SK280242B6

SK280242B6 - Spôsob prípravy glutarylacylázy vo veľkých množstv

Info

Publication number: SK280242B6
Application number: SK804-92A
Authority: SK
Inventors: Klaus-Peter Koller; G�Nther Johannes Riess; Werner Aretz
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1999-10-08
Also published as: DK0504798T3; CZ284405B6; KR920018222A; DE4136389A1; DE59207509D1; JP3366664B2; DE4136389C2; EP0504798A1; ATE145238T1; CA2063176C; EP0504798B1; GR3021610T3; HK1006853A1; IL101258A0; CS80492A3; ES2096671T3; CY2115B1; KR100211002B1; CN1065292A; JPH05207879A

Description

Glutarylacylázu (GA) kódujúci gén obsiahnutý v plazmide pCM145 uloženom v DSM 6409 umožňuje expresiu GA v E. coli vo vysokých výťažkoch.

SK 280242 Β6

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy glutarylacylázy pomocou expresie génu obsiahnutého v plazmide, ktorým je transformovaný kmeň Escherichia coli.

Doterajší stav techniky

Pri enzymatickej príprave kyseliny 7-aminocefalosporánovej a cefalosporínu C sa najprv vytvorí kyselina 7-(4-karboxylbutánamido(cefalosporánová) kyselina glutarylamidocefalosporánová], ktorá sa deacyluje pomocou enzýmu glutarylacylázy (pripadne glutarylamidázy), ďalej označovanej 'GA , na kyselinu 7-aminocefalosporánovú.

Génovú techniku prípravy GA v E. coli opísali už R. Matsuda a K.I. Komatsu, J. Bact. 163 (1985), 1222 - 1228. Špecifická aktivita však bola len nepatrne zvýšená (z 0,12 jednotiek nasadeného kmeňa na 0,2 jednotiek na mg).

Matsuda et al. (pozri hore) použili na skúmanie mutant Pseudomonas sp. GK 16, pre ktorý tlie je uvedené žiadne označenie o uložení. Autori vychádzajú z kmeňa Pseudomonas sp. SY-77-1, ktorý je dostupný vo Fermentation Research Inštitúte (FRI) pod označením FERM 2410.

Podstata vynálezu

V súčasnosti sa zistilo, že z kmeňa Pseudomonas môže byť izolovaný gén kódujúci GA a pomocou tohto génu sa môže získať enzým v E. coli s najmenej päťkrát vyššou špecifickou aktivitou. Tento enzým izolovaný z kmeňa Pseudomonas je porovnateľný s GA z uloženého kmeňa.

Výhodné vyhotovenie, ako i ďalšie aspekty vynálezu budú ďalej v opise bližšie objasnené a v patentových nárokoch definované.

Ukázalo sa, že klonovanie génu vo 'vysoko kópiovom vektore“, ako je pUC 18, vedie za bežných podmienok indukcie k usmrteniu transformovaných buniek. Preto boli na ďalšie skúmanie konštruované 'nízkokópiové vektory', ktorými bola vybavená génová banka genómu kmeňa. Tieto vektory, plač 10, pľac 100 a plač 200, obsahujú začiatok replikácie známeho plazmidu pACYC 184 (A. C. Y. Chang a S. N. Cohen, J. Bact. 134 (1978), 1141 - 1156), a preto sú k dispozícii v asi piatich kópiách na bunku. Tieto vektory dovoľujú selekciu chloramiemkolom a tak bránia tvorbe beta - laktamázy, ktorá by mohla pôsobiť na cefalosporín.

Kvôli identifikácii GA - génu bola najprv založená génová banka, ktorá obsahovala genóm totálne štiepený Pstl. Pomocou 2 sond, ktoré zodpovedajú kodónom 30 až 40 a 41 až 51, zverejneným Matsudom et al., pozri, bol nájdený kloň, ktorý obsahoval 3,7 kb Pstl-inzert. Tento bol po preklonovaní vo fágu M 13mpl9 sekvenovaný. Pritom sa ukázala viac ako 98 %-ná zhoda s publikovanou sekvenciou v rozsahu aminokyselín 51 až 209. 3,7 kb Pstl-fragment bol použitý ako sonda a rádioaktívne označený pri skriningu plazmidovej génovej banky, ktorá klonovaním DNA kmeňa, čiastočne štiepenej Pstl, bola konštruovaná v “nizkokópiovom vektore“ plač 100. Reštrikčnou analýzou a porovnaním miest štiepenia s publikovanými údajmi sa ukázalo, že kloň pCM 145 obsahuje kompletný gén pre GA, ako i 5’- a 3'-priliehajúce sekvencie. Tento kloň obsahuje vektor plač 100 s cca 10 kb Pstl - inzertom a produkuje asi 4 U/I GA. Tento kloň bol za podmienok Budapešťskej zmluvy dňa 8.3.1991 uložený v Deutschen Sammlung von Mikro organismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, pod ukladacím číslom DSM 6409.

Preklonovaním a subklonovaním by mohli byť výťažky GA zvýšené ešte na asi 450 U/I.

Prekvapujúco sa pritom ukázalo, že zníženie teploty fermentácie z 37 °C na 23 °C, výhodne 25 - 30 °C, obzvlášť 27 - 28 °C, dovolí výrazné zlepšenie výťažku. Pri tejto teplote bolo možné uskutočňovať fermentáciu dlhší čas, zatiaľ čo indukcia systému E. coli s IPTG pri 37 °C bola pre produkčný kmeň letálna.

Indukcia nastáva prednostne v logaritmickej rastovej fáze. Ako produkčné kmene sa prednostne používajú kmene E. coli K12, ktoré obsahujú málo alebo žiadnu esterázu, čím sa značne uľahčí spracovanie.

Produktivita môže byť ovplyvnená použitým produkčným kmeňom. Ako vhodné sa ukázali napríklad kmene E. coli MC 1061 (ATCC 53338), E. coli W 3110 (ATCC 27325) alebo E. coli DH1 (ATCC 33849).

Na fermentáciu môžu byť použité známe minerálne médiá a komplexné médiá s extraktom z kvasníc, peptónom, tryptónom alebo Casamino Acids. Vhodné podmienky môže odborník ľahko nájsť jednoduchým predchádzajúcim pokusom.

Expresný vektor T 307 ďalej opísaným preklonovaním (v príklade 4) mal už pri použití kmeňa E. coli TG1 (firma Amersham - Buchler, Braunschweig) za indukčných podmienok výťažok asi 1000 U/I kultivačného média. Plazmid T 307 má gén beta-laktamázy, ktorého génový produkt , enzým beta - laktamáza, slúži na selekciu rekombinantných kmeňov. Pri beta - laktamáze ide podobne ako pri GA, o sekretovaný, periplazmatický lokalizovaný enzým. Prekvapujúco sa tak ukázalo, že nahradenie časti štruktúrneho génu beta - laktamázy génom rezistentným proti chloramfenikolu, vedie k zreteľnému zlepšeniu výťažku (porovnaj príklad 9, plazmid T 347). Rezistencia proti chloramfenikolu je sprostredkovaná enzýmom acetyltransferázou, ktorá je na rozdiel od beta - laktamázy lokalizovaná intraceluláme.

Ďalšie zlepšenie výťažku sa môže dosiahnuť, keď sa neodstráni len časť štruktúrneho génu beta - laktamázy, ale odstráni sa celá oblasť štruktúrneho génu, predovšetkým kódujúca oblasť signálneho peptidu zodpovedného za sekréciu beta - laktamázy a použije sa práve gén rezistencie proti chloramfenikolu - acetyltransferázy ako selekčný markér (porovnaj príklad 10, plazmid T 363).

Vynález sa teda tiež týka použitia expresných vektorov, ktoré ako selekčný gén neobsahujú gén pre sekretovaný, periplazmatický lokalizovaný génový' produkt, resp. enzým. Potom sa môžu tiež použiť “high copy“ vektory, pričom sa volia prednostne vektory bez génu beta - laktamázy. Ďalej sa zistilo, že sa optimálne výťažky dosiahnu pri použití kmeňa W 3110, prípadne MC 1061 E. coli K 12. Tieto plazmidy sa v priebehu fermentácie neeliminujú, ale sú stabilné.

Je však tiež možné namiesto intraceluláme účinných selektívnych markérov použiť periplazmatický alebo membránovo lokalizované markéry. Ak sa to podarí, zníži sa expresia signálneho markéra počas produkčnej fázy glutarylamidázy tak, že to nevedie k destabilizácii plazmidu. Vhodný je napríklad gén rezistentný proti tetracyklínu Tu 1721, ktorý je veľmi presne regulovaný (Klock, G. a spol., J. Bacteriol. 161, 326 - 332, 1988) alebo porovnateľne silne reguluje periplazmatický alebo v membráne lokalizovaný markér kódujúci gén.

Ďalej budú bližšie opísané konštrukcie expresných vektorov nevyhnutné na dosiahnutie vysokých výťažkov. Použité enzýmy boli získané z New England Biolabs (Schwalbach), prípadne od Gibco/BRL (Eggenstein) a použité podľa návodov výrobcu. Nie celkom podrobne opísané práce boli vykonávané podľa detailných návodov Wusubela a spol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1987 a doplnkov.

Všetky údaje, týkajúce sa veľkosti plazmidu (bp) sú údaje približné.

Jedinečnosti vynálezu budú opísané bližšie vnasleduúcich príkladoch. Ak nie je uvedené inak, sú uvedené percentá hmotnostne percentá.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje reštrikčnú mapu plazmidu pCM 145. V inzerte sú očíslované na klonovanie dôležité miesta reštrikčného štiepenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Príprava plazmidu plač 10

Z obchodne dostupného plazmidu pBR 325 (SIGMA) sa izoluje 1,1 kb fragment EcoRI-HindlIII a liguje sa s fragmentom 1,5 kb EcoRI-HingUI z vektora pACYC 184. Takto získaný “mini pACYC sa parciálne štiepi HaelI a liguje sa s fragmentom 819 bp HaelI z obchodne dostupného vektora pUC 12, ktorý obsahuje polylinkér a beta komplementárnu lacZ. Vektory, obsahujúce inzert v HaelI - mieste zpACYC 184 - fragmentu vtákom usporiadaní, že polylinkér nasleduje po začiatku replikácie v postupnosti miest štiepenia EcoRI - HindlH, boli označené plač 10.

Príklad 2

Príprava vektorov plači 00 a plac200

V príklade 1 opísaný “mini-pACYC“ obsahuje v mieste štiepenia Hindin 2 susediace miesta štiepenia pre Clal. Odstránením týchto Clal - fragmentov sa získa plači 00 vektor z placlO vektora, ktorý už neobsahuje na ligovanie k “miniPacyc“ používané miesto štiepenia.

Analogicky s príkladom 1 sa štiepi plači 00 čiastočne HaelI a nahradí sa HaelI - fragment polylinkérom z pUC12 zodpovedajúcim fragmentom zpUC18, získa sa vektor plac200.

3. Založenie génovej banky

Všetky DNA kmeňov Pseudomonas boli plne rozštiepené PstI a ligované s plači 0 štiepeného Pstl. Ligačnou zmesou bola transformovaná E. coli TG1 (Pharmacia).

Na skríning boli najprv použité 2 oligonukleotidy, ktoré zodpovedajú kodónom 30 až 40 a 41 až 50 publikovanej GA - sekvencie. Takto sa izoluje kloň pWK96, ktorý obsahuje 3,7 kb Pstl - inzert. Tento hybridizuje s oboma sondami. Preklonovaním vo fágu Ml 3mpl9 a sekvenovaním sa získa viac ako 98 % zhoda s publikovanou DNA - sekvenciou v oblasti aminokyselín 150 - 209. Porovnanie s publikovanou génovou mapou ukazuje zhodu v relevantných miestach štiepenia.

Inzert bol rádioaktívne označený a bol použitý ako sonda pre génovú banku, ktorá bola založená z celej DNA čiastočne štiepenej Pstl, pričom bol nájdený kloň pCM 145, ktorý obsahuje cca 10 kb inzert. Reštrikčná analýza a porovnanie s publikovanými miestami štiepenia ukazujú, že boli klonované kompletný gén i 5 - a 3' - priliehajúca sekvencia. Kloň poskytuje výťažok 4 U/I GA. Slúži pre nasledujúce práce ako východiskový’ materiál.

4. Preklonovanie

Plazmid plač 100 je štiepený EcoRI a HindUI a inzert s GA - génom preklonovaný do obchodne dostupného vektora pUC19 tvoreného rovnakými enzýmami. Takto získaný kloň T 286 poskytuje výťažok 23,5 U/l GA. Pritom je sekretovaná len časť enzýmu (vo východiskovom kmeni sa enzým nachádza len v periplazme).

Kvôli odstráneniu sekvencii, ktoré možno bránia expresii génu v E. coli sa - vzhľadom na publikovanú mapu GA -

- génu - rekonštruuje gén. Pritom je potrebné zobrať na zreteľ číslovanie reštrikčných miest na obrázku 1.

Najprv sa klonuje 0,8 kb veľký BamHI - fragment (BamHI(l) - BamHI(4)), ktorý nesie Sall-štiepné miesto, do obchodne dostupného plazmidu pUC18. Do vzniknutého plazmidu, ktorý bol rezaný Sali, sa rovnako zavedie 0,8 kb veľký Sali - fragment (SaII(3) - SaH(6)). Do nového plazmidu, ktorý bol štiepený Pstl, sa klonuje 0,9 kb veľký Pstl - fragment (Pstl(5) - Pstl(8)), pričom sa získa kloň pT 93. Ďalej sa klonuje do pUC 18 1,7 kb SaU - fragment (SaH(6) - SaII(9)) a preskúša sa správna orientácia, vznikne plazmid pT 98. Pretože klonovaný Pstl - fragment (Pstl(5) Pstl(8)) obsahuje Xhol - štiepne miesto, mohol byť spoločne klonovaný kompletný gén, v ktorom je naviazaný EcoRI - Xhol - fragment z pT 934 s väčším, Xhol - EcoRI fragmentom z pT98, obsahujúcim tiež začiatok replikácie a gén rezistencie. Takto vzniká plazmid pT 103. Ním transformované kultúry E. coli produkujú až 130 U/I GA, pričom expresia je riadená 5’ - koncovou promótorovou aktivitou zo pseudomonázovej DNA.

Z plazmidu pT103 sa po štiepení reštrikčnými enzýmami SstI a HindlII izoluje fragment s GA - génom a klonuje sa do vektora plac200 štiepeného rovnakými enzýmami, takže vznikne expresný vektor pTl 04, ktorým je dosahovaný GA - výťažok nad 1000 U/L

Po preklonovaní rekonštruovaného génu do miest štiepenia EcoRI - HindlII obchodne dostupného expresného vektora pStac (výrobca: Boehringer - Mannheim) sa získa plazmid pT 105. Ním transformované E. coli - TG - kmene produkujú po 3-dennej fermentácii až 288 U/I GA v trepaných bankách pri teplote fermentácie 37 °C.

Na klonovanie GA - génu do vektora pTrc 99 A (E. Amanna spol., Gene 69 (1988), 301 - 315) je nutný syntetický linkér(sekv. id. č. 1):

(Ncol) (Styl)

C ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GC

GAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGU CGG AAC

Z plazmidu pCM 145 sa po štiepení enzýmami Styl a BamHI izoluje 0,57 kb veľký BamHI(4) - Styl(2) - fragment (v publikovanej DNA - sekvencii sa nachádza Styl -

- štiepne miesto v oblasti aminokyselín 11 až 13. Tento fragment a uvedený linker sa liguje do plazmidu pTrc 99 A štiepeného Ncol a BamHI, pričom plazmid T 297 sa získa so stratou Ncol - štiepneho miesta.

Ďalej sa izoluje z plazmidu pCM 145 1,5 kb SaĽ -

- fragment (SaII(6) - SaII(9), ako i 0,34 kb BamHI - Sali -

- fragment a liguje do vektora pUC 18, ktorý bol otvorený Sali a BamHI. Vzniknutý plazmid T 306 sa preskúša na správnu orientáciu SaH(6 - 9) - fragmentu. Z plazmidu T 306 sa izoluje enzýmami BamHI a HindlII 2,1 kb veľký fragment (ktorý’ obsahuje fragment od BamHI(4) do SaH(9) - miesta). Tieto fragmenty sa ligujú do vektora T 297 otvoreného enzýmami BamHI a HindlII, pričom sa získa plazmid T 307 (obr. 2). Ním transformovaná populácia E. coli produkuje po 2-dennej fermentácii pri 28 °C až 260 U/l GA. Zmenou fermentačných podmienok (pozri nasledujúce príklady) môže tento výťažok stúpnuť nad 780 U/I.

Indukcia systému pomocou IPTG pri 37 °C je pre transformovaný E. coli kmeň letálna, čo často vedie späť k nasadeniu “high-copy-number-vector“ T 307. Pracuje sa pritom pri teplotách pod 30 °C.

5. GA - lamentácia s klonmi E. coli

E. coli klony DH1 T105 a TG1 T307 sa nanesú na minerálne a komplexné médiá a produkujú už v logaritmickej fáze rastu. Maximálny GA - titer sa dosiahne v stacionárnej fáze. To ukazuje, že GA - produkcia je závislá od rýchlosti rastu. V oboch klonoch sa enzým vyskytuje z 50 - 60 % cytoplazmaticky, zo 40 - 50 % cytoplazmaticky a maximálne z 10 % vo filtráte kultúry.

Kvôli kompletnému uvoľneniu GA je potrebné bunky otvoriť pomocou ultrazvuku, “French Press“ alebo “Dyno Milí“. Periplazmatická GA sa môže solubilizovať detergentmi ako je cetyltrimetylamóniumchlorid alebo toluén. Účinnosť zvyšuje prídavok EDTA a lyzozýmu. Vykonané pokusy na optimalizáciu fermentačných parametrov ukazujú, že klony rastú v teplotnej oblasti 25 °C až 37 °C a môžu produkovať GA. Pri teplotách nad 30 °C sa však musí udržiavať parciálny tlak kyslíka < 5 %. Teplota rastu pod 28 °C vedie k GA - produkcii, je potrebný nárast dvojnásobného času > 2 hod., za týchto podmienok už nie je tvorba GA závislá od malého pO₂. Zistená bola výrazná korelácia medzi GA - objemovou produktivitou (U/I kultivačného roztoku) a koncentráciou biomasy (g/1).

6. GA - produkcia v minerálnom médiu Udržiavanie klonu TG1 T307 sa vykonáva pri -18 °C v YT - glycerínovom médiu:

glycerín 17 % kvasničný extrakt 0,7 % bactotrypton 0,4 %

NaCl 0,4 % ampicilín 50 pg/ml.

Z tejto suspenzie sa pripravia agarové platne rovnakého média, inkubujú sa 24 hodín pri 28 - 37 °C a predkultúra sa inokuluj e j ednou kolóniou.

Médium predkultúry:

bactotrypton 1 % kvasničný extrakt 0,5 %

NaCl ' 0,5 % ampicilín 50 pg/ml pH 7,2

100 ml tohto živného roztoku sa inkubuje v Erlenmeyerových bankách po naočkovaní 24 hodín pri 28 °C a 220 otáčkach za minútu. Kultúra potom má OD_j7gnnl, 3,0.

Nasledujúca hlavná kultúra (25 ml živného roztoku/300 ml banky) sa naočkuje 2 % predkultúry a inkubuje 24 - 72 hodín pri 28 °C a 220 otáčkach za minútu:

Minerálne médium hmotn. % NaH₂PO₄1,110

Na₂HPO₄3,680

KC10,100 (NH₄)₂SO₄0,325

MgSO₄.7H₂O0,200 kyselina citrónová0,390 glycerín alebo glukóza 4,000 Fe₂(SO₄)₃H₂O 0,0250 roztok stopových prvkov 0,1000 pH 6,0 - 6,5 roztok stopových prvkov

H₃BO₃ iNH₄)₆Mo₇O₇₄ hmotn. %

0,208

0,080

ZnSO₄.7H₂O0,160

MnSO₄.4H₂O0,160

CuSO₄.5H₂O0,160

KJ0,048 biomasa po 50 hodinách: 11 g/I

GA po 50 hodinách: 39 U/I

7. GA - produkcia v komplexnom médiu

Analogicky s príkladom 6 sa vykoná udržiavanie kmeňa a vypestovanie predkultúry a očkuje sa do 5 1 fermentora s nasledujúcim komplexným médiom (3 1):

Komplexné médium: bactotrypton kvasničný extrakt NaCl

PH

Parametre fermentácie:

Čas fermentácie:

%

0,5 %

7,2 °C, 400 ot.min.⁴, 0,5 wm

- 72 hodín

Biomasa po 72 hodinách: 7 g vlhkej masy/1 GA po 72 hodinách: 460 U/I kultivačného roztoku,

U/g vlhkej masy GA - produkcia v zahustenom komplexnom médiu Analogicky s príkladom 7 sa kloň TG1 T307 nanesie do nasledujúceho média: Komplexné médium: bactotrypton 2 % kvasničný extrakt 1,0%

NaCl 0,5 %

7,2 °C, 500 ot.min.⁴,0,8 vvm g vlhkej hmoty/1

780 U/I kultivačného roztoku,

U/g vlhkej hmoty

PH

Fermentačné parametre: Biomasa po 53 hodinách: GA po 63 hodinách:

Tento príklad ukazuje súvislosť medzi vzostupom biomasy a objemovej produktivity.

Analogicky s príkladom 7 sa kultivuje kmeň DH1 TI 04, po 70 hodinách sa dosiahne biomasa 11 g vlhkej hmoty/1 a objemovej aktivity 1040 U/I kultivačného roztoku s 97 U/g vlhkej hmoty. To zodpovedá špecificky asi 1 U/mg proteínu.

Analogicky s príkladom 7 sa pestuje kmeň DH1 T104, dosiahne sa po 70 hodinách biomasa 11 g vlhkej hmoty/1 a objemová aktivita 1040 U/I kultivačného roztoku so 97 U/g vlhkej hmoty. Toto zodpovedá špecifickej aktivite asi 1 U/mg proteínu.

8. Indukovateľnosť GA - produkcie

Pri indukcii klonu TG1 T307 v neskoršej fáze logaritmického rastu pomocou IPTG (konečná koncentrácia 1 - 5 mM), sa zvýši v priebehu 5 - 10 hodín o 60 %.

Príklad 9

Plazmid T 347

Izolovaná plazmidová DNA z kmeňa TG1 (T 307) sa kompletne štiepi enzýmom Dral a väčší fragment, ktorý obsahuje začiatok replikácie ako aj GA - gén pod kontrolou Trc - promótora, sa izoluje elektroelúciou z agarózového 0,6 % gélu použitého na delenie fragmentov

Z vektora pACYC 184 (Chang a Cohe, J. Bacteriol. 134, 1141 - 1156, 1978) sa uvoľní štiepením reštrikčným enzýmom Ilae II DNA - fragment veľkosti asi 1,3 kb, ktorý obsahuje CAT - gén i regulátorovú oblasť pre gén. Tento fragment sa tiež získa po delení na agarózovom géli elektroelúciou. Enzýmom Hae II sa vytvoria na koncoch fragmentu presahujúce 3' - konce, ktoré samotné nie sú vhodné na ligáciu s uvedeným Dra I vektorovým fragmentom, ktorý obsahuje tupé konce (blunt ends). Preto sa presahujúce

SK 280242 Β6 konce Hae II - fragmentu odštiepia exonukleázou SI a fragment sa spracuje DNA - polymerázou I za prítomnosti 4 dezoxynukleotid - trifosfátu.

Takto pripravený Hae Π - fragment sa pomocou enzýmu DNA - ligázy liguje spolu s Dra I - vektorovým fragmentom a transformuje do E. coli MC 1061. Selekcia vhodného rekombinovaného E. coli klonu sa vykonáva testovaním rezistencie na chloramfenikol a syntézy enzýmu GA. Tvorba GA sa hodnotí pomocou Schibuja - testov. Rekombinantné klony obsahujú plazmid T 347, ktorého reštrikčná mapa je opäť uvedená na obr. 3. Pre výšku expresie GA nie je orientácia CAT - génu vo vektore podstatná.

Príklad 10

Plazmid T 363

Pri dlhšom čase fermentácie E. coli MC 1061 (T 347) sa ukázalo, že počet buniek nesúcich plazmid po indukcii GA-expresie pomocou IPTG významne klesá. Na základe tohto sa predpokladá, že sa ešte zvyšným beta - laktamázovým - promótorom vytvorí asi 69 aminokyselín zahrnujúcich skrátený beta - laktamázový základný proteín, ktorý obsahuje signálny peptid a zvyšok beta - laktamázy. Pretože jeho expresii nie je možné zabrániť klonovaním CAT -

- génu, vedie pravdepodobne táto skutočnosť k negatívnemu selekčnému tlaku, to znamená strate plazmidu. Kvôli získaniu stabilného vektora celý čas fermentácie hol plazmid T 307 dvojnásobne štiepený enzýmami Ssp I a Dra I. Oba najväčšie fragmenty, ktoré obsahujú tak začiatok replikácie, ako aj GA - gén s jeho Trc - promótorovou časťou, boli po delení v 0,6 % agarózovom géli izolované elektroelúciou. Podľa príkladu 9 sa vyrobí Hae II fragment s CAT

- génom a spoja sa s oboma uvedenými fragmentmi pomocou enzýmu DNA - ligázy. Ligačná zmes sa transformuje do E. coli kmeň MC 1061. Rekombinantné klony sa selektujú na základe ich schopnosti rásť za prítomnosti chloramfenikolu a tvorby enzýmu GA.

Optimálne výťažky boli dosiahnuté s rckombinantnými klonmi E. coli, ktoré nesú plazmid T 363, ktorého reštrikčná mapa je uvedená na obr. 4.

Príklad 11

Fermentácia E. coli kmeňa W 3110 (T 347) a W 3110 (T 363)

Podmienky kultivácie:

Kultivácie boli s výnimkou variabilných parametrov vykonané za nasledujúcich a pre oba klony identických podmienok:

Udržiavanie klonovaného kmeňa sa vykonáva pri -18 °C v YT - glycerínovom médiu:

glycerín 17,0% kvasničný extrakt 0,7 % baktotryptón 0,4 %

NaCl 0,4 % chloramfenikol 25 pg/ml

Z tejto suspenzie sa pripravia agarové platne s rovnakým médiom, inkubujú sa 24 hodín pri 28 °C a inokulačné médium sa inokuluje jednotlivou kolóniou, Inokulačné médium (NL 5295):

baktopeptón 0,1 % kvasničný extrakt 0,5 %

NaCl 0,5 % chloramfenikol 25 pg/ml pH 7,2

100 ml tohto živného média v 300 ml Erlenmeycrových bankách sa po naočkovaní inkubuje 24 hodín pri 28 °C a 220 ot.min.'. Kultúra potom má OD₅78nni 6,0 - 8,0. Týmto inokulom sa naočkuje 5 - 10 % (vzťahujúc na inokulum s OD_578ran = 3,0) produkčný stupeň:

Produkčné médium: NL 5292 + 1 ml desmophenu 20,0 g/1 kvasničný extrakt (oxoid) l,2g/lNaH₂PO₄xH₂O

8,5 g/1 Na₂HPO₄ x 2H₂O

L0g/lKCl

2,0 g/1 MgSO₄ x 7H₂O (oddelene autoklávované) 0,25 g/1 kyselina citrónová

5,0g/lNH₄Cl

4,0 ml/ISLA 5029

0,005 g/1 tiamín -> sterilná filtrácia (5 mg/10 ml -> 0,5/50 ml N) pH = 6,5

Podmienky fermentácie: teplota: 28 °C obj.: 3,51 vvm: 0,75 ot.min.'¹: 500 (r = 7cm) pH: 7,0 + 0,2 (udržiavané konštantné pomocou NH₄OH)

Vsádzka: glycerinový roztok: 525 g glycerínu (99 %/l produčného média bez kvasničného extraktu a NH₄C1)

Rýchlosť pridávania živín: 3,4 ml/Γ h pri kontinuálnom pridávaní (max. koncentrácia glycerínu vo fermentore: 0,2 %), prípadne jednorazový prídavok

Počiatok pridávania živín: pri pO₂ = 40 - 50 %, prípadne OD_578llm = 7 - 9 po asi 7 hod. fermentácie Čas pridávania živín: 40 - 60 hodín.

pO₂: udržiavaný konštantný na asi 40 %

Indukcia: po dosiahnutí biomasy 70 až 80 g vlhkej hmoty/1 po asi 20 hodinách sa vykoná indukcia pomocou IPTG/1 mM kon. koncentrácie). Potom sa pokračuje s glycerínom ešte 4 - 40 hodín.

Zber: 24 - 48 hodín po indukcii

GA - expresia v E. coli T 347

S klonom T 347 sa uskutočnila vsádzková fermentácia, ktorá má za cieľ okrem zvýšenia biomasy doložiť indukovateľnosť GA.

S tým cieľom boli skúšané rôzne stratégie živenia glycerínom a jeho pôsobenie na IPTG indukciu:

Spôsob pridávania glycerínu	Vlhká biomasa	GA - aktivita
	g/i	U/l	U/g
bez prikrmovania	14	490	35
1 % glycerínu	33	1219	37
1 % glycerínu + 1 mM IPTG	41	2400	59
kontinuálne glycerín (3,5 %) 1 mM IPTG	61	3800’	62

* GA zo 40 % intraceluláme

Uvedená tabuľka poskytuje dobrú koreláciu biomasy a GA prírastkov a ukazuje zosilnenie GA - expresie pomocou IPTG, ktoré sa reprimuje nielen amoniakom, ale tiež glycerínom a glukózou v koncentráciách vyšších ako 0,2 %. Ako dostatočná sa ukázala koncentrácia induktora 1 mM IPTG. Optimálny okamih indukcie je na prechode kultúr}' do stacionárnej rastovej fázy.

Výskum stability plazmidu tohto konštruktu ukázal, že v čase indukcie (asi po 40 hodinách fermentácie) len ešte 60 % klonov obsahuje plazmid, že po prídavku induktora sa plazmid v priebehu 24 hodín stratí. V kontinuálnej kultúre je polčas plazmidu < 50 hodín.

GA - expresia v E. coli T 363

Kloň T 363 obsahuje plazmid, ktorý po 72 - hodinovej fermentácii je ešte prítomný vo všetkých bunkách. Toto vedie k dosiahnutiu významne vyššieho GA - titra po fermentácii. Za uvedených optimálnych podmienok kultivácie sa môže produkovať až 100 g vlhkej hmoty so 7000 - 1200 U GA/1 KL za asi 70 hodín. Maximálne 40 % tejto aktivity je lokalizovaných cytoplazmaticky.

Kvôli zisteniu, ktoré faktory ovplyvňujú indukciu, boli podrobne skúmané nasledujúce parametre:

1. Teplota fennentácie

V oblasti 25 - 28 °C boli pri maximálnych špecifických aktivitách dosiahnuté najvyššie objemové výťažky. Pri 37 °C rástol kloň za produkcie významne nižšej biomasy a exprimoval maximálne 20 U GA/1. Pokles teploty z 37 na 28 °C v čase indukcie tiež neviedol k zvýšeniu expresie GA.

2. Komplexné zdroje dusíka

Pokiaľ ide o G A - objemovú produktivitu, preukázalo sa, že kvasničný extrakt fy. Oxoid môže byť nahradený extraktom od Bio Springer alebo Marcor. Z iných komplexných zdrojov N poskytujú NZ - amíny A, B, E a L od fy. Sheflľeld ako aj laktalbumín, acypeptón a baktopeptón ešte 50 - 70 % objemovú aktivitu. Pokiaľ ide o špecifickú GA - aktivitu, dosahujú NZ - amíny - laktalbumínu a baktopeptón zvyčajne výrazne vyššie hodnoty.

Kvasničný extrakt (15 - 30 g/1) je v súčasnosti najlepším zdrojom dusíka.

3. Koncentrácia induktora

Pokusy v oblasti 1-10 mM IPTG ukazujú, že 1 mM induktor dosahuje najlepšie GA - expresie, vyššie koncentrácie však nie sú škodlivé.

4. Napájanie kyslíkom

V čase indukcie vytvoril E. coli T 363 asi 80 % svojej biomasy a spotreba kyslíka sa pohybuje okolo 5 mMól/1 h. Preto sa udržiava pO₂ na 40 % sýtení. Pre samotnú indukciu má pO₂ len menšiu úlohu, ak zostáva sýtenie ešte nad 10 %.

Príklad 12

Fermentácia E coli KÍ 2 (GA) Kmeň: E. coli K12 W3110M, delta M 15 lac I^q pT 363/33

Udržiavanie kmeňa: uchovávanie v ampulkách (16,67% glycerínu v LB médiu 2 nás.) pri -74 °C (hlboké chladenie) Médium LB 2 nás.:

Bacto-Trypton (Difco) 20 g/1

Bacto - kvasničný extrakt (Difco) 10 g/1 NaCl 5 g/1

Trepaná kultúra: 1000 ml média LB 2 nás. (v 2 1 oceľových bankách) s 25 mg chloramfenikolu (pridané cez sterilný filter po sterilizácii média) sa naočkuje obsahom jednej ampulky a kultivuje pri 28 °C na trepačke (250 ot.min.’ amplitúda 1,25 cm) 4-5 hod. až do OD 1,0.

Prípravné stupne: DT - fermentor (200 1 pracovný objem) sa naočkuje 1 1 trepanej kultúry (OD 1,0) 0,05 %. Po asi 6 hod. rastu sa dosiahne OD 3 - 4 kvôli preočkovaniu do produkčného stupňa.

Prípravné médium:

kvasničný extrakt (Bio Springer) 20,00 g/1

Na₂HPO₄ 0,24g/1

NaH₂PO₄ 1,70g/1

KC1 0,20g/1

MgSO₄ x 7H₂O 0,40g/1 kyselina citrónová 0,05g/1 (NH₄)₂SO₄ 1,00g/1 tiamín/HCl 1,00 mg/1 stopové prvky - roztok 5029 0,03 mg/1

Desmophen 3600 0,18 ml/1 roztok stopových prvkov 5029:

COC1₂x6H₂O 2,00 g/1

NiCl₂x2H₂O 0,08 g/1

CuC1₂x2H₂O 0,08 g/1

ZnCl₂ 0,80 g/1

H3BO3 4,00 g/1

Na₂MCO₄x2H₂O 2,40 g/1 FeSO₄x7H₂O 1,60 g/1 pH hodnota nastavená HC1 na 2,5 EDTA 0,40 g/1.

Nasledujúce podmienky boli udržiavané počas prípravnej fennentácie:

Teplota: 28 °C, tlak 0,1 MPa, privzdušňovanie 7 Nm³/h, počet otáčok (max. = 175 ot.min.’¹), pH: 7,2 udržiavané plynným NH₃ (pred naočkovaním sa pH hodnota média nastaví z asi 3,0 - 3,5 na 7,2)

Hlavný stupeň: ET - fermentor (2 m³ pracovného objemu) sa naočkuje 10 % DT - kultivačnou kašou. Čas fennentácie 60 - 80 hodín.

Médium hlavného stupňa: kvasničný extrakt (Bio Springer) 20,00 g/1 Na₂HPO₄ 1,20 g/1

NaH₂PO₄ 8,50 g/1

KC1 1,00 g/1

MgSO₄ x 7H₂O 2,00 g/1 kyselina citrónová 0,25 g/1 (NH₄)₂SO₄ 5,00 g/1 tiamin/HCl 5,00 mg/1 stopové prvky - roztok 5029 0,50 ml/1

Desmophen 3600 0,30 ml/1

Boli nastavené nasledujúce fermentačné podmienky: Teplota: 28 °C Tlak: 0,1 MPa Príkon: 2,5 kW/m³

Otáčky: 120 ot.min.’¹ (pri priemere turbomiešadla 600 mm) Privzdušňovanie: 80 Nm³Zh (0,67 wm) pH - hodnota: 7,2 (regulovaná podľa prídavku glukózy) Indukcia: 1 mM IPG pri OD 50

Prídavok: glukóza (30 % roztok), počiatok medzi 6-8 hod., množstvo 0,5 g/1 a h až 2,5 g/1 a h závislé od priebehu pH

Na začiatku rastovej fázy potrebuje kmeň najprv kvasničný extrakt a rastie od začiatku dávkovania glukózy exponenciálne až do OD 50. Pritom sa znižuje parciálny tlak kyslíka na 30 až 10 %. Kvôli dostatočnému zásobovaniu kmeňa počas exponenciálneho rastu kyslíkom (pO₂ -

- 30 %), môže byť príkon zvýšený zvýšením otáčok a/alebo zvýšením prevzdušňovania na 3,5 kW/m³ alebo vyšší.

Hodnota pH sa v tejto prvej fermentačnej fáze udržiava na 7,2 postupným alebo kontinuálnym zvyšovaním pridávania glukózy.

Druhá fáza fennentácie začína indukciou tvorby produktu prídavkom 1 mM IPTG (izopropyltiogalaktozid) ku kultivačnej kaši (OD 50 asi 20 - 24 h.).

V ďalšom priebehu fennentácie sa produkt (glutaryl -

- amidáza) syntetizuje priemernou rýchlosťou tvorby 150 -

- 200 E/l. Pritom prechádza kmeň do lineárneho rastu. Dávkovanie glukózy je asi 0,5 g/1 pri konštantnom udržiavaní pH (7,2).

Po 60 - 80 hodinách môže byť fermentácia pri vytvorení biomasy 80- 100 g/1 vlhkej hmotnosti (suchá hmota 22 -

- 25 g/1) a tvorbe produktov 7000 - 10 000 E/l skončená. Sekv. id. č.: 1

Druh sekvencie: nukleotíd so zodpovedajúcim proteínom

Dĺžka sekvencie: po 33 bázach

Druh reťazca: dvojitý reťazec s presahujúcimi rozpoznávacími sekvenciami

Topológia: lineárna

Druh fragmentu: N - terminálny fragment (signálna sekvencia)

Pôvod: syntetická DNA.

C TATG CTG AGA GTT CTG CAC CCG GCG GCG TCC GC

GAC TCT CAA GAC CTC GCC CGC CGC AGG CGG AAC

Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu

-29 -25 -20 -18

Claims

1. Spôsob prípravy glutarylacylázy (GA) v E. coli génovou technikou, vyznačujúci sa tým, že sa dosiahne expresia GA - gén obsiahnutého v plazmide pCM145 uložený v DSM 6409.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa GA - gén exprimujc pod kontrolou E. coli - promótora.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že promótor je indukovateľný.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa indukcia vykonáva v logaritmickej rastovej fáze.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa indukcia vykonáva v neskoršej logaritmickej fáze.

6. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa GA - gén použije v nízkokópiovom vektore.

7. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, žcsa GA - gén predloží v expresnom vektore, ktorý ako selekčný gén neobsahuje žiaden gén pre sekrétovaný, periplazmaticky lokalizovaný enzým.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že expresný vektor je vysokokópiový vektor.

9. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že GA - gén je predložený vo vysokokópiovom vektore, pričom je prísne regulovaná expresia selekčného génu.

10. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa expresia vykonáva pri teplote fermentácie od asi 25 do 30 °C.

11. Plazmid pCM145 (DSM 6409).

12. GA - gén, obsiahnutý v plazmide pCM145 (DSM 6409).

13. Génové konštrukcie, obsahujúce gén podľa nároku 12.

4 výkresy

SK 280242 Β6 <_> CQ

SK 280242 Β6

Obr. 2

SK 280242 Β6

Obr.3

DraI(U77)

EcoRI (3918)