JPH04504846A - プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシングシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシン グシステム発明の分野 本発明は酵母において発現されそしてプロセス化されたポリペプチド、このよう なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、このようなりＮＡ フラグメントを有するベクターおよびベクターで形質転換された酵母細胞ならび に酵母における異種タンパク質の産生方法に関する。

本発明の背景 酵母微生物は細胞内で合成されるが細胞外で機能を有する多数のタンパク質を産 生ずる。このような細胞外タンパク質は分泌タンパク質と呼ばれてる。これらの 分泌タンパク質は最初に、小胞体（ＥＲ）の膜を発現物質が通過する効果的方向 性を確実にする予備配列を含む前駆体またはプレータンパク質形にて細胞内で発 現される。普通シグナルペプチドと呼ばれる予備配列は、一般に移動する間に所 望の生成物から切断される。一度分泌経路に入ると、タンパク質はゴルジ装置へ 運ばれる。ゴルジ体からタンパク質はたとえば細胞の液胞または細胞膜のような 小室へ導ひく異なった経路をたどるか、または細胞外への経路を通って外側培地 へ分泌される（ペッツ７−、ニス、アール、　Ｐｆｅｆｆｅｒ、Ｓ、Ｒ，および ロスマン、ジ工イ、イー、　Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｊ、Ｅ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、５６（１９８７）、８２９−８５２）。

酵母と異なるタンパク質の酵母における発現および分泌について幾つかのアプロ ーチが提案されてきている。ヨーロッパ公開特許出願第００８８６３２Ａ号には 、酵母微生物を所望のタンパク質およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡを 有する発現ビヒクルで形質転換し、形質転換された微生物の培養物を調製し、培 養物を増殖し、培地からタンパク質を回収することにより、酵母と異なるタンパ ク質を発現し、プロセス化しそして分泌する方法が記載されている。シグナルペ プチドは所望するタンパク質自身のシグナルペプチド、異種シグナルペプチドま たは天然および異種シグナルペプチドのハイブリッドでもよい。

酵母と異なるシグナルペプチドを使用すると遭遇する問題は、異種シグナルペプ チドが有効な移動および／またはシグナルペプチド後の切断を保証しないという ことである。

サツカロミセス　セレヴイシアｘ　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＦα１　 （α−ファクター）は、１９個のアミノ酸長さのシグナルまたはプレペプチドと これに続く６４個のアミノ長さの“リーダー”またはプロペプチドからなり、３ つのＮ−結合グリコシル化部位とこれに続＜　（ＬｙｓＡｒｇ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ 、　Ａｌａ）ｚ−３α−ファクター）４を包含する１６５個のアミノ酸のプレプ ロ形として合成される（クルシャン、ジェイ、Ｋｕｒｊａｎ、Ｊ、ｂよびヘルス コウィッッ、アイ、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１．Ｃｅ１ｌ　３０（１９８２）、 ９３３−９４３）。プレプロＭＦα１のシグナル−リーダ一部は、サツカロミセ ス　セレヴイシアエにおける異種タンパク質の合成および分泌を得るのに広く使 用されている。

酵母と同じシグナル／リーダーペプチドの使用は別の米国特許第４．５４６．０ ８２号明細書、ヨーロッパ公開特許出願第０１１６２０１Ａ号、同第０１２３２ ９４Ａ号、同第０１２３５４４Ａ号、同第０１６３５２９Ａ号および同第０１２ ３２８９Ａ号およびＤＫ特許第２４８４／８４号および同第３６１４／８３号明 細書から公知である。

ＥＰ　０１２３２８９Ａ号では、サツカロミセス　セレヴイシアエａ−ファクタ ー前駆体の使用が記載されており、一方ＤＫ　２５８４／８４号にはサツカロミ セス　セレヴイシアエ　インベルターゼシグナルペプチドの利用について記載さ れており、ＤＫ　３６１４／８３号には外来タンパク質の分泌のためにサツ力ロ ミセスセレヴイシアエＰ）１０５シグナルペプチドの利用が記載されている。

米国特許第４．５４６．０８２号明細書、ＥＰ第００１６２０１Ａ号、同第０１ ２３２９４Ａ号、同第０１２３５４４Ａ号および同第０１６３５２９Ａ号には、 サツカロミセス　セレヴイシアエからのα−ファクター　シグナル−リーダー（ ＭＦα１またはＭＦα２）を酵母において発現される異種タンパク質の分泌方法 に利用する方法が記載されている。所望タンパク質に対する遺伝子の５′末端に サツカロミセス　セレヴイシアエ　ＭＦα１　シグナル／リーダー配列をコード するＤＮＡ配列を融合することにより所望タンパク質の分泌およびプロセッシン グが示された。

ＥＰ　２０６，７８３号にはサツカロミセス　セレヴイシアエからのポリペプチ ドの分泌システムについて記載されており、これによればα−ファクターリーダ ー配列の一部を切断して天然リーダー配列に存在する４つのα−ファクターペプ チドを除きこれによりα−ファクタープロセッシング部位ＬｙｓＡｒｇＧ１ｕＡ １ａＧ１ｕＡ１ａを介して異種ポリペプチドが融合したリーダーペプチド自体を 残しておく。この構築は、より小さいペプチド（アミノ酸５０個未満）の有効な プロセスを導びくことを示唆する。より大きなポリペプチドの分泌およびプロセ ッシングについては、天然α−ファクターリーダー配列の一部を切断してリーダ ーペプチドとポリペプチド間の１または２個のα−ファクターペプチドをそのま まにしておく。

多数の分泌されたタンパク質は、連続する２つの塩基性アミノ酸のカルボキシ末 端でペプチド結合を切断するタンパク質分解プロセッシング系にさらされるよう な経路を通る。この酵素活性はサツカロミセス　セレヴイシアエにおいてＫＥｘ ２遺伝子によりコード化される（ジュリウス、ディー、ニー、らＪｕｌｉｕｓ、 Ｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　３７（１９８４ｂ）、１０７５）　。ＫＥＸ ２遺伝子生成物による生成物のプロセッシングは、活性なサツカロミセス　セレ ヴイシアエ成熟ファクターα１　（ＭＦα１またはα−ファクター）の分泌に必 要であるがしかし活性サツカロミセス　セレヴイシアエ成熟ファクターａの分泌 には関連しない。

分泌が意図されるポリペプチドの分泌および正しいプロセッシングは、上述の参 考文献に示したように構築されたベクターで形質転換された酵母微生物を培養す ると得られる場合もある。多くの場合、しかしながら、分泌レベルが非常に低い かもしくは分泌されず、またはタンパク質分解プロセッシングが正しくないかも しくは不完全である。本発明者らは最近、これはある程度はリーダーペプチドの Ｃ末端と異種タンパク質のＮ末端の間に存在するプロセッシング部位が十分にさ らされておらずこのためタンパク質分解切断が容易に行なわれないかまたは少な くとも不十分に行なわれているためであると考えている。

発明の概略 驚くべきことに、リーダーペプチドのＣ末端および／またはリーダーペプチドに 融合する異種ポリペプチドのＮ末端におけるプロセッシング部位の近くに特定の 修飾を施こすことにより、未修飾リーダーペプチド−異種ポリペプチド構築物で 得られつるものより正しくプロセス化されたタンパク質が高い収率で得られるこ とがわかった。

したがって、本発明はシグナルペプチド、リーダーペプチドおよび異種タンパク 質またはポリペプチドの融合物からなるポリペプチドに関するものであり、その 際ポリペプチドはリーダーペプチドのＣ末端と異種タンパク質のＮ末端の間に位 置する酵母プロセッシング部位に隣接するそのアミノ酸配列において修飾されこ れによりタンパク質分解切断を受け入れやすくするプロセッシング部位を提供す るものであり、該ポリペプチドは次の構造式： シグナルペプチド−リーダーペプチド−ｘ’−ｘ２−ｘ３−ｘ’−異種タンパク 質 （式中、ｘｌはペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なった１つ以上のア ミノ酸を表わし、 ｘ２およびｘ３は同一または異なってもよく、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群か ら選択される塩基性アミノ酸を表わし、ｘ２およびｘ３は一緒になって酵母プロ セッシング部位を限定し、そして Ｘ４はペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なった１つ以上のアミノ酸を 表わし、 ただしｘｌおよび／またはｘ４は１つ以上のアミノ酸を表わしそしてｘｌおよび ／またはｘ４で表わされるアミノ酸の少なくとも１つはＧｌｕおよびＡｓｐから なる群から選択される負に帯電したアミノ酸である） を有するものである。

この関係において、用語“シグナルペプチドは現実には主として疎水性であり酵 母において発現された細胞外タンパク質の前駆体におけるＮ末端配列として存在 する予備配列を意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、分泌さ れるべき異種タンパク質を小胞体へ入れさせることである。シグナルペプチドは この方法の過程において通常は切断除去される。シグナルペプチドはタンパク質 産生酵母微生物と異なるかまたは同じでもよいが、しかし上記したように、当該 酵母微生物とこれが同じである場合により効率的なシグナルペプチドの切断が得 られつる。

語句“リーダーペプチド”とは、主に親水性ペプチドであってその機能が分泌さ れるべき異種タンパク質を小胞体からゴルジ装置へおよびさらに培地への分泌の ための分泌小胞へ向かわせる（すなわち、細胞壁または少なくとも細胞膜を貫通 して細胞の周辺腔へ発現タンパク質またはポリペプチドを輸送すること）ものを 示唆すると理解されたい。

語句“異種タンパク質またはポリペプチド”とは、実際には宿主酵母微生物によ り作られないタンパク質またはポリペプチドを示すものと意図される。用語″゛ タンパク質および“ポリペプチド”は以下の記載においてほとんど交換可能に使 用される。

プロセッシング部位（酵母タンパク質分解酵素により与えられるタンパク質分解 切断によりリーダーペプチドが異種タンパク質から除去される部位）でのポリペ プチドの修飾であってＸｌおよび／またはｘ４により表わされる修飾は、リーダ ーペプチドのＣ末端および／または異種タンパク質のＮ末端における１つ以上の アミノ酸の延長、置換または欠失の形である。

本発明によれば、驚くべきことに、ポリペプチドの配列が延長されるかまたは配 列における天然アミノ酸の１つ以上が置換される少なくとも１つのアミノ酸が負 に帯電したアミノ酸たとえば上述のようなものである場合、異種タンパク質のよ り効率的で正しいプロセッシングが得られうることが見出された。同様な効果は 、負に帯電したアミノ酸を欠失によりプロセッシング部位に近接して与えた場合 、すなわち負に帯電したアミノ酸がプロセッシング部位に隣接して存在するまで リーダーのＣ末端またはタンパク質配列のＮ末端から１個以上のアミノ酸を欠失 させる場合に見られる。

いかなる特定理論にも限定されることを望むものではないが、この効果は、プロ セッシング部位に隣接する負に帯電されたアミノ酸により増加した親水性が賦課 されその結果水性細胞内環境においてプロセッシング部位でのポリペプチドの三 次構造の曝露が強められこれによりプロセッシング酵素によるタンパク質分解切 断をより受けやすくなることに帰因するものと推測される。正に帯電されたまた は中性のアミノ酸と対照的に、負に帯電されたアミノ酸の有利な効果は、プロセ ッシング酵素のいかなる強力な阻害を生ずることなくプロセッシング部位におけ る三次構造の親水性に寄与するこれらアミノ酸の負に帯電された側鎖によるもの である。

負に帯電されたアミノ酸が他の手段たとえばポリペプチドにおける他のアミノ酸 残基と相互反応することによりプロセッシング部位での三次構造（たとえば回転 、ヘアピンまたはループ構造）を作り出しそして維持することに寄与することも 可能である。さらに、負に帯電されたアミノ酸とプロセッシング酵素間の直接の 相互反応も起こり得る。すなわち、プロセッシング部位の２つの塩基性アミノ酸 に隣接して位置する負に帯電されたアミノ酸がプロセッシング酵素に対しタンパ ク質問および／またはタンパク質と溶媒間で帯電相互反応により正しくそして有 効な切断を起こすように指示するものと信じられる。

別の見地において、本発明は上記定義のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列か らなるＤＮＡ構築物に関する。

さらに別の見地において、本発明は酵母において複製することができ上記定義の ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を有する組換体発現ベクター、ならびに 異種タンパク質またはポリペプチドを発現しうるそしてこのベクターで形質転換 された酵母菌株に関する。

さらに別の見地において、本発明は、適当な培地において形質転換された酵母菌 株を培養し異種タンパク質またはポリペプチドの発現および分泌を得、その後で 培地からタンパク質またはポリペプチドを単離することからなる酵母における異 種タンパク質またはポリペプチドの産生方法に関する。

発明の詳細な開示 上記説明と矛盾せず、Ｘｌが１つのアミノ酸を表わす場合、これはＧｌｕまたは Ａｓｐである。

ｘｌおよび／またはＸ４はアミノ酸１〜６個を表わすのが適当である。

ｘｌが２つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式ＢＡであり、その際式中Ａは ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ＢはＧｌｕ、　Ａｓｐ。

Ｖａｌ、　Ｇｌｙ、またはＬｅｕでありたとえばＬｅｕＧｌｕである。

Ｘｌが３つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式ＣＢＡであり、その際式中Ａ およびＢは前記定義のものであり、ＣはＧｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｐｒｏ、　Ｇａｙ 、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　ＡｒｇまたはＬｙｓでありたとえばＡｓｐＬｅｕＧｌ ｕである。

、　ｘｌが３個以上のアミノ酸の配列を表わす場合、追加のアミノ酸の１つは適 当にはＰｒｏまたＧＩｙであり、これらのアミノ酸はタンパク質分解酵素に対す るプロセッシング部位の影響の受け易さを促進しそうな回転、ヘアピンおよびル ープ構造を導入するかおよび／またはこれらの一部を形成することが知られてい るからである。

ｘｌが４つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式ＤＣＢＡを有し、その際Ａ、 ＢおよびＣは前記定義のものであり、ＤはＣと同じ意味を有し、たとえばＧｌｕ ＡｒｇＬｅｕＧｌｕ、　ＬｙｓＧｌｕＬｅｕＧｌｕまたはＬｅｕＡｓｐＬｅｕＧ ｌｕである。

ｘｌが５つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式ＥＤＣＢＡを有し、その際Ａ 、Ｂ、ＣおよびＤは前記定義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有し、たとえば ＬｅｕＧ　１ｕＡｒｇＬｅｕＧ　ｌｕである。

Ｘｌが６個のアミノ酸の配列を表わす場合、構造式ＦＥＤＣＢＡを有し、その際 Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥは前記定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有し、た とえばＶａｌＬｅｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｕである。

本発明範囲から離れることなくｘｌの意味としてアミノ酸の他の組合せも可能で あり、ただし配列におけるアミノ酸の少なくとも１つが上記説明のように負に帯 電したアミノ酸であることは理解されるであろう。

Ｘ４の適当な意味はｘｌについて上記で示したものであるが、アミノ酸の順序は 一般に逆である（すなわちＣＢＡよりむしろＡＢＣ，等）。

１個以上の正に帯電したまたは疎水性アミノ酸により異種タンパク質が開始する 本発明ポリペプチドの実施態様において、タンパク質分解酵素に対しプロセッシ ング部位のよす受入れ易さを確保すると思われるので、Ｘ４はペプチド結合より むしろ１つ以上のアミノ酸を表わすのが有利である。

ｘ４がアミノ酸１〜６個のＮ末端延長を表わす場合、ｘ４で表わされるアミノ酸 および異種タンパク質のＮ末端の間に追加のプロセッシング部位を提供するのが 適当である。これは、タンパク質がＮ末端延長部のないタンパク質の存在を必要 とする目的に対し使用される場合に特に重要である。追加のＮ末端アミノ酸はイ ンビトロで適当なタンパク質分解酵素たとえばトリプシン様プロテアーゼを用い てまたは臭化シアンのような薬品で処理することによりタンパク質分解切断して 除去される。また、別の酵母タンパク質分解酵素に特異的なプロセッシング部位 を選択する宿主酵母微生物により追加のプロセッシング部位における切断を効果 的に行なうこともできる。

しかしながら、いくつかの目的に対し、特異的目的に適合するようにＮ末端延長 部をデザインすることも有利である。

すなわち、延長部はタンパク質の検出のためのマーカーとして、タンパク質を精 製するための助剤としてまたはインビボで薬剤の作用を調節する、たとえば薬剤 の半減期を遅らせたりもしくは身体の特異的位置へこれを攻撃する手段としての 役目をする。

本発明ポリペプチドの好ましい実施態様において、ｘ′および／またはｘ４はア ミノ酸１〜４個のアミノ酸配列を表わす。この実施態様において、先きにさらに 詳細に説明したように、これらのアミノ酸の親水性の性質のためにプロセッシン グ部位の好ましい供与を備えるので、Ｘ２に直接隣接するアミノ酸はＧｌｕまた はＡｓｐであるのが好ましく、Ｘ３に直接隣接するアミノ酸はＧｌｕまたはＡｓ ｐであるのが好ましく、または両方ともＧｌｕまたはＡｓｐである。ｘ′または Ｘ４で表わされるアミノ酸配列は２個以上のＧｌｕまたはＡｓｐからなるのが適 する。

本発明ポリペプチドの別の興味深い実施態様において、Ｘｌおよびｘ４の両方と もが１つ以上のアミノ酸を表わし、換言すれば、ポリペプチドはリーダーペプチ ドのＣ末端と異種タンパク質のＮ末端の両方ともで修飾されている。この実施態 様において、ＸｌおよびＸ４は対称的同一であり、すなわちＸｌおよびｘ４によ り表わされるアミノ酸はそれぞれｘ２およびｘ３から外へ向かって同じ延長部を 有する。

本発明ポリペプチドのシグナルペプチド配列は、細胞の分泌経路へ発現されたポ リペプチドを効果的に向けさせることを保証するいずれかのシグナルペプチドで ある。シグナルペプチドは天然に生ずるシグナルペプチドもしくはその機能的部 分であるか、または合成ペプチドでよい。適当なシグナルペプチドはα−ファク ターシグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、修飾された カルボキシベブチドーゼシグナルペプチドまたは酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド であることが見出された。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は、オー、ハーゲ ンブユヒルＯ，Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ２８９、１９８１．　 Ｐ６４３−６４６に記載されている。カルボキシペプチダーゼシグナル配列は、 エル、ニー、ヴアルスＬ、Ａ、Ｖａｌｌｓう、Ｃｅ１ｌ　４８，１９８７．ｐ８ ８７−８９７により記載されている。ＢＡＲ１シグナルペプチドはＷ　Ｏ’ＭＥ 　８７／　０２６７０号に記載されている。

本発明ポリペプチドのリーダーペプチド配列は、発現されたポリペプチドを小胞 体およびさらに分泌経路へ向けさせる機能のいずれかのリーダーペプチドである 。この目的に適する可能性のあるリーダー配列は、酵母または他の微生物由来の 天然リーダーペプチドであり、たとえばα−ファクターリーダーまたはその機能 的類似物質である。リーダーペプチドは合成リーダーペプチドでもよく、たとえ ば次のアミノ酸配列を有する国際特許出願公開第ＷＯ８９１０２４６３号に記載 されている合成リーダーまたはその誘導体の１つである二本発明方法により作ら れる異種タンパク質は酵母で作られるのが有利ないずれかのタンパク質である。

このようなタンパク質の例は、アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害剤、イ ンシュリン（インシュリン前駆体を含む）、ヒトまたはウシ成長ホルモン、イン ターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、■因子、■ 因子、ｘ■因子、血小板由来増殖因子、酵素等、またはこれらの機能的類似物質 である。この関係において、用語“機能的類似物質”とは天然タンパク質として 同様の機能を有するポリペプチドを示すことを意味する（これは天然タンパク質 の生物学的活性のレベルよりむしろ天然に関するものと理解されることを意図す る）。ポリペプチドは天然タンパク質と構造的に類似であり、天然タンパク質の Ｃ末端およびＮ末端のいずれかもしくは両方へ１つ以上のアミノ酸を追加するか 、天然アミノ酸配列の１つまたは多数の部位で１つ以上のアミノ酸を置換するか 、天然タンパク質のいずれかもしくは両端部またはアミノ酸配列における１つも しくは幾つかの部位で１つ以上のアミノ酸を欠失するか、または天然アミノ酸配 列における１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入することにより天然タン パク質から由来する。このような修飾は上述の幾つかのタンパク質についてよく 知られている。

本発明によれば、驚くべきことに上述したようなリーダーペプチドのＣ末端また は異種タンパク質のＮ末端での修飾が正しくプロセス化されたアプロチニン（ま たは、上述したような機能的類似物質）の高収率での産生を許すことが見出され た。アプロチニンはプロテアーゼ阻害タンパク質であり、その特性により様々な 医療目的に有用である（たとえば、膵炎、敗血性ショック症候群、高線維素溶解 性出血および心筋梗塞の治療）。高い投与量のアプロチニン投与は心臓手術また は他の主な手術と関係する血液損失を著しく減らす。アプロチニンはまた、これ が発現されたタンパク質の不所望なタンパク質分解切断を起こすかもしれない宿 主細胞プロテアーゼを阻害するので培地への添加剤としても有用である。公知の 天然リーダー配列たとえばα−ファクターリーダーを用いて酵母中で正しくプロ セスされたアプロチニンを高収率で得る際に困難を経験した。天然アプロチニン は塩基性アミノ酸（Ａｒｇ）によりＮ末端で開始し、そしてこの理由のために公 知リーダーペプチド（たとえばα−ファクターリーダー）の１つを本発明による 修飾することなく使用する場合、先行するプロセッシング部位がタンパク質分解 切断（上述のような）を受け入れにくくなり、その結果もしあったとしても正し くプロセスされたアプロチニンが低収率で得られることになる。

本発明によれば、ｘｌおよびｘ４が他の意味を有しただしアミノ酸の少なくとも １つ最も好ましくはプロセッシング部位に対し最も近い１つが上述のように負に 帯電したアミノ酸であるアプロチニンの有利な収率が得られることが期待される とはいえ、特に良好な結果はＸｌがＧ　１ｕＡｒｇＬｅｕＧ　ｌｕを表わすかま たはｘ４がＧｌｕＬｅｕもしくはＧ　１ｕＬｅｕＡｓｐＬｅｕを表わすアプロチ ニン（以下の例を参照）の生産に関し得らる。

また本発明によれば、上述のようにリーダーペプチドのＣ末端または異種タンパ ク質のＮ末端での修飾が正しくプロセス化されたインシュリン前駆体くまたは上 記定義のような機能的類似物質）の高収率の産生を許すことが見出された。本発 明のこの実施態様において、ｘｌはＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＧｌｕまたはＬｙ ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕを表わし、その場合ｘ４は通常ペプチド結合を表わ すものである。これに代わり、ｘ４はＧｌｕを表わし、その場合ｘ１は通常ペプ チド結合を表わすものである。

特に、インシュリン類似物質前駆体Ｂ　（１−２９）　−Ａ　１ａＡ　１ａＬｙ ｓ−Ａ　（１−２９）であってＸ、がＬｙｓＧ　１ｕＬｅｕＧ　ｌｕを表わず場 合またはｘ４がインシュリン前駆体の最初のアミノ酸としてのＰｈｅのＧｌｕに よる置換を表わす場合（以下の例を参照）の発現に関し有利な結果が得られる。

ｘ’がＬｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕを表わす場合インシュリン類似物質 前駆体Ｂ　（１−２９）　５ｅｒＡｓｐＡｓｐＡ　１ａＬｙｓ−Ａ　（１−２９ ）の妥当な収率もまた得られる。さらに、ｘｌおよびｘ４は他の意味を表わした だし少なくとも１つのアミノ酸、最も好ましくはプロセッシング部位に最も近い １つが上述のように負に帯電したアミノ酸であるインシュリン前駆体の高収率も 期待される。

本発明ポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ構築物は、確立された標準的方 法により、たとえばニス、エル、ビューケージＳ、　Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅおよ びエム、エイチ、カルーサーズＭ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａ− ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．　ｐ、　１８５９−１８６９ により記載されたホスホアミダイト法またはマツセスらＭａｔ−ｔｈｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、　ＢＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．　ｐ８０１−８０５により 記載された方法により合成されつる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌク レオチドはたとえば自動ＤＮＡ合成機中で合成され、精製され、重複化されそし て連結されて合成りＮＡ構築物を形成する。

本発明によるＤＮＡ構築物はまた、たとえば一般的技術（テ仁マニアテイスらＴ 、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣ１ｏ−ｎ１ｎ ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリング　）１−ノ ＜−１１９８２）にしたがって、たとえばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリィを 作りそして本発明ポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列を合成 オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリッド化によりスクリーニングする ことにより得られるゲノムまたはｃＤＮＡ起源からなる。この場合、シグナルお よびリーダーペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列を異種タンパク質 をコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列と結合し、その後で、たとえば公知手法 にしたがって相同組換体の所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオ チドを用いてたとえば特定部位の突然変異誘発によりポリペプチドのアミノ酸配 列Ｘ’−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ’に相当する部位でＤＮＡ配列を修飾してもよい。

最後に、ＤＮＡ構築物は、（適切に）合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源のフラグ メントをアニーリングすることにより調製された混合された合成およびゲノム性 、混合された合成およびｃＤＮＡまたは混合されたゲノムおよびｃＤＮＡ起源か らなり、前記フラグメントは標準的技術にしたがって全ＤＮＡ構築物の様々な部 分に相当する。すなわち、非相同タンパク質をコードするＤＮＡ配列はゲノム起 源であり一部リーダーペプチドをコードする配列は合成的に調製されうるという ことが観察される。

アプロチニンをコードする好ましいＤＮＡ構築物は添付された第４図、第７図、 第９図、第１１図および第１２図に示されるものであり、またはアプロチニンも しくはその機能的類似物質をコードする適当に修飾されたものである。ＤＮＡ配 列の適当な修飾の例は、タンパク質の別のアミノ酸配列を起こさないがしかしＤ ＮＡ構築物が挿入される酵母微生物のコドン使用に相当するヌクレオチド置換で あるかまたは異なったアミノ酸配列を起こし場合によっては異なったタンパク質 構造を生ずるかもしれないがしかしながら天然アプロチニンの抗プロテアーゼ特 性を損なうことのないヌクレオチド置換である。可能性のある修飾の別の例は、 １個以上のヌクレオチドの配列への挿入、１個以上のヌクレオチドの配列のいず れかの末端への追加および配列範囲内でのいずれかの末端での１個以上のヌクレ オチドの欠失である。特異的アプロチニン類似物質の例はヨーロッパ特許出願公 開第３３９９４２号に記載されているものである。

インシュリン前駆体をコードする好ましいＤＮＡ構築物は添付の第１６図および 第１７図に示されるものまたは上述のように適当に修飾されたものである。

本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換体発現ベクターは酵母 微生物中で複製可能ないずれかのベクターである。ベクターにおいて、本発明ポ リペプチドをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に操作可能に接続 するべきである。プロモーターは酵母において転写活性を示すいずれかのＤＮＡ 配列および酵母と相同または非相同のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子 から由来する。プロモーターは酵母と相同なタンパク質をコードする遺伝子から 由来するのが好ましい。適当なプロモーターの例はサツカロミセス　セレヴイシ アエＭα１．ＴＰ　Ｉ　、ＡＤＨまたはＰＧＫプロモーターである。

本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当なターミネータ−たとえば ＴＰＩターミネータ−（たとえば、タイ、アルバーおよびシイ、カワサキ、　Ｊ 、Ｍｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１゜１９８２、　ｐ４１９−４３４）に操作 可能に接続してもよい。

本発明の組換体発現ベクターはさらにベクターが酵母における複製を可能にする ＤＮＡ配列からなる。このような配列の例は酵母プラスミドＺμ複製遺伝子ＲＥ ＰＩ−３および複製の開始点である。ベクターはまた選択可能なマーカー、たと えばビイ、アール、ラッセルＰ、　Ｒ，Ｒｕ５ｓｅｌ　１．　Ｇｅｎｅ　４０． １９８５゜ｐ１２５−１３０に記載されているようにシゾサツカロミセス　ポン ベＴＰＩ遺伝子を含んでもよい。

本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネータ −をそれぞれ連結するために使用される手段および酵母複製に必要な情報を含む 適当な酵母ベクターへこれらを挿入するために使用される手段は、当業者によく 知られている（たとえば、マニアナイスら、前出）。ベクターは、最初に本発明 ポリペプチドをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し続いてこの フラグメントを適当な発現ベクターへ挿入するか、または個々の要素（たとえば シグナル、リーダーまたは異種タンパク質）に対する遺伝子情報を含むＤＮＡフ ラグメントを逐次挿入し続いて連結するかのいずれかの方法により構築されるこ とは理解されるであろう。

本発明方法で使用される酵母微生物は、培養時に当該異種タンパク質またはポリ ペプチドを多量に産生ずる適当な酵母微生物のいずれかである。適当な酵母微生 物の例は、酵母種たとえばサツカロミセス　セレヴイシアエ、サツ力ロミセスク ルイベリ　（Ｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒ　ｉ）　、シゾサツカロミセス　ボンベマタは サツカロミセス　ウヴアラム（Ｓ、ｕｖａｒｕｍ）　ａ菌株である。

酵母細胞の形質転換は、たとえば原形質体形成（たとえば以下の例１）とこれに 続くそれ自体公知の方法で形質転換することにより行なわれる。細胞を培養する ために使用される培地は酵母微生物増殖に適する通常の培地のいずれかである。

分泌された異種タンパク質であってその十分な割合が正しくプロセスされた形で 培地中に存在するものを、常法によりたとえば遠心分離または濾過により培地か ら酵母細胞を分離し、たとえば硫酸アンモニウムのような塩を用いて上澄または 濾液の水性タンパク質成分を沈でんさせ、続いて様々なりロマトグラフィ手段た とえばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等により精 製することにより、培地から回収する。

さらに別の見地において、本発明は一般式Ｘ４−アプロチニン（１−５８）（式 中、Ｘ４は、少なくともそのうちの１つがＧｌｕおよびＡｓｐからなる群から選 択される負に帯電したアミノ酸である１つ以上のアミノ酸によるＮ末端延長部を 表わす）で表わされる新規アプロチニン類似物質に関する。Ｘ４はアミノ酸１〜 ６個、特にアミノ酸１〜４個の配列を表わし、上述の意味のいずれかを有する。

ｘ４で表わされる特に好ましい意味はＧｌｕ−ＬｅｕおよびＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａ ｓｐ−Ｌｅｕである。

図面の簡単な説明 本発明をさらに添付の図面を参照しながら以下の例において説明するが、図にお いて 第１図はアプロチニン（１−５８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ 配列において示される食い違い線は合成オリゴヌクレオチドから形成される二重 鎖が連結された部位を示す。

第２図はプラスミドｐＫＦＮ−８０２とｐＫＦＮ−８０３の構築を示す。

第３図はプラスミドｐＫＦＮ−８４９とｐＫＰＮ−８５５の構築を示す。

第４図はｐＫＦＮ−８４９とｐＫＦＮ−８５５からの４０６ｂｐ　ＢｃｏＲＩ− ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を示す。

矢印はタンパク質分解が分泌の間に起こる部位を示す。

第５Ａ図および５Ｂ図はそれぞれアプロチニンによるトリプシンとプラスミンの 阻害を示す；・はウシ膵臓アプロチニンを示し、ＸはＧｌｕＬｅｕ−アプロチニ ンを示し、ΔはＧｌｕＬｅｕＡｓｐＬｅｕ−アプロチニンを示す。

第６図はプラスミドｐＫＦＮ−８５２とｐＫＰＮ−８５８の構築を示す。

第７図はｐＫＰＮ−８５２とｐＫＦＮ−８５８からの４１２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ− ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を示す。矢印は分泌の間にタンパク質分解切 断が生ずる部位を示す。

第８図はプラスミドｐＫＦＮ−９９５とｐＫＦＮ−９９８の構築を示す。

第９図はｐＫＦＮ−９９５とｐＫＦＮ−９９８からの４１２ｂｐ　ＢｃｏＲＩ− ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を示す。

第１０図はプラスミドｐＫＰＮ−１０００とｐＫＦＮ−１００３の構築を示す。

第１１図はｐＫＦＮ−１０００とｐＫＦＮ−１００３からの４１２ｂｐ　Ｂｃｏ ＲＩ−Ｘｂａ　ｒフラグメントのＤＮＡ配列を示す。矢印は分泌の間にタンパク 質分解切断が起こる部位を示す。

第１２図は合成アプロチニン（３−５８）遺伝子のＤＮＡ配列を示す。配列内の 食い違い線は１０個の合成されたオリゴヌクレオチドから形成された５つの二重 鎖が連結される部位を示す。

第１３図はプラスミドｐＫＦＮ−３０５とｐＫＦＮ−３７４／３７５の構築を示 す。

第１４図はプラスミドｐＭＴ−６３６の構築を示す。

第１５図はプラスミドｐＬａｃ−２４０の構築を示す。

第１６図はｐＬａＣ−２４０からの修飾されたリーダー−インシュリン前駆体の ＤＮＡ配列を示す。

第１７図はＭＦα１−シグナルリーダー（１−８５）とインシュリン類似物質前 駆体Ｂ（１−２９，ＩＧＩｕ＋２７Ｇ１ｕ）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ（１−２ １）をコードするｐＫｆ’Ｎ−４５８からの５０８ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ 　７ラグメントのＤＮＡ配列を示す。

例 例１ 酵母菌株ＫＦＮ−８３７からのＧｌｕ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）の産 生 ａ）プラスミドρＫＦＮ−８０２の構築アプロチニン（１−５８＞をコードする 合成遺伝子を、連結により１０個のオリゴヌクレオチドから構築した。

オリゴヌクレオチドは、調節された極性ガラス支持体上でホスホルアミダイト化 学を用いて自動ＤＮＡ合成機中で合成されたくビューケージ、ニス、エル、　Ｂ ｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、、およびカーす−ズ、エム、エイチ、Ｃａｒｕｔｈｅ ｒｓ、Ｍ、Ｈ，、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２．　（１９８１ ）１８５９−１８６９）。

Ｎ０Ｒ−７６０：　ＣＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧ ＴＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣ−ＧＧＴＣＣ ＮＤＲ−７５４：　ＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ ＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴ−ＣＴＴＴＴＧＧＣ ＮＯＲ−３５４：　ＡＴＧＴＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴ ＣＴＡＣＡＡ［’ＧＮＯＲ−３５５：　ＣＴＴＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡ ＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴＮＯＲ−３５６：　ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴ ＴＴＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＮＯＲ−３５７： 　ＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣ［：ＧＴＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡ ＡＣＣＡＧＣＮＯＲ−３５８：　ＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴ ＴＣＡＡＧＴＮＯＲ−３５９：　ＡＧＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴ ＣＴＴＡＧＮＯＲ−３６０：　ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＣ ＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＮＯＲ−３６ＣＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＣＡ ＣＣＡ［：ＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣ５つの二重鎖Ａ−Ｅ を第１図に示すように上記１０個のオリゴヌクレオチドから形成した。

二重鎖Ａ−Ｅの各々２０ピコモルを、５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドの 相当する対から、９０℃にて５分間続いて７５分間にわたって室温まで冷却する ことにより形成した。５つの二重鎖を混合し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで処理した 。合成遺伝子は、２％アガロースゲル中での連結混合物の電気泳動後１９１ｂｐ バンドとして単離された。得られた合成遺伝子を第１図に示す。

合成遺伝子を、ｐＬａｃ２１２ｓＰＸ３から２０９ｂｐ　ＢｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌ フラグメントとプラスミドｐＵｃ１９　（ヤーニツシューペロン、シイ。

Ｙａｎ　１ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ１，ヴイエイラ、ジエイ、Ｖｉｅｉｒａ 、　Ｊ、およびメシッヒ、ジェイ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　３３ （１９８５）、１０３−１１９）の２．７ｋｂ　ＢｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメ ントと連結した。プラスミドｐＬａＣ２１２ｓｐｘ３は国際特許出願−０８９１ ０２４６３号の例３に記載されている。

ｐＬａｃ２１２ｓＰＸ３からの２０９ｂｐ　ＢｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌフラグメント は合成酵母リーダーペプチドをコードする。

連結混合物を用いて、アンピシリン耐性について選択されたコンピテント大腸菌 株γ−１ｍ＋）を形質転換した。３２ｐ−Ｘｂａ　ｌ−８ｃｏＲＩフラグメント の配列決定（マクサム、ニー。

Ｍａｘａｍ、Ａおよびギルバート、ダブリュ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、　Ｍｅｔ ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ　１．６５　（１９８０）　、　４９９−５６０）によれ ば得られたコロニーからのプラスミドはアプロチニン（１−５８）についての正 しいＤＮＡ配列を含んでいた。

１つのプラスミドｐＫＦＮ８０２が別の用途に選択された。プラスミドｐＫＰＮ ８０２の構築を第２図に示す。

ｂ）プラスミドρＫＦＮ−８４９，ρＫＦＮ−８５５および酵母菌株ＫＦＮ−８ ３７の構築 ｐＫＦＮ−８０２の３．Ｏｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｓｔｕｌ　フラグメントをＴ、ＤＮ Ａリガーゼを有する合成フラグメントＮ０Ｒ−７９０／７９１と連結した二連結 混合物を制限酵素５ｔｕｌで消化しｐＫＦＮ−８０２のバックグラウンドを減少 させ、得られた混合物を使用してアンピシリン耐性を選択するコンピテント大腸 菌株（γ−２ｍ＋）を形質転換した。得られるコロニーの１つからのプラスミド ｐＫＦＮ−８４９はＤＮＡ配列決定により示され（サンガー、エフ、　Ｓａｎ− ｇｅｔ、　ｐ、　、ミクレ石ニス、　Ｍｉｃｋｌｅｎ、Ｓ、、およびカウルソン 。

ニー、アール、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４（１９７７）、５４６３−５４６７）　、合成酵母リーダー 遺伝子に正しく融合したＧｌｕ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）に対するＤ ＮＡ配列を含む。プラスミドｐＫＦＮ−８４９の構築を第３図に示す。

ｐＫＦＮ−８４９はＢｃｏＲＩとＸｂａｌで切断され、４０６ｂｐフラグメント をｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｂａｌ　フラグメントとｐＭＴ ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、その結 果としてプラスミドｐＫＦＮ−８５５が得られた。第３図参照。プラスミドｐＭ Ｔ６３６ハ［ＮＩＩ！特許ａ［ｉ　ＰＣＴ／ＤＫ８８１００１３８号に記載され ている。

ｐＭＴ６３６は、シソ′サツカロミセス　ポンベＳｃｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ　ＴＰＩ遺伝子（ＰＵＴ）　（ラッセル、ビ仁アール、 　Ｒｕ５ｓｅｌｌ。

Ｐ、Ｒ，、Ｇｅｎｅ　４０（１９８５）、１２５−１３０）、サツカロミセス　 セレヴイシアエ　トリオース　ホスフェート　イソメラーゼプロモーターおよび ターミネータ−ＴＰＩ、およびＴＰｒＴ　（アルバー。

ティ、　Ａｌｂｅｒ、Ｔ、′Ｊ６よびカワサキ、シイ、　Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｇ 、ＪｏＭｏｌ。

Ａｐｐ　１．　Ｇｅｎ、　１（１９８２）　、　４１９−４３４）を含む大腸菌 −サッ力ロミセスセレヴイシアエ　シャトルベクターである。プラスミドｐＫＦ Ｎ−８５５は以下の配列を有する： ＴＰ　Ｉ　ｐ−ＬａＣ２１２ｓｐｘ３シグナル−リーダー−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ア プロチニン（１−５８）　−ＴＰＩ。

（式中、ＬａＣ２１２ｓｐｘ３シグナル−リーダーは、国際特許出願公開第Ｗ０ ８９１０２４６３号に記載された合成酵母リーダーである。

ｐＫＦＮ−８４９およびｐにＦＮ−８５５からの４０６ｂｐ　ＢｃｏＲＩ−Ｘｂ ａｌフラグメントのＤＮＡ配列を第４図に示す。

サツカロミセス　セレヴイシアエ菌株ＭＴ６６３（Ｅ２−７Ｂ　ＸＥ　１ｌ−３ ６ａ／α、ΔｔｐｉΔｔｐ　ｉ、　ｐｅｐ４−３／　ｐｅｐ４−３）をＹ　ＰＧ ａＬ　（１％バクト酵母抽出物、２％バクトベプトン、２％ガラクトース、１％ ラクテート）上でＯ，Ｄ、　６００ｎｍが０．６まで増殖した。

培養物Ｌｏｏｍを遠心分離により採取し、水１０−で洗い、１．２Ｍソルビトー ル、２５　ｍＭ　Ｎａ２ＢＤＴＡ　ｐＨ＝　８．０および６．７■／ｒｒＬｌジ チオトレイトールを含む溶液１０ｒｎｉ中に再懸濁した。

懸濁液を１５分間３０℃でインキュベートし、遠心分離し、１．２Ｍソルビトー ル、１０　ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、　０．１　Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝　 ５．８および２■ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）登録商標２３４を含む溶液１０ Ｔｎ１中に細胞を再懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、遠 心分離により細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１０−およびＣＡＳ　（１，２ Ｍソルビトール、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０ｍＭトリスＨＣＩ（）リス−トリ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）　ｐＨ＝７．５）　１０−中で洗浄し、 ＣＡＳ２ｒｎｌ中に再懸濁した。形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞０．１ ｒｎｌをプラスミドｐＫＦＮ−８５５はぼＩＲと混合し、室温で１５分間放置し た。（２０％ポリエチレングリコール４０００．　２０ｍＭＣａＣｌ２．　１０ ｍＭＣａＣ１，、１０ｍＭトリスＨ（：ｌ　、　ｐＨ＝７．５）　１ｍｌを加え 、そして混合物をさらに３０分間室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレッ トを５Ｏ３（１，２Ｍソルビトール、３３％ｖ／　ｖ　ＹＰＤ　、６．７　ｍＭ ＣａＣ］ｚ、１４ｇ／ｒｎ１．ｏイシン）０．１ｒｎｌ中に再懸濁させ、３０℃ で２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離し、ペレットを１．２Ｍ ソルビトール０．５　ＷＬｌ中に再懸濁させた。次いで、５２℃でトップ寒天（ ジャーマンらＳｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

のＳＣ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　］−ル ド　スプリング　ハーバーラボラトリイ（１９８１））　１．２　Ｍソルビトー ル＋２．５％寒天含有）　６ｍｊ２を添加し、懸濁液を、同じ寒天固化ソルビト ール含有培地を含む皿のトップへ注入した。３０℃で３日後に形質転換体コロニ ーを選び、再度単離しそしてこれを用いて液体培養を始めた。このような形質転 換体の１つＫＦＮ−８３７をさらに特性決定化のため選択した。

酵母菌株ＫＦＮ−８３７をＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン（ディフ コ　ラボラトリイズＤｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）および６％グル コース）上で増殖した。菌株の培養物２０〇−を３日間３０℃で２５０　ｒｐｍ にて振とうしてＯ，Ｄ、　６００ｎｍ２０とした（乾燥酵母バイオマス１８．８ ｇ／　１　）。遠心分離後、上澄をＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィにより 分析した。

０．２２−ミレックスＭｉｌｌｅｘ　ＧＶフィルターユニットを通して酵母上澄 を濾過し、１１ｎ１を、２０ｍＭバイシンＢｉｃｉｎｅ、　ｐＨ＝　８．７で平 衡化したモノニスＭｏｎｏｓ陽イオン交換カラム（０，５Ｘ５印）に施こした。

平衡緩衝液で洗浄後、カラムを直線ＮａＣ１勾配（０−ＬＭ）平衡緩衝液で溶出 した。トリプシン阻害活性は、分光分析（カッセル、ビイ、　Ｋａｓｓｅｌ、Ｂ 、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌ、　１９（１９７０）、　８４４−８ ５２）によりそしてさらに次式からの２８０ｎｍでの吸収量の積算により溶出さ れたフラクション中で定量化された。

収量はＧｌｕ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）　１２０ｍｇ／ｌであった。

アミノ酸分析およびＮ末端配列決定のために、勾配溶出されたＧ　１　ｕ−Ｌｅ ｕ−アプロチニン（１−５８）の濃縮およびさらに精製を、逆相カラム（バイダ クＶｙｄａｃ　Ｃ４，４，６Ｘ　２５０ｍｍ）中ＨＰＬＣにより行なった。０． １％ＴＦＡ中のＣＨ，ＣＮ勾配液で溶出を行なった。集めたフラクションを減圧 遠心分離により約１００ｄまで濃縮し、サンプルをＮ末端配列決定とアミノ酸分 析のために採取した。

Ｎ末端配列決定により、以下の配列： ＧＩ　ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ− Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒ ｇ−１１ｅ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌ ｙｓ−Ａｌａ であることがわかり、Ｎ末端が正しいことが確認された。半分のシスティン残基 がこの方法では測定できず、これは残基Ｎα７およびＮα１６で得られるブラン クサイクル（Ｘ）による。

アミノ酸分析を第１表に示す。この表から生成物が予期されたアミノ酸組成、す なわちさらにＧｌｕおよびＬｅｕを有することが明らかである。Ｉｌｅの若干低 い含有量は、はとんど１１ｅ　（１８）−１１ｅ　（１９）の不完全な加水分解 のせいであろう（これは当業界で公知である）。また、Ａｒｇが予想より若干高 い。

しかしながら、これもまた天然アプロチニンでも見られる（第１表、第３欄）。

上述のカッセル法と比較して、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）の特 異的活性が天然アプロチニンの特異的活性と実験誤差の範囲内で同一であること が見出された。下記のように測定された滴定曲線の結果におけるＧｌｕ−Ｌｅｕ −アプロチニン（１−５８）によるトリプシンおよびプラスミン阻害はウシ膵臓 アプロチニン（アプロチニン　ノボ）のものと区別できなかった。アプロチニン またはその類似物質と酵素の３０分間のインキュベーション後、０．６　［１１ Ｍ　Ｓ　２２５Ｈ力ビビトラムｋａｂｉＶｉｔｒｕｍ）を添加し、活性をニトロ アニリン産生の割合として測定した。アプロチニン濃度の関数としての活性を第 ５Ａ図および第５Ｂ図にプロットした。３つすべての阻害剤による両方の酵素の 完全な阻害が観察された。

例２ 酵母菌株ＫＦＮ−８４０からのＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−７プロチニ ン（１−５８）の産生 Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）をコードする合成 遺伝子を例１に記載のように構築した。合成フラグメントＮ０Ｒ−７９３／７９ ４をＮ０Ｒ−７９０／７９１０代わりに使用したニブラスミドｐＫＰＮ−８５２ 由来のｐＵｃ１９は、ｐＫＦＮ−８４９と同様にして構築された。

例１０手順にしたがって、プラスミドｐＫＰＮ−８５８が次の構築物ＴＰＩｐ− ＬａＣ２１２ｓｐｘ３シグナルリーダー−Ｇ　１ｕＬｅｕＡｓｐＬｅｕ−アプロ チニン（１−５８）　−ＴＰｌ、を含んで得られた。

プラスミドｐＫＦＮ−８５２およびｐＫＦＮ−８５８の構築物を第６図に示す。

ｐＫＦＮ−８５２とｐＫＦＮ−８５８からの４１２ｂｐ　８ｃｏＲＩ−Ｘｂａ１ ７ラグメントのＤＮＡ配列を第７図に示す。

プラスミドｐＫＰＮ−８５８を上述のように酵母菌株ＭＴ６６３へ形質転換する と酵母菌株ＫＦＮ−８４０が得られた。

ＹＰＤ培地中のＫＦＮ−８４０培養物２００ｒｎｌを、３日間３０℃で２５　Ｏ ｒｐｍにて振とうしてＯ，０，６００ｍｍを１８としたく乾燥バイオマス１６． ７■／ｌ）。上述のような上澄液のＦＰＬＣイオンクロマトグラフィによりＧ　 Ｉｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）９０■／Ｉ２の収率 が得られた。

第１表からアミノ酸分析が明らかであり、予期したアミノ酸組成と一致する。

Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−アプロチニン（１−５８）のトリプシンおよ びプラスミン阻害滴定曲線はウシ膵臓アプロチニン（アプロチニン　ノボ）のも のと区別がつかなかった（第５Ａ図および第５Ｂ図参照）。

例３ 酵母菌株ＫＦＮ−１００６からのアプロチニン（１−５８）の産生プラスミドｐ ＫＰＮ−９９５は合成フラグメント　Ｎ０Ｒ−８４８／８４９へ３、０　ｋｂ　 Ｎｃｏｌ−３ｔｕｌフラグメントを連結することによりｐＫＰＮ−８０２から構 築された： 連結混合物を制限酵素Ｂａ１Ｉで消化し、ｐＫＦＮ−８０２のいかなるバックグ ラウンドをも減らした。

酵母発現プラスミドｐＫＦＮ−９９８は実質的に例１に記載のように構築され、 第８図に示される： ＴＰＩｐ−ＬａＣ２１２ｓｐｘ３シグナル−リーダー（１−４７）　Ｌｙｓ−Ｇ ｌｕ−しｅｕ−Ｇ　Ｉｕ　（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−アプロチニン（１−５８）　− ＴｐｔｔｐＫＦＮ−９９５およびｐＫＰＮ−９９８からの４１２ｂｐ　ＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ１７ラグメントのＤＮＡ配列を第９図に示す。

例１に記載のようにプラスミドｐＫＰＮ−９９８を酵母菌株ＭＴ６６３へ形質転 換して酵母菌株ＫＰＮ−１００６を得た。ＹＰＤ培地中の形質転換菌株ＫＦＮ− １００６の培養と上澄中のアプロチニン（１−５８）の分析を上述のように行な った。

収量はアプロチニン（１−５８）３０■／Ｅであった。

精製した物質のアミノ酸分析は予期したアミノ酸組成を確認した。

例４ 酵母菌株ＫＦＮ−１００８からアプロチニン（１−５８）の産生ｐＵＣ由来プラ スミドｐＫＦＮ−１０００を、ｐＫＰＮ−８０２の３．０　ｋｂＮｃｏｌ−５ｔ ｕｌフラグメントを合成フラグメントＮ０Ｒ−８５０／８５１と連結することに より例１に記載のように構築した：例１および例３の手順にしたがって、次の構 築物ＴＰＩ、−ＬａＣ２１２ｓｐｘ３シグナル−リーダー（１−４７）　−Ｇｌ ｕＡｒｇＬｅｕＧｌｕ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−アプロチニン（１−５８）　−ＴＰ ｌ、を含む酵母発現プラスミドｐＫＦＮ−１００３が得られた。

プラスミドｐＫＰＮ−１０００およびｐＫＰＮ−１００３の構築物を第１０図に 示す。ｐＫＦＮ−１０００およびｐＫＰＮ−１００３からの４１２ｂｐ　Ｅｃｏ ＲＩ−ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を第１１図に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−１００３を上述のように酵母菌株ＭＴ６６３に形質転換す ると酵母菌株ＫＦＮ−１００８が得られた。

形質転換菌株ＫＦＮ−１００８０ＹＰＤ培地中での培養および上澄におけるアプ ロチニン（１−５８）の分析を上述のように実施した。収量はアプロチニン（Ｌ −５８）１２０■／ｌであった。

精製した物質のアミノ酸分析は予期されるアミノ酸組成と一致した。さらに、還 元したピリジルエチル化ポリペプチドのガス相配列決定により完全な一次構造の 確認が得られた。

さらに、トリプシンに対する組換体アプロチニン（１−５８）の特異的阻害活性 はウシ膵臓アプロチニンのものと区別がつかなかった。

例５ 酵母菌株ＫＦＮ−７８３からのアプロチニン（１−５８）の産生プラスミドｐＫ ＰＮ−８０２（たとえば例１）を、ＢＣＯＲＩとＸｂａｌで切断し、４００ｂｐ フラグメントをＰＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｂａｌフラグメン トとｐＭＴ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＩＥｃｏＲＩフラグメントに連 結すると、プラスミドｐＫＦＮ−８０３が得られた（例２参照）。

ｐＫＦＮ−８０３は次の構造を有する：ＴＰＩｐ−Ｌａ、Ｃ２１２ｓｐｘ３シグ ナルリーダー−アプロチニン（１−５８）−ＴＰＩＴ プラスミドｐＫＦＮ−８０３を上記のように酵母菌株ＭＴ６６３中で形質転換し た。形質転換菌株ＫＦＮ−７８３のＹＰＤ培地中での培養および上澄のＦＰＬＣ イオンクロマトグラフィを上述のように実施した。アプロチニン（１−５８）を 、ウシ膵臓から精製した真正アプロチニンの標準化溶液のクロマトグラフィと比 較して定量化した。アプロチニン（１−５８）の収量は１■／１未満であった。

第１表 アミノ酸組成 Ａｓｐ　５　５．００　４．９５　５．９３　（＋１）Ｔｈｒ　３　２．８６　 ２．８４　２．８５Ｓｅｔ　１　０．９４　０．９２　０．９３Ｇｌｕ　３　３ ．０４　３．９７（＋１）　３．９９（＋１）Ｐｒｏ　４　４．１８　３．９０ 　３．８６Ｇｌｙ　６　５−９５　５．９１　５−９４Ａｌａ　６　５．８５　 ５．９２　５．９４Ｃｙｓ　６　５．２０　５．２１　５．２２Ｖａｌ　］、　 ０．９９　１．００　１．０１Ｍｅｔ　１　０．８３　０．６５　０．６７１１ ｅ　２　１．３９　１．５８　１．５８Ｌｅｕ　２　１．９７　：１００　（＋ １）　４．００　（＋２）Ｔｙｒ　４　３．８４　：１７４　３．７１Ｐｈｅ　 ４　３．９８　３．９４　３．９２Ｌｙｓ　４　３．９２　３．９９　３．９９ Ａｒｇ　６　６．３９　６．３５　６．３４合計　５８　５６．３３　５７．８ ７　５９．８８例６ アプロチニン（３−５８）の調製 アプロチニン（３−５８）に対する合成遺伝子を多数のオリボヌクレオチドから 連結により構築された。

次の１０個のオリゴヌクレオチドが例１に記載のように合成された： ５つの二本鎖Ａ−Ｅが第１２図に示すように上記１０個のオリゴヌクレオチドか ら形成された。

二本鎖Ａ−Ｅの各々２０ピコモルは、５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドＩ −Ｘの相当する対から、９０℃にて５分間加熱し次いで７５分間にわたって室温 まで冷却することにより形成された。５つの二本鎖を混合し、Ｔ、Ｉ７ガーゼで 処理した。連結混合物の２％アガロースゲル中の電気泳動後、合成遺伝子が１７ ６ｂｐバンドとして単離された。得られた合成遺伝子を第１２図に示す。

合成１７６ｂｐ遺伝子は、サツカロミセス　セレヴイシアエ成熟因子α１シグナ ル−リーダー（１−８５）配列（マルクッセン、ジエイ、　Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ 、Ｊ、ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１（１９８７）、　２１ ５−２２３）をコートするブラｘ　ミ）’ｐＫＦＮ−９からノ３３０ｂｐ　Ｅｃ ｏＲＩ−Ｈｇａｌ　フラグメントとｐＵｃ１９　（ヤーニッシューペロン。

シイ、Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ６，ヴイエイラ、ジエイ、　Ｖｉｅｉｒ ａ、　Ｊ、およびメシッヒ、ジエイ０Ｍｅｓｓｊｎｇ、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　３３ （１９８５）、１０３−１１９）からの２．７ｋｂ　ＢｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラ グメントと連結した。ＭＦα１リーダー配列の直後にＨｇａ　１部位を含むｐＫ ＦＮ−９の構築物はヨーロッパ特許第２１４８２６号に記載されている。

連結混合物を用いてアンピシリン耐性を選択するコンピテント大腸菌株（ｙ−、 ｍ”）を形質転換した。”Ｐ−ＸｂａＩ−ＢｃｏＲＩフラグメントの配列決定（ マクサム、ニー、およびギルバート、ダブリ：、、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚ ｙｍｏｌ、６５（１９８０）、４９９−５６０）により、得られたコロニーから のプラスミドがアプロチニン（３−５８）についての正しいＤＮＡ配列を含むこ とがわかった。

１つのプラスミドｐＫＮＦ３０５が別の用途のために選択された。

プラスミドｐＫＮＦ３０５の構築物を第１３図に示す。

ｐＫＰＮ３０５をＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断し、０．５　ｋｂフラグメントを ｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　ＮｃｏＩ−ＸｂａｌフラグメントおよびｐＭＴ ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、その結 果プラスミドρＫＦＮ３７４が得られ、第１３図を参照せよ。プラスミドＰＭＴ ６３６は、ＬＥ！ＩＪ−２遺伝子の欠失後のｐＭＴ６０ＢおよびｐＭＴ４７９か ら構築され、第１４図を参照せよ。ｐＭＴ６０８はヨーロッパ特許第１９５６９ １号に記載されている。ｐＭＴ４７９はヨーロッパ特許第１６３５２９号に記載 されている。ｐＭＴ４７９はシゾサツカロミセスボンベＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ） 　、サツカロミセス　セレヴイシアエ　トリオースホスフェート　イソメラーゼ 　プロモーターおよびターミネータ−１ＴＰＩ、およびＴＰＩＴ（アルバー。

テ仁およびカワサキ、シイ、　Ｊ−Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１　（１ ９８２）、　４１９−４３４）を含む。プラスミドｐＫＦＮ３７４は次の配列を 含む：ＴＰＩＰ−肝α１−シグナルーリーダー（１−８５）−アプロチニン（３ −５８）−ＴＰＩ。

（式中、ＭＦα１はサツカロミセス　セレヴイシアエ成熟ファクターα１をコー ドする配列（クルシャン、ジェスおよびヘルスコウィッッ、アイ、、　Ｃｅ１ｌ 　３０（１９８２）、９３３−９４３＞であり、シグナル−リーダー（１−８５ ）は配列がＭＦα１シグナル−リーダー配列の最初の８５個のアミノ酸残基を含 むことを意味し、アプロチニン（３−５８）は最初の２つのアミノ酸残基が欠除 しているアプロチニン誘導体をコードする合成配列である。

サツ力ロミセスセレウイシアエ菌株ＭＴ６６３　（Ｅ２−７８．　ＸＥＩＩ−３ ６ａ／α、ΔｔｐｉΔｔｐｉ、　ｐｅｐ４−３／　ｐｅｐ４３）はＹＰＧａＬ　 （１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラクテ ート）中で増殖して０．　Ｄ、　６００ｎｍ　Ｏ，６までにした。

得られた培養物１００ＷＬ１を遠心分離により採取し、水１０顧で洗い、再度遠 心分離し、１．２Ｍソルビトール、２５ｍＭＮａＪＤＴＡ　ｐｌｉ＝　８．０お よび６．７ｍｇ／ｍｌジチオトレイトールを含む溶液１０ｒｎｌ中に再度懸濁し た。懸濁液を１５分間３０ｔ’でインキュベートし、遠心分離し、そして細胞を １．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐ）Ｉ＝５．８および２■のノボザイム０２３４を含む溶液１０ｍ１中に再 度懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離によ り集め、１．２Ｍソルビトール１０ｍｊ！およびＣＡＳ（１，２Ｍソルビトール 、１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、１０ｍＭ）リスＨＣＩ（）リス＝トリス（ヒドロキシ メチル）アミノメタン）ｐＨ＝７．５＞１０ｍ１中で洗浄し、ＣＡＳ２ｒｄ中で 再懸濁した。

形質転換のためＣＡＳ再懸濁化細胞０．１ｍ７！をプラスミドｐＫＰＮ３７４は ぼ１眉と混合し、室温で１５分間放置した。（２０％ポリエチレングリコール４ ０００．１０ｍＭ　ＣａＣ１，，１０ｍＭ）リスＨＣＩ　、ｐＨ＝７．５）　１ ｍｊ！を添加し、混合物をさらに３０分間室温で放置した。混合物を遠心分離し 、ペレットを５Ｏ３（１，２Ｍソルビトール、３３％ｖ／　ｖ　Ｙ　Ｐ　Ｄ、　 ６．７　ｍＭ　ＣａＣｌ２．１４ｘ／ｒＩＴｉロイシン）０．１ｄに再度懸濁し 、３０℃で２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離し、ペレットを １．２Ｍソルビトール０．５ｍｌ中に再度懸濁した。次いで、５２℃でトップ寒 天（シェアマンらのＳＣ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ、　：ｌ−ルド　スプリング　ハーバ−ラボラトリイ、　１９８１）　１． ２　Ｍソルビトール＋２．５％寒天を含む）６ｄを添加し、懸濁液を同種の寒天 固化ソルビトール含有培地を含むプレートのトップへ注入した。３０℃で３日後 に形質転換体コロニーを選び、再度単離しそしてこれを用いて液体培養を開始し た。このような形質転換体ＫＦＮ３２２の１つがさらに特性決定のため選択され た。

酵母菌株にＦＮ３２２をＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン（ディフコ 　ラボラトリイズから）および２％グルコース）上で増殖した。菌株の培養液１ ０ｍ１を０．０．６００ｎｍが３２になるまで３０℃で振とうした。遠心分離後 、上澄をＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィにより分析した。酵母上澄を０． ２２−ミレックスＭｉｌｌｅｘ＠　ＧＶフィルターユニットに通過させ、１ｉを ２０ｍＭバイシンＢｉｃｉｎｅ、　ｐＨ８，７で平衡化したモノニスＭｏｎｏＳ 陽イオン交換カラム（０，５Ｘ　５　ｃｍ）に施こした。

平衡緩衝液で洗浄後、カラムを直線状ＮａＣ１勾配（０−ＬＭ）平衡緩衝液で溶 出した。溶出されたフラクションにおける分光光度分析およびさらに次式 からの２８０ｎｍにおける吸光度の積算によりトリプシン阻害活性を定量化した 。

収率はアプロチニン（３−５８）約３■／ｅであった。

例７ 酵母菌株ＬａＣ１６６７からのインシュリン前駆体Ｂ　（１−２９）　−Ａ　１ ａＡ　１ａＬｙｓ−Ａ　（１−２１）の産生 ５８９ｂｐ　５ｐｈｌ−Ｎｃｏｒおよび１７２ｂｐ　Ｈｐａｌ−Ｘｂａ［フラグ メントをｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３　（国際特許出願第Ｗ０８９１０２４６３号に 記載）から単離した。これらのフラグメントは合成アダプターＭ　Ａ　Ｋ　Ｅ　 Ｌ　Ｅ　Ｋ　ＲＦ　ＶＮＯＲ−９６２ＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡ ＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＴＴＮＯＲ−９６４ＣＧＡＴＴＣＣＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴ ＣＴＣＴＡＡＧＣＡＡおよびｐＭＴ７４３　（国際特許出願第８９１０２４６３ 号に記載）からの１０ｋｂ　Ｘｂａｌ−３ｐｈ［フラグメントと結合し、その結 果プラスミドｐＬａｃ２４０が得られた（第１５図参照）。ｐＬａｃ２４０から の修飾されたリーダー−インシュリン前駆体のＤＮＡ配列を第４６図に示す。

酵母菌株ＭＴ６６３のプラスミドｐＬａｃ２４０を用いた形質転換によりインシ ュリン前駆体分泌菌株、ＬａＣ１６６７（ＭＴ６６３／　ｐＬａｃ２４０）が生 じ、その産生率は国際出願第８９１０２４６３号に記載の未修飾リーダー−イン シュリン前駆体についての遺伝子を含む菌株ＬａＣ１４１４（ＭＴ６６３／　ｐ Ｌａｃ２１２ｓｐｘ３）と比較して１６５％である。

例８ 酵母菌株ＫＦＮ−４７０からのインシュリン類似物質前駆体Ｂ　（１−２９゜Ｉ Ｇ　ｌｕ　＋　２７Ｇ　１　ｕ）　−Ａ　１　ａＡ　１ａＬｙｓ−Ａ　（１−２ １）の産生１０個のオリゴヌクレオチドの連結によりインシュリン類似物質前駆 体Ｂ（１−２９，ＩＧｌｕ＋２７Ｇ１ｕ）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ（１−２１ ＞をコードする合成遺伝子を構築した。Ｂ（１−２９，１Ｇ１ｕ＋２７Ｇ１ｕ） は、ヒトインシュリンのＢ鎖の最初の２９のアミノ酸残基であってその際Ｇｌｕ 残基がＢＩＰｈｅおよびＢ２７Ｔｈｒ残基で置換された基を含むポリペプチドを 表わす。Ａ（１−２１）はヒトインシュリンのＡ鎖でる。トリペプチド、Ａｌａ ＡｌａＬｙｓはＢ２９Ｌｙｓ残基をＡＩＧ１ｙ残基へ結合する。

次の１０個のオリゴヌクレオチドが合成された：Ｎ０Ｒ−５４２：　ＡＡＡＧＡ ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＣＮＯＲ−５４ ３：　ＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡＡＣ ＴＴＣＮＯＲ−６９：ＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧ ＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＮＯＲ−７３：　ＧＴＡＧＡ八ＧＡＡへＣ （１へＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＮＯＲ −３１５：　ＴＣＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧ ＣＴＮＯＲ−３１６：　ＡＴＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣ ＣＴＴＡＣＧＴＴＣＮＯＲ−７０：　ＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡ ＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＮＯＲ−７１：　ＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴ ＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＮ［１Ｒ−７８：　 ＴＧＧＡＡ八ＡＣＴへＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＡＧＧＣＴ ＮＯＲ−７２：　ＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＧＴＣＴＡＧＴＴＧＣ ＡＧＴＡＧ５つの二本鎖が上記１０個のオリゴヌクレオチドから形成され、二本 鎖は例１に記載されたと同様の方法で連結された。

合成１７８ｂｐ遺伝子は、サツカロミセス　セレヴイシアエ成熟ファクターα１ シグナル−リーダー（１−８５）配列（マルクッセン、ジエイ、ら、Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１　（１９８７）。

２１５−２２３）をコードするｐＫＦＮ−９からの３３０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｈ ｇａ［フラグメントとプラスミドｐＵｃ１９　（ヤーニッシューペロン、シイ１ ．ヴイエイラ、ジェイ、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、およびメシッヒ、ジェイ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　３３（１９８５）、ＬＯ３−１１９）の２ ．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとに連結した。

連結混合物を用いてアンピシリン耐性を選択するコンピテント大腸菌株７−、ｍ ”）を形質転換した。”Ｐ−Ｘｂａ［−ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決定（マ キサム、ニーおよびギルバート。

ダブリュ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　［ｉｎｚｙｍｏｌ、６５（１９８０）、４９９ −５６０）により、得られたコロニーからのプラスミドがインシュリン類似物質 前駆体についての正しいＤＮＡ配列を含むことがわかった。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−４５６が別の用途のために選択された。

例１の手順にしたがって酵母発現プラスミドｐＫＦＮ−４５８が次の発現カセッ トを含んで得られた： Ｔｔ’ｒ、−ＭＰα１−シグナル−リーダー（１−８５）　−８（１−２９，Ｉ Ｇ　Ｉｕ　＋２７Ｇ　ｌｕ）　−Ａ　１ａＡ　ＩａＬｙｓ−Ａ　（１−２１＞　 −ＴＰ　ｈｐＫＦＮ−４５６およびｐＫＦＮ−４５８からの５０８ｂｐ　Ｅｃｏ ＲＩ−ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を第１７図に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−４５８を上述のように酵母株ＭＴ−６６３へ形質転換しそ の結果酵母菌株ＫＦＮ−４７０が得られた。

ＹＰＤ培地中での形質転換された菌株ＫＦＮ−４７０の培養を上述のように実施 した。上澄におけるインシュリン類似物質前駆体の収率は上述のようにＨＰＬＣ により測定した（エル。

スネルＬ−３ｎｅｌら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ　２４（１９８７）、 ３２９−３３２）。

第２表において、インシュリン類似物質前駆体Ｂ　（１−２９，ＩＧ　Ｉｕ＋２ ７Ｇ１ｕ）−ＡｌａＡＩａＬｙｓ−Ａ（１−２１）と８　（１−２９，２７Ｇ１ ｕ）−ＡｌａＡＩａＬｙｓ−Ａ（１−２１）およびインシュリン前駆体Ｂ（１− ２９）−ＡｌａＡｌａＬＹｓ−Ａ（１−２１＞の発現レベルを比較する。発現カ セットを有するプラスミドを含むサツカロミセス　ポンベＴＰＩ遺伝子で形質転 換された同じ宿主菌株ＭＴ−６６３においてすべての３つの前駆体が発現された 。

ＴＰＩＰ−ＭＦα１−シグナル−リーダー（１−８５＞前駆体−ＴＰＩ。

第２表 酵母形質転換体におけるインシュリンおよびインシュリン類似物質の前駆体の発 現レベル 前　駆　体　発現レベル０ Ｂ　（１−２９）　−Ａ　ＩａＡ　ＩａＬｙｓ−Ａ　（１−２１）　１００％Ｂ 　（１−２９）　、　２７ＧＬｕ）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ　（１−２１）　 １４８％Ｂ　（１−２９，１Ｇ１ｕ＋　２７Ｇ１ｕ）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ 　（１−２１）　４７９％＊　発現レベルはインシュリン前駆体Ｂ　（１−２９ ）　−Ａ　１ａＡ　ＩａＬｙｓ−Ａ（１−２１）の発現レベルのパーセントとし て示され、これは任意に１００％とされる。

Ｆｉｇ、１ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ １ｉｊｊ：ＬｙｓＡ１ａＶａｌｆ’ｈｓｌ，ｅｕＶａｌＬ費ｕＳｅｒＬ，ｅｕ工 １＊Ｇ１ｙｆ’ｈｅＣｙｓ丁ｒｐＡｌａＧ１ｎＰｒｏＶａｌτｈｒＧ１ｙＡｓｐ ＧｌｕＳ＠ｒＳ＊ｒＶａＬＧＬｕ工１ｅＰｒｏＧｌｕＧ１ｕＳ＠ｒＬｅｕｘｌｅ Ｘ１ｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｈｒＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓ Ａ１ａＡｒｇＸ１ｅ工１＠ＡｒｇＴｙｒＰｈｅ？ｙｒＡｓｎＡｌａＬ．ｙｓＡｌ ａＧｌｙＬ，ｅｕｃｙｓＧ１ｎＴｈｒＰｈｅＶａＬＴｙｒＧｌｙＧ１ｙＣｙｓＡ ｒｇ入ｘａＬｙｓＡｒａ入ｓｎ入ｓｎＦｉｇ．　４ Ｆｊｇ．　６ ＭＥＴＬｙｓＡｌａＶａｌＰｈｓＬｅｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＬｅｕ工１ｅＧｌｙ ＰｈｅｃｙｓＴｒｐＡｌａＧｌｎＰｒｏＶａＬ’ｒｈｒＧｌｙＡｓｐＧｌｕＳｅ ｒＳｅｒＶａｌＧｌｕ工１ｅＰｒｏＧ１ｕＧｌｕｓｅｒＬｅｕ工１ｅ工１＠Ａｓ 　ｐＰｈ　ｅＣｙｓ　Ｉ、ｅｕＧｌｕＰｒｏ？ｒｏＴｙｒ？ｈｒＧｌｙＰｒｏＣ ｙｓ　ＬｙｓＡ　１ａＡｒｇＩｌ　ｅ工１ｅＡｒｇＴｙ窒oｈｅ ＴｙｒＡｓｎ＾１　ａ　ＬｙｓＡｌ　ａＧｌ　ｙＬｅｕｃｙｓに１ｎＴｈｒＰｈ ｅＶａｌＴｙｒＧ１　ｙＧｌ　ｙＣｙｓＡｒｇＡｌａＬｙｓ`ｒｇ ｌｏ　２０　３０　４０　５０　６０ ＭＥＴＬｙｓＡｌａＶａｌＰｈｅＬｅｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＬｅｕ工１ｅＧｌｙ ＰｈｅｃｙｓＴｒｐ入１ａＧｌｎＰｒｏＶａｌＴｈｒＧｌｙＡｓｐＧｌｕＳｅｒ ＳｅｒＶａｌＧｌｕ工１ｅＰｒｏＧｌｕＧｌｕＳａｒＬａｕ工１ｅｌｌｅ２５０ 　２６０　２フ０　２１１０　２９０　３００人ｓｐＰｈｅＣｙｓＬａｕＧｌｕ ＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｈｒＧｌｙＰｒｏｃｙｓＬｙｓＡｌａＡｒｇ！　１ｅ工１ ｅＡｒｇＴｙｒＰｈｅ１　・ ＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧ’ｒＣＡＡＡＣＴｒＴＣＧ ＴＴＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡ入ＧＡＧＴｙｒＡｓｎＡｌａＬｙ ｓＡ１ａＧｌｙＬｓｕｃｙｓＧｌｎＴｈｒＰｈｅＶａ１’ｒｙｒＧｌｙＧｌｙｃ ｙｓＡｒｇＡ１ａＬｙｓＡｒｇＦｉｇ、　９ Ｆｉｇ、　１０ ＭＥＴＩ，ｙｓλ１ａＶａｌＰｈ＊ＬｅｕＶａｌＬａｕＳｅｒＬａｕＩｌａＧＬ ｙＰｈａＣｙｓＴｒｐＡｌａＧｌｎＰｒｏＶａｌＴｈｒＧ１ｙＡｓｐＧ１ｕＳｅ ｒＳｅｒＶａｌＧｌｕ工１＊ＰｒｏＧｌｕＧ１ｕＳｅｒＬｅｕ工Ｌ＊Ｉ１ｅ入１ ａＧｌｕＡｓｎＴｈｒＴｈｒＬｅｕＡｌａＡｓｎＶａＩＡＩａＭＥＴ’ＡｌａＧ ｌｕＡｒｇＬｅｕＧＷＬｙｓ入ｒｇ入ｒｇＰｒｏｋ　↑ 入ｓｐＰｈｅｃｙｓＬｓｕＧｌｕｉ’ｒｏＰｒｏＴｙｒＴｈｒＧ１ｙｆ’ｒｏｃ ｙｓＬｙｓＡｌａＡｒｇＩｌｅ工ｌ＊ＡｒｇＴｙｒＰｈ＊τｙｒ入ｓｎ入１ａＬ ｙｓ入１ａＧＬｙＬ，ｅｕｃｙｓＧＬｎ？ｈｒｌ？ｈ＠ＶａｌτｙｒＧ１ｙＧｌ ｙＣｙｓ入ｒｇＡｌａＬ＋Ｙ！！入ｒ■ ＡｓｐＰｈａＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｈｒＧｌｙＰｒｏｃｙｓ ＬｙｓＡ１ａＡｒｇＸ　ｌｅＸ　ｌｅＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡｌａＬ ｙｓＡｌａＧｌｙＬａｕｃｙｓＧ１ｎＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧ　ｌｙＣｙｓ ＧｌｙＧ１ｙＡｌａＳｔＳ区ｋ区ＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＭＴ ＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＴＣヌ　Ｃｌｏｆ ＭＥＴＬｙｓＡｌａＶａｌＰｈｅＬｅｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＬｅｕ工１ｅＧ１ｙ Ｐｈｅｃｙｓ’ｒｒｐＡＸａＧｌｎＰｒｏＶａｌＴｈｒＧ１ｙＡｓｐＧｌｕｓｅ ｒｓｅｒＶａＩＧｌｕ！ｌ＊ｆ’ｒｏＧｌｕＧｌｕＳ＊ｒＬ＠ｕＩｌｅＸｌ＠Ａ ｓｎＧＬｎＨｉｓＬ＠ｕＣｙｓＧｌｙＳ＠ｒＨｉｓＬ＠ｕＶａｌＧ１ｕ入１ａＬ ＠ｕ？ｙｒＬ＠ｕＶａｌＣｙｓＧｌｙＧｌｕ▲ｒｇＧｌｙＰｈ＠ＰｈｅＴｙｒ？ ｈｒＰｒｏＬｙｍ入１ａ入１ａＬｙｓＧｌｙｘｌ＊！／ａｌＧ１ｕＧｌｎｃｙｓ ｃｙｓτｈｒｓ＊ｒ！ｌ＊ＭＥＴＡｒｇＰｈｓＰｒｏＳ＠ｒＸｌｅＰｈｓ’ｒｈ ｒ入１ａＶａｌＬ＠ｕＰｈ＊入１ｍＡ１ａｓｓｒＳｅｒＡｌａＬａｕ入１ａＡｌ ａＰｒｏＶａｌＡｓｎＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧｌｕＡｓｐＧ１ｕＴｈｒＡ１ａＧ１ ｎＸ１ｅＰｒｏ入１．Ｇｌｕ入１ｍＶｍｌＸｌｅＧｌｙ’ｒｙｒＬｅｕ入ｓｐＬ ｅｕＧｌｕＧ１ｙ入ｓｐＰｈｅ入ｓｐＶａｌ入１ａＶａｌＬｓｕｆ’ｒｏＰｈ＊ ｓ＠ｒｘｓｎｓａｒτｈｒＡｓｎＡｓｎＧ１ｙＬ＠ｕＬ＊ｕＰｈ＊Ｚｌ＊＾ｓｎ 〒ｈｒ〒ｈｒＩｌｅＡｌａｓｅｒＩｌｅＡｌｍＡｌｍＬ，ｙｓＧ１ｕＧｌｕＧｌ ｙＶａｌＳ＊ｒＬ＊ｕＡｓｐＬ，ｙｓＡｒｇＧ１ｕＶａｌ入ｓｎＧｌｎ阻ル管ｕ ＣｙｓＧｌｙＳ＊ｒＨｉｓｔ ＬｅｕＶａｌＧｌｕ入１ａＬｅｕＴｙｒＬｅｕＶａＩＣｙｓＧｌｙＧｌｕＡｒｇ ｃ１ｙＰｈ＠Ｐｈ＠’ｒ’ｙｒＧ１ｕＰｒｏＬｙｓ入１ａ入１ａＬｙｓＧｌｙＸ ｌｅＶａｌＧｌｕＧｌｎＣｙｓＣｙｓＴｈｒＳａｒ！ｌ＠ｃｙｓｓ＠ｒムｅｕ↑ ｙｒＧｌｎＬｅｕＧ１ｕＡｓｎＴｙｒＣｙｓｋｓｎ　Ｆ１９．Ｌ７ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年９月３　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリペプチドがリーダーペプチドのＣ末端と異種タンパク質のＮ末端の間に 位置する酵母プロセッシング部位に隣接するそのアミノ酸配列において修飾され これによりタンパク質分解切断を受けやすくしたプロセッシング部位が提供され 、該ポリペプチドは次の構造式： シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−異種タンパク 質 （式中、Ｘ１はペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なってもよい１つ以 上のアミノ酸を表わし、Ｘ２およびＸ３は同一または異なってもよく、Ｌｙｓお よびＡｒｇからなる群から選択される塩基性アミノ酸を表わし、Ｘ２およびＸ３ は一緒になって酵母プロセッシング部位を限定し、そして Ｘ４はペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なってもよい１つ以上のアミ ノ酸を表わし、 ただしＸ１および／またはＸ４は１つ以上のアミノ酸を表わしそしてＸ１および ／またはＸ４で表わされるアミノ酸の少なくとも１つはＧｌｕおよびＡｓｐから なる群から選択される負に帯電したアミノ酸である） を有することからなる、シグナルペプチド、リーダーペプチドおよび異種タンパ ク質またはポリペプチドの融合物からなるポリペプチド。 ２．Ｘ１がＧｌｕまたはＡｓｐを表わす請求の範囲第１項に記載のポリペプチド 。 ３．Ｘ１が構造式ＢＡで表わされる２つのアミノ酸の配列を表わし、その際Ａが ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ＢがＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＬｅｕ である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ４．Ｘ１が構造式ＣＢＡで表わされる３つのアミノ酸の配列を表わし、その際Ａ およびＢは前記定義のものであり、ＣはＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｖａ ｌ，Ｌｅｕ，ＡｒｇまたはＬｙｓである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド 。 ５．Ｘ１が構造式ＤＣＢＡで表わされる４つのアミノ酸の配列を表わし、その際 Ａ，ＢおよびＣは前記定義のものであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範囲 第１項に記載のポリペプチド。 ６．Ｘ１が構造式ＥＤＣＢＡで表わされる５つのアミノ酸の配列を表わし、その 際Ａ，Ｂ，ＣおよびＤは前記定義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請求 の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ７．Ｘ１が構造式ＦＥＤＣＢＡで表わされる６つのアミノ酸の配列を表わし、そ の際Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥは前記定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有す る請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ８．Ｘ４がＧｌｕまたはＡｓｐである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ９．Ｘ４が構造式ＡＢで表わされる２つのアミノ酸の配列を表わし、その際Ａは ＧｌｕまたはＡｓｐでありＢはＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＬｅｕで ある請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １０．Ｘ４が構造式ＡＢＣで表わされる３つのアミノ酸の配列を表わし、その際 ＡおよびＢは前記定義のものであり、ＣはＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｖ ａｌ，Ｌｅｕ，ＡｒｇまたはＬｙｓである請求の範囲第１項に記載のポリペプチ ド。 １１．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤで表わされる４つのアミノ酸の配列を表わし、その 際Ａ，ＢおよびＣは前記定義のものであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範 囲第１項に記載のポリペプチド。 １２．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤＥで表わされる５つのアミノ酸の配列を表わし、そ の際Ａ，Ｂ，ＣおよびＤは前記定義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請 求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １３．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤＥＦで表わされる６つのアミノ酸の配列を表わし、 その際Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥは前記定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有 する請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １４．Ｘ１および／またはＸ４が２個以上のアミノ酸を表わし、Ｘ２に直接隣接 するアミノ酸がＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘ３に直接隣接するアミノ酸がＧｌ ｕまたはＡｓｐであり、または両方ともがＧｌｕもしくはＡｓｐである請求の範 囲第１項に記載のポリペプチド。 １５．Ｘ１および／またはＸ４が２個以上のアミノ酸を表わし、Ｘ１もしくはＸ ４のいずれかまたは両方ともが２個以上のＧｌｕまたはＡｓｐからなる請求の範 囲第１項に記載のポリペプチド。 １６．Ｘ１およびＸ４の両方ともが１個以上のアミノ酸を表わす請求の範囲第１ 項に記載のポリペプチド。 １７．Ｘ１およびＸ４が対称的同一である請求の範囲第１６項に記載のポリペプ チド。 １８．Ｘ４が１個以上のアミノ酸を表わし、さらに別のプロセッシング部位がＸ ４と異種タンパク質のＮ−末端の間にもたらされる請求の範囲第１項に記載のポ リペプチド。 １９．シグナルペプチドがα−ファクターシグナルペプチド、マウス唾液アミラ ーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチドまたは酵母 ＢＡＲ１シグナルペプチドである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ２０．リーダーペプチドが天然リーダーペプチドたとえばα−ファクターリーダ ーペプチドである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ２１．リーダーペプチドがたとえば Ａ．【配列があります】 Ｂ．【配列があります】 Ｃ．【配列があります】 Ｄ．【配列があります】 Ｅ．【配列があります】 のような合成リーダーペプチドである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ２２．異種タンパク質またはポリペプチドが、アプロチニンまたは他のプロテア ーゼ阻害剤、インシュリンおよびインシュリン前駆体、ヒトまたはウシ成長ホル モン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、グルカゴン、 ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＸＩＩＩ因子、血小板由来増殖因子、酵素およびこ れらタンパク質のいずれかの機能的類似物質からなる群から選択される請求の範 囲第１項に記載のポリペプチド。 ２３．異種タンパク質またはポリペプチドがアプロチニンまたはその機能的類似 物質である請求の範囲第２２項に記載のポリペプチド。 ２４．Ｘ１がＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＧｌｕまたはＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕである請求の範囲第２３項に記載のポリペプチド。 ２５．Ｘ４がＧｌｕ−ＬｅｕまたはＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕである請求 の範囲第２３項に記載のポリペプチド。 ２６．異種タンパク質またはポリペプチドがインシュリンもしくはインシュリン 前駆体またはその機能的類似物質である請求の範囲第２２項に記載のポリペプチ ド。 ２７．Ｘ１がＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＧｌｕまたはＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕである請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。 ２８．Ｘ４がＧｌｕである請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。 ２９．異種タンパク質またはポリペプチドがインシュリン類似物質前駆体Ｂ（１ −２９）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ（１−２９）でありＸ１がＬｙｓ−Ｇｌｕ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕである請求の範囲第２６項〜第２８項のいずれか１に記載のポリ ペプチド。 ３０．異種タンパク質またはポリペプチドがインシュリン類似物質前駆体Ｂ（１ −２９）−ＳｅｒＡｓｐＡｓｐＡｌａＬｙｓ−Ａ（１−２９）であり、Ｘ１がＬ ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕである請求の範囲第２６項〜第２８項のいずれか １に記載のポリペプチド。 ３１．請求の範囲第１項〜第３０項のいずれか１に記載のポリペプチドをコード するＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物。 ３２．図４，７，９または１１に示すＤＮＡ配列またはその適当な修飾物からな る請求の範囲第３１項に記載のＤＮＡ構築物。 ３３．酵母において複製することができ請求の範囲第３１項または同第３２項に 記載のＤＮＡ構築物を保持する組換体発現ベクター。 ３４，異種タンパク質またはポリペプチドを発現することができ請求の範囲第３ ３項に記載のベクターで形質転換される酵母菌株。 ３５．適当な培地中で請求の範囲第３４項記載の酵母菌株を培養して異種タンパ ク質またはポリペプチドの発現および分泌／プロセッシングを得、その後タンパ ク質またはポリペプチドを培地から単離することからなる酵母における異種タン パク質またはポリペプチドの製造方法。 ３６．一般式Ｘ４−アプロチニン（１−５８）で表わされ、その際Ｘ４が少なく とも１つがＧｌｕおよびＡｓｐからなる群から選択される負に帯電されたアミノ 酸である１個以上のアミノ酸によるＮ末端延長部を表わすアプロチニン類似物質 。 ３７．Ｘ４がＧｌｕまたはＡｓｐである請求の範囲第３６項に記載の類似物質。 ３８．Ｘ４が構造式ＡＢで表わされる２つのアミノ酸の配列を表わし、その際Ａ はＧｌｕまたはＡｓｐであり、ＢはＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＬｅ ｕである請求の範囲第３６項記載の類似物質。 ３９．Ｘ４が構造式ＡＢＣで表わされる３つのアミノ酸の配列を表わし、その際 ＡおよびＢは前記定義のものであり、ＣはＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｖ ａｌ，Ｌｅｕ，ＡｒｇまたはＬｙｓである請求の範囲第３６項に記載の類似物質 。 ４０．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤで表わされる４つのアミノ酸の配列を表わし、その 際Ａ，ＢおよびＣは前記定義のものであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範 囲第３６項に記載の類似物質。 ４１．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤＥで表わされる５つのアミノ酸の配列を表わし、そ の際Ａ，Ｂ，ＣおよびＤは前記定義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請 求の範囲第３６項に記載の類似物質。 ４２．Ｘ４が構造式ＡＢＣＤＥＦで表わされる６つのアミノ酸の配列を表わし、 その際Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥは前記定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有 する請求の範囲第３６項に記載の類似物質。 ４３．Ｘ４が２個以上のアミノ酸を表わし、Ｘ４がＧｌｕまたはＡｓｐ２個以上 からなる請求の範囲第３６項に記載のポリペプチド。 ４４．Ｘ４がＧｌｕ−ＬｅｕまたはＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕである請求 の範囲第３６項に記載の類似物質。