DE69011853T3 - System zur bearbeitung von hefe, welches eine zur bearbeitungsstelle benachbarte negativ geladene aminosäure beeinhaltet. - Google Patents

System zur bearbeitung von hefe, welches eine zur bearbeitungsstelle benachbarte negativ geladene aminosäure beeinhaltet.

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Description

    ERFINDUNGSGEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die in Hefe exprimiert und verarbeitet werden, ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Secuenz umfaßt, die solche Peptide kodiert, Vektoren, die solche DNA-Fragmente tragen, und Hefezellen, die mit den Vektoren transformiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung heterologer Proteine in Hefe.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Hefeorganismen produzieren eine Anzahl von Proteinen, die intrazellulär synthetisiert werden, aber eine Funktion außerhalb der Zelle besitzen. Solche extrazellulären Proteine werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Diese sekretierten Proteine werden anfänglich innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder einer Präprotein-Form exprimiert, die eine Präsequenz enthält, die eine effektive Lenkung des exprimierten Produktes durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) hindurch sicherstellt. Die Präsequenz, normalerweise als Signalpeptid bezeichnet, wird im allgemeinen während der Translokation von gewünschten Produkt abgespalten. Einmal in den sekretorischen Weg eingetreten, wird das Protein zum Golgi-Apparat transportiert. Vom Golgi kann das Protein verschiedenen Wegen folgen, die zu Abteilungen führt, die der Zellvakuole oder der Zellmembran, oder es kann aus der Zelle heraus geführt werden, um an das externe Medium sekretiert zu werden (Pfeffer, S.R. und Rothman, JE. Ann.Rev.Biochem. 56 (1987), 829-852).
  • Mehrere Ansätze sind für die Expression und Sekretion in Hefe von zu Hefe heterologen Proteinen vorgeschlagen worden. Die veroffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 088 632A beschreibt ein Verfahren, mit dem zu Hefe heterologe Proteine exprimert, verarbeitet und sekretiert werden, indern ein Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel transformiert wird, das DNA enthält, die das gewünschte Protein und ein Signalpeptid kodiert, eine Kultur des transformierten Organismus hergestellt wird, die Kultur gezüchtet wird und das Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Das Signalpeptid kann das eigene Signalpeptid des gewünschten Proteins, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid aus nativem und heterologen Signalpeptid sein.
  • Ein Problem, auf das man bei der Verwendung von zu Hefe heterologen Signalpeptiden stößt, könnte sein, daß das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translokation und/oder Spaltung nach dem Signalpeptid sicherstellt.
  • Der S. cerevisiea-MFα1 (α-Faktor) wird als eine Präpro-Form mit 165 Aminosäuren synthetisiert, die ein 19 Aminosäuren langes Signal- oder Präpeptid umfaßt, gefolgt von einem 64 Aminosäuren langen "Leader-" oder Propeptid, einschließlich drei Nverknüpften Glykosylierungsstellen, gefolgt von (Lysarg(Asp/Glu, Ala)2-3α-Faktor)&sub4; (Kurjan, J. und Herskowitz, I. Cell 30 (1982), 933-943). Der Signal-Leader-Teil des Präpro-MFα1 ist im breiten Umfang eingesetzt worden, um Synthese und Sekretion von heterologen Proteinen in S. cerevisiae zu erreichen.
  • Die Verwendung von Signgal/Leader-Peptiden, die zu Hefe homolog sind, ist aus u.a. der US-Patentschrift Nr. 4,546,082, den veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen Nr. 0 116 201A, 0 123 294A, 0 123 544A, 0 163 529A und 0 123 289A und den DK-Patentschriften Nr. 2484/84 und 3614/83 bekannt. In EP 0 123 289A ist die Verwendung von S. cerevisiae-α-Faktor-Vorläufer beschrieben, wohingegen DK 2484/84 die Verwendung des Saccharomyces cerevisiae-Invertase-Signalpeptids und DK 3614/83 die Verwendung des Saccharomyces cerevisiae-PH05- Signalpeptids zur Sekretion von fremden Proteinen beschreibt.
  • Die US-Patentschrift Nr. 4,546,082, EP 0 016 201A, 0 123 294A, 0 123 544A und 0 163 529A beschreiben Verfahren, durch die der α-Faktor-Signal-Leader aus Saccharomyces cerevisiae (MFα1 oder MFα2) im Sekretionsprozeß von exprimierten heterologen Proteinen in Hefe eingesetzt wird. Durch Verknüpfen einer DNA-Sequenz, die die S. cerevisiae-MFα1-Signal/Leader-Secuenz kodiert, mit dem 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein wurde Sekretion und Verarbeitung des gewünschten Proteins nachgewiesen.
  • EP 206 783 offenbart ein System für die Sekretion von Polypeptiden aus S. cerevisiae, bei dem die α-Faktor-Leaderseouenz gestutzt worden ist, um die vier α-Faktor-Peptide, die auf der nativen Leadersequenz vorhanden sind, zu eliminieren, um das Leaderpeptid selbst ubrigzulassen, gebunden an ein heterologes Polypeptid über die α-Faktor-Verarbeitungsstelle LysArgGlAla- Gluala. Es wird gezeigt, daß diese Konstruktion zu einem effizienten Verfahren fur kleinere Peptide (weniger als 50 Aminosäuren) führt. Für die Sekretion und Verarbeitung von größeren Polypeptiden ist die native α-Faktor-Leaderseouenz gestutzt worden, um ein oder zwei α-Faktor-Peptide zwischen dem Leaderpeptid und den Polypeptid übrigzulassen
  • Eine Anzahl sekretierter Proteine werden so gelenkt, daß sie einem proteolytischen Verarbeitungssystem ausgesetzt werden, das die Peptidbindung am Carboxyende zweier aufeinanderfolgender basischer Aminosäuren spalten kann. Diese enzymatische Aktivität wird in S. cerevisiae durch das KEX-2-Gen kodiert (Juhus, D.A. et al., Cell 37 (1984b), 1075). Die Verarbeitung des Produktes durch das KEX-2-Genprodukt ist für die Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Reifungsfaktor α1 (MFα1 oder α-Faktor) erforderlich, ist aber nicht beteiligt bei der Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Reifungsfaktor a.
  • Sekretion und richtige Verarbeitung eines Polypeptids, das sekretiert werden soll, wird in einigen Fällen erreicht, wenn ein Hefeorganismus kultiviert wird, der init einem Vektor transformiert wird, der so konstruiert ist, wie in den obengenannten Literaturstellen angegeben. In vielen Fällen ist jedoch das Sekretionsniveau sehr niedrig oder es gibt keine Sekretion oder die proteolytische Verarbeitung kann unrichtig oder unvollständig sein. Die jetzigen Erfinder glauben gegenwärtig, daß dies in gewissem Maße einen ungenügenden Ausgesetztsein der Verarbeitungsstelle, die zwischen dem C-terminalen Ende des Leaderpeptids und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins vorhanden ist, zuzuschreiben ist, so daß diese proteolytischer Spaltung unzugänglich oder zumindest weniger zugänglich gemacht wird.
  • Aus Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 46424646 ist die Herstellung von vom cx-Faktor abgeleiteten Plasmidvektoren zur Sekretion von heterologen Proteinen in Hefe bekannt. In diesen ist (a) der α-Faktor-spacer, d.h. die Aminosäuren, die auf die KEX2-Erkennungsstelle folgen und der kodierenden Region des reifen α-Faktors vorausgehen, welcher in den meisten natürlich auftretenden α-Faktorgenen Glu-Ala- Glu-Ala (Aminosäuren 86 bis 89) ist, durch ein zusätzliches Glu-Ala-Paar verlängert (der resultierende spacer Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala wird auch gelegentlich in der Natur beobachtet); (b) der α-Faktor-spacer wurde verändert zu Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys- Arg; (c) der α-Faktor-spacer wurde deletiert; (d) der α-Faktor-spacer wurde deletiert; zusätzlich wurde die Aminosäure 81 der Leadersequenz (Ser) durch Pro ersetzt; (e) der α-Faktor-spacer wurde deletiert und zusätzlich wurde die Aminosäure 81 der Leadersequenz (Ser) durch Gin ersetzt.
  • W090101063 offenbart sekretorische Leadersequenzen, die entweder aus einer menschlichen Serumalbumin-Prä-Sequenz oder Kluyveromyces lactis-Killertoxin-Prä Sequenz bestehen, welche an die α-Faktor KEX2-Schnitt-Erkennungsstelle fusioniert sind. Unter den zur Verfügung gestellten Leadersequenzen ist die Sequenz Met-Lys- Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Lue-Lue-Phe-Lue-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Lue-Asp.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß es durch Bereitstellung bestimmter Modifikationen nahe der Verarbeitungsstelle am C-terminalen Ende des Leaderpeptids und/oder am N-terminalen Ende eines heterologen Polypeptids, das an das Leaderpeptid gebunden ist, möglich ist, eine höhere Ausbeute des richtig verarbeiteten Proteins zu erhalten, als mit nichtmodifizierten Konstruktionen aus Leaderpeptid und heterologen Polypeptid erhältlich ist.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Fusion eines Signalpeptids, eines Leaderpeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfaßt, wobei das Polypeptid in seiner Aminosäuresequenz benachbart zu einer Hefe-Verarbeitungsstelle, die zwischen dem C-terminalen Ende des Leaderpeptids und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins angeordnet ist, modifiziert ist, um eine Präsentation der Verarbeitungsstelle bereitzustellen, die sie proteolytischer Spaltung zugänglich macht, wobei das Polypeptid die folgende gtruktur besitzt
  • Signalpeptid-Leaderpeptid-X¹-X²-X³-X&sup4;-heterologes Protein,
  • worin X eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die identisch oder verschieden sein können,
  • X² und X³ identisch oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys und Arg besteht,
  • X² und X³ zusammen eine Hefe-Verarbeitungsstelle definieren und
  • X&sup4; eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die identisch oder verschieden sein können,
  • mit der Maßgabe, daß X und/oder X eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine der durch X¹ und/oder X&sup4; dargestellten Aminosäuren eine negativ geladene Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glu und Asp besteht, und mit der weiteren Maßgabe, daß wenn X eine Peptidbindung ist, X&sup4; nicht Glu-Ala-Glu-Ala 'Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala- Glu-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg oder Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp ist und daß, wenn X&sup4; eine Peptidbindung ist, X&sup4; nicht Ser-Leu-Asp ist und mit der weiteren Maßgabe daß das Signalpeptid-Leaderpeptid-X¹ nicht ist:
  • α-Faktor Signal und Leader (1-85)-Glu-Ala-Glu-AIA-Ser-Leu-Asp,
  • α-Faktor Signal und Leader (1 80)-Pro-Leu-Asp,
  • α-Faktor Signal und Leader (1-80)-Gln-Leu-Asp, Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser- Leu-Asp.
  • Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Signalpeptid" eine Präsequenz bedeuten, die in ihrer Natur vorwiegend hydrophob ist und als eine N-terminale Sequenz auf der Vorläuferform eines in Hefe exprimierten extrazellulären Proteins vorliegt. Die Funktion des Signalpeptids besteht darin, zu ermöglichen, daß das zu sekretierende heterologe Protein in das endoplasmatische Retikulum eintritt. Das signalpeptid wird normalerweise im Verlauf dieses Prozesses abgespalten. Das signalpeptid kann heterolog oder homolog zum Hefeorganismus sein, der das Protein produziert, aber, wie oben erläutert, kann eine effizientere Spaltung des Signalpeptids erreicht werden, wenn es homolog zum fraglichen Hefeorganismus ist.
  • Der Ausdruck "Leaderpeptid" soll ein überwiegend hydrophiles Peptid bezeichnen, dessen Funktion darin besteht, zu ermöglichen, daß das zu sekretierende heterologe Protein aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einen sekretorischen Vesikel zur Sekretion in das Medium gelenkt wird Cd. h. Heraustransport des exprimierten Proteins oder Polypeptids durch die Zellwand hindurch oder wenigstens durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Zelle)
  • Der Ausdruck "heterologes Protein oder Polypeptid" soll ein Protein oder Polypeptid bezeichnen, das in der Natur nicht von dem Wirts-Hefeorganismus produziert wird. Die Ausdrücke "Protein" und "Polypeptid" werden in der folgenden Beschreibung im wesentlichen austauschbar verwendet.
  • Die Modifikation des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle (der Stelle, an der das Leaderpeptid vom heterologen Protein durch proteolytische Spaltung, die durch proteolytische Hefeenzyme bereitgestellt wird, entfernt wird), wobei diese Modifikation durch X¹ und/oder X&sup4; dargestellt ist, kann in der Form einer Extension, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren am C-terminalen Ende des Leaderpeptids und/oder am N-terminalen Ende des heterologen Proteins vorliegen.
  • Gemäß der Erfindung ist überraschenderweise festgestellt worden, daß eine effizientere und richtige Verarbeitung des heterologen Proteins erreicht werden kann, wenn wenigstens eine der Aminosäuren, mit der die Sequenz des Polypeptids erweitert worden ist oder die eine oder mehrere der nativen Aminosäuren in der Sequenz ersetzt haben, eine negativ geladene Aminosäure ist, wie etwa diejenigen, die oben angegeben sind. Eine ähnliche Wirkung wird beobachtet, wenn eine negativ geladene Aminosäure in der Nähe der Verarbeitungsstelle durch Deletion, d.h. durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren vom C- terminalen Ende des Leaders oder vom N-terminalen Ende der Proteinsequenz, bis eine negativ geladene Aminosäure benachbart zur Verarbeitungsstelle vorhanden ist, bereitgestellt wird.
  • Ohne auf irgendeine bestimmte Theorie beschränkt werden zu wollen, wird angenommen, daß diese Wirkung der durch die negativ geladenen Aminosäuren benachbart zur Verarbeitungsstelle verliehenen, erhöhten Hydrophilie zugeschrieben werden kann, die zu erhöhtern Ausgesetztsein der Tertiärstruktur des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle in der wässrigen intrazellulären Umgebung führt und daher zugänglicher für proteolytische Spaltung durch das Verarbeitungsenzym ist. Die vorteilhafte Wirkung negativ geladener Aminosäuren, im Gegensatz zu positiv geladenen oder neutralen Aminosäuren, kann den negativ geladenen Seitenketten dieser Aminosäuren zugeschrieben werden, die zur Hydrophihe der Tertiärstruktur an der Verarbeitungsstelle beitragen, ohne zu irgendeiner potentiellen Hemmung des Verarbeitungsenzyms zu führen.
  • Es ist auch möglich, daß negativ geladene Aminosäuren dazu beitragen, eine Tertiärstruktur an der Verarbeitungsstelle (z.B. Windungen, Haarnadeln oder Schlaufenstrukturen) mit anderen Mitteln zu schaffen und aufrechtzuerhalten, wie etwa durch Wechselwirkung mit anderen Aminosäureresten im Polypeptid. Außerdem könnte auch direkte Wechselwirkung zwischen negativ geladenen Aminosäuren und dem Verarbeitungsenzym auftreten. So glaubt man, daß negativ geladene Aminosäuren, die benachbart zu den zwei basischen Aminosäuren der Verarbeitungsstelle angeordnet sind, das Verarbeitungsenzym so lenken können, daß es eine richtige und effiziente Spaltung ausführt, durch Ladungswechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder zwischen Protein und Lösungsmittel.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die das oben definierte Peptid kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen rekonbinanten Expressionsvektor, der zur Replikation in Hefe in der Lage ist und der ein DNA-Konstrukt trägt, das das oben definierte Polypeptid kodiert, sowie einen Hefestamm, der zur Expression des heterologen Proteins oder Polypeptids in der Lage ist und der mit diesem Vektor transformiert ist.
  • In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids in Hefe, welches umfaßt, daß der transformierte Hefestamm in einem geeigneten Medium kultiviert wird, um Expression und Sekretion des heterologen Proteins oder Polypeptids zu erreichen, woraufhin das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
    • DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Mit der oben angegebenen Erklärung konsistent ist, wenn X¹ eine einzelne Aminosäure darstellt, diese Glu oder Asp ist.
  • X¹ und/oder X&sup4; stellen geeigneterweise 1-6 Aminosäuren dar.
  • Wenn X¹ eine. Sequenz von zwei Aninosäuren darstellt, kann sie die Struktur BA besitzen, worin A Glu oder Asp ist und B Glu,
  • Asp, Val, Gly oder Leu ist, z.B. LeuGlu.
  • Wenn X¹ eine Sequenz von drei Aminosäuren darstellt, kann sie die Struktur CBA besitzen, worin A und B wie oben definiert sind und C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg oder Lys ist, z.B. AspLeuGlu.
  • Wenn X¹ eine Sequenz von mehr als zwei Aminosäuren darstellt, kann eine der zusätzlichen Aminosäuren geeigneterweise Pro oder Gly sein, da von diesen Aminosäuren bekannt ist, daß sie Windungen, Haarnadeln oder Schlaufenstrukturen einführen oder ein Teil davon bilden, von denen wahrscheinlich ist, daß sie die zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für das proteolytische Enzym erleichtern.
  • Wenn X¹ eine Sequenz von vier Aminosäuren darstellt, kann sie die Struktur DCBA haben, worin A, B und C wie oben definiert sind und D dieselben Bedeutungen besitzt wie C, z.B. GluArg- LeuGlu, LysGluLeuGlu oder LeuAspLeuGlu.
  • Wenn X¹ eine Sequenz von fünf Aminosäuren darstellt, kann sie die Struktur EDCBA besitzen, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E dieselben Bedeutungen wie C hat, z.B. Leu- GluArgLeuGlu,
  • Wenn X¹ eine Sequenz von sechs Aminosäuren darstellt, kann sie die Struktur FEDCBA besitzen, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F dieselben Bedeutungen hat wie C, z.B. ValleuGluArgLeuGlu.
  • Man wird verstehen, daß andere Kombinationen von Aminosäuren als eine Bedeutung von X¹ möglich sind, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, vorausgesetzt, daß wenigstens eine der Aminosäuren in der Sequenz eine negativ geladene Aminosäure ist, wie oben erläutert.
  • Geeignete Bedeutungen von X¹ können diejenigen sein, die oben für X¹ dargestellt sind, obgleich die Reihenfolge der Aminosäuren typischerweise umgekehrt sein wird (d. h. ABC statt CBA, etc.).
  • In Ausführungsformen des Polypeptids der Erfindung, in denen das heterologe Protein durch eine oder mehrere positiv geladene oder hydrophobe Aminosäuren eingeleitet wird, stellt X&sup4; vorteilhafterweise eine oder mehrere Aminosäuren statt einer Peptidbindung dar, da mian annimmt, daß dies eine größere Zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für proteolytische Enzyme sicherstellt.
  • In Fällen, in denen X&sup4; eine N-terminale Extension von 1-6 Aminosäuren darstellt, kann es passend sein, eine zusätzliche Verarbeitungsstelle zwischen der (den) Aminosäure(n), die durch X&sup4; dargestellt ist (sind), und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins bereitzustellen. Dies ist besonders wichtig, wenn das Protein für Zwecke verwendet werden soll, die das Vorhandensein eines Proteins ohne N-terminale Extension erfordern. Die zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren können in vitro durch proteolytische Spaltung mit Hilfe eines geeigneten proteolytischen Enzyms, wie etwa einer trypsinähnlichen Protease, oder mit Hilfe einer Behandlung mit einer Chemikalie, wie etwa Bromcyan, entfernt werden. Es kann auch möglich sein, die Spaltung der zusätzlichen Verarbeitungsstelle durch den Wirts-Hefeorganismus zu bewirken, indern eine für ein anderes proteolytisches Hefeenzym spezifische Verarbeitungsstelle ausgewählt wird.
  • Für einige Zwecke kann es jedoch vorteilhaft sein, die N-terminale Extension so zu konstruieren, daß sie einem speziellen Zweck angepaßt ist. So kann die Extension als ein Marker für den Nachweis des Proteins dienen, als Hilfsmittel zur Reinigung des Proteins oder als ein Mittel zur Steuerung der Wirkung eines Arzneimittels in vivo, z.B. um die Halbwertszeit eines Arzneimittels zu verlängern oder um es zu einer speziellen Stelle im Körper zu lenken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Polypeptids der vorliegenden Erfindung stellen X¹ und/oder X&sup4; eine Aminosäuresequenz von 1-4 Aminosäuren dar. In dieser Ausführungsform ist die unmittelbar zu X² benachbarte Aminosäure vorzugsweise Glu oder Asp, ist die unmittelbar zu X³ benachbarte Aminosäure vorzugsweise Glu oder Asp oder sind beide Glu oder Asp, da dies eine vorteilhafte Präsentation der Verarbeitungsstelle aufgrund der hydrophilen Natur dieser Aminosäuren bereitstellt, wie oben detaillierter erläutert. Die Aminosäuresequenz, die durch X¹ oder X&sup4; dargestellt ist, kann geeigneterweise mehr als ein Glu oder Asp umfassen.
  • In einer anderen interessanten Ausführungsform des Polypeptids der Erfindung stellen sowohl X¹ als auch X&sup4; eine oder mehrere Aminosäuren dar, das Polypeptid ist mit anderen Worten sowohl am C-terminalen Ende des Leaderpeptids als auch am N-terminalen Ende des heterologen Proteins modifiziert. In dieser Ausführungsform können X¹ und X&sup4; symmetrisch identisch sein, d.h., daß die Aminosäure oder -säuren, die durch X¹ und X&sup4; dargestellt ist (sind), sich von X² bzw. X³ nach außen erstrekkend dieselbe (n) ist (sind).
  • Die Signalpeptidsequenz des Polypeptids der Erfindung kann jedes Signalpeptid sein, das eine effektive Lenkung des exprimierten Polypeptids in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlich auftretendes Signalpeptid oder funktionale Teile desselben sein oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Es hat sich gezeigt, daß geeignete Signalpeptide das α-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid von Mäuse-Speichelamylase, ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid sind.
  • Die Mäuse-Speichelamylase-Signalsequenz ist beschrieben von O. Hagenbüchle et al., Nature 289, 1981, S. 643-646. Die Carboxypeptidase-Signalsequenz ist beschrieben von L.A. Valis et al., Cell 48, 1987, S. 887-897. Das BAR1-Signalpeptid ist offenbart in WO 87/02670.
  • Die Leaderpeptidsequenz des Polypeptids der Erfindung kann jedes Leaderpeptid sein, das darin funktional ist, das exprimierte Polypeptid zum endoplasmatischen Retikulum und weiter entlang des sekretorischen Wegs zu lenken. Mögliche Leadersequenzen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind natürliche Leaderpeptide, die aus Hefe oder anderen Organismen gewonnen sind, wie etwa der &-Faktor-Leader oder ein fuktionales Analog desselben. Das Leaderpeptid kann auch ein synthetisches Leaderpeptid sein, z.B. einer der synthetischen Leader, die in der Internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichungs Nr. WO 89/02463 offenbart sind, mit den folgenden Aminosäuresequenzen
  • A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile- Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala- Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
  • B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ilepro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr- Leu-Ala
  • C. Ala-pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ilepro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
  • D. Al a-pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ilepro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr- Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala und
  • E. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile- Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr- Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala
  • oder ein Derivat derselben.
  • Das mit dem Verfahren der Erfindung produzierte heterologe Protein kann jedes Protein sein, das mit Vorteil in Hefe produziert werden kann. Beispiele für solche Proteine sind Aprotinin oder andere Protease-Inhibitoren, Insulin (einschließlich Insulinvorläufern), Human- oder Rinder-Wachstumshormone, Interleukin, Glucagon, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, platelet-derived growth factor, Enzyme, etc., oder ein funktionales Analog derselben. Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "funktionales Analog" ein Polypeptid mit einer ähnlichen Funktion wie das native Protein bezeichnen (dies soll so verstanden werden, daß es sich eher auf die Natur als auf das Niveau der biologischen Aktivität des nativen Proteins bezieht). Das Polypeptid kann strukturell ähnlich zum nativen Protein sein und kann vom nativen Protein durch Addition einer oder mehrerer Aminosäuren zu einem oder beiden der C- und N-terminalen Enden des nativen Proteins, Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einem oder einer Anzahl verschiedener Stellen in der nativen Aminosäuresequenz, Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem oder beiden Enden des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen der Aminosäuresequenz oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der nativen Aminosäuresequenz abgeleitet sein. Solche Modifikationen sind für viele der obenerwähnten Proteine gut bekannt.
  • Gemäß der Erfindung ist überraschenderweise festgestellt worden, daß Modifikationen am C-terminalen Ende des Leaderpeptids oder am N-terminalen Ende des heterologen Proteins, wie oben beschrieben, die Produktion von richtig verarbeitetem Aprotinin (oder einem funktionellen Analog desselben, wie oben definiert) in hohen Ausbeuten ermöglichen. Aprotinin ist ein Protease-hemmendes Protein, dessen Eigenschaften es für eine Vielzahl von medizinischen Zwecken nützlich machen (z.B. in der Behandlung von Bauchspeicheldrüsenentzündung, septischem Schocksyndrom, hyperfibrinolytischer Hämorrhagie und Myocardinfarzierung). Verabreichung von Aprotinin in hohen Dosen verringert signifikant den Blutverlust in Verbindung mit Herzchirurgie und anderer wichtiger Chirurgie. Aprotinin ist auch nützlich als ein Zusatz zu Kulturmedien, da es Wirtszellproteasen hemmt, die ansonsten unerwünschte proteolytische Spaltung exprimierter Proteine bewirken könnten. Man ist auf Schwierigkeiten gestoßen, eine hohe Ausbeute von richtig verarbeitetem Aprotinin in Hefe unter Verwendung bekannter natürlicher Leadersequenzen, wie etwa dem α-Faktor-Leader, zu erreichen. Natives Aprotinin wird eingeleitet am N-Terminus durch eine basische Aminosäure (Arg) und aus diesem Grund könnte die vorangehende Verarbeitungsstelle weniger geeignet für proteolytische Spaltung sein (wie oben erläutert), wenn eines der bekannten Leaderpeptide (z.B. der α-Faktor-Leader) eingesetzt wird, ohne daß er gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert ist, was zu niedrigen Ausbeuten, wenn überhaupt, von richtig verarbeitetem Aprotinin führt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders gute Ergebnisse im Hinblick auf die Produktion von Aprotinin erzielt worden, wenn X¹ GluArgLeuGlu darstellt oder wenn X GluLeu oder GluLeuAspLeu darstellt (vgl. die folgenden Beispiele), obgleich man erwartet, daß vorteilhafte Ausbeuten von Aprotinin mit anderen Bedeutungen von X¹ und X&sup4; erreicht werden können, vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure und am bevorzugtesten die zur Verarbeitungsstelle nächstgelegene eine negativ geladene Aminosäure ist, wie oben erläutert.
  • Ebenfalls gemäß der Erfindung ist festgestellt worden, daß Modifikationen am C-terminalen Ende des Leaderpeptids oder am N-terminalen Ende des heterologen Proteins, wie oben beschrieben, die Produktion von hohen Ausbeuten von richtig verarbeitetem Insulinvorläufer (oder einem funktionellen Analog desselben, wie oben definiert) erlauben. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann X¹ Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-Glu darstellen, wobei in diesem Fall X&sup4; üblicherweise eine Peptidbindung darstellt. Alternativ kann X&sup4; Glu darstellen, wobei in diesem Fall X¹ üblicherweise eine Peptidbindung darstellt. Insbesondere sind vorteilhafte Ergebnisse gemäß der Erfindung im Hinblick auf die Expression des Insulinanalog-Vorläufers B(1- 29)-AlaAlaLys-A(1-29) erzielt worden, wenn X¹ LysGluLeuGlu darstellt oder wenn X&sup4; eine Substitution von Phe als der ersten Aminosäure des Insulinvorläufers durch Glu darstellt (vgl. die folgenden Beispiele). Vernünftige Ausbeuten sind auch für den Insulinanalog-Vorläufer B (1-29)-SerAspAspAlaLys-A(1-29) erhalten worden, wenn X¹ Lys-Glu-Leu-Glu darstellt. Außerdem erwartet man, daß hohe Ausbeuten an Insulinvorläufer mit anderen Bedeutungen von X¹ und X&sup4; erhalten werden können, vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure und vorzugsweise die zur Verarbeitungsstelle nächstgelegene eine negativ geladene Aminosäure ist, wie oben erläutert.
  • Das DNA-Konstrukt der, Erfindung, das das Polypeptid der Erfindung kodiert, kann synthetisch mit etablierten Standardverfahren hergestellt werden, z.B. mit dem Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters22, 1981, S. 1859-1869, oder mit dem von Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, S. 801-805, beschriebenen Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide z.B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, synthetisiert, gereinigt, duplexiert und ligiert, um das synthetische DNA- Konstrukt zu bilden.
  • Das DNA-Konstrukt der Erfindung kann auch Genom- oder cDNA- Ursprung haben, z.B. erhalten durch Herstellung einer Genomoder cDNA-Bibliothek und Screenen auf DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Teil des Polypeptids der Erfindung kodiereng durch Hybridisieren unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken (vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor, 1982). In diesem Fall können eine Genom- oder cDNA- Sequenz, die ein Signal- und Leaderpeptid kodieren, mit einer Genorn- oder cDNA-Sequenz verknüpft werden, die das heterologe Protein kodiert, woraufhin die DNA-Sequenz an einer Stelle, die der Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-X&sup4; des Polypeptids entspricht, z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die die gewünschte Aminosäuresequenz kodieren, für homologe Rekombination gemäß gut bekannten Verfahren modifiziert werden.
  • Schließlich kann das DNA-Konstrukt gemischt synthetischen und Genom-, gemischt synthetischen und cDNA- oder gemischt Genomund cDNA-Ursprung haben, hergestellt durch Anellieren von Fragmenten mit synthetischem, Genorn- oder cDNA-Ursprung (wie passend), wobei die Fragmente unterschiedlichen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen, gemäß Standardtechniken. So kann man sich vorstellen, daß die DNA-Sequenz, die das heterologe Protein kodiert, Genom-Ursprung hat, während die Sequenz, die das Leaderpeptid kodiert, synthetisch hergestellt sein kann.
  • Bevorzugte DNA-Konstrukte, die Aprotinin kodieren, sind wie in den beigefügten Figuren 4, 7, 9, 11 und 12 dargestellt oder geeignete Modifikationen derselben, die für Aprotinin oder ein funktionales Analog desselben kodieren. Beispiele für geeignete Modifikationen der DNA-Sequenz sind Nukleotid-Substitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Proteins führen, aber die der Codonverwendung des Hefeorganismus entsprechen können, in den das DNA-Konstrukt inseriert ist, oder Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz und daher möglicherweise einer anderen Proteinstruktur führen, ohne jedoch die Anti-Proteaseeigenschaften von nativem Aprotinin zu beinträchtigen. Andere Beispiele für mögliche Modifikationen sind Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden in die Sequenz, Addition von einem oder mehreren Nukleotiden an irgendeinem Ende der Sequenz und Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden an irgendeinem Ende von oder innerhalb der Sequenz. Beispiele für spezielle Aprotinin-Analoge sind diejenigen, die in der europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungs Nr. 339 942, beschrieben sind.
  • Bevorzugte DNA-Konstrukte, die Insulinvorläufer kodieren, sind wie in den beigefügten Figuren 16 und 17 dargestellt oder geeignete Modifikationen derselben, wie oben definiert.
  • Der rekombinante Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz trägt, die das Polypeptid der Erfindung kodiert, kann jeder Vektor sein, der zu Replikation in Hefeorganismen in der Lage ist. In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die das Polypeptid der Erfindung kodiert, operabel verknüpft mit einer geeigneten Promotor-Sequenz sein. Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die Transskriptionsaktivität in Hefe zeigt, und kann abgeleitet werden von Genen, die Proteine kodieren, die zu Hefe entweder homolog oder heterolog sind. Der Promotor wird vorzugsweise abgeleitet von einem Gen, das ein zu Hefe homobges Protein kodiert. Beispiele für geeignete Promotoren sind die Saccharomyces cerevisiae-Mα1-, TPI-, ADH- oder PGK-Promotoren.
  • Die DNA-Sequenz, die das Polypeptid der Erfindung kodiert, sollte auch operabel verknüpft mit einern geeigneten Terminator sein, z.B. dem TPI-Terminator (vgl. T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419-434).
  • Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung umfaßt außerdem eine DNA-Sequenz, die den Vektor in die Lage versetzt, in Hefe zu replizieren. Beispiele für solche Sequenzen sind die Hefe-Plasmid-2u-Replikationsgene REP 1-3 und Replikationsur- Sprung. Der Vektor kann auch einen selektionierbaren Marker umfassen, z.B. das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen, wie beschrieben von P.R. Russel, Gene 40, 1985, S. 125-130.
  • Die Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die für das Polypeptid der Erfindung, den Promotor bzw. den Teminator kodieren, zu ligieren und sie in geeignete Hefevektoren zu inserieren, die die zur Hefereplikation notwendige Information enthalten, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt (vgl. z.B. Maniatis et al., aaO). Man wird verstehen, daß der Vektor konstruiert werden kann, indem entweder zunächst ein DNA-Konstrukt, das die gesamte DNA-Sequenz enthält, die für das Polypeptid der Erfindung kodiert, hergestellt und anschließend dieses Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird oder indem nacheinander DNA-Fragmente, die genetische Information für die einzelnen Elemente (wie etwa das Signal-, Leader- oder heterologe Protein) enthalten, inseriert werden, gefolgt von Ligation.
  • Der Hefeorganismus, der im Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann jeder geeignete Hefeorganismus sein, der bei Kultivierung große Mengen des fraglichen heterologen Proteins oder Polypeptids pröduziert. Beispiele für geeignete Hefeorganismen können Stämme der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluweri, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces uvarum sein. Die Transformation der Hefezellen kann z.B. durch Protoplasmenbildung bewirkt werden (vgl. Beispiel 1 unten), gefolgt von Transformation in einer per se bekannten Art und Weise. Das Medium, das verwendet wird, um die Zellen zu kultivieren, kann jedes herkömmliche Medium sein, das zum Züchten von Hefeorganismen geeignet ist. Das sekretierte heterologe Protein, von dem ein bedeutender Anteil im Medium in richtig verarbeiteter Form vorhanden sein wird, kann mit herkömmlichen Verfahren aus dem Medium gewonnen werden, einschließlich Abtrennung der Hefezellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällung der proteinhaltigen Bestandteile des Oberstandes oder Filtrats mit Hilfe eines Salzes, z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
  • Zn einem zusätzlichen Aspekt betrifft die Erfindung ein neuartiges Aprotinin-Analog der allgerneinen Formel X&sup4;-Aprotinin(1- 58), worin X&sup4; eine N-terminale Extension um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glu und Asp besteht. X&sup4; kann eine Sequenz von 1-6 Aminosäuren darstellen, insbesondere 1-4 Aminosäuren, und kann jede der oben angegebenen Bedeutungen haben. Besonders bevorzugte Bedeutungen von X&sup4; sind Glu-Leu und Glu-Leu-Asp-Leu.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung wird weiter offenbart in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, wobei
  • Fig. 1 die DNA- und Aminosäuresequenz von Aprotinin(1-58) zeigt. Die versetzten Linien, die in der DNA-Sequenz dargestellt sind, geben Stellen an, an denen Duplizes, die aus synthetischen Oligonukleotiden gebildet sind, ligiert wurden.
  • Fig. 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pKFN-802 und pKFN-803.
  • Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Plasmid pKFN-849 und pKFN-855.
  • Fig. 4 zeigt die DNA-Sequenz eines 406 bp langen EcoRI XbaI-Fragmentes aus pKFN-849 und pKFN-855. Der Pfeil gibt die Stelle an, an der proteolytische Spaltung während der Sekretion stattfindet.
  • Fig. 5A und 5B zeigen die Inhibition von Trypsin bzw. Plasmin durch Aprotinin; bezeichnet Rinder-Pancreas-Aprotinin, X bezeichnet GluLeu-Aprotinin und Δ bezeichnet GluLeuAspLeu-Aprotinin.
  • Fig. 6 zeigt die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858.
  • Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz eines 412 bp langen EcoRI XbaI-Fragmentes aus pKFN-852 und pKFN-858. Der Pfeil bezeichnet die Stelle, an der proteolytische Spaltung während der Sekretion auftritt.
  • Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid pKFN-995 und pKFN-998.
  • Fig. 9 zeigt die DNA-Sequenz eines 412 bp langen EcoRI XbaI-Fragmentes aus pKFN-995 und pKFN-998. Der Pfeil bezeichnet die Stelle der proteolytischen Spaltung während der Sekretion.
  • Fig. 10 zeigt die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003.
  • Fig. 11 zeigt die DNA-Sequenz eines 412 bp langen EcoRI XbaI-Fragmentes aus pKFN-1000 und pKFN-1003. Der Pfeil bezeichnet die Stelle, an der proteolytische Spannung während der Sekretion stattfindet.
  • Fig. 12 zeigt die DNA-Sequenz eines synthetischen Aprotinin(3-58)-Gens. Die versetzten Linien innerhalb der Sequenz geben die Stellen an, an denen fünf Duplizes, gebildet aus 10 synthetisierten Oligonukleotiden, ligiert werden.
  • Fig. 13 zeigt die Konstruktion von Plasmid pKFN-305 und pKFN-374/375.
  • Fig. 14 zeigt die Konstruktion von Plasmid pMT-636.
  • Fig. 15 zeigt die Konstruktion von Plasmid plac-240.
  • Fig. 16 zeigt die DNA-Sequenz des modifizierten Leader-Insulinvorläufer-Gens aus plac-240.
  • Fig. 17 zeigt die DNA-Sequenz eines 508 bp langen EcoRIxbax-Fragmentes aus pKFN-458, die den MFα1-Signal- Leader(1-85) und Insulinanalog-Vorläufer B(1-29, 1Glu+27Glu) -AlaAaLays-A(1-21) kodiert.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Produktion von Glu-Leu-Adrotinin(1-58) aus Hefestamm KFN-837 a) Konstruktion von Plasmid pKFN-802
  • Ein synthetisches Gen, das für Aprotinin(1-58) kodiert, wurde aus 10 Oligonukleotiden durch Ligation konstruiert.
  • Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie auf einem Glasträger mit gesteuerter Porengröße synthetisiert (Beaucage, S.L., und Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22, (1981) 1859-1869).
  • Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden synthetisiert:
  • 5 Duplizes A - E wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet, wie in Fig. 1 dargestellt.
  • 20 pMol von jedem der Duplizes A - E wurden äus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden durch Erhitzen für 5'min. bei 90ºC, gefolgt von Abkühlung auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 min., gebildet. Die funf Duplizes wurden vermischt und mit T&sub4;-DNA-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als eine 191 bp-Bande nach Elektrophorese der Ligationsmischung auf einem 2 %igen Agarosegel isoliert. Das erhaltene synthetische Gen ist in Fig. 1 dargestellt.
  • Das synthetische Gen wurde an ein 209 bp langes EcoRI-NcoI- Fragment aus pLac212spx3 und an das 2,7 kb lange EcoRI-XbaI- Fragment von Plasmid pUC19 ligiert (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. und Messing, J., Gene 33 (1985), 103-119). Plasmid pLac212spx3 ist in Beispiel 3 der Internationalen Patentanmel dung, Veröffentlichungs Nr. WO 89/02463 beschrieben.
  • Das 209 bp lange EcoRI-NcoI-Fragment aus pLa212spx3 kodiert ein synthetisches Hefe-Leaderpeptid.
  • Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten Ecoli--Stamm (r&supmin;, m&spplus;), der auf Ampicillinresistenz selektioniert, zu transformieren. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499-560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die richtige DNA-Sequenz für Aprotinin(1-58) enthielten.
  • Ein Plasmid pKFN8O2 wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN8O2 ist in Fig. 2 veranschaulicht.
  • b) Konstruktion der Plasmide pKFN-849, pKFN-855 und Hefestamm KFN-837.
  • Das 3,0 kb lange NcoI,-Stui-Fragment von pKFN-802 wurde an das synthetische Fragment NOR-790/791 mit T&sub4;-DNA-Ligase ligiert:
  • Die Ligationsmischung wurde mit dem Restriktionsenzym StuI verdaut, um jeglichen Hintergrund von pKFN-802 zu reduzieren, und die resultierende Mischung wurde verwendet, um einen kompetenten E coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;), der auf Ampicillinresistenz selektioniert, zu transformieren. Es wurde durch DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S., und Coulson, A.R., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) gezeigt, daß Plasmid pKFN-849 aus einer der resultierenden Kolonien die DNA-Sequenz für Glu-Leu-Aprotinin(1-58) richtig gebunden an das synthetische Hefe-Leader-Gen enthielt. Die Konstruktion von pKFN-849 ist in Fig. 3 veranschaulicht.
  • pKFN-849 wurde mit EcoRI und XbaI geschnitten und das 406 bp lange Fragment wurde an das 9,5 kb lange NcoI-XbaI-Fragment aus pMT636 und das 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert, was zu Plasmid pKFN-855 führte, siehe Fig. 3. Plasmid pMT636 ist in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DKBS/00138 beschrieben.
  • pMT636 ist ein E. coli-S cerevisiae-Pendelvektor, der das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT) (Russell, P.R., Gene 40 (1985), 125-130), den S. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator, TPIP und TPIT (Alber, T., und Kawasaki, G. J.Mol.Appl.Gen. 1 (1982), 419-434) enthält. Plasmid pKFN-855 enthält die folgende Sequenz:
  • TPIP-LaC212spx3-Signal-Leader-Glu-Leu-Aprotinin (1-58) -TPIT,
  • in der tac212spx3-Signal-Leader der synthetische Hefe-Leader ist, der in der Internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichungs Nr. WO 89/02463 beschrieben ist. Die DNA-Sequenz des 406 bp langen EcoRI-XbaI-Fragmentes von pKFN-849 und pKFN-855 ist in Fig. 4 dargestellt.
  • S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-78 XE11-36 a/α, Δtpi Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefeextrakt, 2 % Bacto-Pepton, 2 % Galactose, 1 % Lactat) bis zu einer O.D. bei 600 nm von 0,6 gezüchtet.
  • 100 ml Kultur wurden mit Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH = 8,0 und 6,7 mg/ml Dithiotreit enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wurden erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10,InM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym 234 enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS erneut suspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml erneut in CAS suspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN-855 vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml von (20 % Polyethylenglykol 4000, 20 mM CaCl&sub2;, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet erneut in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33 % vlv YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) suspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981)), das 1,2 M Sorbit plus 2,5 % Agar enthält) bei 52ºC zugegeben und die Suspension oben auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, Sorbit enthaltende Medium enthielten. Transformante Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC ausgewählt, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten. Ein solcher Transformant KFN-837 wurde für weitere Charakterisierung ausgewählt.
  • Hefestamm KFN-837 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton (von Difco Laboratories) und 6 % Glucose) gezüchtet. Eine 200 ml-Kultur des Stammes wurde bei 250 UPM bei 30ºC für 3 Tage bis zu einer O.D. bei 600 nm von 20 gerüttelt (Trockenhefebiomasse 18,8 g/Liter). Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch FPLC-Ionenaustauschchromatographie analysiert.
  • Der Hefeüberstand wurde durch eine 0,22 um Millex-GV-Filtereinheit filtriert und 1 ml wurde auf eine Monos-Kationenaustauschsäule (0,5 x 5 cm), äquilibriert mit 20 nim Bicine, pH = 8,7, aufgebracht. Nach Waschen mit Äquilibrationspuffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-1 M) in Aquilibrationspuffer eluiert. Trypsin-Inhibitor-Aktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrophotometrische Tests quantifiziert (Kassel, B., Methods Enzvmol. 19 (1970), 844-852) und außerdem durch Integration der Absorption bei 280 nm aus (Aprotinin)
  • Die Ausbeute betrug 120 mg/Liter Glu-Leu-Aprotinin(1-58).
  • Für Aminosäureanalyse und N-terminale Sequenzierung wurde die Konzentration und weitere Reinigung des gradienteneluierten Glu-Leu-Aprotinins(1-58) mit HPLC auf einer Umkehrphasensäule (Vydac C4, 4,6 x 250 mm) durchgeführt. Elution wurde mit einem CH&sub3;CN-Gradienten in 0,1% TFA durchgeführt. Die gesammelten Fraktionen wurden durch Vakuumzentrifugation auf etwa 100 ul konzentriert und Proben wurden für N-terminale Sequenzierung und Aminosäureanalyse abgenommen.
  • Durch N-terminale Sequenzierung wurde die folgende Sequenz gefunden:
  • Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-x Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala,
  • was bestätigt, daß das N-terminale Ende richtig ist. Halbcysteinreste werden mit diesem Verfahren nicht bestimmt, was in Übereinstimmung mit den Leerperioden (X) steht, die für die Reste Nr. 7 und 16 erhalten wurden.
  • Die Aminosäureanalyse ist in Tabelle 1 dargestellt. Aus dieser Tabelle wird deutlich, daß das Produkt die erwartete Aminosäurezusammensetzung besitzt, d.h. mehr Glu und Leu. Der leicht gesenkte Gehalt an Ile kann höchstwahrscheinlich unvollständiger Hydrolyse von Ile(18)-Ile(19) (die in der Technik gut bekannt ist) zugeschrieben werden. Auch ist Arg geringfügig höher als erwartet. Dies kann man jedoch auch bei nativem Aprotinin sehen (Tabelle 1, dritte Spalte).
  • Wenn mit dem oben erwähnten Verfahren von Kassel verglichen, wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Glu-Leu- Aprotinin(1-58) innerhalb des experimentellen Fehlers der spezifischen Aktivität von nativem Aprotinin identisch ist. Die Trypsin- und Plasmin-Inhibition durch Glu-Leu-Aprotinin(1-58), bezogen auf Titrationskurven, die bestimmt wurden, wie unten beschrieben, waren ununterscheidbar von derjenigen von Rinder- Pancreas-Aprotinin (Aprotinin Novo). Nach Inkubation des Enzyms mit Aprotinin oder seinen Analogen für 30 Minuten wurden 9,6 mM 52251 (Kabivitrum) hinzugegeben und die Aktivität als die Geschwindigkeit der Nitroanilin-Produktioil gemessen. Die Aktivität als eine Funktion der Aprotininkonzentration ist in Fig. 5A und SB aufgetragen. Vollständige Inhibition beider Enzyme mit allen drei Inhibitoren wurde beobachtet.
    • Beispiel 2 Produktion von Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) aus Hefestamm KFN-840
  • Ein synthetisches Gen, das Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(i-58) kodiert, wurde konstruiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das synthetische Fragment NOR-793/794 wurde anstelle von NOR- 790/791 verwendet:
  • Das von pUC19 abgeleitete Plasmid pKFN-852 wurde in einer ähnlichen Weise konstruiert wie pKFN-849.
  • Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Plasmid pKFN-858 erhalten, das die folgende Konstruktion enthielt:
  • TPIP-Lac212spx3-Signal-Leader-GluLeuAspLeu-Aprotinin (1-58)-TPIT
  • Die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858 ist in Fig. 6 veranschaulicht. Die DNA-Sequenz des 412 bp langen Eco- RI-XbaI-Fragmentes aus pKFN-852 und pKFN-858 ist in Fig. 7 angegeben.
  • Plasmid pKFN-858 wurde in Hefestarrim MT663 transformiert, wie oben beschrieben, was zu Hefestamm KFN-840 führte.
  • Eine 200 ml-Kultur von KFN-840 in YPD-Medium wurde bei 250 UPM bei 30ºC für 3 Tage bis zu einer O.D. bei 600 nm von 18 gerüttelt (Trockenbiomasse 16,7 mg/Liter). FPLC-Ionenchromatographie des Überstands, wie oben beschrieben, ergab eine Ausbeute von 90 mg/Liter Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin (1-58).
  • Die Aminosäureanalyse ist aus Tabelle 1 zu ersehen und bestätigt die erwartete Aminosäurezusammensetzung.
  • Die Trypsin- und Plasmin-Inhibitionstitrationskurven von Glu- Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) waren ununterscheidbar von derjenigen von Rinder-Pancreas-Aprotinin (Aprotinin Novo), siehe Fig. 5A und 58.
    • Beispiel 3 Produktion von Adrotinin(1-58) aus Hefestamm KFN-1006
  • Plasmid pKFN-995 wurde aus pKFN-802 durch Ligation des 3,0 kb langen NcoI-Stui-Fragmentes an das synthetische Fragment NOR- 848/849 konstruiert:
  • Die Ligationsmischung wurde mit dem Restriktionsenzym BalI verdaut, um jeglichen Hintergrund von pKFN-802 zu reduzieren.
  • Das Hefe-Expressionsplasmid pKFN-998 wurde im wesentlichen konstruiert, wie in Beispiel 1 beschrieben und in Fig. 8 dargestellt:
  • TPIP-Lac212spx3-Signal-Leader (1-47) -Lys-Glu-Leu-Glu(Lys-Arg)- Aprotinin (1-58)-TPIT.
  • Die DNA-Sequenz des 412 bp langen EcoRI-XbaI-Fragmentes aus pKFN-995 und pKFN-998 ist in Fig. 9 angegeben.
  • Plasmid pKFN-998 wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie beschrieben in Beispiel 1, was zu Hefestamm KFN-1006 führte. Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1006 in YPD-Medium und Analyse auf Aprotinin(1-58) im Überstand wurde durchgeführt, wie oben beschrieben.
  • Die Ausbeute betrug 30 mg/Liter Aprotinin(1-58).
  • Die Aminosäureanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung.
    • Beispiel 4 Produktion von Aprotinin(1-58) aus Hefestamm KFN-1008
  • Das von pUC abgeleitete Plasmid pKFN-1000 wurde konstruiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Ligation des 3,0 kb langen NcoI-Stui-Fragmentes von pKFN-802 an das synthetische Fragment NOR-850/851:
  • Unter Befolgung der Vorgehensweise der Beispiele 1 und 3 wurde ein Hefe-Expressionsplasmid pKFN-1003 erhalten, das die folgende Konstruktion enthält:
  • TPIP-Lac212spx3-Signal-Leader (1-47)-GluArgLeuGlu(Lys-Arg)-Aprotinin(1-58) TPIT.
  • Die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003 ist in Fig. 10 veranschaulicht. Die DNA-Sequenz des 412 bp langen EcoI-XbaI-Fragmentes aus pKFN-1000 und pKFN-1003 ist in Fig. 11 angegeben.
  • Plasmid pKFN-1003 wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie oben beschrieben, was zu Hefestamm KFN-1008 führte.
  • Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1008 in YPD-Medium und Analyse auf Aprotinin(1-58) im Überstand wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Ausbeute betrug 120 mg/Liter Aprotinin(1-58).
  • Die Aminosäureanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung. Zusätzlich wurde Bestätigung der vollständigen Primärstruktur durch Gasphasensequenzierung des reduzierten, pyridylethylierten Polypeptids erhalten.
  • Außerdem war die spezifische inhibitorische Aktivität des rekombinanten Aprotinins(1-58) gegen Trypsin ununterscheidbar von derjenigen von Rinder-Pancreas-Aprotinin.
    • Beispiel 5 Produktion von Adrotinin(1-58) aus Hefestamm KFN-783
  • Plasmid pKFN-802 (vgl. Beispiel 1) wurde mit EcoRI und XbaI geschnitten und das 400 bp lange Fragment wurde an das 9,5 kb lange NcoI-XbaI-Fragment aus pMT636 und das 1,4 kb lange NcoI- EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert, was zu Plasmid pKFN-803 führte, siehe Fig. 2. pKFN-803 enthält die folgende Konstruktion:
  • TPIP-Lac212spx3-Signal-Leader-Aprotinin (1-58)-TPIT.
  • Plasmid pKFN-803 wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie oben beschrieben. Kultivieren des transfomierten Stammes KFN- 783 in YPD-Medium und FPLC-Ionenchromatographie des Überstandes wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Aprotinin(1-58) wurde durch Vergleich mit Chromatographie einer standardisierten Lösung von authentischem Aprotinin, gereinigt aus Rinder- Pancreas, quantifiziert. Die Ausbeute an Aprotinin(1-58)lag unter 1 mg/Liter. Tabellel
    • Beispiel 6 Produktion von Adrotinin(3-58)
  • Ein synthetisches Gen für Aporotinin(3-58) wurde aus einer Anzahl von Oliginukleotiden durch Ligation konstruiert.
  • Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden synthetisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben:
  • 5 Duplizes A - E wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet, wie in Fig. 12 dargestellt.
  • 20 pMol von jeder der Duplizes A - E wurden aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierter Oligonukleotiden I-X durch Erhitzen für 5 min. bei 90ºC, gefolgt von Abkühlung auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten, gebildet. Die fünf Duplizes wurden vermischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als eine 176 bp-Bande nach Elektrophorese der Ligationsmischung auf einem 2 %igen Agarosegel isoliert. Das erhaltene synthetische Gen ist in Fig. 12 dargestellt.
  • Das synthetische, 176 bp lange Gen wurde an ein 330 bp langes EcoRI-HgaI-Fragment aus Plasmid pKFN-9, das für die S. cerevisiae-Reifungsfaktor-α1-Signal-Leader (1-85)-Sequenz kodiert (Markussen, J. et al., Protein-Engineering 1 (1987), 215-223) und an das 2,7 kb lange EcoRI-XbaI-Fragment aus pUC19 (Yanish- Perron, C., Vieira, J. und Messing, J., Gene 33 (1985), 103- 119) ligiert. Die Konstruktion von pKFN-9, das eine HgaI-Stelle unmittelbar nach der MFα1-Leadersequenz enthält, ist beschrieben in EP 214 826.
  • Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;), derauf Ampicillinresistenz selektioniert, zu trans formieren. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499-560) zeigte, daß die Plasmide aus den resultierenden Kolonien die richtige DNA-Sequenz für Aprotinin(3-58) enthielten.
  • Ein Plasmid pKFN305 wurde.zur weiteren Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN305 ist in Fig. 13 veranschaulicht.
  • pKFN305 wurde mit EcoRI und XbaI geschnitten und das 0,5 kb lange Fragment wurde an das 9,5 kb lange NcoI-XbaI-Fragment von pMT636 und das 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert, was zu Plasmid pKFN374 führte, siehe Fig. 13. Plasmid pMT636 wurde aus pMT608 nach Deletion des Leu-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Fig. 14. pMT608 ist in EP 195 691 beschrieben. pMT479 ist in EP 163 529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT), den S. cere visiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator, TPIP und TPIT (Alber, T. und Kawasaki, G.J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434). Plasmid pKFN374 enthält die folgende Sequenz:
  • TPIP-MFα1-Signal-Leader (1-85) -Aprotinin (3-58) TPIT,
  • in der MFα1 die S. cerevisiae-Reifungsfaktor-Alphai-Kodierungssequenz (Kurjan, J. und Herskowitz, 1., Cell 30 (1982), 933-943) ist, Signal-Leader(1-85) bedeutet, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFα1-Signal-Leader-Sequenz enthält, und Aprotinin(3-58) die synthetische Sequenz ist, die ein Aprotininderivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäurereste fehlen.
  • S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-78 XE11-36 a/α, ΔtpiΔtpi, pep 4- 3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefeextrakt, 2 % Bacto- Bepton, 2 % Galactose, 1 % Lactat) bis zu einer O.D. bei 600 von 0,6 gezüchtet.
  • 100 ml der resultierenden Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH = 8,0 und 6,7 mg/ml Dithiotreit enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen in 10 ml einer Lösung, die 1,2 M Sorbit, 10 InM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym 234 enthielt, erneut suspendiert. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 ml CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS erneut suspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml in CAS erneut suspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN374 vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml von (20 % Polyethylenglykol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurden zugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33 % v/v YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) erneut suspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratones, 1961), das 1,2 M Sorbit plus 2,5 % Agar enthält) bei 52ºC zugegeben und die Suspension oben auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, Sorbit enthaltende Medium enthielten. Transformante Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC ausgewählt, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten. Ein solcher Transformant KFN322 wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
  • Hefestamm KFN322 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % ?epton (von Difco Laboratories) und 2 % Glucose) gezüchtet. Eine 10 ml-Kultur des Stammes wurde bei 30ºC bis zu einer O.D. bei 600 nm von 32 gerüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand mit FPLC-Ionenaustauschchromatographie analysiert. Der Hefeüberstand wurde durch eine 0,22 um-Millex GC-Filtereinheit filtriert und 1 ml wurde auf eine Monos-Kationenaustauschsäule (0,5 x 5 cm), äquilibriert mit 20 mM Bicine, pH = 8,7, aufgebracht. Nach Waschen mit Äquilibrationspuffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Trypsin-Inhibitor-Aktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrophotometrischen Test und außerdem durch Integration der Absorption bei 280 nm aus (Aprotinin)
  • quantifiziert.
  • Die Ausbeute betrug etwa 3 mg/Liter Aprotinin(3-58)
    • Beispiel7 Produktion des Insulinvorläufers B(1-29)-Alaalalvs-A(1-21) aus Hefestamm LaC1667
  • Das 589 bp lange SphI-NcoI und das 172 bp lange HpaI-XbaI- Fragment wurden aus pLa212spx3 (beschrieben in WO 89/02463) isoliert. Diese Fragmente wurden mit dem synthetischen Adaptor
  • und dem 10 kb langen XbaI-SphI-Fragment aus pMT743 (beschrieben in WO 89/02463) verknüpft, was zum Plasmid pLaC240 führte (siehe Fig. 15). Die DNA-Sequenz des modifizierten Leader-Insulinvorläufer-Gens aus pLaC240 ist in Fig. 16 dargestellt.
  • Transformation von Hefestamm MT663 mit Plasmid pLaC240 führte zu einem Insulinvorläufer-sekretierenden Stamm, LaC1667 (MT663/pLaC240), dessen Produktivität 165 % beträgt, relativ zum Stamm LaC1414 (MT663/pLa212spx3), der das Gen für den nicht-modifizierten Leader-Insulinvorläufer enthält, beschrieben in WO 89/02463.
    • Beispiel 8 Produktion von Insulinanalog-Vorläufer B(1-29. 1Glu+27Glu)-Ala- Alalvs-A(1-21) aus Hefestamm KFN-470
  • Durch Ligation von 10 Oligonukleotiden wurde ein synthetisches Gen konstruiert, das für den Insulinanalog-Vorläufer B(1- 29, 1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) kodiert. B(1-29, 1Glu+27Glu) bezeichnet das Polypeptid, das die ersten 29 Aminosäurereste der B-Kette von Humaninsulin enthält, in der die B1Phe- und B27Thr-Reste durch Glu-Reste ersetzt worden sind. A(1-21) ist die A-Kette von Humaninsulin. Ein Tripeptid, AlaAlalys, verbindet den B29Lys-Rest mit dem A1Gly-Rest.
  • Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden synthetisiert:
  • 5 Duplizes wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet und die Duplizes wurden in einer ähnlichen Art und Weise ligiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Das synthetische, 178 bp lange Gen wurde an das 330 bp lange EcoRI-HgaI-Fragment von pKFN-9, das die S. cerevisiae-Reifungsfaktor-αl-Signal-Leader(1-85) -Sequenz kodiert (Markussen, J. et al., Protein Engineering 1 (1987), 215-223), und an das 2,7 kb lange EcoRI-XbaI-Fragment von Plasmid pUC19 (Yanisch- Perron, C., Vieira, J. und Messing, J., Gene 33 (1985), 103- 119) ligiert.
  • Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;), der auf Ampicillinresistenz selektioniert, zu trans formieren. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499-560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die richtige DNA-Se4uenz für den Insulinanalog-Vorläufer enthielten.
  • Ein Plasmid pKFN-456 wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt.
  • Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Hefe-Expressionsplasmid pKFN-458 erhalten, das die folgende Expressionskassette enthielt:
  • TPIP-MFα1-Signal-Leader(1-85)-B(1-29, 1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A (1-21)-TPIT.
  • Die DNA-Sequenz des 508 bp langen EcoRI-XbaI-Fragmentes aus pKFN-456 und pKFN-458 ist in Fig. 17 angegeben.
  • Plasmid pKFN-458 wurde in Hefestamm MT-663 transformiert, wie oben beschrieben, was zu Hefestamm KFN-470 führte.
  • Kultivieren des transformierten Stammes KFN-470 in YPD-Medium wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Ausbeute an Insulinanalog-Vorläufer im Überstand wurde mit HPLC bestimmt, wie beschrieben (L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987), 329-332).
  • In Tabelle 2 werden die Expressionsniveaus der Insulinanalog- Vorläufer B(1-29, 1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) und B(1- 29,27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) und des Insulinvorläufers B(1-29)- AlaAlaLys-A(1-21) verglichen. Alle drei Vorläufer wurden exprimiert im selben Wirtsstamm, MT-663, transformiert mit den S. pombe-TPI-Gen enthaltenden Plasmiden mit der Expressionskassette:
  • TPIP-MFα1-Signal-Leader (1-85) -Vorläufer-TPIT.
    • Tabelle 2 Expressionsniveaus von Vorläufern von Insulin und Insulinanalogen in Hefe-Transformanten
  • * Die Expressionsniveaus sind angegeben als ein Prozentanteil des Expressionsniveaus des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAla- Lys-A(1-21), der willkürlich auf 100 % festgesetzt ist.

Claims (44)

1. Ein Polypeptid, das eine Fusion eines Signalpeptids, eines Leaderpeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids umfaßt, wobei das Polypeptid in seiner Aminosäuresequenz benachbart zu einer Hefe-Verarbeitungsstelle, die zwischen dem C-terminalen Ende des Leaderpeptids und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins angeordnet ist, modifiziert ist, um für eine Präsentation der Verarbeitungsstelle zu sorgen, die diese proteolytischer Spaltung zugänglich macht, wobei das Polypeptid die folgende Struktur besitzt
Signalpeptid-Leaderpeptid-X¹-X²-X³-X&sup4;-heterologes Protein,
worin X¹ eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die identisch oder verschieden sein können,
X² und X³ identisch oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Lys und Arg besteht, wobei X¹ und X&sup4; zusammen eine Hefe- Verarbeitungsstelle definieren, und
X eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die identisch oder verschieden sein können,
mit der Maßgabe, daß X¹ und/oder X&sup4; eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine der Aminosäuren, die durch X¹ und/oder X&sup4; dargestellt sind, eine negativ geladene Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glu und Asp besteht, und mit der weiteren Maßgabe, daß, wenn X¹
eine Peptidbindung ist, X&sup4; nicht Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu- Ala-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg oder Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp ist, und daß,wenn X&sup4; eine Peptidbindung ist, X¹ nicht Ser-Leu-Asp ist, und mit der weiteren Maßgabe, daß das Signalpeptid -Leaderpeptid - X¹ nicht ist:
α-Faktor Signal und Leader (1-85)-Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp,
α-Faktor Signal und Leader (1-80)-Pro-Leu-Asp,
α-Faktor Signal und Leader (1-80)-Gln-Leu-Asp,
Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-S er-Ala-Tyr-Ser-Arg- Ser-Leu-Asp.
2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ Glu oder Asp darstellt.
3. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ eine Sequenz von zwei Aminosäuren mit der Struktur BA darstellt, worin A Glu oder Asp ist und B Glu, Asp, Val, Gly oder Leu ist.
4. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ eine Sequenz von drei Aminosäuren mit der Struktur CBA darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg oder Lys ist.
5. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ eine Sequenz von vier Aminosäuren mit der Struktur DCBA darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
6. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ eine Sequenz von fünf Aminosäuren mit der Struktur EDCBA darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
7. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ eine Sequenz von sechs Aminosäuren mit der Struktur FEDCBA darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
8. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; Glu oder Asp ist.
9. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; eine Sequenz von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin A Glu oder Asp ist und B Glu, Asp, Val, Gly oder Leu ist.
10. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; eine Sequenz von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg oder Lys ist.
11. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; eine Sequenz von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
12. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; eine Sequenz von fünf Aminosäuren mit der Struktur ABCDE darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
13. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X&sup4; eine Sequenz von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
14. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei, wenn X¹ und/oder X&sup4; > 1 Aminosäure darstellen, die unmittelbar zu X² benachbarte Aminosäure Glu oder Asp ist, die unmittelbar zu X³ benachbarte Aminosäure Glu oder Asp ist oder beide Glu oder Asp sind.
15. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei, wenn X¹ und/oder X&sup4; > 1 Aminosäure darstellen, entweder X¹ oder X&sup4; oder beide mehr als ein Glu oder Asp umfassen.
16. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X¹ und X&sup4; beide ≥1 Aminosäure darstellen.
17. Ein Polypeptid nach Anspruch 16, wobei X¹ und X&sup4; symmetrisch identisch sind.
18. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei, wenn X&sup4; eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, eine zusätzliche Verarbeitungsstelle zwischen X&sup4; und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins vorgesehen ist.
19. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Signalpeptid das α-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid von Mäuse-Speichelamylase, das Carboxypeptidase-Signalpeptid oder das Hefe-BAR1- Signalpeptid ist.
20. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Leaderpeptid ein natürliches Leaderpeptid ist, wie etwa das α-Faktor-Leaderpeptid.
21. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid ist, wie etwa
22. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das heterologe Protein oder Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Aprotinin oder anderen Protease-Inhibitoren, Insulin und Insulinvorläufern, Human- oder Rinder-Wachstumshormon, Interleukm, Gewebeplasminogenaktivator, Glucagon, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, platelet derived growth factor, Enzymen und einem funktionalen Analog von irgendeinem dieser Proteine besteht.
23. Ein Polypeptid nach Anspruch 22, wobei das heterologe Protein oder Polypeptid Aprotinin oder ein funktionales Analog desselben ist.
24. Ein Polypeptid nach.Anspruch 23, wobei X¹ Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-Glu ist.
25. Ein Polypeptid nach Anspruch 23, wobei X&sup4; Glu-Leu oder Glu- Leu-Asp-Leu ist.
26. Ein Polypeptid nach Anspruch 22, wobei das heterologe Protein oder Polypeptid.Insulin oder ein Insulinvorläufer oder ein funktionales Analog derselben ist.
27. Ein Polypeptid nach Anspruch 26, wobei X¹ Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-Glu ist.
28. Ein Polypeptid nach Anspruch 26, wobei X&sup4; Glu ist.
29. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 - 28, wobei das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulin-Vorläufer B(1- 29)-AlaAlaLys-A(1-29) ist und wobei X¹ Lys-Glu-Leu-Glu ist.
30. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 - 28, wobei das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulin-Vorläufer B(1- 29)-SerAspAspAlaLys-A(i-29) ist und wobei X¹ Lys-Glu-Leu-Glu ist.
31. Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 - 30 kodiert.
32. Ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 31, das die in Fig. 4, 7, 9 oder 11 dargestellte DNA-Sequenz oder eine geeignete Modifikation derselben umfaßt.
33. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der zur Replikation in Hefe in der Lage ist und der ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 31 oder 32 trägt.
34. Ein Hefestamm, der zur Expression eines heterologen Proteins oder Polypeptids in der Lage ist und der mit einem Vektor nach Anspruch 33 transformiert ist.
35. Ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids in Hefe, welches umfaßt, daß ein Hefestamm nach Anspruch 34 in einem geeigneten Medium kultiviert wird, um Expression und Sekretion/Verarbeitung des heterologen Proteins oder Polypeptids zu erreichen, woraufhin das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
36. Ein Aprotinin-Analog der allgemeinen Formel X&sup4;-Aprotinin(1- 58), worin X eine N-terminale Extension um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glu und Asp besteht.
37. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; Glu oder Asp ist.
38. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; eine Sequenz von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin A Glu oder Asp ist und B Glu, Asp, Val, Gly oder Leu ist.
39. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; eine Sequenz von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg oder Lys ist.
40. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; eine Sequenz von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
41. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; eine Sequenz von fünf Aminosäuren mit der Struktur ABCDE darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
42. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; eine Sequenz von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F dieselben Bedeutungen wie C besitzt.
43. Ein Polypeptid nach Anspruch 36, wobei, wenn X&sup4; > 1 Aminosäure darstellt, X&sup4; mehr als ein Glu oder Asp umfaßt.
44. Ein Analog nach Anspruch 36, wobei X&sup4; Glu-Leu oder Glu-Leu- Asp-Leu ist.
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