FI105348B - Menetelmä proteiinien käsittelemiseksi endoproteolyyttisesti sekä menetelmä proteiinien valmistamiseksi (mikro)biologisesti - Google Patents

Menetelmä proteiinien käsittelemiseksi endoproteolyyttisesti sekä menetelmä proteiinien valmistamiseksi (mikro)biologisesti Download PDF

Info

Publication number
FI105348B
FI105348B FI921847A FI921847A FI105348B FI 105348 B FI105348 B FI 105348B FI 921847 A FI921847 A FI 921847A FI 921847 A FI921847 A FI 921847A FI 105348 B FI105348 B FI 105348B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
furin
protein
enzyme
treatment
proteins
Prior art date
Application number
FI921847A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI921847A0 (fi
FI921847A (fi
Inventor
De Ven Willem Jan Marie Van
Den Ouweland Anna Maria Wi Van
Duijnhoven Johannes Lamber Van
Antonius Johannes Mar Roebroek
Piet Nico Maria Koning
Original Assignee
Univ Leuven Kath
De Ven Willem Jan Marie Van
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26646599&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI105348(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from NL8902651A external-priority patent/NL8902651A/nl
Application filed by Univ Leuven Kath, De Ven Willem Jan Marie Van filed Critical Univ Leuven Kath
Publication of FI921847A0 publication Critical patent/FI921847A0/fi
Publication of FI921847A publication Critical patent/FI921847A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI105348B publication Critical patent/FI105348B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6454—Dibasic site splicing serine proteases, e.g. kexin (3.4.21.61); furin (3.4.21.75) and other proprotein convertases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

, 105348
MENETELMÄ PROTEIINIEN KÄSITTELEMISEKSI ENDOPROTEOLYY-TISESTI SEKÄ MENETELMÄ PROTEIINIEN. VALMISTAMISEKSI (MIKRO)BIOLOGISESTI
Keksintö koskee menetelmää proteiinin valmis-5 tamiseksi (mikro)biologisesti ja menetelmää proteii nin, erityisesti prekursoriproteiinin katkaisemiseksi in vitro käsittelemällä proteiinia endoproteolyytti-sesti aktiivisella entsyymillä sekä nisäkässolua.
Esillä oleva keksintö perustuu lisätutkimuk-10 siin, jotka ovat kohdistuneet furiinin mahdolliseen fysiologiseen käyttökelpoisuuteen. Furiini on ihmisessä tavattava proteiini ja sitä on kuvattu patenttijulkaisussa EP 0 246 709 ja se on genomissa ennen ihmisen fes/fos proto-onkogeenia sijaitsevan fur geenin ilmen-15 tymistuote. Mainitun patenttihakemuksen sekä saman tutkimusryhmän muiden tutkimuksien (Roebroek et ai., Molec. Biol. Rep. 11., 1986, 117-125, Roebroek et ai., EMBO J. 5, 1986, 2197-2202, ja Schalken et ai., J.
Clin. Invest. .80/ 1987, 1545-1549) perusteella, tuol- 20 loin saatavissa olevan rajoittuneen DNA tiedon pohjalta, oli mahdotonta määrittää fur geenituotteen funktiota. Ainoastaan kyettiin päättelemään, että furiini on luultavasti membraani-assosioitunut proteiini, jon-' . ka funktiossa on mukana tiettyjä tunnistusrakenteita.
25 Tällöin havaittiin myös, että fur geeni ilmentyy 4.5 I I f V·’ kb mRNA:na maksassa, munuaisissa, pernassa, kateenkor- *:*** vassa ja aivoissa, kun taas ilmentyminen keuhkokudok- • · J/·; sessa on vähäistä; toisaalta ei-pienisolukeuhko- karsinoomissa havaittiin huomattavasti lisääntynyttä 30 ilmentymistä, joten tämän perusteella fur geenin ar-veltiin olevan käyttökelpoinen kasvainmarkkerina.
i·# ,···. Mainitun tutkimuksen puitteissa tänä aikana * · on määritetty täydellinen nukleotidisekvenssi n. 21 « * kbp genomisen DNA fragmentille, joka sisältää fur gee- t · * 35 nin (Van den Ouweland et ai., Nucl. Acids Res. 17 1989, 7101-7102), kuin myös vastaavan fur cDNA:n nuk- • · • · · 2 105348 leotidisekvenssi on myös määritetty (Van den Ouweland et al. , Nucl. Acids Res. 18, 1990, 664). Siten nyt on mahdollista karakterisoida täydellisesti fur geeni sekä genomisen organisaatiorakenteen tasolla että koo-5 daavien sekvenssien tasolla. Näistä koodaavista nuk-leotidisekvensseistä on mahdollista johtaa furiinin aminohapposekvenssi.
Tämän aminohapposekvenssin tietokoneanalyysi on yllättäen nyt paljastanut, että furiini muistuttaa 10 suuresti subtilisiinin kaltaisia proteaaseja, joita koodaa Kluvveromvces laetis-hiivassa KEX1 geeni ja Saccharomvces cerevisiae-hiivassa KEX2 geeni, ja että furiini on ilmeisesti näiden endoproteaasien korkeampi eukarioottinen muoto (joka on löydetty ihmisestä ja 15 eläimistä, kuten apinasta, kissasta, rotasta, hiirestä, kanasta ja drosophilasta) . Erityisesti on havaittu, että furiini omaa tietynasteista homologiaa tähän mennessä kuvattujen bakteriaalisten subtilisiinien (n.
20 entsyymiä), kuten The rmoac t i nomvee s vulgaris1 en 20 termitaasin ja Bacillus amvlolicruefaciens' n subtili-siini BPN':n, katalyyttisen domeenin kanssa, ja että furiini omaa yllättävän suurta homologiaa subtilisiinin kaltaisten proteaasien kanssa, kuten Kluvveromvces lactis-hiivan KEX1 geenin ilmentymistuotteen ja Sac-25 charomvces cerevisiae-hiivan KEX2 geenin ilmentymis- tuotteen kanssa. 794 aminohappoa sisältävän furiinin ·;··: aminohappojen 97 - 577 domeenilla on homologiaa kaik- * kiaan n. 80.0 % mainitun KEX1 geenin ilmentymistuot- • · teen aminohappojen 123-584 kanssa (so. 41.6 % identti- * · · 30 siä aminohappoja ja 38.3 % konservatiivisia korvautumisia ja homologiaa kaikkiaan n. 78.9 % mainitun KEX2 • · *·"' geenin ilmentymistuotteen aminohappojen 134 - 597 *···1 kanssa (so. 39.4 % identtisiä aminohappoja ja 39.5 % konservatiivisia korvautumisia) . Nämä hiivaproteaasien « · 35 aminohappoalueet sisältävät subtilisiinin kaltaiset
Ml katalyyttiset domeenit. Furiinin subtilisiinin kaltai- « · 1 « · · « · I · • ·
Ml 3 105348 nen domeeni sijaitsee aminoterminaalisessa furiini-fragmentissa käsittäen aminohapot 108 - 464.
Subtilisiinin kaltaisten proteaasien osalta viitataan seuraaviin julkaisuihin: Tanguy-Rougeau et 5 ai., FEBS Letters 234, 1988, 464-470; Mizuno et ai.,
Biochem. Biophys. Res Commun. 156, 1988, 246-254; Me- loun et ai., FEBS Letters. 183, 1985, 195-200; Marklan et ai., J. Biol. Chem. 242, 1967, 5198-5211; Mizuno et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 1989, 305- 10 311; Bathurst et ai., Science 235, 1987, 348-350; Tho
mas et ai., Science 241, 1988, 226-230; Foster et ai., Biochemistry 29, 1990, 347-354; Fuller et ai., PNAS
USA 86, 1989, 1434-1438; Julius et ai., Cell 37, 1984, 1075-1089; Bourbonnais et ai-, J. Biol. Chem. 263, 15 1988, 15342-15347; Cosman et ai., Dev. Biol. Stand. 69, 1988, 9-13; Schubert Wright et ai., Nature 221, 1969, 235-242; Cunningham et ai., Yeast 5, 1989, 25- 33; Davidson et ai., Nature 333, 1988, 93-96.
Kuten yllä olevista julkaisuista käy ilmi, 20 erityisesti Saccharomvces cerevisiae-hiivalai in KEX2 geenin ilmentymistuotetta on tutkittu paljon ja se on hyvin karakterisoitu. Se on membraani-assosioitunut, kalsiumioneista riippuvainen endopeptidaasi ollen ent-syymispesifinen emäksisille aminohappotähdepareille; 25 tämä entsyymi katkaisee substraattiproteiineja argi-niinia sisältävien emäksisten aminohappoparien karbok-·;··: syylikohdasta, ja tämä entsyymi määritellään tässä yhteydessä "restriktio"endopeptidaasiksi (analogisesti • * .·:*. restriktioendonukleaasien nimeämistavalle, jonka mu- • · · 30 kaan annettu nukleotidisekvenssi on määräävä DNA:n ... katkaisussa) . Entsyymi sijaitsee mahdollisesti Golgi- • · • *”·* kompleksin rakenteessa. Subtilisiinin kaltainen domee- '···* ni ja Ca2+-aktivaatiosekvenssit sijaitsevat proteiinin /·.· aminoterminaalipäässä. Saccharomvces cerevisiae- • « j"*. 35 hiivassa endopeptidaasi on mukana tappajatoksiinin ja • « · pariutuvan feromonialfatekijän (a pairing pheromone • « · ' alpha factor) prekursoreiden, so. pro-tappajatoksiinin * · • · · 4 105348 ja pro-alfatekijän, proteolyyttisessä käsittelyssä. Endopeptidaasin on edelleen havaittu kykenevän katkaisemaan oikein hiiren neuroendosiinipeptidin prekurso-rif prepro-opiomelanokortiini, saatettaessa tiettyihin 5 mutatoituihin nisäkässolulinjoihin, joiden proteolyyt-tistä käsittelyä on häiritty, ja kykenevän tuottamaan proalbumiinista valmista albumiinia sekä kykenevän käsittelemään plasma C proteiinin prekursoria.
Tunnettujen endopeptidaasien ja furiinin vä-10 Iillä löydettyjen samankaltaisuuksien perusteella esitetään, että furiini on restriktioendopeptidaasi, jota voidaan käyttää proteiinien käsittelyyn, erityisesti polypeptidihormonien, kasvutekijöiden, toksiinien, entsyymien tai muun tyyppisten biologisesti asiaankuu-15 luvien proteiinien prekursoriproteiinien käsittelyyn.
Tässä yhteydessä kysymykseen tulee toisaalta in vitro sovellutukset ja toisaalta in vivo sovellutukset terapeuttiset sovellutukset mukaan lukien. Ihmisen furiini voi soveltua tällaisiin sovellutuksiin paremmin kuin 20 edellä mainitut, tunnetut, ei-ihmisalkuperää olevat endopeptidaasit, tai yleisemmin, eläimen "furiini" voi soveltua paremmin kuin alemmista organismeista saatu endopeptidaasi. Edellinen pätee myös vielä eristämät-tömiin furiinin analogeihin tai sukulaisiin, joista 25 käytetään tässä yhteydessä nimitystä furiinin kaltai- V, set entsyymit ja jotka kuuluvat suurempaan restriktio- ·:*” endoproteolyytisten entsyymien perheeseen, joista fu- riini on ensimmäinen löydetty edustaja. Tämän perheen • · .·*.'· eri jäsenillä on suurta rakenteellista samankaltai-
• I I J
30 suutta, vaikkakin sekvenssihomologia voi olla aika .... alhainen, mahdollisesti alle 50 % homologia. Tämän i * perheen sisällä voidaan erottaa mahdollisesti useita · entsyymiluokkia, kuten furiinin kaltaisten entsyymien ryhmä, joka on mukana konstitutiivisesti eritettyjen 35 proteiinien käsittelyssä, ja furiinin kaltaisten ent- • · · syymien ryhmä, joka on mukana proteiinien käsittelys- • · · sä, joiden eritys on säädelty (eritys eritysjyväsen 0 · *«« s 105348 kautta). On mahdollista, että jokainen näistä furiinin kaltaisista entsyymeistä ilmentyy tunnusomaisesta rajoitetussa määrässä solutyyppejä, joissa entsyymi on aktiivinen käsittelevänä entsyyminä. Voidaan myös ta-5 vata rajoittunutta päällekkäisyyttä näiden entsyymien jakautumisessa soluihin ja kudoksiin, mikä voi hyvin johtua tunnetusta prekursoreiden solutyyppi- riippuvaisesta erilaistumiskäsittelyilmiöstä.
Aivolisäkeproteiinit PCI ja PC2, jotka on kulo vattu äskettäin julkaisussa, Seidah et ai., DNA and Cell Biol. 9, 1990, 415-424, ovat esimerkkejä tällaisista furiinin kaltaisista entsyymeistä.
Yhdistelmä DNA menetelmien avulla on mahdollista aikaansaada suuria määriä furiiniproteiinia. fur 15 geeni voidaan ilmentää prokaryooteissa fuusioprote- iinina betagalaktosidaasin (pUR vektorijärjestelmä) tai antranilaattisyntetaasin (pATH vektorijärjestelmä) kanssa. Eräänä mahdollisuutena on glutationi-S-transferaasi-furiini -fuusioproteiinin (pGEX) syntee-20 si. Tämän menetelmän etuna on, että furiini voidaan irrottaa trombiinin avulla. Furiini voidaan myös syntetisoida sellaisenaan prokaryooteissa sijoittamalla cDNA sopivalla tavalla asianmukaisen promoottorin perään. pUR ja pATH vektorijärjestelmät on kuvattu ai-25 kaisemmin mainituissa eurooppalaisessa patenttihake- v. muksessa. pGEX on kaupallisesti saatavissa. Käytettä- ·:*" essä voimakasta SV40 promoottoria fur cDNA:ta voidaan ilmentää sopivissa eukaryoott isissä soluissa. Yhdis- • tettynä proteiinin glykosylaatioon tämä menetelmä on 30 edullinen tiettyjä käyttösovellutuksia ajatellen.
...# Furiini voidaan puhdistaa biokemiallisin * * standardimenetelmin proteaasi-inhibiittoreiden läsnä- • · ollessa. Furiini on aktiivinen suhteellisen happamassa väliaineessa pH-arvossa 5.5, joka vallitsee eritysjy-35 väsessä, mutta proteiini säilyttää aktiivisuutensa a < myös pH-arvossa 7.5. Siten in vitro voidaan käyttää 0.2 M natriumasetaattipuskuria (pH 5.5) tai Tris-HCl • • · « · · fi 105348
O
puskuria (7.0). Furiinientsyymin aktiivisuus on riippuvainen Ca2+-ioneista. In · vitro entsyymiaktiivisuutta varten optimaaliseksi kalsiumpitoisuudeksi on havaittu 2-5 mM. Metallikelaattien 5 kuten EDTA:n läsnäolo inhiboi voimakkaasti furiiniak-tiivisuutta. Edelleen, raskasmetalli-ioneja, kuten
Zn2 + , Hg2+ ja Cu2 + , ei saisi olla läsnä. o- fenantroliini sitoo muita raskasmetalleja, paitsi Ca2+:a ja siten sillä ei ole huonontavaa vaikutusta 10 furiinin entsymaattiseen aktiivisuuteen. Fenyylimetyy- lisulfonyylifluoridin (PMSF) ja di-isopropyylifluori-fosfaatin (DFP) alhaisilla pitoisuuksilla aina 5 mM saakka ei ole inhiboivaa vaikutusta. PMSF:n suuremmat pitoisuudet inhiboivat entsyymifunktiota. Kahden tun-15 nin in vitro inkubointi 37°C:ssa riittää katkaistavan proteiinin käsittelemiseksi.
Furiinia voidaan käyttää erilaisten proteiinien käsittelemiseen endoproteolyyttisesti. Tämä mahdollistaa esim. in vitro valmistettujen prekursoripro-20 teiinien katkaisemisen spesifisesti biologisesti ak tiivisten koostumusten muodostamiseksi, joita voidaan käyttää annettavina aineina hoidettaessa sairauksia, joissa prekursorit eivät katkea tai katkeamista tapahtuu riittämättömässä määrin. Yleisesti, furiinia voi-25 daan pitää sopivana biologisesti asiaankuuluvien pro-teiinien käsittelyyn.
·;··: Furiiniproteiinia voidaan myös käyttää lääke- ·1·.· aineissa siten, että endoproteaasin puuttumisesta kär- • ·
Siviä potilaita hoidetaan antamalla furiinia, jolloin • · · 1 30 prekursoriproteiinien riittävä käsitteleminen jälleen ... mahdollistuu. Tämän seurauksena katkaistut tuotteet • · *··' voivat toteuttaa omat funktionsa ja mahdolliset häi- • · ’···’ ritsevän korkeat prekursoriproteiinitasot voivat alen- tua.
35 Furiini on mahdollisesti myös käyttökelpoinen
III
poistamaan substraattiproteiinisaostumia esim. veren- « « · « · « « « · • · • « · 7 105348 kiertojärjestelmässä, jolloin elinvoimaisten elimien tukkeumat voidaan poistaa antamalla furiinia.
Furiini on edelleen käyttökelpoinen erilaisten biologisesti aktiivisten aineiden (esim. muiden 5 entsyymien) kaupallisessa tuotannossa, mikäli niiden eräänä valmistusvaiheena voidaan käyttää käsittelyä.
Farmaseuttinen koostumus voi sisältää yhtä tai useampaa farmaseuttista kantajaa, laimennusainetta tai adjuvanttia sekä endoproteolyyttisesti aktiivisen 10 määrän furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä, tai furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin fragmenttia tai johdannaista, jolla on endoproteolyyttistä aktiivisuutta .
Proteolyyttinen aktiivisuus säilyy, kun 15 transmembraanidomeenin sisältävä karboksiterminaalinen alue on katkaistu pois. Kokonaisen furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin sijasta on mahdollista käyttää entsyymifragmenttia, joka vielä sisältää proteolyytti-sestä aktiivisuudesta vastuussa olevan osan. Eräs täl-20 lainen fragmentti on esim. furiinifragmentti, joka koostuu aminohapoista 108 - 464.
Furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin tai näiden endoproteolyyttisesti aktiivisen fragmentin aktiivisuutta voidaan edelleen manipuloida muodosta-... 25 maila mutaatioita, esim furiinin tai furiinin kaltai- v. sen entsyymin johdannaisia, joilla on vielä endopro- *;*” teolyyttistä aktiivisuutta.
Eräässä edullisessa farmaseuttisessa koostu- • · muksessa käytetty furiini tai furiinin kaltainen ent- 30 syymi tai endoproteolyyttistä aktiivisuutta omaava ...e furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin fragmentti • · tai johdannainen on saatu prokaryoottisistä tai euka- •
*···’ ryoott isistä soluista, jotka yhdistelmä DNA tai RNA
geenimuuntelua käyttäen on tehty kykeneviksi ilmentä-35 mään furiinia, furiinin kaltaista entsyymiä tai furii- • · · nin tai furiinin kaltaisen entsyymin fragmenttia tai • · · johdannaista joko fuusioproteiinin tai ei-fuusio- • ·
»M
8 105348 proteiinin muodossa, jolloin solujen tuottaessa furii-nia, furiinin kaltaista entsyymiä, furiinin tai fu-riinin kaltaisen entsyymin fragmenttia tai johdannaista fuusioproteiinina, tämä fuusioproteiini on käsitel-5 ty furiinin, furiinin kaltaisen entsyymin, furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin fragmentin tai johdannaisen katkaisemiseksi fuusioproteiinista.
Käytettävän furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin lähteenä voidaan toisena mahdollisuutena 10 kuitenkin käyttää soluja, jotka kykenevät luonnostaan tuottamaan furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä, esim. sopivaa syöpäsolulinjaa.
Farmaseuttinen koostumus voi edullisesti sisältää furiinia.
15 Farmaseuttinen koostumus voi edullisesti si sältää furiinin aminoterminaalisen fragmentin, johon kuuluu ainakin furiinin aminohapot 108 - 464.
Keksintö koskee menetelmää proteiinin katkaisemiseksi in vitro käsittelemällä proteiinia endopro-20 teolyyttisesti aktiivisella entsyymillä, jossa keksinnön mukaisessa menetelmässä proteiinia käsitellään Ca2+-ionien läsnäollessa endoproteolyyttisesti aktiivisena entsyyminä käytettävällä furiinilla tai furiinin kaltaisella entsyymillä tai endoproteolyyttisesti 25 aktiivisella furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin J fragmentilla, johdannaisella tai fuusioproteiinilla.
•:**i Käsittely suoritetaan tavallisesti fysiologi- ·*·.· sessa pH- ja lämpötila-arvossa, so. pH-arvossa 4-9 • · ja lämpötilassa n. 37°C.
30 Käsittely suoritetaan edullisesti pH-arvossa 5-7.5, edullisemmin 5.5 - 7.0.
• ·
Keksinnön mukaisesti on edullista suorittaa • · '·;·* käsittely lämpötilassa 20 - 50°C, edullisemmin 30 - 4 0°C.
• · 35 Edelleen keksinnön mukainen käsittely suori- • « · tetaan edullisesti kalsiumpitoisuudessa 1-10 mM, l 4 j edullisemmin 2-5 mM.
·♦« • · « · * * * 105348 9
Keksinnön erään edullisen sovellutuksen mukaisesti käsittely suoritetaan o-fenantroliinin tai vastaavan aineen läsnäollessa muiden raskasmetallien kuin kalsiumin sitomiseksi.
5 Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetel mässä käsiteltävää substraattia käsitellään sellaisenaan furiinilla sellaisenaan (tai furiinin kaltaisella v entsyymillä), so. furiinilla, joka on eristetyssä tai -.'V _ puhdistetussa muodossa, mutta, menetelmässä, käsittely 10 voidaan suorittaa myös solujen kanssa tai splujen sisällä, jotka ovat erityisesti geneettisesti muunneltuja nisäkässoluja, joissa furiinia ilmentyy. Nämä ovat edullisesti huolellisesti valikoituja, geneettisesti muunneltuja nisäkässoluja (kuten COS-1 soluja, CHO 15 soluja ja endoteliaalisoluja), jotka ilmentävät korkeita tasoja sekä fur geeniä että käsiteltävää substraattia koodaavaa geeniä. Kuten alan ammattilaiset hyvin tietävät, huomattavaa ilmentymisen lisääntymistä saavutetaan geeniamplifikaatiolla tai käyttämällä voi-20 makkaita promoottoreita. Keksintö koskee myös sovellutuksia, jotka liittyvät transgeenisiin eläimiin, ja siten sitä ei rajoiteta in vitro proteiinin tuotantoja katkaisumenetelmiin.
Keksintö tuo siten myös esiin nisäkässolut, 25 jotka sisältävät furiinia tai furiinin kaltaista ent- c .
‘.V syymiä koodaavasta yhdistelmä DNA:sta peräisin olevaa ·!**: DNA: ta ja jotka kykenevät ilmentämään furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä. Endoteliaalisolut ovat • · esim. erityisen edullisia nisäkässoluja terapeuttisten 30 geenien ja geenituotteiden kuljettamiseksi kehoon, #...t sillä ne jakautuvat kauttaalleen koko kehoa (verisuo- . · · !*'. nien, keuhkokudoksen ja vastaavien pinnassa) ja ovat • i ’·;· vuorovaikutuksessa erilaisten komponenttien kanssa «« *./·· kehon nesteiden kierrossa (verivirrassa ja vastaavis- 35 sa). Siten sellaisten potilaan endoteliaalisoluja, • * · .j. joilla on proproteiinien käsittelyssä esiintyvistä häiriöistä johtuva sairaus, voidaan muuntaa geneetti- « · • · • · t 10 105348 sesti kehosta eristyksen jälkeen ko. puutteen korjaamiseksi saattamalla niihin aktiivinen fur geeni, jonka jälkeen geneettisesti muunnellut solut voidaan istuttaa uudelleen potilaaseen. Tällainen geeniterapia ei 5 kuitenkaan rajoitu endoteliaalisoluihin.
Keksinnön mukainen eräs edullinen menetelmä-sovellutus käsittää proteiinin (mikro)biologisen valmistamisen, jolloin kasvatetaan geneettisesti muunneltuja soluja, jotka ilmentävät proteiinin pro-muotoa 10 sekä furiinia, ja mahdollisesti eristetään muodostunut proteiini. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää sekä prokaryoottisia että eukaryoottisia soluja, mutta korkeimpien eukaryoottien solut ovat edullisimpia. Esimerkiksi voidaan käyttää hiivasoluja ja vielä edulli-15 sempia kasvisoluja. Erityisen edullista on kuitenkin käyttää geneettisesti muunneltuja nisäkässoluja.
"Pro-muoto" tarkoittaa proteiinimuotoa, joka täytyy tai voidaan muuttaa halutuksi proteiiniksi käsittelyn avulla. Se voi olla proteiinin luonnon pro-20 muoto tai prepro-muoto tai myös synteettinen pro-muoto, joka on saatu yhdistelmä DNA rakenteesta, jossa haluttua proteiinia koodaavaa geeniä edeltää lisätty signaali tai ohjaava sekvenssi.
: Mitä tulee käsiteltäviin substraatteihin, «<>! 25 substraattina voidaan yleensä käyttää proteiinia, jot-
I I
V,' ka on varustettu emäksisillä aminohappotähdepareilla.
·**· Edelleen emäksisen aminohappotähteen esiintyminen vie- lä -4 paikassa katkaisukohtaan nähden (so. 4 paikkaa .*·*· ennen katkaisukohtaa) vaikuttaa tulokseen edullisesti.
9 30 Seuraavat esimerkit mainitaan mahdollisina substraat- .·*·, teinä, joita voidaan käsitellä furiinilla, rajoittu- • · II*. # matta kuitenkaan näihin: prekursorit, joita koodaa *·;*' kasvu- ja erilaistumistekijoiden transformoiva kasvu- ί/·| tekijä S (TGF-β) geeniperhe (kuten TGF-βΙ, TGF-B2, 35 TGF-fi3, TGF-S4, TGF-βδ, aktiviivi, inhibiini, Xenopus »«· laevis Vgl geeni tuote, Mullerianin inhiboiva aine • · · (MIS, Mullerian Inhibiting Substance] , drosophila ai- • · • ·
·· I
105348 11 kioiden ja luun morfogeneettisen proteiinin dekapenta-peptidigeenikompleksi, ks. Sporn ja Roberts, Anal.
N.Y. Acad. Sei. 593, 1990, 1-6), kasvutekijöiden pre-kursorit, kuten β-hermokasvutekijä (β-NGF) ja insulii-5 ni, hyytymätekijöiden prekursori, kuten von Willebran-din tekijä, proteiini C, tekijä IX ja tekijä X, hormonit ja neuropeptidit, kuten pro-opiomelanokortiini, proenkefaliini, prodynorfiini, provasopressiini, pro-oksitosiini, proCRF, (kortikotropiinia vapauttava telo kijä), proGRF (kasvuhormonia vapauttava tekijä), pro-
somatostatiini, proglukagoni, prokalsitoniini, proCGRP
(kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi), proVIP (vaso-aktiivinen suolistopeptidi), prokaeruliini ja proELH
(munintahormoni), interleukiinit, interferonit ja he-15 matopoieettiset tekijät.
Keksintöä voidaan soveltaa myös proteiineihin, jotka eivät itsessään tarvitse endoproteolyyttis-tä käsittelyä. Esimerkkeinä mainittakoon geeniraken- teet, joissa hyvää käsiteltävyyttä (glykosylointi) tai 20 helppoa puhdistusta (eritys) varten haluttua proteii nia koodaava sekvenssi on yhdistetty sopivaan signaa-lisekvenssiin edellä, esim. Elliot et ai., Gene 79, ,·, 1989, 167-180, erytropoiet iinin valmistamisen hii-
• 1 I
.f vasoluissa yhteydessä esitetyn mukaisesti. Ko. julkai- « 25 sussa on kuvattu geenirakenne prepro-alfatekijän ohja- · ' usalueesta (leader region), joka on sijoittunut eryt- * 1 ropoietiinisekvenssin eteen. Saadun synteettisen pre- ·.**: kursorin käsittely suoritetaan hiivasoluissa sen si- • · · V · sältämän KEX2 geenituotteen avulla.
30 Keksintöä selostetaan edelleen seuraavien ku- :***· vien avulla, joissa • « · .·1·. kuva 1 esittää puriinin aminohapposekvenssiä / > (yksikirjaimisena koodina), joka koostuu 794 aminoha- f · « ’· " posta; m n 1 35 kuva 2 esittää kaaviomaisesti furiinigeeniä, cDNA:ta ja proteiinia.
v « m « · · « 105348 12 a. fur geeniosan genominen organisaatio. Eksoni 1 (n. 120 bp) sijaitsee 7.2 kb ennen eksonia 2. Asteriski eksonin 2 yläpuolella osoittaa aloituskodonin paikan ja nuoli eksonin 16 yläpuolella osoittaa lope- 5 tuskodonin. Ei-koodaavat sekvenssit on esitetty mustilla laatikoilla. B=BamHI; E=EcoRI; K=KpnI; S=SalI; P-PstI; X=XbaI.
b. eksonien kaaviomainen jakautuminen fur:in cDNA:ssa 10 c. Eri proteiinidomeenien oletettu sijainti fu- riinissa. Suurin eksoni (eksoni 16) koodaa lähes koko Cys:iä runsaasti sisältävää domeenia, transmembraanis-ta domeenia ja sytoplasmista domeenia. Eksonit 2-12 koodaavat oletettuja prepro- ja katalyyttisiä domeene-15 ja omaten kodonit aktiivisen kohdan tähteille Asp46 (D), His87 (H) ja Ser261 (S) eksoneissa 5, 7 ja vast.
10. Tämä introni/eksoni -jakautuminen on kompleksisuudeltaan samaa astetta kuin on havaittu seriiniprote-aasien trypsiiniperheellä. Pystynuolet osoittavat 20 emäksisten tähteiden parit (Arg-Arg, Lys-Arg), jotka ovat potentiaalisia autokäsittelykohtia; emäksiset aminohappotähdeparit Arg310-Lys311 ja Arg341-Lys342 liittyvät luultavasti proteolyyttiseen katkaisuun.
, Valmiin proteiinin N-terminaalin oletetaan alkavan 25 aminohappotähteestä 108 heti potentiaalisten katkaisu- c C c kohtien tripletin (Ly s-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg) jälkeen, ** ’ sillä arginiinitähteen (Argl04) paikassa -4 ehdotet- • · tuun katkaisukohtaan nähden on havaittu lisäävän kat-; kaisutehoa.
30 Alueisiin, joissa furiinin, Kexl:n (Kluwero- mvces lactis) ja Kex2:n (Saccharomvces cerevisiae) * * * .···. aminohapposekvensseillä on samankaltaisuutta, kuuluu osat preprodomeenista, koko katalyyttinen domeeni (47 • 1 * *. ’! % identtisyys 322 tähteellä) ja koko keskidomeeni (26 • a « 35 - 31 % identtisyys 138 tähteellä) . Transmembraanisilla ja sytoplasmisilla domeeneilla ei ole merkittävää sa- * · « 9 9 9 9 9 « • 9 9 105348 13 mankaltaisuutta, sillä runsaasti Cys:iä sisältävä do-meeni ei esiinny kahdessa hiivaproteiinissa.
Kuvan 3 esityksessä on vertailtu (hfur) ihmisen furiinin, (kexl) Kexl proteaasin, (kex2) Kex2 pro-5 teaasin, (ther) termitaasin, (subC) subtilisiini Carlsbergin ja (subB) subtilisiini BPN':n aminohapposekvenssejä.
Oikealla puolella on numeroituna aminohappotähteet valmiiden entsyymien oletetusta N-10 terminaalista ja furiinin tapauksessa numerointi on esitetty myös yläpuolella. Furiinilla on luultavasti 107 tähteen preprosegmentti, joka päättyy sekvenssiin Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg ja jossa on kolme potentiaalista katkaisukohtaa autoaktivaatiota varten.
15 (V) identtiset tähteet ja (.) konservatiivi set korvautumiset kaikissa kuudessa sekvenssissä; (:) identtiset tähteet ainakin neljässä sekvenssissä. Emäksiset tähdeparit furiinissa, Kexl:ssä ja Kex2:ssa on merkitty pienaakkosilla. Sekvenssin kohdistus on 20 otettu seriiniproteaasien subtilisiiniperheen yli 20 jäsenen moninkertaisesta kohdistamisesta ja termitaasin, subtilisiini Carlsbergin ja subtilisiini BPN':n kolmiulotteisten rakenteiden päällekkäisyydestä, joka on määritetty röntgensädekristallografisesti. Tämä 25 kolmiulotteisten rakenteiden päällekkäisyys johtaa laajentuneeseen yhtenäiseen ytimeen, kuten on osoitet- ***** tu kiinteillä viivoilla topologisesti ekvivalenttien * · *."*: Ca atomien välimatkojen ollessa alle 1.5 Ä. Sekundaa- * * * *m’ · riset rakenteelliset elementit, jotka ovat yhteisiä 30 kaikille kolmelle proteiinille on merkitty seuraavas- ti: (a)a-heliksi, (β) β-laskos, (t) β-käännös ja (s) ··· taitos.
• · ··· y f Tähteet, joiden tiedetään osallistuvan sub- • « « * " straatin tai inhibiittorin sitomiseen termitaasissa,
• * V
35 subtilisiini Carlsbergissä ja subtilisiini BPN' :ssä pääketjun tai sivuketjun välisten vuorovaikutuksien ,···. kautta, on merkitty asteriskeilla. Aktiivisen kohdan • * f»· 14 105348 (D, H ja S) ja oksianionireiän (oxyanion hole) (N) oleelliset tähteet on alleviivattu. Silmukoita, jotka vastaavat vahvimpia Ca-ionin sitomiskohtia termitaa-sissa, on merkitty <==Ca==>.
5 Eksonien rajat, jotka koodaavat furiinin ole tettua katalyyttistä domeenia, sijaitsevat tähteiden 17, 60, 86, 115, 173, 244, 278, 311 ja 352 takana.
Kuvassa 4 on esitetty kaaviomainen malli furiinin katalyyttisestä domeenista. Malli perustuu sub-10 tilisiinin nauhavenytykseen (ribbon drawing). Aktiivinen kohta, joka koostuu tähteistä Asp46, His87 ja-Ser261, sijaitsee yläkeskikohdassa. C-terminaalinen jatke (katkoviivoitetu), joka sisältää lisää domeene-ja, alkaa katalyyttisen domeenin vastakkaiselta puo-15 lelta.
Kahdeksan lyhyen insertin (kiinteä musta) oletetut paikat jatke-N-terminaali mukaan lukien, sub-tilisiiniin nähden, näyttävät sijaitsevan pintasilmu-koissa ja konservoituneiden sekundaaristen rakenne-20 lementtien, α-heliksin ja β-laskoksen, välisissä liittymissä .
Kahden stabiloivan Ca-ionin, Cal ja Ca2, oletetut paikat, kuten termitaasissa, on merkitty varjostetuilla ympyröillä ulkosilmukoissa 98-105 ja vast.
25 68-77. Kaikki sivuketjukarboksyyliryhmät, joita tarvi taan näiden kahden kalsiumionin koordinoimiseen kuten #··· * ' termitaasissa, esiintyvät myös furiinissa topologises- • ti ekvivalenteissa tähteissä näissä silmukoissa; li- • · · V ·' säksi, Asp8 ja Asp55 esiintyvät Cal:n koordinoimiseksi 30 kuten termitaasissa ja subtilisiinissa, joissa topolo-gisesti ekvivalenteissa paikoissa Gin tai Asp ovat • · * .**·. ligandeja.
§· g Oletetut disulfidisillat Cysl04-Cys253 ja • · * *· '· Cysl96-Cys226 (tai Cysl98-Cys226) on osoitettu piste- • · · 35 viivoilla.
.*!*. Furiinimolekyylin substraatin sitomiskohdalla .···. (yläosa) olevat negatiivisesti varatut sivuketjuryhmät • « · · 105348 15 on osoitettu haarukkamaisilla varsilla ja ne vastaavat tähteitä 46, 47, 84, 121, 123, 126, 150, 151, 152, 192, 194, 199, 241, 248 ja 255. Suurin osa näistä varauksista ei esiinny ekvivalenteissa paikoissa subti-5 lisiinissa ja termitaasissa. Monet näistä negatiivisesti varatuista tähteistä voisivat olla suoraan vuorovaikutuksessa emäksisten substaraatin tähdeparien kanssa, sillä ne sijaitsevat luultavasti lysiinin ja/tai arginiinin P1 ja P2 sitovien taskujen sisässä 10 tai niiden läheisyydessä.
Malli, joka on kuvattu furiinin katalyyttiselle domeenille, soveltuu myös Kexl ja Kex2 prote-aaseille, sillä oleellisesti kaikki edellä kuvatut tärkeät elementit esiintyvät myös kaikissa kolmessa 15 proteiinissa.
Kuvassa 5 on esitetty kaaviomaisesti villi-tyyppisen von Willebrand tekijän (yläosa) prepro-vWF:n ja mutantti vWFgly763:n (alaosa) prepro-vWFgly763:n rakenteellinen organisaatio. Sisäiset homologiset do-20 meenit on osoitettu avoimilla laatikoilla; AI, A2 ja A3 tarkoittavat triplikoitua domeenia; B tarkoittaa homologisia domeeneja Bl, B2 ja B3; Cl ja C2 tarkoittavat duplikoituja domeeneja; Dl, D2, D3 ja D4 tarkoittavat neljää toistettua domeenia ja D' tarkoittaa '! 25 osoittain duplikoitua domeenia. Kiintoviiva tarkoittaa ‘r\ jäljelle jääviä aminohapposekvenssejä. Aminoterminaa- ’ ’ lipää sisältää 22 aminohappotähteen signaalipeptidin.
Katkaisukohta arginiinitähteen jäljessä paikassa 763, • · · V ’· joka koostuu emäksisestä aminohappotähdeparista, on 30 merkitty nuolella. Katkaisukohtaa ympäröivän DNA-alueen nukleotidisekvenssi on annettu ja johdettu ami- • · · .···. nohapposekvenssi on esitetty yksikirjaimisesti. Piste- ··· t* t mutaatio pro-vWFgly 763:ssa on merkitty asteriskilla.
« r '· Seuraavassa esitetään esimerkki keksinnön mu- f · 3 5 kaisesta menetelmästä, jossa menetelmässä käytetään furiinin endoproteolyyttistä aktiivisuutta substraat- .···. tina olevan von Willebrand tekijän (pro-vWF) prekurso- • » I·· 105348 rin käsittelyssä. Prepro-, pro- ja valmiin vWF:n rakenteen osalta viitataan julkaisuun, Verweij et ai., EMBO J. 5, 1986, 1839-1847, ja julkaisuun Verweij et
ai., J. Biol. Chem. 263, 1988, 7921-7924. Pro-vWF
5 koostuu propolypeptidistä (741 aminohappotähdettä) ja, C-terminaalissa, valmiista vWF:stä (2050 aminohappotähdettä) . Edellä esitettyjen julkaisujen mukaisesti valmis vWF muodostuu pro-vWF:stä käsittelemällä pro-teolyyttisesti emäksisestä aminohappoparista Lys762-10 Arg763 seuraavaa,· ja COS-1 solut ovat sopivia isäntiä konstitutiivisesti eritettävän vWF: syntetisoimiseksi täyspitkän prepro-vWF cDNA:n transfektion jälkeen. Furiinin aktiivisuutta endoproteolyyttisessä käsittelyssä kokeiltiin sekä pro-vWF:lle että mutantti pro-15 vWFgly763:lie, joka on kuvattu julkaisussa, Voorberg et ai., EMBO J. 9, 1990, 797-803. Tätä mutantti pro- vWFgly763:a koodava DNA sisältää guanosiinin adenosii-nin sijasta täyspitkän prepro-vWF cDNA:n paikassa 2407. Tämän mutaation seurauksena propolypeptidin kat-20 kaisukohta Lys762-Arg763 on korvautunut Lys762-Gly763:lla pro-vWF prekursoriproteiinimutantissa.
ESIMERKIT
COS-1 soluihin transfektoidun täyspitkän fur cDNA:n " 25 koodaamien translaatiotuotteiden identifiointi.
« c < m * ' fur geenituotteen, furiinin, edelleen krakte- • * risoimiseksi suoritettiin kokeita proteiinin synteti-
• M
V ' soimiseksi eukaryoottisoluissa SV40 myöhäisen promoot- 30 torin kontrollin alaisena ja sen funktion selvittämi- :***: seksi. Fur geenin translaatiotuotteiden identifioimi- ·«· .*·*. seksi valittiin immunologinen menetelmä. Käytettiin t· r kaniineissa tuotettua polyklonaalista antiseerumia, • * * ’· '· joka oli kohdistettu yhdistelmäfuriinihybridiprote- I « · 35 iinille, kuten on esitetty kohdassa "Materiaalit ja menetelmät". Proteiinien Western blot -analyysissä .···. bakteerien, jotka oli transformoitu pMJ109:n, pMJ119:n m · f · · 105348 17 tai pEWl:n DNA:lla, koko lysaateissa polyklonaalinen antiseerumi tunnisti P-gal-Afurinl:n, 336trpE-AS-Afurinl:n ja vast. GST-Afurin2:n. Kontrollikokeissa antiseerumi ei ragoinut antralinaattisyntetaasin tai 5 glutationi-S-traansferaasin trpE-koodaaman polypepti-diketjun kanssa. Tätä antiseerumia käyttäen suoritettiin Western blot -analyysi fur geeni-koodaamien proteiinien toteamiseksi COS-1 soluissa, jotka oli trans-fektoitu pSVLfur:lla. fur cDNA:n nukleotidisekvenssiin 10 perustuen voidaan odottaa primaarisen translaatiotuot-teen synteesiä lasketun molekyylipainon ollessa 87 kDa. Transfektoiduista COS-1 soluista todettiin kaksi proteiinia, joiden näennäiset molekyylipainot olivat n. 90 kDa ja vast. 100 kDa verrattuna ei-15 transfektoituihin COS-1 soluihin (tuloksia ei esitetty) .
Kahden furiinimuodon esiintyminen pSVLfur DNA:11a transfektoiduissa COS-1 soluissa viittaa siihen, että furiiniin kohdistuu post-translationaalinen 20 modifiointi. On mahdollista, että 100 kDa proteiini on n. 90 kDa primäärituotteen glykosyloitu muoto. On kuitenkin houkuttelevaa myös olettaa, että 100 kDa poly-peptidi voisi edustaa pro-muotoa, sillä 90 kDa poly-peptidi edustaa valmista furiinia, joka on muodostettu 25 tähteiden 107 ja 108 välisen peptidisidoksen proteo- < < ' , lyyttisellä (auto)käsittelyllä.
’ \ On syytä huomata, että ei-transfektoidut COS- • · · ’· *! 1 solut sisältävät myös pieniä määriä immunoreaktii- • · · : vista materiaalia näennäisten molekyylipainojen olles- 30 sa 90, 60 ja 40 kDa. Vaikka näitä proteiineja ei ole tunnistettu, voidaan olettaa, että 90 kDa proteiini ··· ^ :***: edustaa pientä määrää endogeenistä furiinia.
·· · ,* . Tulokset osoittavat, että transfektoidut fur • · · ; ” geneettiseet sekvenssit todellakin transkriptoituvat • · '···’ 35 ja translatoituvat, jolloin on mahdollista tutkia fur tuotteiden biologista funktiota.
« « « « i · * * « · · 105348 18
Furiinin proproteiinia käsittelevä aktiivisuus: 10 μ9 pSVLvWF DNA:11a suoritetuissa transfek-tiokokeissa 360 kDa pro-vWF prekursoriproteiinia ja 5 260kDa valmista vWF proteiinia havaittiin käytännöllisesti katsoen yhtä suurina osuuksina ilmastoidussa väliaineessa. Valmiin vWF:n muodostuminen soluissa, jotka on saatu transfektoimalla, johtuu endogeenisen furiinin käsittelystä, jota ilmentyy COS-1 soluissa, 10 kuten on osoitettu COS-1 soluista eristetyn mRNA:n
Northern blot -analyysillä ja immunosaostusanalyysillä käyttäen polyklonaalista kaniinin anti-furiinisee-rumia.
Vastaavissa, 10 μ9 pSVLvWFgly763 DNA:11a suo-15 ritetuissa COS-1 solujen transfektiokokeissa havaittiin, että pro-vWFgly763:a muodostui ja erittyi konstitutiivisesta kasvatusväliaineeseen 360 kDa proteiinina. Endoproteolyyttistä käsittelyä valmiiksi vWF:ksi (260 kDa) ei esiintynyt.
20 Samoihin tuloksiin päädyttiin suoritettaessa 5 μg pSVLvWFgly763 DNA:n ja 5 μg pSVLfur DNA:n ko-transfektio (transfektointi suoritetaan kummallakin DNA:11a). Ei havaittu minkäänlaista pro-vWFgly763:n t < käsittelyä valmiiksi vWF:ksi.
”, 25 Toisaalta kotransfektoitaessa COS-1 solut 5 v # μ9 pSVLvWF DNA:lla ja 5 μ9 pSVLfur DNA: 11a, havaittiin * * pro-vWF:n täydellinen käsittely valmiiksi vWF:ksi.
• ♦ • · · ♦ · · • ♦ • · · ϊ,ί Σ Materiaalit ja menetelmä: 30 :*"j Molekulaarinen kloonaus:
.···. pSVLfur sisältää 4.1 kb täyspitkän fur cDNA
fragmentin alkaen 117 nukleotidistä ennen ATG aloitus-·. " kodonia ja päättyen 21 nuklotidiin jälkeen pSVL:n 35 EcoRI kohtaan (Wells et ai., Nucl. Acids Res. 11.
1983, 7911-7925) kloonatusta poly-A additiokohdasta.
: · · · /···. pSVLfur:ssa fur cDNA sekvenssien ilmentyminen on SV40 • « M* 105348 19 myöhäisen promoottorin kontrolloima. pMJ109 koostuu 2.2 kb Smal/Smal ihmisen fur cDNA fragmentista, joka on molekulaarisesti kloonattu plasmidi pUR291:n Hindlll kohtaan; 2.2 kb fur cDNA sisältää furiinin karboksi- 5 terminaalialueen, joka on fuusioitu pMJ109:ssä faasiin β-galktosidaasia (β-gal) koodaavien sekvenssien kanssa käyttäen polylinkkerialuetta, joka on muodostettu juuri lacZ:n lopetuskodonin eteen. pMJ119 sisältää saman 2.2 kb fur cDNA fragmentin, mutta se on tässä kloonat-10 tu molekulaarisesti plasmidi pATHltn Smal kohtaan, joka tuottaa firiinisekvenssien faasifuusion ant-ranilaattisyntetaasin trpE-koodaaman osan (336trpE-AS) ensimmäiseen 336 aminohappotähteeseen. Lopuksi, pEWl:n tapauksessa, 3.5 kb Bglll/EcoRI fur cDNA fragmentti 15 kloonataan pGEX-3X:ään ja fuusioidaan faasiin gluta-tioni-S-transferaasiin (GST).
Bakteereissa, jotka on transformoitu pMJ109:llä, pMJ119:llä tai pEWl:llä, proteiinisynteesin asianmukaisen induktion jälkeen havaitaan suhteel-20 lisen runsaita määriä β^3ΐ-ΔίηΓΪη1 :a (MW 170 kDa) , 336trpE-AS-Afurinl: a (MW 90 kDa) ja vast. GST-Afurin2:a (MW 100 kDa).
Polyklonaalisten anti-furiini vasta-aineiden valmistus ", 25 ja immunotäplitys: pMJ109:llä transformoiduissa bakteereissa ' * syntetisoidun β-gal-Δfurinl-hybridiproteiinin vastai- • · siä polyklonaalisia anti-furiini vasta-aineita muodos- ·«· i.: : tettiin kaniineissa. Immunointeihin käytettiin osit- 30 tain puhdistettuja hybridiproteiinivalmisteita. SDS- ·***: PAGE :11a suoritetun bakteeriproteiinien koon mukaan ··· .·*·. tapahtuvan fraktioinnin jälkeen hybridiproteiinia si- t· c sältävä geelialue otettiin erilleen ja proteiinisisäl- • · r ’· tö poistettiin elektroforeettisesti. Western blot - • · · 35 kokeet suoritettiin transfektoiduille COS-1 solu- .'Γ. uutteille seuraavasti. 10 ^g pSVLfur DNArlla transfek- .···. toituja COS-1 soluja pidettiin 48 h transfektiosta « · • · · 105348 20 seerumittomassa väliaineessa. Tänä aikana soluja pestiin kahdesti 10 mM natriumfosfaatilla (pH 7.4), 0.14
M NaCl:lla ja sitten suoritettiin lyysi "immunosaos-tuspuskurissa (immunoprecipitation buffer, IPB)", joka 5 sisältsi 10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 150 mM NaCl, 5 mM
EDTA, 1 % (v/v) Nonidet P-40, 10 mM bentsamidiinia, 5 mM N-etyylimaleimidiä ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyy-lifluoridia (PMSF). Solu-uutosliuos ajettiin pelkistävissä olosuhteissa 8 % (w/v) SDS-polyakryyliamidi- 10 geelillä ja sitten proteiinit siirrettiin nitrosellu-loosalle (Schleicher and Schuell). Furiinin toteaminen suoritettiin inkuboimalla täplää edellä kuvatun kaniinin anti-furiiniseerumin kanssa.
15 DNA transfektio, solujen radioleimaus ja immunosaos-tusanalyysi:
Apinan munuais COS-1 soluja lisättiin Isco-ve'n modifioidussa niukassa väliaineessa, jota oli täydennetty vasikan sikiöseerumilla (10 % v/v) ja an-20 tibiooteilla [penisilliini (100 U/ml) ja streptomysiini (100 μ9/π\1)]. Kahdenkymmenen tunnin kuluttua siir-rostamisesta puoliksi yhteenkasvaneet solut transfek-toitiin 20 μ9 DNA:n 2 ml Iscove'n modifioiudulla niukalla väliaineliuoksella, jota oli täydennetty 200 25 μ9/τη1 DEAE-dekstraanilla. Käytettyyn transfektointime-netelmään kuului klorokiinishokki (Luthman ja Magnus- ***** son, Nucl. Acids Res. 11, 1983, 1295-1308). Transfek- • · ·.*·· tion jälkeen soluja pidettiin edellä kuvatussa väliai- ;*:*: neessa 48 h ajan. Ennen radioleimausta väliaine pois- 3 0 tettiin ja soluja inkuboitiin 1 h ajan RPMI väliai- .···. neessa, josta puuttui metioniini. Soluja leimattiin ···. tämän jälkeen 4 h ajan [35S]meetioniinin läsnäollessa • · (50 μCi/ml, spesifinen aktiivisuus > 800 Ci/mmol) ja i < sitten suoritettiin 14 h inkubointi leimaamattomalla « · « 35 metioniinilla (lopullinen pitoisuus 1 mM) . 5 min 13000 x g sentrifugoinnin jälkeen leimatut kasvatusväliai- • « · neet sovitettiin 1 x IPB. Esiselvitys suoritettiin • ·
I I I
105348 21 inkuboimalla väliaineita kahdesti gelatiini-Sepharoosin kanssa ja sitten etukäteen valmistettujen kaniinin esi-immuuniseerumin ja proteiini A-Sepharosen välisten kompleksien kanssa. Radioleimattujen vWF-5 liittyvien proteiinien immunosaostus suoritettiin etu-kääteen muodostettujen kaniinin anti-vWF:stä (Dako-patts, Glostrup, Tanska) saadun IgG valmisteen ja proteiini A-Sepharosen välisten kompleksien kanssa. Immu-nosaostumia pestiin perusteellisesti IPB:llä ja saos-10 tumat pelletöitiin käyttäen epäjatkuvaa 10 - 20 % (w/v) ruokosokerigradienttia, joka oli liuotettu IPB:hen, jota oli täydennetty 0.5 % desoksikolaatilla ja vast. 10 mM Tris-HCl:llä (pH 7.8). Immunosaostumat analysoitiin pelkistävissä olosuhteissa 5 % SDS poly-15 akryyliamidigeelillä.
• · • · • 1 · • · · • · ··· « m 9 • · 1 m • · · • · « · • · · ··· • 1 • · ··· • C <
< T
a 1 · a «.
«at a < • t m a a a a • a « • a a « « • · • a ·

Claims (10)

105348 22
1. Menetelmä proteiinin in vitro lohkaisemi-seksi, jolloin proteiinia käsitellään endoproteolyyt-tisesti aktiivisella entsyymillä, tunnettu siitä, 5 että proteiinia käsitellään Ca2+-ionien läsnäollessa mainitulla endoproteolyyttisesti aktiivisella entsyymillä, joka on furiini tai furiinin kaltainen entsyymi tai furiinin tai furiinin kaltaisen entsyymin endoproteolyyttisesti aktiivinen fragmentti, johdannainen tai 10 fuusioproteiini.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suoritetaan pH-arvossa 5 - 7.5, edullisesti 5.5 - 7.0.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mene-15 telmä, tunnet tu siitä, että käsittely suoritetaan kalsiumkonsentraatiossa 1-10 mM, edullisesti 2-5 mM.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suori- 20 tetaan o-fenatroliinin tai vastaavan aineen läsnäollessa muiden raskasmetalli-ionien kuin kalsiumin sitomiseksi. ,\t 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen t menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suori-T'.t 25 tetaan lämpötilassa 20 - 50 °C, edullisesti 30 - 40 °C. 4. f
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen * 1 menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suori- *. tetaan polypeptidihormonin, kasvutekijän, toksiinin, • · · V · entsyymin tai muunlaisen biologisesti vastaavan prote- 30 iinin prekursoriproteiinille.
7. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi (mik- • « · .***· ro)biologisesti, tunnettu siitä, että kasvatetaan ··· ,1 , geneettisesti muunneltuja soluja, jotka ilmentävät • 4 · proteiinin pro-muotoa sekä eläimestä peräisin olevaa 35 furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä, ja valin-naisesti eristetään muodostunut proteiini. • • · m 9 · • » • · · 105348 23
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään geneettisesti muunneltuja nisäkässoluja.
9. Nisäkässolu, tunnet tu siitä, että ni-5 säkässolu sisältää yhdistelmä DNA-johdettua DNA:ta, joka koodaa furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä, ja kykenee ilmentämään furiinia tai furiinin kaltaista entsyymiä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen nisäkässo-10 lu, tunnettu siitä, että nisäkässolu sisältää yhdistelmä DNA-johdettua DNA:ta, joka koodaa proteiinin prekursoria ja joka kykenee ilmentämään proteiinin prekursoria. • · • · »aa • «· • a p a • · » • · · • ·· * · • » ··· • · · • · 9 9 999 t f f I 4 < * M ' · • · · < · I · f · · 1 at »a« »aa a «a a i · a aa» 24 105348
FI921847A 1989-10-25 1992-04-24 Menetelmä proteiinien käsittelemiseksi endoproteolyyttisesti sekä menetelmä proteiinien valmistamiseksi (mikro)biologisesti FI105348B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8902651A NL8902651A (nl) 1989-10-25 1989-10-25 Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van eiwitten.
NL8902651 1989-10-25
NL9000917A NL9000917A (nl) 1989-10-25 1990-04-18 Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro) biologische bereiding van eiwitten.
NL9000917 1990-04-18
NL9000151 1990-10-12
PCT/NL1990/000151 WO1991006314A2 (en) 1989-10-25 1990-10-12 Pharmaceutical composition having an endoproteolytic activity; a process for endoproteolytically processing (precursor) proteins and for the (micro)biological production of proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI921847A0 FI921847A0 (fi) 1992-04-24
FI921847A FI921847A (fi) 1992-04-24
FI105348B true FI105348B (fi) 2000-07-31

Family

ID=26646599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI921847A FI105348B (fi) 1989-10-25 1992-04-24 Menetelmä proteiinien käsittelemiseksi endoproteolyyttisesti sekä menetelmä proteiinien valmistamiseksi (mikro)biologisesti

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5989856A (fi)
EP (3) EP0497828B2 (fi)
JP (2) JP3191111B2 (fi)
AT (1) ATE147437T1 (fi)
AU (1) AU6613290A (fi)
CA (1) CA2069929C (fi)
DE (1) DE69029663T3 (fi)
DK (1) DK0497828T4 (fi)
ES (1) ES2099714T5 (fi)
FI (1) FI105348B (fi)
GR (1) GR3023013T3 (fi)
NL (1) NL9000917A (fi)
WO (1) WO1991006314A2 (fi)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935815A (en) * 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
DK0574402T3 (da) * 1990-11-26 1998-05-18 Chiron Corp Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US6348327B1 (en) 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
DK52293D0 (fi) * 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
US6005077A (en) * 1995-11-10 1999-12-21 Immuno Aktiengesellschaft Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation
AT404838B (de) * 1995-11-24 1999-03-25 Immuno Ag Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen
US6596526B1 (en) 2000-06-09 2003-07-22 Baxter Aktiengesellschaft Furin polypeptides with improved characteristics
EP1756275A1 (en) * 2004-04-23 2007-02-28 Novozymes A/S Method for obtaining mature protease by enzymatic digestion
JP5485873B2 (ja) * 2007-05-22 2014-05-07 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ヒトフューリンのための予備的な精製方法
PT2574677T (pt) 2007-12-27 2017-10-19 Baxalta Inc Processos para cultura de células
CN110066782B (zh) 2007-12-31 2024-04-16 武田药品工业株式会社 基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶及其生产方法
US20130149295A1 (en) 2010-05-12 2013-06-13 Martine Cohen-Solal Furin and biologically active derivatives thereof for use in the prevention or treatment of an inflammatory disease
CN103889454B (zh) 2011-06-02 2017-04-05 百深有限责任公司 重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0246709A1 (en) * 1986-05-20 1987-11-25 Stichting Katholieke Universiteit Recombinant DNA and cDNA, mRNA, protein, antibodies, and a method of detecting tumor cells
CA1340740C (en) * 1987-12-08 1999-09-14 Eileen R. Mulvihill Co-expression in eukaryotic cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP3191111B2 (ja) 2001-07-23
DE69029663T3 (de) 2008-05-21
CA2069929A1 (en) 1991-04-26
EP0885956A1 (en) 1998-12-23
AU6613290A (en) 1991-05-31
FI921847A0 (fi) 1992-04-24
ES2099714T3 (es) 1997-06-01
JP3270760B2 (ja) 2002-04-02
DK0497828T3 (da) 1997-07-07
FI921847A (fi) 1992-04-24
EP0497828B2 (en) 2007-10-03
DK0497828T4 (da) 2008-02-04
EP0497828A1 (en) 1992-08-12
WO1991006314A2 (en) 1991-05-16
DE69029663T2 (de) 1997-09-04
GR3023013T3 (en) 1997-07-30
CA2069929C (en) 2002-08-27
US5989856A (en) 1999-11-23
EP0497828B1 (en) 1997-01-08
EP0693286A1 (en) 1996-01-24
JP2001238683A (ja) 2001-09-04
ES2099714T5 (es) 2008-04-01
WO1991006314A3 (en) 1991-09-05
NL9000917A (nl) 1991-05-16
JPH05504051A (ja) 1993-07-01
ATE147437T1 (de) 1997-01-15
DE69029663D1 (de) 1997-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2525438B2 (ja) ファクタ―８：ｃの製造方法
US5935815A (en) Process for micro biological production of proteins
KR920007666B1 (ko) 변형된 섬유소 용해제의 제조방법
FI105348B (fi) Menetelmä proteiinien käsittelemiseksi endoproteolyyttisesti sekä menetelmä proteiinien valmistamiseksi (mikro)biologisesti
JP2001504324A (ja) α―ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療
JP2002514887A (ja) トロンボポイエチンポリペプチドの分泌方法
US6348327B1 (en) Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
JPH0824579B2 (ja) ヒトウロキナーゼ
JPH01502080A (ja) 組み換えビタミンｋ依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
JPH07501703A (ja) プロホルモンコンバターゼで形質転換された細胞およびポリペプチド合成
RU2128705C1 (ru) Протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция
JP2872255B2 (ja) ファクター▲ｖｉｉｉ▼の高収量生産法
WO1989012685A1 (en) Improved protein c molecules and method for making and activating same
JPH0673456B2 (ja) ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
JPH10262668A (ja) 血管形成誘導因子をコードするタンパク質コード配列を包含するｄｎａ配列
JP3045307B2 (ja) 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法
Ribó et al. Production of Human Pancreatic Ribonuclease inSaccharomyces cerevisiaeandEscherichia coli
NO311895B1 (no) Anvendelse av furin eller furinlignende enzym for spalting av et protein, fremgangsmåte for mikrobiologisk fremstilling av etprotein og pattedyrcelle som omfatter DNA som koder for enzymet
EP0307478A1 (en) Serine protease and serine protease gene
KR20240000391A (ko) N-말단 및/또는 c-말단이 절단된 가용성 ph20 폴리펩티드 및 이의 용도
Mertvetsov Chemo-enzymatic synthesis of the human angiogenin gene. Construction of bacterial strains, producers of human angiogenin. Elaboration of a technology for the purification and preparation of angiogenin
BG60507B2 (bg) човешки тъканен плазминогенен активатор
JPH02104293A (ja) ウサギ上皮細胞成長因子
JPH0494686A (ja) トリプシン阻害活性を有するポリペプチドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN

GB Transfer or assigment of application

Owner name: KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN