JPH02182191A - 発現エンハンサーおよび組換え遺伝子発現時の収量を増大させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、発現エンハンサ−および組換え遺伝子を有す
る発現ベクターを含む適当な宿主細胞の形質転換によっ
て組換え遺伝子の発現時の収量を増大させる方法に関す
る。

従来の技術 組換え遺伝子、就中Ｅ、ｃｏｌｉ中の真核遺伝子の発現
時には、しばしば、所望の遺伝子生成物の発現が不十分
である、という難点が生じる。こｆ′Ｌは、当該分野に
おいて従事する研究者によって種々の原因に帰せら扛て
いるが、就中特定の組換え遺伝子で形質転換さ【たＥ、
ｃｏｌｉ細胞の極めて小さい発酵速度に原因があるとさ
牡ている。

成程Ｅ、ｃｏｌｌ細胞は部分的には組換え遺伝子の極め
て良好な発現を示すが、細胞成長は不良であって、その
ためにバイオマスが僅かしか得られず、その結果また所
望の遺伝子生成物の収量も極めて少なくなる。

発明が解決しようとする課題 したがって本発明は、Ｅ、ｃｏｌｉにおける発現時の所
望の遺伝子生成物の収量全増大させる方法および手段を
提供するという課題を基礎にしている。

課題を解決するための手段 前記課題は本発明により、発現エンハンサ−が、転写後
にｔ　ＲＮＡのクローバ−葉構造を形成する能力のある
ＤＮＡ配列を有しかつ転写後にクロバー葉構造において
アンチコドンループを形成するＤＮＡ＠域で、配列５’
−ＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３’またはこの
配列と相、補的な配列 ５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３’、好１
しくは５’　−ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴ
ＴＧ　−３’または同配列と相補的なオリゴＳ５’−Ｃ
ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’とノ１
イブリッドを形成していることによって解決さＧる。

ｔＲＮＡ分子のクローバ−葉構造は、−本領ＲＮＡ分子
の特定領域の塩基対によって形成さね、すべてのｔＲＮ
Ａ分子において特定の規則性が生じる。

クローバ−葉構造のそｎぞｎには、左のループ、すなわ
ち所謂ジヒドロウリジンルーツ；第２番目のループ、す
なわち相補的なトリジレットを有するｔ　ＲＮＡ分子の
場合にはｍＲＮＡの塩基対ヲ弓受けることができ、七Ｃ
によってｔ　ＲＮＡの特異性を決める所謂アンチコドン
ループおよび右に配置されたループ、すなわち所謂プソ
イドウリジンループが存在し、アンチコドンループとプ
ソイドウリジンループとの間にはしばしば可変のエキス
トラルーツがある。

本発明による発現エンノ・ンサーは、転写後にこのよう
なりローパー葉構造を形成することができるＲＮＡ　’
ｉ与えるＤＮＡ構造を有する。従って本発明は、クロー
バ−葉構造を形成する能力のある天然および合成遺伝子
を包含しており、本発明の範囲内にはまた、クローバ−
葉構造を形成する能力のあるＤＮＡ配列の他に別の配列
を有しかつクローバ−葉構造を有するＲＮＡの形成下に
プロセッシングさｎうるＤＮＡ配列も入る。しかし本発
明による発現エンハンサ−は、アンチコドンループで前
記オリゴヌクレオチドとハイブリットを形成すること全
特徴としている。本発明の好ましい実施態様においては
、発現エンハンサは配列５’−ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡ
ＡＧＧＴＣＧＴＴＧ−３’またばこｎと相補的な配列５
’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’
のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する。

このような発現エンハンサ−は合成することもできるし
、また例えばＥ、ｃｏｌｉ細胞から分離することもでき
る。本発明の好ましい実施態様においては、発現エンハ
ンサ−を製造するために、Ｐｓｔｌで部分的に消化さ扛
た染色体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡから成る遺伝子パンク（
Ｇｅｎｔ）ａｎｋ）を適当なベクターに導入し、この遺
伝子パンクベクターおよびその発現時にＥ、ｃｏｌｉ細
胞の成長を不良にする組換え遺伝子を有する発現シラス
ミド（ここで６成長を不良にする′″という表現は本発
明の範囲では、細胞の成長全組換え遺伝子のみの発現の
場合には、発現エンノーンサーの付加的発現の場合より
も不良にすること全意味する）を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞
が共同形質転換さｎ、選択され、誘導さｎ、培養さ扛、
増殖して大きなコロニーになったクローンを分離し、こ
ｎらのクローンから遺伝子パンクベクターを分離する。

配列５’−ＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３’ま
たはこ【と相補的な配列５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴ
ＡＡＧＴＣ−３’のオリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によって、発現エンハンサ−の存在を検ぺること
かできる。本発明の特に好ましい実施態様においては配
列５’　−ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧ
−３’のオリゴヌクレオチドまたはこれと相補的なオリ
ゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧ
ＴＣＧＴＧ−３’を使用する。

本発明による好ましい製造方法は、Ｅ、ｃｏｌｉでその
遺伝子が発現する際同細胞の成長を極めて不良にする組
換え遺伝子を有する発現シラスミドを用いて行なうこと
ができる。このために好ましくは藺導可能な発現シラス
ミドを使用すると、誘導までＥ、ｃｏｌｉ細胞の通常の
発酵が起こりうる。誘導後に、再び本発明による発現エ
ンハンサ−を有する遺伝子パンクベクターを含むような
りローンが増殖して大きなコロニーになる。これは、前
記配列のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によ
って検べることかできる。次に、発現エンハンサ−を有
する遺伝子バンクベクターを含むクローンから、遺伝子
パンクの製造のために使用した制限酵素による消化によ
って該エンハンサ−を分離することができる。

本発明の好ましい実施態様においては、発現プラスミド
としてはｔ−ＰＡ発現プラスミドを使用し、特に好まし
くはプラスミドｐＵＢＳ　９８．ｓｔを使用する（例３
参照）。

本発明により使用さｎる誘導可能の発現プラスミドは、
好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドによって、極めて好ましくは５〜２０　ｍｍｏｌ／
７の量で誘導さ扛る。

遺伝子パンクを製造するためには、本発明により好まし
くはベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＤＳＭ３６９３Ｐ）を
使用する。

本発明の他の対象は、組換え遺伝子の発現時の収量を、
四組換え遺伝子を有する発現ベクターを含むＥ、ｃｏｌ
ｉ細胞の形質転換によって増大させる方法であり、この
際本発明による発現エンハンサ−を発現可能な形で同様
に宿主細胞に導入し、同エンハンサ−の発現を前記発現
ベクターの発現前にまたはこの発現と同時に生起させる
。

本発明による好ましい実施態様では、該発現エンハンサ
−を組換え遺伝子を有する発現ベクター中に導入する。

これは、本発明によｎば、発現エンハンサ−が特有の別
個のプロモーターに制御ざｎるか、または組換え遺伝子
と一緒に同プロモーターに制御さするように行なわれる
。

本発明の他の好ましい実施態様においては、発現ベクタ
ーを組換え遺伝子を有する発現ベクターに適合するベク
ターに導入する。適合するベクターとは、本発明の範囲
では、発現ベクターとは異なる複製源を有するベクター
のことである。こ扛によって両プラスミドの細胞におけ
る同時的複製および転写が可能になる。

好ましくは、発現エンハンサ−金有するベクターとして
は、シラスミドｐＵＢｓ　１００を使用し、組換え遺伝
子を有する発現ベクターとしてはこ扛に適合するベクタ
ー、例えばｔ−ＰＡ発現シラスミドｐＵＢ８９８．ｓＡ
　ｋ使用する。本発明の好ましい実施態様においては、
組換え遺伝子として、ｔ−ＰＡまたはｔ−ＦＡ誘導体、
ウロキナーゼまたはＨＩＶタンパク質の遺伝子もしくは
ｅＤＮＡｆ：使用する。

発現エンハンサ−の発現は本発明によ牡ば、組換え遺伝
子を有する発現ベクターの発現前にまたはその発現と同
時に行なってよい。しかしこの発現エンハンサ−の発現
は、発現ベクターの発現前に発現エンハンサ−の遺伝子
生成物が宿主細胞でヌクレアーゼによって著しく分解さ
扛るように長時間で起ってはならない。従って本発明に
よ扛ば該発現を発現ベクターの発現と同時に、極めて好
ましくは構成性発現または誘導によって行なうのが有利
である。このために発現エン−・ンザ−は本発明によれ
ば誘導性プロモーター、好ましくは７ａｃプロモーター
に制御さｔでもよい。

次に本発明を実施例によシ詳述する。

例１ 発現エンハンサ−のクローニングおよび選択：制限酵素
Ｐ＠ｔｌで部分的に消化さｎ　ｆｔ−Ｅ、　ｃｏｌ　１
ＤＮＡの遺伝子パンクを、周知の分子生物学的手段（特
にＷｉｎｎａｃｋｅｖ　Ｅ、Ｌ、、Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　
Ｋｌｏｎｐ。

ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ　１９８５）　’！ｃ”用いて、
ｐＡＣＹＣ１７７゜ＤＳＭ　３６９３ｐ　（Ｃｈａｎｑ
　ｕｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１３４（１９７８）、１１４１〜１１５６）　　中に導
入した。

このためにＰｓｔｌ　テ切断さｆｌ’ｃ　ｐＡＣＹＣ１
７７プラスミドＤＮＡ　ｉ、部分的にＰｓｔｉで消化さ
れた染色体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡと結合した。ｐＡＣＹ
Ｃ’　１７７のＰｓｔ１位置に挿入断片を含むクローン
を、アンピシリン感受性によって、および挿入断片の長
さだけ増大された分子量によって固定することができる
。このようなりローンのプラスミドＤＮＡは、ゲル電気
泳動法／ｒル溶離によって挿入断片を含まないプラスミ
ドＤＮＡから分離し、単離することができる。この遺伝
子パンクから、遺伝子バンクプラスミドとｔ−ＰＡ発現
プラスミドｐＵＢｓ９８．ｓｔ（この製造は例３に記載
する）との共同形質転換およびＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）　１０　ｍｍｏｌ
／ｌを含有するＬＢ−カナマイシン／アンビシリン培地
での選択によって、シラスミドｐＵＢｓ　１００を分離
した。

このシラスミドｐＵＢｓ　１００は、約３０００塩基の
長さを有する染色体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡの部分を含む
。

該シラスミドｐＵＢｓ　１００は、同プラスミドｐＵＢ
　５１００および発現グラスミドｐＵＢＳ　９８．　ｓ
ｔｋ有しかつＩＰＴＧの藺導によってｔ−ＰＡを産生す
るＬ　ｃｏ　１１細胞（ＤＳＭ　３６８Ｑ　）が、ｐＵ
Ｂｓ　９３．ｓｔおよびＴＩＡＣＹＣ１７７を有するＥ
、ｃｏｌｉ細胞とは対照的に、藺導後に大きなコロニー
に増殖しうるという効果をもたらす。

例２ 発現エンハンサ−を含むシラスミドを用いる共同形質転
換によるＥ、ｃｏｌｉにおけるｔ−ＰＡの発現： この例では、発現エンハンサ−を含むプラスミドとして
シラスミドｐＵＢｓ　１００　ｅ使用した。

ｐＵＢｓ　１００およびｔ−ＰＡ発現シラスミドを含む
Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＤＳＭ　３６８９　）の共同形質転換
を、プラスミドｐＵＢｓ　９Ｂ、ｓｔのみによる形質転
換の際の宿主細胞における発現率と比較した。さらにこ
の発現率を同一菌株におけるプラスミドｐｅ　Ｐａ９８
．１　（ＤＥ　３６１３４０１）の発現率と比較した。

この比較の結果を表１に記載する。さらに、発現エンハ
ンサ−およびｔ−ＰＡ遺伝子を含むプラスミド、つまり
プラスミドｐＵＢ８９８．　ｓｋｙ　（ＤＡＭ　４８９
８）を使用したｔ−ＰＡの発現も実験した。こ扛に関す
る結果も表１に記載する。

表　　１ Ｅ、ｃｏｌｉ、ＤＳＭ　３６８９　　完全ｔ−ｐＡ／全
タンノ４り質％　生存能力 ＋ｐｅＰａ　９８．１　　　　　　　　　３％　制限さ
牡ている＋ｐＵＢＳ　９８．ｓｌ　　　　　　　　　１
０％　極めて不良＋ｐＵＢＳ　９８．ｓｌ＋ｐＵＢ８１
００３０％　極めて良好＋ｐＵＢＳ　９８．　ａｋｙ　
　　　　　　　３０％　極めて良好表１で示した結果か
ら、発現エンハンサ−を含むＦ、ｅｏｌｌ細胞で発現さ
ｎるｔ−ＰＡの発現率は、発現エンハンサ−を含まない
細胞の場合と比べると明らかに高くなったことがわかる
。これは得らｔ−Ｌｆｃ、クローンの生存能力と相関し
ている。

例３ シラスミドｐｔＪＢ８９８．ｉ＋Ａを構成するための出
発グラスミドとしてグラスミドｐａＰａ　９８．１（ヨ
ーロツノ臂特許出願公開第２４２８３６号）ｔ−使用し
た。このプラスミドにおけるｔ−ＰＡのｃＤＮＡの、約
４００塩基対の長さの３′−未翻訳領域を、３６１塩基
対の長さのＸｈｏ［断片の欠失によって約４０塩基対に
短縮した。この結果生じるシラスミドはｐｅＰａ　１２
６−１命名した。

このプラスミドは、例えば、プラス、ミドｐｅＰａ９８
．１の場合には同プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Ｂ　ａｍＨＩおよびＨｌｎｄ　Ｉで二重消化する際、２
２３４塩基対および４３７２塩基対の長さの２個の断片
を検出することができるが、プラスミドｐｅＰａ　１２
６．１の場合には１８７３塩基対お（］３） よび４３７２塩基対の長さを有する２個の断片が得らｎ
ることによって区別されうる。

該グラスミドｒｅＰｉ　１２６．１　ｋ単一のＨｉｎｄ
ｕ切断位置で線状化し、残っている両末端をフレノウ酵
素およびｄＮＴＰで充填する。また同様にプラスミドｐ
ｅＰａ　１２６．１から、４７２塩基対の長さのＦＪｅ
ｏＲＩ断片を分離し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した。プ
ラスミドｐｅＰａ　１２６−１から得らｎた２つの断片
を結合することによってプラスミドｐＵＢ８９８、ｓｔ
が得らｎた。

ｐＵＢｓ　９８．ｇｔは制限解析によってｐｅＰｉ　１
２６．１から区別さｎうる：Ｂａｎ１消化ｐｅＰａ　１
２６．１　ＤＮＡは、１１７５塩基対、３９３塩基対、
１６５塩基対および４５６０塩基対の長さの断片によっ
て定義さ扛る：　ｐＵＢｓ　９８．５ＬＤＮＡは、Ｂａ
ｎ１ｌ断片が約１１７５塩基対、３９３塩基対、１４塩
基対、１６５塩基対、４７０塩基対および４５４０塩基
対の長さを有することを特徴としている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発現エンハンサーが、転写後にｔ−ＲＮＡのクロー
   バー葉構造を形成する能力のあるＤＮＡ配列を有しかつ
   転写後にクローバー葉構造においてアンチコドンループ
   を形成するＤＮＡの領域で、配列５′−ＧＡＣＴＴＡＧ
   ＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３′またはこの配列と相補的な配
   列５′−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３′を有
   するオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している
   ことを特徴とする発現エンハンサー。 ２、組換え遺伝子の発現時に同組換え遺伝子を有する発
   現ベクターを含む適当な宿主細胞の形質転換によつて収
   量を増大させるに当り、請求項１記載の発現エンハンサ
   ーを発現可能な形で宿主細胞に導入して発現させること
   を特徴とする組換え遺伝子の発現時の収量を増大させる
   方法。