DE69029663T2 - Verfahren zur endoproteolytischen bearbeitung von (vorläufer)proteinen und zur (mikro)biologischen herstellung - Google Patents

Verfahren zur endoproteolytischen bearbeitung von (vorläufer)proteinen und zur (mikro)biologischen herstellung

Info

Publication number
DE69029663T2
DE69029663T2 DE69029663T DE69029663T DE69029663T2 DE 69029663 T2 DE69029663 T2 DE 69029663T2 DE 69029663 T DE69029663 T DE 69029663T DE 69029663 T DE69029663 T DE 69029663T DE 69029663 T2 DE69029663 T2 DE 69029663T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
furin
protein
enzyme
cells
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69029663T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69029663D1 (de
DE69029663T3 (de
Inventor
Piet Nico Maria Nl-2343 Jb Oegstgeest Koning
Antonius Johannes Maria Nl-6121 Xc Born Roebroek
Willem Jan Marie B-3051 St. Joris-Weert Van De Ven
Anna Maria Wilhelmina Nl-6668 An Randwijk Van Den Ouweland
Johannes Lambertus Petrus Nl-5045 Cm Tilburg Van Duijnhoven
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Katholieke Universiteit Leuven
Original Assignee
VEN WILLEM JAN MARIE
Katholieke Universiteit Leuven
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26646599&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69029663(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from NL8902651A external-priority patent/NL8902651A/nl
Application filed by VEN WILLEM JAN MARIE, Katholieke Universiteit Leuven filed Critical VEN WILLEM JAN MARIE
Publication of DE69029663D1 publication Critical patent/DE69029663D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69029663T2 publication Critical patent/DE69029663T2/de
Publication of DE69029663T3 publication Critical patent/DE69029663T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6454—Dibasic site splicing serine proteases, e.g. kexin (3.4.21.61); furin (3.4.21.75) and other proprotein convertases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur (micro)biologischen Herstellung eines Proteins und für die in vitro-Spaltung eines Proteins, insbesondere eines Prekursorproteins durch Bearbeitung des Proteins mit einem endoproteolytisch aktiven Enzym.
  • Die hier beschriebene Erfindung stellt das Ergebnis einer weiteren Untersuchung bezüglich der möglichen physiologischen Signifikanz von Furin dar, bei dem es sich um ein Humanprotein handelt, das in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 246 709 beschrieben ist und bei dem es sich um das Expressionsprodukt des fur-Gens handelt, das in dem Genom stromaufwärts bzw. Oberhalb des humanen fes/fps Protooncogens zu finden ist. Aus der Patentanmeldung, auf die Bezug genommen ist, und aus anderen Veröffentlichungen derselben Forschergruppe (Roebroek et al., Molec.Biol.Rep. 11, 1986, 117-125; Roebroek et al., EMBO J. 5, 1986, 2197-2202; und Schalken et al., J. Clin.Invest. 80, 1987,1545-1549) ist ersichtlich, daß es auf Basis der damals verfügbaren begrenztene DNA-Daten unmöglich war, die Funktion des Produktes des fur-Gens festzustellen. Es konnte jedoch festgestellt werden, daß es sich bei dem Furin wahrscheinlich um ein membranassoziiertes Protein handelt, welches eine Funktion besitzt, bei der bestimmte Erkennungsstrukturen eine Rolle spielen. Es wurde damals ferner beobachtet, daß das fur-Gen als eine 4,5 kb mRNA in Leber, Niere, Milz, Thymus und Hirn exprimiert wird, wobei die Expression in Lungengewebe sehr gering ist. Andererseits wurde festgestellt, daß bei nicht-kleinzelligen Lungencarcinomen eine stark gesteigerte Expression stattfindet. Daraufhin wurde angenommen, daß das fur-Gen als Tumormarker nützlich sein könnte.
  • Innerhalb des Rahmens der oben genannten Forschung konnte zwischenzeitlich die vollständige Nucleotidsequenz eines genomischen DNA-Fragmentes von etwa 21 kbp bestimmt werden, das das fur-Gen enthält (Van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res 17, 1989, 7101- 7102). Ferner konnte die Nucleotidsequenz der entsprechenden fur cDNA ebenfalls bestimmt werden (Van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res. 18, 1990, 664). Auf dieser Basis ist es nun möglich, das fur-Gen vollständig zu charakterisieren sowohl bezüglich der genomischen Organisationsstruktur als auch der codierenden Sequenzen. Aus diesen codierenden Nucleotidsequenzen kann die Aminosäuresequenz des Furins ebenfalls abgeleitet werden.
  • Eine Computer-Analyse dieser Aminosäurensequenz hat nun überraschend ergeben, daß Furin den subtilisin-ähnlichen Proteasen, wie sie codiert sind in Hefe durch das KEX1-Gen von Kluyveromyces lactis und das KEX2-Gen von Saccharomyces cerevisiae sehr ähnlich ist. Ferner ergab sich, daß Furin in der Tat die höher-eukaryotische Form (gefunden beim Menschen und in Tieren, wie Affe, Katze, Ratte, Maus, Huhn und Drosophila) dieser Endoproteasen darstellt. Es wurde insbesondere gefunden, daß Furin über ein gewisses Ausmaß an Homologie mit der katalytischen Domäne von bisher beschriebenen bakteriellen Subtilisinen (etwa 20 Enzymen), wie Thermitase von Thermoactinomyces vulgaris und Subtilisin BPN' von Bacillus amyloliquefaciens, verfügt. Außerdem verfügt es über eine außerordentlich hohe Homologie mit Subtilisin-ähnlichen Proteasen, wie dem Expressionsprodukt des KEX1-Gens der Hefe Kluyveromyces lactis und dem Expressionsprodukt des KEX2-Gens der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Furin, das 794 Aminosäuren enthält, zeigt in der Domäne der Aminosäuren 97 bis 577 eine Gesamthomologie von etwa 80 % mit den Aminosäuren 123-584 des Expressionsproduktes des genannten KEX1- Gens (d.h. 41,6 % identische Aminosäuren und 38,3 % konservative Substitute) und eine Gesamthomologie von etwa 78,9 % mit den Aminosäuren 134-597 des Expressionsproduktes des genannten KEX2- Gens (d.h. 39,4 % identische Aminosäuren und 39,5 % konservative Substitute). Diese Aminsäure-Regionen der Hefeproteasen weisen die Subtilisin-ähnlichen katalytischen Domänen auf. Die Subtilisin-ähnliche Domäne von Furin befindet sich in einem aminoterminalen Furinfragment, welches die Aminosäuren 108-464 aufweist.
  • Bezüglich der Subtilisin-artigen Proteasen wird auf folgende Veröffentlichungen verwiesen: Tanguy-Rougeau et al., FEBS Letters 234, 1988, 464-470; Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 156, 1988, 246-254; Mebun et al., FEBS Letters 183, 1985, 195-200; Marklan et al., J.Biol.Chem 242, 1967, 5198-5211; Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 1989, 305-311; Bathurst et al., Science 235, 1987, 348-350; Thomas et al., Science 241, 1988, 226- 230, Foster et al., Biochemistry 29, 1990 347-354; Fuller et al., PNAS USA 86, 1989, 1434-1438; Julius et al., Cell 37, 1984, 1075-1089; Bourbonnais et al., J.Biol.chem. 263, 1988, 15342-15347; Cosman et al., Dev.Biol.Stand.69, 1988, 9-13; Schubert Wright et al., Nature 221, 1969, 235-242; Cunningham et al., Yeast 5, 1989, 25-33; Davidson et al., Nature 333, 1988, 93-96.
  • Die europäische Patentanmeldung EP 0 319 944 A2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von gewünschten Proteinen mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technik in einer eukaryotischen Wirtszelle, bei dem in diese eukaryotische Wirtszelle eine erste DNA-Sequenz, die für das gewünschte Protein codiert, eingeführt wird und bei dem in diese Wirtszelle mindestens eine weitere DNA-Sequenz eingeführt wird, die für ein Protein codiert, welches das gewünschte Protein stabilisiert oder prozessiert. Das Hefe KEX2-Gen wird als Beispiel für letztere Sequenz angeführt.
  • Wie aus den obigen Veröffentlichungen hervorgeht, ist insbesondere das Expressionsprodukt des KEX2-Gens der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae gut untersucht und charakterisiert worden. Es handelt sich dabei um eine membranassoziierte, calciumionenabhängige Endopeptidase mit einer Enzymspezifizität für gepaarte basische Aminosäurereste; Substratproteine werden an der Carboxylstelle der Paare von basischen, argininhaltigen Aminosäuren durch dieses Enzym gespalten, welches hier als eine "Restriktions-"Endopeptidase definiert wird (in Analogie zu der Nomenklatur bei Restriktions-Endonucleasen, bei denen eine gegebene Nucleotidsequenz für die Spaltung der DNA bestimmend ist). Das Enzym ist wahrscheinlich in einer Struktur des Golgi-Komplexes angeordnet. Die Subtilisin-ähnliche Domäne und die Ca²&spplus;-Aktivierungssequenzen befinden sich in dem aminoterminalen Teil des Proteins. In der Hefe Saccaromyces cerevisisae ist die Endopeptidase bei der proteolytischen Prozessierung der Precursoren von Killertoxin und beim Paaren des Pheromon-Alpha-Faktors, d.h. von Pro-Killertoxin und Pro-Alpha-Faktor, beteiligt. Es wurde zudem gefunden, daß die Endopeptidase in der Lage ist, den Maus- Neuroendocin-Peptid-Precursor Prepro-Opiomelanonocortin nach Einführen in bestimmte mutante Säugetierzelllinien mit gestörter proteolytischer Prozessierung korrekt zu spalten. Zudem ist es in der Lage, Proalbumin zum reifen Albumin zu prozessieren und den Precursor des Plasma-C-Proteins zu prozessieren.
  • Auf Grundlage der gefundenen Ähnlichkeiten zwischen den obigen bekannten Endopeptidasen und dem Furin wird postuliert, daß es sich beim Furin um eine Restriktions-Endopeptidase handelt, die zum Prozessieren von Proteinen, insbesondere zum Prozessieren von Precursor-Proteinen von Polypeptidhormonen, Wachstumsfaktoren, Toxinen, Enzymen und anderen Arten von biologisch relevanten Proteinen eingesetzt werden kann. In diesem Zusammenhang sind einerseits in vitro-Anwendungen und andererseits in vivo-Anwendungen einschließlich einer Anwendung innerhalb des Rahmens einer therapeutischen Behandlung denkbar. Für derartige Anwendungen kann das Humanfurin geeigneter sein als die obigen bekannten Endopeptidasen nicht-humanen Ursprungs. Im allgemeinen kann ein tierisches "Furin" geeigneter sein als eine Endopeptidase auf nierigeren Organismen. Das gleiche gilt für noch nicht isolierte Analoge oder Verwandte von Furin, die hier als furinähnliche Enzyme bezeichnet sind, die zu einer größeren Familie von restriktions-endoproteolytischen Enzymen gehören, von denen Furin der erste gefundene Repräsentant ist. Die verschiedenen Mitglieder dieser Familie werden eine hohe strukturelle Ähnlichkeit besitzen, obwohl die Sequenzhomologie ziemlich niedrig sein kann, möglicherweise niedriger als eine 50%-Homonologie. In dieser Familie wird es möglich sein, verschiedene Enzymklassen zu unterscheiden, beispielsweise eine Gruppe von furinähnlichen Enzymen, die beim Prozessieren von konstitutiv sekretierten Proteinen eine Rolle spielen, und eine Gruppe von furinähnlichen Enzymen, die beim Prozessieren von Proteinen eine Rolle spielen, deren Sekretion reguliert ist (Sekretion durch Sekretionsdrüse). Es ist auch möglich, daß jedes dieser furinähnlichen Enzyme charakteristisch in einer bestimmten Zahl von Zelltypen exprimiert wird, in denen dieses Enzym als Prozessierungsenzym aktiv ist. Ein gewisses Ausmaß an Überlappung zwischen der Zell- und Gewebeverteilung dieser Enzyme ist auch denkbar und könnte sehr wohl für das bekannte Phänomen der zelltypabhängigen differentiellen Prozessierung von Precursoren verantwortlich sein.
  • Die von Seidah et al., DNA and Cell Biol 9, 1990, 415-424, beschriebenen Hypophyseproteine PC1 und PC2 stellen Beispiele für derartige furinartige Enzyme dar.
  • Durch rekombinante DNA-Techniken ist es möglich, große Mengen des Proteins Furin zu erhalten. In Prokaryoten kann das fur-Gen als Fusionsprotein mit beta-Galactosidase (pUR Vectorsystem) oder der Anthranilat-Synthetase (pATH Vectorsystem) exprimiert werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Synthese des Fusionsproteins Glutathion- S-Transferase-Furins (pGEX) dar. Der Vorteil dieser Vorgehensweise besteht darin, daß das Furin mit Hilfe von Thrombin abgespalten werden kann. Das Furin kann auch als solches in Prokaryoten synthetisiert werden, indem die cDNA in korrekter Weise hinter einem geeigneten Promotor plaziert wird. Die pUR- und pATH-Vectorsysteme sind in der zuvor genannten europäischen Patentanmeldung beschrieben worden. pGEX ist im Handel erhältlich. Unter Verwendung des starken SV40- Promotors kann die fur-cDNA in geeigneten eukaryotischen Zellen exprimiert werden. In Verbindung mit der Glycosylierung des Proteins wird diese Vorgehensweise für bestimmte Zwecke bevorzugt.
  • Furin kann durch standardmäßige biochemische Techniken in Anwesenheit von Proteaseinhibitoren gereinigt werden. Furin ist in einem verhältnismäßig sauren Medium mit einem pH-Wert von 5,5 aktiv, wie er in einer Sekretionsdrüse auftritt. Das Protein behält seine Aktivität jedoch auch bei einem pH-Wert von 7,5 bei. Dadurch bedingt kann ein 0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 5,5) oder ein Tris-HCl-Puffer (7,0) in vitro Anwendung finden. Die Aktivität des Enzyms Furin hängt von der Anwesenheit von Ca²&spplus;-Ionen ab. Für die in vitro-Enzymaktivität hat sich eine Calciumkonzentration von 2-5 mM als optimal herausgestellt. Die Anwesenheit von Metallchelatoren, beispielsweise EDTA, inhibiert die Aktivität von Furin stark. Außerdem sollten keine Schwermetallionen, wie Zn²&spplus;, Hg²&spplus; und Cu²&spplus; anwesend sein. Die Substanz o-Phenanthrolin bindet Schwermetalle mit Ausnahme von Ca²&spplus; und hat somit keine gegenteilige Wirkung auf die enzymatische Aktivität von Furin. Niedrige Konzentrationen an Phenylmethylsulfphonylfluorid (PMSF) und Diisopropylfluorphosphat (DFP) bis zu 5 mM haben keine hemmende Wirkung. Bei höheren Konzentrationen von PMSF wird die Enzymfunktion inhibiert. Eine in vitro-Inkubation von zwei Stunden bei 37ºC ist für die Prozessierung des zu spaltenden Proteins ausreichend.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur endoproteolytischen Prozessierung eines Proteins durch Behandeln des Proteins mit einem endoproteolytisch aktiven Enzym, wobei das endoproteolytische aktive Enzym Furin oder ein furinähnliches Enzym oder ein endoproteolytisch aktives Fragment, Derivat oder Fusionsprotein von Furin oder einem furinähnlichen Enzym ist.
  • Furin kann für die endoproteolytische Prozessierung verschiedener Proteine eingesetzt werden. Dadurch ist es beispielsweise möglich, in vitro produzierte Precursorproteine spezifisch zu spalten, wobei biologisch aktive Zusammensetzungen gebildet werden, die als weitere Agenzien zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden können, bei denen die Precursoren nicht oder nur in unzureichendem Maße gespalten werden. Im allgemeinen kann man sagen, daß Furin für die Prozessierung von biologisch relevanten Proteinen geeignet ist.
  • Furin ist außerdem für die kommerzielle Herstellung von allen Arten von biologisch aktiven Substanzen (beispielsweise andere Enzyme) einsetzbar, sofern eine Prozessierung eine Produktionsstufe darin darstellt.
  • Die proteolytische Aktivität bleibt erhalten, wenn die carboxyterminale Region mit der Transmembrandomäne darin abgespalten worden ist. Erfindungsgemäß kann daher anstelle des gesamten Furins oder furinähnlichen Enzyms ein Fragment des Enzyms Anwendung finden, welches immer noch denjenigen Teil enthält, der für die proteolytische Aktivität verantwortlich ist. Ein geeignetes Fragment ist beispielsweise das Furinfragment, welches aus den Aminosäuren 108-464 besteht.
  • Die Aktivität des Furins oder furinähnlichen Enzyms oder eines endoproteolytisch aktiven Fragmentes davon kann zudem durch Einführung von Mutationen weiter verändert werden. Erfindungsgemäß sind demzufolge auch Derivate von Furin oder einem furinähnlichen Enzym umfaßt, welche immer noch über über eine endoproteolytische Aktivität verfügen.
  • Das erfindungsgemäß eingesetzte Furin oder das furinähnliche Enzym oder das Fragment oder Derivat von Furin oder dem furinähnlichen Enzym mit endoproteolytischer Aktivität wurde aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen erhalten, welchen durch genetisches Engineering mit Recombinant-DNA oder -RNA die Fähigkeit gegeben wurde, Furin, ein furinähnliches Enzym, ein Fragment oder Derivat von Furin oder einem furinähnlichen Enzym entweder in Form eines Fusionsproteines oder auch nicht zu exprimieren, während in dem Fall, in dem das Furin, das furinähnliche Enzym, das Fragment oder Derivat von Furin oder einem furinähnlichen Enzym durch die Zellen als Fusionsprotein hergestellt wird, das Fusionsprotein prozessiert wurde, um das Furin, das furinähnliche Enzym, das Fragment oder Derivat von Furin oder einem furinähnlichen Enzym aus dem Fusionsprotein abzuspalten.
  • Eine weitere Möglichkeit jedoch besteht darin, als Quelle für das Furin oder das furinähnliche Enzym Zellen einzusetzen, die von Natur aus in der Lage sind, das Furin oder furinähnliche Enzym zu produzieren, beispielsweise eine geeignete Turmorzelllinie.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die in vitro-Spaltung eines Proteins durch Behandeln des Proteins mit einem endoproteolytisch aktiven Enzym, bei dem das Protein erfindungsgemäß in Anwesenheit von Ca²&spplus;-Ionen mit Furin oder einem furinähnlichen Enzym oder einem endoproteolytisch aktiven Fragment, Derivat oder Fusionsprotein von Furin oder einem furinähnlichen Enzym als dem endoproteolytisch aktiven Enzym behandelt wird.
  • Die Behandlung wird üblicherweise bei physiologischen pH- und Temperaturwerten durchgeführt, d.h. einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 und einer Temperatur von etwa 37ºC.
  • Die Behandlung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5 bis 7,5 und insbesondere bei 5,5 bis 7,0 durchgeführt.
  • Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, die Behandlung bei einer Temperatur von 20 bis 50ºC und insbesondere bevorzugt bei 30 bis 40ºC durchzuführen.
  • Die Behandlung wird vorzugsweise bei einer Calciumkonzentration von 1-10 mM und insbesondere bevorzugt bei 2-5 mM durchgeführt.
  • Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Behandlung in Anwesenheit von o-Phenanthrolin oder einem äquivalenten Agens zum Binden von Schwermetallen mit Ausnahme von Calcium durchgeführt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt eine Behandlung eines Substrates, das als solches prozessiert wird mit Furin als solchem (oder mit einem furinähnlichen Enzym), d.h. Furin in einer isolierten oder gereinigten Form, und umfaßt jedoch auch eine Behandlung mit oder innerhalb von Zellen, insbesondere genetisch veränderten Säugetierzellen, in denen Furin exprimiert wird. Vorzugsweise handelt es sich dabei um sorgfältig selektierte, genetisch veränderte Säugetierzellen (beispielsweise COS-1-Zellen, CHO-Zellen und endotheliale Zellen) mit einem starken Vermögen, sowohl das fur-Gen und auch ein Gen, welches für das so prozessierende Substrat codiert, zu exprimieren. Wie einem Fachmann gut bekannt ist, kann eine stark verstärkte Expression durch Genamplifikation oder durch Verwendung starker Promotoren erreicht werden. Die Erfindung betrifft auch solche Anwendungen, bei denen transgene Tiere eine Rolle spielen und ist somit nicht beschränkt auf in vitro-Verfahren zur Proteinproduktion und Proteinspaltung.
  • Eine bevorzgte erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in einem Verfahren zur (micro)biologischen Produktion eines Proteins durch Kultivieren genetisch veränderter Zellen, die eine Pro-Form des Proteins sowie Furin exprimieren, und gegebenenfalls der Isolierung des gebildeten Protein. Für diesen Zweck können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen eingesetzt werden, wobei jedoch Zellen mit höheren Eukaryoten bevorzugt sind. So können beispielsweise Hefezellen und noch besser Pflanzenzellen eingesetzt werden. Es ist jedoch im allgemeinen bevorzugt, genetisch veränderte bzw. genetisch engineerte Säugetierzellen zur Anwendung zu bringen.
  • Der Ausdruck "Pro-Form" bezeichnet eine Form des Proteins, welches in das gewünschte Protein durch Prozessierung überführt werden sollte oder könnte. Es kann sich dabei um eine natürliche Pro-Form oder Prepro-Form des Proteins und jedoch auch um eine synthetische Pro- Form handeln, welches das Ergebnis eines Rekombinant-DNA- Konstruktes darstellt, bei dem dem Gen, welches für das gewünschte Protein codiert, ein hinzugefügtes Signal oder eine Führungssequenz vorangeht.
  • Was die Substrate anbelangt, die prozessiert werden, kann man allgemein sagen, daß es sich dabei um Proteine mit gepaarten basischen Aminosäureresten handelt, die als ein Substrat dienen können. Die zusätzliche Anwesenheit eines basischen Aminosäurerestes in der -4-Position bezüglich der Spaltungsstelle (d.h. 4 Positionen vor der Spaltungsstelle) wird zu einer höheren Effizienz führen. Nachstehend sind Beispiele für mögliche Substrate zum Prozessieren durch Furin ohne Anspruch auf Vollständigkeit wiedergegeben: Precursoren codiert durch die transforming growth factor β (TGF-β) Genfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (beispielsweise TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, Activiv, Inhibin, Xenopus laevis Vg1 Genprodukt, Mullerian Inhibiting Substance [MIS), Decapentapeptid-Gen-Komplex von Drosophila embryos und bone morphogenetic Protein, man vergleiche Sporn und Roberts, Anal. N.Y. Acad. Sci. 593, 1990, 1-6), Precursoren von Wachstumsfaktoren, wie β- Nerve Growth Factor (β-NGF) und Insulin, Precursoren von clotting- Faktoren, beispielsweise vom Willebrand-Faktor, Protein C, Faktor IX und Faktor X, Hormone und Neuropeptide, beispielsweise Proopiomelanocortin, Proenkephalin, Prodynorphin, Provasopressin, Prooxytocin, ProCRF (Corticotropin-freisetzender Faktor), ProGRF (Wachstumshormon-freisetzender Faktor), Prosomatostatin, Proglucagon, Procalcitonin, ProCGRP (Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid), ProVIP (vasoaktives intestinales Peptid), Procaerulin und ProELH (egg laying hormone), Interleukine, Interferone und hämopoetische Faktoren.
  • Die Erfindung kann auch auf Proteine angewandt werden, welche als solche keine endoproteolytische Prozessierung erfordern. Als Beispiele kann man Genkonstrukte nennen, bei denen aus Gründen einer guten Prozessierung (Glycosilierung) oder leichten Reinigung (Sekretion) eine Sequenz, die für das gewünschte Protein codiert, an eine geeignete Signalsequenz gekoppelt wird, wie dies beispielsweise früher für die Herstellung von Erythropoietin in Hefezellen von Elliott et al., Gene 79, 1989, 167-180 vorgeschlagen wurde. In dieser Veröffentlichung wird ein Genkonstrukt aus der Führungsregion des Prepro-alpha-Faktors beschrieben, der vor der Erythropietin-Sequenz angeordnet ist. Die Prozessierung des resultierenden synthetischen Precursors wird in Hefezellen durch das darin vorhandene KEX2-Genprodukt durchgeführt.
  • Die Erfindung wird anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
  • Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz (im Einbuchstabencode) des Purins bestehend aus 794 Aminosäuren;
  • Fig. 2 zeigt diagrammartig das Furingen, cDNA und Protein;
  • a. Genomische Organisation eins Teiles des fur-Gens. Exon 1 (etwa 120 bp) ist bei 7,2 kb oberhalb des Exon 2 angeordnet. Das Sternchen oberhalb Exon 2 zeigt die Position des Initiierungscodons an, während der Pfeilkopf oberhalb Exon 16 den Stopcodon anzeigt. Nichtcodierende Sequenzen sind durch schwarze Kästen wiedergegeben. B=Bam-HI; E=Eco-RI; K=Kpnl S=Sall; P=Pstl; X=Xbal.
  • b. Schematische Verteilung der Exone in der cDNA von fur.
  • c. Die mutmaßliche Lokalisierung der verschiedenen Proteindomänen in Furin. Das größe Exon (Exon 16) codiert fast die gesamte cys-reiche Domäne, die transmembrane Domäne und die cytoplasmische Domäne. Die Exone 2-12 codieren die mutmaßlichen Prepro- und katalytischen Domänen mit Codonen für die aktiven Seitenreste Asp46 (D), His87(H) und Ser261 (S) in Exonen 5, 7 bzw. 10. Die Intron/Exon-Verteilung besitzt das gleiche Ausmaß an Komplexität wie dies bei der Trypsin-Familie von Serin-Proteasen beobachtet wurde. Vertikale Pfeile deuten Paare von basischen Resten (Arg- Arg, Lys-Arg) an, welche mögliche Autoprozessierungsstellen darstellen; die Paare von basischen Aminosäureresten Arg310-Lys311 und Arg341-Lys342 sind möglicherweise bei der proteolytischen Spaltung beteiligt. Es wird angenommen, daß der N- Terminus des reifen Proteins beim Aminosäurerest 108 direkt hinter dem Triplet der möglichen Spaltungsstellen (Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg) beginnt, da sich herausgestellt hat, daß ein Argininrest (Arg104) an der -4-Position bezüglich der vorgeschlagenen Spaltungsstelle die Spaltungswirksamkeit erhöht.
  • Die Regionen, in denen die Aminosäuresequenzen von Furin, Kex1 (Kluyveromyces lactis) und Kex2 (Saccharomyces cerevisiae) Ähnlichkeit zeigen, beinhalten Teile der Preprodomäne, die gesamte katalytische Domäne (47 % Identität in 322 Resten) und die gesamte mittlere Domäne (26-31 % Identität in 138 Resten). Es besteht keine signifikante Ähnlichkeit in der Transmembrandomäne und der cytoplasmischen Domäne, während die Cys-reiche Domäne in diesen beiden Hefeproteinen nicht vorhanden ist.
  • Fig. 3 enthält einen Vergleich der Aminosäurensequenzen von (hfur) Humanfurin, (kexl) Kex1-Protease, (kex2) Kex2- Protease, (ther) Thermitase, (subC) Subtilisin-Carlsberg und (subB) Subtilisin-BPN'.
  • Auf der rechten Seite ist die Numerierung der Aminosäurenreste aus dem mutmaßlichen N-Terminus der reifen Enzyme angegeben; für Furin ist dies auch oben angegeben. Furin hat wahrscheinlich ein Preprosegment von 107 Resten, die mit der Sequenz Lys- Arg-Arg-Thr-Lys-Arg enden, welches drei mögliche Spaltungsstellen für die Autoaktivierung besitzt.
  • ( ) identische Reste und (.) konservative Substitutionen an allen sechs Sequenzen; (:) identische Reste in mindestens vier Sequenzen. Paare von basischen Resten in Furin, Kex1 und Kex2 sind in den unteren case- Buchstaben angedeutet. Die Sequenzausrichtung stammt von einer multiplen Ausrichtung von mehr als 20 Mitgliedern der Subtilisin-Familie von Serinproteasen und einer Übereinanderlegung der dreidimensionalen Strukturen von Thermitase, Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN', bestimmt durch Röntgenstrahl- Kristallographie. Die Übereinanderlegung der dreidimensionalen Strukturen führt zu einem ausgedehnten Consensus-Kern, gezeigt durch schwarze Balken, mit Abständen zwischen topologisch äquivalenten Cα Atomen von weniger als 1,5 Å. Sekundäre Strukturelemente, die allen drei Proteinen gemeinsam sind, sind angegeben als (α)α-helix, (β)β-sheet, (t)β-turn und (s) bend.
  • Reste, von denen bekannt ist, daß sie bei der Substratoder Inhibitorbindung in Thermitase, Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN' durch Hauptketten- oder Nebenketten-Interaktionen eine Rolle spielen, sind mit einem Stern gekennzeichnet. Essentielle Reste der aktiven Stellen (D, H und S) und des Oxyanionloches (N) sind unterstrichen. Die den stärksten Calcium- Ionenbindungsstellen entsprechenden Loop/Sschleifen in Thermitase sind durch Ca angedeutet.
  • Grenzen der Exone, die Sequenzen der mutmaßlichen katalytischen Domäne von Furin codieren, sind hinter den Resten 17, 60, 86, 115, 173, 244, 278, 311 und 352 angeordnet.
  • Fig. 4 zeigt ein schematisches Modell der katalytischen Domäne von Furin. Das Modell basiert auf einer Bandstreifenzeichnung von Subtilisin. Die aktive Stelle, bestehend aus den Resten Asp46, His87 und Ser261, befindet sich am oberen Zentrum. Die C-terminale Extension (gestrichelt), die zusätzliche Domänen enthält, beginnt an der gegenüberliegenden Seite der katalytischen Domäne.
  • Es ist zu sehen, daß sich die vorhergesagten Positionen von 8 kurzen Inserts (schwarz fett gezeichnet), einschließlich ein ausgedehnter N-Terminus, bezüglich Subtilisin in Oberflächenschleifen und in Verbindungen zwischen konservierten α-helix- und β-Lagen sekundären Strukturelementen befindet.
  • Die vorhergesagten Positionen für zwei stabilisierende Calciumionen, Ca1 und Ca2 wie in Thermitase, sind durch schraffierte Kugeln in den externen Schleifen 98- 105 und 68-77 angedeutet. Alle der Seitenketten- Carboxylgruppen, die für die Koordinierung dieser beiden Calciumionen wie in Thermitase erforderlich sind, sind ebenfalls in Furin in topologisch äquivalenten Resten in diesen Schleifen vorhanden; zusätzlich sind Asp8 und Asp55 vorhanden, um Ca1 wie in Thermitase und Subtilisin zu koordinieren, wobei in topologisch äquivalenten Positionen entweder Gln oder Asp die Liganden darstellen.
  • Die vorhergesagten Disulfidbrücken Cys104-Cys253 und Cys196-Cys226 (oder Cys198-Cys226) sind mit gepunkteten Linien dargestellt.
  • Negativ geladene Seitenkettengruppen auf der Substratbindungsstelle (oben) des Furinmoleküls sind mit gabelartigen Stielen dargestellt und entsprechen den Resten 46, 47, 84, 121, 123, 126, 150, 151, 152, 192, 194, 199, 241, 248 und 255. Die meisten dieser Ladungen sind an den äquivalenten Positionen in Subtilisinen und Thermitase nicht vorhanden. Viele dieser negativ geladenen Reste könnten direkt mit gepaarten basischen Resten in dem Substrat interagieren, da sie wahrscheinlich in oder in der Nähe der P1- und P2- Bindungstaschen für Lysin und/oder Arginin angeordnet sind.
  • Das für die katalytische Domäne von Furin beschriebene Modell ist auch anwendbar auf die Kex1- und Kex2- Proteasen, da im wesentlichen alle der wichtigen oben beschriebenen Elemente in allen drei Proteinen vorhanden sind.
  • Fig. 5 zeigt diagrammartig die strukturelle Organisation von prepro-vWF vom Wildtyp vom Willebrand-Faktor (oberer Teil) und von prepro-vWFgly763 des Mutanten vWFgly763 (unterer Teil). Interne homologe Domänen sind durch offene Kästchen angedeutet. A1, A2 und A3 stellen eine triplizierte Domäne dar; B stellt die homologen Domänen B1, B2 und B3 dar; C1 und C2 repräsentieren eine duplizierte Domäne; D1, D2, D3 und D4 repräsentieren vier wiederholte Domänen und D' repräsentiert eine teilweise duplizierte Domäne. Die durchgezogene Linie zeigt die verbleibenden Aminosäurensequenzen an. Der aminoterminale Teil enthält ein Signalpeptid mit 22 Aminosäureresten. Die Spaltungsstelle nach dem Arginin-Rest in der Position 763, welche aus einem Paar von basischen Aminosäureresten besteht, ist mit einem Pfeil markiert. Die Nucleotid-Sequenz der DNA-Region um die Spaltungsstelle ist angegeben, und die deduzierte Aminosäuresequenz ist mit der Einbuchstaben-Notierung dargestellt. Die Punktmutation in pro-vWFgly763 ist mit einem Stern markiert.
  • Nachstehend wird ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Verfahren näher erläutert, bei dem die endoproteolytische Aktivität von Furin bei der Prozessierung des Precursors des von Willebrand-Faktors (pro-vWF) als Substrat eingesetzt wird. Bezüglich der Struktur von prepro, pro und reifem vWF wird verwiesen auf Verweij et al., EMBO J. 5, 1986, 1839- 1847 und Verweij et al., J.Biol.Chem. 263, 1988, 7921-7924. Pro-vWF besteht aus einem Pro-Polypeptid (741 Aminsäurereste) und, an dem C- Terminus, reifem vWF (2050 Aminosäurereste). Wie in den obigen Veröffentlichungen dargelegt, wird reifes vWF aus pro-vWF durch proteolytische Prozessierung in der Nähe der gepaarten basischen Aminosäuren Lys762-Arg763 gebildet. COS-1-Zellen stellen einen geeigneten Wirt für die Synthese von konstitutiv sekretiertem vWF nach Transfektion von prepro-vWF cDNA voller Länge dar. Die Aktivität von Furin beim endoproteolytischen Prozessieren wurde sowohl für pro-vWF und den Mutanten pro-vWFgly763 getestet, beschrieben von Voorberg et al., EMBO J. 9, 1990, 797-803. Die DNA-Codierung für diesen Mutanten pro-vWFgly763 enthält ein Guanisin anstelle eines Adenosins in der 2407-Position der prepro-vWF cDNA voller Länge. Als Ergebnis dieser Mutation wird die Spaltungsstelle Lys762-Arg763 des Propolypeptids durch Lys762-Gly763 in dem pro-vWF Precursorproteinmutanten ersetzt.
    • BEISPIELE Identifizierung der Translationsprodukte codiert durch fur cDNA voller Länge transfektiert in COS-1 -Zellen
  • Zur weiteren Charakterisierung des fur-Genproduktes Furin wurden Experimente durchgeführt, um dieses Protein in eukaryotischen Zellen unter der Kontrolle des SV40 späten Promotors zu synthetisieren. Dieses Material wurde zur Verdeutlichung seiner Funktion eingesetzt. Um die Transiationsprodukte des fur-Gens zu identifizieren, wurde ein immunologischer Ansatz gewählt. Ein in Kaninchen herangezogenes polyclonales Antiserum für ein recombinantes Furinhybridprotein, beschrieben in "Materialien und Verfahren", wurde eingesetzt. In einer Western-Blot-Analyse von Proteinen in Gesamtlysaten von Bakterien transformiert mit pMJ109, pMJ119 oder pEW1 DNA erkannte das polyconale Antiserum β-gal-Δfurin1, 336trpE-AS-Δfurin1 bzw. GST- Δfurin2. In Vergleichsexperimenten reagierte das Antiserum nicht mit der trpE-codierten Polylpeptidkette von Anthralinat-Synthetase oder Glutathion-S-Transferase. Unter Verwendung dieses Antiserums wurde eine Western-Blot-Analyse durchgführt, um für das fur-Gen codierende Proteine in COS-1-Zellen transfektiert mit pSVLfur zu detektieren. Auf Basis der Nucleotidsequenzdaten für fur cDNA kann die Synthese eines primären Transiationsproduktes mit einem berechneten Molekulargewicht von 87 kDa erwartet werden. Zwei Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von etwa 90 kDa bzw. 100 kDa wurden in transfektierten COS-1-Zellen im Vergleich zu nicht-transfektierten COS-1-Zellen (Ergebnisse nicht gezeigt) detektiert.
  • Die Anwesenheit von zwei Formen von Furin in COS-1-Zellen transfektiert mit pSVLfur DNA deutet darauf hin, daß Furin eine posttranslationale Modifikation erfahren kann. Es ist möglich, daß das 100 kDa-Protein eine glykosylierte Form des primären Produktes von etwa 90 kDa darstellt. Es ist jedoch auch verlockend zu spekulieren, daß das 100 kDa-Polypeptid die pro-Form darstellen würde, während das 90 kDa Polypeptid die reife Form darstellt, erzeugt durch proteolytische (Auto)prozessierung der Peptidbindung zwischen den Resten 107 und 108.
  • Es ist festzuhalten, daß die nicht-transfektierten COS-1-Zellen ebenfalls geringe Mengen immunoreaktiven Materials mit scheinbaren Molekulargewichten von 90, 60 bzw. 40 kDa enthalten. Obwohl die Identität dieser Proteine noch zu klären ist, ist es denkbar, daß das 90 kDa-Protein eine geringe Menge von endogenem Furin darstellt.
  • Die Daten deuten darauf hin, daß die transfektierten fur-genetischen Sequenzen in der Tat transskribiert und translatiert werden, wodurch es möglich wird, die biologische Funktion der fur-Produkte zu testen.
    • PROPROTEIN PROZESSIERENDE AKTIVITÄT VON FURIN
  • In Transfektionsexperimenten mit 10 µg pSVLvWF DNA konnte festgestellt werden, daß das 360 kDa pro-vWF-Precursorprotein und das 260 kDa reife vWF-Protein in fast gleichen Anteilen in dem konditionierten Medium vorhanden sind. Die Bildung von reifem vWF in den durch Transfektion erhaltenen Zellen wird einer Prozessierung durch endogenes Furin zugeschrieben, welches in COS-1-Zellen exprimiert wird, wie dies durch Northern-Blot-Analyse von mRNA, isoliert aus COS-1-Zellen, und durch Immuno-Präzipitations-Analyse mit einem polyclonalen Kaninchen-Anti-Furin-Serum gezeigt wurde.
  • In ähnlichen Transfektionsexperimenten von COS-1-Zellen mit 10 µg pSVLvWFgly763 DNA konnte festgestellt werden, daß pro-vWFgly763 gebildet und konstitutiv sekretiert wurde in dem Kulturmedium als ein 360 kDa-Protein. Es gab keine endoproteolytische Prozessierung zu reifem vWF (260 kDa).
  • Das gleiche Ergebnis wurde bei einer Co-Transfektion von 5µg pSVLvWFgly763 DNA und 5µg pSVLfur DNA erhalten. Es wurde keine Prozessierung von pro-vWFgly763 zu reifem vWF beobachtet.
  • Andererseits konnte eine vollständige Prozessierung von pro-vWF zu reifem vWF festgestellt werden, wenn COS-1-Zellen mit 5µg pSVLvWF DNA und 5µg pSVLfur DNA cotransfektiert wurden.
    • MATERIALIEN UND VERFAHREN MOLECULARES KLONEN
  • pSVLfur enthält ein 4,1 kb fur cDNA-Fragment voller Länge, beginnend 117 Nucleotide aufwärts von dem ATG Startcodon und endend 21 Nudeotide abwärts von der poly-A-Additionsstelle, kloniert in EcoRI- Stelle von pSVL (Wells et al., Nucl. Acids Res. II, 1983, 7911-7925). In pSVLfur findet die Expression der fur cDNA-Sequenzen unter Kontrolle des SV40 späten Promotors statt. pMJ109 besteht aus einem kleinen 2,2 kb Smal/Smal humanen fur cDNA-Fragment molekular geklont in die HindIII-Stelle des Plasmids pUR291; das 2,2 kb fur cDNA umfaßt die carboxyterminale Region von Furin, die in pMJ109 verschmolzen ist in Phase mit den für β-Galactosidase (β-gal) codierenden Sequenzen unter Verwendung der Polylinker-Region gebildet kurz vor dem Stopcodon in lacZ. pMJ119 besteht aus dem gleichen 2,2 kb fur cDNA-Fragment, ist hier jedoch molekular in die Smal-Seite des Plasmid pATH1 geklont, was zu der in Phase-Verschmelzung der Furinsequenzen mit den ersten 336 Aminosäuren des trpE-codierten Teiles der Anthranilat-Synthetase (336trpE-AS) führt. Schließlich ist im Falle von pEW1 ein 3,5 kb BgIII/EcoRI fur cDNA-Fragment kloniert in pGEX-3X und verschmolzen in Phase mit Glutathion-S-transferase (GST).
  • Nach geeigneter Induktion der Proteinsynthese in Bakterien transformiert mit pMJ109, pMJ119 oder pEW1 wurden verhältnismäßig große Mengen von β-gal-Δfurin1 (MW 170 kDa), 336trpE-AS-Δfurin1 (MW 90 kDa) und GST-Δfurin2 (MW 100 kDa) erhalten.
    • HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTI-FURIN ANTIKÖRPER UND IMMUNOBLOTTEN
  • Polyclonale Anti-furin Antikörper wurden in Kaninchen für das β-gal- Δfurin1 Hybridprotein herangezogen, synthetisiert in Bakterien transformiert von pMJ109. Zur Immunisierung wurden teilweise gereinigte Hybridproteinpräparate eingesetzt. Nach Größenfraktionierung der bakteriellen Proteine durch SDS-PAGE wurde die das Hybridprotein enthaltende Gelregion ausgeschnitten und der Proteingehalt elektrophoretisch entfernt. Western-Blot-Untersuchungen mit Extrakten von transfektierten COS-1-Zellen wurden wie folgt durchgeführt. COS-1-Zelien transfektiert mit 10 µg pSVLfur DNA wurden 48 h nach der Transfektion in serumfreiem Medium erhalten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen zweimal gewaschen mit 10mM Natriumphosphat (pH 7,4), 0,14 M NaCl und dann im "Immunopräzipitationspuffer (IPB)" lysiert, der aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% (v/v) Nonidet P-40, 10 mM Benzamidin, 5 mM N-Ethylmaleimid und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bestand. Ein Aliquot des Zellextraktes wurde bei reduzierenden Bedingungen gegen ein 8% (G/V) SDS-Polyacrylamidgel laufengelassen. Im Anschluß daran wurden Proteine auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell) übertragen. Die Detektion von Furin wurde durch Inkubieren des Blots mit dem oben beschriebenen Kaninchen-Antifurin-Serum durchgeführt.
    • DNA-TRANSFEKTION, RADIOMARKIERUNG VON ZELLEN UND IMMUNOPRÄZIPITATIONSANALYSE
  • COS-1-Zellen aus Nieren von Affen wurden in Iscove's modifiziertem minimalen Medium vermehrt, das mit fetalem Kälberserum (10% V/V) und Antibiotika [Penicillin(10,0 E/ml) und Streptomycin (100 µg/ml)] supplementiert war. 24 h nach dem Impfen wurden semi-confluente Zellen transfektiert mit 20 µg DNA in 2 ml Iscove's modifiziertem minimalem Medium, supplementiert mit 200 µg/ml DEAE-Dextran. Das eingesetzte Transfektionsverfahren schloß einen Chloroquin-Schock ein (Luthman und Magnusson, Nucl. Acids Res. 11, 1983, 1295-1308). Nach der Transfektion wurden die Zellen in dem oben beschriebenen Medium 48 h gehalten. Vor der Radiomarkierung wurden das Medium enfernt und die Zellen 1 h in RPMI-Medium, frei von Methionin, inkubiert.
  • Anschließend wurden die Zellen 4 h in Anwesenheit von [³&sup5;S]methionin (50 µCi/ml, spezifische Aktivität > 800 Ci/mol) markiert; es schloß sich eine 14-stündige Behandlung (chase) mit nicht markiertem Methionin (Endkonzentration 1 mM) an. Nach fünfminütiger Zentrifugierung bei 13000 x g wurde das markierte Kulturmedium auf 1 x IPB eingestellt. Eine Vorklärung des Mediums wurde durchgeführt, indem inkubiert wurde zweimal mit Gelatin-Sepharose und im Anschluß daran mit vorgeformten Komplexen von Kaninchen-Prä-Immunserum mit Protein-A- Sepharose. Die Immunopräzipitation der radiomarkierten vWF- verwandten Proteine wurde durchgeführt mit vorgeformten Komplexen eines IgG-Präparates, abstammend aus Kaninchen-Anti-vWF (Dakopatts, Glostrup, Dänemark) mit Protein-A-Sepharose. Die Immunopräzipitate wurden gründlich mit IPB gewaschen und durch einen diskontinuierlichen 10-20% (G/V) Zuckergradienten gelöst in IPB supplementiert mit 0,5% Desoxycholat bzw. 10 mM Tris-HCl (pH 7,8) pelletiert. Die Immunopräzipitate wurden bei reduzierenden Bedingungen auf einem 5% SDS-Polyacrylamidgel analysiert.

Claims (8)

1. Nichttherapeutisches Verfahren zur endoproteolytischen Bearbeitung eines Proteins durch Behandlung des Proteins mit einem endoproteolytisch wirksamen Enzym, wobei das endoproteolytisch wirksame Enzym Furin oder ein furinartiges Enzym oder ein endoproteolytisch wirksames Fragment, Derivat oder Fusionsprotein des Furins oder furinartigen Enzyms ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein durch Behandlung mit dem endoproteolytisch wirksamen Enzym in Gegenwart von Ca²&spplus;-Ionen in vitro gespaltet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Behandlung bei einem pH- Wert von 5 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0, durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Behandlung bei einer Calciumkonzentration von 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2 bis 5 mM, durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Behandlung in Gegenwart des o-Phenanthronins oder eines äquivalenten Mittels zur Bindung von Ionen von Schwermetallen anders als Calcium durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Behandlung bei einer Temperatur von 20 bis 50ºC, vorzugsweise 30 bis 40ºC, durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Behandlung auf ein Vorläuferprotein eines Polypeptidhormons, eines Wachstumsfaktors, eines Toxins, eines Enzyms oder irgendeiner anderen Art von biologisch relevantem Protein angewendet wird.
8. Eukaryotische Zelle mit von Rekombinant-DNA abgeleiteter DNA, die für Furin oder ein furinartiges Enzym codiert und in der Lage ist, das Furin oder furinartige Enzym zu exprimieren.
DE69029663T 1989-10-25 1990-10-12 Verfahren zur endoproteolytischen bearbeitung von (vorläufer)proteinen und zur (mikro)biologischen herstellung Expired - Lifetime DE69029663T3 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8902651 1989-10-25
NL8902651A NL8902651A (nl) 1989-10-25 1989-10-25 Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van eiwitten.
NL9000917 1990-04-18
NL9000917A NL9000917A (nl) 1989-10-25 1990-04-18 Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro) biologische bereiding van eiwitten.
PCT/NL1990/000151 WO1991006314A2 (en) 1989-10-25 1990-10-12 Pharmaceutical composition having an endoproteolytic activity; a process for endoproteolytically processing (precursor) proteins and for the (micro)biological production of proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE69029663D1 DE69029663D1 (de) 1997-02-20
DE69029663T2 true DE69029663T2 (de) 1997-09-04
DE69029663T3 DE69029663T3 (de) 2008-05-21

Family

ID=26646599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69029663T Expired - Lifetime DE69029663T3 (de) 1989-10-25 1990-10-12 Verfahren zur endoproteolytischen bearbeitung von (vorläufer)proteinen und zur (mikro)biologischen herstellung

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5989856A (de)
EP (3) EP0693286A1 (de)
JP (2) JP3191111B2 (de)
AT (1) ATE147437T1 (de)
AU (1) AU6613290A (de)
CA (1) CA2069929C (de)
DE (1) DE69029663T3 (de)
DK (1) DK0497828T4 (de)
ES (1) ES2099714T5 (de)
FI (1) FI105348B (de)
GR (1) GR3023013T3 (de)
NL (1) NL9000917A (de)
WO (1) WO1991006314A2 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935815A (en) * 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
ES2109336T3 (es) * 1990-11-26 1998-01-16 Genetics Inst Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma.
US6348327B1 (en) * 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
DK52293D0 (de) * 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
US6005077A (en) * 1995-11-10 1999-12-21 Immuno Aktiengesellschaft Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation
AT404838B (de) * 1995-11-24 1999-03-25 Immuno Ag Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen
US6596526B1 (en) 2000-06-09 2003-07-22 Baxter Aktiengesellschaft Furin polypeptides with improved characteristics
EP1756275A1 (de) * 2004-04-23 2007-02-28 Novozymes A/S Verfahren zur gewinnung reifer protease durch enzymatische verdauung
DK2157177T3 (da) * 2007-05-22 2013-06-24 Baxter Int Fremgangsmåde til præparativ oprensning af humant furin
DK2235197T3 (en) 2007-12-27 2017-10-09 Baxalta GmbH Methods of cell culture
HUE043863T2 (hu) 2007-12-31 2019-09-30 Baxalta GmbH Lényegében állati fehérjétõl mentes rekombináns furin és eljárás elõállítására
WO2011144517A1 (en) 2010-05-12 2011-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Furin and biologically active derivatives thereof for use in the prevention or treatment of an inflammatory disease
TWI586802B (zh) 2011-06-02 2017-06-11 巴克斯歐塔公司 重組成對鹼性胺基酸蛋白酶之調配物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0246709A1 (de) * 1986-05-20 1987-11-25 Stichting Katholieke Universiteit Rekombinantes DNS, komplementäre DNS, Protein, Antikörper und Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen
CA1340740C (en) * 1987-12-08 1999-09-14 Eileen R. Mulvihill Co-expression in eukaryotic cells

Also Published As

Publication number Publication date
FI105348B (fi) 2000-07-31
JP2001238683A (ja) 2001-09-04
EP0497828B1 (de) 1997-01-08
EP0497828B2 (de) 2007-10-03
ES2099714T5 (es) 2008-04-01
CA2069929A1 (en) 1991-04-26
WO1991006314A3 (en) 1991-09-05
EP0497828A1 (de) 1992-08-12
ATE147437T1 (de) 1997-01-15
DK0497828T4 (da) 2008-02-04
DE69029663D1 (de) 1997-02-20
GR3023013T3 (en) 1997-07-30
EP0885956A1 (de) 1998-12-23
EP0693286A1 (de) 1996-01-24
DK0497828T3 (da) 1997-07-07
NL9000917A (nl) 1991-05-16
CA2069929C (en) 2002-08-27
FI921847A (fi) 1992-04-24
JPH05504051A (ja) 1993-07-01
WO1991006314A2 (en) 1991-05-16
ES2099714T3 (es) 1997-06-01
JP3191111B2 (ja) 2001-07-23
US5989856A (en) 1999-11-23
AU6613290A (en) 1991-05-31
DE69029663T3 (de) 2008-05-21
JP3270760B2 (ja) 2002-04-02
FI921847A0 (fi) 1992-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69127829T2 (de) Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
DE69011853T3 (de) System zur bearbeitung von hefe, welches eine zur bearbeitungsstelle benachbarte negativ geladene aminosäure beeinhaltet.
DE3689845T2 (de) Rekombinanter fibroblast-wachstumsfaktor.
EP0602688B1 (de) Methioninfreier G-CSF aus Prokaryonten
DE69029663T2 (de) Verfahren zur endoproteolytischen bearbeitung von (vorläufer)proteinen und zur (mikro)biologischen herstellung
DE68923741T2 (de) Fledermausspeichel-Plasminogenaktivatoren.
US6274365B1 (en) Pharmaceutical composition having an endoproteolytic activity
WO1996001274A1 (de) NEUE hIL-4-MUTANTENPROTEINE ALS ANTAGONISTEN ODER PARTIELLE AGONISTEN DES HUMANEN INTERLEUKIN 4
DE3752008T2 (de) Hybride Plasminogenaktivatoren
DE60038312T2 (de) Faktor x-analog mit einer verbesserten fähigkeit, aktiviert zu werden
DE69010096T2 (de) Expression und Sekretion von reifem menschlichem beta-Interleukin-1 in Bacillus subtilis und Mittel und Verfahren zu deren Ausführung.
DE3879823T2 (de) Verfahren zur herstellung von menschlichem wachstumshormon.
DE3687948T2 (de) Verfahren und nukleinsaeure zur herstellung von lecithin: cholestrinacyltransferase.
DE69101486T2 (de) Verfahren zur reinigung rekombinanter polypeptide.
EP0677107B1 (de) Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern
DE19611234C1 (de) Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein
DE3877197T2 (de) Verfahren zur herstellung von hirudin.
EP0496327A1 (de) Polypeptide mit Prourokinase-Aktivität, dafür kodierende Plasmide und Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2000061727A2 (de) Herstellung von pankreatischer procarboxypeptidase b, isoformen und muteinen davon und ihre verwendung
DE3881953T2 (de) Expression von fremden Genen in Drosophila-Zellen.
DE69930118T2 (de) Verfahren zur herstellung von proteinen in transformierten hefezellen
IE902906A1 (en) Expression of a functional insect specific toxin gene in¹mammalian cells
WO1992001794A2 (de) Ancrod ähnliche proteine, ihre herstellung und verwendung
DE4039415A1 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine ohne n-terminalen methioninrest
EP0312941A2 (de) Polypeptide mit Prourokinase-Aktivität, ihre Herstellung und Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN, LEUVEN, BE VEN, WI

8363 Opposition against the patent
8366 Restricted maintained after opposition proceedings