JP3115622B2 - クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法 - Google Patents
クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法Info
- Publication number
- JP3115622B2 JP3115622B2 JP03048705A JP4870591A JP3115622B2 JP 3115622 B2 JP3115622 B2 JP 3115622B2 JP 03048705 A JP03048705 A JP 03048705A JP 4870591 A JP4870591 A JP 4870591A JP 3115622 B2 JP3115622 B2 JP 3115622B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- host
- promoter
- dna fragment
- escherichia coli
- restriction enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種遺伝子や種々の用
途に用いるＤＮＡ断片のクローニング用のベクターとし
て好適な構成を有するクローニング用ベクター及びそれ
を用いた大腸菌の選択的取得方法に関する。
途に用いるＤＮＡ断片のクローニング用のベクターとし
て好適な構成を有するクローニング用ベクター及びそれ
を用いた大腸菌の選択的取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学の根幹をなすクローニング技
術とは、各種遺伝子やＤＮＡ断片を組換え技術を利用し
てクローニング用のベクターに挿入し、これを適当な宿
主に導入して培養し、宿主のＤＮＡ複製機構を利用して
その複製物（クローン）を作製する技術であり、この技
術を利用して、目的とする各種遺伝子やＤＮＡ断片、組
換えＤＮＡなどの増幅、単離、あるいは適当な宿主中で
の外来遺伝子の発現を行うことができる。
術とは、各種遺伝子やＤＮＡ断片を組換え技術を利用し
てクローニング用のベクターに挿入し、これを適当な宿
主に導入して培養し、宿主のＤＮＡ複製機構を利用して
その複製物（クローン）を作製する技術であり、この技
術を利用して、目的とする各種遺伝子やＤＮＡ断片、組
換えＤＮＡなどの増幅、単離、あるいは適当な宿主中で
の外来遺伝子の発現を行うことができる。
【０００３】このクローニングにおける宿主中でのクロ
ーンの生産は、クローニング用ベクターに持たせた適当
なマーカーによって確認できる。
ーンの生産は、クローニング用ベクターに持たせた適当
なマーカーによって確認できる。
【０００４】このようなマーカーとしては、アンピシリ
ン（Ａｍｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）などに対す
る耐性をコードする薬剤耐性遺伝子を代表的なものとし
て挙げることができる。
ン（Ａｍｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）などに対す
る耐性をコードする薬剤耐性遺伝子を代表的なものとし
て挙げることができる。
【０００５】このマーカー遺伝子を利用し、マーカー遺
伝子の発現している形質転換体を選択することで、目的
とするＤＮＡ断片が挿入されたクローニング用ベクター
を有する宿主（形質転換体）を選別することができる。
伝子の発現している形質転換体を選択することで、目的
とするＤＮＡ断片が挿入されたクローニング用ベクター
を有する宿主（形質転換体）を選別することができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
マーカー遺伝子を利用する方法は、形質転換体における
マーカー遺伝子の発現から目的とするＤＮＡ断片のクロ
ーニングを間接的に確認するにすぎないもので、マーカ
ー遺伝子を発現する形質転換体の有するクローニング用
ベクター中に目的とするＤＮＡ断片が確かに挿入されて
いるかどうかを直接確認することはできない。
マーカー遺伝子を利用する方法は、形質転換体における
マーカー遺伝子の発現から目的とするＤＮＡ断片のクロ
ーニングを間接的に確認するにすぎないもので、マーカ
ー遺伝子を発現する形質転換体の有するクローニング用
ベクター中に目的とするＤＮＡ断片が確かに挿入されて
いるかどうかを直接確認することはできない。
【０００７】従って、マーカー遺伝子を利用する方法に
おいて、例えばプラスミドをベクターとして用いた場合
には、形質転換体からプラスミドを単離し、その構造を
解析したり、単離されたプラスミドに挿入されているＤ
ＮＡ断片からの遺伝子産物を発現させ、それが目的とす
るものであるかどうかを確認するという作業が必要とな
る。
おいて、例えばプラスミドをベクターとして用いた場合
には、形質転換体からプラスミドを単離し、その構造を
解析したり、単離されたプラスミドに挿入されているＤ
ＮＡ断片からの遺伝子産物を発現させ、それが目的とす
るものであるかどうかを確認するという作業が必要とな
る。
【０００８】そこで、目的とするＤＮＡ断片のクローニ
ング用ベクターへの挿入を直接確認できる方法について
の検討が種々なされてきた。
ング用ベクターへの挿入を直接確認できる方法について
の検討が種々なされてきた。
【０００９】そのような方法として、２種の薬剤耐性遺
伝子領域（Ａｍｐr 、Ｔｅｔr ）を有するプラスミドｐ
ＢＲ３２２のＴｅｔr 領域中の制限酵素切断部位を目的
とするＤＮＡ断片の挿入用として利用する方法が知られ
ている。
伝子領域（Ａｍｐr 、Ｔｅｔr ）を有するプラスミドｐ
ＢＲ３２２のＴｅｔr 領域中の制限酵素切断部位を目的
とするＤＮＡ断片の挿入用として利用する方法が知られ
ている。
【００１０】このｐＢＲ３２２を利用する方法では、Ｔ
ｅｔr 領域中の制限酵素切断部位を利用して目的とする
ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドによって宿主の形質
転換をおこなうと、形質転換された宿主はＴｅｔ耐性が
発現しないＴｅｔ感受性になる。そこで、目的とするＤ
ＮＡ断片が挿入されたプラスミドを有する宿主と、目的
とするＤＮＡ断片の挿入が行われていないプラスミドを
有する宿主とを、ＡｍｐとＴｅｔをそれぞれ個々に用い
たスクリーニングで分離でき、かつ目的とするＤＮＡ断
片が挿入されたプラスミドの存在を直接確認できる。
ｅｔr 領域中の制限酵素切断部位を利用して目的とする
ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドによって宿主の形質
転換をおこなうと、形質転換された宿主はＴｅｔ耐性が
発現しないＴｅｔ感受性になる。そこで、目的とするＤ
ＮＡ断片が挿入されたプラスミドを有する宿主と、目的
とするＤＮＡ断片の挿入が行われていないプラスミドを
有する宿主とを、ＡｍｐとＴｅｔをそれぞれ個々に用い
たスクリーニングで分離でき、かつ目的とするＤＮＡ断
片が挿入されたプラスミドの存在を直接確認できる。
【００１１】しかしながら、この方法は、Ａｍｐでの形
質転換体のスクリーニングによって現われるＡｍｐ耐性
を示すコロニーのレプリカを、Ｔｅｔでのスクリーニン
グ用の培養プレートに作製し、これを培養してＡｍｐ耐
性コロニー中でのＴｅｔ感受性コロニーの選択を行うと
いう過程が必要である点において煩雑である。
質転換体のスクリーニングによって現われるＡｍｐ耐性
を示すコロニーのレプリカを、Ｔｅｔでのスクリーニン
グ用の培養プレートに作製し、これを培養してＡｍｐ耐
性コロニー中でのＴｅｔ感受性コロニーの選択を行うと
いう過程が必要である点において煩雑である。
【００１２】この方法に対し、Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら
［Gene, 33(1985) 103 〜119 ］は、レプリカの培養過
程を省略できる方法として、マーカー遺伝子としてＡｍ
ｐr を用いるとともに、大腸菌のラクトースオペロンの
α−相補性により、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド）のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を利用した分解による青色呈色反応に
より目的とするＤＮＡ断片の挿入を確認できるクローニ
ング用のベクター−宿主系を用いる方法を開発した。
［Gene, 33(1985) 103 〜119 ］は、レプリカの培養過
程を省略できる方法として、マーカー遺伝子としてＡｍ
ｐr を用いるとともに、大腸菌のラクトースオペロンの
α−相補性により、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド）のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を利用した分解による青色呈色反応に
より目的とするＤＮＡ断片の挿入を確認できるクローニ
ング用のベクター−宿主系を用いる方法を開発した。
【００１３】この方法では、大腸菌のβ−ガラクトシダ
ーゼのＮ末端を欠失したペプチドを合成する株（例えば
ＪＭ８３）を宿主として用い、これにクローニング用ベ
クターとして、ラクトースオペロン（ｌａｃ）領域を有
するプラスミド（例えば各種ｐＵＣ）を組合せて用い、
ｌａｃ領域のポリリンカーを利用して目的とするＤＮＡ
断片のクローニングを行う。
ーゼのＮ末端を欠失したペプチドを合成する株（例えば
ＪＭ８３）を宿主として用い、これにクローニング用ベ
クターとして、ラクトースオペロン（ｌａｃ）領域を有
するプラスミド（例えば各種ｐＵＣ）を組合せて用い、
ｌａｃ領域のポリリンカーを利用して目的とするＤＮＡ
断片のクローニングを行う。
【００１４】この方法において、目的とするＤＮＡ断片
の挿入が行われなかったプラスミドにより形質転換され
た宿主は、Ａｍｐ含有培地で増殖でき、さらにｌａｃ領
域からβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１４６アミノ
酸を持つペプチドが発現補給されると、これと宿主から
合成されるＮ末端が欠失したβ−ガラクトシダーゼとが
互いに補い合うα−相補性によってβ−ガラクトシダー
ゼ活性が発現され、Ｘ−ｇａｌ存在下でこれを増殖させ
ると、Ｘ−ｇａｌの分解による青色の呈色がコロニーに
観察できる。
の挿入が行われなかったプラスミドにより形質転換され
た宿主は、Ａｍｐ含有培地で増殖でき、さらにｌａｃ領
域からβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１４６アミノ
酸を持つペプチドが発現補給されると、これと宿主から
合成されるＮ末端が欠失したβ−ガラクトシダーゼとが
互いに補い合うα−相補性によってβ−ガラクトシダー
ゼ活性が発現され、Ｘ−ｇａｌ存在下でこれを増殖させ
ると、Ｘ−ｇａｌの分解による青色の呈色がコロニーに
観察できる。
【００１５】これに対して、ｌａｃ領域のポリリンカー
部位に目的とするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで
形質転換された宿主では、上述のα−相補性は成立せ
ず、Ｘ−ｇａｌ存在下での増殖において青色呈色のない
白色コロニーが現われる。
部位に目的とするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで
形質転換された宿主では、上述のα−相補性は成立せ
ず、Ｘ−ｇａｌ存在下での増殖において青色呈色のない
白色コロニーが現われる。
【００１６】従って、Ｘ−ｇａｌ存在下での培養におい
て青色呈色があるかどうかによって目的としたＤＮＡ断
片の挿入を直接確認できる。
て青色呈色があるかどうかによって目的としたＤＮＡ断
片の挿入を直接確認できる。
【００１７】ところが、この方法では、クローニング用
の宿主がＮ末端を欠失したβ−ガラクトシダーゼを合成
する株に限定されてしまい、汎用性に乏しく、また操作
条件によってはコロニーの呈色状態の判別が困難である
という問題があった。
の宿主がＮ末端を欠失したβ−ガラクトシダーゼを合成
する株に限定されてしまい、汎用性に乏しく、また操作
条件によってはコロニーの呈色状態の判別が困難である
という問題があった。
【００１８】しかも、上述のｐＢＲ３２２を用いる方法
及びβ−ガラクトシダーゼ活性を利用する方法のいずれ
の方法も、目的とするＤＮＡ断片の挿入の直接確認に必
要な十分な形質転換体の増殖菌体量を得るための操作が
必要であり、小さなスケールでのクローニングにおいて
も作業量が多いという欠点がある。
及びβ−ガラクトシダーゼ活性を利用する方法のいずれ
の方法も、目的とするＤＮＡ断片の挿入の直接確認に必
要な十分な形質転換体の増殖菌体量を得るための操作が
必要であり、小さなスケールでのクローニングにおいて
も作業量が多いという欠点がある。
【００１９】本発明は以上述べたクローニングにおける
問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、宿主が
限定されず、より簡易なプロセスで目的とするＤＮＡ断
片のクローニング用ベクターへの挿入を直接確認できる
構成のクローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌
の選択的取得方法を提供することにある。
問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、宿主が
限定されず、より簡易なプロセスで目的とするＤＮＡ断
片のクローニング用ベクターへの挿入を直接確認できる
構成のクローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌
の選択的取得方法を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明のクローニング用
ベクターは、宿主としての大腸菌内での複製のためのオ
リジンと、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増殖
を阻害する膜タンパク質としてのバクテリオオプシンを
コードする阻害タンパク質遺伝子と、クローニングすべ
きＤＮＡ断片挿入用の制限酵素切断部位とを有し、前記
プロモーターと前記阻害タンパク質遺伝子とが、該阻害
タンパク質遺伝子の誘導発現が該プロモーターにより行
われ、該宿主の増殖が阻害される様にバクテリオオプシ
ンが該宿主に発現する位置関係で配置されており、かつ
前記制限酵素切断部位が、該制限酵素切断部位を利用し
たクローニングすべきＤＮＡ断片の挿入により前記阻害
タンパク質遺伝子の前記プロモーターによる誘導発現が
不能となる位置に設けられている、形質転換された大腸
菌の選択的な取得を可能とするためのクローニング用ベ
クターである。また、本発明にかかる形質転換された大
腸菌の取得方法は、クローニングすべきＤＮＡ断片が挿
入され、形質転換されている大腸菌を選択的に取得する
方法であって、 （ａ）宿主としての大腸菌内での複製のためのオリジン
と、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増殖を阻害
する膜タンパク質としてのバクテリオオプシンをコード
する阻害タンパク質遺伝子と、該ＤＮＡ断片挿入用の制
限酵素切断部位とを有し、前記プロモーターと前記阻害
タンパク質遺伝子とが、該阻害タンパク質遺伝子の誘導
発現が該プロモーターにより行われ、該宿主の増殖が阻
害される様にバクテリオオプシンが該宿主に発現する位
置関係で配置されており、かつ前記制限酵素切断部位
が、該制限酵素切断部位を利用した該ＤＮＡ断片の挿入
により前記阻害タンパク質遺伝子の前記プロモーターに
よる誘導発現が不能となる位置に設けられているクロー
ニング用ベクターに対して、該ＤＮＡ断片を該制限酵素
切断部位に挿入し、前記阻害タンパク質遺伝子の前記プ
ロモーターによる誘導発現が不能となったクローニング
用ベクターを宿主としての大腸菌に導入する工程；およ
び （ｂ）工程（ａ）によって得られた形質転換されている
大腸菌を、形質転換されている大腸菌のみが増殖可能な
ように培養する工程、を有することを特徴とする。
ベクターは、宿主としての大腸菌内での複製のためのオ
リジンと、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増殖
を阻害する膜タンパク質としてのバクテリオオプシンを
コードする阻害タンパク質遺伝子と、クローニングすべ
きＤＮＡ断片挿入用の制限酵素切断部位とを有し、前記
プロモーターと前記阻害タンパク質遺伝子とが、該阻害
タンパク質遺伝子の誘導発現が該プロモーターにより行
われ、該宿主の増殖が阻害される様にバクテリオオプシ
ンが該宿主に発現する位置関係で配置されており、かつ
前記制限酵素切断部位が、該制限酵素切断部位を利用し
たクローニングすべきＤＮＡ断片の挿入により前記阻害
タンパク質遺伝子の前記プロモーターによる誘導発現が
不能となる位置に設けられている、形質転換された大腸
菌の選択的な取得を可能とするためのクローニング用ベ
クターである。また、本発明にかかる形質転換された大
腸菌の取得方法は、クローニングすべきＤＮＡ断片が挿
入され、形質転換されている大腸菌を選択的に取得する
方法であって、 （ａ）宿主としての大腸菌内での複製のためのオリジン
と、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増殖を阻害
する膜タンパク質としてのバクテリオオプシンをコード
する阻害タンパク質遺伝子と、該ＤＮＡ断片挿入用の制
限酵素切断部位とを有し、前記プロモーターと前記阻害
タンパク質遺伝子とが、該阻害タンパク質遺伝子の誘導
発現が該プロモーターにより行われ、該宿主の増殖が阻
害される様にバクテリオオプシンが該宿主に発現する位
置関係で配置されており、かつ前記制限酵素切断部位
が、該制限酵素切断部位を利用した該ＤＮＡ断片の挿入
により前記阻害タンパク質遺伝子の前記プロモーターに
よる誘導発現が不能となる位置に設けられているクロー
ニング用ベクターに対して、該ＤＮＡ断片を該制限酵素
切断部位に挿入し、前記阻害タンパク質遺伝子の前記プ
ロモーターによる誘導発現が不能となったクローニング
用ベクターを宿主としての大腸菌に導入する工程；およ
び （ｂ）工程（ａ）によって得られた形質転換されている
大腸菌を、形質転換されている大腸菌のみが増殖可能な
ように培養する工程、を有することを特徴とする。
【００２１】本発明のクローニング用ベクターに用いる
宿主での複製のためのオリジンは、クローニングに用い
る宿主の種類に応じて選択される。
宿主での複製のためのオリジンは、クローニングに用い
る宿主の種類に応じて選択される。
【００２２】複製オリジンとしては、大腸菌由来のプラ
スミドの有する複製オリジンが利用でき、例えばプラス
ミドｐＢＲ３２２などの有する複製オリジンが利用でき
る。
スミドの有する複製オリジンが利用でき、例えばプラス
ミドｐＢＲ３２２などの有する複製オリジンが利用でき
る。
【００２３】本発明のクローニング用ベクターに用いる
プロモーターは、宿主の増殖を阻害するタンパク質をコ
ードする阻害タンパク質遺伝子の誘導発現を行うために
用いられるものであり、用いる宿主の種類に応じて選択
される。このプロモーターとしては、発現誘導剤の添加
により活性化されるものや、温度シフトによって活性化
されるものなど種々のタイプのものが利用できる。
プロモーターは、宿主の増殖を阻害するタンパク質をコ
ードする阻害タンパク質遺伝子の誘導発現を行うために
用いられるものであり、用いる宿主の種類に応じて選択
される。このプロモーターとしては、発現誘導剤の添加
により活性化されるものや、温度シフトによって活性化
されるものなど種々のタイプのものが利用できる。
【００２４】プロモーターとしては、例えば、ｌａｃプ
ロモーター・オペレーター領域、ｔｒｐプロモーター・
オペレーター領域、ＰLプロモーター・オペレーター領
域、ｔａｃプロモーターなどを利用することができる。
ロモーター・オペレーター領域、ｔｒｐプロモーター・
オペレーター領域、ＰLプロモーター・オペレーター領
域、ｔａｃプロモーターなどを利用することができる。
【００２５】この誘導可能なプロモーターを利用するこ
とによって、宿主の増殖を阻害するタンパク質の発現を
外部因子を用いて制御することが可能となる。
とによって、宿主の増殖を阻害するタンパク質の発現を
外部因子を用いて制御することが可能となる。
【００２６】本発明のクローニング用ベクターに用いる
阻害タンパク質遺伝子は、上記のプロモーターに、機能
的に、すなわち該プロモーターでの誘導発現が可能な位
置に連結される。この遺伝子としては、その発現によっ
て宿主の増殖を阻害できるバクテリオオプシン遺伝子が
利用される。
阻害タンパク質遺伝子は、上記のプロモーターに、機能
的に、すなわち該プロモーターでの誘導発現が可能な位
置に連結される。この遺伝子としては、その発現によっ
て宿主の増殖を阻害できるバクテリオオプシン遺伝子が
利用される。
【００２７】すなわち、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株、
ＤＨ１２１０ＨＰ株等の大腸菌を宿主として利用する場
合は、宿主の増殖を阻害するタンパク質としてバクテリ
オオプシンが利用でき、これをコードする遺伝子［Khor
anら、Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A (1981) 78, 6744-
6748］をプロモーターでの発現が可能な位置に連結す
る。
ＤＨ１２１０ＨＰ株等の大腸菌を宿主として利用する場
合は、宿主の増殖を阻害するタンパク質としてバクテリ
オオプシンが利用でき、これをコードする遺伝子［Khor
anら、Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A (1981) 78, 6744-
6748］をプロモーターでの発現が可能な位置に連結す
る。
【００２８】バクテリオオプシンを用いた場合の宿主の
増殖阻害効果のメカニズムは詳細に解明されていない
が、発現した膜タンパク質であるバクテリオオプシンが
宿主である大腸菌の膜機能を損なうために、宿主の増殖
が阻害されるものと考えられる。
増殖阻害効果のメカニズムは詳細に解明されていない
が、発現した膜タンパク質であるバクテリオオプシンが
宿主である大腸菌の膜機能を損なうために、宿主の増殖
が阻害されるものと考えられる。
【００２９】なお、この阻害タンパク質遺伝子として
は、宿主増殖の阻害活性の発現に必要なペプチド部分を
コードする領域を少なくとも有していれば良く、上記の
阻害タンパク質の全体をコードする必要はない。
は、宿主増殖の阻害活性の発現に必要なペプチド部分を
コードする領域を少なくとも有していれば良く、上記の
阻害タンパク質の全体をコードする必要はない。
【００３０】また、阻害タンパク質遺伝子は、宿主増殖
の阻害効果を損なわない範囲内で、あるいは該阻害効果
を高めるために、天然の塩基配列に、配列の組換え、変
更、欠失、挿入等がなされたものであっても良い。
の阻害効果を損なわない範囲内で、あるいは該阻害効果
を高めるために、天然の塩基配列に、配列の組換え、変
更、欠失、挿入等がなされたものであっても良い。
【００３１】更に、分泌型の場合は、阻害タンパク質遺
伝子中に分泌シグナルをコードする領域を含有させて用
いる。
伝子中に分泌シグナルをコードする領域を含有させて用
いる。
【００３２】なお、この分泌シグナルをコードする領域
は、用いる阻害タンパク質固有のものでも、他の分泌型
タンパク質のものでも良い。また、分泌により宿主阻害
効果を発揮できるもので、その遺伝子に分泌シグナルを
コードする領域を有していないものを用いる場合は、他
の分泌型タンパク質の適当な分泌シグナルをコードする
領域を組合せて用いる。このような目的で利用できる分
泌シグナルをコードする領域としては、大腸菌で機能で
きるシグナルシークエンスが利用できる。
は、用いる阻害タンパク質固有のものでも、他の分泌型
タンパク質のものでも良い。また、分泌により宿主阻害
効果を発揮できるもので、その遺伝子に分泌シグナルを
コードする領域を有していないものを用いる場合は、他
の分泌型タンパク質の適当な分泌シグナルをコードする
領域を組合せて用いる。このような目的で利用できる分
泌シグナルをコードする領域としては、大腸菌で機能で
きるシグナルシークエンスが利用できる。
【００３３】本発明のクローニング用ベクターにおける
クローニングすべきＤＮＡ断片挿入用の制限酵素切断部
位は、そこに目的とするＤＮＡ断片が挿入されることで
上記の阻害タンパク質遺伝子のプロモーターによる誘導
発現が不能となる位置に設けられる。
クローニングすべきＤＮＡ断片挿入用の制限酵素切断部
位は、そこに目的とするＤＮＡ断片が挿入されることで
上記の阻害タンパク質遺伝子のプロモーターによる誘導
発現が不能となる位置に設けられる。
【００３４】なお、この制限酵素切断部位としては、特
に制限はなく、また、２以上の制限酵素切断部位をＤＮ
Ａ断片挿入用として用いても良い。なお、このＤＮＡ断
片挿入用の制限酵素切断部位としては、クローニング用
ベクターの他の部分に制限酵素切断部位が存在する場合
には、それと異なる制限酵素により切断される部位を用
いると、一つの制限酵素を用いた処理で所望とする部分
のみを切断できるので都合が良い。
に制限はなく、また、２以上の制限酵素切断部位をＤＮ
Ａ断片挿入用として用いても良い。なお、このＤＮＡ断
片挿入用の制限酵素切断部位としては、クローニング用
ベクターの他の部分に制限酵素切断部位が存在する場合
には、それと異なる制限酵素により切断される部位を用
いると、一つの制限酵素を用いた処理で所望とする部分
のみを切断できるので都合が良い。
【００３５】この制限酵素切断部位を設ける位置として
は、プロモーターから阻害タンパク質遺伝子までの領域
内の上述の効果が得られる位置を選択して用いると良
い。
は、プロモーターから阻害タンパク質遺伝子までの領域
内の上述の効果が得られる位置を選択して用いると良
い。
【００３６】そのような位置としては、例えば、 １）プロモーター領域内にある制限酵素切断部位で、そ
こに目的とするＤＮＡ断片が挿入されるとプロモーター
の機能が損なわれて、該プロモーターによる阻害タンパ
ク質遺伝子の発現が不能となるもの。 ２）プロモーター領域と阻害タンパク質遺伝子との間の
領域にある制限酵素切断部位で、そこに目的とするＤＮ
Ａ断片が挿入されるとプロモーターによる阻害タンパク
質遺伝子の発現が阻止されるもの。 ３）阻害タンパク質遺伝子領域内にあるにある制限酵素
切断部位で、そこに目的とするＤＮＡ断片が挿入される
と阻害タンパク質遺伝子の構成が崩されて、その発現が
不能となる、あるいは該領域由来のタンパク質が発現さ
れても、所定の宿主の増殖阻害活性が失われるもの。
こに目的とするＤＮＡ断片が挿入されるとプロモーター
の機能が損なわれて、該プロモーターによる阻害タンパ
ク質遺伝子の発現が不能となるもの。 ２）プロモーター領域と阻害タンパク質遺伝子との間の
領域にある制限酵素切断部位で、そこに目的とするＤＮ
Ａ断片が挿入されるとプロモーターによる阻害タンパク
質遺伝子の発現が阻止されるもの。 ３）阻害タンパク質遺伝子領域内にあるにある制限酵素
切断部位で、そこに目的とするＤＮＡ断片が挿入される
と阻害タンパク質遺伝子の構成が崩されて、その発現が
不能となる、あるいは該領域由来のタンパク質が発現さ
れても、所定の宿主の増殖阻害活性が失われるもの。
【００３７】本発明のクローニング用ベクターには、上
記の各構成要素に加えて、各種マーカー遺伝子、ターミ
ネーターなどを必要に応じて組合せて用いても良い。
記の各構成要素に加えて、各種マーカー遺伝子、ターミ
ネーターなどを必要に応じて組合せて用いても良い。
【００３８】また、本発明に用いる宿主としては、例え
ば、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株、ＤＨ１２１０ＨＰ株
等の大腸菌などを挙げることができる。
ば、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株、ＤＨ１２１０ＨＰ株
等の大腸菌などを挙げることができる。
【００３９】
【実施例】以下実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。
る。
【００４０】実施例１ クローニング用ベクターの構築 １−１）プロモーターを含むＤＮＡ断片の調製（図１参
照） プラスミドｐＵＹＯ−１の構築 ｌａｃプロモーター（ｌａｃＰ）とｔａｃプロモーター
（ｔａｃＰ）とが直列に配列されたプロモーター領域を
有するプラスミドｐＮＨ８ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）を、常法に従ってＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化
し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により大
ＤＮＡ断片を分離、回収した。
照） プラスミドｐＵＹＯ−１の構築 ｌａｃプロモーター（ｌａｃＰ）とｔａｃプロモーター
（ｔａｃＰ）とが直列に配列されたプロモーター領域を
有するプラスミドｐＮＨ８ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）を、常法に従ってＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化
し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により大
ＤＮＡ断片を分離、回収した。
【００４１】１−２）プラスミドｐＵＹＯ−１の構築
（図２） プラスミドｐＵＣ１９を常法に従ってＢａｍＨＩ及びＰ
ｓｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳
動法により大ＤＮＡ断片を分離、回収した。
（図２） プラスミドｐＵＣ１９を常法に従ってＢａｍＨＩ及びＰ
ｓｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳
動法により大ＤＮＡ断片を分離、回収した。
【００４２】次に、バクテリオオプシン構造遺伝子（分
泌シグナルをコードする領域を含む）を含むＢａｍＨＩ
−ＰｓｔＩＤＮＡ断片［Khorana ら，Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.(1981) 78, 6744-6748 ］を調製し、こ
れを先に得たｐＵＣ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩＤ
ＮＡ断片（大断片）と常法に従ってリガーゼの存在下で
反応させた。
泌シグナルをコードする領域を含む）を含むＢａｍＨＩ
−ＰｓｔＩＤＮＡ断片［Khorana ら，Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.(1981) 78, 6744-6748 ］を調製し、こ
れを先に得たｐＵＣ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩＤ
ＮＡ断片（大断片）と常法に従ってリガーゼの存在下で
反応させた。
【００４３】得られた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、
ＴＡＫＡＲＡ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地
で培養し、Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体とし
て識別した。この形質転換体を、更に単離、培養し、得
られた培養菌体からプラスミドを常法に従って単離し
て、プラスミドｐＵＹＯ−１を得た。なお、目的とする
プラスミドが得られたかどうかは、コロニーハイブリダ
イゼーション及びサザーンハイブリダイゼーションにに
より確認した。
ＴＡＫＡＲＡ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地
で培養し、Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体とし
て識別した。この形質転換体を、更に単離、培養し、得
られた培養菌体からプラスミドを常法に従って単離し
て、プラスミドｐＵＹＯ−１を得た。なお、目的とする
プラスミドが得られたかどうかは、コロニーハイブリダ
イゼーション及びサザーンハイブリダイゼーションにに
より確認した。
【００４４】１−３）プラスミドｐＵＹＯ−２の構築 以下の操作により、上記１−２）項で得たｐＵＹＯ−１
のバクテリオオプシン構造遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩＤＮＡ断片領域の３’末端側から余分な部分を削
除し、バクテリオオプシン構造遺伝子の直後にＳａｃＩ
部位を導入することによってｐＵＹＯ−２を構築した。
のバクテリオオプシン構造遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩＤＮＡ断片領域の３’末端側から余分な部分を削
除し、バクテリオオプシン構造遺伝子の直後にＳａｃＩ
部位を導入することによってｐＵＹＯ−２を構築した。
【００４５】まず、下記塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドＡ1 及びＡ2 ； Ａ1 5' GGCCGCGACC AGCTAGTAAT GAGCTCTGCA 3' （配
列番号１） Ａ2 3' CGCTGG TCGATCATTA CTCGAG 5' （配
列番号２） をＤＮＡ合成機によりそれぞれ合成し、これらを常法に
よってアニールして、２本鎖リンカーＤＮＡ断片（リン
カーＩ）を得た。
オチドＡ1 及びＡ2 ； Ａ1 5' GGCCGCGACC AGCTAGTAAT GAGCTCTGCA 3' （配
列番号１） Ａ2 3' CGCTGG TCGATCATTA CTCGAG 5' （配
列番号２） をＤＮＡ合成機によりそれぞれ合成し、これらを常法に
よってアニールして、２本鎖リンカーＤＮＡ断片（リン
カーＩ）を得た。
【００４６】次に、上記１−２）項で得たｐＵＹＯ−１
を常法に従ってＸｍａＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、得
られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によって、大Ｄ
ＮＡ断片を分離、回収した。
を常法に従ってＸｍａＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、得
られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によって、大Ｄ
ＮＡ断片を分離、回収した。
【００４７】このＸｍａＩＩＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片
（大ＤＮＡ断片）と、先に調製したリンカーＩとを、リ
ガーゼの存在下で常法に従って反応させ、得られた得ら
れた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、ＴＡＫＡＲＡ］に
導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で培養し、Ａｍｐ
耐性を示すコロニーを形質転換体として識別した。この
形質転換体を、更に単離、培養し、得られた培養菌体か
らプラスミドを常法に従って単離して、プラスミドｐＵ
ＹＯ−２を得た。なお、目的とするプラスミドが得られ
たかどうかは、各種制限酵素での完全消化後の電気泳動
パターンにより確認した。
（大ＤＮＡ断片）と、先に調製したリンカーＩとを、リ
ガーゼの存在下で常法に従って反応させ、得られた得ら
れた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、ＴＡＫＡＲＡ］に
導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で培養し、Ａｍｐ
耐性を示すコロニーを形質転換体として識別した。この
形質転換体を、更に単離、培養し、得られた培養菌体か
らプラスミドを常法に従って単離して、プラスミドｐＵ
ＹＯ−２を得た。なお、目的とするプラスミドが得られ
たかどうかは、各種制限酵素での完全消化後の電気泳動
パターンにより確認した。
【００４８】１−４）プラスミドｐＵＹＯ−３の構築
（図４） 以下の操作により、上記１−３）項で得たｐＵＹＯ−２
のバクテリオオプシン構造遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｃＩＤＮＡ断片領域の５’末端側から余分な部分を削
除し、バクテリオオプシン構造遺伝子の直前にＢａｍＨ
ＩとＰｓｔＩ部位を導入することによってｐＵＹＯ−３
を構築した。
（図４） 以下の操作により、上記１−３）項で得たｐＵＹＯ−２
のバクテリオオプシン構造遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｃＩＤＮＡ断片領域の５’末端側から余分な部分を削
除し、バクテリオオプシン構造遺伝子の直前にＢａｍＨ
ＩとＰｓｔＩ部位を導入することによってｐＵＹＯ−３
を構築した。
【００４９】まず、下記塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドＢ1 及びＢ2 ； Ｂ1 5' GATCCTGCAG GAGGTTTGAA CTCATGCAGG CCCAGATCAC CGGACGT 3' （配列番号３） Ｂ2 3' GACGTC CTCCAAACTT GAGTACGTCC GGGTCTAGTG GCCTGCA GGCC 5' （配列番号４） をＤＮＡ合成機によりそれぞれ合成し、これらを常法に
よってアニールして、２本鎖リンカーＤＮＡ断片（リン
カーＩＩ）を得た。
オチドＢ1 及びＢ2 ； Ｂ1 5' GATCCTGCAG GAGGTTTGAA CTCATGCAGG CCCAGATCAC CGGACGT 3' （配列番号３） Ｂ2 3' GACGTC CTCCAAACTT GAGTACGTCC GGGTCTAGTG GCCTGCA GGCC 5' （配列番号４） をＤＮＡ合成機によりそれぞれ合成し、これらを常法に
よってアニールして、２本鎖リンカーＤＮＡ断片（リン
カーＩＩ）を得た。
【００５０】次に、上記１−３）項で得たｐＵＹＯ−２
を常法に従ってＢａｍＨＩ及びＡｃｃｃＩＩＩで消化
し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によっ
て、ＢａｍＨＩ−ＡｃｃｃＩＩＩＤＮＡ断片（大ＤＮＡ
断片）を分離、回収した。
を常法に従ってＢａｍＨＩ及びＡｃｃｃＩＩＩで消化
し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によっ
て、ＢａｍＨＩ−ＡｃｃｃＩＩＩＤＮＡ断片（大ＤＮＡ
断片）を分離、回収した。
【００５１】このＢａｍＨＩ−ＡｃｃｃＩＩＩＤＮＡ断
片（大ＤＮＡ断片）と、先に調製したリンカーＩＩと
を、リガーゼの存在下で常法に従って反応させ、得られ
た得られた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、ＴＡＫＡＲ
Ａ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で培養し、
Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体として識別し
た。この形質転換体を、更に単離、培養し、得られた培
養菌体からプラスミドを常法に従って単離して、プラス
ミドｐＵＹＯ−３を得た。なお、目的とするプラスミド
が得られたかどうかは、各種制限酵素での完全消化後の
電気泳動パターンにより確認した。
片（大ＤＮＡ断片）と、先に調製したリンカーＩＩと
を、リガーゼの存在下で常法に従って反応させ、得られ
た得られた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、ＴＡＫＡＲ
Ａ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で培養し、
Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体として識別し
た。この形質転換体を、更に単離、培養し、得られた培
養菌体からプラスミドを常法に従って単離して、プラス
ミドｐＵＹＯ−３を得た。なお、目的とするプラスミド
が得られたかどうかは、各種制限酵素での完全消化後の
電気泳動パターンにより確認した。
【００５２】１−５）プラスミドｐＵＹＯ−４の構築
（図５） 前記１−４）項で得たｐＵＹＯ−３を、常法に従ってＢ
ａｍＨＩ及びＳｃａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片混
合物から電気泳動法によって、ＢａｍＨＩ−ＳｃａＩＤ
ＮＡ断片（小断片）を分離、回収した。
（図５） 前記１−４）項で得たｐＵＹＯ−３を、常法に従ってＢ
ａｍＨＩ及びＳｃａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片混
合物から電気泳動法によって、ＢａｍＨＩ−ＳｃａＩＤ
ＮＡ断片（小断片）を分離、回収した。
【００５３】次に、この小断片と、前記１−１）項で得
た大ＤＮＡ断片とを、リガーゼの存在下で常法に従って
反応させ、得られた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、Ｔ
ＡＫＡＲＡ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で
培養し、Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体として
識別した。この形質転換体を、更に単離、培養し、得ら
れた培養菌体からプラスミドを常法に従って単離して、
本発明のクローニング用ベクターとしてのプラスミドｐ
ＵＹＯ−４を得た。なお、この形質転換体の識別、及び
プラスミド単離用の培養は、バクテリオオプシンが発現
しない条件、すなわち、ヒートショックを与えず、また
安全をみて３０℃で培養を行った。また、目的とするプ
ラスミドが得られたかどうかは、各種制限酵素での完全
消化後の電気泳動パターンにより確認した。
た大ＤＮＡ断片とを、リガーゼの存在下で常法に従って
反応させ、得られた反応物を大腸菌［ＪＭ１０９株、Ｔ
ＡＫＡＲＡ］に導入し、これをＡｍｐを含む選択培地で
培養し、Ａｍｐ耐性を示すコロニーを形質転換体として
識別した。この形質転換体を、更に単離、培養し、得ら
れた培養菌体からプラスミドを常法に従って単離して、
本発明のクローニング用ベクターとしてのプラスミドｐ
ＵＹＯ−４を得た。なお、この形質転換体の識別、及び
プラスミド単離用の培養は、バクテリオオプシンが発現
しない条件、すなわち、ヒートショックを与えず、また
安全をみて３０℃で培養を行った。また、目的とするプ
ラスミドが得られたかどうかは、各種制限酵素での完全
消化後の電気泳動パターンにより確認した。
【００５４】実施例２ 本発明のクローニング用ベクターを用いたクローニング 実施例１の１−５）項で得たｐＵＹＯ−４を、ＳｐｈＩ
で常法に従って消化し、環状プラスミドを開環してＤＮ
Ａ断片とした。
で常法に従って消化し、環状プラスミドを開環してＤＮ
Ａ断片とした。
【００５５】次に、常法に従って調製したλファージＤ
ＮＡのＳｐｈＩ消化物から電気泳動法によって３．０ｋ
ｂＤＮＡ断片と２．２ｋｂＤＮＡ断片を分離、回収し
た。
ＮＡのＳｐｈＩ消化物から電気泳動法によって３．０ｋ
ｂＤＮＡ断片と２．２ｋｂＤＮＡ断片を分離、回収し
た。
【００５６】次に、この２種のＤＮＡ断片の混合物と、
先に得たｐＵＹＯ−４のＳｐｈＩ消化物とをリガーゼの
存在下で常法に従って反応させた後、得られた反応物を
大腸菌ＤＨ１２１ＯＨＰ株のコンピテントセルに導入
し、３０℃、６０分間、ＳＯＣ培地（０．００５％濃度
のＡｍｐを含む）で培養した。得られた培養菌体を、更
に２×ＹＴ培地（０．００５％濃度のＡｍｐを含む）の
プレートに植え継いで、４２℃で一晩培養した。
先に得たｐＵＹＯ−４のＳｐｈＩ消化物とをリガーゼの
存在下で常法に従って反応させた後、得られた反応物を
大腸菌ＤＨ１２１ＯＨＰ株のコンピテントセルに導入
し、３０℃、６０分間、ＳＯＣ培地（０．００５％濃度
のＡｍｐを含む）で培養した。得られた培養菌体を、更
に２×ＹＴ培地（０．００５％濃度のＡｍｐを含む）の
プレートに植え継いで、４２℃で一晩培養した。
【００５７】プレートに現われたコロニーから２４個の
株を選択し、各株から個々に菌体を２×ＹＴ培地に植菌
し、３７℃で一晩振とう培養した。
株を選択し、各株から個々に菌体を２×ＹＴ培地に植菌
し、３７℃で一晩振とう培養した。
【００５８】その結果、２３個の株については菌体増殖
が認められ、１つの株については菌体増殖が認められな
かった。
が認められ、１つの株については菌体増殖が認められな
かった。
【００５９】さらに、増殖の見られた２３株の各培養液
から培養菌体をそれぞれ回収し、回収された培養菌体か
らプラスミドを常法に応じて調製し、そのＳｐｈＩ消化
物の電気泳動パターンを分析した。その結果、１４個の
株からのプラスミドに３．０ｋｂＤＮＡ断片が挿入さ
れ、また９個の株からのプラスミドに２．２ｋｂＤＮＡ
断片が挿入されていることが確認できた。すなわち、Ｄ
ＮＡ断片の挿入のなかったプラスミド（ｓｅｌｆ ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ）は増殖菌体には存在しなかった。
から培養菌体をそれぞれ回収し、回収された培養菌体か
らプラスミドを常法に応じて調製し、そのＳｐｈＩ消化
物の電気泳動パターンを分析した。その結果、１４個の
株からのプラスミドに３．０ｋｂＤＮＡ断片が挿入さ
れ、また９個の株からのプラスミドに２．２ｋｂＤＮＡ
断片が挿入されていることが確認できた。すなわち、Ｄ
ＮＡ断片の挿入のなかったプラスミド（ｓｅｌｆ ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ）は増殖菌体には存在しなかった。
【００６０】
【発明の効果】本発明のクローニング用ベクターを用い
れば、目的とするＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを有
する宿主だけが増殖できることになるので、形質転換体
を培養するという簡易な操作だけで、目的とする組換え
ＤＮＡが得られたかどうかを直接確認することができ
る。
れば、目的とするＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを有
する宿主だけが増殖できることになるので、形質転換体
を培養するという簡易な操作だけで、目的とする組換え
ＤＮＡが得られたかどうかを直接確認することができ
る。
【００６１】また、本発明のクローニング用ベクターを
用いたクローニングにおいては、ベクター断片と目的と
するＤＮＡ断片の反応物を導入した宿主の培養による形
質転換体の選択の際に、増殖菌体のコロニーの出現の有
無によって目的とするＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡを
有する形質転換体の選択を容易に行うことができ、より
簡易なプロセスでのクローニングが可能となり、小さな
スケールでのクローニングもより簡便に行うことができ
る。
用いたクローニングにおいては、ベクター断片と目的と
するＤＮＡ断片の反応物を導入した宿主の培養による形
質転換体の選択の際に、増殖菌体のコロニーの出現の有
無によって目的とするＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡを
有する形質転換体の選択を容易に行うことができ、より
簡易なプロセスでのクローニングが可能となり、小さな
スケールでのクローニングもより簡便に行うことができ
る。
【００６２】
【００６３】
【配列番号】：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 二本鎖リンカーＩ（ＸｍａＩＩＩ−ＳａｃＩＤＮＡ断
片）調製用 配列 GGCCGCGACC AGCTAGTAAT GAGCTCTGCA 30
片）調製用 配列 GGCCGCGACC AGCTAGTAAT GAGCTCTGCA 30
【００６４】
【配列番号】：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 二本鎖リンカーＩ（ＸｍａＩＩＩ−ＳａｃＩＤＮＡ断
片）調製用 配列 GAGCTCATTA CTAGCTGGTC GC 22
片）調製用 配列 GAGCTCATTA CTAGCTGGTC GC 22
【００６５】
【配列番号】 ３ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 二本鎖リンカーＩＩ（ＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩＤＮＡ断
片）調製用 配列 GATCCTGCAG GAGGTTTGAA CTCATGCAGG CCCAGATCAC CGGACGT 47
片）調製用 配列 GATCCTGCAG GAGGTTTGAA CTCATGCAGG CCCAGATCAC CGGACGT 47
【００６６】
【配列番号】 ４ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 二本鎖リンカーＩＩ（ＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩＤＮＡ断
片）調製用 配列CCGGACGTCC GGTGATCTGG GCCTGCATGA GTTCAAACCT CC
TGCAG
片）調製用 配列CCGGACGTCC GGTGATCTGG GCCTGCATGA GTTCAAACCT CC
TGCAG
【図１】プラスミドｐＮＨ８ａからのＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｃＩＤＮＡ断片の調製過程を示す図である。
ｃＩＤＮＡ断片の調製過程を示す図である。
【図２】プラスミドｐＵＹＯ−１の構築過程を示す図で
ある。
ある。
【図３】プラスミドｐＵＹＯ−２の構築過程を示す図で
ある。
ある。
【図４】プラスミドｐＵＹＯ−３の構築過程を示す図で
ある。
ある。
【図５】プラスミドｐＵＹＯ−４の構築過程を示す図で
ある。
ある。
ｌａｃＰ ｌａｃプロモーター領域 ｔａｃＰ ｔａｃプロモーター領域 Ａｍｐr アンピシリン耐性遺伝子領域 ｇａｌｋ ガラクトースオペロン領域 ＢＯ バクテリオオプシン遺伝子領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．50，Ｎｏ．１−３ （1986）ｐ．３−40 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 262，ＮＯ．19（1987）ｐ．9246−9254 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 宿主としての大腸菌内での複製のための
オリジンと、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増
殖を阻害する膜タンパク質としてのバクテリオオプシン
をコードする阻害タンパク質遺伝子と、クローニングす
べきＤＮＡ断片挿入用の制限酵素切断部位とを有し、前
記プロモーターと前記阻害タンパク質遺伝子とが、該阻
害タンパク質遺伝子の誘導発現が該プロモーターにより
行われ、該宿主の増殖が阻害される様にバクテリオオプ
シンが該宿主に発現する位置関係で配置されており、か
つ前記制限酵素切断部位が、該制限酵素切断部位を利用
したクローニングすべきＤＮＡ断片の挿入により前記阻
害タンパク質遺伝子の前記プロモーターによる誘導発現
が不能となる位置に設けられている、形質転換された大
腸菌の選択的な取得を可能とするためのクローニング用
ベクター。 - 【請求項２】 クローニングすべきＤＮＡ断片が挿入さ
れ、形質転換されている大腸菌を選択的に取得する方法
であって、 （ａ）宿主としての大腸菌内での複製のためのオリジン
と、誘導可能なプロモーターと、前記宿主の増殖を阻害
する膜タンパク質としてのバクテリオオプシンをコード
する阻害タンパク質遺伝子と、該ＤＮＡ断片挿入用の制
限酵素切断部位とを有し、前記プロモーターと前記阻害
タンパク質遺伝子とが、該阻害タンパク質遺伝子の誘導
発現が該プロモーターにより行われ、該宿主の増殖が阻
害される様にバクテリオオプシンが該宿主に発現する位
置関係で配置されており、かつ前記制限酵素切断部位
が、該制限酵素切断部位を利用した該ＤＮＡ断片の挿入
により前記阻害タンパク質遺伝子の前記プロモーターに
よる誘導発現が不能となる位置に設けられているクロー
ニング用ベクターに対して、該ＤＮＡ断片を該制限酵素
切断部位に挿入し、前記阻害タンパク質遺伝子の前記プ
ロモーターによる誘導発現が不能となったクローニング
用ベクターを宿主としての大腸菌に導入する工程；およ
び （ｂ）工程（ａ）によって得られた形質転換されている
大腸菌を、形質転換されている大腸菌のみが増殖可能な
ように培養する工程、 を有することを特徴とする形質転換されている大腸菌の
選択的取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03048705A JP3115622B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03048705A JP3115622B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04267881A JPH04267881A (ja) | 1992-09-24 |
| JP3115622B2 true JP3115622B2 (ja) | 2000-12-11 |
Family
ID=12810735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03048705A Expired - Fee Related JP3115622B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3115622B2 (ja) |
-
1991
- 1991-02-22 JP JP03048705A patent/JP3115622B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１−３（１９８６）ｐ．３−４０ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６２，ＮＯ．１９（１９８７）ｐ．９２４６−９２５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04267881A (ja) | 1992-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kahmann et al. | G inversion in bacteriophage Mu DNA is stimulated by a site within the invertase gene and a host factor | |
| EP0123228B1 (en) | Hybrid dna synthesis of mature insulin-like growth factors | |
| EP0160571A2 (en) | Cloning vehicle | |
| EP0130166A1 (en) | A recombinant plasmid, a transformant microorganism, a polydeoxy-ribonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced | |
| RU1776276C (ru) | Способ получени полипептида со свойствами гирудина | |
| US20030022373A1 (en) | Novel system for the sequential, directional cloning of multiple DNA sequences | |
| Margolin et al. | Rhizobium meliloti contains a novel second homolog of the cell division gene ftsZ | |
| Kalderon et al. | Deletion loop mutagenesis: a novel method for the construction of point mutations using deletion mutants | |
| Sykes et al. | Molecular cloning of genes encoding branched-chain keto acid dehydrogenase of Pseudomonas putida | |
| CA2622710C (en) | Hybrid portable origin of replication plasmids | |
| CN101978057A (zh) | 修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒 | |
| CA2020656C (en) | Plasmids, their preparation and their use in the manufacture of a plasminogen activator | |
| Tojo et al. | Integration of bacteriophage Mx8 into the Myxococcus xanthus chromosome causes a structural alteration at the C-terminal region of the IntP protein | |
| US5858734A (en) | DNA sequence construction | |
| JP2574142B2 (ja) | 組換えリシン毒素フラグメント | |
| JP3319605B2 (ja) | ストレプトミセスにおける外来タン白質の製造法 | |
| EP0162898A4 (en) | INTERLEUKIN-2 GENERATION USING CLONED GENES FOR INTERLEUKIN-2 AND YEAR ALPHA FACTOR. | |
| JPS62115281A (ja) | 細菌性ｎ−末端のメチオニンペプチダ−ゼ | |
| JP3115622B2 (ja) | クローニング用ベクター及びそれを用いた大腸菌の選択的取得方法 | |
| HU197937B (en) | Process for producing new cloning carriers usable for the expression of polypeptides in microbiological host cells | |
| JPH104981A (ja) | 細菌中に含まれるプラスミドの安定化方法 | |
| JPH08507218A (ja) | 一重鎖分子の過剰発現 | |
| Tarragona-Fiol et al. | Production of mature bovine pancreatic ribonuclease in Escherichia coli | |
| JP2984239B2 (ja) | ストレプトマイセスｇａｌオペロン | |
| DE4024158A1 (de) | Klonierung und ueberexpression von glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus leuconostoc dextranicus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080929 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100929 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |