CN101243190B - 制备成熟胰岛素多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌大量正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。

Description

制备成熟胰岛素多肽的方法
发明领域
本发明涉及在酵母中制备成熟人胰岛素类似物的方法。
发明背景
胰岛素是在胰岛β细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处切割C-肽形成。A-和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子还在A6和A11位Cys残基之间有一个内部二硫键。
在开发出重组DNA技术之后，已经描述了许多在基因修饰宿主细胞中生产胰岛素及其前体的方法。因此在例如Frank，B.H.，Pettee，J.M.，Zimmerman，R.E.& Burck，P.J.In：Peptides Synthesis-Structure-Function.Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium(D.H.Rich和E.Gross，eds).Pierce Chemical Company，p.729(1981)中公开了从大肠杆菌(E.coli)中制备胰岛素的方法。由于大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行折叠的细胞机器且不确立在成熟胰岛素中连接A-和B-链的二硫键，所以，该策略包括了许多体外加工步骤，比如在重折叠过程中体外确立二硫键以及随后的C-肽切割。
与大肠杆菌形成对比，真核生物包含折叠和确立二硫键所必需的机器，且由此看来似乎是用于在基因修饰生物中生产成熟胰岛素的好候选者。美国专利US 4,914,026公开了一种在酵母中生产成熟胰岛素的方法，其通过下述实现，在酵母宿主细胞中插入与酵母α-因子前导序列相连的人胰岛素原基因并在一定条件下使转化酵母细胞在营养培养基中生长，由此表达和分泌成熟形式的胰岛素原。
Thim等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，第83卷，第6766-6770页，公开了人胰岛素原以及多种带有经过修饰的C-肽的胰岛素前体的表达，所述经过修饰的C-肽例如RREAENLQKR(SEEQ ID NO：1)、RREAPLQKR(SEQ ID NO：2)、RREALQKR(SEQ ID NO：3)、KREALQKR(SEQ IDNO：4)和RRLQKR(SEQ ID NO：5)。SEQ ID NO：5还公开于Thim等人，FEBS Letters，第212卷，第2期，第307-312页。
此外，WO 97/03089公开了式为BZA的胰岛素前体的表达，其中B和A是通过至少一个二硫键相连的人胰岛素A和B肽链，Z是包含至少一个蛋白酶剪切位点的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQ ID NO：6)。
然而，所公开的胰岛素前体仅在培养基中产生微量分泌的成熟胰岛素。
欧洲专利申请0163529A、PCT专利申请号WO 95/02059和WO90/10075公开了基于胰岛素或胰岛素类似物前体在酵母中的表达来制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，这些胰岛素或胰岛素类似物前体在从发酵液体培养基中初始回收后被酶促转化为成熟胰岛素或胰岛素类似物。这些前体分子包含特定的经过修饰的C-肽，且还包含胰岛素B-链的N-末端延伸。经过修饰的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被设计成不在酵母中细胞被切割，且由此前体作为单链肽分泌，其中A-和B-链仍然通过经过修饰的C-肽连接但具有正确定位的二硫键。之后通过许多随后的体外酶促步骤以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰岛素或胰岛素类似物产物。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且导入随后在进一步的下游加工步骤比如昂贵的层析步骤等中必须被除去的额外杂质。
美国专利号6,348,327中公开了在不能天然形成分泌颗粒的基因工程改造的动物细胞中制备成熟胰岛素的方法。
本发明的目的是开发能够分泌完全加工的成熟人胰岛素类似物的真菌菌株，由此避免昂贵且费时的下游纯化方法步骤。
发明概述
一方面，本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。
根据本发明的人胰岛素类似物在真菌细胞内将作为单链前体表达，且将在该细胞内被切割，并以成熟、双链人胰岛素类似物分泌，无需进一步的体外加工。
位于连接肽与胰岛素分子A-和B-链各接点处的切割位点可以相同或不同，但通常是相同的，且在一种实施方案中，位于与A-和B-链接点处的切割位点均为Kex2切割位点。
在另一种实施方案中，切割位点为Yps1位点。
连接肽将具有经过最优化以确保在真菌细胞内发生切割以分泌正确成熟化的胰岛素类似物多肽的氨基酸组成。
在本发明的一种实施方案中，对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met和Ala。
在本发明的另一种实施方案中，连接肽在对于与A-链接近的切割位点倒数第二位将包含Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Val或Ala氨基酸残基。
在本发明的又一种实施方案中，连接肽在该位置将包含Leu或Ile氨基酸残基。
我们还发现，相同位置的氨基酸残基不应当是Asp、Glu或Gly。
人胰岛素中C-肽的大小是35个氨基酸残基。因此在本发明的一个方面，该连接肽为约与天然C-肽相同长度。
在一种实施方案中，连接肽将为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。
在又一种实施方案中，连接肽将为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。
在又一种实施方案中，连接肽将由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34或35个氨基酸残基组成。
真菌细胞将分泌大量正确加工的人胰岛素类似物，且在一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
对来自胰岛素类似物前体分子的连接肽的切割越有效，靶蛋白的终产量越高。因此，连接肽的氨基酸组成使得能够分别对其与A-和B-链接点处的切割位点进行有效切割将是令人满意的。
在本发明的一种实施方案中，至少50％表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。
在另一种实施方案中，至少60％表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。
在又一种实施方案中，至少70％表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。
在又一种实施方案中，至少75％表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。
在又一种实施方案中，至少85％或至少95％表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。
真菌细胞可以是任何能够表达和分泌成熟胰岛素类似物的真菌细胞。然而，酵母，尤其是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)，已显示为最适于本发明目的的。
人胰岛素分子有三个螺旋结构，一个在B-链中，且两个在A-链中。A-链含有通过A9-A11位环相连的两个螺旋部分A2-A8和A13-A19，且在胰岛素的T-状态构象中，残基B9-B19形成B-链的中央α-螺旋。已显示，胰岛素分子中的特定突变将增强这些螺旋结构的稳定性，从而导向高的生物学活性(参见N：Kaarsholm等人，Biochemistry 1993，32，10773-10778)。由本发明方法制备的胰岛素类似物通常将含有对人胰岛素类似物分子螺旋结构具有稳定作用从而导致更高产量分泌的突变。
因此，在一种实施方案中，由本发明方法制备的胰岛素类似物在胰岛素分子A8、B10和A14位中的一个或多个位置将含有突变，且在又一种实施方案中，这些位置的天然氨基酸残基可突变为选自Asp、Glu、His、Gln和Arg的氨基酸残基。
胰岛素分子的其它突变包括在B28和B29位的突变、在A18位的突变、B30或B1氨基酸残基的缺失以及A21氨基酸残基的突变。
在本发明的一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp且B29位氨基酸残基是Lys。
在本发明的另一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp，B29位氨基酸残基是Pro，且B30位氨基酸残基是Thr。
在本发明的又一种实施方案中，A18位的氨基酸是Gln。
在本发明的又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基是Gly。
在本发明的另一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu。
在本发明的另一种实施方案中，A8位的氨基酸残基是His。
在本发明的另一种实施方案中，A14位的氨基酸残基是Glu。
在本发明的又一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu，A8位的氨基酸残基是His，且A14位的氨基酸残基是Glu。
在本发明的又一种实施方案中，B30位的氨基酸残基缺失。
在一种实施方案中，人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列
B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)
其中，B(1-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(1-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Yps1位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。
在一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Lys-Arg。
在另一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Arg-Arg、Lys-Lys或Arg-Lys。
在又一种实施方案中，X-X是Lys-Arg且Y-Y是Arg-Arg，或X-X是Arg-Arg且Y-Y是Lys-Arg。
在一种实施方案中，Z的大小为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。
在又一种实施方案中，Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。
在本发明的一种实施方案中，Z的大小可以是2、3、4、5、7、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34和35个氨基酸残基。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-20个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-19个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-18个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-14个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-13个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-12个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-11个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-10个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-9个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-8个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-7个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-6个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-5个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，Z是3-4个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Trp、Val、Met和Ala。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Leu。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Ile。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Tyr。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Arg。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Lys。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是His。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Pro。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Phe。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Trp。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Met。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Val。
在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Ala。
在本发明的一种实施方案中，Z具有序列AspGlyLeuGly(SEQ IDNo：7)。
其余的Z为任何可编码的氨基酸残基，它们可以相同或不同。然而，在一种实施方案中，Z中对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基不是Asp、Glu或Gly。
另一方面，本发明涉及编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
另一方面，本发明涉及含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列的表达载体，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
在又一方面，本发明涉及含有表达载体的转化的真菌细胞，所述表达载体含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。
用本发明方法生产的人胰岛素类似物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。
在有利的情况下，胰岛素类似物也可以以与其它类型的胰岛素的混合物使用，例如具有更快开始作用的胰岛素类似物。胰岛素类似物的例子描述于，例如公开号为EP 214826、EP 375437和EP 383472的欧洲专利申请中。
另一方面，本发明涉及含有人胰岛素类似物与适宜的药学可接受佐剂和添加剂，比如一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂组合的药物制剂。
附图简述
图1显示称作pSA50的酵母质粒例子。该质粒包含表达盒，所述表达盒含有插入到该质粒中啤酒糖酵母TPI基因转录启动子和转录终止子之间的EcoRI-XbaI片段。
图2显示实施例3中所述的包含胰岛素前体B(1-30)-KRDGLGKR-(A1-21)，A18Q的NcoI-XbaI DNA片段(SEQ ID NO：8)，及其相应氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
图3显示对起始体积为1.25L的发酵罐的物料添加速率(g物料/分钟)的时间曲线。还显示了作为时间函数的发酵罐中废气中的二氧化碳浓度。以及
图4显示在600nm处测量的光密度和计算得到的每升发酵液体培养基胰岛素的浓度的时间曲线(包括desB30胰岛素)。
发明详述
通过直接向发酵液体培养基中分泌成熟产物来生产胰岛素需要对含有在两个末端都侧接切割位点的连接肽的胰岛素前体进行细胞内加工。这样的连接肽可以是B-KR(W)nKR-A型，其中B是人胰岛素的B-链，且W是长度不同的肽链。高尔基体蛋白酶Kex1和Kex2促成细胞内加工。切割是多步骤过程，其中第一步的Kex2将切割与A-链附着的KR序列并将单链分子转化为双链分子。之后Kex2将切除连接肽W以得到双链中间体胰岛素分子，其中二肽KR仍然与B-链的C-末端氨基酸相连。最后，Kex1将除去最后的KR肽序列，从而得到成熟的双链分子。
试验已显示，对A链接点处的切割位点的有效切割对于切割过程的进一步发展是重要的，且本发明的连接肽被设计成能够实现对A-链Kex2的切割位点的有效体内切割，从而导致产生高产量的分泌的双链胰岛素分子而无需额外的体外加工步骤。
从酵母中分泌大量活性成熟双链人胰岛素类似物将显著减少为产生纯度足够高以用于药用目的的人胰岛素类似物所必需的下游纯化步骤的数目。因此，在美国专利号4916212中公开的在酵母中制备胰岛素的方法中，胰岛素前体在两个步骤中被转化为人胰岛素，即，转肽作用以将单链胰岛素前体B(1-29)-Alal-Ala-Lys-A(1-21)转化为人胰岛素酯，以及之后将胰岛素酯水解为人胰岛素。各转化步骤将需要初始分离步骤，以及至少一个随后的纯化步骤。因此需要包括至少一个酶促转化的至少六个额外步骤来生产成熟的双链胰岛素。
已熟知的是，没有酶促切割达到100％切割，从而导致未切割杂质或部分切割的杂质，在药物产品的情况下这些杂质必须被有效除去。因此，各切割步骤之后将有至少一个分离或纯化步骤，通常是借助交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等的层析纯化。可商业规模应用的层析柱材料是非常昂贵的，且因此减少这样的层析步骤的数目对于生产经济有显著的影响。此外减少下游转化和纯化步骤将减少工作量和在该过程中所消耗的时间，且因此进一步提高生产经济。
在本发明的方法中，其中成熟双链胰岛素类似物可直接以高产量从培养液体培养基中分离出来，需要更少的下游加工步骤来生产纯度足够于药物用途的产品。
除了稳定化胰岛素分子中的螺旋结构的修饰外，用本发明的方法生产的胰岛素类似物还可以在A-和或B-链的特定位置进行修饰。因此，B28位的氨基酸残基可以是Asp。在另一组胰岛素类似物中，B1位的氨基酸残基已缺失。该组胰岛素类似物的具体例子是desB1人胰岛素。
在另一组胰岛素类似物中，B30位的氨基酸残基已缺失。在另一组胰岛素类似物中，B28位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Pro。
在另一组胰岛素类似物中，A18位的氨基酸残基可以是Gln，且在又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基可以是Gly。
编码胰岛素前体类似物的DNA序列可以是基因组或cDNA起源的，例如可以是通过制备基因组或cDNA文库以及利用根据标准技术(参见，例如，Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)合成的寡核苷酸探针杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列来获得的。编码胰岛素前体的DNA序列也可以用确定的标准方法合成制得，例如，Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801-805所述的方法。DNA序列还可以用具体引物通过聚合酶链反应制备，例如US 4,683,202或Saiki等人，Science 239(1988)，487-491中所述的。
可将DNA序列插入任何可经历重组DNA程序的载体中，且载体的选择通常将依赖于其所将导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如质粒。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。
载体优选为其中编码胰岛素前体的DNA序列与DNA转录所需的其它部分，比如启动子，可操作地连接的表达载体。该启动子可以是任何在所选的宿主细胞中显示出转录活性的DNA序列，并且可衍生自编码该与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
适于在酵母宿主细胞中使用的启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等人，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等人，eds.)，Plenum Press，New York，1982)的启动子、或TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等人，Nature 304(1983)，652-654)启动子。
如果必需的话，编码胰岛素前体的DNA序列还可以是与适宜的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列可操作地连接的。本发明的重组载体还可含有使载体能够在正被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
为指导胰岛素进入宿主细胞的分泌途径，可向重组载体提供分泌信号序列(也已知为前导序列、前序列原或前序列)。该分泌信号序列以正确的读框与编码胰岛素前体的DNA序列相连。分泌信号序列通常定位于编码肽的DNA序列的5′。信号肽可以是天然存在的信号肽、或其功能性部分，或者它可以是合成肽。
为了在酵母中有效分泌，也可将编码前导肽的序列插入信号序列下游和编码胰岛素前体的DNA序列的上游。
被导入DNA序列或重组载体的酵母宿主细胞可以是任何能够表达胰岛素前体的酵母细胞，且包括糖酵母属物种(Saccharomyces spp.)或裂殖糖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)，尤其是菌株啤酒糖酵母或克鲁弗利氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri)。其它的适宜酵母细胞的例子是菌株克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，比如乳克鲁维氏酵母(K.lactis)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊氏酵母(H.polymorpha)或毕赤氏酵母属(Pichia)，例如，巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)(cf.Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；US4,882,279)。
用异源DNA转化酵母细胞和从其生产异源多肽的方法描述于例如US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075。所转化的细胞通过由选择标记确定的表型来选择，所述表型通常是药物抗性或在无特定营养物(例如亮氨酸)存在下生长的能力。在酵母中使用的优选载体是在US 4,931,373中公开的POT1载体。
本发明的方法是所谓的发酵法。该发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。
温度可以在约25至约35、约26至约31、或约26至约29℃范围内。pH将在约4.0至约6.8或约5.0至约6.5范围内。
控制搅拌以确保最小溶解氧浓度为最小5％饱和。
此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。
发酵过程中所生产的所需产物以可溶性细胞外材料存在，或者以可溶材料形式或以包括聚集材料在内的不溶材料形式的细胞内材料存在。产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。
发酵过程中所使用的培养细胞的培养基可以是任何适于生长宿主细胞的常规培养基，比如基本培养基或含有适当补料的复合培养基。适宜的培养基可获自商业提供者，或者可以根据已公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目录中的)制备。因此该培养基将包含至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、硝酸盐和硫酸盐在内的必需的盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含在包括加热灭菌在内的一些操作条件下在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。培养基可通过将几种液体和气溶体混合来制备。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同的培养基组分液体溶液之间的比率可在发酵过程的不同阶段发生变化，这意味着培养基总组成可以在发酵过程期间变化。
适宜的发酵培养基可包含20至60mM的PO4 3-盐，50至70mM的K+，20至35mM的SO4 2-，4至6mM的Na+，6至13mM的Mg2+，0.5至1.5mM的Mn2+，0.02至0.04mM的Cu2+，0.1至0.3mM的Fe2+，0.01至0.05mM的Zn2+，痕量Co、Mo和Ni，作为复合氨基酸源的部分添加，1至40g/L的酵母提取物，选自m-肌醇(100至250mg/L)、泛酸钙(2至20mg/L)、盐酸硫胺素(0.5至20mg/L)、吡哆醇(0.2至20mg/L)、烟酸烟酰胺(2至7mg/L)、生物素(0.03至0.8mg/L)、柠檬酸二氢胆碱(0.1至0.2mg/L)的维生素，比如柠檬酸这样的配体，H2O(0.5至7g/L)和作为碳源的葡萄糖(50至200g/L)。以400至1800mM的量持续加入作为气体NH3或液体NH4OH的氮。以自来水作为天然钙和Cl-源。
之后可以通过常规方法从培养基中回收由细胞生产的肽，所述常规方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，借助盐(例如硫酸铵)从上清液或者滤液中沉淀蛋白质组分，依赖于正被讨论的蛋白的类型用多种层析法纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
胰岛素或胰岛素类似物从培养液体培养基中分离出来之后可以，例如通过酰化尤其是B29Lys残基的ε-氨基基团，转化为酰化形式。对胰岛素的酰化方法是本领域熟知的，且公开于例如，EP专利792,290和894,095以及美国专利号5,693,609、5,646,242、5,922,675、5,750,497和6,011,007。
酰化胰岛素的例子为NεB29-十四烷酰des(B30)人胰岛素、NεB29-石胆酰(lithocholoyl)-γ-谷氨酰des(B30)人胰岛素、NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素或NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素。
“desB30”或“B(1-29)”意指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素B链，B(1-30)意指人胰岛素的天然B链，且“A(1-21)”意指天然胰岛素A链。A18Q人胰岛素是在人胰岛素A-链A18位为Gln的胰岛素类似物。B10E、A8H、A14E分别是B10位为Glu、A8位为His及A14位为Glu的胰岛素类似物。
“B1”、“A1”等分别意指胰岛素B链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基以及胰岛素A链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基。具体位置的氨基酸残基还可用例如，PheB1表示，其意指B1位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。
“C-肽”意指将胰岛素分子的A-和B-肽链连接在一起的肽序列，包括各末端的切割位点。
“连接肽”分别意指与A-和B-链各接点处的两个切割位点之间的肽序列。
“成熟人胰岛素类似物”意指具有与天然人胰岛素分子相同结构构象的活性双链胰岛素类似物，例如，在CysA7和CysB7以及CysA20和CysB19之间带有二硫键，以及在CysA6和CysA11之间带有内部二硫键，但是与相应位置的天然氨基酸残基相比，在A和/或B-链的一个或多个位置带有特定的突变。
本文所使用的“胰岛素类似物”意指多肽，其具有形式上可通过缺失和/或取代至少一个存在于天然胰岛素中的氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基，源自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)结构的分子结构。所添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码氨基酸或其它天然存在的氨基酸残基或纯合成的氨基酸残基。与人胰岛素相比，胰岛素类似物通常将不包含超过约7个突变，更一般不超过5个且甚至更一般最多3个突变。
胰岛素类似物可以是这样的，其中B链28位可以从天然的Pro残基修饰为Asp、Lys或Ile。B29位的Lys还可以修饰为Pro。
而且，A21位的Asn可修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，尤其是Gly、Ala、Ser或Thr，且尤其是Gly。此外，B3位的Asn可修饰为Lys或Asp。胰岛素类似物的其它例子是des(B30)人胰岛素，其中B1和B2中的一个或者二者均被缺失的胰岛素类似物；其中A-链和/或B-链具有N-末端延伸的胰岛素类似物和其中A-链和/或B-链具有C-末端延伸的胰岛素类似物。其它胰岛素类似物是这样的，其中B26-B30中的一个或多个已被缺失。
本文中所使用的“胰岛素衍生物”意指已经过化学修饰的天然存在的胰岛素或胰岛素类似物，例如，通过向胰岛素主链中的一个或多个位置导入侧链，或通过氧化或还原胰岛素中氨基酸残基基团，或将游离氨基基团或羟基基团酰化。
“Kex2”意指优先催化在两个碱性残基(赖氨酸或精氨酸)序列后切割的枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶(Rockwell，NC，Krysan，DJ，Komiyama，T & Fuller，RS 2002 Precursor Processing by Kex2/FurinProteases.Chem.Rev.102：4525-4548)。
“Kex1”意指优先催化去除C-末端赖氨酰和/或精氨酰残基的丝氨酸羧肽酶(Shilton BH，Thomas DY，Cygler M 1997 Crystal structure ofKexldeltap，a prohormone-processing carboxypeptidase fromSaccharomyces cerevisiae.Biochemistry 36：9002-9012)。
“Yps1”意指在缺乏天然前α交配因子(pro-alpha-mating factor)加工酶Kex2的酵母突变体中部分抑制前α交配因子加工缺陷的天冬氨酰蛋白酶(Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)。
“正确加工的”意指在所需切割位点酶切，从而得到具有正确氨基酸残基序列的所需产物。
“POT”是粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因，且“TPI1”是啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶基因。
术语“信号肽”被理解为意指在蛋白质前体形式中作为N-末端序列存在的前-肽。信号肽的功能是使异源蛋白能够容易地转运到内质网中。信号肽通常在该加工过程中被切除。信号肽可以是与产生蛋白质的宿主生物异源或同源的。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶基因、黑色曲霉(Aspergillus niger)中性淀粉酶基因、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(Humicola lanugmosa)纤维素酶或脂肪酶基因、或米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶基因、曲霉属物种(Aspergillus sp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶、编码米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶的基因的信号肽编码区。信号肽优选源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑色曲霉中性a-淀粉酶、黑色曲霉酸稳定淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。
可用于酵母宿主细胞的有用信号肽获自啤酒糖酵母a-因子和啤酒糖酵母转化酶基因。可与本发明的DNA构建体使用的许多信号肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(Yps1)信号肽或其任何功能类似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST 6：127-137和US 5,726,038)和MFα1基因的α-因子信号(Thorner(1981)in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae，Strathern等人，eds.，pp 143-180，Cold Spring HarborLaboratory，NY和US 4,870,008，小鼠唾液淀粉酶信号肽(参看O.Hagenbuchle等人，Nature 289，1981，pp.643-646)、修饰的羧肽酶信号肽(参看L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)和酵母BAR1信号肽(参看WO 87/02670)。
术语“前-肽”意指多肽序列，其功能为允许将所表达的多肽从内质网导向高尔基体并进一步导向分泌小泡以分泌进入培养基(即，多肽穿过细胞壁或至少穿过细胞膜输出到酵母细胞的周质间隙内)。前肽可以是酵母α-因子前肽，参见US 4,546,082和4,870,008。作为选择，前肽可以是合成前肽，也就是说自然界中未曾发现的前肽。适宜的合成前肽是US 5,395,922、5,795,746、5,162,498、WO 89/02463、WO 92/11378和WO 98/32867中公开的那些。
本发明的多核苷酸序列还可以是混合基因组、cDNA和合成来源的。例如，可将编码前导肽的基因组或cDNA序列与编码A和B链的基因组或cDNA序列相连，之后可以根据熟知的方法，通过插入用于同源重组的编码所需氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选用适宜的寡核苷酸通过PCR产生所需序列，对该DNA序列进行位点修饰。
本发明包括载体，所述载体能够在所选择的微生物或宿主细胞中复制的载体，且带有编码本发明的胰岛素前体的多核苷酸序列。该重组载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何确保自我复制的工具。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒、或者两个或更多个共同包含全部将被导入宿主细胞基因组中的DNA的载体或质粒、或转座子。载体可以是线性或闭环质粒，且优选将包含允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
在一种实施方案中，重组表达载体能够在酵母中复制。能够使载体在酵母中复制的序列的例子为酵母质粒2μm复制基因REP 1-3和复制起点。
载体还可包含选择标记，例如，产物补偿宿主细胞缺陷的基因或赋予药物抗性的基因，所述药物例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。
用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶。
用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母优选的选择标记是粟酒裂殖糖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene 40：125-130)。
载体中，多核苷酸序列与适宜的启动子序列可操作地连接。该启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，而且可获自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
在丝状真菌宿主细胞中指导转录的适宜启动子的例子是获自米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性α-淀粉酶、和黑色曲霉酸稳定α-淀粉酶基因的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子是啤酒糖酵母MFα1、TPI、ADH或PGK启动子。
本发明的多核苷酸构建体通常也与适宜的终止子可操作地连接。酵母中适宜的终止子是TPI终止子(Alber等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：419-434)。
用于分别连接编码胰岛素前体的DNA序列、启动子以及任选地终止子和/或分泌信号序列，以及把它们插入包含复制所必需信息的适宜载体的方法，是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
可以理解，可以通过首先制备包含编码本发明胰岛素前体的完整DNA序列的DNA构建体，和随后将该片段插入适宜的表达载体中，或通过连接前顺序插入包含各元件(比如信号、前肽、经过修饰的C-肽、A和B链)遗传信息的DNA片段，来构建载体。
本发明还涉及含有编码本发明胰岛素前体的多核苷酸序列的重组真菌细胞。如前述，将含有这样的多核苷酸序列的载体导入宿主细胞中，从而该载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的由于复制过程中发生突变而导致与亲本细胞不相同的任何子代。
本发明中所使用的宿主细胞是真菌细胞。本文所使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人，In，Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同上，第171页所引述的)以及所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。
在一种实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。产子囊酵母分作蚀精霉科(Spermophthoraceae)和糖酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，裂殖糖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，粟酒裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊氏酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和糖酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤氏酵母属(Pichia)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)和糖酵母属(Saccharomyces))。产担孢子酵母包括Leucosporidim、红冬孢属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌的酵母分作两个科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，Sorobolomyces和布氏弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。由于酵母分类将来可能发生变化，所以为了本发明的目的，酵母应按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所述的进行定义。酵母的生物学和酵母遗传学操作是本领域熟知的(参见，例如，Biochemistry andGenetics of Yeast，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.编，第二版，1987；The Yeasts，Rose，A.H.，和Harrison，J.S.编，第二版，1987；以及The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Strathern等人编，1981)。
酵母宿主细胞可选自假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)的物种的细胞。在一种实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗利氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomycesnorbensis、卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁糖酵母(Sacchoromyces uvarum)、克鲁弗利氏毕赤氏酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candidacacaoi)和发酵性丝孢酵母(Geotrichum fermentans)。其它可用的酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Ustilgomaylis、麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichia guillermondii)和Pichia methanoliol(参看Gleeson等人，J.Gen. Microbiol.132，1986，第3459-3465页；US 4,882,279和US 4,879,231)。
在一种实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚类的所有丝状形式(如Hawksworth等人所定义的，1995，见前述)。丝状真菌的特征在于，由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的营养菌丝体。丝状真菌宿主细胞可选自支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、草根霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)。
“可编码氨基酸”或“可编码氨基酸残基”这一表达用于表示可由核苷酸三联体(密码子)编码的氨基酸或氨基酸残基。
本发明上下文中，氨基酸三字母或单字母表示法以下表中所示的常规的含义使用。除非明确指明，本文所提到的氨基酸是L-氨基酸。此外，除非另外说明，肽的氨基酸序列的左右末端分别为N-和C-末端。
氨基酸缩写：
发酵意指增殖浸没在液体培养基中的微生物的无菌过程。发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。
发酵过程中所生产的所需产物以可溶性细胞外材料存在，或者以可溶材料形式或以包括聚集材料在内的不溶材料形式的细胞内材料存在。产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。
分批过程意指，在将微生物加入罐中之前发酵罐中含有无菌培养基的发酵。在该过程期间，自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和诱导物。酸和碱以液体溶液或气体组分加入。这些组分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。发酵过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在发酵过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。然而，对于连续分批过程，仅部分收获发酵罐中的内容物，并用新鲜无菌培养基重新填充发酵罐，从而允许发生另一批发酵。
补料分批过程是在加入微生物之前仅向发酵罐中填入部分培养基的发酵。将剩余的培养基组分或剩余量的已部分添加的培养基组分作为一次脉冲、作为一系列不连续的脉冲或作为以恒定或可变速率添加的连续流供应给发酵罐。分批过程可以在补料分批过程之前，之后为补料分批操作模式。过程期间加入发酵罐的培养基组分由生长限制组分、微溶组分、挥发性组分或在液体环境中稳定性有限的组分组成但不限于此。微生物的生长速率可通过速率调节来控制，通过此调节来向发酵罐中添加培养基组分。在该过程期间自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和诱导物。酸和碱以液体溶液的部分或气体组分加入。补料分批过程期间，所有组分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。补料分批过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。
补料分批过程的一种变化方式是重复补料分批过程(Repeated-Fed-batch process)。重复补料分批发酵的实施类似于补料分批过程，但是在过程期间一次或几次取出部分发酵罐内容物。部分取出发酵罐内容物后可加入新鲜培养基。新鲜培养基加入后在重新开始补料分批过程操作之前可接着分批过程。新鲜培养基的组成以及补料分批过程期间加入的培养基无需相同。
连续过程意指，在加入微生物以及发酵开始之前向罐中加入一些培养基的发酵。连续加入含有生长所必需的所有培养基组分以及抑制剂、诱导物、消泡剂、酸、碱和稳定产物的组分的新鲜培养基。这些组分可以通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的供应线中向发酵罐供应，以提高所使用的培养基的稳定性或提高其品质。酸和碱作为液体溶液的部分抑或作为气体组分加入。所有组分作为一系列不连续的脉冲或作为以恒定或可变速率添加的连续流加入发酵罐。为将发酵罐内容物维持在预定范围内，连续收获发酵罐的内容物。微生物的生长可通过向发酵罐中添加培养基的速率以及调节发酵罐内容物来控制。
培养基意指包含下述的液体溶液，至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐在内的必需盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含，在包括加热灭菌在内的一些操作条件下，在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。可通过将几种液体和气溶体混合来制备培养基。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同的培养基组分液体溶液之间的比率可在发酵过程的不同阶段发生变化，这意味着培养基总组成可以在发酵过程期间变化。下表包含不同培养基组分的浓度范围列表。这些浓度以所加入的培养基组分总量除以发酵罐中初始培养基体积来计算。连续培养的培养基浓度以进入发酵罐中的培养基中的浓度包括在其中。
下表是对发酵培养基的一般组分的评论。
含有本发明胰岛素类似物的药物组合物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。对任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括所使用的具体胰岛素衍生物的效力、患者年龄、体重、身体活性以及饮食、与其它药物的可能组合以及所治疗的状态的严重程度。推荐由本领域技术人员以类似于已知胰岛素组合物的方式来确定本发明胰岛素衍生物对各单独患者的日剂量。
胰岛素类似物的药物组合物将包含通常的佐剂和添加剂，且优选配制成水溶液。例如，使用氯化钠、乙酸钠或甘油将水性培养基制成等渗的。此外，水性培养基可包含锌离子、缓冲液和防腐剂。可将组合物的pH值调至所需值，且其可为约4至约8.5。
在本发明的一种实施方案中，制剂的pH选自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。
药物组合物将包含一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂这样的通常的佐剂，例如，锌离子、酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯(parabene)、氯化钠、甘油或甘露糖醇。
药物中所使用的缓冲液可选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、和三羟甲基氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、N-[2-羟-1，1-二羟甲基乙基]甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。
药学可接受防腐剂可选自酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯代丁醇、和乙基汞硫代水杨酸钠(thiomerosal)、溴硝丙二醇(bronopol)、安息香酸、咪唑烷脲(imidurea)、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化苄乙氧铵、氯酚醚(3对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体的防腐剂的每一种构成本发明的一种替代实施方案。药物组合物中的防腐剂的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
等渗剂可选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如，甘油、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，比如单糖、二糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普鲁分支葡聚糖、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一种实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇的定义是，具有至少一个--OH基团的C4-C8烃，且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一种实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述糖或糖醇可单独或组合使用。对于用量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的且不对用本发明方法所得到的稳定效果产生不利作用。在一种实施方案中，糖或糖醇浓度为约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至50mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至7mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为8mg/ml至24mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为25mg/ml至50mg/ml。等渗剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，19th edition，1995。
本文中所引述的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利，均全文引入本文作为参考，且程度如同各参考文献单独或具体指明引入本文作为参考，且全文引入本文(至法律所允许的最大程度)。
本文所使用的所有标题和副标题仅为方便而使用，且不应当理解为以任何方式限制本发明。
本文中所提供的任何和所有实施例、或例举式语言(例如，“比如……这样的”)的使用仅意欲更好地阐述本发明，且不限制本发明的范围，除非另外声明。本发明说明书中的任何语言均不应当被解释为将任何非请求保持的要素视为对于本发明的实践来说关键的。
本文中对专利文献的引述和引入仅为了方便而作出，而非反映这样的专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。
如适用的法律所允许的，本发明包括对本文所附权利要求书中所述主题的所有改变或等同方案。
实施例
通用程序
所有表达质粒均为C-POT型，类似于EP 171,142中所描述的那些。这些是基于2μ的表达载体，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)以在啤酒糖酵母中选择和稳定质粒。这些质粒还包含啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子序列。这些序列类似于质粒pKFN1003(描述于WO 9010075)中的相应序列。
通过转化宿主菌株啤酒糖酵母菌株MT663或ME1719制备酵母转化体。酵母菌株MT663(MATa/MATαpep4-3/pep4-3 HIS4/his4Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 Cir′)与申请WO 92111378关联，保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，且所得保藏号为DSM6278。啤酒糖酵母菌株ME1719(MATa/αleu2/leu2 pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2Δura3/Δura3Δyps1::URA3/Δyps1::ura3 Cir+)描述于WO 98/01535。
MT663或ME1719在YPGaL(1％细菌用酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％半乳糖，1％乳酸)上生长至600nm处O.D.为0.6。通过离心收获100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心并重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、25mM Na2EDTA pH＝8.0和6.7mglml二硫苏糖醇(dithiotreitol)的溶液中。30℃下温育该悬浮液15分钟，离心，并将细胞重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、10mM Na2EDTA.0.1M柠檬酸钠、pH 0 5.8和2mg NovozymC3234的溶液中。将悬浮液在30℃下温育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml 1.2M的山梨糖醇和10ml CAS(1.2M山梨糖醇，10mM CaCl2，10mM Tris HCl(Tris＝三(羟甲基(-氨基甲烷)pH＝7.5)中洗涤，并重悬于2ml CAS中。为进行转化，将1mlCAS-悬浮的细胞与约0.1mg质粒DNA混合，且在室温下放置15分钟。加入1ml(20％聚乙二醇4000，10mM CaCl2，10mM Tris HCl，pH＝7.5)，并将混合物在室温下再放置30分钟。离心混合物，将沉淀重悬于0.1mlSOS(1.2M山梨糖醇，33％vlv YPD，6.7mM CaCl2)中并于30℃温育2小时。之后离心悬浮液并将沉淀重悬于0.5ml的1.2M山梨糖醇中。之后，于52℃下加入6ml的上层琼脂(Sherman等人，(1982)，Methods inYeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory的SC培养基(含有1.2M山梨糖醇加2.5％琼脂))，之后将悬浮液倒入含有相同的琼脂固化的含山梨糖醇培养基平板顶部上。
实施例1
构建A18Q-胰岛素的酵母表达系统
图1显示名为pSA50的酵母质粒。该质粒含有表达盒，该表达盒包含插入到质粒的啤酒糖酵母TPI基因的转录启动子和转录终止子之间的EcoRI-XbaI片段。在质粒pSA50中，EcoRI-XbaI片段编码由MFα1*前前导序列原、二元加工内肽酶KEX2的Lys-Arg切割位点、和胰岛素前体B(1-30)-KRDGLGKR-(A1-21)，A18Q组成的融合产物。
按照下述构建包含编码胰岛素前体B(1-30)-KRDGLGKR-(A1-21)，A18Q的序列的DNA片段。将2.5pmol寡核苷酸ASA-SCI-2(对应于图2中的序列1279-1358)和SCI-kex2-3(对应于图2中的序列1425-1337——反向引物)混合入含有10μl 10X高保真缓冲液、2.5mMdNTP、1μl高保真聚合酶和76μl H2O的PCR反应物中。一个循环(94℃下30秒，50℃下30秒，72℃下1分钟)后，加入100pmol寡核苷酸ASA-SCI1(对应于图2中的1252-1301)和ASA-SCI-7(对应于序列1464-1407——反向引物)后进行如上的9个循环。所得PCR片段用Roche的PCR纯化试剂盒纯化，用NcoI和XbaI消化，并最终在琼脂糖凝胶上跑电泳并用GFX-PCR凝胶带纯化试剂盒(Amersham Biosciences#27-9602-01)纯化。将片段与来自上述(“通用程序”)C-POT型表达载体的NcoI-XbaI载体片段相连。
使表达质粒在大肠杆菌中增殖，在存在氨苄青霉素的条件下生长，并用标准技术分离(Sambrook等人，1989)。利用适宜的限制性核酸酶(例如，EcoRI，NcoI，XbaI)检查质粒DNA中的插入片段，并通过序列分析显示包含正确胰岛素前体B(1-30)-KRDGLGKR-(A1-21)，A18Q序列(图2)。
将质粒pSA50转化入啤酒糖酵母菌株MT663。通过在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)琼脂(2％)平板上作为碳源的葡萄糖利用选择携带质粒pSA50的酵母转化体，并将所得菌株命名为ySA63。
实施例2
人胰岛素类似物的生产
采用与实施例1中所述方法相应的方法制备含编码特定人胰岛素类似物的DNA的质粒。如实施例1所述用质粒转化啤酒糖酵母菌株并分离转化体。
所有的胰岛素类似物前体均有C-肽KRDGLGKR(SEQ ID NO：9)。
将用表达胰岛素类似物的质粒转化的啤酒糖酵母菌株MT663接种到5ml由以下组成的培养基中：5g/L(NH4)2SO4、184mg/L(NH4)2HPO4、2.88g/L KH2PO4、1.42g/L MgSO4·7H2O、1.28g/L、K2SO4、10.00g/L琥珀酸、10.00g/L水解酪蛋白氨基酸、0.0112g/L FeSO4·7H2O、0.0086g/L MnSO4·H2O、0.0014g/L CuSO4.5H2O、0.00185g/L ZnSO4·7H2O、0.0129g/L CaCl2.2H2O、0.071g/L柠檬酸、28.0mg/L m-肌醇、14.0mg/L氯化胆碱、2.8mg/L硫胺素、2.8mg/L烟酰胺、2.1mg/L Ca-泛酸、0.14mg/L生物素、0.14mg/L叶酸、40g/L葡萄糖。30℃下培养3天。离心后，取出上清液以进行定量HPLC分析，通过该方法测量分泌的胰岛素类似物浓度。通过LC/MS分析确定胰岛素类似物的特性。
产量(mg/l)示于下表
实施例3
补料分批发酵
将表达B(1-30)-KRDGLGKR-(A1-21)，A18Q的啤酒糖酵母菌株ySA63接种到由酵母提取物(Difco)：20g/L和蛋白胨(Bacto)：10g/L和60g/L葡萄糖和0.1mL消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)组成的培养基中。加热灭菌前将培养基的pH调至6.5-6.6。将葡萄糖分开灭菌，并加入其余无菌组分中。
将200mL培养物(于500mL三角瓶中)于30℃下在定轨摇床上及于250rpm温育16-30小时。
将50mL摇瓶培养物转移到含有1.2L由下述组成的生长培养基的发酵罐：50g/L液体酵母提取物(50％干物质)、3.6g/L KH2PO4、2.3g/LK2SO4、1.5g/L MgSO4·7H2O、0.064g/K FeSO4·7H2O、0.016g/LMnSO4·H2O、0.011g/L CuSO4·5H2O、0.016g/L ZnSO4·7H2O、0.8g/L柠檬酸、2g/L m-肌醇、0.2g/L氯化胆碱、0.2g/L盐酸硫胺素、0.1g/L盐酸吡哆醇、0.2g/L烟酰胺、1g/L Ca-泛酸、0.005g/L生物素、0.05g/L对氨基苯甲酸、0.66mL/L消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)和21g/L葡萄糖。除葡萄糖之外的所有组分均加热灭菌。将葡萄糖单独灭菌且加入发酵罐。
30℃下培养，其中pH设定点为5.9，且通气速率为1vvm。通过加入NH4OH来使培养基pH保持在调定点。对溶解氧与废气组成(氧、二氧化碳和乙醇)共同进行监控。发酵过程从持续23小时的分批生长阶段开始，该过程中发酵消耗葡萄糖，之后在之前形成的乙醇上进行需氧分批生长。随后，当废气中的乙醇水平开始下降时，开始添加由50％(w/w)葡萄糖组成的物料溶液。物料添加速率遵循图3所示的曲线，包括为将废气中的乙醇水平维持在250ppm以下进行人工调节。
在该过程期间，通过测量稀释的发酵样品在600nm处的光密度来监控生长。利用HPLC对样品的胰岛素浓度进行定量，所述样品为用酸性乙醇(552g乙醇、340g去离子水和5mL浓硫酸)以1∶1体积比稀释并以3000-5000x g离心的。计算每升发酵液体培养基中的胰岛素浓度时，包括了对由酵母细胞所占的体积的校正，其中假定沉淀中细胞为菱形包装(rhombic packaging)。所报告的胰岛素浓度包括完整胰岛素和desB30胰岛素。
69小时后停止添加葡萄糖溶液，但在收获产物之前再继续发酵4小时。
光密度和胰岛素浓度相对时间作图示于图4，其显示37mg/L发酵液体培养基的最终胰岛素浓度。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
     Sloth Andersen，Asser
<120>制备成熟胰岛素多肽的方法
<130>7210.204-WO
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>1
Arg Arg Glu Ala Glu Asn Leu Gln Lys Arg
1               5                   10
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>2
Arg Arg Glu Ala Pro Leu Gln Lys Arg
1               5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>3
Arg Arg Glu Ala Leu Gln Lys Arg
1               5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>4
Lys Arg Glu Ala Leu Gln Lys Arg
1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>5
Arg Arg Leu Gln Lys Arg
1               5
<210>6
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>6
Lys Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Ala Leu Val Asp Lys Arg
1               5                   10                  15
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>7
Asp Gly Leu Gly
1
<210>8
<211>204
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>编码
<222>(1)..(193)
<220>
<221>编码
<222>(2)..(193)
<400>8
atccatggct aagagattcg ttaaccaaca cttgtgcggt tcccacttgg ttgaagcttt     60
gtacttggtt tgcggtgaaa gaggtttctt ctacactcct aagactaaga gagacggttt    120
gggtaagaga ggtattgtcg agcaatgctg tacatccatc tgctccttgt accaattgga    180
acaatactgc aactagactc taga                                      204
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的
<400>9
Lys Arg Asp Gly Leu Gly Lys Arg
1               5
<210>10
<211>65
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Ser Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu
1               5                   10                  15
Val Gly Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phc Tyr Thr
            20                  25                  30
Pro Lys Thr Lys Arg Asp Gly Leu Gly Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
        35                  40                  45
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Gln Tyr Tyr Cys
    50                  55                  60
Asn
65

Claims (6)

1.通过培养含有编码具有下式的人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，
B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)
其中B(1-30)是B-链人胰岛素的类似物，A(1-21)是A-链人胰岛素的类似物，X-X和Y-Y均为Lys-Arg，且Z为AspGlyLeuGly，其中人胰岛素A-和/或B-链的类似物包含包括在A14位的突变Glu在内的3个突变，所述Lys-Arg在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物具有分别在B10位的Glu、在A8位的His及在A14位的Glu。
3.根据权利要求1-2的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
4.编码具有以下氨基酸序列的胰岛素前体的DNA序列
B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)
其中，B(1-30)是B-链人胰岛素的类似物，A(1-21)是A-链人胰岛素的类似物，X-X和Y-Y均为Lys-Arg，且Z为AspGlyLeuGly，其中人胰岛素A-和/或B-链的类似物包含包括在A14位的突变Glu在内的3个突变。
5.含有根据权利要求4的DNA序列的表达载体。
6.用根据权利要求5的载体转化的酵母细胞。
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