JPS6188881A - ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 意」ししΩｍ汰Ｉ一 本発明は、ヒト表皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦと略記）製
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。

より具体的にはｈＥＧＦに対応する合成遺伝子およびそ
れを含むＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した宿主およびこ
れらを用いるｈＥＧＦの製造法に関する。

従】鵠と皮哲− ｈＥＧＦは主として十二指腸や顎下線から分泌される５
３個のアミノ酸から成るポリペプチド・ホルモンであり
、胃酸分泌抑制ならびに表皮細胞増殖促進作用を有する
。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用は十二指腸潰瘍の治療薬とし
ての可能性を示すものである６さらにｈＥＧＦは細胞の
膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合して、多方面的な
生体反応を惹起せしめることが知られている（Ｄ、Ｇ。

ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ＋Ｐｈｙｓｉ
ｏ１．４３　２５１（１９８１））、ＥＧＦによって誘
起される反応は腫瘍ウィルスの発癌遺伝子産物によって
誘発される反応と同一で、ＥＧＦの生体内での役割や細
胞増殖調節機構を解明することは発癌機構を探る上から
も興味あることと考えられている。しかし、天然に存在
するｈＥＧＦは極めて微量であるため１組換えＤＮＡ技
術による生産が注目されるようになった。ｈＥＧＦ遺伝
子をヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極め
て困難なため、未だにｈＥＧＦのＤＮＡ配列は決定され
ていない。

一方、既に決定されているｈＥＧＦのアミノ酸配列［Ｈ
，Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ　　２５７３２５（’
７５））を基にして、化学的に合成した構造遺伝子を微
生物において発現させる例は知られている。しかし、Ｅ
ＧＦは比較的低分子のペプチドであり、菌体内で異物と
して認識され、酵素分解され易い点を考慮して、融合ペ
プチドとして発現させている（Ｊ、Ｓｍ１ｔｈら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１
且　４４６７　（’８２））。また融合ペプチドから不
要部分を除去する方法も提示されているが、極めて不確
実なものにすぎない（スチーブン・ジェームス・ブルウ
アーら、特開昭５８−２１６６９７）、ｈＥＧＦそのも
のを発現させた例は酵母の系において知られているが［
Ｍ、　Ｓ、　Ｕｒ　ｄ　ｅ　ａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、ｓｃｉ。

ＵＳＡ　”１度、７４５１　　（’８３））、その発現
量は非常に低く、酵母の増殖速度が遅いことと相まって
大量生産には適していない。

日が　“　しよ゛とする口 上記のようにｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列は未だ解明さ
れておらず、またｈＥＧＦのアミノ酸配を基にして合成
した対応遺伝子を種々の系で発現させる試みもあるが、
融合ペプチドとして発現させる方法ではその操作上の煩
雑さ、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融合ペ
プチドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例では
、その生産量は極めて低く実用的なものではなかった。

問題点を解決するための手 本発明者らはｈＥＧＦを効率よく生産させる方法を提供
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した宿主、
それらによるｈＥＧＦの製造法を確立し、本発明を完成
したものである。

ｈＥＧＦのＤＮＡ配列として従来採用されていたものは
、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるもの
であったが、このたび本発明者等はこのような人間とは
かなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く異
なった、人間により近いネズミのＥＧＦ　（ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。

ｈＥＧＦはネズミのそれ（Ｊ、５ｃｏｔｔら、５ｃｉｅ
ｎｃｅ、２２１　２３６（’８３））と比較すると、ア
ミノ酸配列において７０％の相同性があり、アミノ酸の
異なっている部分もその大部分はコドンのｏｎｅ　　ｐ
ｏｉｎｔ　　ｍｕｔａ−ｔｉｏｎによって導びかれるも
のである。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列はネ
ズミのそれと極めて良く似ているものと推定される。一
般にアミノ酸配列からＤＮＡ配列を導くと、コドンの縮
重によって多数のＤＮＡ配列が可能となる。そこで合成
遺伝子の配列を決定する基準として、発現系の細胞にお
いて最も容認されたコドンを採用するのが通例となって
いる〔池原森男ら、生命工学研究レポート　２．７　（
１９８３））。

しかし最近の知見によると、原核生物において真植生物
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい（Ｍ、Ｈ，Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　５ｅｒｉ
ｅｓ　　１上　１９７（’８２））。遺伝子の発現を高
めるための因子としては多くのものが挙げられるが、構
造遺伝子に対応するｍＲＮＡの安定性ならびに翻訳効率
も重視される。この場合ｍ　ＲＮ　Ａの塩基配列が決定
する高次構造が重要な意味を持つと推定される。

これらの点を考慮するとｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列を
アミノ酸配列を変えない範囲でネズミのＥＧＦ遺伝子に
類似させるべきであろう、実際にこの考え方でｈＥＧＦ
遺伝子をデザインしたところ。

ネズミのそれに対して９０％近い相同性を持たせること
が可能であった。しかし、目的とする遺伝子を正確に構
築するためには、さらにＤＮＡＮ玉鎖上ける比較的長い
自己相補性の存在あるいは二重鎖ＤＮＡ間での正常でな
い相補性を最小限にすべきである。これらの条件を満足
させるためにコンピューターを利用して若干の修正を施
し、第１図に示すような、ｈＥＧＦの製造に最も適した
新規なりＮＡ配列を見出した。第１図にはＤＮＡ配列に
加えてアミノ酸配列を示す。

該遺伝子は融合ペプチドとして発現させることもできる
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。

前者の場合は、ｈＥＧＦの合成遺伝子の５′末端側に開
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。

後者の直接発現に用いるには第２図に示すように、ｈＥ
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ、停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ　　ＲＩ、Ｂａｍ　ＨＩ付
着末端とし、それ以外にも遺伝子操作上の多様性を持た
せるために構造遺伝子の後半部にＢｇｌＩＩの認識部位
を設ける。

また３′末端の下流にはＰｓｔ　　Ｉの認識部位を設け
ることもできる。以上の修正を施すと、ネズミのＥＧＦ
　（ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相同性となる。

本発明のｈＥＧＦ遺伝子の合成に当っては、例えば第２
図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２個のフ
ラグメントに分割したが、ここでフラグメントの自己会
合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己相補的
配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮＡフラ
グメントを示す。このフラグメントへの分割の仕方は上
記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のものに限
定される必要はなく、種々の分は方が可能である。

各ＤＮＡフラグメント（＃１〜＃２２）は既知の合成法
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて５
′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２乃
至３群に分けてハイブリダイズさせＤＮＡリガーゼによ
って二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリガ
ーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子が
得られた（第４図参照）。

これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
る消化物と結合させ、新規プラスミドｐＴＢ３６１を得
、大腸菌ＤＨＩを形質転換する。

単離したプラスミドについてＤＮＡフラグメントの一部
をプライマーとしてＳａｎｇｅｒ法によって塩基配列を
決定し、目的とするｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。

本発明の合成遺伝子を発現するに際しては、プラスミド
、バクテリオファージなどのベクターに挿入した組換え
ＤＮＡとして用いることが好ましＶ）。

上記組換えＤＮＡは前記した開始コドンＡＴＧの上流に
プロモーターを有しているのが好ましく。

該プロモーターは、形質転換体の製造に用いる宿主に対
応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよ
い。

たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ　　
＋　　；　　例、　　２９４．　　Ｗ３１　１　０．　
　ＤＨＩ、　　Ｎ４８３０など）ではｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒａｃ　　Ａプロモーター、
入ＰＬプロモーターｒ　　ＩＰＰプロモーター、など、
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ；例、
ＭＩ　　１１４など）ではＳＰＯ１プロモーター。

５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰ　　プロモーターなど
、酵母（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ；例、Ａ３２２など）ではＰＨ０５プロモーター、
ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロ
モーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯ３−７，チ
ャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなと）ではＳＶ４０由
来のプロモーターなどが挙げられる。とりわけ宿主が大
腸菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたは入ＰＬ
　プロモーターであることが好ましい。

ｈＥＧＦ合成逍伝子の転子の一例を次に述べる（第５図
参照）。

ｐＴＢ３６１からＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉで切り出され
る１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐｔｒｐ７８
１のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ部位に組込み、Ｐｔｒｐ支配
下の発現用ベクターｐＴＢ３７０を得た。

一方、ｐＴＢ３６１のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｂ　ａ　ｍ
　ＨＩ消化によって得られる１７９塩基対のＤＮＡを発
現用ベクターｐＴＢ２８１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部
位に組込みＰＬ支配下の発現用ベクターＰＴＢ３７２と
した。

ｐＴＢ３７０を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、生育
するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別し
、目的ｈＥＧＦ遺伝子を含む株を得た。

ｐＴＢ３７２の場合には、温度感受性大腸菌Ｎ４８３０
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたｐＴＢ３７２で大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換して合成遺伝子の発現を行フた。

これら形質転換株を培養し、菌体を７Ｍグアニジン処理
した液中に含まれるｈＥＧＦを〔′Ｊｒ１）で標識され
たｍ　Ｅ　Ｇ　Ｆとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞
ＥＧＦ受容体結合アッセイにより定量したところ、大腸
菌ＤＨＩ／ｐＴＢ３７０によって約２　ｍ　ｇ　／　１
以上の産生量を示した（第１表参照）。この発現量は大
腸菌におけるｈＥＧＦの直接発現としては注目すべきも
のである。

旦 本発明ではｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列として、発現系
の細胞において最も容認されたコドンを採用するのでな
く、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において類似し
たｍＥＧＦの遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ配列と高い相同性を有
するＤＮＡ配列とすることによって、ｍＲＮＡの安定性
、翻訳効率、ｍ　ＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造
の影響が良好なものとなって、ｈＥＧＦが効率よく生産
される。

また本発明では構造遺伝子の後半部にＢｇｌＵ、３′末
端近くにＰｓｔ　　Ｉの認識部位を有することによって
、遺伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にしたり、
数種類のベクターに果せることができる等、遺伝子操作
上の有利さ、多様性を発揮し得るものである。

そして本発明で提供するｈＥＧＦ遺伝子は新規なりＮＡ
配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近いネズミ
のＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するもの
で、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本発明によ
り初めてｈＥＧＦを大腸菌を宿主とした系で直接発現さ
せることが可能となった。更に本発明のｈＥＧＦに対応
する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術により、ｈＥ
ＧＦをより効率よく製造することができ、治療薬として
のｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での役割や細胞
増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解明に役立つ
ものである。

失凰五五主旦匁玉 次に本発明を実施例により説明する。

なお以下に開示する形質転換体　エシェリヒアコリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＤＨｌ　／　ｐ　
Ｔ　Ｂ　３７０およびエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＤＨＩ／ｐＴＢ３７２、ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
それぞれＩＦＯ−１４３７９およびＩＦＯ−１４３８０
として、また昭和５９年１０月５日から通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−７８８３およびＦＥＲＭ　　Ｐ−７８８４
として寄託されている。

実施例１．ＤＮＡフラグメントの合成 りＮＡフラグメントはフォスフオトリエステル法による
固相合成（Ｉ　ｔ　ｏ、　Ｈ，ら　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、上０，１７５５　（１９８２
））で、各々合成した。また、原料となるダイマーブロ
ックは、Ｂｒｏｋａらの方法 （Ｂｒｏｋａ、Ｃ，ら　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
、８，５４６１　　（１９８０））に従い合成したもの
、あるいは市販品（和光純薬工業）の完全保護ダイマー
を、ピリジン（Ｐｙ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、
水（３：　１　：　１．ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シ
アノエチル基を除去後、ペンタン、エーテル（１：　１
．ｖ／ｖ）の混液中で、粉末としたものを用いた。ＤＮ
Ａフラグメントの合成手順は次の通りである。

ジメトキシトリチルヌクレオシドを付着させた２　５ｍ
ｇの１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の試薬で順
次処理した。

（１）ジクロルメタン中３％（ｗ／ｖ）ｈリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）　　（Ｔ　ａ　ｎ　ａ　ｋ　ａ　、　Ｔ、ら
　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、１０．３２４９
（１９８２））で１分×２（２回同じ操作を行ったこと
を示す） （２）ジクロルメタン　　　×４ （３）ピリジン　　　　　　×３ （４）２０ｍｇのジヌクレオチドブロック又は３０ｍｇ
のモノマーブロックを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジン （５）上記溶液を減圧上濃縮（ピリジン共沸）（６）２
５ｍｇのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリッド（
Ｍ　Ｓ　Ｎ　Ｔ　）および５　ｍ　ｇのニトロトリアゾ
ールを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジンで４０°Ｃｌ２Ｏ
分間 （７）ピリジン　　　　　　×２ （８）１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および０．１Ｍジメチ
ルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２ｍ
ｌで２分間 （９）ピリジン　　　　　　×２ （１０）ジクロルメタン　　×３ 適当なジヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた０合成完了後、
０．５Ｍの１．１，３．３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−アルドキシム（Ｒｅ　ｅ　ｓ　ｅ、Ｃ
，Ｂ、らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、２７
２７（１９７８））で４０°Ｃ，１４時間処理し、重合
体担体より目的物を取り出し、次に濃アンモニア水で６
０°Ｃ１４時間処理して、ジメトキシトリチル基以外の
保護基をすべて除いた。この試料を逆相のＣＦｒシリカ
ゲル（リクロプレップＲＰ−８．メルク社）のカラム（
グ３．ＯＸ２．Ｏｃｍ）にかけ、３０％アセトニトリル
で溶出した分画を、８０％酢酸で室温、１５分間処理し
た。エーテル洗浄後、さらにイオン交換高速液体クロマ
トグラフィー（パーティジル１０ＳＡＸ、ワットマン社
）で精製［Ｇａ１ｔ。

Ｍ、Ｊ、ら　Ｊ、Ｃ，Ｓ、＋Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、
、３７　　（１９８２））を行ない、純粋なりＮＡフラ
グメン１〜を得た。この様にして合成した２２種のＤＮ
Ａフラグメントは第３図に示した通りである。

実施例２　オリゴＤＮＡのリン酸化 各々のＤＮＡフラグメントを２５　、、１のリン酸化反
応液〔オリゴＤＮＡ２．５．”ｇ、５０ｍＭＴｒ　ｉ　
５−ＨＣＩ、ｐｌ（７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．
１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール。

１ｍＭ　　ＡＴＰ、２．５ユニツトＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造）〕中で、３７℃、１時間反応させ
、５′末端をリン酸化した。この反応液をこのまま凍結
し、融解後、次の反応に用いた。

実施例３　　ＤＮＡフラグメントの連結ｈＥＧＦ３ａ仏
子の２重鎖植成の１連の段階は第４図に示した通りであ
る（図中−印は５′末端水酸基がリン酸化されているこ
とを示す）。たとえばブロック■の連結は次の様にした
。１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２に各々対応す
る）の実施例２の操作で得たＤＮＡフラグメントのリン
酸化反応液を５．−１ずつ加え、６０、−１とした。

これに１．４ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造）
を加え、１４℃で２５時間インキュベートした後、６５
°Ｃで１０分間処理し、反応をとめた。

ここで主生成物となったブロックＩの２Ｍ体を、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（全酒造）で消化するため
に、この反応液に次の３成分を５０ｍＭ　　ＮａＣ１，
０，０１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、７ｍＭＭｇＣ
１２になるように加え、１２０ユニツトのＥｃｏＲＩで
３７℃、１．５時間反応させ、６％含有アクリルアミド
ゲルを用いて、緩衝液（ｐＨ８，３）　［１００ｍＭ　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、１００ｍＭホウ酸、　２　ｍ　
ＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　：１中、２５ｍＡで１．５時間電気
泳動にかけた。泳動後、０．６ｍｇ／ｌのエチジウムブ
ロマイド（ＥｔＢｒ）でゲルを染色し、１０１ｂｐのＤ
ＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動
用緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出
した（Ｊ、　Ｍｏ　Ｌ、　Ｂ　ｉ　ｏ　１．．１１０゜
１１９　（１９７７））。この透析チューブ内液を０、
ＯＩＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、（ｐＨ７，６）。

０、ＩＭＮａＣｌおよびＯ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡで飽和
したフェノールで３回抽出し、さらにエーテル抽出した
後、Ｎ　ａ　Ｃ１を０，２Ｍとなるように加えた。続い
て２倍量の冷エタノールを加えて、−２０°ＣでＤＮＡ
を沈澱させた。以上と同様の操作によってさらにブロッ
クｎ（＃Ｉ３から＃２２を含む）を調製した。

実施例４　　ｈＥＧＦ遺伝子のクローニング（第５図）
クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐ　ＢＲ
３２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０　、、　
ｌの反応液Ｃ１０ｍ　Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ　
。

ｐｌ−１８，０，７ｍＭ　Ｍｇｃ１２，１００ｍ〜１Ｎ
ａＣ１，２ｍＭ２−メルカプトエタノール。

０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１９ユニツ
トのＥｃｏＲ，Ｉ（全酒造）、５ユニツトのＢａｍＨＴ
（全酒造）〕中、３７°Ｃ１１時間反応させた後、水で
３倍稀釈し、６５°Ｃで１０分間処理し、酵素を失活さ
せた。この反応液０．５Ｐ１と約２０当量のＤＮＡフラ
グメントブロックＩおよび■とを混合し、６６ｍＭＴ　
ｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１２，１０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＤＴ）およ
び１　ｍ　ＭＡＴＰ存在下、１０□ｌの反応液として、
１４°Ｃ１２時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイングラン
ド・バイオラボ社製）を作用させて、ｈＥＧＦ遺伝子を
プラスミドに結合させた。

この反応液を用い、既知の方法に従い、大腸菌Ｄ）（１
株（Ｓｅ　ｌ　ｓｏｎ、　Ｍ、　Ｅ、ら　Ｎ　ａ　ｔ　
ｕｒｅ、２１７．１１１０　１１１４　　（１９６８）
）を形質転換させた。すなわち、−７０℃で保存してい
た５　０　Ｐｌのコンピテントセル（Ｈａｎａｈａｎ＋
　Ｄ、ｒ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋　１６６゜５５７
　（１９’８３））をｏ　’ｃ、１５分間インキュベー
トした後、４．．１の上記反応液を添加した。

さらに０°Ｃ１３０分間インキュベートした後、４２℃
、１．５分間おき、さらに０°Ｃで５分間おいた。この
反応液に２００．．１のＬＢ培地（１１当リバクトトリ
プトンｌｏｇ、バク１−イースト抽出物５ｇ、ＮａＣ１
８ｇを含む）を加え、３７°Ｃ１５０分間インキュベー
トした。この大腸菌を３５）−ｇ　／　ｍ　ｌのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、３７℃で１晩培養
した。生じたアンピシリン耐性コロニー中、６０株を選
び、さらに７．−ｇ　／　ｍ　１のテトラサイクリンを
含むＬＢ寒天培地に接種したが、５９株ははえなかった
。次にこの５９株中１６株を選択し、この転換株のプラ
スミドＤＮＡをアルカリ法［Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　
ｓ、　Ｔ。

ら　　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
　（Ｃ。

ｌｄ　　Ｓｐｒ　ｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｕｒ）、３６８
−３６９　（１９８２）］により粗精製し、Ｅｃ。

ＲＩおよびＢａｍＨＩ消化、さらにＥ　ｃ　ｏ　ＲＩお
よびＢｇｌＩＩ消化、ＰｓｔＩ消化した。これら消化物
の２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１４株が
正しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株であるこ
とがわかった。この様にして得たクローニングベクター
をｐＴＢ３６１と名付けたにのプラスミドｐＴＢ３６１
を持つ大腸菌０８１組み換え体の１白金耳を、３５．”
ｇ／ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１．５ｍｌに
接種し、３７℃で一夜、振盪培養した。この培養液０．
３ｍｌを２００ｍ１フラスコに分注した２５ｍ１の同じ
培地に加え、３７°Ｃ１６，５時間振盪培養した後、こ
の培養液を５００　ｍ　ｌフラスコに分注した同培地１
２５ｍ１に加え、さらに４５分間振盪培養した。次にク
ロラムフェニコールを１７０Ｐｇ　／　ｍ　ｌになるよ
うに添加し、さらに−夜培養をつづけ、プラスミドＤＮ
Ａの増幅をはかった。この培養液１５０ｍ１を、６００
０ｒｐｍ、４℃。

９分間遠心分離し、得られた菌体を生理食塩水で洗浄し
、４ｍｌの反応液（２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　、
　　ｐ　Ｈ８、０、５０ｍ　Ｍグルコース、１０ｍＭ　
ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム〕を加え、懸濁した
。水中で２０分間おいた後、８　ｍ　ｌのアルカリ溶液
〔１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２ＮＮａＯＨ）を添加し
、水中で５分間したら、６ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム緩衝
液（ｐＨ４，８）を加え、１０分間水中でおき、１０．
ＯＯＯｒｐｍで４°Ｃｌ２Ｏ分間遠心分離した。得られ
た上澄液に２倍量のエタノールを加え、振盪した後、−
２０℃で１０分間おき、１０．００Ｏｒｐｍで４℃、２
０分間遠心分離した。沈殿物を風乾後、４ｍｌの緩衝液
（１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０））に溶かし
、塩化セシウム（ＣｓＣ１）を３．９ｇ、ＥｔＢｒを３
　ｍ　ｇ加え、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターで３５
．ＯＯＯｒｐｍ、１５℃、６４時間Ｃ５ｃｌ−ＥｔＢｒ
平衡密度勾配遠心分離にかけた。

プラスミドＤＮＡのバンドを集め、２倍量の緩衝液（１
ｍＭ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０，１０ｍＭ　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、ｐＨ８，０）を加え、等量のクロ
ロホルム−フェノール（１：　１　、　ｖ／ｖ）を加え
て２回洗浄し、ＥｔＢｒを除去後、エタノール沈殿を行
なった。さらに沈殿物を０．６ｍｌの緩衝液（１ｍＭ　
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、ｐＨ８，
０，６，３ＭＮａＣ１）に溶かし、もう一度エタノール
沈殿を行なった。

ここで単離したプラスミドｐＴＢ３６１に組み込まれて
いるｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの方
法（Ｗａ　ｌ　ｌ　ａ　ｃ　ｅ、　Ｒ。

Ｂ、ら　Ｇｅｎｅ、　１６．２ｌ−２６（１９８１））
に従った。すなわち、ｐＴＢ３６１ＤＮＡを１０、、、
ｌの反応液（７ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、ｐＨ７，
５，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ　ＮａＣｌ。

４ユニツトのＰｖｕＩＩ　（全酒造）〕中、３７°Ｃ１
１時間反応させた。この反応液にプライマーとしてＤＮ
Ａフラグメント＃７の水溶液（１，０Ａ２６０／　ｍ　
ｌ　）　　１、−１を加え、１００°Ｃで５分加熱後、
水浴で急冷した。以後の操作はジデオキシ法の一般法ど
おりで行なった。同様にして、プライマーにＤＮＡフラ
グメント＃１４、ｔｔ１８を用いてｈＥＧＦ遺伝子の塩
基配列が正しいことを確Ｊ１３した。

実施例５　　ｈＥＧＦの発現用プラスミドの構築ならび
に形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例４で得られた１０□ｇのｐＴ８３６１を
反応液（５０ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、　６　ｍ　Ｍ　
Ｔ　ｒｉ　　　ｓ　　　　　ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　　
　、　　　６ｍＭ　　　ＭｇＣｌ２　　　。

６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＳ
Ａ、５０ユニットＥｃｏＲＩ、１０ユニツトＰｓｔＩ（
全酒造）〕中、３７℃、１．５時間反応させた後、２％
アガロースゲル電気泳動により１７２ｂｐＤＮＡ断片を
常法（前述）に従って精製した。一方、発現用ベクター
にはｐｔｒｐ７８１　［Ｋｕｒｏｋａｗａ、　Ｔ、ら　
Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、１上、３０７７−
３０８５（１９８３））を使用した。ｐｔｒｐ７８１Ｄ
ＮＡを上記と同様にして、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＰｓ
ｔＩ消化し、この反応液に２倍量の水を加え、６５℃で
１０分間おき、酵素を失活させた。

この様にして得た１７２ｂＰＤＮＡおよびプラスミドＤ
ＮＡは各々、両端にＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化およびＰｓｔ
ｌ消化により生じた単鎖の付着端を有する。

これら両者を混合し、６６ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，５，６，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭＤ
ＴＴおよび１ｍＭ　ＡＴＰ存在下、１４°Ｃ１５，５時
間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＦ２社）を作用させてＤＮＡ
を結合し、前出と同様な方法で大腸菌ＤＨＩ株を形質転
換させた。次にこの大腸菌を７　、”　ｇ　／　ｍ　ｌ
のテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、３７
°Ｃで１日培養した。生じたテトラサイクリン耐性コロ
ニーを、次に３５Ｐｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地に接種し、はえない転換株を選び出した
。さらに前出と同様な方法で、転換株のプラスミドＤＮ
ＡをＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、さらに
８ｇ１■およびＨｉｎｄｍで消化して、ｈＥＧＦ遺伝子
が正しく挿入された転換株を選択した。この様にして得
た発現用プラスミドをｐＴＢ３７０と、また形質転換体
をエシェリヒア　コリ　ＤＨＩ／ｐＴＢ　３７０と名づ
けだ。

１１）入ＰＬプロモーター遺伝子を持つ発現用ベクター
は次の様にして構築した（第６図）プラスミドｐｔｒｐ
６０１　［黒用　勉、学位論文東京大学（１９８３））
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩで切断した後、生
じた単鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅ
ｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ）でうめ、フェノール処理し、
エタノール沈殿を行なった。この直鎖状ＤＮＡを１４°
ＣでＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて環状ＤＮＡとし、
前出と同様な方法で大腸菌を形質転換させ、これよりｔ
ｒｐプロモーター下流がＥｃ。

ＲＩとなったプラスミドを単離し、、ｐＴＢ５６と名付
けた。

次にこのプラスミドｐＴＢ５６をＰｖｕＩＩで消化し直
鎖状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼな
った。この反応物をＥｃｏＲＩで消１ヒした後、２％ア
ガロースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子
を含む約０．２８ｋ　ｂ　ｐ　ＤＮＡ断片を定法に従っ
て精製した。

一方、ｐＢＲ３２２ＤＮＡをＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化して
直鎖状ＤＮＡとした後、５″末端のリン酸基をアルカリ
性フォスファターゼ処理により除去し、前記０．２８ｋ
ｂｐＤＮＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４°ＣでＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌を形
質転換させ、これよすｔｒｐプロモーターがｐ　ＢＲ３
２２のＥｅｏＲ１部位にクローニングされたプラスミド
を単離し、ｐＴＢ５７と名付けた。

次にこのプラスミドｐＴＢ　５７をＥｃｏＲＩで部分消
化して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同様の操作で処理
し、片方のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ認識部位をつぶし、環状Ｄ
ＮＡとした後、大腸菌を形質転換させ、得られたコロニ
ーよりプラスミドを得、制限酵素の切断でのパターンよ
りｔｒｐプロモーターの上流側にあるＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ
認識部位がなくなったプラスミドをｐＴＢ９１と名付け
た。

さらにプラスミドｐＴＢ９１をＥｃｏＲＴで消化後、単
鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼ■でうめ、合成オリゴ
ヌクレオチド（ＢｇｌＵリンカ−）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、ｔｒｐプロモーター遺伝子の
下流にＢｇｌ　　ＩＩ認識部位を導入し、このプラスミ
ドをｐＴＢ３３４と名づけだ。

この様にして得たｐＴＢ５７とｐＴＢ　３３４を用い、
ｔｒｐプロモーターの上流にＥｃｏＲＩ認識部位、およ
び下流にＢｇｌ　　ＩＩｎ認識部位持つプラスミドを構
築した。まずｐＴＢ３４４を制限酵素Ｈｐａ　　Ｉおよ
びＰｓｔＩで切断した後、２％アガロースゲル電気泳動
により約０．７８ｋｂｐＤＮＡ断片を溶出精製した。

またｐＴＢ５７も同様の制限酵素で切断した後、１％ア
ガロースゲル電気泳動により、３．８５ｋｂｐＤＮＡ断
片を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得ら
れたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断での
パターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択した
。これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付け
た。

次に入ＰＬプロモーターを持つプラスミドｐＡＤ３２９
　（Ａｄｈｙａ、Ｓ、ら　Ｃａｌ　ｌ、　２９゜９３９
−９４４　（１９８２））より、入ＰＬプロモーター遺
伝子を持つ０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離した。ま
ずプラスミドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌＩＩおよび
ＨｐａＩで消化後、２％アガロースゲル電気泳動にかけ
、約０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出ｖＩ製した。次
いでこの０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＨ４ｎｆ　　Ｉ
により部分消化した後、２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した。

この様にして得た０、３５ｋｂｐのＤＮＡ断片は両端に
ＢｇｌＩＩ消化およびＨｉｎｆＩ消化により生じた付着
端を有する。

一方、プラスミドｐＴＢ３４０を制限酵素Ｂｇ１■およ
びＥｃ　ｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気
泳動にかけ、約４．３５ｋｂｐＤＮＡを溶出し、精製し
た。ここで得られたＤ　Ｎ　Ａは両端にＢｇｌＩＩ消化
およびＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化により生じた付着端を有す
る。この様にして得られた入ＰＬプロモーター遺伝子を
含む０．３５ｋｂｐＤＮＡ断片と約４．３５ｋｂｐのＤ
ＮＡとを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状ＤＮＡとした
後、大腸菌を形質転換させ、これより入ＰＬプロモータ
ーを持ち、その上流にＢｇｌ　　ｎ認識部位、下流にＥ
ｃｏＲＩ認識部位を有するプラスミドを単離し、これを
ｐ　Ｔ　Ｂ　２８１と名付けた。

これを用いてｈＥＧＦの発現用プラスミドを構築した（
第５図）。まず実施例４で前述したプラスミドｐＴＢ３
６１　１０Ｐｇを反応液〔１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ。

ｐＨ８，０，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ｍＭ　　２−メル
カプトエタノール、０．０１％ＢＳＡ、５０ユニットＥ
ｃｏＲＩ、２０ユニットＢａｍＨＩ　　（全酒造）〕中
、３７°Ｃ１１，５時間反応させた後、２％アガロース
ゲル電気泳動により、ｈＥＧＦ遺伝子を含む１７９ｂｐ
のＤＮＡ断片を溶出し、精製した。一方、プラスミドｐ
Ｔ８２８１も上記と同様にしてＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよび
ＢａｍＨＩ消化し、２借景の水を加えて６５°Ｃ１１０
分間おき、酵素を失活させた。これら両者を混合し、１
４℃でＴ４　ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合
した。

大腸菌の形質転換は次の様に行なった。大腸菌Ｎ４８３
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の−晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。；３７°Ｃで２
時間振盪培養した後３，３００ｒｐｍ、４°Ｃ，８分間
遠心分ｍし、得られた菌体を１０ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄
した。これに５０ｍＭ　ＣａＣｌ２溶液を添加し、水中
で１５分間おき、３．３０Ｏｒｐｍで４℃、４分間遠心
分離し、もう一度５０　ｍＭ　Ｃａ　Ｃｌ　２に懸濁し
た。この１００Ｐ１に想濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記
で得た反応液７）−１を添加し、０℃、４５分間インキ
ュベートした。次いで３７℃、２分間インキュベートし
、９０　ＯＮ］のＬＢ培地を加えた後、３０℃で１時間
インキュベー１−シた。この大腸菌を３５　／−ｇ　／
　ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、
３０°Ｃで一晩培養した。生じたアンピシリン耐性コロ
ニーは、すべて７．−ｇ／ｍｌのテトラサイクリンに対
する耐性能をなくしていた。

次に、この転換株の一部からプラスミドＤＮＡをとり、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌ
ＩＩ消化により、ｈＥＧＦ遺伝子の正しく挿入された転
換株を選択した。この様にして得たプラスミドをｐＴＢ
３７２と名づけだ。

上記で得られたｐＴＢ　３７２を次に前述同様の操作に
よりｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ（レプレッサー）（Ｂｅｒｎ
ａｒｄ、Ｈ，ら　Ｍ　ｅ　ｔ　ｈ　ｏ　ｄ　ｓｉｎ　　
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　　６８，４８２−４９２　
（１９７９））を含有する大腸菌ＤＨＩ株の形質転換に
用い、得られた形質転換体を３５　Ｐｇ／　ｍ　ｌのア
ンピシリンおよび７　ｐ　ｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイ
クリンを含有するＬＢ寒天培地上にまき。

３０°Ｃで一晩培養した。生じたコロニーから前述同様
に得たプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し。

そのパターンよりｈＥＧＦ遺伝子を含む形質転換株を選
び、これをエシェリヒアコリ　ＤＨＩ／ＰＴＢ３７２．
ＰＲＫ２４８ｃＩｔｓと名づけだ。

実施例６　　ｈＥＧＦの製造法 ｉ）エシェリヒアコリ　ＤＨＩ／ｐＴＢ３７０を７　、
”　ｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地
中、３７°Ｃで一晩振盪培養した。この培養液０゜５ｍ
ｌに７　戸ｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイクリンを含む１
０ｍ１のＭ９培地〔０，４％カザミノ酸、１％グルコー
スを含む〕を加え、３７℃、４時間振盪培養した後、３
β−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて３０　Ｐ
ｇ　／　ｍ　ｌとなるようにしだにのまま、さらに４時
間培養を続けた後、この培養液１０．５ｍｌを７．ＯＯ
Ｏｒｐｍ、４°Ｃ１１０分間遠心分射し、得られた菌体
を一７０℃で凍結した。これを溶解後、１ｍｌの反応液
（７Ｍグアニジン塩酸塩、２ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、０．ＩＭ　Ｔｒ　ｉ　
５−ＨＣＩ、ＰＨ７，０）中、０℃、１時間インキュベ
ートした。この反応液を２０．００Ｏｒｐｍ、４°Ｃ１
３０分間遠心分離し、得られた上溌液をＴＥＮ　（２０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、ｐＨ８，０゜１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣ１）１１に対して４°Ｃで
２回透析し、析出した不溶物を２０゜０００ｒｐｍ、４
°Ｃ１３０分間の遠心分離で除去した。この様にして得
られた溶液は一２０°Ｃで保存した。

ｉｉ）エシェリヒアコリ　ＤＨＩ／ｐＴＢ３７２゜ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５　Ｐｇ　／　ｍ　ｌのアンピシ
リンおよび７　Ｐｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイクリンを
含むＭ９培地中、２９℃で一晩振盪培養した。この培養
液０．５ｍｌに３５戸ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを
含む１０ｍ１のＭ９培地を加え、２９°Ｃで４時間振盪
培養し、続いて４２°Ｃで２時間振盪培養を続けた後、
前述と同様な処理を行ない、得られた溶液は一２０°Ｃ
で保存した。

上記ｉ）、ｉｉ）で得られた各生産物をラジオレセプタ
ーアッセイ法（ＲＲＡ法）（Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、ら　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７２．１３１７−１３２１　　（１９７５））
で分析した。

ＥＧＦ活性は、同じ活性を示す精製マウスＥＧＦ標準の
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０　（ｆ　ｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、市販）を１０％の牛胎児血清を含む
ダルベツコ・ミニマル・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地
を用いて、直径１．６ｃｍの細胞培養用ディツシュ（Ｌ
ｉｎｂｒｏ、Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、市販）で培養した。この培地を捨て、０．１％
ＢＳＡを含むＤＭＥ　Ｍ　Ｊ’ｆＪ地で釉胞を洗浄後、
０．２ｍｌの同培地と、クロラミンＴ法によりｔ）Ａ−
１でラベルしたマウスＥＧＦ（’Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ　　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、市販）５βｇ
、および上記テ得た各生産物を適量加え、３７℃で１時
間培養した。

次に同培地で洗浄後、０．２ＮＮａＯＨで処理し、チュ
ーブへ移し、ＦＡＲカウンターで、とりこまれた　■を
測定した。同様の操作で重量既知のマウスＥＧＦとの競
合反応により得られた検量曲線より、生産物中のヒトＥ
ＧＦ量を算出した。結果は第１表に示した。

またエシェリヒアコリ　ＤＨＩ／ｐＴ８３７０株を培養
し、ＩＡＡで誘導後、すでに記載した方法で融解物中の
ＥＧＦ活性を発育とあわせて測定した。その結果を第７
図に示した。図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧＦ
活性を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はｈＥＧＦに対応する本発明の合成遺伝子のＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図であり、第２図は
本発明のｈＥＧＦ遺伝子合成の際のＤＮＡフラグメント
への分割の一例を示した図であり、第３図は本発明のｈ
ＥＧＦ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡフラグメントの一例
を示す図であり、第４図は第３図の各ＤＮＡフラグメン
トを連結してｈＥＧＦ合成遺伝子を製造する模式図であ
る。第５図は本発明のｈＥＧＦ対応合成遺伝子を組込ん
だ発現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミ
ドｐＴ、Ｂ２８１の構築図である。第７図は本発明方法
の一例における菌体の発育とＥＧＦ活性を示すグラフで
ある。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
   子を有するＤＮＡ。
2. （２）複数個のオリゴデオキシヌクレオチドを酵素的に
   連結し、所望によりベクターに挿入することを特徴とす
   る、ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
   子を有するＤＮＡの製造法。
3. （３）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
   子を有するＤＮＡによって形質転換した宿主。
4. （４）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
   子を有するＤＮＡによって形質転換した宿主を増殖させ
   ることを特徴とするヒト表皮細胞増殖因子の製造法。