JP2003319788A

JP2003319788A - 新規デヒドロゲナーゼ及びそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JP2003319788A
Application number: JP2003050338A
Authority: JP
Inventors: Nobuyoshi Ezaki; 信芳江崎; Hisaaki Mihara; 久明三原; Mari Hara; 磨理原; Makoto Ueda; 誠上田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2003-11-11
Anticipated expiration: 2023-02-27
Also published as: JP4231709B2

Abstract

(57)【要約】【課題】公知のデヒドロゲナーゼとは異なる性質を有
する新規なデヒドロゲナーゼを提供すること。【解決手段】以下の理化学的性質を有するデヒドロゲ
ナーゼ。（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素
としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミ
ンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミ
ンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さな
い；（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とし
た場合の至適ｐＨが１０付近；及び、（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定である
ｐＨが５〜１０．５付近：

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規デヒドロゲナ
ーゼ、それをコードするＤＮＡ、及びそれを用いたＮ−
アルキルアミノ酸の製造方法に関するものである。Ｎ−
アルキルアミノ酸の中でも、特にＮ−メチルアミノ酸
は、ジデムニン（Didemnin）あるいはドラスタチン（do
lastatin）といった天然の生理活性物質の構造の一部で
存在することが知られ(J.Am.Chem.Soc. 1981, 103号,p1
857-1859;Tetrahedron 1993, 49号p9151-9170)、近年は
医薬あるいは農薬の中間原料として注目されている有用
な物質である。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−置換アミノ酸類の製造方法として
は、アジドの還元的アルキル化による方法(J. Org. Che
m. 1995, 60号, p4986-4987)、オキザゾリジン誘導体か
らの還元的開環反応による製法(Tetrahedron Letter 39
(1998) 1985-1986)といった化学的反応などが知られて
いた。

【０００３】また、微生物を用いた方法としては、デヒ
ドロゲナーゼ又はアミノトランスフェラーゼを用いた２
−オキソカルボン酸誘導体からのアミノ酸類の製造方法
が知られているものの、これらは主として、単なるアミ
ノ化のみが行われているだけであり、置換アミノ基を用
いたものとしては、シュードモナス（Pseudomonas）属
の微生物を用いてピルビン酸からＮ−メチルアラニンを
製造する方法（J. Biol. Chem., 250号, p3746-3751(19
75)）、及びロドコッカス属、アルスロバクター属の微
生物を用いたメチルアミノ化方法（特開２００１−１９
０２９８号公報）のように単なるメチルアミノ化のみが
知られているのみであった。

【０００４】また、上記反応に関与する酵素としては、
J. Biol. Chem., 250号, p3746-3751(1975)に、シュー
ドモナスＭＳＡＴＣＣ２５２６２由来のＮ−メチルア
ラニンデヒドロゲナーゼが精製されたことが報告されて
いる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ように、公知のアミノ酸デヒドロゲナーゼおよびＮ−メ
チルアミノ酸デヒドロゲナーゼは、アミン類又はジカル
ボニル基含有化合物といった基質特異性が限定されてお
り、適用できる応用の範囲が狭い。また、上記した公知
の酵素を用いてＮ−メチルアミノ化を行った場合、Ｎ−
メチル−アミノ酸だけではなくアミノ基の置換基のない
通常のアミノ酸も同時に製造されるため、工業的に有利
な方法とは言えない。このため、新規なデヒドロゲナー
ゼの取得が望まれていた。即ち、本発明は、公知のデヒ
ドロゲナーゼとは異なる性質を有する新規なデヒドロゲ
ナーゼを提供することを解決すべき課題とした。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、シュードモナスプ
チダＡＴＣＣ１２６３３株より新規デヒドロゲナーゼを
単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明によれば、以下の理化学的性
質を有するデヒドロゲナーゼが提供される。（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素
としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミ
ンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミ
ンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さな
い；（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とし
た場合の至適ｐＨが１０付近；及び、（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定である
ｐＨが５〜１０．５付近：

【０００８】本発明の別の側面によれば、下記の何れか
のポリペプチドが提供される。（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド；（２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポ
リペプチド；又は（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナー
ゼ活性を有するポリペプチド；

【０００９】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかの
ＤＮＡが提供される。（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；（２）配列番号２で表される塩基配列において１から複
数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列
を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ；又は（３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、デヒド
ロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ：

【００１０】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明
のＤＮＡまたは組換えベクターを有する形質転換体が提
供される。

【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、下記一
般式（Ｉ）

【化４】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されていてもよいア
ルキル基を示し、Ｒ²は置換されていてもよいアルキル
基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表さ
れるジカルボニル基含有化合物とＲ³（Ｒ⁴）ＮＨ（式
中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立して、水素原子又は置
換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ³と
Ｒ⁴は共に水素原子であることはない。）で表されるア
ルキル置換アミン類とを、本発明のデヒドロゲナーゼ、
ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応させること
を含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法が提
供される。

【００１２】好ましくは、Ｒ¹は水素原子である。好ま
しくは、Ｒ³はアミノ基で置換されていてもよいＣ１〜
Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基であり、
Ｒ⁴が水素原子である。好ましくは、式（Ｉ）で表され
る化合物は、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、β―フ
ルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトヘキサン
酸又は２−ケトｎ−吉草酸である。

【００１３】本発明のさらに別の側面によれば、下記一
般式（ＩＩ）：

【化５】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されていてもよいア
ルキル基を示し、Ｒ²は置換されていてもよいアルキル
基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表さ
れるアミノカルボン酸類と、一般式（ＩＩ）で表される
アミノカルボン酸類を一般式（Ｉ）：

【化６】（式中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（ＩＩ）における定義と
同義である）で表される化合物に変換することのできる
酵素と、Ｒ³（Ｒ⁴）ＮＨ（式中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞ
れ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキ
ル基を示す。ただし、Ｒ³とＲ⁴は共に水素原子であるこ
とはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、本
発明のデヒドロゲナーゼ、ポリペプチド又は形質転換体
の存在下で反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミ
ノ酸誘導体の製造方法が提供される。

【００１４】好ましくは、Ｒ³はアミノ基で置換されて
いてもよいＣ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のア
ルキル基であり、Ｒ⁴が水素原子である。好ましくは、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類は、フェ
ニルアラニンまたはメチオニンである。好ましくは、式
（ＩＩ）で表されるアミノカルボン酸類を式（Ｉ）で表
されるアルキル置換アミン類に変換することのできる酵
素は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシ
ダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸
デヒドロゲナーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼであ
る。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。（Ｉ）本発明のデヒドロゲナーゼ及びポリペプチド本発明のデヒドロゲナーゼは以下の理化学的性質を有す
るものである。（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素
としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミ
ンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミ
ンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さな
い；（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とし
た場合の至適ｐＨが１０付近；及び、（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定である
ｐＨが５〜１０．５付近：

【００１６】本発明のデヒドロゲナーゼは、例えば、フ
ェニルピルビン酸のようなジカルボニル基含有化合物
と、ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨの存在下で、アン
モニア、アルキルアミン及びジアルキルアミンを用いた
スクリーニングを行うことにより、取得することができ
る。

【００１７】スクリーニングに当たっては、デヒドロゲ
ナーゼ活性を有する微生物の培養物から増殖菌体、該菌
体破砕物、又はこれから通常の操作により単離した粗酵
素又は精製酵素を用いることができる。

【００１８】加えて、酵素の安定なｐＨが５〜１０．５
付近である上で、至適ｐＨが１０付近となるといった特
性を有することが本発明のデヒドロゲナーゼの特性であ
る。

【００１９】上記デヒドロゲナーゼは、例えば、シュー
ドモナス・プチダに属する微生物、特に好ましくは、シ
ュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株より単離す
ることができる。

【００２０】上記デヒドロゲナーゼの具体例としては、
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチ
ド、並びにそのホモログであってデヒドロゲナーゼ活性
を有するものが挙げられる。

【００２１】配列番号１に記載のアミノ酸配列で示され
るデヒドロゲナーゼの性質としては、上記（１）〜
（４）で示される性質の他に以下のような特性も示す。（５）Superose 12HR10/30（アマシャムバイオサイエン
ス社製）を用いたゲル濾過法分析により測定される分子
量が約８０〜９３キロダルトンであり、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動において、少なくとも約３６キロ
ダルトンと推定されるポリペプチドのバンドを示す。（６）フェニルピルビン酸とメチルアミンを基質とした
場合の活性測定による至適温度は３５℃付近である。（７）至適ｐＨ（フェニルピルビン酸とメチルアミンと
を基質とした場合＝ｐＨ１０）において３０分処理した
ときの熱安定性は、約３０℃未満である。（８）ピルビン酸だけでなく、少なくとも２−ケトヘキ
サン酸、フェニルピルビン酸、２−オキソ酪酸、β―フ
ルオロピルビン酸、２−ケトｎ−吉草酸にも活性を示
す。（９）０．０１ｍＭの塩化水銀（ＨｇＣｌ₂）及び０．
０１ｍＭの塩化銅（ＣｕＣｌ₂）といった２価の重金属
によって活性が阻害される。

【００２２】本発明のデヒドロゲナーゼのホモログとし
ては、配列番号1で表されるアミノ酸配列において１か
ら複数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜
１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましく
は１〜７個、特に好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸
が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有
し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ま
しくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好
ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さ
らに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上
の相同性を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペ
プチド；が挙げられる。

【００２３】尚、上記ポリペプチドのホモロジー検索
は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象に、F
ASTA programやBLAST programなどを用いて行うことが
できる。

【００２４】また、デヒドロゲナーゼ活性とは、一般に
脱水素反応を触媒する活性の総称であるが、本発明では
ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の酸化還元反応に関する補酵素
とアルキルアミン類によりカルボニル化合物をアルキル
アミノ化させる活性をいう。

【００２５】本発明のデヒドロゲナーゼの取得方法とし
ては、上述したようにデヒドロゲナーゼ活性を有する微
生物の培養物から単離・精製する方法のほか、後述する
ように本発明のアミノ酸配列の一部又は全部をコードす
る塩基配列を元にして作成したプローブを用いることに
より、デヒドロゲナーゼ活性を有する任意の微生物から
該還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元
に遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。

【００２６】あるいは、本発明のデヒドロゲナーゼは、
Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc
法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によ
っても製造することができる。また、桑和貿易(米国Adv
anced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米
国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオ
テク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国P
rotein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Sy
nthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド
(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機
を利用して化学合成することもできる。

【００２７】（II）本発明のＤＮＡ本発明によれば、上記デヒドロゲナーゼをコードするＤ
ＮＡまたはそのホモログが提供される。上記デヒドロゲ
ナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号
２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。

【００２８】本発明のデヒドロゲナーゼをコードするＤ
ＮＡのホモログとしては、配列番号２で表される塩基配
列において１から複数個（好ましくは１〜６０個、より
好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、
さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個
程度）の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配
列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ；又は配列番号２で表される塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ：が挙げられる。

【００２９】当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮ
Ａに部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８
（１９８３）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄＥｄｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）
（以下、"モレキュラークローニング第２版" と略
す）、ＰＣＲＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈＩＲＬＰｒｅｓｓｐｐ．２００（１９９
１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付
加変異を導入することにより所望のホモログを得ること
が可能である。

【００３０】本明細書において「ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション
法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザ
ンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることに
より得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロ
ニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断
片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍ
のＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行
った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成
は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナト
リウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する
ことにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。

【００３１】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
クローニング第２版等に記載されている方法に準じて行
うことができる。上記したＤＮＡのホモログとしては、
配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと６０％以
上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以
上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有するものが
挙げられる。

【００３２】本発明のデヒドロゲナーゼをコードするＤ
ＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離するこ
とができる。

【００３３】まず、本発明のデヒドロゲナーゼを精製
後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、染色体ＤＮ
ＡからＰＣＲ法を用いたクローニング等の通常の遺伝子
工学的解析手法を用いて、目的とするデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解析する
ことができる。また、本発明により、その塩基配列が明
らかになったため、当該塩基配列を元にプライマーを設
定し、目的とする遺伝子をクローニングすることもでき
るし、ＤＮＡ合成装置により合成することもできる。

【００３４】（III）本発明の組み換えベクター及び形
質転換体上記の（II）で取得された本発明のデヒドロゲナーゼを
コードするＤＮＡは、公知の発現ベクターに挿入するこ
とにより、デヒドロゲナーゼ発現ベクターを提供するこ
とができる。また、この発現ベクターで形質転換した形
質転換体を培養することにより、デヒドロゲナーゼを該
形質転換体から得ることができる。

【００３５】本発明のデヒドロゲナーゼを発現させるた
めの形質転換の対象となる微生物としては、宿主自体が
本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはな
く、具体的には以下に示すような微生物を挙げることが
できる。

【００３６】エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス
(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラ
チア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacteriu
m)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、スト
レプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(La
ctobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細
菌；ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセ
ス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されてい
る放線菌；サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クラ
イベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイ
セス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス
(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ト
リコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rho
dosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pi
chia)属、キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター
系の開発されている酵母；ノイロスポラ(Neurospora)
属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリ
ウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)
属などの宿主ベクター系の開発されているカビ。

【００３７】上記微生物の中で宿主として好ましくは、
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテ
リウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましくは、
エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Co
rynebacterium)属である。

【００３８】形質転換体の作製のための手順および宿主
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、モレキュラークロ
ーニング第２版などを参照）。

【００３９】具体的には、微生物中において安定に存在
するプラスミドベクターやファージベクター中に本発明
のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に
本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳さ
せる必要がある。

【００４０】このとき、プロモーターを本発明のＤＮＡ
鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを
３’−側下流にそれぞれ組み込むことが好ましい。本発
明で用いることができるプロモーター及びターミネータ
ーとしては、宿主として利用する微生物中において機能
することが知られているプロモーター及びターミネータ
ーであれば特に限定されず、これら各種微生物において
利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーター
などに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工
学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem.
Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、な
どに詳細に記述されている。

【００４１】具体的には、例えばエシェリヒア属、特に
大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)において
は、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミ
ドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプ
トファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λ
ファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが
挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由
来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のター
ミネーターなどが挙げられる。

【００４２】バチルス属においては、ベクターとして
は、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどを挙
げることができ、また、染色体にインテグレートするこ
ともできる。プロモーター及びターミネーターとして
は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−ア
ミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネータ
などが利用できる。

【００４３】シュードモナス属においては、ベクターと
しては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putid
a)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)
などで開発されている一般的な宿主ベクター系や、トル
エン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミド
を基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する
自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240を挙げること
ができる。

【００４４】ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene
39,281 (1985))などのプラスミドベクターを挙げること
ができる。プロモーター及びターミネーターとしては、
大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネ
ーターが利用可能である。

【００４５】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799
号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)な
どのプラスミドベクターが挙げられる。

【００４６】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces ce
revisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp
系、YCp系、YIp系プラスミドが挙げられる。また、アル
コール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった
各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用
可能である。

【００４７】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Bio
l. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポン
ベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特
に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用
できる。

【００４８】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。

【００４９】また、上記以外でも、各種微生物に応じた
宿主ベクター系が開発されており、それらを適宜使用す
ることができる。

【００５０】また、微生物以外でも、植物、動物におい
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タン
パク質を発現させる系及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚
芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が開発され
ており、好適に利用できる。

【００５１】本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養
し、培養物から公知の方法で本発明のデヒドロゲナーゼ
を単離精製することができる。本発明のＤＮＡを有する
形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる
通常の方法に従って行うことができる。本発明の形質転
換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である
場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化
し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換
体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成
培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通
気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、
培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６
時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテ
トラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００５２】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているRP
M11640培地〔The Journal of the American Medical As
sociation,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Scienc
e, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(19
59)〕、199培地〔Proceeding of the Society for theB
iological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地
に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養
は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ₂存在下
等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じ
て、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添
加してもよい。

【００５３】形質転換体の培養物から、本発明のデヒド
ロゲナーゼを単離精製するには、通常のタンパク質の単
離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のデヒドロ
ゲナーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培
養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸
濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリ
ンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、
無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離するこ
とにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精
製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩
法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEA
E)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジ
ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Seph
arose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオ
ン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フ
ェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマト
グラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニテ
ィークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング
法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独ある
いは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【００５４】また、本発明のデヒドロゲナーゼが細胞内
に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収
後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分
より、通常の方法により該デヒドロゲナーゼを回収後、
該デヒドロゲナーゼの不溶体をタンパク質変性剤で可溶
化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあ
るいはタンパク質変性剤の濃度がデヒドロゲナーゼが変
性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該
デヒドロゲナーゼを正常な立体構造に構成させた後、上
記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができ
る。

【００５５】（IV）本発明のデヒドロゲナーゼを用いた
Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体の製造さらに本発明は、下記一般式（Ｉ）

【００５６】

【化７】

【００５７】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されて
いてもよいアルキル基を示し、Ｒ²は置換されていても
よいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を
示す）で表されるジカルボニル基含有化合物とＲ
³（Ｒ⁴）ＮＨ（式中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立し
て、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示
す。ただし、Ｒ³とＲ⁴は共に水素原子であることはな
い。）で表されるアルキル置換アミン類とを、上記した
本発明のデヒドロゲナーゼまたは形質転換体の存在下で
反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体
の製造方法；及び、下記一般式（ＩＩ）：

【００５８】

【化８】

【００５９】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されて
いてもよいアルキル基を示し、Ｒ²は置換されていても
よいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を
示す）で表されるアミノカルボン酸類と、一般式（Ｉ
Ｉ）で表されるアミノカルボン酸類を一般式（Ｉ）：

【００６０】

【化９】

【００６１】（式中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（ＩＩ）に
おける定義と同義である）で表される化合物に変換する
ことのできる酵素と、Ｒ³（Ｒ⁴）ＮＨ（式中、Ｒ³及び
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてい
てもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ³とＲ⁴は共に水
素原子であることはない。）で表されるアルキル置換ア
ミン類とを、本発明のデヒドロゲナーゼ、ポリペプチド
又は形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ−
アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法に関する。

【００６２】上記一般式（Ｉ）中のＲ¹のアルキル基と
しては、ハロゲン原子、アリール基等の反応に不活性な
基で置換されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環
状のアルキル基であり、具体例としては、メチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、トリフルオ
ロメチル基、ベンジル基等が挙げられる。このうち、好
ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは１〜４のもの
である。

【００６３】上記Ｒ¹として好ましくは、水素原子又は
直鎖のアルキル基であり、特に好ましくは水素原子であ
る。

【００６４】上記Ｒ²のアルキル基としては、ハロゲン
原子、水酸基、アリール基等の反応に不活性な基で置換
されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環状のアル
キル基であり、具体例としては、メチル基、エチル基、
ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フルオロメチル基、
トリフルオロメチル基、ヒドロキシメチル基、ベンジル
基等が挙げられる。

【００６５】上記Ｒ²のアリール基としては、ハロゲン
原子、水酸基、アルキル基、アリール基等の反応に不活
性な基で置換されていていてもよいアリール基であり、
具体例としては、フェニル基、トリル基、フルオロフェ
ニル基、ヒドロキシフェニル基等が挙げられる。

【００６６】上記置換されていてもよいアルキル基及び
アリール基として好ましくは炭素数１〜１０のものであ
る。

【００６７】上記Ｒ²として好ましくは、アルキル基、
ハロアルキル基、アラルキル基であり、このうち、直鎖
状のものが特に好ましい。

【００６８】一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい
具体例としては、ピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸、
フェニルピルビン酸、β−フルオロピルビン酸、２−ケ
トヘキサン酸、２−ケトイソヘキサン酸、２−オキソ酪
酸、２−ケトオクタン酸又は２−ケトｎ−吉草酸が挙げ
られ、特に好ましくはピルビン酸、フェニルピルビン
酸、β―フルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケ
トヘキサン酸又は２−ケトｎ−吉草酸である。一般式
（ＩＩ）で表される化合物の好ましい具体例としては、
フェニルアラニン、メチオニンである。

【００６９】本反応に用いられるアミン類は、Ｒ
³（Ｒ⁴）ＮＨで表されるものである。ここで、上記Ｒ³
及びＲ⁴として、それぞれ独立して、水素原子又は置換
されていてもよいアルキル基であり、ここで、置換され
ていてもよいアルキル基としては、ハロゲン原子、水酸
基、アミノ基、アリール基等の反応に不活性な基で置換
されていていてもよい直鎖、分岐鎖若しくは環状のアル
キル基である。

【００７０】上記置換されていてもよいアルキル基の具
体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、
イソプロピル基、フルオロメチル基、トリフルオロメチ
ル基、ヒドロキシメチル基、アミノメチル基、ベンジル
基等が挙げられ、このうち好ましくは直鎖状のアルキル
基又はアミノアルキル基である。また、上記置換されて
いてもよいアルキル基としては、炭素数１〜６のものが
好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のものである。

【００７１】上記アミン類の好ましい具体例としては、
メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イ
ソプロピルアミン、ジアミノメタン、ジメチルアミン、
シクロヘキサンアミン等が挙げられ、より好ましくは１
級のアミン類であり、特に好ましくはメチルアミンであ
る。

【００７２】本反応において、反応基質であるジカルボ
ニル基含有化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０
％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用
いられる。これらは、反応開始時に一括して添加しても
よいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと
言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点から
すると、連続的もしくは間欠的に添加することが望まし
い。本反応において、反応基質であるアミノカルボン酸
類は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ま
しくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。

【００７３】また、アミン類は、ジカルボニル基含有化
合物及びアミノカルボン酸類に対して等モル量以上、好
ましくは１．５モル倍以上用いられる。上記範囲であれ
ば、通常、系内のｐＨ及びコスト等を勘案して任意に用
いればよいが、通常、５０モル倍量以下、好ましくは２
０モル倍以下である。

【００７４】本反応において、ジカルボニル基含有化合
物及びアミノカルボン酸類に上記形質転換体を作用させ
るに当たっては、該形質転換体をそのまま、該形質転換
体をアセトン、ＤＭＳＯ、トルエン等の有機溶媒や界面
活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物
理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該形
質転換体中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物
として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリ
ルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に
固定化したものを用いることができる。

【００７５】また、本反応においては、補酵素ＮＡＤ＋
あるいはＮＡＤＰ＋（以下ＮＡＤ（Ｐ）＋と略）もしく
はＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ（以下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと
略）を添加するのが好ましく、通常、０．００１mM〜１
００mM、好ましくは０．０１〜１０mM添加する。

【００７６】上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
への再生させることが生産効率向上のため好ましく、上
記再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤ
（Ｐ）＋還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）＋か
らＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその
処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素
酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有
機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応
系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当た
り、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素である上記
再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導
入する方法が挙げられる。

【００７７】このうち、上記１）の方法においては、反
応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方
が好ましい。

【００７８】また、上記２）の方法においては、上記再
生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理し
たもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に
破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物ある
いは精製物として取り出したもの、さらには、これらを
ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表さ
れる担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販
の酵素を用いてもよい。

【００７９】この場合、上記再生酵素の使用量として
は、具体的には、本発明のデヒドロゲナーゼに比較し
て、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５
〜２０倍程度となるよう添加する。

【００８０】また、上記再生酵素の基質となる化合物、
例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコ
ース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコー
ル脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソ
プロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量
としては、反応原料であるジカルボニル基含有化合物に
対して、０．１〜２０モル倍量、好ましくは１〜５モル
倍量添加する。

【００８１】また、上記３）の方法においては、本発明
のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む
方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形
質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクター
に導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることが
できるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入し
た後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士
の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。

【００８２】単一のベクター中に複数の遺伝子を導入す
る場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現
制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法や
ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオ
ペロンとして発現させることも可能である。

【００８３】本反応は、反応基質及び本発明の形質転換
体並びに必要に応じて添加された各種補酵素及びその再
生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と
有機溶媒との混合物中で行われる。

【００８４】上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が
挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロ
パノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド
等の水溶性有機溶媒や酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエ
ン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の非水溶性有機溶媒
などから適宜反応基質の溶解度が高い物を使用すること
ができる。

【００８５】本反応は、通常、４〜５０℃、好ましくは
１０〜４０℃の反応温度で、通常ｐＨ６〜１１、好まし
くはｐＨ７〜１１で行われる。また、膜リアクターなど
を利用して行うことも可能である。

【００８６】さらに、本反応において、一般式（Ｉ）で
表される化合物のうちカルボン酸エステル類を反応原料
として用いる場合には、市販の加水分解酵素を系内に共
存させ、系内でＲ¹が水素原子であるカルボン酸類に変
換させ引き続き、Ｎ−アルキルアミノ化してもよい。

【００８７】また、本反応においては、上記一般式
（Ｉ）に対応するアミノカルボン酸類、すなわち一般式
（ＩＩ）で表される化合物（Ｒ²ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＲ
¹）を反応原料として用い、一般式（ＩＩ）で表される
化合物に作用し一般式（Ｉ）で表される化合物に変換す
る事の出来る酵素を共存させることにより、系内で上記
一般式（Ｉ）で表される化合物を生成させ、引き続き、
本デヒドロゲナーゼによりＮ−アルキルアミノ化しても
よい。

【００８８】一般式（ＩＩ）で表される化合物に作用し
一般式（Ｉ）で表される化合物に変換する事の出来る酵
素であれば特に限られないが、具体的にはアミノ酸オキ
シダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トラン
スフェラーゼがあげられる。好ましくは基質特異性の広
い酵素が好ましい。具体的にはEnzyme and MicrobialTe
chnology vol.31(2002) p77-87に記載されているＬ−ア
ミノ酸オキシダーゼ、シグマ社製のＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼなどがあげられる。用いられるアミノ酸オキシダ
ーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トランスフ
ェラーゼは、アミノ酸にのみ反応するものであり、かつ
本反応で用いられる補酵素に対応するものを使用できる
と補酵素の再生システムの代替ともなり好ましい。すな
わち、本反応のＮ−アルキルアミノ化において、補酵素
としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いた場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは
本反応のＮ−アルキルアミノ化によりＮＡＤＰ＋となる
が、一方で、アミノカルボン酸類から上記一般式（Ｉ）
で表される化合物を製造するに当たり、このＮＡＤＰ＋
を利用してＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ変換することとなる。また
一般式（ＩＩ）で表される化合物に作用し一般式（Ｉ）
で表される化合物に変換する事の出来る酵素がカルボン
酸基に置換基のないアミノ酸のみに作用する場合、該ア
ミノカルボン酸をアミノ酸に加水分解する酵素をさらに
共存させ、該アミノ酸を生成せしめた後に反応を行わせ
ても良い。

【００８９】本反応により生成するＮ−アルキル−アミ
ノ酸誘導体は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク
質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エ
チル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラ
ムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせ
ることにより行うことができる。以下、実施例により本
発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定され
るものではない。

【００９０】

【実施例】本実施例における酵素活性は下記のような方
法で測定した。測定対象となる粗酵素液にフェニルピル
ビン酸ナトリウム（最終濃度１５ｍＭ）、メチルアミン
−硫酸緩衝液（ｐＨ１０）（最終濃度４００ｍＭ）、Ｎ
ＡＤＰＨ（最終濃度１０ｍＭ）を加え全量５０μＬとし
た。３７℃で１時間反応させた。反応終了後、５μＬの
１０％トリクロロ酢酸液を加え１３０００ｒｐｍ、５分
間遠心を行った。遠心上清１０μＬを４０μＬの高速液
体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）溶
離液で希釈し０．４５μｍのフィルターで濾過後高速液
体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）に
て分析した。

【００９１】ＨＰＬＣの条件はカラム：ＵｌｔｒｏｎＥＳＰｈ−ＣＤ（信和化工株式
会社）温度：４０℃ 溶離液：２０％アセトニトリル、８０％２０ｍＭＫＨ
₂ＰＯ₄、Ｈ₃ＰＯ₄ ０．４ｍｌ／Ｌ（ｐＨ３）流速：０．８５ml/min. 検出器：ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）標準サンプルとしてＳｉｇｍａ社の試薬を用いた。酵素
の活性単位１ｕｎｉｔを一分間に１μモルのＮ−メチル
フェニルアラニンを生成する酵素量と規定する。

【００９２】実施例１：酵素精製（１−１）滅菌した液体培地１００ｍｌ（メチルアミン
塩酸塩５g/L, グルコース１g/L, 酵母エキス５g/L,
リン酸水素二カリウム７g/L, リン酸二水素カリウム
３g/L, 硫酸マグネシウム七水和物０．１g/Lを含む）
×２本（５００ｍｌ坂口フラスコ）に、シュードモナス
プチダＡＴＣＣ１２６３３株を接種し、２８℃で１
８時間、好気的に振とう培養した（前々培養）。次に、
同じ組成の滅菌した液体培地５００ｍｌ×４本（２Ｌ坂
口フラスコ）に、前々培養で得られた培養液を各２Ｌ坂
口フラスコに５０ｍｌずつ接種した。２８℃で８時間、
好気的条件で振とう培養した（前培養）。１％ポリペプ
トン（ナカライテスク社製）、０．５％酵母エキス（ナ
カライテスク社製）、１％塩化ナトリウム（ナカライテ
スク社製）を添加した培地（以下、ＬＢ培地と略す）２
００Ｌを滅菌して、前培養で得られた培養液２２００ｍ
ｌをすべて接種し、２８℃で好気的に１６時間培養した
（本培養）。培養後得られた培養液を遠心分離し、２．
５ｋｇの湿菌体を得た。この菌体を、５Ｌの２０ｍＭト
リス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波
破砕によって５．９Ｌの粗酵素液を得た。

【００９３】粗酵素に対し硫安分画を行ったところ、硫
安濃度２０〜６０％画分に活性があった。この画分を集
めて１５Ｌの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ
７．０）で５回透析した。酵素液の量は３１００ｍｌに
なった。

【００９４】（１−２）SuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ
社製）による精製２０ｍＭトリス−塩酸バッファー (pH 7.0)で平衡化し
たSuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）７００ｍＬに、
硫安分画20〜60％飽和の画分３１００ｍＬを供した。そ
の後２０ｍＭトリス−塩酸バッファー (pH 7.0) ４９
００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活性が検出され
なかった。上記洗浄後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含
有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー３５００ｍＬで
溶出した。この条件で、活性を持つタンパク質が溶出さ
れた。さらに、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する２
０ｍＭトリス−塩酸バッファー３５００ｍＬで溶出した
が、この画分では活性が検出されなかった。

【００９５】上記０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する
２０ｍＭトリス−塩酸バッファーで溶出した画分を回収
し、タンパク量及び酵素活性を測定した。活性を示した
溶液３９００ｍＬを、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭト
リス−塩酸バッファー(pH 7.0) に１２Ｌで３回透析し
た。透析後の酵素液は３０００ｍＬであった。

【００９６】（１−３）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ
社製）による精製上記（１−２）で得た酵素液３０００ｍＬを、２０％飽
和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)
で平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５０
０ｍＬに流した。その２０％飽和の硫安含有２０ｍＭト
リス−塩酸バッファー(pH 7.0)２８００ｍＬで洗浄を行
った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定したと
ころ、この画分に活性が検出された。洗浄で得た酵素液
に直接硫安を加えて、硫安濃度が５〜２０％飽和の画分
を取得し再びButyl-TOYOPEARLに流すことにした。

【００９７】（１−４）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ
社製）による２回目の精製得られた硫安画分の酵素液５７００ｍＬを、３０％飽和
の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で
平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５００
ｍＬに流した。その後、３０％飽和の硫安含有２０ｍＭ
トリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２３００ｍＬで洗浄を
行った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定した
ところ、この画分に活性が検出された。続いて、このカ
ラムを１５％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッ
ファー(pH 7.0)で溶出した。その結果、溶出液にも活性
が検出された。活性を示した上記両方の画分を回収し、
60％飽和濃度になるように３０７０ｇの硫安を加えて撹
拌し、濃縮した。その結果、酵素液は６００ｍＬとなっ
た。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)１
４Ｌで３回透析を行い、得られた酵素液は１０００ｍＬ
になった。

【００９８】（１−５）DEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社
製）による精製上記（１−４）において透析して得た酵素液１０００ｍ
Ｌを、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平
衡化したDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）６００ｍＬ
に供した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(p
H 7.0)４０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活性
がみられなかった。続いて０．１Ｍの塩化ナトリウムを
含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２５
００ｍＬで溶出した。その結果、この画分にほとんど活
性が検出されなかった。次に、塩化ナトリウム濃度が
０．１〜０．３Ｍとなるようにグラジェントをかけてタ
ンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したと
ころ、１７００ｍＬの酵素液が得られた。この酵素液に
７６０ｇの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、
酵素液は６０ｍＬになった。これを２０ｍＭトリス−塩
酸バッファー(pH 7.0)８Ｌで2回透析を行った。透析
後、酵素液は１００ｍＬになった。

【００９９】（１−６）Green-sepharose CL-4Bによる
精製市販の膨潤SepharoseCL-4Bゲル150mlをガラスフィルタ
ー上にとり、１Lの蒸留水を用いて吸引洗浄した。これ
を２Ｌ坂口フラスコに移した。これに、150mＬの水に溶
かしたReactive Green 19(Sigma社製) 0.75ｇ（7.5mg色
素／ｍＬゲルの割合）を加えた。さらに２２％塩化ナト
リウム水溶液15mＬ（最終濃度：約2％）を加え、ゲルと
色素がよく混ざり合う程度で、約30分間振とう撹拌し
た。１．５ｇの結晶炭酸ナトリウムを加えて、５０℃で
一晩振とう撹拌した。反応終了後、ゲル懸濁液をガラス
フィルターに移し、水（約１．５Ｌ）、１Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液（約１．５Ｌ）、水（約３Ｌ）の順序で、ろ
液の着色が見られなくなるまで色素ゲルを洗浄し、Gree
n-sepharose CL-4Bを調製した。

【０１００】上記方法で調製したGreen sepharose CL-
4B ４５０ｍＬを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH
7.0) で平衡化した後に上記（１−５）で得た酵素液１
００ｍＬを流した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッ
ファー(pH 7.0)３０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分
には、上記（１−５）で得られた酵素液のトータル活性
の１５％ほどの活性が検出された。次に、塩化ナトリウ
ム濃度が０〜３Ｍになるようにグラジェントをかけてタ
ンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したと
ころ、２３１ｍＬの酵素液が得られた。これに、70％飽
和濃度になるように硫安を１０９ｇ加えてタンパクを沈
殿させた。沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH
7.0)３ｍＬに懸濁し、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭト
リス−塩酸バッファー(pH 7.0)９Ｌで８時間透析した。
透析後、チューブ内に沈殿物が見られたため、透析と同
じバッファー８．５ｍＬを加えて懸濁した。この操作で
も沈殿物が溶解しなかったため、遠心して沈殿物と上清
を分離した。活性がほとんど上清の方にみられたため、
上清１３ｍＬをRESOURCE PHE（アマシャムバイオサイエ
ンス社製）で精製した。20 mＬの２０％飽和の硫安含有
２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)と20 mＬの２
０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)でグラジェント
をかけてタンパクを溶出した。回収した酵素液１９ｍＬ
を限外濾過で５ｍＬまで濃縮した後に、２０ｍＭトリス
−塩酸バッファー(pH 7.0)で透析したところ、酵素液は
６．５ｍＬになった。

【０１０１】（１−７）Blue-sepharose 4B（アマシャ
ムバイオサイエンス社製）による精製 Blue−sepharose 4B（アマシャムバイオサイエンス社
製）５ｍＬを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)
で平衡化した後に上記（１−６）で得られた酵素液
６．５ｍＬを流した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バ
ッファー(pH 7.0)５０ｍＬで洗浄を行った。さらに、50
mＬの1Ｍ塩化ナトリウム水溶液と50 mＬの20mM トリス
−塩酸バッファー(pH 7.0)で、塩化ナトリウム濃度が０
〜１Ｍとなるようにグラジエントをかけ活性画分を溶出
させた。上記（１−１）〜（１−７）の各精製ステップ
における酵素画分の比活性等を表１にまとめる。

【０１０２】

【表１】

【０１０３】実施例２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび部分ア
ミノ酸配列の解析各酵素精製ステップのサンプルをすべてＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動した。精製と共に量の増加が
見られる約３５〜４０ｋＤａを通常の方法で切り出し、
プロテインシーケンサーにより、エドマン法によるアミ
ノ酸配列の解析を行い、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定し
た。該配列を配列表の配列番号３で示す。ＢＬＡＳＴサ
ーチにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼと相同性が高い
蛋白であることが示唆された。

【０１０４】実施例３：酵素遺伝子のクローニングシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣ
Ｃ１２６３３株をＬＢ培地で培養し得られた菌体よりDN
easy Tissue Kit (Qiagen社製)を用いて、染色体DNAを
調製した。実施例２で決定されたN末端アミノ酸配列及
びＢＬＡＳＴサーチで見出されたアミノ酸配列をコード
する塩基配列を元にプライマーを合成した。それぞれの
塩基配列を、配列表の配列番号４(NMPDHf)及び５ (NMPD
Hr1) に示す。

【０１０５】シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３
３株の染色体DNAを鋳型とし、NMPDHf、NMPDHr1をプライ
マーとして、PCR(98℃,20秒、68℃,3分)を30サイクル行
い、特異的な増幅サンプルを得た。上記で得られたＤＮ
Ａ断片を常法に従い、クローニングベクターｐＥＴ２１
ａ（宝酒造社製））に導入した。（このプラスミドをpE
NMadhとする）

【０１０６】次に大腸菌（Escherichia coli）BL21（DE
3）（Novagen社）を形質転換した。形質転換株をアンピ
シリン（１００μg/mL）を含むＬＢ培地プレート（LB培
地＋２％寒天）上で３７℃で生育させた。出現したいく
つかの白いコロニーを培養しプラスミドの抽出を通常の
条件で行った。とれたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩお
よびＨｉｎｄIIIで切断後（３７℃で３時間）、目的Ｄ
ＮＡ断片がプラスミドに挿入されているかアガロース電
気泳動で確認した。

【０１０７】目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると
考えられるコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地
で培養し、培養１４時間目にＩＰＴＧを０．１ｍＭとな
るように添加しさらに培養を３時間続けて、集菌した。
菌体を超音波破砕し粗酵素を得た。得られた粗酵素の活
性測定を行って目的蛋白の発現を確認した。

【０１０８】目的断片が入ったコロニーから得られた粗
酵素を用いるとＮ−メチル−フェニルアラニンの生成が
確認され、プラスミドのみで形質転換した菌体破砕物で
はＮ−メチル−フェニルアラニン生成が見られなかっ
た。活性確認されたプラスミド中の挿入断片の塩基配列
を解析した。該遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２
に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を
配列表の配列番号１に示す。

【０１０９】実施例４：形質転換体の無細胞抽出液を用
いたＮ−メチル−フェニルアラニンの合成ＬＢ培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分間蒸
気殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌアンピシ
リン水溶液を５μＬ加えた。これに実施例３で得られた
大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種し
て、３７℃で２４時間振とう培養した（前培養）。次に
ＬＢ培地５０ｍＬを５００ｍＬの坂口フラスコに入れて
殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌアンピシリ
ン水溶液を５０μＬ加えた。これに前培養で得られた大
腸菌クローン株の培養液０．５ｍＬを接種して、３７℃
で１０時間振とう培養した。この段階で１ＭのＩＰＴＧ
水溶液を５０μＬ加え、さらに３７℃で３時間振とう培
養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。
得られた菌体０．３７ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）８．０ｍＬに懸濁し、超音波で菌体
を破砕した。遠心分離により菌体断片を除き、８．０ｍ
Ｌの無細胞抽出液を得た。

【０１１０】５０ｍＬのビーカーに、フェニルピルビン
酸ナトリウム６０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ２．３ｍｇ、グルコ
ース脱水素酵素３５Ｕ、グルコース１ｇを含有する４０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５．８８ｍｌ
に、硫酸でｐＨ８．０に調整した２４０ｍＭメチルア
ミンを５．８８ｍＬ、上記無細胞抽出液３．２５ｍＬを
入れ、３０℃で反応を行った。反応は１規定の水酸化ナ
トリウム水溶液でｐＨを８．０に調整しながら、撹拌し
つつ行った。反応液の一部を定期的にＨＰＬＣで分析
し、基質のフェニルピルビン酸ナトリウムが枯渇してい
る場合には、さらに３０ｍｇを追加して反応を継続させ
た。この操作を８回繰り返しつつ、２４時間反応した。
反応終了後のＮ−メチルフェニルアラニンの生成量は１
４６ｍｇであった。

【０１１１】実施例５：形質転換体からの酵素精製ＬＢ培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分間蒸
気殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌアンピシ
リン水溶液を５μＬ加えた。これに実施例３で得られた
大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種し
て、３７℃で２４時間振とう培養した（前培養）。次に
ＬＢ培地５００ｍＬを２Ｌの坂口フラスコに入れて殺菌
し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌアンピシリン水
溶液を５００μＬ加えた。これらに前培養で得られた大
腸菌クローン株の培養液０．５ｍＬを接種して、３７℃
で１４時間振とう培養した。この段階で１ＭのＩＰＴＧ
水溶液を５００μＬ加え、さらに３７℃で３時間振とう
培養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄し
た。得られた菌体３．３ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）２８ｍＬに懸濁し（全量３０ｍ
ｌ）、超音波で菌体を破砕した。遠心分離により菌体断
片を除き、２９ｍＬの無細胞抽出液を得た。次に実施例
１で用いたGreen sepharose CL-4Bを用いて精製を行っ
た。Green sepharose CL-4B（樹脂１００ｍｌ量）をト
リス塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記無
細胞抽出液を流した。

【０１１２】その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー
(pH 7.0)８００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には、次
に、塩化ナトリウム濃度が０〜１Ｍになるようにグラジ
ェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する
画分を回収し、これをCentriprep（アマシャムバイオサ
イエンス社製）で濃縮した。これを２０ｍＭトリス−塩
酸バッファー(pH 7.0)で８時間透析した。透析後、酵素
液量は５９ｍｌとなった。

【０１１３】次にDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）に
よる精製を行った。上記の透析して得た酵素液を、２０
ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化したDEA
E-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）（樹脂６０ｍＬ）に供
した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.
0)５００ｍＬで洗浄を行った。次に、塩化ナトリウム濃
度が０〜０．３５Ｍとなるようにグラジェントをかけて
タンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収し、
Centriprep（アマシャムバイオサイエンス社製）で濃縮
した後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)に対
して透析を行った。透析後、酵素液は６ｍＬになった。
上記の各精製ステップにおける酵素画分の比活性比を表
２にまとめる

【０１１４】

【表２】

【０１１５】実施例６：本酵素の基質特異性実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。これに表３に示す各種ケト酸を最終濃度10m
M、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸でｐＨ１０に調整
したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた
反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより
酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にし
た。β−フェニルピルビン酸を基質としたときを100％
として相対活性の結果を表３に示した。

【０１１６】

【表３】

【０１１７】実施例７：至適ｐＨの測定実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。これにβ−フェニルピルビン酸を最終濃度10
mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸で各ｐＨに調整
したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた
反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより
酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にし
た。一分間に１マイクロモルのβ−フェニルピルビン酸
と反応する酵素量を１ｕｎｉｔととして蛋白量あたりの
ｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨの関係の結果を図１に示
した。反応の至適pHは10.0であった。

【０１１８】実施例８：酵素の作用至適温度実施例６と同様な反応条件のうちメチルアミン−硫酸
（ｐＨ１０）にして、温度だけを変化させて活性を測定
した。結果を図２に示す。至適温度は３０〜４０℃であ
った。

【０１１９】実施例９：pH安定性実施例５で得られた精製酵素を、緩衝液を用いてｐＨを
変化させて30℃で30分間インキュベートし、残存活性を
測定した。反応条件は実施例７と同様にメチルアミン−
硫酸（ｐＨ１０）、３７℃で行った。結果は、未処理の
活性を１００とした残存活性で表し、図３に示した。本
発明による酵素は、ｐＨ６〜９において最も安定であっ
た。

【０１２０】実施例１０：酵素の温度安定性実施例５で得られた精製酵素を２５℃、３０℃、３５
℃、４０℃、４５℃および５０℃の温度で３0分間放置
した後、実施例７と同様に活性を測定した。結果は、未
処理（氷中放置）の活性を１００とした残存活性で表
し、図４に示した。本発明による酵素は、３０℃まで１
００%の残存活性を示した。

【０１２１】実施例１１：ＮＡＤＨを補酵素とした場合
の本酵素の基質特異性実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。これに表４に示す各種ケト酸を最終濃度40mM
（但しβ−フェニルピルビン酸は30mM）、ＮＡＤＨを最
終濃度0.3mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ10.0）を
最終濃度100mM、メチルアミンを最終濃度180mMとなるよ
うに加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べる
ことにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３
７℃にした。ピルビン酸を基質としたときを100％とし
て相対活性の結果を表４に示した。

【０１２２】

【表４】

【０１２３】実施例１２：ＮＡＤＨを補酵素とした場合
の至適ｐＨの測定実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。これにピルビン酸を最終濃度80mM、ＮＡＤＨ
を最終濃度0.3mM、硫酸で各ｐＨに調整したメチルアミ
ンを最終濃度180mMとなるように加えた反応液の３４０
ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定
した。測定時の反応温度は３７℃にした。一分間に１マ
イクロモルのピルビン酸と反応する酵素量を１ｕｎｉｔ
ととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨ
の関係の結果を図５に示した。反応の至適pHは9.5であ
った。

【０１２４】実施例１３：ＮＡＤを補酵素とした場合の
逆反応の検討実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。Ｎ−メチル-L-アラニンを最終濃度50mM、Ｎ
ＡＤを最終濃度10mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ1
0.0）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液の３４
０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測
定した。測定時の反応温度は３７℃にした。活性は7.8
×10^-3（ｕ／ｍｇ蛋白）であった。

【０１２５】実施例１４：ＮＡＤＰＨを補酵素とした場
合の本酵素の基質特異性実施例５と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵
素を得た。これに表５に示す各種アミン類を最終濃度60
mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、β−フェニルピルビ
ン酸を最終濃度10mMとなるように加えた反応液の３４０
ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定
した。測定時の反応温度は３７℃にした。メチルアミン
を基質としたときを100％として相対活性の結果を表５
に示した。

【０１２６】

【表５】

【０１２７】実施例１５：枯草菌からのDNAの精製枯草菌（Bacillus subtilis 株）をLB培地上で培養し、
菌体を調製した。菌体から染色体DNAの調製はQiagen k
it(Qiagen社製)を用い、付属マニュアル記載の方法によ
り行った。

【０１２８】実施例１６：枯草菌からのグルコース脱水
素酵素遺伝子のクローニング NADPHの再生を行わせるために、文献（J.Bacteriol.16
6,238-243(1986)）記載の枯草菌由来グルコース脱水素
酵素（以下GDHと略す）遺伝子のクローニングを行っ
た。文献記載の塩基配列を元に、GDH遺伝子のオープン
リーディングフレーム部分ののみをPCRクローニングす
るため構造遺伝子の5-末、3'-末の配列を元にプライマ
ー BsuG_S(配列番号６)、BsuG_A(配列番号７)を合成し
た。実施例１７により調製した枯草菌染色体DNAを鋳型
としてPCR（94℃、30秒、54℃、30秒、72℃1分）を30サ
イクル行い、特異的な増幅DNAを得た。得られたDNA断片
をEcoRIとHindIIIの2種類の制限酵素で消化した。プラ
スミドベクターpKK223-3(アマシャム−ファルマシア社
製)をEcoRIとHindIIIで消化し、上記PCR増幅DNA断片をT
4DNAリガーゼで連結し、pKK223-3GDHを得た。挿入断片
の塩基配列解析を行った結果、データベース(DDBJ Acce
ssionNo. M12276)に収録されている塩基配列と全て一致
した。得られたGDH遺伝子の塩基配列を配列番号８に示
す。

【０１２９】実施例１７：pENMadh [pET21aに本デヒド
ロゲナーゼのDNA断片を挿入したプラスミド]と共発現で
きるＧＤＨプラスミドpSTV28-GDHの構築実施例１６で構築したpKK223-3GDHをEcoRI、PstIの2種
類の制限酵素で消化し、枯草菌GDH遺伝子を含む断片を
調製した。プラスミドベクターpSTV28(TAKARA社製)をEc
oRI、PstIで消化し、上記GDHを含む断片をT4DNAリガー
ゼで連結し、pSTV28-GDHを得た。

【０１３０】実施例１８：枯草菌由来GDHと本デヒドロ
ゲナーゼの大腸菌における共発現 pENMadh を保持する大腸菌BL21(DE3) クローン株をpSTV
28-GDHで形質転換した。組み換え大腸菌を100ug/mLのア
ンピシリン、25ug/mLのクロラムフェニコールを含む液
体LB培地に植菌し１７時間培養した後、1mM IPTGを添加
し、さらに３時間培養した。集菌後、20mM Tris-HCL (p
H7.0) にて懸濁し、超音波破砕によって得られた細胞粗
抽出液の酵素活性を測定した。

【０１３１】（１）本デヒドロゲナーゼ活性の測定本デヒドロゲナーゼ活性の測定は100mMbis-trispropane
バッファー（pH10.0）、0.2mM NADPH、30mM methylamin
e、10mM ピルビン酸ナトリウムを含む反応液で30℃で行
った。1Uは上記反応条件で1分間に1μmolのNADPHを酸化
する酵素量とした。結果、6.6U/mg蛋白であった。

【０１３２】（２）グルコース脱水素酵素活性の測定粗酵素１０μlにグルコースを最終濃度100mM、ＮＡＤＰ
を最終濃度2mM、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ9.0）を最終
濃度100mM、となるように加えた反応液１ｍｌの３４０
ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定
した。測定時の反応温度は３０℃にした。一分間に１マ
イクロモルのグルコースと反応する酵素量を１ｕｎｉｔ
ととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）を求め
た。結果、１mg蛋白あたり3.4Uであった。

【０１３３】実施例１９：グルコース脱水素酵素共発現
形質転換体を用いたＮ−メチル−フェニルアラニンの合
成実施例１８で得られた大腸菌を実施例１７と同様に培養
し培養液１００ｍｌを得た。培養後、遠心分離により菌
体を集め、0.85%の食塩を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）４0ｍｌで２回洗浄休止菌体を得
た。得られた休止菌体に最終濃度100mMのフェニルピル
ビン酸ナトリウム、最終濃度0.2mMのＮＡＤＰ最終濃度1
00ｍＭのグルコース、および最終濃度700mMのメチルア
ミン−塩酸(pH９)を含む反応液を加え菌体の濁度を２０
（66０nmの吸光度）となるようにした。３０℃で攪拌し
ながら反応を行った。反応は１０規定の水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨを８〜９に調整しながら、撹拌しつつ行
った。２４時間反応後のＮ−メチルフェニルアラニンの
生成量は13.4g/Lであった（反応収率７５％）。

【０１３４】実施例２０：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと
の共反応（１）実施例１０と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵
素を得た。これに最終濃度50mMとなるようにＤ−フェニ
ルアラニン、またＮＡＤＰＨを最終濃度10mM、硫酸でｐ
Ｈを１０にあわせたメチルアミンを最終濃度６0mM、ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９）を最終濃度100mMとなるよう
に加えた反応液１００μlにＤ−アミノ酸オキシダーゼ
（シグマ社製 porcine kidney由来）を0.052unit加え
た。このとき反応液中の本酵素の蛋白量は２６．５μｇ
となるようにした。測定時の反応温度は３０℃にした。

【０１３５】９００分後反応液にトリクロロ酢酸を最終
濃度２％となるように２５μl添加し反応を終了させ
た。反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。カラム：ＯＤＳカラム UK-C18 250 x 4.6mm （imtakt
社製）溶離液：水１００％流速：0.5ml/min 温度：４０℃ 検出：ＵＶ２１０nm 測定の結果Ｎ−メチルフェニルアラニンが0.46g/L生成
されていた。残存するフェニルアラニンは1.06g/Lであ
った。

【０１３６】実施例２１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと
の共反応（２）フェニルアラニンを用いる代わりにＤ−メチオニンを用
いた以外は実施例２０と同様に行った。ＨＰＬＣのクロ
マトグラムを図６に示す。ＨＰＬＣのリテンションタイ
ムはメチオニンが１０．６分であるが１４．１分にピー
クが反応と共に生成されておりＮ−メチルメチオニンと
推測された。そこで同分析カラムを用いて下記の条件の
ＬＣ−ｍａｓｓにかけた。マススペクトルの結果を図７
に示す。Ｎ−メチルメチオニンと推定されたピークの分
子量は１６３となり、Ｎ−メチルメチオニンの分子量と
一致した。

【０１３７】ＬＣ−ｍａｓｓ条件装置：Waters ２６９０型セパレーションモジュール
および micromass ＺＭＤ型質量分析計カラム：ＯＤＳカラム UK-C18 250 x 4.6mm （imtakt
社製）溶離液：水１００％流速：0.5ml/min 温度：４０℃ 検出：ＵＶ２１０nm イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）
正イオン検出質量走査条件：m/z60-500 1sec 印可電圧：３．６ｋＶコーン電圧：１０Ｖ

【０１３８】実施例２２：Ｌ−フェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼとの共反応Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの代わりにＬ−フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼ（シグマ社製）、およびＤ−フェ
ニルアラニンの代わりにＬ−フェニルアラニンを用いる
以外は実施例２０と同様に反応を行った。結果Ｎ−メチ
ルフェニルアラニンが0.21g/L生成されていた。また残
存するＬ−フェニルアラニンは2.75g/Lであった。

【０１３９】実施例２３：実施例１０と同様な方法で大
腸菌クローン株の精製本酵素を得た。本酵素の蛋白量１
４μgに最終濃度30mMとなるようにメチルピルビン酸、
またＮＡＤＰＨを最終濃度10mM、硫酸でｐＨを１０にあ
わせたメチルアミンを最終濃度６0mM、リン緩衝液（ｐ
Ｈ７）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液１０
０μlを反応温度３０℃で４時間反応させた。反応終了
後下記の条件のＨＰＬＣで分析を行った。カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫＷＨ 250 x 4.6mm （ダ
イセル社製）溶離液：2mM CuSO4 流速：0.5ml/min 温度：５０℃ 検出：ＵＶ２５４nm 結果Ｎ−メチルアラニンが０．1g/L生成されていた。

【０１４０】

【発明の効果】本発明によれば、公知のデヒドロゲナー
ゼとは異なる性質を有する新規なデヒドロゲナーゼが提
供される。本発明のデヒドロゲナーゼを用いることによ
り、医薬あるいは農薬の中間原料として有用なＮ−アル
キルアミノ酸を製造することができる。

【０１４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> A novel dehydrogenase and a gene encoding it <130> A31051A <160> 8

【０１４２】 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 1 Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu 20 25 30 Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp 35 40 45 Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr 50 55 60 Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln 85 90 95 Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser 100 105 110 Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala 115 120 125 Leu Trp Pro Asp Val Glu Pro Phe Ala Glu Glu Gly Leu Val Ala Leu 130 135 140 Ser Val Val Asn Ser Met Thr Cys Val Val Pro His Gly Ala Arg Lys 145 150 155 160 Pro Leu Phe Gly Thr Asn Pro Ile Ala Phe Ala Ala Pro Cys Ala Glu 165 170 175 His Asp Pro Ile Val Phe Asp Met Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly 180 185 190 Asp Val Gln Ile Ala Ala Arg Ala Gly Gln Gln Leu Pro Glu Gly Met 195 200 205 Gly Val Asp Ala Asp Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Lys Ala Ile Leu 210 215 220 Glu Gly Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Ser Ala Leu 225 230 235 240 Ser Met Met Val Glu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly His Phe 245 250 255 Ser Trp Glu Phe Asp Trp Ser Gly His Pro Gly Ala Lys Thr Pro Trp 260 265 270 Thr Gly Gln Leu Ile Ile Val Ile Asn Pro Gly Lys Ala Glu Gly Glu 275 280 285 Arg Phe Ala Gln Arg Ser Arg Glu Leu Val Glu His Met Gln Ala Val 290 295 300 Gly Leu Thr Arg Met Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Val 305 310 315 320 Ala Glu Glu Glu Gly Val Ala Val Thr Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu 325 330 335 Lys Glu Leu Leu Gly 340

【０１４３】 <210> 2 <211> 1026 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 2 atg tcc gca cct tcc acc agc acc gtt gtg cgc gtg cct ttt acc gag 48 Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu 1 5 10 15 ctg caa agc ctg ttg cag gcc att ttc cag cgc cat ggg tgc agc gag 96 Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu 20 25 30 gcc gtg gcc cgg gtg ctg gcc cac aac tgc gcc agc gcc cag cgt gat 144 Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp 35 40 45 ggc gcc cat agc cat ggg gtg ttc cgc atg ccc ggt tat gtc tcg acc 192 Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr 50 55 60 ttg gcc agc ggc tgg gtc gat ggc cag gcc acg cca cag gtc agc gac 240 Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp 65 70 75 80 gtg gcc gcc ggc tat gtg cgt gtc gat gct gcg ggc ggt ttt gcc cag 288 Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln 85 90 95 cca gca ctg gcg gcg gcc cgt gag ctg ttg gtg gcg aag gcg cgc agc 336 Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser 100 105 110 gca ggc att gcc gtg ctg gcg atc cac aac tcg cac cac ttc gcc gcg 384 Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala 115 120 125 cta tgg ccg gat gtc gag ccg ttc gcc gaa gag ggc ctg gta gcc ctc 432 Leu Trp Pro Asp Val Glu Pro Phe Ala Glu Glu Gly Leu Val Ala Leu 130 135 140 agc gtg gtc aac agc atg acc tgc gtg gtg ccg cat ggt gca cgc aag 480 Ser Val Val Asn Ser Met Thr Cys Val Val Pro His Gly Ala Arg Lys 145 150 155 160 ccg ctg ttc ggt acc aac ccc atc gct ttt gct gcg cct tgc gcc gag 528 Pro Leu Phe Gly Thr Asn Pro Ile Ala Phe Ala Ala Pro Cys Ala Glu 165 170 175 cat gac ccg atc gtt ttc gac atg gcc acc agt gcc atg gcc cat ggc 576 His Asp Pro Ile Val Phe Asp Met Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly 180 185 190 gat gtg cag att gcc gcg cgc gcc ggc cag caa ttg ccg gag ggc atg 624 Asp Val Gln Ile Ala Ala Arg Ala Gly Gln Gln Leu Pro Glu Gly Met 195 200 205 ggg gtg gat gcc gat ggc cag ccg acc acc gac ccg aag gcg atc ctg 672 Gly Val Asp Ala Asp Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Lys Ala Ile Leu 210 215 220 gaa ggc ggc gcc ctg ctg cca ttt ggc ggg cac aag ggc tcg gcg ttg 720 Glu Gly Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Ser Ala Leu 225 230 235 240 tcg atg atg gtc gag ctg ctg gcg gcg gcg ctg acc ggc ggt cat ttc 768 Ser Met Met Val Glu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly His Phe 245 250 255 tcc tgg gag ttc gat tgg tcc ggg cat ccg ggg gcg aaa acg cca tgg 816 Ser Trp Glu Phe Asp Trp Ser Gly His Pro Gly Ala Lys Thr Pro Trp 260 265 270 acc ggg cag ttg atc atc gtc atc aac cca ggc aag gcc gag ggc gag 864 Thr Gly Gln Leu Ile Ile Val Ile Asn Pro Gly Lys Ala Glu Gly Glu 275 280 285 cgc ttt gcc cag cgc agc cgc gag ctg gtg gag cac atg cag gcg gtg 912 Arg Phe Ala Gln Arg Ser Arg Glu Leu Val Glu His Met Gln Ala Val 290 295 300 ggg ctg acg cgc atg ccg ggc gag cgg cgc tac cgt gag cgc gag gtg 960 Gly Leu Thr Arg Met Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Val 305 310 315 320 gcc gag gag gag ggg gtg gcg gtg acc gag cag gag ttg caa ggc ctg 1008 Ala Glu Glu Glu Gly Val Ala Val Thr Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu 325 330 335 aaa gag ctg ctt ggc tga 1026 Lys Glu Leu Leu Gly 340

【０１４４】 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 3 Ala Phe Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu Lys Gln 1 5 10 15

【０１４５】 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 ggaattccat atgtccgcac cttccaccag caccg 35

【０１４６】 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 gggaagcttt cagccaagca gctctttcag g 31

【０１４７】 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 cggaattcat gtatccggat ttaaaagg 28

【０１４８】 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 gcaagcttat taaccgcggc ctg 23

【０１４９】 <210> 8 <211> 783 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 8 atg tat ccg gat tta aaa gga aaa gtc gtc gct att aca gga gct gct 48 Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 tca ggg ctc gga aag gcg atg gcc att cgc ttc ggc aag gag cag gca 96 Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala 20 25 30 aaa gtg gtt atc aac tat tat agt aat aaa caa gat ccg aac gag gta 144 Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val 35 40 45 aaa gaa gag gtc atc aag gcg ggc ggt gaa gct gtt gtc gtc caa gga 192 Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly 50 55 60 gat gtc acg aaa gag gaa gat gta aaa aat atc gtg caa acg gca att 240 Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile 65 70 75 80 aag gag ttc ggc aca ctc gat att atg att aat aat gcc ggt ctt gaa 288 Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu 85 90 95 aat cct gtg cca tct cac gaa atg ccg ctc aag gat tgg gat aaa gtc 336 Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val 100 105 110 atc ggc acg aac tta acg ggt gcc ttt tta gga agc cgt gaa gcg att 384 Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 aaa tat ttc gta gaa aac gat atc aag gga aat gtc att aac atg tcc 432 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 agt gtg cac gcg ttt cct tgg ccg tta ttt gtc cac tat gcg gca agt 480 Ser Val His Ala Phe Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala Ser 145 150 155 160 aaa ggc ggg ata aag ctg atg aca gaa aca tta gcg ttg gaa tac gcg 528 Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala 165 170 175 ccg aag ggc att cgc gtc aat aat att ggg cca ggt gcg atc aac acg 576 Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn Thr 180 185 190 cca atc aat gct gaa aaa ttc gct gac cct aaa cag aaa gct gat gta 624 Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp Val 195 200 205 gaa agc atg att cca atg gga tat atc ggc gaa ccg gag gag atc gcc 672 Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile Ala 210 215 220 gca gta gca gcc tgg ctt gct tcg aag gaa gcc agc tac gtc aca ggc 720 Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr Gly 225 230 235 240 atc acg tta ttc gcg gac ggc ggt atg aca caa tat cct tca ttc cag 768 Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe Gln 245 250 255 gca ggc cgc ggt taa 783 Ala Gly Arg Gly 260

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼの至適pHを示すグラフである。

【図２】図２は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼの至適温度を示すグラフである。

【図３】図３は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼのpH安定性を示すグラフである。

【図４】図４は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼの熱安定性を示すグラフである。

【図５】図５は、本発明のN-メチル-L-フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼに対するpHの影響を示すグラフであ
る。

【図６】図６は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応
産物をＨＰＬＣ分析した結果を示す。

【図７】図７は、図６のpeak-1とpeak-2についてマスス
ペクトル解析した結果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 13/04 5/00 Ａ (72)発明者原磨理神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社内 (72)発明者上田誠神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA08 BA71 CA01 CA03 CA06 DA06 EA04 FA10 GA11 GA19 HA01 4B050 CC01 CC03 CC04 DD02 FF04E FF05E FF11E FF12E LL01 LL05 4B064 AE02 AE03 CA02 CA19 CB16 CC24 CD07 CD12 CD13 DA01 DA11 4B065 AA19Y AA26X AA44Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA28 CA44 CA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の理化学的性質を有するデヒドロゲ
ナーゼ。（１）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素
としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミ
ンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；（２）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミ
ンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さな
い；（３）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とし
た場合の至適ｐＨが１０付近；及び、（４）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定である
ｐＨが５〜１０．５付近：
【請求項２】下記の何れかのポリペプチド。（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド；（２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポ
リペプチド；又は（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、デヒドロゲナー
ゼ活性を有するポリペプチド；
【請求項３】請求項２に記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ。
【請求項４】下記の何れかのＤＮＡ。（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；（２）配列番号２で表される塩基配列において１から複
数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列
を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ；又は（３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、デヒド
ロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ：
【請求項５】請求項３又は４に記載のＤＮＡを有する
組み換えベクター。
【請求項６】請求項３又は４に記載のＤＮＡあるいは
請求項５記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項７】下記一般式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されていてもよいア
ルキル基を示し、Ｒ²は置換されていてもよいアルキル
基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表さ
れるジカルボニル基含有化合物とＲ³（Ｒ⁴）ＮＨ（式
中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立して、水素原子又は置
換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、Ｒ³と
Ｒ⁴は共に水素原子であることはない。）で表されるア
ルキル置換アミン類とを、請求項１に記載のデヒドロゲ
ナーゼ、請求項２に記載のポリペプチド又は請求項６に
記載の形質転換体の存在下で反応させることを含む、Ｎ
−アルキル−アミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項８】Ｒ¹が水素原子である、請求項７に記載
の製造方法。
【請求項９】Ｒ³がアミノ基で置換されていてもよい
Ｃ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基で
あり、Ｒ⁴が水素原子である、請求項７又は８に記載の
製造方法。
【請求項１０】式（Ｉ）で表されるジカルボニル基含
有化合物が、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、β―フ
ルオロピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−ケトヘキサン
酸又は２−ケトｎ−吉草酸である、請求項７から９のい
ずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】下記一般式（ＩＩ）：【化２】（式中、Ｒ¹は、水素原子又は置換されていてもよいア
ルキル基を示し、Ｒ²は置換されていてもよいアルキル
基又は置換されていてもよいアリール基を示す）で表さ
れるアミノカルボン酸類と、一般式（ＩＩ）で表される
アミノカルボン酸類を一般式（Ｉ）：【化３】（式中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（ＩＩ）における定義と
同義である）で表される化合物に変換することのできる
酵素と、Ｒ³（Ｒ⁴）ＮＨ（式中、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞ
れ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキ
ル基を示す。ただし、Ｒ³とＲ⁴は共に水素原子であるこ
とはない。）で表されるアルキル置換アミン類とを、請
求項１に記載のデヒドロゲナーゼ、請求項２に記載のポ
リペプチド又は請求項６に記載の形質転換体の存在下で
反応させることを含む、Ｎ−アルキル−アミノ酸誘導体
の製造方法。
【請求項１２】Ｒ³がアミノ基で置換されていてもよ
いＣ１〜Ｃ６の直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基
であり、Ｒ⁴が水素原子である、請求項１１に記載の製
造方法。
【請求項１３】一般式（ＩＩ）で表されるアミノカル
ボン酸類が、フェニルアラニンまたはメチオニンであ
る、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】式（ＩＩ）で表されるアミノカルボン
酸類を式（Ｉ）で表されるアルキル置換アミン類に変換
することのできる酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸トラン
スフェラーゼである、請求項１１から１３のいずれかに
記載の製造方法。