DK171278B1 - DNA-Sekvens, vektor omfattende en sådan sekvens, værtsorganisme transformeret med en sådan vektor og fremgangmåde til fremstilling af et protein eller peptidprodukt ved hjælp deraf - Google Patents

Description

i DK 171278 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt DNA-sekvens og en hidtil ukendt vektor omfattende en sådan sekvens. Opfindelsen angår desuden en værtsorganisme transformeret med en sådan vektor og en frem-5 gangsmåde til fremstilling af et ønsket protein eller peptidprodukt i nativ form ved hjælp af en sådan værtsorganisme.

I de senere år har udviklingen indenfor rekombi-nant-DNA-teknikken gjort det muligt at eksprimere en 10 lang række klonede fremmede gener i værtsorganismer, såsom bakterier og gærsvampe. Man har anvendt to hovedmetoder.

ved den ene metode er ekspressionen af det fremmede gen blevet sat under direkte kontrol af i værtsor-15 ganismen tilstedeværende ekspressionskontrolsekvenser, f.eks. en coli-promotor og Shine-Delgarno-sekvens, til opnåelse af ikke-sammensmeltede fremmedprotein og polypeptid-produkter. Denne metode har imidlertid forskellige mangler.

20 Højniveauekspression i coll af mange eukaryo- tiske gener har vist sig vanskelig, selv når en stærk promotor, såsom coll-XPL- eller Trp-promotoren og Shine-Delgarno-sekvensen fra et i høj grad eksprimeret E. coll-gen er blevet anvendt foran den fremmede gen-25 sekvens. Disse vanskeligheder opstår øjensynlig, fordi den sekundære struktur af mRNA'et i nærheden af Shine-Delgarno-sekvensen påvirker tilgængeligheden af mRNA til ribosomet og følgelig translationseffektiviteten. Da den sekundære struktur afhænger af den sekvens, som følger 30 efter startkodonet, dvs. den fremmede gensekvens, fører sådanne konstruktioner ofte til ringe translationseffektivitet.

Desuden har mange proteiner eksprimeret i coli en ekstra methionin-aminosyrerest ved deres N-ende, hid-35 rørende fra det ATG-startkodon i 5'-enden af det fremmede gen, som kræves til at initiere translation. Tilstedeværelsen af dette ekstra N-terminale methionin er uønsket, da det kan påvirke stabiliteten og aktiviteten af 2 DK 171278 B1 proteinet og, hvis proteinet skal anvendes klinisk, kan fremkalde antigenecitetsproblemer.

Direkte eksprimerede fremmede genprodukter, navnlig når de er forholdsvis små polypeptider såsom visse 5 hormoner, undergår endvidere ofte proteolytisk omgruppering inde i værtsorganismens celler. Dette fører til meget lave akkumulationsmængder af det fremmede genprodukt i værtsorganismecellerne.

Ved en alternativ metode er mange eukaryotiske 10 proteiner blevet produceret i stor mængde i Ε^_ coli i form af hybridfusionsproteiner opnået ved sammensmeltning af den fremmede gensekvens med kodesekvensen i et i høj grad eksprimeret E^_ coli-gen, såsom lacZ-, tufB-, bla-, XCII- og XN-genet. I sådanne konstruktioner giver 15 videreforløbet af translationen fra det bakterielle gen høj translationseffektivitet. Tilstedeværelsen af bakteriel protein sammensmeltet med det fremmede genprodukt kan endvidere gøre fusionsproteinet bestandigt mod proteolytisk omgruppering og kan også sørge for rumoptagel-20 se af fusionsproteinet inde i værtsorganismecellerne eller dets sekretion derfra. Ved fusionsproteinekspression kan potentielt biofarlige materialer, såsom peptidhormoner, desuden produceres i en inaktiv "pro-form", som derpå efterfølgende kan aktiveres in vitro ved spe-25 cifik spaltning.

Sådanne hybridfusionsproteiner selv er imidlertid ikke normalt egnede som slutprodukter, f.eks. til klinisk anvendelse, og det er nødvendigt at spalte fusionsproteinet specifikt til frigørelse af det fremmede gen-30 produkt i nativ form. Specifikke enkelte eller dobbelte aminosyre-spaltningssteder er blevet tilvejebragt i fusionsproteiner ved sammenføjningsstedet mellem E_j_ coli-proteinet og det eukaryotiske protein. Man har f.eks. anvendt kemisk behandling med bromcyan til spaltning ved 35 enkelte methionin-aminosyrespaltningssteder, og man har anvendt enzymatisk behandling med trypsin til spaltning 3 DK 171278 B1 ved enkelte arginin- eller lysin- eller dobbelte argi-nin-arginin- eller lysin-lysin-spaltningssteder. Sådanne enkelt eller dobbelt gentagne aminosyre-spaltningssteder har imidlertid kun begrænset anvendelighed, da spalt-5 ningsbehandlingen, hvis spaltningssted-aminosyrerne er til stede i det fremmede genprodukts aminosyresekvens, vil føre til såvel uønsket spaltning af det fremmede protein som spaltning ved sammenføjningsstedet med fusionsproteinet .

10 I EP offentliggørelsesskrift nr. 0 035 384 (The

Regents of the University of California) beskrives anvendelsen af specifikke spaltningslinkere på sammenføjningsstedet mellem værts- og fremmed-DNA-sekvenser ved konstruktionen af rekombinant-DNA-sekvenser, der koder 15 for fusionsproteiner. Disse indbefatter spaltningslinkere, der koder for forlængede specifikke spaltningssekvenser, som omfatter en sekvens af mindst to forskellige aminosyrer, der tilvejebringer et specifikt enzymspaltningssted. Jo større antallet af aminosyrerester i 20 den specifikke spaltningssekvens er, desto mindre er sandsynligheden for, at der forekommer en lignende sekvens i det fremmede genprodukts aminosyresekvens, og desto lavere er således risikoen for, at der sker uønsket spaltning af det fremmede protein. I EP offentlig-25 gørelsesskrift nr. 0 035 384 er der specielt beskrevet anvendelsen af en spaltningslinker med sekvensen X-(Asp)n- Lys-Y, hvor n = 2-4, hvilken sekvens spaltes specifikt af enterokinase på carboxylsiden af Lys. De i EP offentliggørelsesskrift nr. 0 035 384 beskrevne 30 spaltningssteder er imidlertid ikke helt tilfredsstillende til anvendelse ved spaltning af fusionsproteiner. Det er f.eks. blevet eftervist (Anderson et al., Biochemistry 1_6, 3354-(1977)), at enterokinase spalter proco-coonase ved peptidbindingen, der følger efter sekvensen 35 Gly-Gly-Lys, og det ser således ud til, at enterokina-sespaltning ikke er unikt afhængig af sekvensen 4 DK 171278 B1 X-(Asp)n-Lys-Y.

Man har nu udfundet forbedrede spaltningslinkere til anvendelse ved konstruktionen af rekombinant-DNA-sekvenser, der koder for fusionsproteiner. Hver linker 5 koder for et enzymspaltningssted, der omfatter en sekvens af fire forskellige aminosyrer. Disse spaltningssekvenser findes sjældent i andre proteinsekvenser, og disse spaltningssteder vil således være egnede til anvendelse ved spaltningen af en meget lang række af re-10 kombinant-fusionsproteiner. Endvidere fremgår det, at spaltning ved hjælp af enzymet på disse steder ikke er afhængig af den totale tredimensionale proteinstruktur, som det kan være tilfældet med andre forlængede specifikke spaltningssekvenser såsom de, der er blevet fore-15 slået tidligere, men er strengt sekvensspecifikke.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der følgelig en DNA-sekvens, der er ejendommelig ved, at den koder for aminosyresekvensen X-Y-Gly-Arg 20 der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa, og hvori X er Ile, Leu, Pro eller Ala, og Y er Glu, Asp, Gin eller Asn.

Opfindelsen angår desuden en vektor, der er ejendommelig ved, at den omfatter en DNA-kodesekvens, 25 som koder for aminosyresekvensen X-Y-Gly-Arg, der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa, hvilken DNA-kodesekvens er fusioneret til en DNA-sekvens, der koder for et ønsket protein eller peptidprodukt, og i hvilken aminosyresekvens X er 30 Ile, Leu, Pro eller Ala, og Y er Glu, Asp, Gin eller Asn.

Hensigtsmæssige former for vektoren ifølge opfindelsen er angivet i krav 5-7.

Opfindelsen angår endvidere en værtsorganisme, 35 der er ejendommelig ved, at den er transformeret med en vektor ifølge opfindelsen.

5 DK 171278 B1

Opfindelsen angår ydermere en fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket protein eller peptidprodukt i nativ form, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man 5 transformerer en værtsorganisme med en vektor ifølge et vilkårligt af kravene 4-7, eksprimerer det ønskede protein eller peptidprodukt som et fusionsprotein, der omfatter det ønskede protein eller peptidprodukt fusioneret til den C-ter-10 minale ende af et faktor xa-spaltningsted, og spalter fusionsproteinet med faktor Xa til opnåelse af det fremmede genprodukt i nativ form.

I den foreliggende beskrivelse refererer udtrykket "i nativ form" til et polypeptid eller protein, som 15 omfatter aminosyresekvensen deraf uden yderligere amino-syrerester, f.eks. yderligere N-terminale aminosyrerester, såsom en N-terminal methionin-aminosyrerest eller N-terminale værtsprotein-aminosyrerester.

I den foreliggende beskrivelse refererer desuden 20 udtrykket blodkoagulationsfaktor Xa til en vilkårlig aktiveret blodkoagulationsfaktor X, heruder faktor Xa afledt fra et vilkårligt mammalia-individ eller en vilkårlig rekombinant-kilde. Disse omfatter især bovinfaktor Xla og bovinfaktor x2a* 25 Blodkoagulationsfaktor X er proenzymet for en serin-protease, faktor Xa (E.C.3.4.21.6), der aktiverer prothrombin til thrombin ved specifik begrænset proteo-lyse ved bindingerne Arg (274) -Thr (275) og Arg (323) -Ile (324). I prothrombin ligger der forud for begge 30 spaltningssteder det samme tetrapeptid, Ile-Glu-Gly-Arg, der er blevet foreslået som en deternant for faktor Xa-substrat-genkendelse (Magnusson, S. et al., Proteases and Biological Control (Eds. Reich, E., Rifkin, D. B. og Shaw, E.) 123-149, Cold Spring Harbor Laboratory, New 35 York, 1975). Nogle af de peptidsekvenser, der vides at blive spaltet af faktor Xa, er anført i nedenstående tabel l.

6 DK 171278 B1

Tabel 1

Peptldbindinder, der vides at blive spaltet af blodkoa-gulationsfaktor Xa - - P4-P3- P2* Pi= Pi '* P2P3' "V *"' Substrat * —Ilfi-Gk><2y-ArgtøMfi --- QZCF>^-gldbin - - - -Il£-G!i><Ily-Ar^Thp-Ala-Thrv-Ser--- humant prothrcxribin -—Ile-Glj>GljHAr^Thr^er^jli>^D - - · bovint prothrcrnbin 1 g ---- humant prothrarifcin ----ne-Gk>^yHAr^ne-V,al--Gli>GIy--- bovint prothrcrrbin

.ALa<2i>(2yrArg=A^-A^-ieu-^'r--- humant antithraribin III

Proteolytisk spaltning ved hjælp af blodkoagulationsfak-15 tor Xa finder sted mellem stederne Pj^ og Ρ^'.

Faktor Xa-spaltning af nativt prothrombin er identisk med spaltning af chymotryptiske peptider indeholdende de i tabel 1 anførte peptidsegmenter (Magnusson 20 et al. supra, Magnusson et al., Proteolysis and Physiological Regulation, Eds. Ribbons, D. W. og Brew, K., 203-238, Academic Press, New York 1976).

Der er også blevet udført arbejde med produktionen af chromogene substrater til anvendelse ved bestem-25 melsen af faktor Xa. I denne henseende kan der henvises til: "Chromogenic Substrates based on the Primary Structure of Prothrombin-Especially intended for the Determination 30 of Factor Xa activity", Aurell, L, et al., Peptides 1976 (Proceedings of the Fourteenth European Peptide Symposium, Wépion, Belgium, April 11-17, 1976, 191-195, 1976; 7 DK 171278 B1 "A New Sensitive and Highly Specific Chromogenic Peptide Substrate for Factor Xa", Aurell, L, et al., Thrombosis Research, 11, 595-609, 1977; 5 New chromogenic Peptide Substrates for Factor Xa", Aurell, L, et al., Haemostasis, 7, 92-94, 1978; og

Small Synthetic Peptides with Affinity for Proteases in Coagulation and Fibrinolysis: An Overview", Claeson, G, 10 and Aurell, L, Annals of the New York Academy of Sciences, 370, 798-811, 1981.

Dette arbejde har vist, at specifik spaltning med forøget hastighed kan opnås, hvis P3-resten er Gin frem-15 for Glu, og at specifik spaltning med formindsket hastighed kan opnås, hvis P4-resten er Leu eller Pro fremfor Ile eller R3-resten er Asn fremfor Glu.

Det har desuden vist sig, at peptidbindingen, der følger efter Ala-Glu-Gly-Arg i et chrymotryptisk peptid 20 fra antithrombin III, også spaltes af faktor Xa.

Det ser derfor ud til, at den til genkendelse af faktor Xg krævede struktur bestemmes af den lokale sekvens på spaltningsstedet. Hver af de ovenfor omtalte sekvenser indeholder arginin og glycin på henholdsvis 25 Pj- og P2-stedet og en glutaminsyre- eller asparaginsy-re- eller glutamin- eller asparagin-rest på P3-stedet. Isoleucin på P4-stedet bevares i alle faktor Xa-spalt-ningssteder i humant og bovint prothrombin, men af de andre data fremgår det, at spaltningskravet muligvis kun 30 kan være for en lille hydrofob rest på P4-stedet.

DNA-Sekvensen ifølge opfindelsen er som nævnt en sekvens, der koder for aminosyresekvensen 8 DK 171278 B1 X-Y-Gly-Arg hvori X er Ile, Leu, Pro eller Ala, og Y er Glu, Asp, Gin eller Asn. Mere foretrukket gælder det, at X er Ile, og Y er Glu eller Gin. Mest foretrukket er DNA-sekvensen 5 en sekvens, der koder for aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg, der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa.

De i DNA'et tilstedeværende specifikke nucleoti-der vil afhænge af den særlige aminosyresekvens på 10 spaltningsstedet og den genetiske kode. I betragtning af den genetiske kodes overtallighed kan der således anvendes flere forskellige DNA-sekvenser til at kode for et enkelt spaltningssted. En særlig DNA-sekvens kan vælges under hensyn til, hvilke kodoner værtsorganismen fore-15 trækker at bruge, og/eller for at lette DNA-manipulatio-nerne, f.eks. for at tilvejebringe bekvemme endonu-clease-restriktionssteder. Eksempler på DNA-sekvenser, der koder for Ile-Glu-Gly-Arg-spaltningsstedet, er

ATC GAG GGT AGG

20 og

ATT GAA GGT CGT

Den første af de ovennævnte sekvenser er særlig nyttig derved, at hvis kodonet CCT føjes til det, dannes restriktionsstedet for endonucleasen Stu 1, idet spalt-25 ning finder sted mellem AGG- og CCT-kodonet.

Vektorerne ifølge opfindelsen kan omfatte den DNA-sekvens, der koder for faktor Xa-spaltningsstedet uden associerede fusionsprotein-kodesekvenser, såsom vektoren M13mpllFX som specielt beskrevet nedenfor. Så-30 danne vektorer frembyder en kilde for DNA-sekvens, der koder for spaltningsstedet og typisk omfatter passende endonuclease-restriktionssteder til at muliggøre udskæring af spaltningssted-kodesekvensen eller kloning af andre DNA-sekvenser, f.eks. en fremmed gensekvens, til 35 konstruktion af fusionsproteinvektorer. F.eks. frembyder Stul-stedet i M13mpllFX et passende sted til kloning af 9 DK 171278 B1 kodesekvenser.

Vektorerne ifølge opfindelsen omfatter imidlertid fortrinsvis fusionsprotein-ekspressionsvektorer, der karakteristisk indeholder et fremmed gen fusioneret til 5 en DNA-sekvens, der koder for et faktor Xa-spaltnings-sted. Pusionsproteinet kan således omfatte en N-terminal methionin-aminosyrerest sammenknyttet via faktor Xa-spaltningssekvensen med et fremmed genprodukt. Mere almindeligt omfatter fusionsproteinet imidlertid en værts-10 proteinsekvens fusioneret til et fremmed genprodukt via en faktor Xa-spaltningssekvens, og tilsvarende vektorer omfatter værtsprotein-kodesekvenser fusioneret via faktor Xa-spaltningssted-kodesekvensen til en fremmedpro-tein-kodesekvens. Typisk fusioneres værtsprotein- og 15 spaltningssted-aminosyre-kodesekvenserne til N-enden af fremmedprotein-kodesekvensen.

Det er klart, at det kan være nødvendigt at tilføje yderligere nucleotidrester til faktor Xa-spalt-ningssekvensen for at bringe fremmedproteinsekvensen i 20 den korrekte læseramme med hensyn til vektorens startkod on.

Ekspression af proteiner i de med fusionsproteinekspressionsvektorer ifølge opfindelsen transformerede værtsceller fører til produktion af fusionsproteiner, 25 som omfatter i det mindste et ønsket fremmed protein eller peptid, hvortil der er knyttet faktor Xa-spalt-ningssekvensen. Almindeligvis omfatter fusionsproteinet i det mindste en del af et værtsprotein knyttet til det ønskede fremmede protein eller peptid via faktor Xa-30 spaltningssekvensen.

Under anvendelse af fusionsprotein-ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen kan der fremstilles et vilkårligt fremmed genprodukt. Sådanne produkter kan indbefatte eukaryotiske, f.eks. mammaliale, polypepti- 10 DK 171278 B1 der og proteiner, herunder enzymer, serumproteiner, f.eks. β-glubin, og peptid-hormoner og precursorer herfor, f.eks. calcitonin-glycin.

Et vilkårligt egnet værtsprotein eller en del 5 heraf kan anvendes til fusionsproteinekspression. Som eksempler på egnede bakterielle værtsproteingener kan der nævnes lacZ-, tufB-, trpE-, trpD-, bla-, XCII- og CAT-generne.

Opfindelsen er i vid udstrækning anvendelig til 10 produktion af rekombinant-fusionsproteiner i værtsorganismer i almindelighed, herunder gærceller og mammaliale celler. Opfindelsen er imidlertid særlig anvendelig til bakterielle værtsceller, herunder Bacillus-værtsceller eller specielt E_^ coli-værtsceller. De til fremstilling 15 af DNA-sekvenserne ifølge opfindelsen anvendte metoder og procedurer, f.eks. oligonucleotid-syntese, fremstillingen af vektorer, transformationen af værtsorganismer og ekspressionen af fusionsproteiner, er velkendte indenfor rekombinant-DNA-teknikken.

20 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen spaltes et fusionsprotein, der er eksprimeret af med en fusionsprotein-ekspressionsvektor transformede værtsceller, ved behandling med aktiveret faktor X til opnåelse af det fremmede genprodukt i nativ form. Der kan anvendes en 25 vilkårlig egnet blodkoagulationsfaktor Xa, herunder human faktor Xa eller fortrinsvis bovin faktor Xa.

Proenzymet, faktor X, kan let fremstilles ud fra humant, bovint eller andet mammalialt blodplasma. F.eks. kan faktor X isoleres i en biokemisk ren form og fri for 30 kontaminerende proteaser efter adsorption fra bovint plasma på uopløselige bariumsalte efterfulgt af et chro-matografisk trin (Fujikawa et al., Biochemistry 11, 4882-4891, (1972)). Der kan anvendes en vilkårlig egnet aktivering til omdannelse af proenzymet til dets aktive 35 form, dvs. faktor Xa, herunder aktivering med Russell's 11 DK 171278 B1 slangegift eller immobiliseret trypsinaktivitet. Ved anvendelse af fra bovint plasma isoleret faktor Xa ved et molforhold mellem enzym og substrat på ca. 1:100 har det vist sig, at fusionsproteindigestionen var fuldendt 5 indenfor 2 timer. Efter spaltning kan fremmede genprodukter udvindes og i øvrigt behandles som ønsket.

I almindelighed har det vist sig, at aminosyre-sekvensen i det fremmede genprodukt ikke i signifikant grad påvirker spaltningseffektiviteten. I betragtning af 10 resultater opnået med andre serinproteaser antages det imidlertid, at faktor Xa ikke vil spaltes, når en pro-lin-aminosyrerest følger umiddelbart efter argininresten på faktor Xa-spaltningsstedet.

Ved behandling med aktiveret faktor X spaltes 15 fusionsproteinerne fortrinsvis, fortrinsvis i det væsentlige udelukkende, ved den peptidbinding, der følger efter arginin-aminosyreresten på faktor Xa-spaltnings-stedet, til frigørelse af det fremmede genprodukt i na-tiv form. Behandling med aktiveret faktor X kan således 20 anvendes til at spalte en N-terminal methionin-amino-syrerest eller værtsprotein-aminosyresekvenser sammen med faktor xa-spaltningssted-aminosyresekvens fra fremmedgenprodukt-aminosyresekvenserne.

Under visse omstændigheder kan det vise sig, at 25 det ønskede fremmede protein indeholder en aminosyrese-kvens, der er modtagelig for spaltning ved hjælp af faktor xa. I sådanne tilfælde kan det ikke desto mindre være muligt at anvende fremgangsmåden ifølge opfindelsen til opnåelse af det fremmede protein. F.eks. kan den 30 modtagelige sekvens i det fremmede protein være en kinetisk mindre foretrukket sekvens, såsom en sekvens med Pro i stedet for Ile ved P4, eller den kan være "begravet" i det fremmede protein. I sådanne tilfælde kan den hastighed, hvormed sekvensen i det fremmede protein 35 spaltes, være signifikant mindre end den, hvormed lin- 12 DK 171278 B1 kersekvensen spaltes, og det kan derfor vise sig muligt at opnå i det væsentlige fuldstændig spaltning af lin-kersekvensen uden signifikant spaltning af sekvensen i det fremmede protein ved regulering af reaktionsbetin-5 gelserne eller ved begrænsning af det tidsrum, i hvilket spaltningen udføres.

Opfindelsen beskrives nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. Det vil være klart, at opfindelsen ikke er begrænset til de beskrevne specifikke 10 eksempler. Eksemplerne refererer til tegningen, hvorpå fig. 1 viser DNA-sekvenser og enzymrestriktionskort, der angiver konstruktionsmåden for en vektor ifølge opfindelsen, indeholdende en sekvens, der koder for et faktor Xa-spaltningssted, knyttet til en sekvens, der 15 koder for humant β-globin, fig. 2 viser en polyacrylamid-SDS-gel, som udviser resultater af fusionsproteinekspression under anvendelse af den i fig. 1 viste vektor, fig. 3 viser en polyacrylamid-SDS-gel, som udvi-20 ser resultater af spaltning med aktiveret bovin faktor Xa af det i fig. 2 viste fusionsprotein, og fig. 4 viser et enzymrestriktionskort for en vektor ifølge opfindelsen indeholdende en sekvens, der koder for et CAT-faktor Xa-spaltningssted-humant-calcito-25 nin-glycin-fusionsprotein.

Eksempel 1

Fremstilling af faktor Xa-spaltningssted-kodesekvens og konstruktion af vektorer.

30

Der konstrueredes en fag-vektor M13mpllFX indeholdende en DNA-sekvens, der koder for Ile-Glu-Gly-Arg-genkendelsesstedet for faktor Xa. Desuden konstrueredes 35 der to vektorer pLcILFXfJ og pLcIIø, som dirigerer effek- 13 DK 171278 B1 tiv produktion af hybridfusionsproteiner, der omfatter de 31 amino-terminale rester af XCII-proteinet og den fuldstændige aminosyresekvens af humant B-globin. Den førstnævnte af disse to vektorer omfatter desuden en 5 DNA-sekvens, der koder for Ile-Glu-Gly-Arg-faktor Xa-spaltningsstedet, der sammenknytter XCII- og β-globin-kodesekvenserne.

METODER

10

Alle DNA-manipulationer udførtes i det væsentlige som beskrevet af Maniatis et al., ("Molecular Cloning",

Cold Spring Harbor, New York, 1982). En temperaturfølsom lysogen stamme MZ-1 (gal KamA8 att LA Bam N7 N53 CI857 15 ΔΗ1, his”, ilv”, bio“, N+, en gave fra Dr K McKenney) anvendtes som værtsstamme for plasmider indeholdende XPL-promotor. Transformation udførtes ved den metode, der er angivet af Remaut et al. (Gene 15, 81-93 (1981)).

T4 DNA-ligase fremstilledes ud fra stamme NM 989 (Mur-20 ray et a_l., J. Molec. Biol. 132, 493-505 (1979) og Tait et al., J. Biol. Chem. 255, 813-815 (1980)). Restrik tionsenzymer var indkøbt fra New England BioLabs.

(a) M13mpllFX 25

To oligonucleotider dTACCCTCGATGGATC og dCATCGAGGGTAGGCC syntetiseredes ved phosphortriester-metoden på en bærer af kontrolleret poreglas ( Sproat et al., Tetrahedron Lett, 24, 5771-5774, (1983)) og rense- 30 des ved hjælp af HPLC (Gait et al., Nucleic Acids Research, 10, 6243-6254 (1982). Man lod de to oligonucleotider annellere efter phosphorylering med T4 polynucleo-tid-kinase (P-L Biochemicals) og r[Y“32p] ATP (3.000 Ci/mmol, Amersham), og ligeredes til dannelse af conca-35 tamerer. DNA'et digesteredes derefter med BamHI og klo- 14 DK 171278 B1 nedes i det dephosphorylerede sted i Ml3mpll (Vieira et al., Gene lj), 259-268 (1982)) til opnåese af M13mpllFX som vist i fig. 1. Denne vektor danner blå plaques i nærværelse af isopropyl-Ø-D-thiogalacto-pyranosid og 5 5-brom-4-chlor-3-indolyl-6-d-galactosid (Sigma).

(b) pLcIIØ og pLcIIFXØ

EcoRl-HindiIl-fragmentet indeholdende multire-10 striktionsstederne blev skåret ud fra M13mpl0 (Vieira et al. Supra) og ligeredes til med EcoRl-Hindlll overskåret pLc245 (Remaut et al., supra) til dannelse af pLmplO.

319 bp Alul-fragmentet indeholdende nutR, tR]_-stederne og en del af CII-genet blev skåret ud fra pKG1805 15 (McKenney, K., PhD. Dissertation, The Johns Hopkins University (1982)) og klonedes i Smal-stedet i M13mpl0 i den samme orientering med hensyn til β-galactosidase-a-peptid-genet. EcoRl-HindliI-fragmentet indeholdende XDNA-sekvensen blev derefter skåret ud og klonedes i 20 EcoRl-HindiII-stedet i pLmplO til opnåelse af pLcII. En fuldstændig human Ø-globin-cDNA-sekvens rekonstrueredes ved at sammenføje restriktionsfragmenter fremstillet ud fra en ufuldstændig cDNA-klon (pJW102 - Wilson et al., Nucleic Acids Research 5, 563-581 (1978) og en genomisk 25 DNA-klon (Lawn et al., Cell 21, 647-651 (1980) og klonedes i Smal-HindiIl-stedet i M13mp9. Det Således opnåede M13mp9ø-cDNA åbnedes ved Ncol-stedet, der er placeret ved startkodonet,og behandledes med Klenow-DNA-polymera-se (Boehringer Mannheim) i nærværelse af 100 yM 4dNTP 30 til opnåelse af glatte ender. β-Globin-cDNA-sekvensen blev derefter skåret ud med Hindlll og indføjedes i BamHI (udfyldt) -Hindlll-stedet i pLcII til opnåelse af plasmidet pLcIIØ, som vist i fig. 1. I pLcIIØ fusioneres $-globin-genet til XCII-genet i fase via et lille lin-35 ker-DNA afledt fra M13mpl0. Til konstruktion af pLcIIFXØ 15 DK 171278 B1 åbnedes Ml3mp9f$-cDNA med Ncol, og 40 yg DNA behandledes med 200 enheder af mungbønne-nuclease (P-L Biochemicals) i 30 mM Na-acetat pH 4,6, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCl2# 5% glycerol ved 0°C i 10 minutter til fjernelse af den 5 fremspringende 5'-ende. β-Globin-cDNA-sekvensen blev skåret ud med HindiII og klonedes i det med Stul-Hindlll overskårne M13mpllFX. DNA-Sekvensen bestemtes ved dide-oxy-kædeafslutningsmetoden (Sanger et al·# PNAS 74, 5463-5467 (1977)) til sikring af, at der forud for det 10 første valin-kodon i β-globin-genet lå den DNA-sekvens, der koder for Ile-Glu-Gly-Arg. Derefter blev BamHI-frag-mentet, der indeholdt en del af fj-globin-sekvensen, skåret ud og klonet i med BamlII digesteret pLcIIg til dannelse af pLcIIFXB som vist i fig. 1.

15 (c) Ekspression af ACIl/3-globin-hybridfusionsproteiner i Ej_ coli.

De totale cellulære proteiner fra MZ-1, der bærer 20 pLcII, pLdie og pLcIIFXp, med og uden to timers induktion, analyseredes på en 18% polyacrylamid-SDS-gel og synliggjordes med Coomassie-blåt. Den opnåede gel er vist i fig. 2, hvori banerne identificeredes ved hjælp af det af MZ-l-cellerne bårne plasmid som følger: 25 (a) pLcII ved 30°C; (b) pLcII ved 42°C; (c) pLcIIø ved 30°C; (d) pLcIIø ved 42°C; 30 (e) pLcIIFXø ved 30°C og (f) pLcIIFXS ved 42°C.

o 16 DK 171278 B1

METODER

MZ-1 indeholdende ekspressionsplasmiderne pLcII, pLcIIB og pLcIIFXS dyrkedes til AgøO = 0,7 i 2 x TY 5 medium (trypton 16 g, gærekstrakt 10 g, NaCl 5 g pr. liter) ved 30°C, og kulturerne halveredes, og den ene halvdel af hver kultur blandedes med et ligeså stort rumfang af 2 x TY, der var blevet foropvarmet til 65°C, og dyrkedes ved 42°C. De tilbageblevne halvdele dyrkedes 10 ved 30°C som kontrol. Det totale cellulære protein eks-traheredes med et ligeså stort rumfang phenol og centrifugeredes efter precipitation med 5 rumfang ethanol (Remaut et al. supra). De opnåede pellets opløstes i SDS-prøvepuffer og analyseredes på en 18% polyacrylamid-15 SDS-gel som ovenfor under anvendelse af den procedure, der er beskrevet af Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)).

(d) Digestion af CIIFXø-globin-fusionsprotein med bovin 20 blodkoagulationsfaktor Xa.

Prøver af CIIFX&-globin-fusionsprotein digestere-des med faktor Xa ved et molforhold mellem enzym og substrat på 1:100 ved 25°C i forskellige tidsrum, og de op-25 nåede produkter analyseredes på en 18% polyacrylamid-SDS-gel (Laemmli, supra). Den opnåede gel er vist i fig.

3, idet digestionstiderne efter tilsætning af faktor Xa for de forskellige baner er som følger: 1 (b) 5 minutter (c) 15 minutter (d) 30 minutter (e) 60 minutter (f) 120 minutter 17 DK 171278 B1

Bane (a) er det resultat, der opnås for udigesteret CIIFXø-globin, og bane (g) er humant hæmoglobin fra et voksent menneske, bestående af a-typen (hurtigere bånd) og Ø-typen (langsommere bånd). Til sammenligning 5 indeholder fig. 3 også resultater for Cllø-globin-fu-sionsprotein, der mangler faktor Xa-spaltningsstedet, både ubehandlet (bane (i)) og efter 120 minutters behandling med faktor Xa som ovenfor (bane (h)). Resultaterne viser, at CIIFXø-globin spaltes specifikt ved fak-10 tor Xa-behandling til dannelse af et protein af samme størrelse som autentisk humant ø-globin, hvilket protein akkumulerer med tiden, og at der ikke sker nogen spaltning af Cllø-globinet.

15 METODER.

MZ-1 indeholdende pLcIIFXØ dyrkedes i 500 ml 2 x TY medium. Ved Agoo = 0,7 blandedes kulturen med 500 ml x TY, der var blevet foropvarmet til 65°C, og dyrkedes 20 ved 42°C. Efter 2 timer høstedes cellerne, og preci-pitatet frembragt ved høj saltkoncentration fremstilledes (Gilmer et al., PNAS 7_9, 2152-2156 (1982)). Pelleten opløstes i 30 ml 10 mM Na-phosphat pH 6,4, 1% SDS (BDH),

1% ø-mercaptoethanol, og inkuberedes i et kogende bad i 25 5 minutter. Prøven dialyseredes mod 10 mM Na-phosphat pH

6,0, 1 mM dithiothreitol, 0,1% SDS, og rensedes i en kolonne med hydroxylapatit (Bio-Rad, DNA-kvalitet) (Moss et al., J. Biol. Chem. 247, 5194-5198 (1972)). CIIFXØ-globin-hybridproteinet koncentreredes ved ultrafiltre-30 ring (Amicon, PM-10 membran) og precipiteredes derefter med 6 rumfang acetone/0,1 N HC1 til fjernelse af SDS. Precipitatet lufttørredes, opløstes i 8 M urinstof og dialyseredes derefter mod 100 mM NaCl, 50 mM tris-HCl pH

8,0 og 1 mM CaCl2· Bovin blodkoagulationsfaktor X (en 35 gave fra Dr. M.P. Esnouf) aktiveredes til faktor Xa med 18 DK 171278 B1

Russell's slangegift (Sigma) (Fujikawa et al., Biochemistry 11, 4892-4898 (1972)).

Eksempel 2 5 Til opnåelse af eksperimentelt bevis for den snævre substratspecificitet hos faktor Xa denatureredes en række proteiner, og hver sattes for sig til CIIFXe-globin-fusionsproteinet, opnået som anført i eksempel 1, før digestion med faktor Xa. Digestionen ud-10 førtes som anført i eksempel 1. Tidsforløbet af digestionen fulgtes derefter ved SDS-polyacrylamidgel-elek-troforese.

Ved hvert forsøg forblev ^70% af det denaturerede proteinsubstrat udigesteret på det tidspunkt, hvor 15 næsten alt Ø-globulinet var blevet spaltet fra hybridproteinet, hvilket angav, at hvert af disse polypeptider (>1000 aminosyrerester i alt) kunne være genvundet som autentiske proteiner fra hybridproteiner indeholdende en med faktor Xa spaltelig linker.

20 METODER.

Bovint serumalbumin, humant plasminogen, bovint pancreatisk trypsin-inhibitor og ribonuclease A reduce-25 redes og alkyleredes med iodeddikesyre i nærværelse af 5 M guanidin-hydrochlorid, og hønsekerne-("chicken core") histon H2a-H2b dimer denatureredes ved udsættelse for 1 M HC1. Alle seks proteiner digesteredes hurtigt af trypsin og denatureredes derfor delvis eller fuldstæn-30 digt under de betingelser, der anvendtes til inkubering med CIIFXP-globin-fusionsprotein og faktor Xa. Hvert protein blandedes i en ækvimolær mængde af CIIFXP-glo-bin-fusionsprotein fremstillet som anført i eksempel 1(c) og digesteredes som anført i eksempel 1(d).

19 DK 171278 B1

Eksempel 3 (a) Konstruktion af vektor pCT 20210.

5 Der konstrueredes en vektor pCT 20210, der kodede for ekspression af et chloramphenicol-acetyltransferase-(CAT)-humant-calcitonin-glycin(hCT-Gly)-fusionsprotein indeholdende en faktor Xa-spaltningssekvens (Ile-Glu-Gly-Arg) mellem CAT- og hCT-Gly-polypeptidsekvenserne.

10 Som i de tidligere eksempler udførtes DNA-manipulationerne i det væsentlige som beskrevet af Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, New York 1982).

Startpunktet for konstruktionen af vektoren pCT 15 20210 var vektoren pCT 2026, der koder for ekspression af et CATI-Glu-hCT-Gly-fusionsprotein. Konstruktionen af vektor pCT 2026 er beskrevet nærmere i GB offentliggørelsesskrift nr. 2 104 810, hvis indhold skal betragtes som inkorporeret heri i kraft af henvisningen dertil.

20 Under henvisning til fig. 4 digesteredes vektor pCT 2026 med Acc I og Bgl II til udskæring af den DNA-sekvens, der koder for Glu og aminosyreresterne 1-4 i hCT. Det opnåede plasmid-DNA isoleredes og ligeredes med et overskud af følgende oligonucleotider: 25 R276 5' - GA TCT ATT GAA GGT CGT TGT GGT AAC CTG T-3' og R275 5' - AGA CAG GTT ACC ACA ACG ACC TTC ATT A-3'

De opnåede plasmid-molekyler transformeredes til 30 E_^ coli HB 101-celler, og de afledte transformerede celler udvalgtes ved vækst på medier indeholdende ampicil-lin (100 pg/ml). Transformation og selektion efterfulgtes af plasmid-fremstillinger i lille målestok ud fra de opnåede ampicillinresistente kolonier og digestion af 20 DK 171278 B1 disse DNA-molekyler med Bst E II. Et plasmid indeholdende et BstEII-sted, pCT 20210, isoleredes, og dets DNA sekvensbestemtes i området omkring sammenføjningsstedet mellem de sekvenser, der koder for CAT- og hCT-polypep-5 tiderne. Den bestemte DNA-sekvens er vist nedenfor sammen med den tilsvarende aminosyresekvens (øverste linie) og bekræfter, at pCT 20210 indeholder den korrekte sekvens, der koder for faktor Xa-spaltningssekvensen, Ile-Glu-Gly-Arg, mellem de sekvenser, der koder for CAT- og 10 hCT-Gly-polypeptiderne.

Partiel sekvens af pCT 20210

Calcitonin-glycin _

15 ^-CATI FACTOR XA

" ’ S S

_ I---) ——Ile Arg Ser|Ile Glu Gly ArglCys Gly Asn Leu Ser Thr Cys—— -ATC TCT ATT G AA GGT CGT TGT GpT AAC CTG IjCT ACT TGC- -TAG TCT AG A TAA CTT CCA GCA ACA CCA TTGI GAC AGA TGA ACG .— 20

Bgl II Bst E II ACC I

(b) Fremstilling af CATI-XahCT-Gly-fusionsprotein.

25 E. coli HBlOl-celler indeholdende plasmid pCT 20210 dyrkedes ved 37°C til sidst i den eksponentielle vækstfase i en 4 liters fermenteringsbeholder i suppleret mineralsaltmedium indeholdende 20 yg/ml chloramphe-30 nicol. Cellerne høstedes ved centrifugering (1000 o/m x 10 minutter). Cellerne resuspenderedes i 60 ml 50 mM Tris-HCl-puffer, pH 8,0, indeholdende 100 mM NaCl og 1 mM EDTA, og 0,2 ml PMSG-opløsning (3,3 mg/ml i ethanol) og 21,4 mg lysozym sattes derefter til suspensionen.

35 Efter 25 minutter tilsattes der 2 ml 4% (vægt/vol) de- 21 DK 171278 B1 oxycholat, og man lod den opnåede viskose suspension henstå i yderligere 10 minutter. 0,6 mg DNase 1 tilsattes, og man lod suspensionen henstå ved stuetemperatur, indtil viskositeten var tydeligt formindsket. Efter 5 fuldendelse af dette trin blev suspensionen centrifugeret (11000 o/m x 5 minutter). Fusionsproteinet viste sig at være til stede overvejende i den uopløselige pelletfraktion.

Noget af det i den opløselige fraktion tilstede-10 værende CAT-Xa-hCT-Gly-fusionsprotein rensedes imidlertid ved CAT-substrat-affinitetschromatografi i det væsentlige som beskrevet for rensningen af CATl-Glu-hCT-Gly i GB-offentliggørelsesskrift nr. 2 104 810.

Pelleten, der indeholdt størstedelen af CAT-Xa-15 hCT-Gly-fusionsproteinet, rensedes desuden yderligere som følger. Pelleten vaskedes med 9 rumfang kold, pufret Triton X 100 opløsning (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM

EDTA, 0,55 (vol/vol) Triton X 100, 100 mM NaCl) og udvandtes ved centrifugering (11.000 o/m x 5 minutter).

20 Denne vaskningsprocedure blev derefter gentaget to gange. Den opnåede pellet resuspenderedes i 5 ml af Tris-HCl-suspensionspufferen med pH 8,0 som ovenfor. Fusionsproteinet kontrolleredes for renhed ved hjælp af SDS-polyacrylamidgel-elektroforese, og den tilbageblevne 25 suspension opbevaredes ved -20°C.

CAT-Xa-hCT-Gly-fusionsproteinet, oprenset enten fra den opløselige eller uopløselige fraktion som beskrevet ovenfor, behandles med bovin blodkoagulationsfaktor Xa i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1(c) 30 til opnåelse af hCt-Gly.

Eksempel 4 Hønsemyosin-let-kæde-cDNA digesteredes med Sau96, udfyldt med Klenow-polymerase, og klonedes i Stul-stedet 35 i MP13mpllFX (fremstillet som anført i eksempel 1 oven- 22 DK 171278 B1 for) til dannelse af M13mpllFX-MLC. Alle DNA-manipula-tionerne udførtes i det væsentlige som beskrevet af Ma-niatis et al. (loc.cit.). I dette Ml3-derivat ligger der forud for den første aminosyrekodon i myosin-let-kæde-5 genet en DNA-sekvens, der koder for Ile-Glu-Gly-Arg-tetrapeptidet som vist nedenfor.

| Mjyosin-let-kæde-gen

GlySerlleGluGlyArgAlaProLysLysAlaLysArgArgAla............

GGAT C CAT C GAG G GTAGGGCCCCCAAGAAGGCGAAGCGCCCCGCA............

10 BamHI

Myosin-let-kæde-cDNA-sekvensen blev skåret ud fra M13mpllFX-MLC sammen med faktor Xa-spaltningssekvensen og klonedes i pLcII til dannelse af pLcIIFX-MLC, i det 15 væsentlige som beskrevet i eksempel 1.

CIIFX-MLC-fusionsprotein produceredes i høj koncentration i coli og rensedes til homogenitet. Fusionsproteinet spaltedes derefter med faktor Xa ved den peptidbinding, der følger efter Ile-Glu-Gly-Arg-tetra-20 peptidet, og den autentiske myosin-lette-kæde blev frigjort. Disse manipulationer udførtes også i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1.

Hønsemyosin-let-kæde-cDNA'et opnåedes som beskrevet af Reinach og Fischman, J. Mol. Biol., 181 1985.

Claims (9)

1. DNA-Sekvens, kendetegnet ved, at den koder for aminosyresekvensen X-Y-Gly-Arg der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blod-5 koagulationsfaktor xa, og hvori X er Ile, Leu, Pro eller Ala, og Y er Glu, Asp, Gin eller Asn.

2. DNA-Sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X er Ile, og Y er Glu eller Gin.

3. DNA-Sekvens ifølge krav 2, kendeteg- 10 net ved, at den koder for aminosyresekvensen Ile- Glu-Gly-Arg, der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa.

4. Vektor, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-kodesekvens, som koder for aminosyrese- 15 kvensen X-Y-Gly-Arg, der er et spaltningssted, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa, hvilken DNA-kodesekvens er fusioneret til en DNA-sekvens, der koder for et ønsket protein eller peptidprodukt, og i hvilken aminosyresekvens X er Ile, Leu, Pro eller Ala, 20 og Y er Glu, Asp, Gin eller Asn.

5. Vektor ifølge krav 4, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen, der koder for spaltningsstedet, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xg, også er fusioneret til en DNA-sekvens, der koder for i det 25 mindste en del af et værtsprotein.

6. Vektor ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen, der koder for spaltningsstedet, som spaltes specifikt af blodkoagulationsfaktor Xa, er fusioneret til den N-terminale 3° ende af den DNA-sekvens, der koder for det ønskede protein eller peptidprodukt.

7. Vektor ifølge krav 4, valgt blandt vektorerne: - M13mpllFX, som defineret i eksempel 1 og i fig. 1, DK 171278 B1 - Ml3mpl1FX-MLC, som defineret i eksempel 4, - pLcIIFXp, som defineret i eksempel 1 og i fig. 1, - pLcIIFX-MLC, som defineret i eksempel 4, og - pCT 20210, som defineret i eksempel 3. 5

8. Værtsorganisme, kendetegnet ved, at den er transformeret med en vektor ifølge et vilkårligt af kravene 4-7.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket protein eller peptidprodukt i nativ form, kende-10 tegnet ved, at man transformerer en værtsorganisme med en vektor ifølge et vilkårligt af kravene 4-7, eksprimerer det ønskede protein eller peptidprodukt som et fusionsprotein, der omfatter det ønskede 15 protein eller peptidprodukt fusioneret til den C-ter-minale ende af et faktor Xa-spaltningssted, og spalter fusionsproteinet med faktor Xa til opnåelse af det fremmede genprodukt i nativ form.