NO863596L - Enbakteriell metionin n-terminal peptidase. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av proteiner, spesielt fremmedproteiner, som mangler et N-terminal metionin, i bakterielle systemer som bruker rekombinante teknikker. Mere spesielt angår oppfinnelsen en peptidase som er spesifikk for N-terminal metionin som kan benyttes in vitro eller benyttes for å danne en overlegen bakteriell vert inneholdende forhøyede nivåer av peptidase for total prose-sering av maturproteiner i disse systemer.

Fremstilling av fremmedproteiner i bakterielle verter er kjent teknikk. Ved relativt standardiserte prosedyrer blir genesekvensen som koder det ønskede protein plassert under kontroll av regulatoriske sekvenser som er egenartet for eller kompatible med verten og transformert inn i vertbak-terien. Generelt er det tre hovedmåter på hvilken dette kan gjennomføres: 1) DNA som koder det ønskede protein kan limes inn i leserammen med en bakteriell gen som allerede er under kontroll av den bakterielle regulatoriske sekvens for å oppnå et "sammenlimt protein": 2) den ønskede kodende sekvens kan limes inn i leserammen med en opererbar ledersekvens som resulterer i et utskilt protein: eller 3) den ønskede kodende sekvens anbringes umiddelbart nedstrøms fra en ATG start codon som resulterer i "direkte" eksprimering for å oppnå det "mature" protein. I dette sistnevnte tilfelle blir det mature protein ikke utskilt men finnes i en intracellulær lokalisering, ofte som et refraktilt eller inklusjonslegeme.

Det er ofte forblitt usagt men vel erkjent av praktikanter i denne teknikk at det mature protein som dannes ved direkte eksprimering av ATG foregåtte kodingssekvenser hyppig har et N-terminal metionin som er translateringsproduktet av ATG. Avhengig av det spesielle rekombi

nante protein og av produksjonsomstendighetene, kan mere eller mindre av det behandles i cellen for å fjerne denne N-

terminal Met rest, men generelt vil i det minste noe og ikke helt uvanlig en vesentlig del av det rekombinante protein som produseres bære denne uønskede fremmede rest. Nærværet er ikke helt uskadelig. Når de resulterende proteiner brukes terapeutisk, vil det som vanligvis ville være et autologt protein for recipienten (f. eks. human veksthormon hGH, administrert til mennesker) nu inneholde en peptidsekvens som er ufamiliær for mottageren. Resultatet kan forutsies. En immunrespons kan oppstå på grunn av den ikke-fami 1 iære sekvens og et terapeutisk viktig peptid blir et immunogen.

I tillegg til fremmedproteiner, mature native proteiner og bakterielle proteiner fra andre genera eller specier er også ofte ufullstendig behandlet. Eksempler på dette fenom inkluderer E. Coll aspartate transcarbamylase (R-kJedet), E. coli tryptophan synthestase A protein, og E. coli bacterio-phage T4 lysozome. (Fasman, G.O., Ed., CRC Handbook of Biochemlstrv & Molecular Biology.111:308-313.)

Andre har forsøkt å løse N-terminal metioninproblemet og å fremstille N-terminal "Met-frie" peptider eller proteiner på forskjellige måter.

Baxter bruker i U.S-PS 4 350 764 in vitro behandling med protease trypsin for å spalte et forløperprotein etter beskyttelse av alternerende spaltingsseter. Limingsproteiner er også syntetisert der den ønskede kodingssekvens foregås av ATG for derved å tilveiebringe "internt" metionin i limingen som kan spaltes av CNBr. Ikke bare involverer dette ekstra fremstillingstrinn men har videre den alvorlige virkning at proteinet eller peptidet også spaltes ved enhver metioninrest i den gjenværende sekvens. EPO publikasjon 127 305 i navnet Genentech beskriver fremstilling av met-fritt hGH ved å benytte en kodingssekvens som inkluderer det native hGH lederpeptid som tilsynelatende arbeider i visse bakterielle verter for å bevirke sekresjon av det resulterende hGH. Gilbert har i US-PS 4 338 397 benyttet penicillinaseleder sekvensen for å bevirke sekresjon av antagelig N-terminal Met-løs p<->globin. Europeisk søknad nr. 86302201.8 beskriver bruken av ledersekvensen for bakteriell fosfolipase A, pHoA, for å bevirke sekresjon av visse men ikke alle rekombinante peptider.

Ingen av de foregående løsninger gir en universell løsning på problemet. Stilt overfor nødvendigheten av å fremstille et hvilket som helst spesielt rekombinant protein i N-terminal Met-fri form må man nødvendigvis velge blant et repertoar av muligheter, en prosedyre som er egnet for det spesielle peptid som skal fremstilles. Metoden ifølge oppfinnelsen som beskrevet nedenfor utvider dette repertoar for å stille til rådighet nok et anvendelsesmønster.

Oppfinnelsen tilveiebringer et hensiktsmessig enzym for å sikre behandling av N-terminal metioninrester fra bakterielt produserte rekombinante eller andre proteiner. Videre tilveiebringes det DNA som koder dette enzym som tillater genetisk manipulering av den rekombinante vertsorganisme for å bevirke den ønskede behandling in vlvo uten nødvendigheten av det separate trinn. Tilgjengeligheten av peptidaseenzymet ifølge oppfinnelsen tillater således fremstilling i bakterielle verter av rekombinante proteiner som har redusert immunogenlsltet ved terapeutisk bruk.

I et aspekt av oppfinnelsen angår den en peptidase som spalter en terminal metioninrester fra visse proteinsekven-ser, det vil si en metioninamino peptidase eller N-terminal exopeptidase . Enzymet kalles heretter Met-aminopeptidase. Dette Met-aminopeptidase enzym inkluderer proteiner som har en aktivitet med definert spesifisitet, se nedenfor, og som immunoprecipiterer med antistoffer fremstilt mot proteinet av aminosyre sekvensen vist i Fig. 2. Met-aminopeptidase enzymet inkluderer videre proteiner som har denne aktivitet og som kodes av DNA som hybridiseres under spesifiserte betingelser til det DNA som er vist i Fig. 2 kodene den avledede aminosyresekvens. Oppfinnelsen angår også antistof fer som er immunoaktive med proteinet av aminosyresekvensen vist i Fig. 2, inkludert de som oppstår ved injeksjon av dette protein til vertebrater.

I andre aspekter angår oppfinnelsen en rekombinant DNA sekvens som koder Met-aminopeptidase, plasmider som bærer denne sekvens samt mikrobielle verter som transformeres med disse plasmider, såvel som metoder for fremstilling av N-terminale Met-frie rekombinante proteiner i bakterielle verter eller in vitro ved bruk av oppfinnelsens stoffer.

Under et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen fremgangsmåte for å oppnå en bakteriell stamme med en høy Met-amino peptidase aktivitet som omfatter avsøking av generelt peptidase defisiente (men ikke Met-amino peptidase-deficient) transformante verter hvori transformanten har fått innført en del av sitt eget genom.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere under henvisning til de ledsagende figurer der: Figur 1 viser den N-terminale aminosyresekvens bestemt fra proteinet av Met-aminopeptidasen ifølge oppfinnelsen; Figur 2 viser et 1,2 kb innskudd av pSYC1174 som koder Met-aminopeptidasen vist i Figur 1; Figur 3 viser en SDS gel av renset rekombinant IL-2 før og etter behandling med enzymet ifølge oppfinnelsen; og

Figur 4 viser genet for ricin A.

A. Def inis. loner.

Som heri benyttet betyr "Met-aminopeptidase" et enzym som spesifikt spalter N-terminal metioninresten fra en peptidsekvens og som ikke spalter en intern metioninrest eller en N-terminalrest forskjellig fra metionin. Met-aminopeptidasen ifølge oppfinnelsen synes å være spesifikk for spesielle peptidsekvenser avhengig av resten som opptar possisjon 2 og av den sekundære og tertiære struktur til substratproteinet eller -peptidet. Den nøyaktige spesifisitet av enzymet i denne henseende kan ikke bestemmes uten prøving av et nær uendelig antall substrater: imidlertid er en brukbar tommel-fingerregel angitt av Sherman, F., et al " Bio Essays" (1985) 3:27-31. Sherman et al baserte deres betraktninger for spesifisiteten til met-aminiopeptidaser på de observerte former av mutanter av iso-l-cytokrom-C fra gjær og den publiserte primære sekvens av 82 mature intracellulære proteiner. De konkluderte med at metionin vanligvis spaltes fra rester med en sidekjede med en dreiningsradius på 1,29 Å eller mindre, men spaltes vanligvis ikke fra rester med sidekjeder større enn 1,43 Å. Dette er konsistent med den observasjon at mutasjonelt endret iso-l-cytokrom-C, sett sammen med andre publiserte sekvenser av andre proteiner fra prokariotisk og eukariotiske systemer, indikerer at N-terminal metionin spaltes når den foregår rester av alanin, cystein, glycin, prolin, serin, treonin eller valin, men ikke når den forgår rester av arginin, aspargin, aspartik syre, glutamin, glutaminsyre, isoleucin, leucin, lysin eller metionin. Disse resultater er generelt konsistente med de som er angitt i illustrasjonene nedenfor. Imidlertid inntrer visse unntak der gireringsradien for den andre aminosyre er høyere enn 1,29 Å og den sekundære og tertiære struktur eller andre betingelser er spesielt gunstige. Derfor er dette aspekt av spesifisiteten ment som en generell retningslinje og det skal holdes for øyet at sogar spesifisiteten for aminopeptidase som benyttes for å illustrere oppfinnelsen, ikke er bestemt med nøyaktighet, det vil si at ikke alle tertiære strukturer er prøvet. For derfor å komme innenfor definisjonen av "met-aminopeptidase", behøver enzymet kun å tilfredsstille kravene til spesifikk spalting av N-terminal metionin uten spalting av interne metioninrester og uten spalting av N-terminalrester andre enn metionin fra noe peptid.

De foretrukne met-aminopeptidaser ifølge oppfinnelsen har N-terminal aminosyresekvenser i det vesentlige ekvivalente med det som er vist i Fig. 1 og total aminosyresekvenser i det vesentlige ekvivalent med det som kodes av DNA som er vist i Fig. 2. Med "i det vesentlige ekvivalent" menes at proteinet bibeholder den samme aktivitet ved spesifikt å spalte en terminal metioninrester fra spesielle peptid- eller protein-sekvenser med fundamentalt den samme underliggende spesifisitet med henblikk på sekundære og tertiære strukturer eller etterfølgende aminosyrerester, selv om mindre endringer i aminosyresekvensen kan være tilstede. Slik endring, intern-bytting, tilføyelse eller utelatelse av en eller flere aminosyrer i sekvensen som ikke åpenbart endrer aktiviteten, fjerner ikke et spesielt protein fra denne definisjon.

For eksempel kan vanlilge aminosyreerstatninger slik som erstatning av en serin- eller en alaninrest for en eller flere av cysteinene i posisjonene 45, 59, 78, 126 eller 245, resultere i peptider som kan bibeholde met-aminopeptidase aktiviteten. I tillegg kan det være en interutveksling av leucin-, isoleucin- og valinrester. Videre kan opptil de første syv aminosyrer ved N-terminus utelates og deler av nedstrømsområdene av peptidet som begynner ved aminosyre 228 behøver ikke å være vesentlig for aktiviteten.

Inkludert også er selvfølgelig de nøytrale og saltformene av met-aminopeptidasene såvel som former som inneholder ytterligere ikke-proteindeler slik som glycosilering, lipldrester eller acetylering.

"Peptidasemanglende" stammer henviser til en bakteriestamme som mangler minst 4 peptidaser andre enn met-aminopeptidase, hvilke peptidaser vanligvis finnes i den ville type.

"N-terminal met-fritt" protein som brukt i foreliggende søknad henviser spesielt til et protein som mangler et N-terminal metionin men som kan inkludere metioninrester andre steder i primærstrukturen. Kodingssekvensen for proteinet vil ha en umiddelbart foregående ATG start kodon i leseramme. "N-terminal met-fritt" benyttes som en hensiktsmessig

forkortelse slik at betingelsene rundt denne tilstand ikke må gjentas. Spesielt betyr "N-terminal met-fritt" ikke ifølge oppfinnelsens kontekst at den nødvendigvis ikke er metioninrester noe sted i proteinsekvensen, heller ikke er den ment å inkludere proteiner som ikke hadde noen mulighet for et N-terminal metionin for det første, slik som de som produseres som smelteproteiner eller som sekretert protein, foregått før behandling av en signalsekvens. Som benyttet heri betyr således "N-terminal met-fritt protein" et protein som kodes av en DNA sekvens hvori det mature protein umiddelbart foregås av en i-leseramme ATG startkodon og Ikke del av en fusjon som deretter skal spaltes av CNBr, trypsin eller andre reagenser. Når det gjelder rekombinante proteiner er konstruksjonen klart spesifisert; for native eller naturlig rekombinerte DNA sekvenser behøver konstruksjonene ikke være så lett definerte.

"Met-foregått protein" er et protein som inneholder en N-terminal metioninrest umiddelbart foran den første aminosyre som vanlig finnes i det spesielle mature protein.

"Celler", "cellekulturer", "vertsceller" og lignende betyr subjektceller for rekombinante DNA manipulasjoner. Slik det vil være klart fra konteksten kan disse celler være kandidater for eller resultater av overføring av nye DNA sekvenser ifølge rekombinante teknikker. Teknikker som er egnet for DNA opptak av celler inkluderer hyppigst in vitro transforma-sjon. Imidlertid kan andre teknikker slik som transduksjon eller konjugasjon også benyttes. Definisjonen inkluderer videre avkommet av cellene det direkte henvises til. Det skal være klart at et slikt avkom ikke behøver å være nøyaktig identisk i DNA innholdet i forhold til opphavet, men slikt avkom er definert innen definisjonen så lenge endring-ene som f. eks. skyldes tilfeldig eller tilsiktet mutasjon, ikke ødelegger evnen til cellen til å vise egenskapene som gis av den innførte DNA på en måte tilsvarende det som vises av opphavet.

B. Generell beskrivelse

Oppfinnelsen tilveiebringer fremstilling av N-terminale met-frie rekombinante proteiner i bakterielle verter via bruk av en metaminopeptidase. I den mest foretrukne utførelsesform dannes metaminopeptidasen i høye nivåer in situ og behandler den rekombinante eller annet protein in vivo i den bakterielle vert. Imidlertid er det også mulig å isolere eller å ekstrahere det ønskede rekombinante eller et annet protein fra vertscellene og å behandle ekstraktet in vitro med den met-aminopeptidase som oppnås uavhengig fra en bakteriell kilde.

Med henblikk på met-aminopeptidasen per se er dette enzym fremstilt og det DNA som koder det gjenvunnet ved å trekke fordel av den lette avsøking av E. coli stammer som generelt er peptidasefattige med henblikk på forbedret produksjon av met-aminopeptidasen kodet i deres eget genom. Ved denne prosess oppnås en kilde for plasmidbåret og forsterket DNA kodende met-aminopeptidase og enzymet kan så fremstilles og renses direkte fra disse celler. I tillegg resulterer kotransformering av rekombinante verter med dette plasmid DNA sammen med eksprimeringsvektoren for et ønsket rekombinant protein i in situ fremstillingen av rekombinant protein i N-terminal met-fri form.

Et antall E. coli stammer som er fattige på en multiplisitet av peptidaser som vanligvis finnes i villtypebakterier er kjente. For eksempel beskriver Miller, C.G., et al, " J. Bacteriol" (1978) 135:603-611. et antall bakterielle stammer som er peptidasefattige. En av disse stammer, CM89, som er fattig på peptidase N, peptidase A, peptidase B, peptidase D og peptidase Q, ble benyttet i den ovenfor angitte illustra-sjon. Imidlertid kan andre peptidasefattige mutanter av bakterielle stammer også benyttes.

Det antas at genomet i disse stammer fremdeles inneholder sekvensen som koder met-aminopeptidase aktiviteten og det genomiske DNA benyttes derfor for å konstruere et bibliotek ved nedbrytning med et egnet restriksjonsenzym og kloning av fragmentene til bærervektorer. Et antall slike bærervektorer er tilgjengelige inkludert pUC seriene og pBR322. Plasmid DNA kan så hvis ønskelig forsterkes ved bruk av en hvilken som helst hensiktsmessig villtypevert før isolering av plasmid DNA og transformering tilbake til peptidasefattig stamme for avsøking.

Den transformert peptidase-fattige bakterie avsøkes så for produksjon av den ønskede met-aminopeptidase ved analysering av råekstrakter med henblikk på evnen til å spalte et egnet substrat. En stamme som viser et forhøyet nivå av met-aminopeptidase blir så hensiktsmessig benyttet som en kilde for dette enzym eller som en kilde for plasmid DNA for kotransformering med eksprimeringsvektoren for et rekombinant protein.

I tillegg kan plasmid DNA fra denne stamme benyttes for å prøve genomen av villtype bakterier for egnet Met-aminopeptidase kodende sekvenser. Egnede stringenser er de som er karakteristiske for hybridlseringsbetingelser beskrevet spesifikt nedenfor. Disse spesielle betingelser behøver ikke å benyttes, men de som har de homologe kravene. Disse avledede sekvenser er også selvfølgelig i stand til å kunne eksprimeres, enten under kontroll av deres egne promotere, eller ved bruk av andre promotere som er kjente i denne teknikk slik som trp- eller penicillinasepromotere.

Met-aminopeptidase proteinet som her produseres renses, og det rensede protein benyttes for å oppnå antistoffer ved bruk av egnede immuniseringsprotokoller. Rensingen gjennomføres ved å bryte opp cellene og isolere enzymet fra supernatant-lysatet. Denne isolering kan hensiktsmessig inkludere behandling med en anionbytteharpiks under betingelser hvori proteinet adsorberes, fulgt av eluering i en egnet buffer. Egnede anionbytteharpikser inkluderer DEAE konjugert til forskjellige karbohydratbærere. Andre anionbytteharpikser, velkjente i teknikken, kan også benyttes.

Antistoffer dyrket som respons på renset protein i kaniner, rotter og andre pattedyr er brukbare ved identifisering av Met-aminopeptidase proteiner fra et antall mikroorganismer. Store antall rekombinante proteiner er kandidater for fremstilling som mature proteiner i prosessert form, fri for N-terminal metioniner, ved bruk av metoden ifølge oppfinnelsen.

For eksempel inneholder lymfokiner slik som IL-2, IL-1; cx- og 7 - interferonene (p<->interferon inneholder vanligvis et enterminalmetionin i maturform); tumor nekrose faktor; og andre proteiner forbundet med de lymfatiske systemer, fremstilles således. Videre kan forskjellige hormoner slik som veksthormoner, insulin, ACTH, endorfiner og andre peptidhormoner produseres rekombinant. Andre kandidater for rekombinant fremstilling inkluderer enzymer slik som vev-plasmidogenaktivator, urokinase og enzymer som kan brukes ved Industrielle anvendelser slik som alkohol-dehydrogenase. Andre proteiner inkluderer toksiner slik som difteri- og ricintoksin og forskjellige faktorer slik som epidemisk vekstfaktor og transformerende vekstfaktor. De foregående eksempler er kun eksempler, og i prinsippet kan et hvilket som helst ønsket protein, når dets gen først er oppnådd, eksprimeres som et maturprotein ved å binde det i leserammen til en umiddelbart oppstrøms ATG startkodon og å tilveiebringe den nødvendige kontrollsekvens. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater at et hvilket som helst av disse proteiner hensiktsmessig fremstilles uten en terminal-metionin.

Som angitt ovenfor kan Met-aminopeptidase benyttes på to generelle måter. Enzymet kan isoleres, f.eks. fra de spesifikke celler som produserer det i relativt stor mengde fra plasmidbåret DNA, og tilsettes til en in vitro reaksjonsblanding for å bevirke en terminal metioninprosessering, eller Met-aminopeptidasen som koder plasmider kan cotrans-formeres sammen med eksprimeringsvektorer for et ønsket protein i en rekombinant bakterievert for å tillate in vivo prosessering.

Ved in vitro metoden blir det rensede Met-aminopeptidase tilsatt til en reaksjonsblanding inneholdende ikke-behandlet protein og egnet salt og buffer. Reaksjonsblandingen inkuberes ved en temperatur på ca. 30°C over natt for å tillate en utvikling. Enzymet viser på kravet på koboltion. En typisk reaks j onblanding kan inneholde ca. 1 mg pr. ml substratprotein, ca. 80 pg/ml enzym i pH 7-8 fosfatbuffer og ca. 0,2 mm koboltioner. Den beskrevne karakteristiske blanding er selvfølgelig kun illustrerende, og konsentrasjon-ene av komponentene kan varieres I et kontinuum avhengig av arten av substratet og de benyttede tids- og temperatur-betingelser. Total prosessering kan verifiseres ved måling av mengden metioninrest som frigis, ved å sammenlikne mobiliteten på SDS PAGE av prosessert og Ikke-prosessert subjektprotein, eller ved sekvensering av substratmaterialet inneholdt i blandingen.

I in vivo metoden blir plasmid DNA isolert fra Met-aminopeptidase kildestammen og benyttet for å transformere celler som allerede huser eller som concomitant eller subsekvent transformeres til å huse et eksprimeringssystem for protein-ene. Benyttet i bakterielle kilder for bakterielle enzymer kan de ikke-prosesserte substrater fremstilles som en del av det komplementære av proteiner som vanligvis dannes av mikroorganismen. Mer generelt benyttes peptidasen som dannes in situ for å prosessere rekombinant fremstilte proteiner og cellene må på et visst punkt transformeres til å inneholde eksprimeringssystemet for det ønskede protein.

C. Standardteknikker

Standardmetoder for transformering av bakterier, seleksjon av vellykkede transformanter ved bruk av markører, fremstilling av plasmidvektorer og avsøking av gene- eller cDNA banker er nå velkjent teknikk. For hensiktsmessighetens skyld blir et utvalg av prosedyrer spesielt brukbare i eksempelt angitt nedenfor. De fleste slike metoder eller alternative brukbare metoder finnes i Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Press.

Verts- og kontrollsekvenser

Cellene egnet for co-transformerlng med vektorer som bærer Met-aminopeptidase og eksprimeringssystemer for protein er bakterielle. Hyppigst er vertene forskjellige stammer av E. coli. Imidlertifd kan andre mikrobielle stammer også benyttes slik som basiller, f.eks. Bacillus subtilis, forskjellige arter av pseudomonas, eller andre bakterielle stammer. I slike prokariotiske systemer benyttes plasmidvektorer som inneholder et replikasjonssete og kontrollsekvenser avledet fra en art kompatibel med verten. F.eks. blie E. coli typisk transformert ved bruk av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra E. coli arter av Bolivar et al, Gene (1977) 2:95. pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-motstandsevne og tilveiebringer således ytterligere markører som enten kan bibeholdes eller ødelegges ved konstruering av den ønskede vektor. Vanligvis benyttede prokariotiske kontrollsekvenser som her er definert til å inkludere promotere for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med r ibosomb Indingssetesekvenser, inkluderer slike vanligvis benyttede promotere som3-lakta-mase (penicillinase)- og laktose (lac) promotersystemer (Chang et al, " Nature" (1977) 198:1056) og tryptofan (trp) promoter systemet (Goeddel et al, " Nucleic Acid Res" (1980) 8:4057) og den lambdaderiverte Pl promoter og N-gene ribosom-bindingssete (Shimatake et al, " Nature" (1981) 292:128) som er gjort brukbar som en mobil kontrollkasett som angitt i den paraleltløpende USSN 578,133. Imidlertid kan et hvilket som helst promoter system som er kompatibelt med prokariotene benyttes.

Transformering

Cellene transformeres ved bruk av kalsiumbehandling under anvendelse av kalsiumklorid som beskrevet av Cohen, S.N. , " Proe Nati Acad Sei ( USA)" (1972) 69:2110, eller RbCl2metoden som beskrevet av Maniatis et al, (supra).

Vektorkonstruks. 1 on

Konstruksjonen av egnede vektorer Inneholdende de ønskede kodings- og kontrollsekvenser benytter standard legerings- og restriksjonsteknikker som er velkjente i denne teknikk. Isolerte plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserte oligo-nukleotider spaltes, skreddersys og sys sammen i ønsket form. Setespesifikk DNA spalting gjennomføres ved behandling med egnede restriksjonsenzym (eller enzymer) under betingelser som er velkjente og som angis av produsenten. Generelt blir ca. 1 jig plasmid eller DNA sekvens spaltet av en enzymenhet i ca 20 pl bufferoppløsning; i det her gitte eksempel blir et overskudd av restr iks j onsenzym benyttet for å sikre total fermentering av DNA substratet. Inkuberingstider på ca. 1 time til 2 timer ved ca. 37° C kan benyttes, selv om varia-sjoner kan tolereres. Etter hver inkubering blir proteinet fjernet ved ekstrahering med fenol/kloroform og kan følges av eterekstrahering, og nukleinsyren kan gjenvinnes fra vanndige fraksjoner ved presipitering med etanol fulgt av overløp over en Sefadex G-50 spinnkolonne. Hvis ønskelig kan størrelses-separering av de spaltede fragmenter gjennomføres ved polyakrylamidgel- eller agarose gel elektroforese ved bruk av standard teknikker. En generell beskrivelse av hver sepa-rer ingsteknikk finnes i " Methods in Enzymology" (1980) 65:499-560.

Restriksjonsspaltede fragmenter kan være stumpendede ved behandling med det store fragment av E. coli DNA polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire deoksynukleotidtrifosfater (dNTPs) ved bruk av inkuberingstider på ca. 15 til 25 minutter ved 20 til 25° C i 50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT og 5-10 jjM dNTPs. Klenowfragmentene fyller inn ved 5' klebrige ender, men tygger tilbake ut-ragende 3' enkelstrenger, selv om de fire dNTPs er til stede. Hvis ønskelig kan selektiv reparasjon gjennomføres ved å tilmåte kun ett av, eller utvalgte, dNTPs innen de begrens-ninger som dikteres av arten av de klebrige ender. Etter behandling med Klenow blir blandingen ekstrahert med fenol/ kloroform og etanolpresipitert fulgt av føring over en Sefadex G-50 spinnkolonne. Behandlingen under egnede betingelser med Sl nuklease resulterer i hydrolyse av et hvert enkeltstrenget protein.

Syntetiske oligonukleider fremstilles ved triestermetoden til Mateucci et al, (" J Am Chem Soc" (1981) 103:3185) eller ved bruk av komersielt tilgjengelige automatiserte oligonukleo-tidsyntetisører. Kinasering av enkeltstrenger før aldring og merking oppnås ved bruk av et overskudd, f.eks. hensiktsmessig 10 enheter polynukleotid kinase pr. 0,1 nmol substrat i nærvær av 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiorei-tol, 1-2 mM ATP, 1,7 pmolT32P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM spermidin, 0,1 mM EDTA.

Legeringen gjennomføres i 15-30 pl volumer under bruk av det følgende standardbetingelser og temperaturer: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 jJg/ml BSA, 10 mM - 50 mM NaCl og enten 40 pM APT 0,01-0,02 (Weiss) enheter T4 DNA ligase ved 14°C (for "klebrig-ende" legering) eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4 DNA ligase ved 14°C (for "stump-ende" legering). Intermolekylær "klebrig-ende" legering gjennomføres vanligvis ved 33-100 jig/ml total DNA konsen-trasjon (5-100 nM total sluttkonsentrasjon). Intermulekylær stump-ende legering (vanligvis under anvendelse av et 10-30 gangers molart overskudd av forbindere) gjennomføres ved 1 pM total sluttkonsentrasjon.

Ved vektorkonstruering ved bruk av "vektorfragmenter" blir vektorfragmentet vanligvis behandlet med bakterielt alkalisk fosfatase (BAP) for å fjerne 5' fosfatet og for å forhindre relegering av vektoren. BAP fermentering gjennomføres ved pH 8 i ca. 150 mM Tris, i nærvær av Na<+>og Mg<+>^ ved bruk av en enhet BAP pr. pg vektor ved 60° C i ca. 1 time. For å gjenvinne nukleinsyrefragmentene blir preparatet ekstrahert med fenol/kloroform og etanolpresipitert og avsaltet ved anvendelse av en Sefadex G-50 spinnkolonne. Alternativt kan relegering gjennomføres i vektorer som er dobbelt fermentert ved tilsetning av restriksjonsenzymfermentering av uønskede f ragmenter.

For andeler av vektorene avledet fra cDNA eller genomisk DNA som krever sekvensmodifiseringer, blir setespesifikk primer-rettet mutagenese benyttet i henhold til Zoller, M.J. et al " Nucleic Acids Res" (1982) 10:6487-6500. Dette gjennomføres ved bruk av primer synetisk oligonukleotid komplementært til en enkeltstrenget phage DNA som skal mutageneres bortsett fra begrenset mistilpasning, og som representerer den ønskede mutasjon. Kort sagt benyttes det syntetiske oligonukleotid som en primer for direkte syntese av en streng komplementær til phagen og den resulterende dobbelstrengede DNA transformeres til den phage-bærende vertsbakterie. Kulturer av den transformerte bakterie plateres i topp agar, tillates plaque-dannelse fra enkelte seter som huser phagen.

Teoretisk vil 50$ av de nye plaquer inneholde phagen som Inneholder, som enkel streng, den muterte form; 50$ vil ha den opprinnelige sekvens. De resulterende plaquer hybridiseres med kinasert syntetiske primer ved en temperatur som tillater hybridiseringen av en nøyaktig tilpasning, men ved hvilken mistilpasninger med den opprinnelige streng er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plaquer som hybridiserer med proben blir så plukket ut, dyrket og DNA gjenvunnet. Detaljer av setespesifikke mutasjonsprosedyrer er beskrevet nedenfor i de spesifikke eksempler.

Verifisering av konstruksjonen

Korrekt ligering for plasmidkonstruksjon bekreftes ved først å transformere E. coli stamme MM294 oppnådd fra E. coli Genetic Stock Center, CGSC #6135, eller en annen egnet vert, med legeringsblandingen. Vellykkede transformanter velges ved ampicillin- tetracyklin eller annen antibiotikaresistans, eller ved bruk av andre markører avhengig av metoden for plasmidkonstruksjon slik dette er velkjent. Plasmid fra transformantene blir så fremstilt i henhold til Clewell, D.B., et al " Proe Nati Acad Sei" ( USA) (1969) 62:1159 eventuelt fulgt av kloramfenikolforsterkning (Clewell, D.B., " J Bacteriol" (1972) 110:667). Den isolerte DNA analyseres ved restriksjon og/eller sekvenseres ved dideoksymetoden i henhold til Sanger, F. et al " Proe Nati Acad Sei" ( USA)

(1977) 7.4:5463 og som videre beskrevet av Messing et al, " Nucleic Acids Res" (1981) 9:309, eller ved metoden i henhold til Maxam et al, " Methods in Enzmology" (1980) 65:499.

Eksemplifiserte verter

Vertsstammer som benyttes ved kloning og eksprimering er som følger: For kloning og sekvensering og for eksprimering av konstruksjon under kontroll av de fleste bakterielle promotere ble E. coli stamme MM294 (supra), Talmadge, K. et al " Gene" (1980) 12:235; Meselson, M. et al " Nature" (1968) 217:1110 benyttet som vert. For eksprimering under kontroll av P^N^gg promoteren ble E. coli stamme K12 MC1000 lysogen, N7N53Cl857Sus-P80, ATCC 39531 (heretter enkelte ganger kalt MC1000-39531) benyttet. For å verifisere nærværet av et innskudd ble stammer som komplementerte vektorsjelettets karakteristika i området for innskuddet benyttet. F.eks. benyttes for pUC seriene, E. coli stamme DG99 som produserer blå kolonier på X-gal indikatormedium i fravær av innskudd og hvite kolonier i nærvær av innskudd.

De følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen uten å begrense den. 1. Fremstilling av en kilde for plasmid Met- aminopeptidase som koder DNA.

Kromosomal DNA ble ekstrahert fra E. coli stamme CM89 (supra) ved metoden i henhold til Silhavy, T.J. et al " Experiments with Gene Fusions" (1984), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 137-139 og lagret i 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) buffer. Dette DNA ble fermentert med Sau3AI ved 0,1 11/pg og 0,2 U/pg i 1 time ved 37° C. Etter reaksjonsavslutning og etanolpresipitering ble de partielt fermenterte DNAer samlet og fraksjonert i en 10-40$ sucrose gradient ved bruk av en Bechmann SW28 rotor ved 26.000 rpm i 24 timer ved 15°C. Fraksjoner inneholdende 4-8 Kb fragmenter ble samlet, renset på en DE52 kolonne, etanolpresipitert fra elueringsmiddelet og lagret i TE buffer.

En 4 pg andel av det kromosomale DNA ble så legert med 0,5 pg BamHI-fermentert, BAP behandlede pUC18 vektorfragmenter. Legeringsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli DG99 og platert på laktoseindikatorplater for å bekrefte nærværet av innskudd i plasmidene. Ca. 94% av transformantene inneholdt DNA innskudd på ca. 4 kb.

Derfor ble 18 pl av legeringsblandingen benyttet for å fransformere E. coli MM294 til Amp<R>for å oppnå genebiblioteket. Vellykkede transformanter ble plukket opp og benyttet for å inokulere 700 ml av ampicillinholdig dyrkningsmedium for plasmid DNA fremstilling.

Plasmid DNA ble oppnådd fra cellene som beskrevet i C.4 (Clewell, D.B. " Proe Nati Acad Sei" ( USA) (1969)) og benyttet for å transformere E. coli CM89. Vellykede transformanter valgt for Amp<R>ble platert på mikrotiterskåler for avsøking og ca. 1000 kolonier ble bedømt.

Enkeltkolonier ble søkt ut i 200 pl minimalmedium (se f.eks. US 4,518,584, supplementert med 5$ v/v hver av 2X L-Broth (DIFCO) plus 1$ NaCl, 10$ casaminosyrer og 10 X gjærnitrogen-base. Etter overnattvekst ved 37° C ble cellene vasket 2 ganger i 0,1 M Tris*HCl pH 7,4. Cellene ble lysert ved tilsetting av 20 pl av en 1 mg/ml lysozymoppløsning i den samme buffer, fulgt av tre cykler frys-tin. Deretter ble 180 pl 0,1 M kaliumfosfatbuffer (KP04) pH 7,4 + 0,2 mM CoCl2, inneholdende 72 pg Met-Gly-Met-met, 36 pg L-aminosyre, 4-5 pg pepperrotperoksydase, og 18 pg O-dianisidin dihydroklorid tilsatt til hver brønn, fargedannelsen var åpenbar i Met-aminopepsidaseholdige lysater. Av de omtrent 1000 kolonier som ble avsøkt viste 10 øket evne for frigjøring av Met fra Met-Gly-Met-Met, og ble ytterligere avsøkte for mangel på å frigjøre Leu fra Leu-Gly-Gly under de samme betingelser. En vellykket koloni ble kalt pSYC1174. E. coli pSYC1174 ble avsatt ved ATCC den 27. August 1985 og har aksessnummeret 53245.

2. Gjenvinning av Met- aminopeptidase kodende sekvens.

E. coli stammen som huset pSYC1174 (også kalt 18E7) gav en ca. 100 ganger høyere aktivitet ved Met-Gly-Met-Met substrat-mediert in vitro analyse, gjennomført generelt som beskrevet ovenfor.

Plasmid DNA ble isolert fra stamme 18E7 og det Met-aminopeptidase kodende plasmid pSYC1174 ble isolert. pSYC1174 bar et innskudd av 3,2 kb i pUC18 vektor på BamHI setet. Et 1,2 kb fragment ble skåret ut fra 5'enden av innskuddet ved hjelp av EcoRI/Clal defermentering og skutt inn i pUC18 og pUC19: pSYC1174 ble fermentert med Clal, stumpet med Klenow og så med EcoRI for å skjære ut 1,2 kb EcoRI/stumpfragmentet. Dette fragment ble skutt inn i EcoRI/Smal-fermentert pUC18 eller pUC19, noe som resulterte i motsatt orientering til lac promoteren av vertsplasmidene. Begge de resulterende vektorene pSYC1187 og pSYC1188 viste etter transformering til CM89, nivåer av aminopepsidaseproduksjon sammenlignbar med den som ble vist av pSYC1174. Disse resultater antyder at både Met-aminopeptidase genet og dets promoter er lokalisert i 1,2 kb fragmentet.

Figur 2 viser den totale nukleotidsekvens av 1,2 kb fragmentet bestemt ved dideoksysekvensering. Den åpne leserammen som starter med ATG er ved posisjonene 219-1010 og koder et putativt protein på 264 aminosyrer med en beregnet molekyl-vekt på 29.333. De første 64 deduserte aminosyrer tilsvarer de som oppnås ved bruk av aminosyresekvensering av renset protein som beskrevet ovenfor. Lokalisering av to tandem promotere forbundet med denne åpne leseramme er også vist og er merket Pl og P2. (Tallene i den venstre kolonne representerer nukleotider, de i den høyre kolonne aminosyrer.)

1,2 kb fragmentet ovenfor ble benyttet for å probe det genome DNA av E. coli ved Southern blot og hybridisert til bånd på 3,6, 5,2 og 1,35 kb som ble generert ved fermentering med Pstl, EcoRI, henholdsvis BssHII, men ikke til andre regioner av kromosomet, noe som indikerte at genet er til stede som en enkelt kopi i E. coli. Evaluering av sekvensen av 3' enden av genet fører også til den konklusjon at det sannsynligvis ikke er noen cotranskriberte gener nedstrøms fra Met-aminopeptidasen. Evaluering av sekvensen ved 5' enden indikerer nærværet av tandem promotere som vist.

Den nukleotide sekvens som vises i Figur 2 og som koder den deduserte aminosyresekvens 1-264 (eller komplementet derav) er generelt brukbart for å probe genomisk mikrobielle DNA for ytterligere Met-aminopeptidase kodende sekvenser. Således er dette innskudd et hensiktismessig verktøy for å oppnå denne ønskede DNA fra f.eks. Bacillus subtilis, Pseudomonas eller gjær. Egnet stringens er den som er forbundet med hybridisering i en buffer inneholdende 6 x SSC, 0,01 M EDTA, 5 x Denhardfs, 0,5$ SDS ved 65°C i et tidsrom tilstrekkelig til å fullføre reaksjonen, fulgt av vasking med 3 x SSC ved 65°C. Det vil si at DNA som hybridiserer til den ovenfor nevnte nick-translaterte probe under disse betingelser, og som koder protein med Met-aminopeptidase aktivitet som her beskrevet, er inkludert innenfor oppfinnelsens rammer, og koder Met-ami-nopeptidaseproteinet ifølge oppfinnelsen. 3. Karakteristika av Met- aminopeptidase fra E. coliPSYC1174.

Met-aminopeptidase ble renset fra råekstrakter av E. coli pSYC1174 og det rensede protein ble analysert på evner til frigjøring av aminosyrer ved bruk av et antall peptidsub-strater.

For rensing ble over natt kulturer av E. coli pSYC1174 i Brain Heart Infusion buljong vasket to ganger i KPO4buffer (20 mM, pH 7,4) med 0,2 mM CoCl2og sondikert. 0,1 mM PMSF ble tilsatt til sondikatet. Dette ble sentrifugert og supernatanten ført over "DEAE-Sefarose Fast Flow". Enzymet ble eluert med NaCl i gradient 0-0,25 M i den samme buffer. Fraksjoner med Met-aminopeptidaseaktivitet ble samlet, konsentrert ved bruk av 30.000 MW "Centricon" filtre og ført over S-200 "Sefacryl" kolonne i den samme buffer pluss 1 mM metionin. Aktive fraksjoner ble samlet og konsentrert som tidligere.

Underenhetsmulekylvektene ble bestemt til å være ca. 32.000 ved å redusere SDS PAGE (Laemmli, " J Mol Biol" ( 1973 ) 80:575-599) og enzymrenheten ble anslått til 95$. Proteinet er således av den omtrentlige tilsiktede størrelse for et 264 aminosyreprotein. Estimater av mengde basert på densiometri av flekket gel viste at Met-aminopeptidasen var ca. 15-20$ av det cellulære protein.

N-terminalsekvensering ble gjennomført på renset peptidase. Resultatene for de første 65 aminosyrer er gitt i Figur 1.

Renset Met-aminopeptidase ble analysert på evnen til å frigi aminosyrer fra et antall peptidasesubstrater ved bruk av modifiserte L-aminosyreoksidase-HRP-ODAD analyse, generelt som beskrevet ovenfor, og TLC metoden. For den førstnevnte analyse ble 10 pl av proteinoppløsningen, i dette tilfelle lysatet, tilsatt til 90 pl av substratoppløsningen inneholdende 4 mM Met-Gly-Met-Met, 0,1 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,5, og 0,2 mM CoClg. Rørene inneholdende reaksjonsblandingen ble inkubert ved 30°C i 10 minutter og reaksjonen ble stanset ved å anbringe rørene i et kokende vannbad i 2 minutter. Etter tilsetting av 0,9 ml farveutviklingsblanding (0,1 M Tris HC1, pH 7,4 inneholdende 0,2 mg L-aminosyreoksydase, 0,03 ml pepperrotperoksydase og 0,2 mg O-dianisidin dihydroklorid) ble rørene inkubert i 30-60 minutter ved 30°C og den optimale densitet avlest til 440 nm.

TLC metoden benyttet silica gel plater med en oppløsnings-middelblanding n-butanol:eddiksyre:vann i volumforholdet 120:50:30. Aminosyrene som ble frigitt ble detektert og identifisert etter spraying av platene med ninhydrinreagens. Metionin ble frigitt fra følgende peptider:

Ingen aminosyrer ble frigitt fra:

Peptidaseaktiviteten ble fullstendig Inhibert av 1 mM EDTA og krevet ca. 1-200 mM fosfationer og 0,02-2,0 mM Co<+2>for maksimal aktivitet.

Co<+2>kunne ikke erstattes av Mn<+2>, Cu<+2>, Zn<+2>eller Mg"1"2. Aktiviteten ble altså alvorlig redusert når Tris ble benyttet 1 stedet for kal iumf osf atbuf f er, men denne aktivitet kan gjenopprettes ved tilsetting av natrium- eller kaliumsalter.

Fra de foregående resultater er det klart at peptidasen spalter kun en terminal metionin og har andre spesifisitets-krav likeså. Arten av den andre og tredje aminosyre i sekvensen synes å være vesentlig, og et minimum på tre aminosyrer i peptidet synes å være nødvendig. Resultatene på kortkjedepeptider behøver imidlertid ikke å være helt bestemmende uttrykt ved kravet for etterfølgende aminosyrer, da utvikling i større proteiner kan gi sekundære og tertiære strukturer som endrer spesifisiteten med henblikk på restene 2 og 3. I tillegg er spesifisiteten avhengig av betingelsene, og peptider som ikke undergår hydrolyse under de spesielle betingelser som benyttes kan alikevel hydrolyseres hvis betingelsene endres.

Mens generelt Met-aminopeptidase spalter N-terminalt metionin når den andre rest har en sidekjede med en gyreringsradius mindre enn 1,29 Å, og mens det generelt er forventet at spalting ikke skjer når sidekj edestørrelsen er større enn 1,43 Å, inntrer unntak, spesielt det når det gjelder ricin A ovenfor, hvori gyreringsradiusen for Ile, den andre aminosyre, er 1,56 Å. Således synes virkningene av naboaminosyr-ene og den sekundære og tertiære struktur av substratet også å ha en virkning på spesifisiteten.

I tillegg ble Met-aminopeptidase renset fra pSYC1174 som nevnt ovenfor, injisert i kaniner ved bruk av standard-protokoller og tilsettingsmidler for derved å oppnå antisera-spesifikt reaktive med Met-aminopeptidaseprotein.

4. Fremstilling av N- Terminal Met- fri IL- 2.

E. coli MM294 som bærer pSYC1143, en eksprimeringsvektor for et IL-2 mutein med N-terminalsekvensen i det mature protein: Ala-Pro-Thr-Ser, under kontroll av Trp promoteren, ble transformert med plasmid DNA (kalt pSYC1174) fremstilt fra E-coli pSYC1174. Vellykkede transformanter ble valgt ved "Amp<R>" og "Tet^", som viste nærvær av begge ønskede plasmider .

Celler inneholdende begge plasmider ble dyrket over natt ved 37°C i minimalmedium pluss tryptophan 50 mg/l, casaminosyre 5 g/l, og både ampicilling 50 mg/l og tetracyklin 5 mg/l. Kulturen ble så vasket og resuspendert i det samme medium minus tryptophan for å avlaste undertrykking av IL-2 syntese, og inkubert ved 37<0>C i 4 timer.

Det således fremstilte IL-2 er inneholdt i intracellulære refraktlle legemer. Disse ble renset ved gjentatt sonifiker-ing og vasket i 8 mM EDTA og til slutt resuspendert i 5$ SDS.

IL-2 ble ytterligere renset ved HPLC ved bruk av en Vydac C4 reversfasekolonne og en gradient av vann til acetonitril i 0,1$ trifluoreddlksyre. N-terminal sekvensen ble bestemt for rensing av IL-2 og viste følgende blanding:

Kontrollkulturer som var dyrket og indusert som ovenfor men inneholdende kun pSYC1143 gav produsert IL-2 der det rensede protein hadde sammensetningen 70$ Met-Ala-Pro og 30$ Ala-Pro.

(pSYC1143 inneholder IL-2 sekvensene under kontroll av Trp promoteren og Cry-positiv retroregulator sekvensen. Den fremstilles fra pFC51.T, som inneholder dette eksprimeringssystem som et 0,95 kb EcoRI fragment, og pACYC184 som er vertsvektor kompatibel med pUC18 som bærer en Cm<R>markør. Eksprimeringssystemet fremstilles som et EcoRI fermentat av pFC51.T og legeres inn i EcoRI fermentert pACYC184 for å

oppnå pSYC1143. pFC51.T er inngående bekrevet i EPSN 85306183.6.)

5. In vitro prosessering av Met- IL- 2.

Renset Met-aminopeptidase ble også benyttet for å behandle renset IL-2 in vitro. Reaksjonsblandlngen inneholdt 50 pl utgangsoppløsning Inneholdende 1,7 mg/ml IL-2 fremstilt ovenfor i 0,05$ SDS; 40 pl 0,1 M kaliumfosfatbuf f er, pH 7,5 inneholdende 0,2 mM CoClg; og 10 pl av en 1:10 fortynning av Met-aminopeptidase renset fra E. coil pSYC1174 utgangs-oppløsning inneholdende 8 mg/ml. Reaksjonsblandlngen ble inkubert ved 30°C over natt, og behandlingsgraden bedømt ved bruk av SDS PAGE og N-terminal sekvensering. Figur 3 viser resultatene av SDS PAGE gjennomført på ikke-omsatt IL-2 og IL-2 i nærvær av enzym. Etter inkubering erstatter nærværet av en noe mindre molekylvekst proteinbåndet som vises av det opprinnelige Met-foregåtte protein. N-terminal sekvensen for renset IL-2 før enzymbehandling var 74$ Met-Ala-Pro- og 26$ Ala-Pro; etter enzymbehandling var den 94$ Ala-Pro- og 6$ Met-Ala-Pro.

6. Konstruksjon av Rlcin A eksprimerlngsvektorer.

En vertsvektor for ricin A sekvensene pSYC1089, inneholdende phoA promoteren, leder og kodesekvensen med en modifikasjon for å tilveiebringe et Narl sete ved C-terminal enden av leder sekvensen, fulgt av B. thur ingiensis positive retroregulatorer ble konstruert som følger:PSYC997: PhoA promoter og leder, modifisert til å inneholde Narl sete

Plasmid pEG247, en 25 kb plasmid inneholdende 2,6 kb phoA strukturgen som et Hindlll/Xhol fragment ble benyttet som kilde for phoA genet. Dette plasmid ble oppnådd fra M. Casadaban og ble konstruert på en måte analogt det som er angitt i Groisman, E.A. et al, " Proe Nati Acad Sei" ( USA)

(1984) 81:1840-1843. Ved å anvende prosedyren som angitt i den foregående referanse kunne phoA genet lett klones inn i en hvilken som helst sjelettvektor.

Hindlll/Xhol 2,6 kb fragmentet fra pEG247 ble renset og klonet inn i pUC18, et 2,7 kb plasmid inneholdende en ampicillin resistansmarkør og en polyforbinder som tillot hensiktsmessig innskyting av ønskede sekvenser. pUC18 ble fermentert med Hindlll/Sall og den lineære vektor legert med det isolerte phoA fragment. Legeringsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli DG99, en stamme sammenlignbar med E. coli JM103 eller JM101, til Amp<R>, til konstruksjonen av det mellomliggende plasmid pSYC991 i vellykkede transformanter som var avsøkte med henblikk på innskudd i pUC18, ble verifisert.

pSYC997 som inneholdt den ønskede Narl modifisering ble preparert fra pSYC991 ved sete-rettet mutagenese. PvuII/- PvuII 770 baseparfragmentet ble oppnådd fra pSYC991. Det inkluderer en andel av phoA promoteren og oppstrøms N-terminalsekvensene for den mature alkaliske fosfatase, og således også hele ledersekvensen. Dette fragment ble ligert inn i Smal setet i M13mpll og enkeltstrenget phage ble fremstilt som sjablon for mutagenesen. I mutagenesen ble den syntetiske 26-mer

(linjen over viser Narl setet) ble benyttet som primer og probe. De mutageniserte phage-partikler ble så benyttet for å fremstille RF-DNA som en kilde for ønsket ledersekvens inneholdende Narl setet.

PSYC1015: CmB. Markørs. 1 elettvektor.

pSYC1015 som tilveiebringer kloramfenikolres istans , et replicon, og egnede restriksjonsseter i phoA genet, konstru-

eres også fra pSYC991. pSYC991 ble først fermentert fra HindiII/BamHI, og ca. 2,6 kb fragmenter inneholdende phoA genet ble renset og ligert med renset 3,65 kb vektorfragmentet fra Hindlll/BamHI-fermentert pACYC184. pACYC184 er tilgjengelig fra ATCC og inneholder kloramfenikolgenet (Cm<R>), et bakterielt replicon, og Hindlll- og BamHI-setene i det tetracyklinresistante gen. Ligeringsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli MM294 til Cm<R>, og konstruksjonen av pSYC1015 ble verifisert ved restr iks j onsanalyse og sekvensering.

To ytterligere mellomprodukter - plasmider, pSYC1052 og pSYC1078, ble konstruert for å tilveiebringe en egnet vertsvektor for B. thuringiensis positive retroregulatorer.

pSYC1052 ble konstruert ved ligering av det rensede Hindlll/- BssHII fragment inneholdende phoA promoteren og Narl sete fra modifisert leder pSYC997 til Hindi11/BssHII fermentert pSYC1015, som i sin tur hadde utelatt de ikke-modifiserte phoA sekvenser. Den resulterende vektor pSYC1052 ble bekreftet i E. coli transformanter til Cm<R>.

pSYC1078 er en modifisert form av pSYC1052 der BamHI sete i front av phoA promoteren er utelatt. For å utelate dette BamHI setet, ble pSYC1052 underkastet partiell BamHI fermentering, fylt inn ved bruk av DNA polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire dNTPs, og relegert under stump-ende betingelser. Det ønskede resulterende plasmid, nå inneholdende et unikt BamHI sete akkurat 3' fra phoA genet, ble bekreftet etter avsøking av vellykkede Cm<R>transformanter.

PHCW701: Kilde for retroregulatoren.

Evnen til 3' sekvensen av genet som koder krystallproteinet fra B. thuringiensis (cry gen) for å øke eksprimeringen av oppstrøms kodingssekvenser er beskrevet og krevet i den paralleltløpende USSN 646,584. Kort sagt karakteriseres sekvensene ved en DNA sekvens som transskriberer til et tilsvarende RNA transskript i stand til å danne en stamme av sløyfestruktur med en cytosin-guanin rest på ca. 43$. Ligert til 30-300 nokleotider fra 3' enden av genet blir en positiv retroregultorisk effekt vist på genekspremeringen. Den positive retroregulatoren ble fremstillt som et 400 bp EcoRI/BamHI restriksjonsfragment som var stumpendet og ligert til pLWI, en eksprimeringsvektor for interleukin-2.

(pLWT er et pRBR322 derivat inneholdende et replikon effektiv i E. coli, et Tet<R>gen, E. coli trp promoteren, ribosom-bindingsfragmentet og et 706 bp Hindlll/Pstl DNA fragment som inkluderer genet for human IL-2. pLWI er deponert ved ATCC i henhold til Budapestavtalen og har aksessnummeret 39405.)

PHCW701 ble fullført ved stumpendlng av 400 bp EcoRI/BamHI fragmentet inneholdende den positive retroregulator av cry genet med Klenow og de fire dNTPs, og ligeringer av det stumpendede fragmentet, ved bruk av T4 ligase og ATP til Stul-f ermentert plasmid pLWI . To mulige orienteringer av innskuddet kan resultere, noe som lett kan skilles ved restriksjonsanalyse. Det ønskede plasmid kalt pHCW701, har det nyskapte BamHI sete nærmere 3' enden av IL-2 genet. Dette plasmid er deponert ved ATCC under aksessnummeret 39757 i henhold til Budapestavtalen.

For å fullføre pHCW1089, ble pHCW701 fermentert med EcoRI, fyllt inn ved bruk av Klenow og de fire dNTPs, så fermentert med BamHI, hvoretter 400 bp fragmentet inneholdende den positive retroregulator ble gjennvunnet. pSYC1078 ble fermentert med Aval, fylt inn med Klenow og de fire dNTPs, og så fermentert med BamHI. Ligeringsblandinger ble transformert inn i E. coli MM294 og konstruksjonen av det ønskede plasmid pSYC1089, et 5,5 kb plasmid tilsvarende Cm<R>, ble bekreftet. pSYC1089 inneholder sekvensene for phoA promoteren og leder (med Narl setet) sekvensen og strukturelle gener umiddelbart oppstrøms BamHI setet, ble fulgt av de positive retroregulatoriske sekvenser av cry genet.

Ricin A

De ricin A kodende sekvenser ble oppnådd fra pRA123, mer spesifikt et M13 subklon av pRA123, beskrevet ovenfor, ved konstruksjon av pRATl. pRA123 er deponert ved ATCC 17. august 1984 og har aksessnummer 39799. Konstruksjonen av pRATl fra pRA123 er beskrevet i USSN 653,515. Kort sagt ble pRA123, som inneholder hele ricin A kodingssekvensen (se Figur 4) modifisert for å tilveiebringe denne sekvens som en Hindlll/BamHI kassett med en termineringskodon i riktig posisjon etter aminosyre 265, og med et startcodon i posisjon umiddelbart foran den mature sekvensen. pRA123 ble fermentert med BamHI og det omtrentlige 896 bp BamHI/BamHI fragment ble isolert og subklonet inn i M13mpl8 i en antiretningsori-entering i forhold til lacpromoteren i M13 vektoren. Det phage enkeltstrengede DNA ble underkastet to trinn primerret-tet mutagenese ved bruk av, som primere, skvensen:

5'-CACAGTTTTAATTGCTTATAAGG-3'.

som plasserer TAA termineringskodonet i riktig leseramme ved enden av ser-gln-phe C-terminus av ricin A kjeden, fulgt av,

som plasserer den ønskede HindIII/ATG startkodon diad umiddelbart oppstrøms N-terminalen ile-phe-pro-lys sekvensen av ricin A. Den modifiserte phage ble identifisert etter hver mutagenese ved bruk av egnede ovenfor angitte primere som prober. De ønskede konstruksjoner ble så dobbelt-fermentert med med Hindlll og BamHI og det egnede ricin A kodede fragment isolert. pRATl ble kompletert ved ligering av Hindlll/BamHI fragmentet med HindiII/BamHI fermentert pTRP3. pTRP3 er en pBR322 basert vektor inneholdende trp promoteren med et nedstøms Hindlll sete; pTRP3 er deponert med ATCC 18. desember 1984 og har aksessnummer 39946. pRAP229 ble konstruert ved bruk av kodingssekvenser avledet helt og holdent fra pRATl. Dette ble oppnådd ved en treveis-ligering av (1) det store Narl/BamHI replikonholdige fragment av pSYC1089 som i rekkefølge gav B. thurlngiensis-positive retroregulatori ske sekvenser, kloramfenikolresistante markører, et kompatibelt repllkon, og phoA promoteren og ledersekvensene; (2) Clal/BamHI fermenterte pRATl som gav et 500 bp fragment kodende det C-terminale del av ricin A som avsluttes på riktig måte; og (3) den N-terminale sekvens tilveiebrakt ved et ca. 350 bp Clal/Clal fragment fra pRATl. Det er klart at ricin A sekvensene også kunne ha vært og fortrinnsvis burde være fremstilte som et Clal (partiell )/BamHI utskåret fragment fra pRATl. Den resulterende fusjon (1) bibeholder startkodonet av ricin A kjeden som foregår isoleucinresten; (2) separeres ved 7 bp og således ut av leserammene i forhold til leder sekvensen; (3) utvider pHOA lederen ved tripeptidet Ile-ser— leu; og (4) tillater terminering av ledersekvensen ved et TGA kodon ut av leserammen med, men proksimalt til, startkodonet til ricin A. pRAP229 ble deponert vad ATCC den 8. mars 1985 og har aksessnummer 53408.

7. Fremstilling og behandling av ricin A i E. coli.

E. coli MM294 ble transformert enten med pRAP229 alene eller cotransformert med pRAP229 of pSYC1174. De transformerte kulturer ble dyrket under betingelsene tilsvarende det som er beskrevet av Michaelis et al, " J. Bact" (1983) 154:356365. Cellene ble indusert ved å redusere den eksogene fosfatkon-sentrasjon og å opprettholde kulturen i 16-17 timer.

Cellene ble høstet og helcelleekstraktene preparert ved sonikering i fravær av detergens og undersøkt med henblikk på eksprimering ved bruk av Western blot under anvendelse av kaninantiseran til nativt ricin A. For å bedømme N-terminal metyleringen ble ricin A renset og underkastet Edman nedbrytning for kvantitativ analyse. Etter at cellene var transformert med pRAP229 alene, inneholdt 40$ av ricin A N-terminal metionin; de cotransformerte celler produsert i ricin A som kun hadde 9$ metylerte kjeder.

8. In vitro prosseserlng av Met- ricin A.

Renset ricin A i en mengde av 600 pg fra de pRAP229 transformerte cellelysater ble blandet med 24 pg Metaminopeptidase renset fra E. coli pSYC1174 i 0,2 mM koboltklorid og 0.1 mM kaliumfosfatbuffer , pH 7,5, med 0,3 ml totalt volum. Reaksjonsblandlngen ble inkubert over natt ved 30°C og stanset ved oppvarming i et kokende vannbad. N-terminalsekvensen ble bestemt ved Edman nedbrytning etter avsalting av reaks j onsblandlngen. Kontrollblandinger som ikke inneholdt Met-aminopeptidase viste 40$ ricin A med N-terminal metionin, den samme fraksjon som vanligvis finnes i lysatet som beskrevet ovenfor. Reaksj onsb landingene inneholdende Met-aminopeptidase-enzym inneholdt ricin A der kun 8$ av proteinet inneholdt N-terminal metionin, i det vesentlige den samme fraksjon som oppnådd i pRAP229/pSYC1179 transformerte celler.

E. coli stammen pSYC1174 ble 27.august 1975 deponert ved ATCC under aksessnummer 53245 i henhold til Budapestavtalens regler. Den såkalte ekspertløsning ble angitt.

Claims (28)

1. Met-aminopeptidase med N-terminal sekvensen Ala-Ile-Ser-Ile-Lys-Thr-Pro.

2. Met-aminopeptidase ifølge krav 1, karakterisert ved aminosyresekvensen 1-264 i figur 2.

3. E. coli Met-aminopeptidase.

4. Antistoffer, karakterisert ved at de er immunoreaktive med Met-aminopeptidase som har aminosyresekvensen 1-264 i Figur 2.

5. Met-aminopeptidase, karakterisert ved at den er immunoreaktiv med antistoffene ifølge krav 4.

6. Met-aminopeptidase ifølge krav 5, karakterisert ved at den hydrolyserer N-terminal Met resten fra Met-y-z der y er Ala, Pro, Ile eller Gly og z er en aminosyrerest.

7. Met-aminopeptidase Ifølge krav 5, karakterisert ved at den ikke hydrolyserer dlpeptider.

8. Met-aminopeptidase ifølge krav 1, karakterisert ved at den kodes av et DNA som hybridiserer til et DNA i Figur 2 som vist i figur 2 (eller komplimentet derav).

9. Met-aminopeptidase ifølge krav 8, karakterisert ved at hybridiseringsbetingelsene har stringens ekvivalent hybridisering i en buffer inneholdende 6 x SSC, 0,01 M EDTA, 5 X Denhardfs, 0,5$ SDS ved 65° C i et tidsrom tilstrekkelig til å fullføre reaksjonen, fulgt av vasking med 3 x SSC ved 65°C.

10. Fremgangsmåte for å oppnå en bakteriell Met-aminopeptidase ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: fremstilling av et plasmldbåret genebibliotek fra en første-bakteriell stamme; transformering av genebiblioteket til en andre bakteriell stamme som er defisient på peptidaseaktivitet; og avsøking av transformanter for Met-aminopeptidaseaktivitet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den første bakterielle stamme er defisient på peptidaseaktivitet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den første bakterielle stamme og den andre bakterielle stamme er like.

13. Fremgangsmåte for å oppnå en bakteriell Met-aminopeptidase ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: avsøking av transformanter for Met-aminopeptidaseaktivitet, hvor transformantene fremstilles ved: fremstilling av et plasmldbåret genebibliotek fra en første bakteriell stamme; og transformering av genebiblioteket i en andre bakteriell stamme som er defisiente på peptidaseaktivitet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den første bakterielle stamme er defisient på peptidaseaktivitet.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den første og den andre bakterielle stamme er den samme.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at den bakterielle stamme er E. coli CM89.

17. Fremgangsmåte for å oppnå en DNA kodende Met-aminopeptidase ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: avsøking av et mikrobielt genombibliotek med et merket DNA omfattende DNA ifølge Figur 2 eller komplementet derav.

18. Fremgangsmåte for femstilling av N-terminal metioninfritt protein, karakterisert ved at det omfatter behandling av et Met-foregått protein med en effektiv mengde Met-aminopeptidase.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at peptidasen avledes fra E. coli og at det Met-foregåtte protein er IL-2 eller ricin A.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at E. coli er stammen pSYC1174.

21. Rekombinant bakterie som omfatter: plasmid DNA som koder Met-aminopeptidase, og en eksprimeringsvektor for et ønsket rekombinant fremmet protein.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av N-terminalt Met-fritt rekombinant protein i en bakterievert, karakterisert ved at den omfatter: dyrking av verten under betingelser egnet for eksprimering av genet som koder det rekombinante protein; der verten er transformert med en vektor i stand til å ekprimere genet som koder Met-aminopeptidase.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det rekombinante protein velges blant IL-2 og ricin A.

24. Rekombinant DNA som er fremstilt fra en enkel klonet rekombinant celle som koder Met-aminopeptidase.

25. DNA ifølge krav 24, karakterisert ved at den Met-aminapeptidasekodende del er avledet fra E. coli.

26. DNA ifølge krav 25, karakterisert ved at den er anbrakt på et plasmid.

27. DNA ifølge krav 26, karakterisert ved at plasmidet er avledet fra E. coli pSYC1174.

28. Plasmid DNA karakterisert ved at det er avledet fra en bakterie defisient på peptidaser, og hvilken bakterie er transformert med et plasmldbåret genbibliotek avledet fra et bakterielt genom, og hvilken bakterie, etter transformering, viser øket peptidaseaktivitet.