良く行うこ
とができる。また、各種ヒダントイナーゼ、カルバミル
アミノ酸ハイドロラーゼなどと組み合わせて用いること
により、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有
用なＤ−アミノ酸やＬ−アミノ酸を効率良く生産でき
る。
【０１２５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 味の素株式会社
Ajinomoto Co., Inc.
<120> ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換えＤ
ＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法
<130> PAMA-13341
<140>
<141>
<160> 15
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 732
<212> DNA
<213> Flavobacterium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(732)
<223> HRase
<400> 1
atg aag atc aag gtg atc aat ccg aac acg aca ttg acc atg acc gcc 48
Met Lys Ile Lys Val Ile Asn Pro Asn Thr Thr Leu Thr Met Thr Ala
1 5 10 15
aag atc ggc gag gcg gcc gcc gcc gtc gcc tcg gcg gga acc gag gtc 96
Lys Ile Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Gly Thr Glu Val
20 25 30
gtc gcc gtc agc ccc gct atg ggg ccg gcc tcc atc gag ggg cat tat 144
Val Ala Val Ser Pro Ala Met Gly Pro Ala Ser Ile Glu Gly His Tyr
35 40 45
gac gag gcg gtc agt gcg ctc ggc gtg ctc gac gaa gtg cgc aag gga 192
Asp Glu Ala Val Ser Ala Leu Gly Val Leu Asp Glu Val Arg Lys Gly
50 55 60
aag gcg gaa gga tgc gac ggc tat ctt atc gcc tgc ttc gac gat ccc 240
Lys Ala Glu Gly Cys Asp Gly Tyr Leu Ile Ala Cys Phe Asp Asp Pro
65 70 75 80
ggc ctg cag gct gcc cgc gag att gcc gat ggc ccg gtg gtc ggc atc 288
Gly Leu Gln Ala Ala Arg Glu Ile Ala Asp Gly Pro Val Val Gly Ile
85 90 95
gcc gag gcg gcc atg cat atg gcc tcg ttc gtc tcg gaa ggc ttt tcg 336
Ala Glu Ala Ala Met His Met Ala Ser Phe Val Ser Glu Gly Phe Ser
100 105 110
gtc gtc gcg aca ggg cat cgc agc cgt atc atc ctc gaa cat ctg gcg 384
Val Val Ala Thr Gly His Arg Ser Arg Ile Ile Leu Glu His Leu Ala
115 120 125
cgc tcc tac ggc atg gag cac aag tgc cgc aag gtg cgc acc acg gaa 432
Arg Ser Tyr Gly Met Glu His Lys Cys Arg Lys Val Arg Thr Thr Glu
130 135 140
ctg gcg gtg ctc gat ctg gag gtg gag gga tcg gat gcg cgc ggc atc 480
Leu Ala Val Leu Asp Leu Glu Val Glu Gly Ser Asp Ala Arg Gly Ile
145 150 155 160
atc ctg gag gaa tgc cgc cgg gcc atc gtc gag gac cat tcg gat tgc 528
Ile Leu Glu Glu Cys Arg Arg Ala Ile Val Glu Asp His Ser Asp Cys
165 170 175
atc gtg ctc ggt tgc gcc ggc atg gcc gac ctt gcc gat tac att tcg 576
Ile Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Ala Asp Leu Ala Asp Tyr Ile Ser
180 185 190
aag gag ctc ggc gtg ccg gtc gtc gat ggt gtc gcc gcc ggc gtg aag 624
Lys Glu Leu Gly Val Pro Val Val Asp Gly Val Ala Ala Gly Val Lys
195 200 205
gtc ctc gag ggg ctg ata ggc ctg cgc ctg tca acg agc cgt gcc tgc 672
Val Leu Glu Gly Leu Ile Gly Leu Arg Leu Ser Thr Ser Arg Ala Cys
210 215 220
ggc tat gcc tat ccc aat ccc aag acc tat tcc ggc gag atg gct cgc 720
Gly Tyr Ala Tyr Pro Asn Pro Lys Thr Tyr Ser Gly Glu Met Ala Arg
225 230 235 240
ttc cag ccc tga 732
Phe Gln Pro
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> Flavobacterium sp.
<400> 2
Met Lys Ile Lys Val Ile Asn Pro Asn Thr Thr Leu Thr Met Thr Ala
1 5 10 15
Lys Ile Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Gly Thr Glu Val
20 25 30
Val Ala Val Ser Pro Ala Met Gly Pro Ala Ser Ile Glu Gly His Tyr
35 40 45
Asp Glu Ala Val Ser Ala Leu Gly Val Leu Asp Glu Val Arg Lys Gly
50 55 60
Lys Ala Glu Gly Cys Asp Gly Tyr Leu Ile Ala Cys Phe Asp Asp Pro
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ala Ala Arg Glu Ile Ala Asp Gly Pro Val Val Gly Ile
85 90 95
Ala Glu Ala Ala Met His Met Ala Ser Phe Val Ser Glu Gly Phe Ser
100 105 110
Val Val Ala Thr Gly His Arg Ser Arg Ile Ile Leu Glu His Leu Ala
115 120 125
Arg Ser Tyr Gly Met Glu His Lys Cys Arg Lys Val Arg Thr Thr Glu
130 135 140
Leu Ala Val Leu Asp Leu Glu Val Glu Gly Ser Asp Ala Arg Gly Ile
145 150 155 160
Ile Leu Glu Glu Cys Arg Arg Ala Ile Val Glu Asp His Ser Asp Cys
165 170 175
Ile Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Ala Asp Leu Ala Asp Tyr Ile Ser
180 185 190
Lys Glu Leu Gly Val Pro Val Val Asp Gly Val Ala Ala Gly Val Lys
195 200 205
Val Leu Glu Gly Leu Ile Gly Leu Arg Leu Ser Thr Ser Arg Ala Cys
210 215 220
Gly Tyr Ala Tyr Pro Asn Pro Lys Thr Tyr Ser Gly Glu Met Ala Arg
225 230 235 240
Phe Gln Pro
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer (3)
<400> 3
tcgaggttga ccggatggcc ggtgat 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(4)
<400> 4
acttcgtcga gcacgccgag cgca 24
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(5)
<400> 5
cgcgaattcg gaaaggacag gacgatgaa 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(6)
<400> 6
cgcggatccc gggaacattc cttgcatca 29
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(7)
<400> 7
cgctctagat agccggagct gataccatga 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(8)
<400> 8
cgcaagcttt ccgcctcagg ccgtttcca 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(9)
<400> 9
cgcgaattct atctcggcgg ttgaggctc 29
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(10)
<400> 10
cgctctagat ggagccgcgc cgctcaga 28
<210> 11
<211> 4654
<212> DNA
<213> Flavobacterium sp.
<400> 11
gatcggccgc gcgctgatgt cgaagccgcg ccttctgctt ctcgacgaac cctcgctggg 60
actggcgccg ctcgtcgtgc gcgacatcgc ccgtctcgtc acggagatca accgggagca 120
gggcaccagc atcgtgctgg tcgagcagaa ttcgcgcatg gcgctgcgca tcagccgata 180
cgcctatgtg ctcgaaaccg ggcgcatcgg tctcgaagga gcctcgcaga gcctcctcga 240
cgacgacaag gtcaagcaac tctatctcgg cggttgaggc tccgggaaag gaaaaggaga 300
ggaatatgcc aggaaagatc attctcgcgg tgggccagct tggacccatc gcccgcagcg 360
acagccgcga acaggtggtg aagcggctcg tcgacatgct ggaggaggcc gcggcccgca 420
attcggattt catcgtcttt cccgagctgg cgctgaccac cttcttcccc cgctggtatt 480
tcaccgacga ggcggaactg gacgcgttct acgagacgga aatgccgagc ccggtgacac 540
gcccgctgtt cgaggccgcc gcgaaacacg gcgtcgggtt caatctcggc ttcgcggagc 600
tcgtgtcgga gggcggcagg aagcgccgct tcaacacgtc catcgccgtc gacaggaccg 660
gcaggatcat cggcaagtac cgcaagatcc atctgccggg ccacaaggac tatgaagact 720
accgcccgtt ccagcatctg gagaagcggt acttcgagac cggcaatctc ggattcccgg 780
tctatgaggt cgatggtttc aagatgggca tgttcatctg caacgaccgg cgctggccgg 840
agacctggcg cgtgatgggt ctcaagggcg cggagctgat ctgcggcggc tacaacacgc 900
cgctgcacaa tccgccggtg ccgcagcacg accagctcag ctccttccac catctcctgt 960
cgatgcaggc gggcgcctac cagaacggtg cgtggaccgc cggagcgggc aaggtcgggg 1020
tggaggaagg ctgcatgctg ctcggccatt cctgcatcgt cgcgcccacc ggggagcttg 1080
ccgcgctcac caacacgctg gaggacgagg tcatcacggc cgctgccgat tttgcccgct 1140
gccgggaaat ccgcgagaac atcttcaatt tcgagcagca tcgcgagccg caggaatacg 1200
ggttgatcgc cgccgtctga gcggcgcggc tccatacaat catgatgccc gagccgcctt 1260
cctgtgggag gcggaacggg caaggcatgc ccgccggaca tacggcgggc ggaggagaaa 1320
ggagggagac catgcgcgcg atcctgctgg atcagcccgg cgaagccgcc ggcctgttgc 1380
gcgtcgccga gctgcccgcg ccggtcgcgg ggcgcggaga actcgtcgtc gcggtcgcct 1440
gctgcggctg caacttcgcc gacacgatga tgcggcgcgg tacctatccg catccgaagc 1500
aatacccgct cgttcccggt ttcgagatcg tgggccgggt gacggcggtc ggtgcgggcg 1560
tcgatggttt tgccgtcggc gaccgggtgg cgggctatgc cgagtcgggc ggcggctttg 1620
ccgcgctctg cgccgttgcg gcggacggtg ccgttcgcct tcccgattcc gttcccttcg 1680
aaacggcggc agccttcctc atccaggcgc agacggcctg gcatctgctg cataccgtct 1740
cggcggtgcg accgggtgag gtcgtcctga tccacgccat cggcggcggt gtcgggctct 1800
atctcaccca gctcgccgtg caggccggag ccgtcgttgt cggtaccgtc ggcacggccg 1860
gcaaggaaag gcgggcgctc gattatggcg caagcctcgt cgtcaaccgc gcggaggctg 1920
atttcgtgga ggagatcggc cgcttcctga acgggcgcgg cgtcgacagg atttacgatt 1980
ccaccggggc gacgatcctc gaccgtagct ttgcgctcct gcgcccgctc ggccagatcg 2040
tcagtttcgg cgaggccgag ggccgcccgc tcgacaatct ctgggcgcgg ctggtggaga 2100
aatcggcgac cttcacgcgc ttccatctcg gccatctcga tttcgccgcg caagcctggc 2160
gcgacgggct gcgccttacc cttgccgccg tcgcggacgg tacgcttcgc gtgccggtcg 2220
aacgcgtctt ttccttcgaa caggcagagc agatgtatga atgcctcgaa tcccgcacgg 2280
tgtcgggaaa gctcctgctt gccgtcaacc ctaccgcaac cgatagccgg agctgatacc 2340
atgacccatt acgatctcgt cattcgcgga ggaaccgtcg ccacggcgag tgattgcttc 2400
cgggcggatg ttgcggtcac cgacggcagg atcgtcgcca tcggcgagaa tctcgggccc 2460
gccgcccgcg agatctcggc ggaaggccgc ctcgttctgc ccggcggcgt cgattcccat 2520
tgccatatcg aggagccgca ggtcggcgag gtgcgcaacg cggaaacctt cgcctccgcc 2580
acctcttcgg cggccgcggg cggcacgacg acggtcattt ccttctctca gcaggtgaaa 2640
ggcggcggca tcaccgaggc cctgcgcgac tatcacgaga aggcgacccg cgcgctgatc 2700
gactattcct tccatctcgt cgtgaccgat cccacggatg cggtgctgga ggaactggtg 2760
ccgctgatcg aggaagggca ccggtcgctg aagatcttca tgacctatac caatgtcgtg 2820
ctcgacgacg agcagacgct gcgcgtgctg gcgctcgccc gcaagaccgg cgctctcgtc 2880
acggtgcatg ccgagaacca tgccgcgatc atgtacctca cgcgtgcctt ggaaaaggcc 2940
gggctcaccg ccccgaagta ccacgcctgg gccaagccca tgccggtgga acgggaggcc 3000
tgccaccgca tcatcatgct ctccgaactg ctggatgttc ccattcagat cttccacgtt 3060
tccggggcgg aggcggccga ggaaatccgc cgcgcgcaga atcgcggcct caaggtcttc 3120
ggcgagacct gcccgcaata tctgatgctg acggcggcgg atctcgaccg gccggatttc 3180
gagggtgcga aattcctgtg cagccccgcg ccgcgcacga cggccgatca ggaagccctg 3240
tgggactata tccgcacggg aacgatcggg gtcgtgtcgt ccgaccacgc gccgaaccgc 3300
ttcgacgatc cgcacggcaa gaaggtcggc ggggtggacg cgcccttcag cgccattccg 3360
aacggcgtgc cggggctggc gacgcgcctg ccgatcctgt tttccgaagg ggtcgtcaag 3420
gggcgcatcg acctcaacac cttcgtcgcg ctgacggcgg ccaatccggc gaagctcttt 3480
ggcctgcatc ccagaaaggg caccatcgcc gtcggagccg atgcggatat cgcgatctgg 3540
gatcccgagc gcaaggtgac gatccgcaac gacatgctgc atcacggcgt cgactacacg 3600
gtctacgagg gcgtcgaggt gaccggatgg ccggtgatga cgctctcgcg cggcgaggtg 3660
gtctatgatg acggcgcggt ggtcggcaag ccgggtcacg ggcgcttcct tgcccgcggt 3720
ccctatgacg cgatcaagcc gcgcggcagg catgtgacgc ctttcgaccc ggtgacgggc 3780
gaagtggaaa cggcctgagg cggaaaggac aggacgatga agatcaaggt gatcaatccg 3840
aacacgacat tgaccatgac cgccaagatc ggcgaggcgg ccgccgccgt cgcctcggcg 3900
ggaaccgagg tcgtcgccgt cagccccgct atggggccgg cctccatcga ggggcattat 3960
gacgaggcgg tcagtgcgct cggcgtgctc gacgaagtgc gcaagggaaa ggcggaagga 4020
tgcgacggct atcttatcgc ctgcttcgac gatcccggcc tgcaggctgc ccgcgagatt 4080
gccgatggcc cggtggtcgg catcgccgag gcggccatgc atatggcctc gttcgtctcg 4140
gaaggctttt cggtcgtcgc gacagggcat cgcagccgta tcatcctcga acatctggcg 4200
cgctcctacg gcatggagca caagtgccgc aaggtgcgca ccacggaact ggcggtgctc 4260
gatctggagg tggagggatc ggatgcgcgc ggcatcatcc tggaggaatg ccgccgggcc 4320
atcgtcgagg accattcgga ttgcatcgtg ctcggttgcg ccggcatggc cgaccttgcc 4380
gattacattt cgaaggagct cggcgtgccg gtcgtcgatg gtgtcgccgc cggcgtgaag 4440
gtcctcgagg ggctgatagg cctgcgcctg tcaacgagcc gtgcctgcgg ctatgcctat 4500
cccaatccca agacctattc cggcgagatg gctcgcttcc agccctgatg caaggaatgt 4560
tcccgtgacc gatacaaata ccgaaacgag gccgacggtc ttttccgaac tgccggatgt 4620
gcgcgtcgac ggccgcacaa agggaatgcc gggc 4654
<210> 12
<211> 1458
<212> DNA
<213> Flavobacterium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1458)
<223> D-HHase
<400> 12
atg acc cat tac gat ctc gtc att cgc gga gga acc gtc gcc acg gcg 48
Met Thr His Tyr Asp Leu Val Ile Arg Gly Gly Thr Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
agt gat tgc ttc cgg gcg gat gtt gcg gtc acc gac ggc agg atc gtc 96
Ser Asp Cys Phe Arg Ala Asp Val Ala Val Thr Asp Gly Arg Ile Val
20 25 30
gcc atc ggc gag aat ctc ggg ccc gcc gcc cgc gag atc tcg gcg gaa 144
Ala Ile Gly Glu Asn Leu Gly Pro Ala Ala Arg Glu Ile Ser Ala Glu
35 40 45
ggc cgc ctc gtt ctg ccc ggc ggc gtc gat tcc cat tgc cat atc gag 192
Gly Arg Leu Val Leu Pro Gly Gly Val Asp Ser His Cys His Ile Glu
50 55 60
gag ccg cag gtc ggc gag gtg cgc aac gcg gaa acc ttc gcc tcc gcc 240
Glu Pro Gln Val Gly Glu Val Arg Asn Ala Glu Thr Phe Ala Ser Ala
65 70 75 80
acc tct tcg gcg gcc gcg ggc ggc acg acg acg gtc att tcc ttc tct 288
Thr Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Val Ile Ser Phe Ser
85 90 95
cag cag gtg aaa ggc ggc ggc atc acc gag gcc ctg cgc gac tat cac 336
Gln Gln Val Lys Gly Gly Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Asp Tyr His
100 105 110
gag aag gcg acc cgc gcg ctg atc gac tat tcc ttc cat ctc gtc gtg 384
Glu Lys Ala Thr Arg Ala Leu Ile Asp Tyr Ser Phe His Leu Val Val
115 120 125
acc gat ccc acg gat gcg gtg ctg gag gaa ctg gtg ccg ctg atc gag 432
Thr Asp Pro Thr Asp Ala Val Leu Glu Glu Leu Val Pro Leu Ile Glu
130 135 140
gaa ggg cac cgg tcg ctg aag atc ttc atg acc tat acc aat gtc gtg 480
Glu Gly His Arg Ser Leu Lys Ile Phe Met Thr Tyr Thr Asn Val Val
145 150 155 160
ctc gac gac gag cag acg ctg cgc gtg ctg gcg ctc gcc cgc aag acc 528
Leu Asp Asp Glu Gln Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Lys Thr
165 170 175
ggc gct ctc gtc acg gtg cat gcc gag aac cat gcc gcg atc atg tac 576
Gly Ala Leu Val Thr Val His Ala Glu Asn His Ala Ala Ile Met Tyr
180 185 190
ctc acg cgt gcc ttg gaa aag gcc ggg ctc acc gcc ccg aag tac cac 624
Leu Thr Arg Ala Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Ala Pro Lys Tyr His
195 200 205
gcc tgg gcc aag ccc atg ccg gtg gaa cgg gag gcc tgc cac cgc atc 672
Ala Trp Ala Lys Pro Met Pro Val Glu Arg Glu Ala Cys His Arg Ile
210 215 220
atc atg ctc tcc gaa ctg ctg gat gtt ccc att cag atc ttc cac gtt 720
Ile Met Leu Ser Glu Leu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ile Phe His Val
225 230 235 240
tcc ggg gcg gag gcg gcc gag gaa atc cgc cgc gcg cag aat cgc ggc 768
Ser Gly Ala Glu Ala Ala Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Asn Arg Gly
245 250 255
ctc aag gtc ttc ggc gag acc tgc ccg caa tat ctg atg ctg acg gcg 816
Leu Lys Val Phe Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu Met Leu Thr Ala
260 265 270
gcg gat ctc gac cgg ccg gat ttc gag ggt gcg aaa ttc ctg tgc agc 864
Ala Asp Leu Asp Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Phe Leu Cys Ser
275 280 285
ccc gcg ccg cgc acg acg gcc gat cag gaa gcc ctg tgg gac tat atc 912
Pro Ala Pro Arg Thr Thr Ala Asp Gln Glu Ala Leu Trp Asp Tyr Ile
290 295 300
cgc acg gga acg atc ggg gtc gtg tcg tcc gac cac gcg ccg aac cgc 960
Arg Thr Gly Thr Ile Gly Val Val Ser Ser Asp His Ala Pro Asn Arg
305 310 315 320
ttc gac gat ccg cac ggc aag aag gtc ggc ggg gtg gac gcg ccc ttc 1008
Phe Asp Asp Pro His Gly Lys Lys Val Gly Gly Val Asp Ala Pro Phe
325 330 335
agc gcc att ccg aac ggc gtg ccg ggg ctg gcg acg cgc ctg ccg atc 1056
Ser Ala Ile Pro Asn Gly Val Pro Gly Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ile
340 345 350
ctg ttt tcc gaa ggg gtc gtc aag ggg cgc atc gac ctc aac acc ttc 1104
Leu Phe Ser Glu Gly Val Val Lys Gly Arg Ile Asp Leu Asn Thr Phe
355 360 365
gtc gcg ctg acg gcg gcc aat ccg gcg aag ctc ttt ggc ctg cat ccc 1152
Val Ala Leu Thr Ala Ala Asn Pro Ala Lys Leu Phe Gly Leu His Pro
370 375 380
aga aag ggc acc atc gcc gtc gga gcc gat gcg gat atc gcg atc tgg 1200
Arg Lys Gly Thr Ile Ala Val Gly Ala Asp Ala Asp Ile Ala Ile Trp
385 390 395 400
gat ccc gag cgc aag gtg acg atc cgc aac gac atg ctg cat cac ggc 1248
Asp Pro Glu Arg Lys Val Thr Ile Arg Asn Asp Met Leu His His Gly
405 410 415
gtc gac tac acg gtc tac gag ggc gtc gag gtg acc gga tgg ccg gtg 1296
Val Asp Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Val Glu Val Thr Gly Trp Pro Val
420 425 430
atg acg ctc tcg cgc ggc gag gtg gtc tat gat gac ggc gcg gtg gtc 1344
Met Thr Leu Ser Arg Gly Glu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Val Val
435 440 445
ggc aag ccg ggt cac ggg cgc ttc ctt gcc cgc ggt ccc tat gac gcg 1392
Gly Lys Pro Gly His Gly Arg Phe Leu Ala Arg Gly Pro Tyr Asp Ala
450 455 460
atc aag ccg cgc ggc agg cat gtg acg cct ttc gac ccg gtg acg ggc 1440
Ile Lys Pro Arg Gly Arg His Val Thr Pro Phe Asp Pro Val Thr Gly
465 470 475 480
gaa gtg gaa acg gcc tga 1458
Glu Val Glu Thr Ala
485
<210> 13
<211> 485
<212> PRT
<213> Flavobacterium sp.
<400> 13
Met Thr His Tyr Asp Leu Val Ile Arg Gly Gly Thr Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Ser Asp Cys Phe Arg Ala Asp Val Ala Val Thr Asp Gly Arg Ile Val
20 25 30
Ala Ile Gly Glu Asn Leu Gly Pro Ala Ala Arg Glu Ile Ser Ala Glu
35 40 45
Gly Arg Leu Val Leu Pro Gly Gly Val Asp Ser His Cys His Ile Glu
50 55 60
Glu Pro Gln Val Gly Glu Val Arg Asn Ala Glu Thr Phe Ala Ser Ala
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Val Ile Ser Phe Ser
85 90 95
Gln Gln Val Lys Gly Gly Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Asp Tyr His
100 105 110
Glu Lys Ala Thr Arg Ala Leu Ile Asp Tyr Ser Phe His Leu Val Val
115 120 125
Thr Asp Pro Thr Asp Ala Val Leu Glu Glu Leu Val Pro Leu Ile Glu
130 135 140
Glu Gly His Arg Ser Leu Lys Ile Phe Met Thr Tyr Thr Asn Val Val
145 150 155 160
Leu Asp Asp Glu Gln Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Lys Thr
165 170 175
Gly Ala Leu Val Thr Val His Ala Glu Asn His Ala Ala Ile Met Tyr
180 185 190
Leu Thr Arg Ala Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Ala Pro Lys Tyr His
195 200 205
Ala Trp Ala Lys Pro Met Pro Val Glu Arg Glu Ala Cys His Arg Ile
210 215 220
Ile Met Leu Ser Glu Leu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ile Phe His Val
225 230 235 240
Ser Gly Ala Glu Ala Ala Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Asn Arg Gly
245 250 255
Leu Lys Val Phe Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu Met Leu Thr Ala
260 265 270
Ala Asp Leu Asp Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Phe Leu Cys Ser
275 280 285
Pro Ala Pro Arg Thr Thr Ala Asp Gln Glu Ala Leu Trp Asp Tyr Ile
290 295 300
Arg Thr Gly Thr Ile Gly Val Val Ser Ser Asp His Ala Pro Asn Arg
305 310 315 320
Phe Asp Asp Pro His Gly Lys Lys Val Gly Gly Val Asp Ala Pro Phe
325 330 335
Ser Ala Ile Pro Asn Gly Val Pro Gly Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ile
340 345 350
Leu Phe Ser Glu Gly Val Val Lys Gly Arg Ile Asp Leu Asn Thr Phe
355 360 365
Val Ala Leu Thr Ala Ala Asn Pro Ala Lys Leu Phe Gly Leu His Pro
370 375 380
Arg Lys Gly Thr Ile Ala Val Gly Ala Asp Ala Asp Ile Ala Ile Trp
385 390 395 400
Asp Pro Glu Arg Lys Val Thr Ile Arg Asn Asp Met Leu His His Gly
405 410 415
Val Asp Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Val Glu Val Thr Gly Trp Pro Val
420 425 430
Met Thr Leu Ser Arg Gly Glu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Val Val
435 440 445
Gly Lys Pro Gly His Gly Arg Phe Leu Ala Arg Gly Pro Tyr Asp Ala
450 455 460
Ile Lys Pro Arg Gly Arg His Val Thr Pro Phe Asp Pro Val Thr Gly
465 470 475 480
Glu Val Glu Thr Ala
485
<210> 14
<211> 915
<212> DNA
<213> Flavobacterium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(912)
<223> D-CHase
<400> 14
atg cca gga aag atc att ctc gcg gtg ggc cag ctt gga ccc atc gcc 48
Met Pro Gly Lys Ile Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala
1 5 10 15
cgc agc gac agc cgc gaa cag gtg gtg aag cgg ctc gtc gac atg ctg 96
Arg Ser Asp Ser Arg Glu Gln Val Val Lys Arg Leu Val Asp Met Leu
20 25 30
gag gag gcc gcg gcc cgc aat tcg gat ttc atc gtc ttt ccc gag ctg 144
Glu Glu Ala Ala Ala Arg Asn Ser Asp Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
gcg ctg acc acc ttc ttc ccc cgc tgg tat ttc acc gac gag gcg gaa 192
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
ctg gac gcg ttc tac gag acg gaa atg ccg agc ccg gtg aca cgc ccg 240
Leu Asp Ala Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro
65 70 75 80
ctg ttc gag gcc gcc gcg aaa cac ggc gtc ggg ttc aat ctc ggc ttc 288
Leu Phe Glu Ala Ala Ala Lys His Gly Val Gly Phe Asn Leu Gly Phe
85 90 95
gcg gag ctc gtg tcg gag ggc ggc agg aag cgc cgc ttc aac acg tcc 336
Ala Glu Leu Val Ser Glu Gly Gly Arg Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
atc gcc gtc gac agg acc ggc agg atc atc ggc aag tac cgc aag atc 384
Ile Ala Val Asp Arg Thr Gly Arg Ile Ile Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
cat ctg ccg ggc cac aag gac tat gaa gac tac cgc ccg ttc cag cat 432
His Leu Pro Gly His Lys Asp Tyr Glu Asp Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
ctg gag aag cgg tac ttc gag acc ggc aat ctc gga ttc ccg gtc tat 480
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Thr Gly Asn Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145 150 155 160
gag gtc gat ggt ttc aag atg ggc atg ttc atc tgc aac gac cgg cgc 528
Glu Val Asp Gly Phe Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
tgg ccg gag acc tgg cgc gtg atg ggt ctc aag ggc gcg gag ctg atc 576
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Leu Ile
180 185 190
tgc ggc ggc tac aac acg ccg ctg cac aat ccg ccg gtg ccg cag cac 624
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
gac cag ctc agc tcc ttc cac cat ctc ctg tcg atg cag gcg ggc gcc 672
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
tac cag aac ggt gcg tgg acc gcc gga gcg ggc aag gtc ggg gtg gag 720
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Thr Ala Gly Ala Gly Lys Val Gly Val Glu
225 230 235 240
gaa ggc tgc atg ctg ctc ggc cat tcc tgc atc gtc gcg ccc acc ggg 768
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
gag ctt gcc gcg ctc acc aac acg ctg gag gac gag gtc atc acg gcc 816
Glu Leu Ala Ala Leu Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
gct gcc gat ttt gcc cgc tgc cgg gaa atc cgc gag aac atc ttc aat 864
Ala Ala Asp Phe Ala Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
ttc gag cag cat cgc gag ccg cag gaa tac ggg ttg atc gcc gcc gtc 912
Phe Glu Gln His Arg Glu Pro Gln Glu Tyr Gly Leu Ile Ala Ala Val
290 295 300
tga 915
<210> 15
<211> 304
<212> PRT
<213> Flavobacterium sp.
<400> 15
Met Pro Gly Lys Ile Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala
1 5 10 15
Arg Ser Asp Ser Arg Glu Gln Val Val Lys Arg Leu Val Asp Met Leu
20 25 30
Glu Glu Ala Ala Ala Arg Asn Ser Asp Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
Leu Asp Ala Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro
65 70 75 80
Leu Phe Glu Ala Ala Ala Lys His Gly Val Gly Phe Asn Leu Gly Phe
85 90 95
Ala Glu Leu Val Ser Glu Gly Gly Arg Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
Ile Ala Val Asp Arg Thr Gly Arg Ile Ile Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
His Leu Pro Gly His Lys Asp Tyr Glu Asp Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Thr Gly Asn Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145 150 155 160
Glu Val Asp Gly Phe Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Leu Ile
180 185 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Thr Ala Gly Ala Gly Lys Val Gly Val Glu
225 230 235 240
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
Glu Leu Ala Ala Leu Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
Ala Ala Asp Phe Ala Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
Phe Glu Gln His Arg Glu Pro Gln Glu Tyr Gly Leu Ile Ala Ala Val
290 295 300
【図１】ＡＪ１１１９９株のＤ−ヒダントイナーゼ、Ｄ
−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、およびヒダント
インラセマーゼをコードする遺伝子群の構造を示す図で
ある。
−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、およびヒダント
インラセマーゼをコードする遺伝子群の構造を示す図で
ある。
【図２】本発明のヒダントインラセマーゼの製造工程を
示すフローチャートである。
示すフローチャートである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【整理番号】 ＰＡＭＡ−１３３４１
【提出日】 平成１４年９月１２日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ −Ｐ ４２２９
【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託セン ター
究所 特許生物寄託セン ター
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ− ８０６３
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｐ 13/04
13/04 41/00 Ａ
41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 渡部 乙比古
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の
素株式会社アミノサイエンス研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA07 BA71
BA80 CA03 CA20 DA06 EA04
GA11 GA19 GA27
4B050 CC03 DD02 EE01 LL01 LL02
LL03 LL05
4B064 AE02 AE03 AE29 CA21 CB06
CB30 CC01 CD12 CD13 CD27
DA01 DA10 DA11 DA13
4B065 AA26X AA27Y AB01 AC14
BA02 BA25 BB01 BC03 BC26
CA17 CA27 CA31 CA41 CA43
CA44 CA46 CA47
4H006 AA02 AC80 NB00
Claims (13)
- 【請求項１】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項２】 フラボバクテリウム属細菌を培養して得
た菌体を破砕または溶菌後、精製処理を行うことにより
取得されるフラボバクテリウム属細菌由来の５置換ヒダ
ントインラセマーゼ画分。 - 【請求項３】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置
換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光
学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換
ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素ま
たは当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作
用させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製
造方法。 - 【請求項５】 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも
一方が光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素
含有物であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒ
ダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活
性アミノ酸の製造方法。 (i)請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活
性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置換ヒ
ダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 - 【請求項６】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダン
トイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当
該酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加
水分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン
化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸
の製造方法。 - 【請求項７】 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 - 【請求項８】 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し
５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項９】 請求項７または８のいずれかに記載のＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 - 【請求項１０】 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラ
スミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体で
あることを特徴とする請求項９に記載の組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項１１】 請求項９または１０に記載の組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 - 【請求項１２】 前記細胞は、エシェリヒア コリであ
ることを特徴とする請求項１１に記載の細胞。 - 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP2002013552A JP4485734B2 (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002013552A JP4485734B2 (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003210176A true JP2003210176A (ja) | 2003-07-29 |
| JP4485734B2 JP4485734B2 (ja) | 2010-06-23 |
Family
ID=27650483
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002013552A Expired - Fee Related JP4485734B2 (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP4485734B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005038021A1 (ja) * | 2003-09-08 | 2005-04-28 | Ajinomoto Co., Inc. | 新規トランスポータタンパク質 |
| US7709235B2 (en) | 2005-01-31 | 2010-05-04 | Kaneka Corporation | 5-Substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and process for production of optically active N-carbamylamino acid or optically active amino acid |
-
2002
- 2002-01-22 JP JP2002013552A patent/JP4485734B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005038021A1 (ja) * | 2003-09-08 | 2005-04-28 | Ajinomoto Co., Inc. | 新規トランスポータタンパク質 |
| US7709235B2 (en) | 2005-01-31 | 2010-05-04 | Kaneka Corporation | 5-Substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and process for production of optically active N-carbamylamino acid or optically active amino acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4485734B2 (ja) | 2010-06-23 |
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