JPH0494686A - トリプシン阻害活性を有するポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ
）の製造法に関するものである。本発明は特に、遺伝子
の発現に関与するプロモーターリボゾーム結合部位およ
び分泌シグナルをコードする領域の直後にＰＳＴＩをコ
ードするＤＮＡ配列が結合しているＤＮＡ断片かベクタ
ーＤＮＡ！こ結合しているＰＳＴＩ分泌プラスミド、な
らびにそれを用いた形質転換株、およびＰＳＴＩの分泌
生産法に関する。また、本発明は特に、バチルス・アミ
ロリキファンエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター、リボゾーム結合部位、および分泌シグナルをコ
ードする領域の直後にＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列
が結合しでいるＤＮＡ断片がベクターＤＮＡに結合して
いるＰＳＴＩ分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形
質転換株およびＰＳＴＩの分泌生産法に関するものであ
る。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕近時増加
傾向にある疾病として、急性膵炎が注目を浴びている。

膵炎とは、活性化した膵酵素により起こる膵臓の自己消
化をいう。膵臓の浮腫、出血、壊死を主体にした病変で
あるが、重症の膵炎では、全身の重要臓器の機能不全が
併発し、これが原因で、今日でも約１０％の急性膵炎の
患者が死亡しているといわれる（参考文献１）。膵臓を
消化する酵素としてカリクレイン、キモトリプシン、エ
ステラーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が考えられるが
、これらは正常な状態では活性のない前駆体として膵臓
内に存在している。これらの前駆体が、膵臓内で何らか
の原因により活性化されることにより、膵臓が消化され
、膵炎になるといわれている。前駆体酵素の活性化の火
付は役となるのが、トリプシンである。何らかの原因で
膵臓内で少量のトリプシノーゲンが活性化されトリプシ
ンとなり、それが他の前駆体酵素を次々と活性化し、膵
臓の自己消化が起こる。このように、膵炎の発症や増悪
に膵臓の酵素、とくにトリプシノーゲンの活性化が深く
かかわっている。従って、その治療には、トリプシンの
阻害剤であるトリプシンインヒビターを用いることが可
能である。急性肝臓炎患者には、１９５３年にＦｒｅｙ
がウシ塩基性トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）を患
者に投与した報告がある（参考文献２）。このものは重
篤なアナフラキシーショックを惹起させることがあり、
またウシ由来であることから複数投与することより抗体
が生し大きな問題となっている（参考文献３）。そこで
、ヒト由来の膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＩ
Ｎ）に対する期待が高まった。また、ＰＳＴＩは、血清
中にも存在し、種々の臓器から生した悪性腫ｆ＆患者で
血清ＰＳＴＩ値は高値を示し、血清ＰＳＴＩ値測定によ
る悪性腫瘍診断率は極めて高いとの報告もなされている
（参考文献４）。このような点から、ＰＳＴＩは、膵炎
の治療薬として、また有用な腫瘍マーカーとして期待が
寄せられている。

組換えＤＮＡ技術が出現する前のＰＳＴＩの生産は膵臓
から直接抽出することによってなされていた。例えば、
ウシＰＳＴＩの場合、原材料としてウシ膵Ｒ８，１６５
ｋｇから出発し、また得られたＰＳＴＩも電気泳動的単
一成分でなかったと報告されている（参考文献５）。ま
た、ヒ）ＰＳＴＩを生産する場合は、ヒトＷＱ臓、ある
いはヒト血液より行う必要があり、材料を人手するのが
困難であり、また臓器からのウィルスの混入の可能性も
考えられる点から問題であった。

ところで、組換えＤＮＡ技術により微生物を宿主として
異種遺伝子を発現させ、異種遺伝子産物を多量に生産す
ることが可能となりつつある。異種遺伝子産物とは、あ
る微生物において、その微生物に由来しない遺伝子が発
現した結果産生される蛋白質をいう。

微生物を宿主として生産される組換えＤＮＡ技術による
物質生産は、大きく菌体内生産と菌体外分泌生産とに分
けられる。

前者の場合、異種遺伝子産物を菌体内に効率よく生産す
ることが可能であるが、下記に記載するような問題点が
あることが指摘されている。

第一に、菌体内に生産された異種遺伝子産物は、通常、
生物活性を持たないインクルージヨン・ボディ（ｉｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）と呼ばれる不溶性の塊となる
ことが知られている。

一般に、このような１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを、
菌体から回収することは困難ではないが、天然の高次構
造と活性を有する異種遺伝子産物を得るには、尿素等の
可溶化剤で１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを可溶化後、
天然の高次構造と活性を有する異種遺伝子産物に戻す工
程が必要となる。この工程は、かなり繁雑であり、しか
も、その効率が低い点に実用的な問題がある。例えば、
５ｃｈｏｎｏｒら（参考文献６）によれば、大腸菌の菌
体内で１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを形成したウシ成
長ホルモンの場合は、５Ｍ尿素存在下で一部可溶化する
が、その量は全体の１０％と少なく残りはベレット状の
ままであったと報告されている。

第二に、天然型の異種遺伝子産物を生産することが困難
であることが指摘されている。一般に、異種遺伝子を微
生物で発現させる場合、蛋白質をコードする遺伝子の前
に開始コドン（ＡＴＧ）が必要である。その結果、産生
される蛋白質は、Ｎ末端にＭｅｔが附加された型の融合
蛋白質となる。このようなＭｅｔが附加された型の融合
蛋白質は医薬品として人体に投与した場合、融合蛋白質
による抗体の出現率が高まり、薬効の低下、アナフィラ
キシ−などの副作用の惹起などが問題となる。実際、大
腸菌の菌体内で生産されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）
は、Ｎ末端にＭｅｔが附加されたＭｅｔ−ｈＧＨであり
、天然のｈＧＨと効果において同等であったが、Ｍｅｔ
−ｈＧＨを人体に投与した場合、抗体出現率が高いこと
が認められた（参考文献７）。

第三に、Ｓ−３結合を有する異種遺伝子産物を菌体内に
生産させる場合、そのＳ−８結合が正確に架橋されない
場合が知られている。たとえば、Ｊ、Ｍ、Ｓｃｈｏｅｍ
ａｒｋｅｒ（参考文献８）らによれば、Ｓ−３結合を分
子内に３個持つウシキモシンを大腸菌で発現させた場合
では、分子間のＳ−３結合が形成されたと報告されてい
る。

従って、トリプシン活性を有するＰＳＴＩを生産するプ
ロセスの確立が望まれるが、前述した理由から、菌体内
生産法はふされしくないと考えられた。他方、有用異種
遺伝子産物の菌体外分泌生産は検討すべき種々の課題が
存在するが、以下に述べる理由により、この目的により
適していると考えられた。

一般に、分泌蛋白質は、菌体内でその成熟蛋白質のＮ末
端上流に分泌シグナルが付加した型の前駆体蛋白質とし
て合成されるが、前駆体蛋白質は、分泌の過程で分泌シ
グナルは除去され分泌、シグナルが除去された型の成熟
蛋白質として菌体外に分泌される（参考文献９）。ここ
で、成熟蛋白質とは、分泌蛍白質からそれ自身の分泌シ
グナルを除去された蛋白質をさす。

そこで、ＰＳＴＩのＮ末端上流に分泌シグナルが結合し
た型の前駆体蛋白質として菌体内で発現させ、菌体外へ
分泌させれば、菌体内生産の問題点を回避して抗トリプ
シン活性を有するＰＳＴＩが菌体外に分泌されること、
さらに、分泌シグナルとＰＳＴＩとの結合方法を工夫す
ることにより、分泌の際に分泌シグナルが所望の部位で
切断されたヒト膵臓由来のＰＳＴＩと同しＮ末端を有す
るＰＳＴＩを培養液中に産生させることが期待される。

このような観点から、大腸菌を宿主としたＰＳＴｌの分
泌生産について報告がなされている。彼らは、大腸菌の
ｏｍｐＡの分泌シグナルの直後に成熟ＰＳＴＩを結合さ
せた分泌プラスミドを構築し、大腸菌を宿主としてＰＳ
Ｔ　Ｉの分泌を試みた。この場合、２．５から１０■の
ＰＳＴＩの分泌が認められた（参考文献１０）。また、
酵母では酸性ホスファターゼのプロモーターおよびＰＳ
ＴＩ自身の分泌シグナルを利用し、ＰＳＴＩ（Ｄ誘導発
現を行った。この場合、培養液中に蓄積したＰＳＴＩの
量はわずか１．６■／！であったと報告されている（参
考文献１１）。

本発明者らは、これらの系に代わるさらに良いＰＳＴＩ
の分泌生産系を探索することにした。そこで、本発明者
らは、分泌蛋白質を多量に分泌する性質ををし、病原性
がなく、酵素、アミノ酸、核酸等の工業用微生物として
使用経験の豊富なバチルス属細菌を宿主として用いる方
法を検討した。特にバチルス属細菌のなかでもバチルス
°ズブチリスは、遺伝学的、生化学的、分子生物学的、
応用微生物学的知見が多く蓄積されている。この点から
、バチルス・ズプチリスを宿主とした異種遺伝子産物を
菌体外に分泌するための宿主−ベクター系の確立は大き
な意義を有するものである。

これまでに、バチルス・アミロリキファシエンスのα−
アミラーゼ遺伝子を利用した、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のβ−ラクタマーゼの分泌（参考
文献１２）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のヌクレアーゼの分泌（参
考文献１３）、スタフィロコッカスのプロティンＡの分
泌（参考文献１４）ヒトーα−インクフエロンの分泌（
参考文献１５）、バチルス・ズプチリスのαアミラーゼ
遺伝子を利用したマウス−β−インクフェロンの分泌（
参考文献１６）、バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子、あるいはアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子を利用したスタフィロコッカスのプロティン
Ａの分泌（参考文献１７）、ヒト血清アルブミン分泌（
参考文献１８）等の報告がされている。これらの報告が
示すように、バチルス・ズプチリスを宿主として成る種
の原核生物由来の蛋白質は効率よく分泌蓄積されること
が報告されている。例えば、β−ラクタマーゼ（参考文
献１２）、ヌクレアーゼ（参考文献１３）、プロティン
Ａ（参考文献１７）の分泌蓄積量は、培養液ＩＰあたり
、それぞれ約２０■、約５０■、約１０００■であった
。しカシながら、真核生物由来のヒト−α−インターフ
ェロン（参考文献１５）、マウス−β−インターフェロ
ン（参考文献１６）、ヒト血清アルブミン（参考文献１
８）の分泌蓄積量はともにわずかで、例えばヒト−α−
インターフェロンの場合は、培養液１１あたり０．５■
であったと報告されている。これらの例が示すように、
バチルス・ズプチリスを宿主とした真核生物由来の蛋白
質を多量に分泌生産することは必ずしも容易でないこと
を示している。

一般に、分泌蛋白質の遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼに
よる転写の結果ｍＲＮＡとなり、さらにそのｍＲＮＡを
鋳型として成熟蛋白質のＮ末端上流に分泌シグナルが付
加した型の前駆体蛋白質が合成される９分泌の過程にお
いて、この分泌シグナルは、前駆体蛋白質から除去され
ることが知られている。

そこで、分泌させたい蛋白質の種類によって、分泌蓄積
量が異なる原因を調べるために、Ｕｌｍａｎｅｎ（参考
文献１９）らは、分泌蛋白質の遺伝子のプロモーター、
リボゾーム結合部位および分泌シグナルをコードする領
域の直後に異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を結合さ
せた型の融合遺伝子の転写、翻訳、およびその結果産生
された異種遺伝子産物の分泌効率のうち、どの段階が異
種遺伝子産物の分泌蓄積量に影響を与えるかを検討した
。

すなわち、彼らは、バチルス・アミロリキファシエンス
のアミラーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部
位、分泌シグナルをコードする領域を用いて、Ｓｅｍ１
ｌｉｋｉ　ｆｏｒｅｓｔ　ｖｉｒｕｓの糖蛋白であるＥ
１タンパクと大腸菌のβ−ラクタマーゼ、および、バチ
ルス・アミロリキファシエンスのαアミラーゼの分泌を
試みた。その結果、菌体内に生産されるそれらの成熟蛋
白質のＮ末端上流に分泌シグナルが付加した型の前駆体
蛋白質をコードするｍＲＮＡの量には大差が見られなか
った。

一方、Ｅ１タンパク、β−ラクタマーゼの分泌蓄積量は
、α−アミラーゼの分泌蓄積量に比べそれぞれ、０．０
１％、１０％であったと報告されている。この報告では
、この原因を宿主であるバチルス・ズプチリスが、アミ
ラーゼ遺伝子の分泌シグナルの下流に異種蛋白質を結合
させた型の融合蛋白質を効率よく分泌させえないため、
あるいは、バチルス・ズプチリスが持つ蛋白質分解活性
による異種蛋白質の分解によるものとしている。

このように、同し分泌蛋白質遺伝子、すなわちα−アミ
ラーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位、お
よび、分泌シグナルをコードする領域を用いても、分泌
される蛋白質の種類によって分泌蓄積量に差が生ずるの
であると報ぜられている。

また、同一の分泌蛋白質遺伝子の分泌シグナルをコード
する領域と、同一の真核生物由来の蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片を用いても、両者の結合様式の相違により、
真核生物由来の蛋白質が枯草菌で分泌される場合とされ
ない場合とがあることを、Ｐａ１ｖａ、　Ｉ　　（参考
文献１５）らと５ｃｈｅｉｎ　Ｃ，Ｈ３（参考文献２０
）らの報告が示している。すなわち、Ｐａ１ｖａらは、
分泌蛋白質の一つであるバチルス・アミロリキファシエ
ンスのα−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナルの切断点を
含む領域（Ａｌａ−Ｖａｌ）、すなわち分泌シグナルを
コードする３′−末端（Ａｌａ）のあとに成熟蛋白質の
Ｎ末端アミノ酸（Ｖａｌ）をコートするＤＮＡ断片の後
に、直接、または５アミノ酸残基からなる結合領域（＾
５ｎ−Ｇｌｙ−ＴｈｒＧｌｎ−Ａｌａ）を介して成熟イ
ンターフェロン（ＩＦＮ）をコードするＤＮＡ断片を結
合させ、ヒトｌＦＮタンパクの分泌を試みた。この場合
、分泌シグナルは除去されたが、分泌されたインターフ
ェロンは、成熟インターフェロンのＮ末端上流に１個（
Ｖａｌ）　、または６個（Ｖａｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｉｎ−Ａｌａ）のアミノ酸が付加した型の融合
蛋白質が分泌蓄積され、それらの量は、培養液１１あた
り０．５ｒｎｇから１ｍｇであった。一方、５ｈｅｉｎ
　らは、Ｐａｌνａと同じα−アミラーゼ遺伝子の分泌
シグナルのＣ末端のアミノ酸（Ａｌａ）をコードする領
域の直後に、成熟インターフェロン（ＩＦＮ）をコード
するＤＮＡ断片を結合させ、ヒトＩＦＮの分泌を試みて
いる。しかしながら、この場合、多量の前駆体ＩＦＮ、
あるいは成熟ＩＦＮが細胞膜に留まり、培地中への分泌
は、少量であったと報告されている。

以上記載した様に、バチルス・ズプチリスを宿主とした
系で、真核生物由来の成熟蛋白質のＮ末端上流に分泌シ
グナルが付加した型の前駆体蛋白質が分泌されるかどう
か、また分泌の過程でその分泌シグナルがプロセスされ
るかどうかは予測不可能であり、結局のところ選択され
る成熟蛋白質と分泌シグナルとの組合せ、あるいは、両
者の結合様式の差によって異なるものであることは当業
者の共通の認識となっている。

〔課題を解決するための手段〕

上記の点に鑑み本発明者らは、ＰＳＴＩを分泌させ得る
プロモーター、リボゾーム結合部位および分泌シグナル
を有する遺伝子を検索し、遂に本目的を達しせしめるＤ
ＮＡ断片を見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、バチルス・アミロリキフプシエン
スの中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾー
ム結合部位および分泌シグナルをコードする領域の直後
にＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列が結合しているＤＮ
Ａ断片をヘクターＤＮＡに結合したＰＳＴＩ分泌プラス
ミド、およびこのＰＳＴＩ分泌プラスミドで形質転換し
て得た形質転換株、およびこの形質転換株を培養してそ
の培養上清からＰＳＴＩを回収するＰＳＴ　Ｉの製造法
である。

ヘクターに結合したＤ　Ｎ　Ａ断片は好ましくは下記の
ＤＮＡ配列を有している。

５’　ＧＡＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴ
ＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴ
ＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＡＴＴＣＧＡ
ＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＡＴＣＣＡＡＣＡＣＧＴＣＴＣＴ
ＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣ
ＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＴＣ、ＧＡＣＣＡＡＴＣ
ＴＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＡＣ；
ＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＡＧＡＴＴＣ
ＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＣＴＴ
ＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＧＣ、ＧＡＴ
ＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＣ；ＡＡＡＴ
ＴＧＴＣＴＡＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＴＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴ
ＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣ、ＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴＡＡ
Ｃ；ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣ
ＣＧＡＣＧＣ；ＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡ
ＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＣ；ＣＴＴＣＧＡＡＡＡＣＣＧ
ＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣ
ＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣ３′ 以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で言うプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが
認識し結合するＤＮＡ配列をいう。

一般に、ＲＮＡの合成開始点を“＋１パとし、その上流
のＤＮＡ配列を並べると、そこから約１０塩基のところ
に共通性の高いＤＮＡ配列の存在が知られている。その
ＤＮＡ配列は、５’ＴＡＴＡＡＴ３’であり、　−１０
領域”といわれている。さらに約３５塩基のところにも
共通性の高いＤＮＡ配列の存在が知られており、そのＤ
ＮＡ配列は、５’　ＴＴＧＡＣＡ３’であり、　−３５
頭域”といわれている。通常、　−３５領域”はＲＮＡ
ポリメラーゼの認識のため、　−１０頭域“′はその結
合のために必要とされている（参考文献２１）。

バチルス・ズプチリスは幾つかの種類のＲＮＡポリメラ
ーゼを持つことが知られている。この多様性は、バチル
ス・ズプチリスの複雑な発現制御を伴う胞子形成の過程
において重要な役割を果たしている。とくに、栄養増殖
期にあるＲＮＡポリメラーゼの大部分はσ５５型ＲＮＡ
ポリメラーゼを持ち、従って大部分の遺伝子の転写はこ
れによって行われることが知られている（参考文献２２
）。

本発明の分泌プラスミドにおけるプロモーターの゛−３
５領域°゛、および゛−１０領域”と考えられるＤＮＡ
配列は、前記のＤＮＡ配列のうち、それぞれ５′末端か
ら１７８番目の塩基であるＴから開始する５“ＴＴＧＣ
ＡＧ３’　、および２０２番目の塩基から開始する５’
　ＴＡＴＴＡＴ３’である。このＤＮＡ配列は、バチル
ス・ズプチリスの栄養増殖機の主たるＲＮＡポリメラー
ゼであるσ５５型ＲＮＡポリメラーゼと高い相同性を有
している（参考文献２２）。

また、リポゾーム結合部位とはＲＮＡポリメラーゼによ
り合成されたｍＲＮＡがリボゾームと結合するＤＮＡ配
列を指す。

−ｍに、リポゾーム結合部位は開始コドンの５から９塩
基上流に共通にみられるＤＮＡ配列で、１６ＳｒＲＮＡ
の３′末端のＤＮＡ配列と相補的なりＮＡ配列を指す。

微生物の種類によって、その１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配
列は異なるが、バチルス・ズプチリスの１６ＳｒＲＮＡ
のＤＮＡ配列は３’　ＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣ５’である
ことが知られている（参考文献２２）。

本発明の分泌プラスミドのりボヅーム結合部位と考えら
れるＤＮＡ配列としては、前記ＤＮＡ配列において２３
５番目の塩基から開始する５’ＡＡＡＧＧＧＧ（１，３
’である。このＤＮＡ配列は、バチルス・ズプチリスの
１６３ｒＲＮＡと極めて高い相補性を有するものである
。

これらのブロモター、およびリポゾーム結合部位のＤＮ
Ａ配列は、遺伝子の発現に重要な役割を果たす。また、
これらのＤＮＡ配列は、遺伝子の発現効率に関係してい
ることは今日広く知られている（参考文献２１）。

バチルス属細菌を宿主として所望の蛋白質の遺伝子を発
現させる場合は、バチルス属細菌のＲＮＡポリメラーゼ
及びリポゾームが、プロモーター及びリポゾーム結合部
位に対して厳格な特異性を持つため（参考文献２２）、
それらの領域はバチルス属細菌由来であることが望まし
い（参考文献２３）。

また、分泌シグナルとは、成熟蛋白質のＮ末端上流に存
在する２０から３０アミノ酸残基によりなるポリペプチ
ドを指す。分泌シグナルには、次のような特徴がある。

すなわち、Ｎ末端近くに塩基性アミノ酸の存在、中央部
に疎水性アミノ酸のクラスターの存在、および分泌シグ
ナルの切断部位に小さな側鎖を有するアミノ酸の存在が
知られている。このポリペプチドは、分泌の過程で除去
されるものであり、前駆体蛋白質の細胞膜通過において
重要な役割を果たすと考えられている（参考文献９）。

本発明の分泌プラスミドの構築に用いたバチルス・アミ
ロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子の分泌シ
グナルと考えられるアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５
ｅｒ−ＡｌａＶａ　１−Ａｌａ−Ａ　ｌａ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−５ｅ
ｒＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−ＡＩ’ａ
−であり、典型的な分泌シグナルの１次構造を有してい
る。すなわち、このアミノ酸配列には、Ｎ末端付近の塩
基性アミノ酸であるＬｙｓの存在、中央部分の疎水性ア
ミノ酸のクラスター（Ｌｅｕ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−）
の存在、および分泌シグナルの切断部位に小さな側鎖を
有するアミノ酸（Ａｌａ）の存在が認められるからであ
る。

従って、本発明の前記ＤＮＡ配列における分泌シグナル
をコードするＤＮＡ配列としては、５′ＧＴＧＧＧＴＴ
ＴＡＣ，ＧＴＡＡＣ；ＡＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＣＴ
ＧＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣ，ＡＧＴＴＴＡ
ＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＡＣＧ
ＣＣＧＣＴ３’である。

また、本発明のＰＳＴ　Ｉ分泌プラスミドの構築に用い
たＰＳＴＩタンパクのアミノ酸配列は、１９７６年にＧ
ｒｅｅｎｅらにより決定され報告されている（参考文献
１０）。発表されたアミノ酸配列はＡｓ　ｐ−５ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　１ａ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ−ＡｓｎＧ　１　ｕ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−１１ｅ−
Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＡｓｎＧ　１ｕ
−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＧｌｎ−Ｔｈｒ−３
ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

Ｃｙｓであり、このＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列は
、５’　ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴ
ＡＡＡＴＣ；ＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧ
ＧＴＴＴＧＣＣ；ＧＴＡＣＣ，ＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴ
ＴＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＴＣ，ＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣ
ＴＴＣＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＴＴ
ＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣ；ＡＡＡＴＣＴＣ；ＧＴ
ＣＣＧＴＧＣ３′である。

また、−船釣にはプロモーター、リボゾーム結合部位お
よび分泌シグナルをコードする領域の下流に、異種蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を挿入結合することが可能で
、しかもバチルス属細菌で複製可能な異種蛋白質分泌プ
ラスミドを創製する場合は、短時間の内に菌体外に分泌
生産される分泌蛋白質の遺伝子を用いることが重要であ
る。そのような分泌蛋白質としては、アルカリ性プロテ
アーゼ、α−アミラーゼ、レバンシュクラーゼ等が知ら
れている。しかしながら、このような分泌蛋白質のプロ
モーター、リボゾーム結合部位および分泌シグナルをコ
ードする領域の下流に、異種蛋白質をコードするＤＮＡ
断片を挿入結合したバチルス属細菌で複製可能な異種蛋
白質分泌プラスミドを構築するだけでは、異種遺伝子産
物が菌体外に効率よく分泌生産させえない場合のあるこ
とを、Ｕｌｍａｎｅｎ　ら（参考文献１９　）　、５ｃ
ｈｅｉｎ　（参考文献２０）らが報告が示していること
に注目すべきである。

本発明者らは、ＰＳＴＩを多量に菌体外Ｓ＋分泌しうる
能力を有する分泌蛋白質をコードする遺伝子を鋭意探索
し、さらに分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片とＰＳ
ＴＩをコードするＤＮＡ断片の結合との仕方を種々追究
した結果、バチルス・アミロリキファシエンスの中性プ
ロテアーゼ遺伝子を選択し、かつこの中性プロテアーゼ
遺伝子のプロモーター、リポゾーム結合部位および分泌
シグナルをコードする領域の直後にＰＳＴＩをコードす
るＤＮＡ断片を結合させることにより、後述の実施例で
示すようにきわめて優れた成績を有する本発明の分泌プ
ラスミドを構築することが出来本発明のＰＳＴＩ分泌プ
ラスミドを構成するベクターＤＮＡとしては、バチルス
属細菌で複製可能なものであれば如何なるものでも使用
可能である。通常よく用いられるものとしてスタフィロ
コッカス属由来のプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、
ｐｃｌ　９４、ＰＤＢ９、ｐＢＤ６４、ｐＢＣ１６、ｐ
、Ｅ１９４等およびその誘導体を挙げることができる。

上記のプラスミドを有するバチルス・ズプチリスは、い
ずれもオハイオ大学バチルスストックセンター（住所；
　４８４　Ｗｅｓｔ　１２ｔｈ　ＡｖｅｎｕｅＣｏｌｕ
ｍｂｕｓ　０ｈｉｏ　４３２１０　ＵＳＡ）で万人に分
譲されるものである。

とくに、本発明で用いるベクターＤＮＡとしては、バチ
ルス属細菌で複製可能なプラスミドであれば如何なるも
のでもよいが、分子生物学的知見の蓄積が多く、かつバ
チルス属細菌で安定に保持される点からｐＵＢ１１０が
よい。

本発明のＰＳＴＩ分泌プラスミドは、後述の実施例に記
載するように、中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
、リポゾーム結合部位および分泌シグナルをコードする
領域の直後に異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を結合
することのできる異種蛋白質発現分泌ベクターを用いて
、そのプロモーター、リポゾーム結合部位および分泌シ
グナルをコードする領域の直後にＰＳＴＩをコートする
ＤＮＡ配列を挿入結合し構築したものである。本発明の
ＰＳＴＩ分泌プラスミドは、また、化学的に合成した前
記ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片と適当な制限酵素で切断
したバチルス属細菌で複製可能なベクターＤＮＡ断片と
を常用の連結技術を用いて結合することにより構築する
ことも可能である。これらの場合、２つのＤＮＡ断片は
、たとえば、共通の制限酵素部位を介して、および／ま
たは合ＮＡリンカ−を用いることにより、および／また
は平滑末端結合により連結されることが可能である。

バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
遺伝子のプロモーター、リポゾーム結合部位、および、
分泌シグナルをコードする領域の下流にＰＳＴＩタンパ
クをコートするＤＮＡ断片を結合させたＤＮＡ断片が上
記に記載したベクタ−ＤＮＡと結合して構築されたＰＳ
ＴＩ分泌プラスミドは、これを用いてバチルス・ズプチ
リスを形質転換して形質転換株を得ることができる。バ
チルス・ズプチリスの形質転換の方法としては、当業界
で用いられている方法ならばいかなる方法を用いること
が可能である。例えば、Ｃｈａｎｇらの方法（参考文献
２３）により行うことができる。

この方法は、３段階に分けることができる。

１、バチルス・ズプチリスを等調液において、リゾチウ
ムで処理することによる細胞壁のないバチルス・ズプチ
リス、すなわちプロトプラストを生成させる過程。

２、ポリエチレングリコール溶液を用いた、ベクターＤ
ＮＡによるプロトプラストの形質転換を行う過程。

３、再生培地におけるプロトプラストの細胞壁の再生と
形質転換されたバチルス・ズプチリスを選択する過程。

かくしてえられた形質転換株を用いＰＳＴＩを得るには
その菌株を通常の方法で液体培養すればよい。例えば、
２！の三角フラスコに、４００ｄのＬＢ培地（参考文献
２４）に形質転換株を植菌した後、３７°Ｃで、約２０
時間、好ましくは最大収量のＰＳＴＩが分泌産生される
まで、振盪を行いながら培養する方法がある。

本発明の形質転換株は、資化可能な炭素源、窒素源、お
よび無機塩源を有す液体培地で培養される。例えば、通
常よく用いられる液体培地としてＬＢ培地等が挙げられ
る。

また、ここで用いる菌株としては、本発明のＰＳＴＩ分
泌プラスミドで形質転換されるバチルス属細菌なら如何
なるものでもよいが、遺伝学的、生化学的、分子生物学
的、応用微生物学的知見が多く蓄積されており、かつ安
全性も高い点からバチルス・ズプチリスがよい。

培養液からのＰＳＴＩの調製は、培養上清から回収精製
を行えば実施可能である。本発明者らは、この培養上清
のＰＨを塩酸で３に調整した後、蛋白性の沈殿を遠心で
除いて得られた上清画分にＰＳＴＩは残存し、しかも、
その存在比は、全蛋白に対し６％と高まり極めて夾雑蛋
白の少ないものとなることを見出した。その結果、培養
液中に分泌されたＰＳＴＩは、この上清から、陽イオン
交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーによ
り容易に精製できる。

本発明者らは、ＰＳＴＴ分泌プラスミドを用いて形質転
換されたバチルス・ズプチリスをＣＹＧ培地で培養する
ことにより、３■／ｌ・Ａ６６０相当の抗トリプシン活
性を有するＰＳＴＩが分泌蓄積されることを見出した。

なお、この時のバチルス・ズプチリスの生育度を示す培
養液の吸光度（Ａ６６０）は、１０であった。この単位
（■／２・Ａ６６０）は、培養上清（１１）に蓄積した
ＰＳＴＩの量（■）を、培養液のバチルス・ズプチリス
の生育度を示す吸光度（Ａ６６０）で割った値を示す。

この培養上清（１１）のｐＨを塩酸で３に調整した後、
生した蛋白性の沈殿を遠心で除いて得られた上清画分か
ら、陽イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグ
ラフィーを用いて精製後、培養液ｌｌから１５■のＰＳ
ＴＩを得ることが可能であることが判明し、本発明を完
成したのである。

また、本発明のＰＳＴＩ分泌プラスミドは、中性プロテ
アーゼ遺伝子の分泌シグナル領域の３゛末端直後に、Ｐ
ＳＴＩのＤＮＡ断片の５′末端が直接結合した型のＤＮ
Ａ領域を有しおり、このプラスミドで形質転換して得た
形質転換株の菌体内あるいは、細胞膜において、中性プ
ロテアーゼ分泌シグナルのＣ末端に存在するアミノ酸の
直後にＰＳＴＩのＮ末端に存在するアミノ酸が結合した
型の前駆体蛋白質が合成されると考えられる。一般に、
分泌の過程において、分泌シグナルは除去されることが
知られており、本発明の場合も、分泌シグナルが除去さ
れた、ヒト膵臓由来のＰＳＴＩと同しＮ末端アミノ酸配
列を有する天然型ＰＳＴＩの分泌生産が期待される。し
かしながら、単に分泌蛋白質をコードする遺伝子のプロ
モーターリボゾーム結合部位、および分泌シグナルをコ
ートする領域の直後に、所望の成熟蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列を結合させただけでは、菌体内で合成される
と考えられる分泌シグナルの下流に成熟蛋白質が結合し
た型の前駆体蛋白質から分泌シグナルが除去された成熟
蛋白質を効率よく分泌させ得ない場合のあることを５ｃ
ｈｅｉｎ　（参考文献２０）らが報告している。本発明
においてもＰＳＴＩ分泌プラスミドにより形質転換され
たバチルス・ズプチリスの場合も、中性プロテアーゼ分
泌シグナルのＣ末端に存在するアミノ酸の直後にＰＳＴ
ＩのＮ末端に存在するアミノ酸が結合した型の前駆体蛋
白質から、分泌シグナルが除去された天然型ＰＳＴＩが
分泌されるかどうかについては不明であった。本発明者
らは、分泌シグナルとＰＳＴＩとの結合の仕方を種々検
討した結果、本発明の場合のみが驚くべきことに、本発
明の実施例に示すように、形質転換されたバチルス・ズ
プチリスによって、天然型ＰＳＴＩが培養液中に分泌さ
れることが見いだされた。

（作用） 本発明の一態様として示すように、バチルス・アミロリ
キファンエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロモータ
ー、リボゾーム結合部位および分泌シグナル領域を利用
してＰＳＴＩ分泌プラスミドを構築し、バチルス・ズプ
チリスに導入して得た形質転換株を培養することにより
、ヒト膵臓由来のＰＳＴＩと同しＮ末端アミノ酸配列を
有するＰＳＴＩを培養上清中に分解させることなく分泌
させることが可能となった。すなわち、ＰＳＴＩを培養
上清から簡単な方法で回収精製できるＰＳＴＩの製造法
が確立された。

〔実施例］ 以下、本発明を具体例で説明するが本発明は、この例に
より何ら限定されるものではない。

実施例１ （異種蛋白質発現分泌ベクターｐＮＰＡ２２５の構築） バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位および分泌
シグナルをコードする領域の直後に異種蛋白質をコード
するＤＮＡ断片を挿入結合することの可能な異種蛋白質
発現分泌ヘクターＰＮＰＡ２２５は図１に示した方法に
従って構築した。

プラスミドｐＮＰＡ８４は、中性プロテアーゼ遺伝子の
プロモーター、リボゾーム結合部位、分泌シグナル、お
よび、プロペブタイドの上流域をコードする領域の下流
に、成熟α−アミラーゼタンパクをコードするＤＮＡ断
片が結合したＤＮＡ断片を有するアミラーゼ分泌プラス
ミドである。

成熟α−アミラーゼ遺伝子とは、天然に存在するロイシ
ンから始まるα−アミラーゼ活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を指す。このプラスミドｐＮＰＡ８４
を含む形質転換株ＭＴ−８４００（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
９２３）から、ｐＮＰＡ８４をＴａｂａｋらの方法（参
考文献２５）を用いて調製した。このｐＮＰＡ８４ＤＮ
Ａを制限酵素Ｈｐａｌｌ（宝酒造製）と制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ（宝酒造製）とで分解して生した約７．８ＫｂのＤ
ＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片Ａとする）をアガロースゲ
ルを用いた電気泳動により精製した。このＤＮＡ断片Ａ
は、中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾー
ム結合部位およびＣ末端頭載を欠く分泌シグナルをコー
ドする領域を含んででいる。一方、中性プロテアーゼ遺
伝子の分泌シグナル頭載の直後に制限酵素５ｔｕｌ切断
部位を創製するために、ｌ　６ｍｅ　ｒと１８ｍｅ　ｒ
の２種類の合成オリゴヌクレオチドを改良トリエステル
法（参考文献２６）で合成した。２種類の合成オリゴヌ
クレオチド各１μｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
宝酒造製）、およびｄＡＴＰ（ファルマシア製）を用い
てリン酸化した（参考文献２７）。次に、これらの反応
生成物を混ぜ、熱湯中で３分間加熱後、ゆっくりと冷却
することにより２種類の合成オリゴヌクレオチドをアニ
ールした。然る後に、ＤＮＡ断片Ａ（０，５μｇ）とア
ニルした合成オリゴヌクレオチド（１μｇ）をＴ４リガ
ーゼ（宝酒造製〕を用いて結合し、プラスミドｐＮＰＡ
２２５を得た。

実施例２ （ＰＳＴＩ分泌プラスミドｐＮＰＰ１２６の構築）プラ
スミドｐＮＰＰ１２６は第２図に示した方法に従って構
築した。

まず、ＰＳＴＩのＮ末端から２６残蟇目までのアミノ酸
をコードするＤＮＡ５１Ｍを含むＤＮＡ断片（第３図）
を構築するために、４種のオリゴヌクレオチ）’　（５
’　ＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＣ，ＴＣＣ，ＴＧＡＡＧ
ＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧ
ＴＴＣＣＡ３’　、５’　ＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＣ
ＣＣＧＧＴＴＴＣＣＣ，ＧＴＡＣＣＴＧ３’　、５’　
ＴＴＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ
ＧＡＣ，ＡＧＴＣＧＧ３’　、５’　ＧＡＴＣＣＡＧＧ
ＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴ
ＡＣ，ＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧ３’　）を
合成した。次に、得られた合成オリゴヌクレオチド各ｌ
μｇは、リン酸化後アニールした。これと制限酵素５ｔ
ｕｌと制限酵素ＢａｍＨＴとで切断したｐＮＰＡ２２５
　ＤＮＡ　（０，５μｇ）とをＴ４リガ〜ゼ（宝酒造製
）を用いて結合させ、中性プロテアーゼ遺伝子の分泌シ
グナルをコードする領域の直後にＰＳＴＩをコードする
ＤＮＡ断片のＮ末端領域（ＰＳＴＩのＮ末端から２６ア
ミノ酸残蟇目までに対応）が結合したバイブツリドプラ
スミＦＰＮＰＰ１１３０を得た。

次にＰＳＴＩの２７残基目から５６残基までのアミノ酸
をコードするＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片（図４）を構
築するために、４種オリゴヌクレオチド（５’　ＣＧＡ
ＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＡＣＣ；ＡＡＴＧ
ＣＣ；ＴＴＣＴＧＴ３’５’　Ｃ，ＣＴＴＣＧＡＡＡＡ
ＣＣＣＴＡＡＡＣＣ；ＴＣＡＣ；ＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣ
ＴＣ；ＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＴ
ＧＡＡＴＴＣＡ３’　、５’　ＡＣＡＧＡＡＣＧＣＡＴ
ＴＣＣＴＴＣＧＧＧＴＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣ
ＴＡＣ３’　、５’　ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣ，Ｃ
ＡＣＧＣ，ＡＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣ；Ｇ
ＡＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＴ
ＣＣ；ＡＡＧＣ３’　）を合成した。そして得られた合
成オリゴヌクレオチド各１μｇは、リン酸化後アニール
した。これと制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩ［Ｉとで切
断した大腸菌ｐＵｃ１　ＢＤＮＡ　（０５μｇ）とをＴ
４リガーゼ（全酒造製）を用いて結合させ、ハイブリッ
ドプラスミドｐＬｌｃＰ１２１を構築した。このｐＵｃ
Ｐ１２１ＤＮＡ（２μｇ）を制限酵素ＫｐｎｌとＨｉｎ
ｄｌ［ｌとで分解することにより、ＰＳＴＩの２７番目
からＣ末端までのアミノ酸配列をコードするＤ　Ｎ　Ａ
　’ｐＭ域を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ）を調製ア
ガロースゲル電気泳動によって精製した。このＤＮＡ断
片（ｌμｇ）とｐＮＰＰＬ１３０を制限酵素Ｋｐｎ■と
Ｈｉｎｄｌｌ＋　とで分解した結果生した約６．２Ｋｂ
のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｃ）（１μｇ）をＴ４リガー
ゼを用いて結合し、ＰＳＴＩ分泌プラスミドｐＮＰＰ１
２６を構築した。このＰＮＰＰ１２６は、バチルス・ア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロ
モーター、リボゾーム結合部位および分泌シグナルをコ
ードする領域の直後にＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列
が結合したＤ　Ｎ　Ａ断片を含むプラスミドである。

実施例３ （ＳＴ１分泌プラスミドによるＰＳＴＩの分泌生産） 構築したプラスミドｐＮＰＰ１２６を用いて、バチルス
・ズプチリスＭＴ−４３０株（ＦＥＲＭＢＰ−１０７９
）をＣｈａｎｇらの方法（参考文献２４）に従い形質転
換した。得られた形質転換株ＭＴ−１２６株ＣＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２７５９）をＣＹＧ培地（２％カザミノ酸（
ＤＩＦＣＯ製）、１％粉末酵母エキスＤ−３（日本製薬
部）、０．４％グルコース、０．１％ＮａＣ目を用いて
、３０°Ｃで２０時間振盪培養した。得られた培養上清
中の抗トリプシン活性を測定することにより、ＰＳＴＩ
の分泌蓄積量を測定した。その結果、培養液１リツター
中に３０ｍｇのＰＳＴＩに相当する量の抗トリプシン活
性が認められた。この時の菌の生育度を示す吸光度（Ａ
６６０）は、１０であった。抗トリプシン活性は、トリ
プシンに対する合成基質カルボベンゾキシ−ハリルーグ
リシル−アルギニン−ｐ−二トリル氷解活性の阻害塵を
測定することによった。すなわち、５０μβのトリプシ
ン（ヘーリンガーマンハイム製）溶液（ｌ　ｔｔｍｏ　
ｌ／／りと緩衝液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
０゜２９％　塩化カルシウム２水和）１００μｌを中性
から酸性で混合し、３０°Ｃで５分間プレインキユヘー
トしたのち５０μｌを、カルボベンゾキシ−バリル−グ
リシル−アルギニン−ｐ−二トリルに加えた（基質終濃
度、０゜３１ｍＭ）。反応開始後ｐ−ニトロアニリンの
遊離を波長４０５ｎｍで測定し、単位時間当りの吸収の
増加をａとした。次に、緩衝液の代わりに、試料溶液を
加え、同様の操作を行い、波長４０５ｎｍの吸収の増加
を測定し、その値をｂとした。

（ａ−ｂ）／ａを算出することにより、培養上清の抗ト
リプシン活性を測定した。この活性測定法からＰＳＴＩ
含有量を求めるには、トリプシン比活性を別に求め、Ｐ
ＳＴＩが、１：１（モル比）でトリプシンを阻害するこ
とから計算した。

ＰＳＴＩは、この上清から、５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｙｌ　
　Ｍクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーによ
り精製した。すなわち、培養上清を塩酸処理して得られ
た上清両分を、１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー（
ｐＨ３，０）で　洗浄した５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　
　Ｍカラムに添加した後、ｐＨ３，０から８．０のｐＨ
勾配により溶出した。得られた抗トリプシン活性を有す
る画分を集めた。溶出した抗トリプシン活性を有する画
分を集めＣ８μＢＯＮＤＡＳＨＡＲＥ　（Ｗａｔｅｒｓ
、Ｉｎｃ、製）カラムを用いた逆相カラムクロマトグラ
フィーにより更に精製した。溶出条件は、０．　１％Ｔ
ＦＡを含む水（Ａ液）と、０１％ＴＦＡを含むアセトニ
トリル（Ｂ液）とのグラジェントによった。すなわち、
初期条件は、Ａｉを１００％とした。Ｂ液の比率が、グ
ラジェント開始後１０分後に１９％、７０分後に２５％
、９０分後に１００％になるようにした。得られた溶出
液を用いて抗トリプシン活性を測定した結果、カラム保
持時間４８分のところに抗トリプシン活性が認められた
。このように精製して得られた　ＰＳＴＩは、５ＤＳ−
ＰＡＧＥ的に１ハンドであった。そこで、得られた精製
ＰＳＴＩを用いて、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した
ところＡｓｐ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓであることが判明した。

このことは、本発明のＰＳＴ　Ｉ分泌プラスミドで形質
転換されたバチルス・ズプチリスにより分泌生産される
ＰＳＴＩが、ヒト由来のＰＳＴＩと同じＮ末端アミノ酸
配列を示すものである。

また、トリプシン阻害実験の結果、この精製ＰＳＴＩは
、化学量論的にトリプシンと１：１で反応することが明
らかとなった。

これらのことは、また、本発明のＰＳＴＩ分泌プラスミ
ドで形質転換されたバチルス・ズプチリスにより分泌生
産されるＰＳＴＩが、抗トリプシン活性に関してヒト由
来のＰＳＴＩと同じ活性を有するものであることを示す
ものである。

（参考文献） １、小川道雄、外科治療、４５　（３）、２９０、２、
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ｗａｌｄ、Ｆ、　　　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｇｅｎｅ　　６Ｂ、３５７　（１９８８）１１、　　Ｉ
ｚｕｍｏｔｏ、Ｙ、、Ｇｅｎｅ、５９１２、　　Ｐａ１
ｖａ、　　Ｉ、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　　ｉ。

ＵＳＡ、　　　７９．５５８２．　　（１９８２）１３
、Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ、Ｓ、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１６２，５２１、　　
（１９８５） １４　　Ｆａｈｅｓｔｏｃｋ、Ｓ、Ｒ，ｅｔ　　　ａｌ
、　、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６５１５、Ｐａ１
ｖａ、１．　　　ｅｔ　　ａｌ、Ｇｅｎｅ１６、Ｙａｍ
ａｎｅ、に、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｉｎ、Ｊ、Ａ、　　Ｈｏｃｈ　　ａｎｄ　　Ｐ。

Ｓｅｔ　ｌｏｗ　　（ｅｄ、） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　　　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，。

１７、Ｖａｓａｎｔｈａ、Ｎ、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、　　　１６５１８、　　Ｓａ
’ｎｄｅｒｓＳ　Ｃ，Ｗ、　　、　ｅｔ　　　ａ　　ｌ
。

Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６９．　２９１９
、Ｕｌｍａｎｅｎ、１．　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１６２１７６、　　
（１９８５） ２０．５ｃｈｅｉｎ、Ｃ，Ｈ，ｅｔ　　　ａｌ、。

Ｂ　１０／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｎｔ、　　１３３１９、
　　（１９７９） ２１、Ｍｏｒａｎ、Ｊｒ、Ｃ８Ｐ、　　　ｅｔ　　　ａ
ｌ、Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅ、　Ｇｅｎｅｎｔ。

２２、　　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　　Ｄ、　　Ｓ、　　ｅ
ｔ　　　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　　　２９３．　３０９　　（１９８１２
３、Ｃｈａｎｇ、Ｓ、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｍｏｌ、　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ。

２４、Ｍａｎｉｔｉｓ、Ｔ、　　　　ｅｔ　　　ａｔ。

“　Ｍａｌｅｃｕｌａｒ　　　Ｃｌｏｎｉｎｇ４４０　
　　Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇｂａｒ　　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　　（１９８２２５、Ｔａｂａｋ、Ｈ，Ｆ
、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ、　　Ａｃ１ｄｓ、　　Ｒｅｓ。

５．２３２１．　　（１９７Ｂ） ２６、Ｃｒｅａ　　　Ｒ，ｅｔ　　　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　　７５．５７６５　　（１９７８）２７、Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、　　　ｅｔ　　　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　　７６　　１０６　　　（１９７９）ａｒ

【図面の簡単な説明】

第１図は、異種蛋白質発現分泌ベクターｐＮＰＡ２２５
の構築法を示す図、第２図は、ＰＳＴＩ分泌プラスミド
ｐＮＰＰ１２６の構築法を示す図、第３図は、ＰＳＴＩ
のＮ末端から２６残蟇目までのアミノ酸をコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を示す図、第４図は、ＰＳＴ
Ｉの２７残基目から５６残基目までのアミノ酸をコード
するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を示す図である。 なお、第１図、第２図、第３図、第４図においてｐ　ｒ
　ｏｍｏ　ｔ　ｅ　ｒは、中性プロテアーゼ遺伝子のプ
ロモーター領域を、ＳＤは、中性プロテアーゼ遺伝子の
りポゾーム結合部位を、ｐｒｅは、中性プロテアーゼ遺
伝子の分泌シグナルをコードする領域を、Δｐｒｏは中
性プロテアーゼ遺伝子のプロペブタイド領域を、α−ａ
ｍｙ　Ｉ　ａ　ｓ　ｅはアルファーアミラーゼをコード
するＤＮＡ配列を、ＦｒａｇｍｅｎｔＡは、ＰＳＴＩの
Ｎ末端から２６残蟇目までのアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ断片を、ＦｒａｇｍｅｎｔＢは、Ｐ
ＳＴＩの２７残基目から５６残基目までのアミノ酸をコ
ートするＤ　Ｎ　Ａ配列を含むＤＮＡ断片を示す。ＰＳ
ＴＩは、ＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列を、Δｐｒｏ
ｔｅａｓｅは中性プロテアーゼの後半部分を示す。 また、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミンを示す。 第２し１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテア
   ーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位および
   分泌シグナルをコードする領域の直後に膵分泌性トリプ
   シンインヒビター（ＰＳＴＩ）をコードするＤＮＡ配列
   を結合させたＤＮＡ断片が、ベクターＤＮＡに結合して
   いることを特徴とする分泌プラスミド。 ２、ベクターＤＮＡに結合しているＤＮＡ断片が、次の
   配列を有するものである請求項１記載の分泌プラスミド 【遺伝子配列があります】 ３、ベクターＤＮＡが、バチルス属細菌で複製可能なプ
   ラスミドであることを特徴とする請求項１または２に記
   載の分泌プラスミド ４、バチルス属細菌で複製可能なプラスミドが、ｐＵＢ
   １１０である請求項３記載の分泌プラスミド。 ５、請求項１から４に記載した分泌プラスミドから任意
   に選択される一つの分泌プラスミドにより形質転換され
   た形質転換株。 ６、形質転換される微生物が、バチルス・ズプチリスで
   あることを特徴とする請求項５記載の形質転換株。 ７、請求項６に記載する形質転換株を培養し、その培養
   上清からＰＳＴＩを回収することを特徴とするＰＳＴＩ
   の製造法。