JP3236284B2 - プラスミド、その製造方法及びこれをプラスミノ―ゲンアクチベーターの収得に使用する方法 - Google Patents
プラスミド、その製造方法及びこれをプラスミノ―ゲンアクチベーターの収得に使用する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 <産業上の利用分野> 本発明はプラスミド,その製造方法及びこれをプラス
ミノーゲンアクチベーターの収得に使用する方法に関す
る。
ミノーゲンアクチベーターの収得に使用する方法に関す
る。
<従来の技術> フィブリンが原因する血管閉塞,たとえば心臓硬塞,
肺塞栓,四肢の動脈閉塞疾患等々の治療に,ブラスミノ
ーゲンアクチベーターが重要な役割を果している。1950
年代の初めから,ヒドの尿中にタンパク質分解酵素が含
有され,この酵素はプラスミノーゲンのプラスミンへの
変換を生じさせる,すなわちこの変換がフィブリンの可
溶性ポリペプチド中での分解及びそれを同時にフィブリ
ンに起因する閉塞の溶解を生じせしめる酵素中で行われ
ることは公知である。このプラスミノーゲンアクチベー
ターはウロキナーゼと呼ばれ,実際に種々のウロキナー
ゼ型が存在するのが分った。しかしすべての型は,同一
の前駆分子,70年代の半ばから公知の酵素原プロウロキ
ナーゼから導かれる。このプロウロキナーゼは,1本鎖構
造を有することが明らかになった後に,これをscu−PA
(single chain urinary Plasminogen activator)と呼
ばれる。このscu−PAは411アミノ酸から成り,アミノ酸
302の天然に存在する形でグリコシリル化される。
肺塞栓,四肢の動脈閉塞疾患等々の治療に,ブラスミノ
ーゲンアクチベーターが重要な役割を果している。1950
年代の初めから,ヒドの尿中にタンパク質分解酵素が含
有され,この酵素はプラスミノーゲンのプラスミンへの
変換を生じさせる,すなわちこの変換がフィブリンの可
溶性ポリペプチド中での分解及びそれを同時にフィブリ
ンに起因する閉塞の溶解を生じせしめる酵素中で行われ
ることは公知である。このプラスミノーゲンアクチベー
ターはウロキナーゼと呼ばれ,実際に種々のウロキナー
ゼ型が存在するのが分った。しかしすべての型は,同一
の前駆分子,70年代の半ばから公知の酵素原プロウロキ
ナーゼから導かれる。このプロウロキナーゼは,1本鎖構
造を有することが明らかになった後に,これをscu−PA
(single chain urinary Plasminogen activator)と呼
ばれる。このscu−PAは411アミノ酸から成り,アミノ酸
302の天然に存在する形でグリコシリル化される。
種々の処理から,scu−PAの非グリコシル化されたたん
白質部分−−これは“rscu−PA"(組換えscu−PA)と呼
ばれるか又は俗名“サルプラーゼ”である−−)の遺伝
子工学上の製造は公知である。rscu−PAを治療的に使用
する場合,これは作用及び相容性の点で市販のフィブリ
ン溶解薬に比して優れていることが分った(Lancet 198
9,第863−868頁参照)。
白質部分−−これは“rscu−PA"(組換えscu−PA)と呼
ばれるか又は俗名“サルプラーゼ”である−−)の遺伝
子工学上の製造は公知である。rscu−PAを治療的に使用
する場合,これは作用及び相容性の点で市販のフィブリ
ン溶解薬に比して優れていることが分った(Lancet 198
9,第863−868頁参照)。
非グリコシル化プラスミノーゲンアクチベーターrscu
−PAの製造に,原核生物を使用する。このことはすでに
文献中にいくつか記載されている。従来公知のrscu−PA
に関する製造方法は,ヒトの組織から単離された,scu−
PAの構造遺伝子の発現に基づいている。その際残念なが
らほんの僅かな発現率しか得られず,これは比較的多量
に目的生成物を経済的に製造することができない。した
がってたとえばヒビノ等,Agric.Biol.Chem.52,329−336
(1988)に,大腸菌中でのrscu−PA−産生に関して細菌
の全たん白質を測定して2%発現水準しか記載されてい
ない。他方,ヨーロッパ特許第92182A2号並びにホーム
ズ等後記文献(10)中に達成される発現率が正確に記載
されていない。しかしこの記載の補正に於て,種々の菌
株中で2%より少ないrscu−PAの細菌たん白質が得られ
ている。
−PAの製造に,原核生物を使用する。このことはすでに
文献中にいくつか記載されている。従来公知のrscu−PA
に関する製造方法は,ヒトの組織から単離された,scu−
PAの構造遺伝子の発現に基づいている。その際残念なが
らほんの僅かな発現率しか得られず,これは比較的多量
に目的生成物を経済的に製造することができない。した
がってたとえばヒビノ等,Agric.Biol.Chem.52,329−336
(1988)に,大腸菌中でのrscu−PA−産生に関して細菌
の全たん白質を測定して2%発現水準しか記載されてい
ない。他方,ヨーロッパ特許第92182A2号並びにホーム
ズ等後記文献(10)中に達成される発現率が正確に記載
されていない。しかしこの記載の補正に於て,種々の菌
株中で2%より少ないrscu−PAの細菌たん白質が得られ
ている。
細菌中の真核たん白質の発現のほとんどの場合と同様
に,細胞中のrscu−PAも変性封入体−−以下これを“初
期たん白質”と呼ぶ−−として存在し,これは中間単離
の後にたん白質化学でrscu−PAの正確な三次構造に逆も
どりしなければならないことが言及されている。次いで
この様にして得られた生成物を,形成されたrscu−PA−
量の測定のために,たとえばプラスミンの添加によって
2本鎖の非グリコシル化ウロキナーゼ(“rtcu−PA")
に変えることができ,その酵素活性を測定し,rscu−PA
の形成量に関する尺度として使用することができる。し
かし当然初期たん白質又はrscu−PAの収量及び同時にま
た発現率を,たとえば全たん白質のゲル電気泳動分離の
デンストメトリー評価で検出することができる。
に,細胞中のrscu−PAも変性封入体−−以下これを“初
期たん白質”と呼ぶ−−として存在し,これは中間単離
の後にたん白質化学でrscu−PAの正確な三次構造に逆も
どりしなければならないことが言及されている。次いで
この様にして得られた生成物を,形成されたrscu−PA−
量の測定のために,たとえばプラスミンの添加によって
2本鎖の非グリコシル化ウロキナーゼ(“rtcu−PA")
に変えることができ,その酵素活性を測定し,rscu−PA
の形成量に関する尺度として使用することができる。し
かし当然初期たん白質又はrscu−PAの収量及び同時にま
た発現率を,たとえば全たん白質のゲル電気泳動分離の
デンストメトリー評価で検出することができる。
<課題を解決するための手段> 今や,本発明者は驚くべきことに,本発明によるプラ
スミドで形質転換された細菌は,従来技術から公知のプ
ラスミドで形質転換された同一の宿主菌株に比してはる
かに高い発現率を提供することを見い出した。本発明に
よるプラスミドはそれに応じてすべての従来公知のプラ
スミドに比してrscu−PA又はその初期たん白質の収得に
一層良好に適する。念のために,本発明に基づいてrscu
−PAが良好に入手されるので,公知方法で上記の,分析
目的に関して述べたrscu−PAの,たとえばプラスミンで
の分解によって,rtcu−PAも工業的規模で得ることがで
きるともいえる。
スミドで形質転換された細菌は,従来技術から公知のプ
ラスミドで形質転換された同一の宿主菌株に比してはる
かに高い発現率を提供することを見い出した。本発明に
よるプラスミドはそれに応じてすべての従来公知のプラ
スミドに比してrscu−PA又はその初期たん白質の収得に
一層良好に適する。念のために,本発明に基づいてrscu
−PAが良好に入手されるので,公知方法で上記の,分析
目的に関して述べたrscu−PAの,たとえばプラスミンで
の分解によって,rtcu−PAも工業的規模で得ることがで
きるともいえる。
更に本発明によるプラスミドは,そのオペロンが調節
可能な,場合により合成のプロモーター,リボソーム結
合部位として有効なscu−PAに関する合成構造遺伝子及
び構造遺伝子の下流に少なくとも1個のターミネーター
を有する点で優れている。2個の連続ターミネーターが
存在するのが好ましく,これは特にTn10からのtrp Aタ
ーミネーター及び(又は)tet A/orf Lターミネーター
〔ショルマイヤー(Schollmeier)等,後記文献(6)
参照〕である。
可能な,場合により合成のプロモーター,リボソーム結
合部位として有効なscu−PAに関する合成構造遺伝子及
び構造遺伝子の下流に少なくとも1個のターミネーター
を有する点で優れている。2個の連続ターミネーターが
存在するのが好ましく,これは特にTn10からのtrp Aタ
ーミネーター及び(又は)tet A/orf Lターミネーター
〔ショルマイヤー(Schollmeier)等,後記文献(6)
参照〕である。
調節可能なプロモーターは,特にTrp−プロモーター
又はTac−プロモーターである。
又はTac−プロモーターである。
本発明によるプラスミドの制御域中でSD−配列と開始
コドンの間の距離は,6−12,好ましくは8−10ヌクレオ
チドである。
コドンの間の距離は,6−12,好ましくは8−10ヌクレオ
チドである。
本発明によるプラスミド中に挿入された構造遺伝子の
構成に於て,夫々のアミノ酸に関して暗号づけする,次
表に記載された塩基配列を組み込むのが好ましい。その
際構造遺伝子中ですべてがこの要件を同時に満たす必要
はない。アミノ酸 トリプレット アルギニン CGT ロイシン CTG バリン GTT プロリン CCG グリシン GGT 他方で構造遺伝子の構成に於て,次のコドンの使用を
夫々記載のアミノ酸に関してできる限り回避するのが好
都合である(この際またこの要件をすべてのアミノ酸に
関して同時に満たす必要はない): 回避すべきコドン アミノ酸 ATA イソロイシン GTC バリン CCC プロリン AAG リジン AGG,AGA,CGG,CGA アルギニン GGA,GGG グリシン 構造遺伝子中で個々のアミノ酸に関するコドンの本発
明による選択並びに制御域の前記要件によって,構造遺
伝子と制御域との間の安定な二次構造の形成を著しく阻
害する。
構成に於て,夫々のアミノ酸に関して暗号づけする,次
表に記載された塩基配列を組み込むのが好ましい。その
際構造遺伝子中ですべてがこの要件を同時に満たす必要
はない。アミノ酸 トリプレット アルギニン CGT ロイシン CTG バリン GTT プロリン CCG グリシン GGT 他方で構造遺伝子の構成に於て,次のコドンの使用を
夫々記載のアミノ酸に関してできる限り回避するのが好
都合である(この際またこの要件をすべてのアミノ酸に
関して同時に満たす必要はない): 回避すべきコドン アミノ酸 ATA イソロイシン GTC バリン CCC プロリン AAG リジン AGG,AGA,CGG,CGA アルギニン GGA,GGG グリシン 構造遺伝子中で個々のアミノ酸に関するコドンの本発
明による選択並びに制御域の前記要件によって,構造遺
伝子と制御域との間の安定な二次構造の形成を著しく阻
害する。
合成構造遺伝子の収得に,先ずオリゴヌクレオチドを
40−80塩基の断片で1本の鎖状に合成する。これを1μ
Mol−尺度でアダムス(Adams)等,後記文献(7)の固
相法に従ってDNA−シンセサイザー(New Brunswick Sci
entific Co.社のモデルバイオサーチ8600)を用いて製
造するのが好ましい。その際モノマーサイソン(Syntho
ne)として,夫々必要なデスオキシヌクレオシドの市販
のβ−シアノエチル−保護されたジイソプロピルアミノ
−ホスホルアミジトを使用する。担体の離脱後,末端で
まだトリチル保護された鎖を無菌条件下ゲル濾過によっ
て脱塩し,前もって精製し,次いで2回のうち最初の分
離を“逆相”−HPLCによって行う。夫々の主生成物を脱
トリチル化し,2回別の“逆相”−HPLC−精製工程の後,
所望のオリゴヌクレオチドがゲル電気泳動分析(PAGE)
に示した様な高純度で得られる。
40−80塩基の断片で1本の鎖状に合成する。これを1μ
Mol−尺度でアダムス(Adams)等,後記文献(7)の固
相法に従ってDNA−シンセサイザー(New Brunswick Sci
entific Co.社のモデルバイオサーチ8600)を用いて製
造するのが好ましい。その際モノマーサイソン(Syntho
ne)として,夫々必要なデスオキシヌクレオシドの市販
のβ−シアノエチル−保護されたジイソプロピルアミノ
−ホスホルアミジトを使用する。担体の離脱後,末端で
まだトリチル保護された鎖を無菌条件下ゲル濾過によっ
て脱塩し,前もって精製し,次いで2回のうち最初の分
離を“逆相”−HPLCによって行う。夫々の主生成物を脱
トリチル化し,2回別の“逆相”−HPLC−精製工程の後,
所望のオリゴヌクレオチドがゲル電気泳動分析(PAGE)
に示した様な高純度で得られる。
次いでこの1本鎖の4〜9のグループから,長さ約20
0ヌクレオチドの2本鎖断片を次の様にして得る:非末
端1本鎖のオリゴヌクレオチドを5′−末端でホスホリ
ル化し,夫々の補体鎖を末端オリゴヌクレオチドと共に
やきもどし,連結する。次いで連結後,形成されたクロ
ーン化しうる2本鎖断片を適する線状化されたベクター
中に挿入する。他の処理法は,下記の例から明らかであ
る。
0ヌクレオチドの2本鎖断片を次の様にして得る:非末
端1本鎖のオリゴヌクレオチドを5′−末端でホスホリ
ル化し,夫々の補体鎖を末端オリゴヌクレオチドと共に
やきもどし,連結する。次いで連結後,形成されたクロ
ーン化しうる2本鎖断片を適する線状化されたベクター
中に挿入する。他の処理法は,下記の例から明らかであ
る。
本発明中で使用される略号は,次の意味を有する: bp:塩基対 DE 52:ワットマン社のアニオン交換体 EDTA:エチレンジアミンテトラ酢酸 IPTG:イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PU:プラーク単位 SDS:ナトリウムドデシルスルフアート S.D.−配列:Shine−Dalgarno−配列 トリス−HCl:トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ヒ
ドロクロリド トウーン−80:ポリエチレンオキシド(20)ソルビタン
モノオレアート 本発明によるプラスミドの構成のために,市販のプラ
スミドpBR322(4363bp)から出発するのが好ましい。こ
れからnic/bom−域及び(又は)テトラサイクリン耐性
遺伝子を離脱するのが有利である。その際テトラサイク
リン耐性遺伝子を完全に除去する必要はない。むしろこ
れは,プラスミドがこれを用いて形質転換された細菌株
にテトラサイクリン−耐性をもはや付与しないことで十
分である。この操作(nic/bom−域及び少なくとも一部
のテトラサイクリン耐性遺伝子の除去)によって,いわ
ゆる“高度に安全なプラスミド”が得られる。
ドロクロリド トウーン−80:ポリエチレンオキシド(20)ソルビタン
モノオレアート 本発明によるプラスミドの構成のために,市販のプラ
スミドpBR322(4363bp)から出発するのが好ましい。こ
れからnic/bom−域及び(又は)テトラサイクリン耐性
遺伝子を離脱するのが有利である。その際テトラサイク
リン耐性遺伝子を完全に除去する必要はない。むしろこ
れは,プラスミドがこれを用いて形質転換された細菌株
にテトラサイクリン−耐性をもはや付与しないことで十
分である。この操作(nic/bom−域及び少なくとも一部
のテトラサイクリン耐性遺伝子の除去)によって,いわ
ゆる“高度に安全なプラスミド”が得られる。
本発明によるプラスミドの構成に好ましいスターター
−−これは前記修飾されたプラスミドpBR322(又は他
の,ここで挙げたすでに知られているプラスミド)から
出発する−−は,最も近い間隔として合成“マルチ ク
ローニング サイト”の組み入れを切断部位Eco R I及
びHind IIIとの間に定める。このマルチ クローニング
サイト(第2図参照)は,切断部位の固定された配列
順序を有し,その間に存在する塩基はXba I及びNde Iの
間の配列を除いて任意に選択され,この配列はB.subtil
is Xylオペロン5′−AAGGAG−3′(4)から及びS.D.
−配列と開始コドンの間の固定された距離から成るリボ
ソーム結合部位を含有する。S.D.−配列に続く塩基GAAA
Tは文献(4)から引用され,CATATG,すなわちNde I切断
部位は結合する。したがってS.D.−配列はATGの間の距
離は8塩基対である。マルチ クローニング サイトの
個々の切断部位の間の距離は,クローン化技術の理由か
ら長さ少なくとも約20のヌクレオチドでなければなら
ず,それによって介在断片の除去を促進する。
−−これは前記修飾されたプラスミドpBR322(又は他
の,ここで挙げたすでに知られているプラスミド)から
出発する−−は,最も近い間隔として合成“マルチ ク
ローニング サイト”の組み入れを切断部位Eco R I及
びHind IIIとの間に定める。このマルチ クローニング
サイト(第2図参照)は,切断部位の固定された配列
順序を有し,その間に存在する塩基はXba I及びNde Iの
間の配列を除いて任意に選択され,この配列はB.subtil
is Xylオペロン5′−AAGGAG−3′(4)から及びS.D.
−配列と開始コドンの間の固定された距離から成るリボ
ソーム結合部位を含有する。S.D.−配列に続く塩基GAAA
Tは文献(4)から引用され,CATATG,すなわちNde I切断
部位は結合する。したがってS.D.−配列はATGの間の距
離は8塩基対である。マルチ クローニング サイトの
個々の切断部位の間の距離は,クローン化技術の理由か
ら長さ少なくとも約20のヌクレオチドでなければなら
ず,それによって介在断片の除去を促進する。
このマルチ クローニング サイトを用いて,プラス
ミド中に切断部位を挿入する。この切断部位は,−−好
ましくは転写ターミネーターの組み込みの後−−scu PA
−構造遺伝子の部分配列の連続して行われる組み込み
を,目的たん白質のC−末端から,したがって製造すべ
き構造遺伝子のDNA−鎖の3′−末端から開始し,並び
にたとえば合成又は他のプラスミドから単離された又は
市販のTrp−プロモターの組み込みも可能にする。この
様にして得られたscu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレ
オチド配列を,第15図中に記載した個々のコドンに対応
するアミノ酸で示す。
ミド中に切断部位を挿入する。この切断部位は,−−好
ましくは転写ターミネーターの組み込みの後−−scu PA
−構造遺伝子の部分配列の連続して行われる組み込み
を,目的たん白質のC−末端から,したがって製造すべ
き構造遺伝子のDNA−鎖の3′−末端から開始し,並び
にたとえば合成又は他のプラスミドから単離された又は
市販のTrp−プロモターの組み込みも可能にする。この
様にして得られたscu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレ
オチド配列を,第15図中に記載した個々のコドンに対応
するアミノ酸で示す。
本発明によるプラスミドの他のものは,前記の様に構
成されたプラスミドから,たとえば次の様にして得るこ
とができる:Eco R I及びHind IIIで切断してすべての調
節単位を有する合成scuPA−構造が得られ,次いで他
の,腸内細菌中,好ましくは大腸菌中で自律的増殖可能
なプラスミド中に組み込む。このプラスミドをEco R I
及びHind IIIで切断して線状化し,短縮する。原則的に
同一方法で,しかし切断部位Eco R I及びXba Iの利用下
に,たとえばTrp−プロモーターをTac−プロモーターと
(逆もまた同じ)本発明によるプラスミド中で交換する
こともできる。
成されたプラスミドから,たとえば次の様にして得るこ
とができる:Eco R I及びHind IIIで切断してすべての調
節単位を有する合成scuPA−構造が得られ,次いで他
の,腸内細菌中,好ましくは大腸菌中で自律的増殖可能
なプラスミド中に組み込む。このプラスミドをEco R I
及びHind IIIで切断して線状化し,短縮する。原則的に
同一方法で,しかし切断部位Eco R I及びXba Iの利用下
に,たとえばTrp−プロモーターをTac−プロモーターと
(逆もまた同じ)本発明によるプラスミド中で交換する
こともできる。
同様な方法で他の公知のプラスミド−−これは単一の
Eco R I−及びHind III−切断部位を有する−−,たと
えばpUC 9,pUC 12,pUC 13,pUC 18,pUC19等からも出発す
ることができる。
Eco R I−及びHind III−切断部位を有する−−,たと
えばpUC 9,pUC 12,pUC 13,pUC 18,pUC19等からも出発す
ることができる。
S.D.−配列と開始コドンATGとの間の伸長された距離
を有する本発明によるプラスミドを,次の様に得ること
ができる:上記の様に構成されたプラスミド−−これ中
で上記距離,たとえば8ヌクレオチドを有する−−Nde
Iで切断し,生じる切断部位を補充し,次いで生じる平
滑−末端を連結する。それによってS.D.−配列と開始コ
ドンとの間の距離がたとえば10ヌクレオチドである本発
明によるプラスミドを形成する。
を有する本発明によるプラスミドを,次の様に得ること
ができる:上記の様に構成されたプラスミド−−これ中
で上記距離,たとえば8ヌクレオチドを有する−−Nde
Iで切断し,生じる切断部位を補充し,次いで生じる平
滑−末端を連結する。それによってS.D.−配列と開始コ
ドンとの間の距離がたとえば10ヌクレオチドである本発
明によるプラスミドを形成する。
上述の様に,本発明によるプラスミドで形質転換され
た細菌を用いて,従来技術から公知のプラスミドで形質
転換された発現率よりもほぼ数倍高い発現率がもたらさ
れる。適当な受容プラスミドの形質転換は,公知方法で
行われる。本発明によるプラスミドの発現に関して,特
に適する宿主生物は大腸菌−及び使用される腸内細菌−
種の株,たとえばシュードモナス,サルモネラ,エンテ
ロバクター,クレブシエラ又はセレイシアの菌株であ
る。
た細菌を用いて,従来技術から公知のプラスミドで形質
転換された発現率よりもほぼ数倍高い発現率がもたらさ
れる。適当な受容プラスミドの形質転換は,公知方法で
行われる。本発明によるプラスミドの発現に関して,特
に適する宿主生物は大腸菌−及び使用される腸内細菌−
種の株,たとえばシュードモナス,サルモネラ,エンテ
ロバクター,クレブシエラ又はセレイシアの菌株であ
る。
好ましい宿主生物は,大腸菌−種,たとえば大腸菌GR
T−1及び特に下部群K12の大腸菌−株,たとえば大腸菌
K12 JM 101(ATCC 33876),大腸菌K12JM 103(ATCC 39
403),大腸菌K12 JM 105(DSM4162),大腸菌−K12−
株(ATCC 31446)又はまた大腸菌K12DH1(ATCC 33849)
である。
T−1及び特に下部群K12の大腸菌−株,たとえば大腸菌
K12 JM 101(ATCC 33876),大腸菌K12JM 103(ATCC 39
403),大腸菌K12 JM 105(DSM4162),大腸菌−K12−
株(ATCC 31446)又はまた大腸菌K12DH1(ATCC 33849)
である。
Tac−プロモーターを含有する大腸菌−発現系での発
現開始を,たとえば乳糖添加又はブドウ糖添加によっ
て,好ましくはイソプロピル−β−D−チオガラクトピ
ラノシドの添加によって生じさせる。しかしプラスミド
中にTrp−プロモーターが存在する場合,誘導をインド
ールアクリル−,−酢酸−又は−プロピオン酸で行うの
が好ましい。他の公知の誘導は,当然同一方法で利用す
ることができる。
現開始を,たとえば乳糖添加又はブドウ糖添加によっ
て,好ましくはイソプロピル−β−D−チオガラクトピ
ラノシドの添加によって生じさせる。しかしプラスミド
中にTrp−プロモーターが存在する場合,誘導をインド
ールアクリル−,−酢酸−又は−プロピオン酸で行うの
が好ましい。他の公知の誘導は,当然同一方法で利用す
ることができる。
誘導及び一定の,前もって与えられた細胞密度の達成
の後に,細胞を遠心分離し,遠心分離残渣を水性塩溶液
中に懸濁後たとえば均一機中に移し,それ中で細胞を圧
力差によって裂開する。新たな遠心分離の後,残渣中に
rscu−PAの初期たん白質が水不溶性細胞破片等々と共に
得られる。グアニジンヒドロクロリド溶液で処理して,
初期たん白質を溶解し,次いで新たに遠心分離の後,上
澄液をレドックス系(たとえば還元及び酸化グルタチオ
ンを含有する。)で処理する。それによって天然構造の
形成,すなわち目的のrscu−PAの形成を生じさせる。そ
の時これは反応混合物中に溶解された形で存在し,通常
の精製工程(たとえばクロマトグラフィー分離,次いで
凍結乾燥)によって純粋な形で単離することができる。
の後に,細胞を遠心分離し,遠心分離残渣を水性塩溶液
中に懸濁後たとえば均一機中に移し,それ中で細胞を圧
力差によって裂開する。新たな遠心分離の後,残渣中に
rscu−PAの初期たん白質が水不溶性細胞破片等々と共に
得られる。グアニジンヒドロクロリド溶液で処理して,
初期たん白質を溶解し,次いで新たに遠心分離の後,上
澄液をレドックス系(たとえば還元及び酸化グルタチオ
ンを含有する。)で処理する。それによって天然構造の
形成,すなわち目的のrscu−PAの形成を生じさせる。そ
の時これは反応混合物中に溶解された形で存在し,通常
の精製工程(たとえばクロマトグラフィー分離,次いで
凍結乾燥)によって純粋な形で単離することができる。
分析目的で,試験すべきプラスミドを用いて形質転換
された大腸菌−株を発酵し,前もって付与された,細胞
懸濁液の光学密度を適する誘導剤で達成した後,rscu−P
A−初期たん白質の発現を誘導する様にして行うのが有
利である。適当な発酵期間の後,一部を下り出し,次い
でこれから遠心分離された細胞を,リゾチーム(pH8.0
の50mMトリスヒドロクロリド緩衝液,50mM EDTA及び15%
サッカロースmlあたり1mgリゾチーム)で溶解する。溶
解された細胞の均一物を,4−5 Mグアニジニウムヒドロ
クロリド溶液中に溶解し,1.2 Mグアニジニウムヒドロク
ロリドで希釈後,還元剤(グルタチオン,メルカプトエ
タノール又はシステイン)の添加下に2−5時間逆戻り
反応を行う(たとえばヴィンクラー(Winkler)等,後
記文献(11)参照)。得られた1本鎖rscu−PAを,プラ
スミンの添加によって2本鎖rtcu−PAに変え,次いでそ
の活性を基質S 2444(pyroGlu−Gly−Arg−p−ニトロ
アニリド;Kabi Diagnostika,スウエーデン)−−−−こ
れは2本鎖の活性ウロキナーゼによってしか分離されな
い−−で測定する。プラスミンでのrscu−PAのこの活性
化は,50mMトリス−緩衝液,12mM塩化ナトリウム,0.02%
トウィーン80中でpH7.4及び37℃で行われる。rscu−PA
とプラスミンの割合は、モル濃度あたり約100〜1500:1,
あるいは酵素単位あたり約8.000〜36.000:1である。テ
スト培養は,50mMトリス−緩衝液,38mM塩化ナトリウム中
でpH8.8で0.36μMアプロチニン(プラスミン阻止のた
めに)及び0.27mM S 2444の存在下に37℃で行われる。
試料のrscu−PA含有量に応じて反応を,5〜60分の培養後
90%酢酸の添加によって停止し,吸光を405nmで測定す
る。基質S 2444の生産者の指令に従って,この処理法で
405nmで分あたり0.05の吸光変化は,25プラーク−単位/m
lテスト溶液の活性を意味する。
された大腸菌−株を発酵し,前もって付与された,細胞
懸濁液の光学密度を適する誘導剤で達成した後,rscu−P
A−初期たん白質の発現を誘導する様にして行うのが有
利である。適当な発酵期間の後,一部を下り出し,次い
でこれから遠心分離された細胞を,リゾチーム(pH8.0
の50mMトリスヒドロクロリド緩衝液,50mM EDTA及び15%
サッカロースmlあたり1mgリゾチーム)で溶解する。溶
解された細胞の均一物を,4−5 Mグアニジニウムヒドロ
クロリド溶液中に溶解し,1.2 Mグアニジニウムヒドロク
ロリドで希釈後,還元剤(グルタチオン,メルカプトエ
タノール又はシステイン)の添加下に2−5時間逆戻り
反応を行う(たとえばヴィンクラー(Winkler)等,後
記文献(11)参照)。得られた1本鎖rscu−PAを,プラ
スミンの添加によって2本鎖rtcu−PAに変え,次いでそ
の活性を基質S 2444(pyroGlu−Gly−Arg−p−ニトロ
アニリド;Kabi Diagnostika,スウエーデン)−−−−こ
れは2本鎖の活性ウロキナーゼによってしか分離されな
い−−で測定する。プラスミンでのrscu−PAのこの活性
化は,50mMトリス−緩衝液,12mM塩化ナトリウム,0.02%
トウィーン80中でpH7.4及び37℃で行われる。rscu−PA
とプラスミンの割合は、モル濃度あたり約100〜1500:1,
あるいは酵素単位あたり約8.000〜36.000:1である。テ
スト培養は,50mMトリス−緩衝液,38mM塩化ナトリウム中
でpH8.8で0.36μMアプロチニン(プラスミン阻止のた
めに)及び0.27mM S 2444の存在下に37℃で行われる。
試料のrscu−PA含有量に応じて反応を,5〜60分の培養後
90%酢酸の添加によって停止し,吸光を405nmで測定す
る。基質S 2444の生産者の指令に従って,この処理法で
405nmで分あたり0.05の吸光変化は,25プラーク−単位/m
lテスト溶液の活性を意味する。
種々の本発明によるプラスミドの使用下に種々の細菌
中に得られる初期たん白質から得られるrscu−PAの収量
を,第10,12及び14図中に表わす。
中に得られる初期たん白質から得られるrscu−PAの収量
を,第10,12及び14図中に表わす。
第11図から並びに下記例−特に例2からの表1−の記
載から明らかな様に,本発明によるプラスミドが好まし
くは大腸菌の株中で形成された全たん白質10〜25重量
%,特に14〜20重量%の発現率を有するrscu−PA−初期
たん白質の形成を生じさせる。したがって発現率は,本
発明によるプラスミドの使用で公知のプラスミド,たと
えばpUK 54 trp207−1を用いた発現率に比して少なく
とも10〜15倍高く得ることができる。
載から明らかな様に,本発明によるプラスミドが好まし
くは大腸菌の株中で形成された全たん白質10〜25重量
%,特に14〜20重量%の発現率を有するrscu−PA−初期
たん白質の形成を生じさせる。したがって発現率は,本
発明によるプラスミドの使用で公知のプラスミド,たと
えばpUK 54 trp207−1を用いた発現率に比して少なく
とも10〜15倍高く得ることができる。
添付の図面は,次のことを示す: 第1a図及び第1b図:市販のプラスミドpBR 322からの
プラスミドpBF 158の構造。その際連続してnic/bom−域
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を除去する。
プラスミドpBF 158の構造。その際連続してnic/bom−域
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を除去する。
第2図:合成“マルチ クローニング サイト”のヌ
クレオチド配列。
クレオチド配列。
第3図:プラスミドpBF 158−01の構造。プラスミドp
BE 158中の切断部位Eco R IとHind IIIの間に合成マル
チ クローニング サイトの組み込みを描く。
BE 158中の切断部位Eco R IとHind IIIの間に合成マル
チ クローニング サイトの組み込みを描く。
第4図:プラスミドpBF 158−01 Tの構造。断片Cla I
×Hind IIIを,Tn 10(6)からのtet A/orf Lターミネ
ーターが存在するプラスミドpRT 61(5)からの対応す
る断片“T"に替える。
×Hind IIIを,Tn 10(6)からのtet A/orf Lターミネ
ーターが存在するプラスミドpRT 61(5)からの対応す
る断片“T"に替える。
第5a図ないし第5g図:ヒトscu−PAに関して暗号づけ
する遺伝子に対する合成断片のヌクレオチド配列(例1d
〜1f中に記載されかつ第6図,第7図及び第9図中に図
示されたプラスミドpBF 158−01Tから出発して,本発明
によるプラスミド中にscu−PAに対する構造遺伝子の形
成下にこの配列を組み込む。) 第6a図ないし第6c図:オリゴヌクレオチド断片M4〜M8
を,プラスミドpBF 158−01 Tで開始して目的のたん白
質のC−末端(DNA−鎖の3′−末端に対応)から組み
込むことによるプラスミドpBF 158−02T〜pBF 158−06
の構成。
する遺伝子に対する合成断片のヌクレオチド配列(例1d
〜1f中に記載されかつ第6図,第7図及び第9図中に図
示されたプラスミドpBF 158−01Tから出発して,本発明
によるプラスミド中にscu−PAに対する構造遺伝子の形
成下にこの配列を組み込む。) 第6a図ないし第6c図:オリゴヌクレオチド断片M4〜M8
を,プラスミドpBF 158−01 Tで開始して目的のたん白
質のC−末端(DNA−鎖の3′−末端に対応)から組み
込むことによるプラスミドpBF 158−02T〜pBF 158−06
の構成。
第7a図ないし第7c図:プラスミドpUC 19中で補助構造
を介するプラスミドpBF 158−08 Tの構造。
を介するプラスミドpBF 158−08 Tの構造。
第8図:合成Trp−プロモーターのヌクレオチド配
列。
列。
第9図:ヒトrscu−PAの初期たん白質に関する発現プ
ラスミドの構造。pBF 160 scu−PAに関する構造遺伝子
を切断部位Nde IとCla Iとの間の黒色帯によって表わ
す。
ラスミドの構造。pBF 160 scu−PAに関する構造遺伝子
を切断部位Nde IとCla Iとの間の黒色帯によって表わ
す。
第10図:種々の,プラスミドpBF 160(0−0)で又
はプラスミドpUK trp 270−1(10)(・−・)で形質
転換された大腸菌−株に於て,0時点を基準にしてインド
ールアクリル酸での誘導後の時間に基づいてTrp−プロ
モーターの調節下に,ヒトrscu−PAの初期たん白質の発
現率(逆戻り及び活性後rtcu−PA−活性として測定)。
基質S 2444で決定されたrtcu PA−活性を,578nmで光学
密度1の発酵培地mlあたりプラーク−単位で記載する。
はプラスミドpUK trp 270−1(10)(・−・)で形質
転換された大腸菌−株に於て,0時点を基準にしてインド
ールアクリル酸での誘導後の時間に基づいてTrp−プロ
モーターの調節下に,ヒトrscu−PAの初期たん白質の発
現率(逆戻り及び活性後rtcu−PA−活性として測定)。
基質S 2444で決定されたrtcu PA−活性を,578nmで光学
密度1の発酵培地mlあたりプラーク−単位で記載する。
第11図:誘導剤としてインドールアクリル酸添加前
(A)及び添加6時間後(B)の発酵の後に,pBF 161で
形質転換された大腸菌K12 JM103−細胞からのたん白質
のSDS−PAGEのデンシトグラム。
(A)及び添加6時間後(B)の発酵の後に,pBF 161で
形質転換された大腸菌K12 JM103−細胞からのたん白質
のSDS−PAGEのデンシトグラム。
第12図:pBF 171で形質転換された大腸菌K12 JM 103中
で,すなわちTac−プロモーターの調節下にヒトrscu−P
Aの初期たん白質の発現率(逆戻り及び活性化後rtcu−P
A−活性として測定)。決定された基質S 2444に対するr
tcu−PA−活性を,578nmで光学密度1を有する発酵培地m
lあたりのプラーク−単位で記載する。
で,すなわちTac−プロモーターの調節下にヒトrscu−P
Aの初期たん白質の発現率(逆戻り及び活性化後rtcu−P
A−活性として測定)。決定された基質S 2444に対するr
tcu−PA−活性を,578nmで光学密度1を有する発酵培地m
lあたりのプラーク−単位で記載する。
第13図:SD−配列(SD)と開始コドンATGとの間の距離
を,Nde I−切断部位の補充及び生じる平滑−末端の引き
続きの連結反応によって8から10の塩基伸長する。
を,Nde I−切断部位の補充及び生じる平滑−末端の引き
続きの連結反応によって8から10の塩基伸長する。
第14図:プラスミドpBF 161(o−o)又はpBF163
(Δ−Δ)で形質転換された大腸菌GRT−1中でTrp−プ
ロモーターの調節下にヒトrscu−PAの初期たん白質の発
現率(逆戻り及び活性化後rtcu−PA−活性として測
定)。誘導は,0時点直後にインドールアクリル酸で行わ
れる。基質S 2444で決定されたrtcu PA−活性を,578nm
で光学密度1の発酵培地mlあたりのプラーク−単位で記
載する。
(Δ−Δ)で形質転換された大腸菌GRT−1中でTrp−プ
ロモーターの調節下にヒトrscu−PAの初期たん白質の発
現率(逆戻り及び活性化後rtcu−PA−活性として測
定)。誘導は,0時点直後にインドールアクリル酸で行わ
れる。基質S 2444で決定されたrtcu PA−活性を,578nm
で光学密度1の発酵培地mlあたりのプラーク−単位で記
載する。
第15a図及び第15b図:個々のコドンに対応するアミノ
酸の表示を有するscu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレ
オチド配列。
酸の表示を有するscu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレ
オチド配列。
例中で使用される制限酵素は,市販されている(たと
えばNachr.Chem.Techn.Lab.35,939,1987参照)。
えばNachr.Chem.Techn.Lab.35,939,1987参照)。
クローンの選択に関する例中で使用される培地はあ
たり次のものを含有する:肉からのペプトン7.8g,カゼ
インからのペプトン7.8g,酵母抽出物10g,塩化ナトリウ
ム5.6g及びグルコース10g。この培地に熱い状態であ
たり寒天10gを加え,プレート中に注ぐ。
たり次のものを含有する:肉からのペプトン7.8g,カゼ
インからのペプトン7.8g,酵母抽出物10g,塩化ナトリウ
ム5.6g及びグルコース10g。この培地に熱い状態であ
たり寒天10gを加え,プレート中に注ぐ。
例1 Trp−プロモーターの調節下で合成scu−PA−構造遺伝
子を有するrscu−PAの初期たん白質に関する発現プラス
ミドpBF 160の構成。
子を有するrscu−PAの初期たん白質に関する発現プラス
ミドpBF 160の構成。
a)プラスミドpBF 158の構成 i)プラスミドpBF 322(Pharmacia,No.27−4902,4363b
p)から,塩基2207と2263の間に存在するnic/bom域を次
の様に除去する(1)(第1図も参照):pBR 322を,塩
基2298でNde Iにより切断し,それによって線状とな
る。上方の末端を“fill in"反応を介して補充し,それ
によって平滑−末端が得られる(2)。その後塩基2068
でPvu IIを用いて切断し,pBR 322の残った部分の2つの
平滑末端を常法に従ってT4−リガーゼで再び連結する。
次いで連結混合物をコムピテント大腸菌K12 JM 103細胞
(ATCC 39403)中で形質転換する(3)。形質転換され
た細胞を,培地上で150μgアンピシリン/mlの添加下に
培養する。得られたクローンから,プラスミドpBF157を
含有するクローンを選択する。このプラスミドは,出発
プラスミドpBR 322と228ヌクレオチドだけ小さいa)Ps
t I×BspM II−,b)Pst I×Bal I−,c)Pst I×Ava I−
断片の点で異なる。pBR 322の2つの単一切断部位Pvu I
I及びNde Iは,プラスミドpBR 157中にもはや在しな
い。
p)から,塩基2207と2263の間に存在するnic/bom域を次
の様に除去する(1)(第1図も参照):pBR 322を,塩
基2298でNde Iにより切断し,それによって線状とな
る。上方の末端を“fill in"反応を介して補充し,それ
によって平滑−末端が得られる(2)。その後塩基2068
でPvu IIを用いて切断し,pBR 322の残った部分の2つの
平滑末端を常法に従ってT4−リガーゼで再び連結する。
次いで連結混合物をコムピテント大腸菌K12 JM 103細胞
(ATCC 39403)中で形質転換する(3)。形質転換され
た細胞を,培地上で150μgアンピシリン/mlの添加下に
培養する。得られたクローンから,プラスミドpBF157を
含有するクローンを選択する。このプラスミドは,出発
プラスミドpBR 322と228ヌクレオチドだけ小さいa)Ps
t I×BspM II−,b)Pst I×Bal I−,c)Pst I×Ava I−
断片の点で異なる。pBR 322の2つの単一切断部位Pvu I
I及びNde Iは,プラスミドpBR 157中にもはや在しな
い。
ii)pBF 157から,テトラサイクリン耐性遺伝子の大部
分をEcoR V×Nru Iでの切断,次いで生じる平滑末端の
連結によって除去する。大腸菌K12,JM103中で形質転換
し,150μgアンピシリン/mlを含有する培地上で培養し
た後,クローンが得られ,このクローンからプラスミド
pBF 158を含有するプラスミドを選択する。これらはpBF
157より787ヌクレオチド小さく,その上Bam H I−切断
部位の欠落の点で異なる。細菌株のpBF 158での形質転
換は,細菌にテトラサイクリン耐性を付与しない。
分をEcoR V×Nru Iでの切断,次いで生じる平滑末端の
連結によって除去する。大腸菌K12,JM103中で形質転換
し,150μgアンピシリン/mlを含有する培地上で培養し
た後,クローンが得られ,このクローンからプラスミド
pBF 158を含有するプラスミドを選択する。これらはpBF
157より787ヌクレオチド小さく,その上Bam H I−切断
部位の欠落の点で異なる。細菌株のpBF 158での形質転
換は,細菌にテトラサイクリン耐性を付与しない。
b)pBF 158−01の構成,合成マルチクローニングサイ
トの組み込み。
トの組み込み。
pBF 158から,Eco R I×Hind IIIでの切断によって31
ヌクレオチド大きい断片を除去し,裂け目に合成マルチ
クローニングサイトを連結する。その配列を,第2図中
に描写する。大腸菌K12JM 103中で連結混合物を形質転
換し,150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養し
た後,プラスミドpBF158−01を含有するクローンを選択
する。このクローンはpBF 158と付加的な単一切断部位X
ba I,Nde I,Sac I,Eag I,Kpn I,Spe I並びに第二Pst I
−切断部位の点で異なる(第3図)。
ヌクレオチド大きい断片を除去し,裂け目に合成マルチ
クローニングサイトを連結する。その配列を,第2図中
に描写する。大腸菌K12JM 103中で連結混合物を形質転
換し,150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養し
た後,プラスミドpBF158−01を含有するクローンを選択
する。このクローンはpBF 158と付加的な単一切断部位X
ba I,Nde I,Sac I,Eag I,Kpn I,Spe I並びに第二Pst I
−切断部位の点で異なる(第3図)。
c)pBF 158−01Tの構成,転写ターミネーターの込み込
み。
み。
pBE 158−01から,マルチ クローニング サイトのC
la I×Hind III断片を除去し,Tn 10からのtet A/orf L
ターミネーター(6)が存在するpRT 61からのCla I×H
ind III断片(5)に替える。
la I×Hind III断片を除去し,Tn 10からのtet A/orf L
ターミネーター(6)が存在するpRT 61からのCla I×H
ind III断片(5)に替える。
菌株大腸菌K12 JM103中で形質転換し,150μgアンピ
リシン/mlを有する培地上で培養した後,プラスミドpBF
158−01Tを含有するクローンを選択する。このクロー
ンはpBF158−01と297ヌクレオチドだけ大きいCla I×Hi
nd III断片の点で異なる(第4図)。
リシン/mlを有する培地上で培養した後,プラスミドpBF
158−01Tを含有するクローンを選択する。このクロー
ンはpBF158−01と297ヌクレオチドだけ大きいCla I×Hi
nd III断片の点で異なる(第4図)。
d)scu−PA−遺伝子に関する合成断片M4−M8の組み込
み,プラスミドpBF 158−02T−pBF 158−06Tの構成。
み,プラスミドpBF 158−02T−pBF 158−06Tの構成。
すべての合成断片を,第5a−5g図中に記載する。これ
らを長さ約200ヌクレオチドの二本鎖断片として当該ベ
クター中に使用する。更にベクターを,その都度挙げた
切断部位に相当する制限酵素で切断し,アガロースゲル
電気泳動,電気溶離及び精製によってDE52に経て除去す
べき断片を分離する。その後付随する二本鎖合成断片と
の連結は,T4−リガーゼを用いて行われ,形質転換は大
腸菌K12 JM103中で行われ(第6a−6c図)及び選択はア
ンピシリン−含有培地上で行われる。
らを長さ約200ヌクレオチドの二本鎖断片として当該ベ
クター中に使用する。更にベクターを,その都度挙げた
切断部位に相当する制限酵素で切断し,アガロースゲル
電気泳動,電気溶離及び精製によってDE52に経て除去す
べき断片を分離する。その後付随する二本鎖合成断片と
の連結は,T4−リガーゼを用いて行われ,形質転換は大
腸菌K12 JM103中で行われ(第6a−6c図)及び選択はア
ンピシリン−含有培地上で行われる。
i)プラスミドpBF 158−01T中のBam H IとCla Iとの間
の断片M8の連結反応。
の断片M8の連結反応。
プラスミド158−02Tが生じる。オリゴヌクレオチド01
9は,scu−PAのC−末端配列に関して暗号化する。停止
−コドンTAAの後にNhe I切断部位が存在し,これは付加
的な,TrpAターミネーター(8)の転写ターミネーター
ないしCla Iを有する。
9は,scu−PAのC−末端配列に関して暗号化する。停止
−コドンTAAの後にNhe I切断部位が存在し,これは付加
的な,TrpAターミネーター(8)の転写ターミネーター
ないしCla Iを有する。
ii)プラスミドpBF158−02T中でのSpe IとBam H Iとの
間の断片M7の連結反応。
間の断片M7の連結反応。
プラスミド158−03Tが生じる。
iii) プラスミドpBF158−03T中でのKpn IとSpe Iとの
間の断片M6の連結反応。
間の断片M6の連結反応。
プラスミドpBF158−04Tが生じる。
iv)プラスミドpBF 158−04T中でのEag I及びKpn Iとの
間の断片M5の連結反応。
間の断片M5の連結反応。
プラスミドpBF 158−05Tが生じる。
v)プラスミドpBF158−05T中でのSac IとEag Iとの断
片M4の連結反応。
片M4の連結反応。
プラスミドpBF 158−06Tが生じる。
得られたクローンi−vから夫々次の様なクローンを
選択する。それは夫々調べられた正しい配列中に組み込
まれた新規断片が存在する点で夫々前駆体と異ってい
る。
選択する。それは夫々調べられた正しい配列中に組み込
まれた新規断片が存在する点で夫々前駆体と異ってい
る。
e)scu−PA−構造遺伝子に関する合成断片M2及びM3の
組み込み。
組み込み。
pBF 158−08Tの構成 断片M2及びM3の組み込みに関してPst I−切断が必要
であり,これまで使用されていたプラスミドpBF158上に
まだPst I切断部位(アンピシリン耐性遺伝子中に)−
−これは次のクローニングで妨害する−−が存在するの
で,次の様に処理する(第7a〜7c図): i)市販の(たとえばPharmacia)プラスミドpUC 19か
ら,マルチ クローニング サイト及び付加的に212ヌ
クレオチドを下流にNde I×Hind III断片として除去す
る。次いで生じる裂け目中にプラスミドpBF 158−04−3
Tからの合成マルチクローニング サイトをNde I×Hind
III断片として連結する。このプラスミドpBF 158−04
−3Tが,プラスミドpBF158−02−T(例1di参照)から
オリゴヌクレオチド断片M6の組み込みによって得られ,
断片M7のないプラスミドpBF 158−04Tに相当する。大腸
菌K12 JM103細胞中で形質転換し,150μgアンピシリン/
mlを有する培地上で培養した後,プラスミドpUC19−04
−3を含有するクローンを選択する。これはpUC19と長
さ712ヌクレオチドのNde I×Hind III断片の存在の点で
異なる。
であり,これまで使用されていたプラスミドpBF158上に
まだPst I切断部位(アンピシリン耐性遺伝子中に)−
−これは次のクローニングで妨害する−−が存在するの
で,次の様に処理する(第7a〜7c図): i)市販の(たとえばPharmacia)プラスミドpUC 19か
ら,マルチ クローニング サイト及び付加的に212ヌ
クレオチドを下流にNde I×Hind III断片として除去す
る。次いで生じる裂け目中にプラスミドpBF 158−04−3
Tからの合成マルチクローニング サイトをNde I×Hind
III断片として連結する。このプラスミドpBF 158−04
−3Tが,プラスミドpBF158−02−T(例1di参照)から
オリゴヌクレオチド断片M6の組み込みによって得られ,
断片M7のないプラスミドpBF 158−04Tに相当する。大腸
菌K12 JM103細胞中で形質転換し,150μgアンピシリン/
mlを有する培地上で培養した後,プラスミドpUC19−04
−3を含有するクローンを選択する。これはpUC19と長
さ712ヌクレオチドのNde I×Hind III断片の存在の点で
異なる。
ii)pUC19−04から,Pst I×Sac I断片を除去し,線状化
されたベクターを単離し,オリゴヌクレオチド断片M3と
連結する。大腸菌K12 JM1403中で形質転換し,150μgア
ンピシリン/mlを有する培地上で培養した後,プラスミ
ドpUC19−07を含有するクローンを選択する。これはpUC
19−04−3と,正しい配列を有する断片M3を含有す
る,長さ189ヌクレオチドのPst I×Sac I断片の点で異
なる。
されたベクターを単離し,オリゴヌクレオチド断片M3と
連結する。大腸菌K12 JM1403中で形質転換し,150μgア
ンピシリン/mlを有する培地上で培養した後,プラスミ
ドpUC19−07を含有するクローンを選択する。これはpUC
19−04−3と,正しい配列を有する断片M3を含有す
る,長さ189ヌクレオチドのPst I×Sac I断片の点で異
なる。
iii) 上記プラスミドpUC19−07から,Nde I×Pst I断
片を除去し,裂け目に断片M2を連結する。大腸菌K12 JM
103中で形質転換し,150μgアンピシリン/mlを有する培
地上で培養した後,プラスミドpUC19−08を含有するク
ローンを選択する。これは,pUC19−07と正しく調べられ
た配列を有する長さ246bpのNde I×Pst I断片M2の存在
の点で異なる。
片を除去し,裂け目に断片M2を連結する。大腸菌K12 JM
103中で形質転換し,150μgアンピシリン/mlを有する培
地上で培養した後,プラスミドpUC19−08を含有するク
ローンを選択する。これは,pUC19−07と正しく調べられ
た配列を有する長さ246bpのNde I×Pst I断片M2の存在
の点で異なる。
iv)プラスミドpUC19−08から,断片M2及びM3をNde I×
Sac I断片として除去し,Nde I×Sac Iで切断後に得られ
るpBF158−06Tのより一層大きい部分中で連結する。大
腸菌K12 JM103中で形質転換し,150μgアンピシリン/ml
を有する培地上で培養後,プラスミドpBF158−08Tを含
有するクローンを選択する。これはpBF158−06Tと長さ4
35ヌクレオチドのNde I×Sac I断片の存在の点で異な
る。
Sac I断片として除去し,Nde I×Sac Iで切断後に得られ
るpBF158−06Tのより一層大きい部分中で連結する。大
腸菌K12 JM103中で形質転換し,150μgアンピシリン/ml
を有する培地上で培養後,プラスミドpBF158−08Tを含
有するクローンを選択する。これはpBF158−06Tと長さ4
35ヌクレオチドのNde I×Sac I断片の存在の点で異な
る。
f)プラスミドpBF160の構成,合成Trp−プロモーター
の組み込み。
の組み込み。
Trp−プロモーターの(9)に記載された配列をXda I
−切断部位まで引き継ぎ,5′−末端で配列5′−AATTCT
GAAAT−3′によって伸長する。それによってEco R I−
切断部位を構成する。(第8図,切断M1)。1本鎖021
と021Aをやきもどし,Eco R I×Xda I中で切断されたプ
ラスミドpBF 158−08Tを連結する(第9図)。大腸菌K1
2 JM103中で形質転換し,150μgアンピシリン/mlを有す
る培地上で培養した後,pBF160を含有するクローンを選
択する。プラスミドpBF160は,すべての上記前駆体と,
これで形質転換された大腸菌細菌株がインドールアクリ
ル酸の添加でrscu−PAの初期たん白質を駆出する点で異
なる。
−切断部位まで引き継ぎ,5′−末端で配列5′−AATTCT
GAAAT−3′によって伸長する。それによってEco R I−
切断部位を構成する。(第8図,切断M1)。1本鎖021
と021Aをやきもどし,Eco R I×Xda I中で切断されたプ
ラスミドpBF 158−08Tを連結する(第9図)。大腸菌K1
2 JM103中で形質転換し,150μgアンピシリン/mlを有す
る培地上で培養した後,pBF160を含有するクローンを選
択する。プラスミドpBF160は,すべての上記前駆体と,
これで形質転換された大腸菌細菌株がインドールアクリ
ル酸の添加でrscu−PAの初期たん白質を駆出する点で異
なる。
g)発現テスト i)発酵 種々のプラスミドpBF160で軽質転換された大腸菌株,
たとえば大腸菌GRT−1,大腸菌K12 JM103並びに大腸菌K1
2 ATCC31446を,夫々同一条件下で38mM硫酸アンモニウ
ム,56mMリン酸塩緩衝液pH7.0,1mM硫酸マグネシウム,1%
酵母抽出物,1%ブドウ糖から成る培地−−これは1あ
たり150mgアンピシリンを含有する−−中で発酵し,62mg
インドールアクリル酸/を用いてrscu−PAの初期たん
白質の発現を誘導する。比較として前記プラスミド−−
これはデトロイト562−細胞−m RNA(10)から得られる
cDNA−Bankからヒトプロウロキナーゼに関する遺伝子を
含有し,これは表示pUK 54 trp 207−1である−−を有
する前記菌株を軽質転換し,次いで同一条件下で発酵
し,誘導する。
たとえば大腸菌GRT−1,大腸菌K12 JM103並びに大腸菌K1
2 ATCC31446を,夫々同一条件下で38mM硫酸アンモニウ
ム,56mMリン酸塩緩衝液pH7.0,1mM硫酸マグネシウム,1%
酵母抽出物,1%ブドウ糖から成る培地−−これは1あ
たり150mgアンピシリンを含有する−−中で発酵し,62mg
インドールアクリル酸/を用いてrscu−PAの初期たん
白質の発現を誘導する。比較として前記プラスミド−−
これはデトロイト562−細胞−m RNA(10)から得られる
cDNA−Bankからヒトプロウロキナーゼに関する遺伝子を
含有し,これは表示pUK 54 trp 207−1である−−を有
する前記菌株を軽質転換し,次いで同一条件下で発酵
し,誘導する。
誘導前及び全体の6時間の誘導後の毎時間,578nmで光
学密度(OD)1を有する細胞懸濁液1mlに相当する細胞
を遠心分離し,発現率のテストに使用する。
学密度(OD)1を有する細胞懸濁液1mlに相当する細胞
を遠心分離し,発現率のテストに使用する。
ii)rscu−PAへの初期たんぱく質の逆戻り,そのたん白
質のrtcu−PAへの分解及び活性測定。
質のrtcu−PAへの分解及び活性測定。
遠心分離された細胞を,上述した様に,リゾチームで
溶解し,次いで溶解された細胞の均一物を活性測定のた
めに上述の様に使用する。
溶解し,次いで溶解された細胞の均一物を活性測定のた
めに上述の様に使用する。
rscu−PA(初期たん白質から得られる)から形成され
たrtcu−PAの活性測定によって検出された発現率を,第
10図に示す。これから,プラスミドpBF 160で形質転換
された大腸菌の菌株は,文献上公知のプラスミドpUK54
trp207−1(10)で形質転換された同一の大腸菌−株に
比して10−15倍高い発現収率を生じることが分る。更に
発現収率は,すべての菌株中で形質転換に利用されるプ
ラスミドに依存してほぼ同一値であることが明らかであ
る。すなわち特にプラスミドpBF160で形質転換された菌
株(個々の大腸菌−株と無関係に)は,常に公知のプラ
スミドpUK54 trp207−1で形質転換された同一菌株に比
して数倍だけ高い発現率をもたらすことが明らかであ
る。
たrtcu−PAの活性測定によって検出された発現率を,第
10図に示す。これから,プラスミドpBF 160で形質転換
された大腸菌の菌株は,文献上公知のプラスミドpUK54
trp207−1(10)で形質転換された同一の大腸菌−株に
比して10−15倍高い発現収率を生じることが分る。更に
発現収率は,すべての菌株中で形質転換に利用されるプ
ラスミドに依存してほぼ同一値であることが明らかであ
る。すなわち特にプラスミドpBF160で形質転換された菌
株(個々の大腸菌−株と無関係に)は,常に公知のプラ
スミドpUK54 trp207−1で形質転換された同一菌株に比
して数倍だけ高い発現率をもたらすことが明らかであ
る。
例2 a)Trp−プロモーターの調節下に合成scu−PA−遺伝子
を有すrscu−PAの初期たん白質に関して発現プラスミド
の構成。
を有すrscu−PAの初期たん白質に関して発現プラスミド
の構成。
プラスミドpBR322を,Eco R IとHind IIIで切断する。
生じる長さ31ヌクレオチドの断片を,分取アガロースゲ
ル電気泳動によって分離する。pBR 322の残存する部分
を電気溶離によってゲルから溶離し,グロマトグラフィ
ーによってDE52を介して精製する。
生じる長さ31ヌクレオチドの断片を,分取アガロースゲ
ル電気泳動によって分離する。pBR 322の残存する部分
を電気溶離によってゲルから溶離し,グロマトグラフィ
ーによってDE52を介して精製する。
プラスミドpBF160(例1f)を,同様にEco R I及びHin
d IIIで切断し,長さ1684ヌクレオチドのEco R I×Hind
III断片−−これはすべての調節単位(Trp−プロモー
ター)を有する合成scu−PAを含有する−−をアガロー
スゲル電気泳動によって分離し,上述の様に溶離し,精
製する。
d IIIで切断し,長さ1684ヌクレオチドのEco R I×Hind
III断片−−これはすべての調節単位(Trp−プロモー
ター)を有する合成scu−PAを含有する−−をアガロー
スゲル電気泳動によって分離し,上述の様に溶離し,精
製する。
得られた断片を常法でT4−リガーゼで結合し,次いで
大腸菌K12 JM103中で形質転換する。150μgアンピシリ
ン/mlを有する培地上で培養した後,長さ1684ヌクレオ
チドのEco R I×Hind III断片を含有し,インドールア
クリル酸の添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するク
ローンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF 16
1を含有する。
大腸菌K12 JM103中で形質転換する。150μgアンピシリ
ン/mlを有する培地上で培養した後,長さ1684ヌクレオ
チドのEco R I×Hind III断片を含有し,インドールア
クリル酸の添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するク
ローンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF 16
1を含有する。
b)発現テスト 大腸菌GRT−1,大腸菌K12 JM103及び大腸菌K12 ATCC31
446を,pBF161で形質転換し,次いで例1g)に記載した様
に発酵し,発現結果をテストする。誘発後1〜6時間rt
cu−PA−活性として測定されるrscu−PA−初期たん白質
の収率は,形質転換のためにプラスミドpBF160を使用す
る第10図中に示した収率値と同等である。
446を,pBF161で形質転換し,次いで例1g)に記載した様
に発酵し,発現結果をテストする。誘発後1〜6時間rt
cu−PA−活性として測定されるrscu−PA−初期たん白質
の収率は,形質転換のためにプラスミドpBF160を使用す
る第10図中に示した収率値と同等である。
例1gi)に準じて遠心分離によって得られた細胞−ペ
レットを,0.25MトリスHCl−緩衝液(pH8.0)中で4%SD
S,1%メルカプトエタノール及び20%グリセリンと共に
煮沸しても溶解することができる。この様に溶解された
たん白質を,SDS−PAGEによって分離し,Coo−masieblue
−染色(12)によって視覚化する。染色されたゲルをデ
ンシドメトリーで評価し,ピーク下の面積を積分する。
インドールアクリル酸で誘導された後に形成されたrscu
−PA−初期たん白質の割合を,誘導後の初期たん白質と
して同定されるバンドの面積から誘導前の面積の引き算
によって検出する。第11図中に,大腸菌K12 JM103細胞
から得られるたん白質に関するデンストグラムを示す。
本例中で誘導後のrscu−PA−初期たん白質の割合は,細
菌全たん白質17.9重量%である。他の例は表1中に記載
する。
レットを,0.25MトリスHCl−緩衝液(pH8.0)中で4%SD
S,1%メルカプトエタノール及び20%グリセリンと共に
煮沸しても溶解することができる。この様に溶解された
たん白質を,SDS−PAGEによって分離し,Coo−masieblue
−染色(12)によって視覚化する。染色されたゲルをデ
ンシドメトリーで評価し,ピーク下の面積を積分する。
インドールアクリル酸で誘導された後に形成されたrscu
−PA−初期たん白質の割合を,誘導後の初期たん白質と
して同定されるバンドの面積から誘導前の面積の引き算
によって検出する。第11図中に,大腸菌K12 JM103細胞
から得られるたん白質に関するデンストグラムを示す。
本例中で誘導後のrscu−PA−初期たん白質の割合は,細
菌全たん白質17.9重量%である。他の例は表1中に記載
する。
例3 テトラサイクリン耐性構造遺伝子中で欠失を有するpB
R322に於て,Trp−プロモーターの調節下に合成scu−PA
−遺伝子を有するrscu−PAの初期たん白質に関する発現
プラスミドの構成。
R322に於て,Trp−プロモーターの調節下に合成scu−PA
−遺伝子を有するrscu−PAの初期たん白質に関する発現
プラスミドの構成。
a)プラスミドpBR 322 delの構成 プラスミドpBR322をEcoR VとNru Iで切断する。生じ
る大きさ787ヌクレオチドの断片をアガロースゲル電気
泳動によって除去し,pBR322の残部を電気溶離によって
ゲルから溶離し,DE52を介して精製する。pBR322 EcoR V
×Nru I−残部の平滑−末端を常法でT4−リガーゼと連
結する。大腸菌K12 JM 103中で形質転換し,150μgアン
ピシリン/mlを有する培地上で培養した後,次のクロー
ンを選択する:これらのうち一部分は,25μgテトラサ
イクリン/mlを有する培地上に移した後この培地上で増
殖しない,すなわちテトラサイクリン耐性を有しない。
このクローンは,プラスミドpBR 322 delを含有し,こ
れはpBR 322と,787ヌクレオチド小さいかつEco R V及び
Nru Iによってもはや切断されない点で異なる。
る大きさ787ヌクレオチドの断片をアガロースゲル電気
泳動によって除去し,pBR322の残部を電気溶離によって
ゲルから溶離し,DE52を介して精製する。pBR322 EcoR V
×Nru I−残部の平滑−末端を常法でT4−リガーゼと連
結する。大腸菌K12 JM 103中で形質転換し,150μgアン
ピシリン/mlを有する培地上で培養した後,次のクロー
ンを選択する:これらのうち一部分は,25μgテトラサ
イクリン/mlを有する培地上に移した後この培地上で増
殖しない,すなわちテトラサイクリン耐性を有しない。
このクローンは,プラスミドpBR 322 delを含有し,こ
れはpBR 322と,787ヌクレオチド小さいかつEco R V及び
Nru Iによってもはや切断されない点で異なる。
b)プラスミドpBF 162の構成 pBR322 delをEco R I及びHind IIIで切断する。生じ
る長さ31ヌクレオチドの断片を分取アガロースゲル電気
泳動によって分離し,pBR322 delの残部を電気溶離によ
ってゲルから溶離し,DE52を介して精製する。
る長さ31ヌクレオチドの断片を分取アガロースゲル電気
泳動によって分離し,pBR322 delの残部を電気溶離によ
ってゲルから溶離し,DE52を介して精製する。
pBF160から,1684ヌクレオチド長いEco R I×Hind III
断片−−これはすべての調節単位(Trp−プロモータ
ー)を有する合成scu−PA−遺伝子を含有する−−が同
一方法で得られる。
断片−−これはすべての調節単位(Trp−プロモータ
ー)を有する合成scu−PA−遺伝子を含有する−−が同
一方法で得られる。
2つの断片を,常法でT4−リガーゼと連結し,次いで
大腸菌K12 JM103細胞中で形質転換する。150μgアンピ
シリン/mlを有する培地上で培養後,長さ1684bpのEco R
I×Hind III断片を含有し,62μgインドールアクリル
酸/mlの添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するクロ
ーンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF162を
含有する。
大腸菌K12 JM103細胞中で形質転換する。150μgアンピ
シリン/mlを有する培地上で培養後,長さ1684bpのEco R
I×Hind III断片を含有し,62μgインドールアクリル
酸/mlの添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するクロ
ーンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF162を
含有する。
c)発現テスト 大腸菌GRT−1をpBF162で形質転換し,次いで例1g)
に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。rtcu−
PA−活性として誘導後6時間測定されるrscu−PA−初期
たん白質の収率は,光学密度1を有する細胞懸濁液1300
PU/mlであり,第10図中に大腸菌GRT−1をプラスミドpB
F160で形質転換後の発現に関して示された収率値と同等
である。
に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。rtcu−
PA−活性として誘導後6時間測定されるrscu−PA−初期
たん白質の収率は,光学密度1を有する細胞懸濁液1300
PU/mlであり,第10図中に大腸菌GRT−1をプラスミドpB
F160で形質転換後の発現に関して示された収率値と同等
である。
例4 a)Tac−プロモーターの調節下に,合成scu−PA−遺伝
子を有するrscu−PAの初期たん白質に関して発現プラス
ミドpBF171の構成。
子を有するrscu−PAの初期たん白質に関して発現プラス
ミドpBF171の構成。
プラスミドpBF161をEco R IとXba Iで切断する。生じ
る長さ74ヌクレオチドの断片を分取アガロースゲル電気
泳動によって分離し,プラスミドの残部を電気溶離によ
って溶離し,次いでDE52を介して精製する。
る長さ74ヌクレオチドの断片を分取アガロースゲル電気
泳動によって分離し,プラスミドの残部を電気溶離によ
って溶離し,次いでDE52を介して精製する。
プラスミドptac SDT(DSM 5018)から,Tac−プロモー
ターを含有するEco R I×Xba I断片を単離する。更にpt
ac SDTをEco R I×Xba Iで切断し,断片を分取PAGEによ
って分離する。断片を酢酸アンモニウム/SDS−緩衝液
(pH8.0)中で65℃に加熱して,機械的に粉砕されたポ
リアクリルアミドから溶離し,1Mトリス−緩衝液(pH8)
で飽和されたフエノールで数回抽出して精製する。
ターを含有するEco R I×Xba I断片を単離する。更にpt
ac SDTをEco R I×Xba Iで切断し,断片を分取PAGEによ
って分離する。断片を酢酸アンモニウム/SDS−緩衝液
(pH8.0)中で65℃に加熱して,機械的に粉砕されたポ
リアクリルアミドから溶離し,1Mトリス−緩衝液(pH8)
で飽和されたフエノールで数回抽出して精製する。
2つのこの様にして得られた断片を,常法でT4−リガ
ーゼと連結し,次いで大腸菌K12 JM103中で形質転換す
る。150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養後,I
PTGの添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するクロー
ンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF171を含
有する。
ーゼと連結し,次いで大腸菌K12 JM103中で形質転換す
る。150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養後,I
PTGの添加後rscu−PA−初期たん白質を産生するクロー
ンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF171を含
有する。
b)発現テスト 大腸菌K12 JM103をpBF171で形質転換し,次いで例1
g)中に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。
しかし誘導をIPTGで行う(最終濃度0.5mM)。
g)中に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。
しかし誘導をIPTGで行う(最終濃度0.5mM)。
誘発後1〜6時間のrtcu−PA−活性として測定される
rscu−PA−初期たん白質の収率を,第12図中に示す。こ
れは,プラスミドpBF160を同一の大腸菌株中に使用する
第10図中に示した収率値と同等である。
rscu−PA−初期たん白質の収率を,第12図中に示す。こ
れは,プラスミドpBF160を同一の大腸菌株中に使用する
第10図中に示した収率値と同等である。
例5 a)テトササイクリン耐性構造遺伝子に欠失を有するpB
R322中で,Tac−プロモーターの調節下に合成scu−PA−
遺伝子に関する発現プラスミドpBF172の構成 プラスミドpBR322 del(例3a参照)をEco R I×Hind
IIIで切断する。生じる長さ31ヌクレオチドの断片を分
取アガロースゲル電気泳動によって分離し,pBR322 del
−残部を電気溶離によってゲルから溶離し,次いでDE52
を介して精製する。
R322中で,Tac−プロモーターの調節下に合成scu−PA−
遺伝子に関する発現プラスミドpBF172の構成 プラスミドpBR322 del(例3a参照)をEco R I×Hind
IIIで切断する。生じる長さ31ヌクレオチドの断片を分
取アガロースゲル電気泳動によって分離し,pBR322 del
−残部を電気溶離によってゲルから溶離し,次いでDE52
を介して精製する。
pBF171(例4a)から,Eco R I×Hind III断片−−−こ
れはすべての調節単位(Tac−プロモーター)を有する
合成scu−PA−構造遺伝子を含有する−−−が,同一方
法で得られる。
れはすべての調節単位(Tac−プロモーター)を有する
合成scu−PA−構造遺伝子を含有する−−−が,同一方
法で得られる。
2つのこの様にして選られた断片を,常法でT4−リガ
ーゼと連結し,次いで大腸菌K12 JM103細胞中で形質転
換する。150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養
後,0.5mM IPTG rscu−PA−初期たん白質を産生するクロ
ーンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF172を
含有する。
ーゼと連結し,次いで大腸菌K12 JM103細胞中で形質転
換する。150μgアンピシリン/mlを有する培地上で培養
後,0.5mM IPTG rscu−PA−初期たん白質を産生するクロ
ーンを選択する。このクローンは,プラスミドpBF172を
含有する。
b)発現テスト 大腸菌K12 JM103を,pBF172で形質転換し,次いで例1
a)に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。し
かし誘導をIPTG(最終濃度0.5mM)で行う。誘導後1〜
6時間のrtcu−PA−活性として測定されたrscu−PA−初
期たん白質の収率は,光学密度1の約1100PU/ml細胞懸
濁液であり,プラスミドpBF160を同一大腸菌株中に使用
する第10図中に示した収率値と同等である。
a)に記載した様に発酵し,発現結果をテストする。し
かし誘導をIPTG(最終濃度0.5mM)で行う。誘導後1〜
6時間のrtcu−PA−活性として測定されたrscu−PA−初
期たん白質の収率は,光学密度1の約1100PU/ml細胞懸
濁液であり,プラスミドpBF160を同一大腸菌株中に使用
する第10図中に示した収率値と同等である。
例6 rscu−PA−初期たん白質に関する発現プラスミド中で,S
D配列と開始コドンの間の距離の変化 例1−5に記載した,すべての構造中での開始コドン
ATGは,Nde I−切断部位−CATAG−の成分である。Nde I
は,ヘキサヌクレオチド配列の最初のAの後を切断し,2
つの塩基だけが突出する5′−末端を生じる。3′−末
端を補充する,すなわち平滑末端を構成し,その後再び
連結した場合,当該配列を2塩基対だけ伸長する。同時
にNde I−部位を除く。第13図から明らかな様に,そこ
に記載された例中でS.D.配列から開始コドンまでの距離
を8塩基対から10塩基対に伸長する。下記に実験による
実施を例中で説明する: a)プラスミドpBF 163の構成 プラスミドpBF161をNde Iで切断し,次いで突出する
末端をDNA−ポリメラーゼIのクレノー断片で補充する
(2)。その後DNAを通常T4−リガーゼで連結し,次い
で大腸菌K12 JM103中で形質転換する。アンピシリン含
有培地上で培養後,プラスミドpBF163を含有するクロー
ンを選択する。これはpBF161とNde I−部位の欠損及び
先のNde I−部位の範囲で付加的な塩基−TA−の点で異
なる(第13図参照)。
D配列と開始コドンの間の距離の変化 例1−5に記載した,すべての構造中での開始コドン
ATGは,Nde I−切断部位−CATAG−の成分である。Nde I
は,ヘキサヌクレオチド配列の最初のAの後を切断し,2
つの塩基だけが突出する5′−末端を生じる。3′−末
端を補充する,すなわち平滑末端を構成し,その後再び
連結した場合,当該配列を2塩基対だけ伸長する。同時
にNde I−部位を除く。第13図から明らかな様に,そこ
に記載された例中でS.D.配列から開始コドンまでの距離
を8塩基対から10塩基対に伸長する。下記に実験による
実施を例中で説明する: a)プラスミドpBF 163の構成 プラスミドpBF161をNde Iで切断し,次いで突出する
末端をDNA−ポリメラーゼIのクレノー断片で補充する
(2)。その後DNAを通常T4−リガーゼで連結し,次い
で大腸菌K12 JM103中で形質転換する。アンピシリン含
有培地上で培養後,プラスミドpBF163を含有するクロー
ンを選択する。これはpBF161とNde I−部位の欠損及び
先のNde I−部位の範囲で付加的な塩基−TA−の点で異
なる(第13図参照)。
b)発現テスト 大腸菌GRT−1を,プラスミドpBF163で形質転換し,
次いで例1g)に記載した様に発酵し,発現結果をテスト
する。逆戻りし,62mgインドールアクリル酸/で誘導
後1〜6時間光学密度1を有する細胞懸濁液mlあたりrt
cu−PA−活性として活性化した後に測定されたrscu−PA
−初期単白質の収率を,第14図中に示す。これは,プラ
スミドpBF160を大腸菌の同一株中に使用する第10図中に
示した収率値と同等である。
次いで例1g)に記載した様に発酵し,発現結果をテスト
する。逆戻りし,62mgインドールアクリル酸/で誘導
後1〜6時間光学密度1を有する細胞懸濁液mlあたりrt
cu−PA−活性として活性化した後に測定されたrscu−PA
−初期単白質の収率を,第14図中に示す。これは,プラ
スミドpBF160を大腸菌の同一株中に使用する第10図中に
示した収率値と同等である。
文献 (1)ヴインナカー(Winnacker),E.L.“遺伝子及びク
ローン",VCH出版,ヴアインハイム,1985,第298頁 (2)マニアチス(Maniatis),T.,フリッシュ(Fritsc
h),E.F.,ザムブルック(Sambrook),J.:“分子クロー
ニング",研究所マニュアル,コールドスプリングハーバ
ー研究所,1982 (3)ハナハン(Hanahan),I.:“DNAクローニング",Vo
l.I,ed,D.M.グロバー,IRLプレス,オックスホード1985,
第109−135頁 (4)ウイルヘルム(Wilhelm),M.,ホレンベルグ(Hol
lenberg),C.P.:Nucl.Acids Res.13,5717−5722(198
5) (5)ヨルゲンセン(Jorgensen),R.A.レツニコフ(Re
znikoff),W.S.:J.Bacteriol.138,705−714(1979) (6)シヨルマイヤー(Schollmeier),K.,ゲルトナー
(Gartner),D.,ヒレン(Hillen),W.:Nucl.Acids Res.
13,4227−4237(1985) (7)アダムス(Adams),S.P.,カブカ(Kavka),K.S.,
ヴィケス(Wykes),E.I.,ホルダー(Holder),S.B.,ガ
ルピ(Gallupi),G.R.:J.Am.Chem.Soc.105,661−663(1
983) (8)クリスティ(Christie),G.E.,フアルンハム(Fa
rnham),P.J.,プラト(Platt),T.:Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78,4180−4184(1981) (9)デボーエル(De Boer),H.A.,コムストク(Comst
ock),L.J.,バアサー(Vasser),M.:Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80,21−25(1983) (10)ホームズ(Holmes),W.E.,ペニカ(Pennica),
D.,ブラバー(Blaber),M.,レイ(Rey),M.W.,ギュンツ
エラー(Gunzler),W.A.,シユテフエンス(Steffens),
G.J.,ヘイネッカー(Heyecker),H.L.:Biotechnol.3,92
3−929(1985) (11)ヴィンクラー(Winkler),M.E.,ブラバー(Blabe
r),M.:Biochem.25,4041−4045(1986) (12)ブラケスレイ(Blakesley),R.W.,ボエツ(Boez
i),J.A.:Anal.Biochem.82 580−582(1977)
ローン",VCH出版,ヴアインハイム,1985,第298頁 (2)マニアチス(Maniatis),T.,フリッシュ(Fritsc
h),E.F.,ザムブルック(Sambrook),J.:“分子クロー
ニング",研究所マニュアル,コールドスプリングハーバ
ー研究所,1982 (3)ハナハン(Hanahan),I.:“DNAクローニング",Vo
l.I,ed,D.M.グロバー,IRLプレス,オックスホード1985,
第109−135頁 (4)ウイルヘルム(Wilhelm),M.,ホレンベルグ(Hol
lenberg),C.P.:Nucl.Acids Res.13,5717−5722(198
5) (5)ヨルゲンセン(Jorgensen),R.A.レツニコフ(Re
znikoff),W.S.:J.Bacteriol.138,705−714(1979) (6)シヨルマイヤー(Schollmeier),K.,ゲルトナー
(Gartner),D.,ヒレン(Hillen),W.:Nucl.Acids Res.
13,4227−4237(1985) (7)アダムス(Adams),S.P.,カブカ(Kavka),K.S.,
ヴィケス(Wykes),E.I.,ホルダー(Holder),S.B.,ガ
ルピ(Gallupi),G.R.:J.Am.Chem.Soc.105,661−663(1
983) (8)クリスティ(Christie),G.E.,フアルンハム(Fa
rnham),P.J.,プラト(Platt),T.:Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78,4180−4184(1981) (9)デボーエル(De Boer),H.A.,コムストク(Comst
ock),L.J.,バアサー(Vasser),M.:Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80,21−25(1983) (10)ホームズ(Holmes),W.E.,ペニカ(Pennica),
D.,ブラバー(Blaber),M.,レイ(Rey),M.W.,ギュンツ
エラー(Gunzler),W.A.,シユテフエンス(Steffens),
G.J.,ヘイネッカー(Heyecker),H.L.:Biotechnol.3,92
3−929(1985) (11)ヴィンクラー(Winkler),M.E.,ブラバー(Blabe
r),M.:Biochem.25,4041−4045(1986) (12)ブラケスレイ(Blakesley),R.W.,ボエツ(Boez
i),J.A.:Anal.Biochem.82 580−582(1977)
本発明によるプラスミドを,第1図〜第15図によって示
す: 第1a〜1b図は,市販のプラスミドpBR 322からのプラス
ミドpBF 158の構造を示す。 第2図は,合成“マルチ クローニング サイトのヌク
レオチド配列を示す。 第3図は,プラスミドpBF158−01の構造を示す。 第4図は,プラスミドpBF158−01Tの構造を示す。 第5a〜5g図は,ヒトscu−PAに関して暗号づけする遺伝
子に対する合成断片のヌクレオチド配列を示す。 第6a〜6c図は,プラスミドpBF 158−02T〜pBF158−06の
構造を示す。 第7a〜7c図は,プラスミドpBF 158−08Tの構造を示す。 第8図は,合成Trp−プロモーターのヌクレオチド配列
を示す。 第9図は,ヒトrscu−PAの初期たん白質に関する発現プ
ラスミドの構造pBF 160を示す。 第10図は,Trp−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第11図は,pBF 161で形質転換された大腸菌K12 JM103−
細胞からのたん白質のSDS−PAGEのデンシトグラムを示
す。 第12図は,Tac−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第13図は,SD−配列と開始コドンATGとの間の距離を8か
ら10塩基に伸長することを示す。 第14図は,Trp−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第15a〜15b図は,scu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列を示す。
す: 第1a〜1b図は,市販のプラスミドpBR 322からのプラス
ミドpBF 158の構造を示す。 第2図は,合成“マルチ クローニング サイトのヌク
レオチド配列を示す。 第3図は,プラスミドpBF158−01の構造を示す。 第4図は,プラスミドpBF158−01Tの構造を示す。 第5a〜5g図は,ヒトscu−PAに関して暗号づけする遺伝
子に対する合成断片のヌクレオチド配列を示す。 第6a〜6c図は,プラスミドpBF 158−02T〜pBF158−06の
構造を示す。 第7a〜7c図は,プラスミドpBF 158−08Tの構造を示す。 第8図は,合成Trp−プロモーターのヌクレオチド配列
を示す。 第9図は,ヒトrscu−PAの初期たん白質に関する発現プ
ラスミドの構造pBF 160を示す。 第10図は,Trp−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第11図は,pBF 161で形質転換された大腸菌K12 JM103−
細胞からのたん白質のSDS−PAGEのデンシトグラムを示
す。 第12図は,Tac−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第13図は,SD−配列と開始コドンATGとの間の距離を8か
ら10塩基に伸長することを示す。 第14図は,Trp−プロモーターの調節下にヒトrscu−PAの
初期たん白質の発現率を示す。 第15a〜15b図は,scu−PA−構造遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウオルフガング・ヒレン ドイツ連邦共和国、エルランゲン、クリ ステイアン‐エルンスト‐ストラーセ、 26 (72)発明者 ゲルト・ヨット・シユテフエンス ドイツ連邦共和国、アーヒエン、ムーフ フエター・ウエーク、50 (72)発明者 ウオルフガング・シユトラスブルガー ドイツ連邦共和国、ウユルゼレン、ア ン・デン・クエレン、32 (72)発明者 マルテイン・エル・エフ・ウイルヘルム ドイツ連邦共和国、デユツセルドルフ、 オットー‐ハーン‐ストラーセ、195 (56)参考文献 Agric.Biol.Chem., 52(2),1988,p.329−336 Nucreic Acids Res earch 13(5),1985,p.5717 −5722 J.Biochem,101,1987,p. 525−534 Nucreic Acids Res earch 10(21),1982,p.6639 −6657 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (20)
- 【請求項1】1本鎖のウリン−プラスミノーゲンアクチ
ベーターを収得するのに使用するプラスミドに於て,そ
のオペロンは,調節可能なプロモーターとしてTrp−又
はTac−プロモーター,リボソーム結合部位として有効
なSD配列(Shine−Dalgarno−Sequenz),開始コドン,4
11アミノ酸残基を含有し、かつアルギニンに関してはト
リプレットCGT,ロイシンに関してはトリプレットCTG,バ
リンに介してはトリプレットGTT,プロリンに関してトリ
プレットCCG及び(又は)グリシンに関してはトリプレ
ットGGTをコドンとして使用する、1本鎖のウリン−プ
ラスミノーゲンアクチベーター“scu−PA"に関する合成
構造遺伝子及びTn 10からのtrp Aターミネーター及び
(又は)tet A/orf Lターミネーターより成る群から選
ばれた1〜2個のターミネーターをこの構造遺伝子の下
流に有し、かつこのプラスミドは腸内細菌中で,好まし
くは大腸菌株中でのrscu−PA−初期プロティン−発現に
適することを特徴とする、上記プラスミド。 - 【請求項2】大腸菌、好ましくは亜族大腸菌K12の株中
に産生された全たん白質10〜25重量%の発現率でrscu−
PA−初期たん白質の合成を生じさせる、請求項1記載の
プラスミド。 - 【請求項3】1本鎖のウリン−プラスミノーゲンアクチ
ベーターを収得するのに使用するプラスミドに於て,そ
のオペロンは,調節可能なプロモーターとしてTrp−又
はTac−プロモーター,リボソーム結合部位として有効
なSD配列(Shine−Dalgarno−Sequenz),開始コドン,4
11アミノ酸残基を含有し、かつアルギニンに関してはト
リプレットCGT,ロイシンに関してはトリプレットCTG,バ
リンに介してはトリプレットGTT,プロリンに関してトリ
プレットCCG及び(又は)グリシンに関してはトリプレ
ットGGTをコドンとして使用する、1本鎖のウリン−プ
ラスミノーゲンアクチベーター“scu−PA"に関する合成
構造遺伝子及びTn 10からのtrp Aターミネーター及び
(又は)tet A/orf Lターミネーターより成る群から選
ばれた1〜2個のターミネーターをこの構造遺伝子の下
流に有し,かつ大腸菌、好ましくは亜族大腸菌K12の株
中に、形成された全たん白質10〜25重量%の発現率でrs
cu−PA−初期たん白質の合成を生じさせることを特徴と
する,上記プラスミド。 - 【請求項4】1本鎖のウリン−プラスミノーゲンアクチ
ベーター“scu−PA"に関する合成構造遺伝子において、
アルギニンに関してはトリプレットCGT,ロイシンに関し
てはトリプレットCTG,バリンに介してはトリプレットGT
T,プロリンに関してトリプレットCCG及び(又は)グリ
シンに関してはトリプレットGGTをコドンとして使用す
る、請求項3記載のプラスミド。 - 【請求項5】SD配列と開始コドンの間の距離は、6−1
2,好ましくは8−10ヌクレオチドである、請求項1ない
し4のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項6】調節可能なプロモーターは、第8図による
ヌクレオチド配列を有する合成Trp−プロモーターであ
る、請求項1ないし5のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項7】調節可能なプロモーターは、プラスミドpt
acSDT(DSM 5018)に由来するTac−プロモーターであ
る、請求項1ないし5のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項8】構造遺伝子は第15図によるヌクレオチド配
列を有する請求項1ないし7のいずれかに記載したプラ
スミド。 - 【請求項9】nic/bom−領域が除かれたプラスミドpBK 3
22中にオペロンを有する請求項1ないし8のいずれかに
記載したプラスミド。 - 【請求項10】オペロンをプラスミドpBK 322中に有
し,このプラスミドからテトラサイクリン耐性遺伝子の
全部又は一部は,このプラスミドがこれを用いて形質転
換される菌株にエトラサイクリン耐性を与える能力がな
い程度に除かれている、請求項1ないし8のいずれかに
記載したプラスミド。 - 【請求項11】オペロンをプラスミドpBR 322中に有
し,このプラスミドからnic/bom−領域は除かれ及びこ
のプラスミドは,これを用いて形質転換される菌株にテ
トラサイクリン耐性を与える能力のない,テトラサイク
リン耐性遺伝子の少なくとも1個の部分が除かれてい
る、請求項1ないし9のいずれかに記載したプラスミ
ド。 - 【請求項12】合成Trp−プロモーターの調節下に合成s
cu−PA−遺伝子を有するプラスミドpBF 160pBF 161,pBF
162及びpBF 163である、請求項1ないし4又は6のい
ずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項13】プラスミドptac SDT(DSM 5018)に由来
するTac−プロモーターの調節下に、合成scu−PA−遺伝
子を有するプラスミドpBF 171,pBF 172及びpBF 173であ
る、請求項1ないし4又は7のいずれかに記載のプラス
ミド。 - 【請求項14】制限酵素地図1t(第9図)を有するプラ
スミドpBF 160である、請求項1ないし4のいずれかに
記載のプラスミド。 - 【請求項15】大腸菌,好ましくは亜族大腸菌K12の株
中に産生された全たん白質14〜20重量%の発現率を有す
るrscu−PA−初期たん白質の形成を生じさせる、請求項
1ないし14のいずれかに記載したプラスミド。 - 【請求項16】nic/bom−領域及び(又は)少なくとも
1個のテトラサイクリン耐性遺伝子の部分が除かれたプ
ラスミドpBR 322中に、切断部位Eco R IとHind IIIとの
間に第2図に記載したヌクレオチド配列を有する“マル
チ クローニングサイト”を挿入し、これを用いて公知
の方法で転写ターミネーター、scu−PA−構造遺伝子の
合成部位配列、好ましくは構造遺伝子の3′C−終点か
ら開始する配列、並びに合成Trp−プロモーターを組み
込むことを特徴とする、請求項1又は3記載のプラスミ
ドの製造方法。 - 【請求項17】請求項16に従って得られたプラスミドか
らのEco R I×Hind III断片を,発現カセットとして腸
内細菌中,好ましくは大腸菌中で自律的増殖可能な、そ
の他のプラスミド中に公知の方法で挿入する請求項1な
いし4のいずれかに記載のプラスミドの製造方法。 - 【請求項18】請求項16又は17に従って得られたプラス
ミドをNde Iで切断し、生じる切断部位を補充し、次い
で生じる平滑末端を連結する、SD−配列と開始コドンと
の間の伸長された距離を有する、請求項1ないし5のい
ずれかに記載のプラスミドの製造方法。 - 【請求項19】プラスミドを用いて腸内細菌−株,好ま
しくは大腸菌株を公知方法で形質転換し,scu−PA−構造
遺伝子の発現を誘導し,形成されたscu−PA−初期たん
白質から培地及び溶解された細菌細胞を分離し,初期た
ん白質を溶解し,次いでレドックス−系の作用によって
rscu−PAに戻すことを特徴とする,プラスミノーゲンア
クチベーターの収得において請求項1ないし15のいずれ
かに記載のプラスミドを使用する方法。 - 【請求項20】プラスミドを用いて大腸菌−種,好まし
くは大腸菌−K12−株を形質転換し,次いで請求項19に
従って処理する、プラスミノーゲンアクチベーターの収
得において請求項1ないし15のいずれかに記載のプラス
ミドを使用する方法。
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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DE4101736A1 (de) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Gruenenthal Gmbh | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
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