HU215538B - Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel - Google Patents
Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel Download PDFInfo
- Publication number
- HU215538B HU215538B HU902376A HU237690A HU215538B HU 215538 B HU215538 B HU 215538B HU 902376 A HU902376 A HU 902376A HU 237690 A HU237690 A HU 237690A HU 215538 B HU215538 B HU 215538B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- glu
- ala
- asp
- polypeptide
- leu
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 102
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 66
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims abstract description 15
- VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N Asp-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N 0.000 claims abstract 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 77
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 60
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 59
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 45
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 32
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 19
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 19
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 19
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 12
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 8
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 3
- PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylcarbamoyl)benzoic acid Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 5
- -1 Glu and / or Asp Chemical class 0.000 abstract description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 74
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 71
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 16
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 16
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 14
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 12
- 101150032817 TPI1 gene Proteins 0.000 description 11
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 11
- 101100288313 Arabidopsis thaliana KTI4 gene Proteins 0.000 description 10
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101100228206 Caenorhabditis elegans gly-6 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100491597 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000988 hyperfibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 108700030835 yeast plasmid REP Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Particle Accelerators (AREA)
- Thermotherapy And Cooling Therapy Devices (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás heterőlóg prőtein vagy pőlipeptidelőállítására élesztőben, azzal jellemezve, hőgy valamely, a jelpeptid – vezető peptid – X1–X2–X3–X4 – heterőló prőteinszerkezettelrendelkező pőlipeptidet – ahőlX1 peptidkötés, vagy egy vagy több,azőnős vagy különböző aminősav,X2 és X3 azőnős vagy különböző bázikűsaminősav, és jelentésük Lys vagy Arg, és együttesen egy élesztőgőmba-feldőlgőzási helyet határőznak meg, és X4 peptidkötés, vagy egy vagytöbb, azőnős vagy különböző aminősav,azzal a feltétellel, hőgy X1és/vagy X4 egalább egy aminősav, és ezen aminősavak legalább egyikenegatív töltésű aminősav, így Glű és/vagy Asp, tővábbá azzal afeltétellel, hőgy ha X1 peptidkötés, X4 Glű-Ala-Glű-Ala, Glű-Ala-Glű-Ala- lű-Ala, Glű-Ala-Glű-Ala-Ser-Leű-Asp-Lys-Arg vagy Glű-Ala-Glű-Ala-Ser-Leű-Asp-peptidtől eltérő, és X4 peptidkötés, akkőr X1 Ser-Leű-Asppeptidtől eltérő, tővábbá azzal a feltétellel, hőgy a jel eptid –vezető peptid – X1 peptid jelentése az alábbi szekvenciáktól eltérő:a-faktőr jel és vezető (1–85)-Glű-Ala-Glű-Ala-Ser-Leű-Asp,a-faktőr jelés vezető (1–85)-Prő-Leű-Asp,a-faktőr jel és vezető (1–85)-Gln-Leű-Leű-Asp,Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leű-Leű-Phe-Leű-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leű-Asp, kódőló DNS-szerkezetet tartalmazó vektőrral transzfőrmált élesztőt aheterőlóg prőtein vagy pőlipeptid kifejezésének megfelelő körülményekközött alkalmas tápközegben tenyésztik, majd a kapő t prőteint vagypőlipeptidet kinyerik a tápközegből. ŕ
Description
A jelen találmány élesztőgombákban való heterológ proteinek termelési folyamatával kapcsolatos.
Az élesztőgombák számos intracellulárisan szintetizált fehérjét termelnek, melyeknek azonban sejten kívüli funkciójuk van. Az ilyen extracelluláris proteinekre mint kiválasztott proteinekre utalunk. Ezek a kiválasztott proteinek kezdetben a sejten belül expresszálódnak egy az expresszált termék endoplazmás retikulum (ER) membránon keresztül történő hatékony áthaladását biztosító előszekvenciát tartalmazó formájában. A preszekvencia, melyet rendes körülmények között jel pepiidnek neveznek, általában lehasad a kívánt termékről a transzlokáció alatt. Amikor belép a kiválasztási reakcióútba, a protein a Golgi-apparátushoz szállítódik. A Golgi-apparátusból a protein különböző útvonalakat követhet, melyek olyan részekhez vezetnek, mint amilyen a sejtvakuolum vagy a sejtmembrán, vagy kivezetődhetnek a sejtből, hogy a külső tápközegbe választódjanak ki (Pfeffer, S. R. and Rothman, J. E. Ann. Rév. Biochem. 56 (1987), 829-852).
Számos megközelítést javasoltak az élesztőgombák heterológ proteinjeinek élesztőgombákban való expresszálásához. A 0088632A számú európai közzétételi irat leír egy eljárást, mellyel az élesztőgombák heterológ proteinjei kerülnek expresszálásra, előállításra és kiválasztásra oly módon, hogy egy élesztőgombát transzformáinak egy a kívánt proteint és egy jel pepiidet kódoló DNS-t tartalmazó expressziós vektorral, a transzformált mikroszervezetből tenyészetet készítenek, a tenyészetet elszaporítják és a tenyésztápközegből kinyerik a fehérjét. A jel peptid lehet a kívánt proteinek saját jel peptidje, egy heterológ jel peptid vagy az eredeti és heterológ jel peptid egy hibridje.
Az élesztőgombával heterológ jel peptidek használatakor felmerülő probléma lehet, hogy a heterológ jel peptid nem biztosít hatékony transzlokációt és/vagy hasítást a jel peptid után.
AS. cerevisiae MFal (a=faktor) 165 aminosav preproformájaként szintetizálódik, mely aminosav tartalmaz egy 19 aminosav hosszúságú jel vagy prepeptidet, melyet egy 64 aminosav hosszúságú „vezető” vagy propeptid követ, körülvéve 3 N-kötésű glikozilációs helyet, melyet a [Lys Arg(Asp/Glu, Ala)23 a-faktor]4 követ (Kurjan, J. and Herskowitz, I. Cell.30 (1982), 933-943). A prepro MFal jel vezető részét széleskörűen alkalmazzák a heterológ proteinek S. cerevisiaeben való szintézisének és szekréciójának elérése céljából.
Az élesztőgombákkal homológ jel/vezető peptidek használata ismert a 4546082 számú USA szabadalmi leírásból, a 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A és 0123289A számú európai közzétételi iratokból és a 2484/84 és 3614/83 számú dán szabadalmi leírásokból.
Az EP 0123289A a S. cerevisiae a-faktor prekurzor hasznosítása került leírásra, míg a DK 2484/84 számú szabadalmi leírás a Saccharomyces cerevisiae invertáz jel peptid hasznosítását írja le és a DK 3614/83 számú szabadalom a Saccharomyces cerevisiae PH05 jel peptid hasznosítását az idegen proteinek kiválasztása céljából.
A 4546082 számú USA szabadalmi leírás és az EP 016201A, 0123294A, 0123544A és 0163529A olyan eljárásokat írnak le, melyekkel a Saccharomyces cerevisiaeből származó α-faktor jelvezető (MFal, vagy MFa2) kerül alkalmazásra az élesztőgombákban expresszált heterológ proteinek szekréciós folyamatában. A kívánt protein szekréciójához szükséges gén 5’ végén levő S. cerevisiae MFal jel/vezető szekvenciát kódoló DNS-szekvencia fuzionálása és a kívánt protein előállítása került bemutatásra.
Az EP 206783 leír egy a 5. cerevisiaeből történő polipeptidek szekréciójához való rendszert, amiből az α-faktor vezető szekvenciát megcsonkították az eredeti vezető szekvencián jelen levő négy α-faktor peptid eliminálása céljából, azért, hogy a vezető pepiidet magát hagyják a heterológ polipeptidhez fuzionálni a LysArgGluAlaGluAla α-faktor előállítási helyen keresztül. Ez a szerkezet hivatott vezetni a kisebb peptidek (kevesebb mint 50 aminosav) hatékony előállítását. A nagyobb polipeptidek szekréciójához és előállításához az eredeti α-faktor vezető szekvenciát megcsonkították, hogy csupán egy vagy két α-faktor pepiidet hagyjanak a vezető peptid és a polipeptid között.
Számos szekretált proteint úgy irányítanak, hogy ki legyen téve egy proteolitikus előállítási rendszernek, mely fel tudja hasítani a peptidkötést két egymás után levő bázikus aminosav karboxil végén. Ezt az enzimatikus aktivitást a S. cerevisiaeben a KEX2 gén kódolja [Julius, D. A. et al., Cell, 37 (1984 b), 1075], A termék KEX2 géntermék által történő feldolgozása szükséges az aktív S. cerevisiae al párosodási faktor (MFal vagy α-faktor) szekréciójához, de nem tartozik bele az aktív S. cerevisiae a párosodási faktor szekréciójába.
A szekretálásra szánt polipeptid szekrécióját és helyes előállítását néhány olyan esetben lehet elérni, amikor a fent megadott irodalomban jelölt módon megszerkesztett vektorral transzformált élesztőgombát szaporítunk. Számos esetben azonban a szekréció szintje nagyon alacsony vagy nincs szekréció, vagy a proteolitikus előállítás nem megfelelő vagy nem teljes. A jelen találmány leírói jelenleg úgy gondolják, hogy ez bizonyos mértékig a vezető peptid C-terminális vége és a heterológ protein N-terminális vége között levő feldolgozó hely nem megfelelő kitevésének tudható be úgy, hogy az nem hozzáférhető vagy legalábbis kevésbé hozzáférhető a proteolitikus hasításhoz.
A következőkben megadjuk a találmány összegzését.
Meglepően azt találtuk, hogy bizonyos módosításokat biztosítva a vezető peptid C-terminális végénél és/vagy a vezető peptid C-terminális végénél és/vagy a vezető pepiidhez fuzionált heterológ polipeptid N-terminális végénél levő feldolgozó helyhez közel nagyobb hozamot lehet elérni a megfelelően előállított proteinből, mint a módosítás nélküli vezető peptid - heterológ polipeptidszerkezettel.
Ennek megfelelően a jelen találmány egy polipeptiddel kapcsolatos, mely polipeptid tartalmazza egy jel peptid, egy vezető peptid és egy heterológ protein vagy
HU 215 538 Β polipeptid fúzióját, mely polipeptidet úgy módosítottuk, a vezető peptid C-terminális vége és a heterológ protein N-terminális vége között pozícionált élesztőgomba feldolgozó hellyel szomszédos aminosav szekvenciáját, hogy úgy biztosítsuk a feldolgozó hely beállítását, hogy hozzáférhető legyen a proteolitikus hasításhoz. A polipeptid szerkezete a következő:
jel peptid - vezető peptid - Xl-X2-X3-X4-heterológ protein ahol X* egy peptidkötés vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek, X2 és X3 azonosak vagy különbözők és egy a Lys-t és Arg-t tartalmazó csoportból szelektált bázikus aminosavat képviselnek,
X2 és X3 együttesen meghatároznak egy élesztőgombaelőállítási helyet és
X4 egy peptidkötés vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek lehetnek azonosak vagy különbözők, azzal a feltétellel, hogy X1 és/vagy X4 egy vagy több aminosavat képviselnek és hogy az X1 és/vagy X4 által képviselt aminosavak közül legalább egy a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav.
A jelen összefüggésben a , jel pepiidet” úgy kell értelmezni, mint egy előszekvenciát, mely túlnyomóan hidrofób természetű és egy élesztőgombában expresszált extracelluláris protein prekurzor formáján N-terminális szekvenciaként van jelen. A jel peptid funkciója, hogy lehetővé tegye a szekretálandó heterológ protein számára, hogy belépjen az endoplazmás retikulumba. A jel peptid rendes körülmények között ezen folyamat során lehasad. A jel peptid lehet heterológ vagy homológ a proteint termelő élesztőszervezettel, de mint azt fent magyaráztuk, a jel peptiddel sokkal hatékonyabb hasítást lehet elérni, ha az homológ a kérdéses élesztőszervezettel.
A „vezető peptid” kifejezést úgy kell értelmezni, hogy egy túlnyomórészt hidrofil pepiidet jelöl, melynek az a funkciója, hogy lehetővé tegye a szekretálandó heterológ protein számára, hogy az endoplazmás retikulumból a Golgi-apparátushoz irányítódjon, majd tovább egy szekréciós vezikulumba, a tápközegbe való kiválasztódás céljából (azaz egy expreszszált protein vagy polipeptid exportálását a sejtfalon keresztül vagy legalább a sejtmembránon át a sejt periplazmás terébe).
A „heterológ protein vagy polipeptid” kifejezés egy olyan proteint vagy polipeptidet hivatott jelölni, mely a természetben nem termelődik a gazda-élesztőszervezetben. A „protein” és „polipeptid” fogalmakat alapjában véve egymással kicserélhető fogalmakként használjuk a következő leírásban.
A polipeptid feldolgozó helynél levő módosítása (az a hely, ahol a vezető peptidet a heterológ proteinből élesztőgomba proteolitikus enzimekkel végzett proteolitikus hasítással távolítottuk el), mely módosítást az X1 és/vagy X4 képviseli, lehet a vezető peptid C-terminális végén és/vagy a heterológ protein N-terminális végén levő egy vagy több aminosav extenziójának, helyettesítésének vagy deléciójának formájában.
A találmány értelmében meglepően azt találtuk, hogy sokkal hatékonyabb és helyesebb heterológ proteinelőállítást lehet elérni, ha legalább egy azon aminosavak közül, melyekkel a polipeptid szekvenciáját kibővítettük vagy melyekkel a szekvenciában levő eredeti aminosavak közül egyet vagy többet helyettesítettünk, negatív töltésű aminosav, mint azok, melyeket fent jelöltünk. Hasonló hatás figyelhető meg, amikor negatív töltésű aminosavat biztosítottunk delécióval az előállító hely közelében, azaz eltávolítottunk egy vagy több aminosavat a vezető peptid C-terminális végéből vagy a protein szekvencia N-terminális végéből, míg egy negatív töltésű aminosav van jelen az előállítási hely közelében.
Bármely adott elméletre való korlátozódás óhaja nélkül az a feltételezés, hogy ez a hatás az előállítási hely szomszédságában levő negatív töltésű aminosavak által adott megnövekedett hidrofilitásnak tudható be, ami a vizes intracelluláris környezetben az előállítási helynél levő polipeptid tercier szerkezetének megnövekedett kitettségét eredményezi, így sokkal hozzáférhetőbb az előállító enzim által történő proteolitikus hasításhoz. A negatív töltésű aminosavak előnyös hatása a pozitív töltésű vagy semleges aminosavakkal szemben az ezen aminosavak negatív töltésű oldalláncainak tulajdonítható, mely a feldolgozó hely tercier szerkezetének hidrofilitásához járul hozzá anélkül, hogy az előállító enzimet bármilyen lehetséges módon gátolná.
Az is lehetséges, hogy a negatív töltésű aminosavak hozzájárulnak a feldolgozó hely tercier szerkezetének létrehozásához és fenntartásához (például fordulók, hajtűk vagy hurokszerkezetek) máshogy, mint például a polipeptidekben levő más aminosavmaradékokkal való kölcsönhatás révén. Továbbá létrejöhet közvetlen kölcsönhatás a negatív töltésű aminosavak és a feldolgozó enzim között. így, úgy gondoljuk, hogy a feldolgozó hely két bázikus aminosavjával szomszédos elhelyezkedésű negatív töltésű aminosavak irányíthatják a feldolgozó enzimet, hogy egy megfelelő és hatékony hasítást végezzen a proteinek közötti és/vagy a protein és oldószer közötti töltés kölcsönhatások révén.
Más szempontból a jelen találmány a fent meghatározott polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szerkezettel kapcsolatos.
Egy további szempontból a jelen találmány egy rekombináns expressziós vektorral kapcsolatos, mely képes élesztőgombában replikálódni és mely a fent meghatározott peptidet kódoló DNS-szerkezetet hordoz, kapcsolatos egy élesztőgombatörzzsel is, mely képes expresszálni a heterológ proteint vagy polipeptidet és melyet ezzel a vektorral transzformáltunk.
Egy még további szempontból a jelen találmány kapcsolatos egy az élesztőgombában való heterológ protein vagy polipeptid termelésére való eljárással, mely tartalmazza a transzformált élesztőgombatörzs egy megfelelő tápközegben való szaporítását a heterológ protein vagy polipeptid expressziójának és szekréciójának elérése céljából, mely után a proteint vagy polipeptidet izoláljuk a tápközegből.
A következőkben megadjuk a találmány részletes leírását.
HU 215 538 Β
A fent megadott magyarázattal összhangban, ha X1 egy magányos aminosav, akkor Glu vagy Asp.
X1 és/vagy X4 megfelelően 1-6 aminosavat képvisel.
X1 két aminosav szekvenciáját képviseli, akkor BAszerkezete lehet, ahol A Glu vagy Asp és B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu, például LeuGlu.
Ha X* három aminosav szekvenciáját képviseli, CBA-szerkezete lehet, ahol A és B a fenti meghatározás szerinti és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys, például AspLeuGlu.
Ha X1 kettőnél több aminosav szekvenciáját képviseli, a további aminosavak egyike megfelelően lehet Pro vagy Gly, minthogy ezek az aminosavak úgy ismertek, hogy fordulók, hajtűk és hurokszerkezeteket vezetnek be és/vagy ezek részét képezik, valószínűleg elősegítik az előállítási hely hozzáférhetőségét a proteolitikus enzim számára.
Ha X1 négy aminosav szekvenciáját képviseli, DCBA-szerkezete lehet, ahol A, B és C olyan, amilyennek fent meghatároztuk, és D-nek ugyanolyan jelentései vannak, mint C-nek, például GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu vagy LeuAspLeuGlu.
Ha X* öt aminosav szekvenciáját képviseli, szerkezete EDCBA lehet, ahol A, B, C és D olyan, amilyennek fent meghatároztuk és E-nek ugyanolyan jelentései vannak mint C-nek, például LeuGluArgLeuGlu.
Ha X1 hat aminosav szekvenciáját képviseli, szerkezete FEDCBA lehet, ahol A, B, C, D és E olyan, amilyennek fent meghatároztuk és F-nek ugyanolyan jelentései vannak, mint C-nek, például V alLeuGluArgLeuGlu.
Érthető, hogy az aminosavak más kombinációi is lehetségesek, mint X1 jelentései, a találmány elméletétől való eltávolodás nélkül, azt biztosítva, hogy a szekvenciában az aminosavak közül legalább egy negatív töltésű aminosav, mint azt fent meghatároztuk.
Az X4 megfelelő jelentései lehetnek az X1 esetében bemutatottak, bár az aminosav sorrendje tipikusan fordított (például ABC CBA helyett stb.).
A találmány polipeptidjeinek megtestesülésében, ahol a heterológ proteint egy vagy több pozitív töltésű aminosav vagy hidrofób aminosav iniciál, X4 előnyösen egy vagy több aminosavat képvisel a peptidkötések helyett, mivel azt gondoljuk, hogy ez a proteolitikus enzimek számára nagyobb hozzáférhetőséget biztosít.
Olyan esetekben, ahol X4 1-6 aminosavnak egy N-terminális extenzióját képviseli, megfelelő lehet egy további előállítási hely biztosítása az X4 és a heterológ protein N-terminális vége által képviselt aminosav vagy aminosavak között. Ez különösen akkor fontos, amikor a proteint olyan célokra kívánjuk felhasználni, ahol N-terminális extenzióval nem rendelkező protein jelenléte a kívánatos. A további N-terminális aminosavakat in vitro proteolitikus hasítással el lehet távolítani megfelelő proteolitikus enzimet alkalmazva, mint például egy tripszinszerű proteázt vagy egy vegyszert, mint például a cianogén bromidot alkalmazva. A további előállítási helynél levő hasítást befolyásolni lehet gazda-élesztőszervezettel egy másik élesztőproteolitikus enzimre specifikus előállítási helyet szelektálva.
Néhány célból azonban előnyös lehet az N-terminális extenziót úgy tervezni, hogy speciális célhoz legyen megfelelő. így az extenzió markerként szolgálhat a protein detektálásához, mint a protein tisztításánál segítségként, vagy egy gyógyszer hatásának in vivő szabályozására, például egy szer felezési idejének megnyújtására vagy a testben való speciális elhelyezés tervezésénél.
A jelen találmány polipeptidjének előnyben részesített megtestesítésében X1 és/vagy X4 1 -4 aminosavak aminosavszekvenciáját képviselik. Ebben a megtestesítésben az X2-vel közvetlenül szomszédos aminosav előnyösen Glu vagy Asp, az X3-mal közvetlenül szomszédos aminosav előnyösen Glu vagy Asp, vagy mindkettő Glu vagy Asp, mivel ez az előállítási hely kedvező elhelyezkedését biztosítja ezen aminosavak hidrofil tulajdonságának köszönhetően, ahogy azt a fentiekben bővebben részleteztük. Az X1 vagy X4 által képviselt aminosavszekvencia megfelelően tartalmazhat egynél több Glu-t vagy Asp-t.
A találmány polipeptidjének egy másik érdekes megtestesítésében X1 és X4 mind egy vagy több aminosavat képvisel, más szóval a polipeptid módosított mind a vezető peptid C-terminális végénél, mind a heterológ protein N-terminális végénél. Ebben a megtestesítésben X1 és X4 szimmetrikusan azonos lehet, azaz az X1 és X4 által képviselt aminosav vagy aminosavak ugyanazok sorrendben az X2-ből és X3-ból kinyúlva.
A találmány polipeptidjének jel peptid szekvenciája bármely jel peptid lehet, mely biztosítja az expresszált polipeptid sejtben való kiválasztási reakcióútjára való hatékony irányítását. A jel peptid lehet egy a természetben előforduló jel peptid vagy annak funkcionális részei, vagy lehet egy szintetikus peptid. Az α-faktor jel peptidet, az egémyál amiláz jel peptidet, a módosított karboxipeptidáz jel peptidet vagy az élesztőgomba BARI jel peptidet megfelelő jel peptideknek találtuk. Az egémyál amiláz jel szekvenciát O. Hagenbüchle et al., írták le, Natúré 289, 1981, pp. 643-646. A karboxipeptidáz jel szekvenciát L. A. Valis et al. írták le Cell 48, 1987, pp. 887-897. A BARI jel peptidet a WO 87/02670 számú szabadalomban írták le.
A találmány polipeptidjének vezető peptidszekvenciája lehet bármely olyan vezető peptid, mely részt vesz az expresszált polipeptid endoplazmás retikulumhoz való irányításában és tovább a kiválasztási útvonalon. Lehetséges vezető szekvenciák, melyek erre a célra megfelelőek, élesztőgombákból vagy más szervezetekből származó természetes vezető szekvenciák, mint amilyen az α-faktor vezető vagy annak egy funkcionális analógja. A vezető peptid lehet egy szintetikus vezető peptid is, például az egyik szintetikus vezetőt a WO 89/02463 számú közzétételi iratban írták le a következő aminosavszekvenciával:
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-AspLeu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala
HU 215 538 Β
B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-.
Thr-Leu-Ala
C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala és
E. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala vagy ezek egy származékával.
A találmány módszerével létrehozott heterológ protein lehet bármely olyan protein, melyet előnyösen lehet termelni élesztőgombában. Az ilyen proteinekre példák az aprotinin vagy más proteáz inhibitorok, az inzulin (ide értve az inzulin prekurzorokat), a humán vagy szarvasmarha növekedési hormon, az interleukin, a glukagon, a szöveti plazminogén aktivátor, a VII Faktor, a VIII Faktor, a XIII Faktor, a trombocita eredetű növekedési faktor, az enzimek és így tovább vagy ezek egy funkcionális analógja. A jelen összefüggésben a „funkcionális analóg” fogalom egy a természetes proteinnel hasonló funkciójú polipeptidet hivatott jelölni (ezt úgy kell értelmezni, hogy inkább a természetes protein természetére, mintsem a biológiai aktivitás szintjére vonatkozik). A polipeptid szerkezetileg lehet hasonló a természetes proteinhez és származhat a természetes proteinből a természetes protein C- és N-terminális végeinek egyikéhez vagy mindkettőhöz való egy vagy több aminosav hozzáadásával, a természetes aminosavszekvencia egy vagy több különböző helyén, vagy egy vagy több aminosav helyettesítésével, a természetes protein egyik vagy mindkét végén vagy az aminosavszekvencia egy vagy több helyén, vagy egy vagy több aminosav deléciójával, vagy a természetes aminosavszekvenciában egy vagy több helyen egy vagy több aminosav inzertálásával. Jól ismertek ilyen módosítások számos fent említett protein esetében.
A találmánynak megfelelően, meglepően azt tapasztaltuk, hogy a vezető peptid C-terminális végén vagy a heterológ protein N-terminális végén levő módosítások, ahogy fent leírtuk, lehetővé teszik a helyesen előállított aprotinin (vagy ahogy fent meghatároztuk, egy funkcionális analógjának) magas hozamú termelését. Az aprotinin egy proteázgátló protein, melyet tulajdonságai hasznossá tesznek számos orvosi célra (például a pancreatitis kezelésében, a szeptikus sokk szindrómában, a hiperfibrinolitikus vérzésben és a szívinfarktus esetén). Az aprotininadagolás nagy dózisban csökkenti a vérveszteséget szívsebészeti vagy más nagyobb sebészeti beavatkozás esetében. Az aprotinin hasznos mint tenyésztápközeg-adalék, mivel gátolja a gazdasejt proteázokat, melyek máskülönben az expresszált proteinek nemkívánatos proteolitikus hasítását okozzák. Élesztőgombákban helyesen előállított aprotinin magas hozamának elérése nehézségekbe ütközött ismert természetes vezető szekvenciákat - mint például amilyen az α-faktor vezető - használva. A természetes aprotinint az N-végnél egy bázikus aminosav (Arg) iniciálja és ezen oknál fogva az előző előállítási hely kevésbé megfelelő lehet a proteolitikus hasításhoz (mint azt fent magyaráztuk), ha az ismert vezető peptidek (például az α-faktor vezető) egyikét a jelen találmánynak megfelelő módosítás nélkül alkalmazzuk, a helyesen előállított aprotinin alacsony hozamát eredményezve, ha van egyáltalán hozam.
A jelen találmánynak megfelelően különösen jó eredményeket értünk el az aprotinintermelést figyelembe véve, ha X1 GluArgLeuGlu-t képvisel, vagy ha X4 GluLeu vagy GluLeuAspLeu (lásd a következő példákat), bár azt várjuk, hogy kedvező aprotininhozamokat lehet elérni X1 és X4 más jelentéseivel, feltéve, ha legalább egy aminosav - és legelőnyösebben az előállítási helyhez legközelebb levő - egy negatív töltésű aminosav, ahogy azt fent magyaráztuk.
Szintén a találmánynak megfelelően azt találtuk, hogy a fent leírtak szerint a vezető peptid C-terminális végén vagy a heterológ polipeptid N-terminális végén levő módosítások lehetővé teszik a helyesen előállított inzulin prekurzor, vagy ahogy fent meghatároztuk, ennek egy funkcionális analógja magas hozamú termelését. A találmány ezen megtestesítésében η X1 Glu-ArgLeu-Glu-t vagy Lys-Glu-Leu-Glu-t képviselhet, mely esetben X4 általában egy peptidkötést képvisel.
Másik lehetőségként X4 a Glu-t képviselheti, mely esetben X1 általában egy peptidkötést képvisel. Különösen előnyös eredményeket értünk el a találmánynak megfelelően a B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-29) inzulin analóg prekurzor expresszióját tekintve, ha X1 LysGluLeu-Glu-t képvisel, vagy ha X4 a Phe Glu-val való helyettesítését képviseli - mint az inzulin prekurzor első aminosavját - (lásd a következő példákat). A B(l-29)Ser-AspAspAlaLys-A(l-29) inzulin analóg prekurzorból is elfogadható mennyiséget lehetett elérni, ha X1 Lys-Glu-Leu-Glu-t képviselt. Továbbá azt várjuk, hogy az inzulin prekurzorból magas hozamot lehet elérni az X1 és X4 más jelentéseivel, feltételezve, hogy legalább egy aminosav és legelőnyösebben az, amelyik az előállítási helyhez legközelebb van, egy negatív töltésű aminosav, amint azt korábban magyaráztuk.
A találmány polipeptidját kódoló DNS-szerkezet előállítható szintetikusan, megalapozott standard módszerekkel például az S. L. Beaucage and Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869 által leírt foszforamidit-módszerrcl vagy a Matthis et al., EMBO Journal 3, 1984 pp. 801-805 által leírt módszerrel. A foszforamidit-módszemek megfelelően oligonukleotidokat szintetizálunk például egy automata DNS-szintetizálón, tisztítjuk őket, duplexeket képezünk és ligáljuk a szintetikus DNS-szerkezet létrehozása céljából.
A találmány DNS-szerkezete lehet genom vagy cDNS eredetű, például egy genom vagy cDNS könyvtár preparálásával és a találmány polipeptidjének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvencia standard technikáknak megfelelően (lásd T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) szintetikus oligonukleotid pró5
HU 215 538 Β bákkal végzett hibridizációjával való szkrineléssel lehet kinyerni. Ebben az esetben egy a jel és a vezető peptidet kódoló genom vagy cDNS szekvencia kapcsolódhat egy a heterológ proteint kódoló genom vagy cDNS szekvenciával, mely után a DNS-szekvenciát módosítani lehet a polipeptid X'-X2-X3-X4 aminosavszekvenciának megfelelő helynél, például hely-irányított mutagenezissel, a homológ rekombinációhoz szükséges kívánt aminosavszekvenciát kódoló szintetikus oligonukleotidokat használva, a jól ismert eljárásokkal egyező módon.
Végül a DNS-szerkezet lehet kevert szintetikus és genomiális DNS, kevert szintetikus és cDNS vagy kevert genomiális és cDNS, melyeket a szintetikus genomiális vagy cDNS eredetű fragmentek - mely fragmentek megfelelnek a teljes DNS-szerkezet különböző részeinek - kétszálúvá tételével készítettünk (megfelelően), standard technikáknak megfelelően. így előre látható, hogy a heterológ proteint kódoló DNS-szekvencia genom eredetű, míg a vezető peptidet kódoló szekvencia szintetikusan állítható elő.
Az aprotinint kódoló előnyben részesített DNSszerkezetek olyanok, mint amilyenek a 4., 7., 9., 11. és
12. csatolt ábrákban láthatók, vagy ezek aprotinint kódoló megfelelő módosításai vagy ezek funkcionális analógjai. A DNS-szekvenciák megfelelő módosításaira példák a nukleotid helyettesítések, melyek nem változtatják meg a protein aminosavszekvenciáját, de amely egyezik az élesztőszervezet kódon használatával, melybe a DNS-szerkezetet inzertáltuk, vagy nukleotid helyettesítések, melyek hozzájárulnak egy eltérő aminosavszekvencia kialakulásához és ezért feltehetően egy eltérő proteinszerkezethez, anélkül azonban, hogy káros hatással lennének az eredeti aprotinin antiproteáz tulajdonságaira. A lehetséges módosításokra más példák a szekvenciába való egy vagy több nukleotid inzertálása, a szekvencia bármely végére való egy vagy több nukleotid hozzáadása és egy vagy több nukleotid deléciója a szekvencia bármely végén vagy a szekvencián belül. A specifikus aprotinin analógokra példák az EP 39942A iratban kerültek leírásra.
Az inzulin prekurzorokat kódoló előnyben részesített DNS-szerkezetek azok, amelyeket a 16. és 17. csatolt ábrákban mutattunk be, vagy azok megfelelő módosításai, ahogy fent meghatároztuk.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS-szekvenciát hordozó rekombináns expressziós vektor bármely vektor lehet, mely képes élesztőszervezetekben replikálódni. A vektorban a találmány polipeptidjét kódoló DNS-szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő promoter szekvenciához. A promoter lehet bármely DNS-szekvencia, mely transzkripciós aktivitást mutat élesztőgombában és származhat az élesztőgombákkal akár homológ proteineket kódoló génekből. A promoter előnyösen származhat egy az élesztőgombával homológ proteint kódoló génből. A megfelelő promoterekre példák a Saccharomyces cerevisiaeMai, TPI-, ADH- vagy PGK-promoterek.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS-szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő terminátorhoz is, például a TPI-terminátorhoz (lásd T. Alber and G. Kawasaki, J. Mól. Appl. Génét. 1, 1982, pp. 419-434).
A találmány rekombináns expressziós vektora továbbá tartalmaz egy DNS-szekvenciát, mely képessé teszi a vektort az élesztőgombában való replikálódásra. Az ilyen szekvenciákra példák az élesztőgomba plazmid REP 1-32 μ-os replikációs génjei és a replikációs origó. A vektor tartalmazhat egy szelektálható markert is, például Schizosaccharomyces pombe TPI-gént, amint azt P. R. Russell Gene 40, 1985, pp. 125-130 leírta.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS-szekvenciák sorrendben a promoter és a terminátor ligálásához használt eljárások és ezek az élesztőgombában való replikációhoz szükséges információt hordozó megfelelő élesztőgomba vektorokba való inzertálásához használt eljárások jól ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára (lásd például Maniatis et al., op. cit). Érthető, hogy a vektor megszerkeszthető úgy, hogy vagy először a találmány polipeptidjét kódoló teljes DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szerkezetet hozzuk létre, és ezt követően ezt a ffagmentet egy alkalmas expressziós vektorba inzertáljuk, vagy folyamatosan inzertáljuk az egyes elemek (mint például a jel - vezető vagy heterológ protein) genetikai információit tartalmazó DNS-fragmenteket a ligálást megelőzően.
A találmány eljárásában használt élesztőszervezet lehet bármely alkalmas élesztőszervezet, mely a tenyésztés során nagy mennyiségben termeli a kérdéses heterológ proteint vagy polipeptidet. Az alkalmas élesztőszervezetekre példák lehetnek a Saccharomyces cerevisiae, a Saccharomyces kuyveri, Schizosaccharomyces pombe vagy a Saccharomyces uvarum élesztőfajok törzsei. Az élesztőgomba-sejtek transzformációját protoplaszt-képzéssel lehet befolyásolni (például lásd később az 1. példát), melyet a per se ismert módon végzett transzformáció követ. A sejtek szaporításához használt tápközeg bármely hagyományos tápközeg lehet, mely alkalmas élesztőszervezetek szaporítására. A szelektált heterológ proteint, melynek egy jelentős része a tápközegben lesz jelen, megfelelően előállított formában, hagyományos eljárásokkal lehet a tápközegből kinyerni. Ezen eljárások magukba foglalják az élesztőgombasejtek szeparálását a tápközegből centrifugálással vagy szűréssel, a felülúszó vagy szűrlet proteines tartalmának egy sóval, például ammónium-szulfáttal való kicsapatását, melyet számos kromatográfiás eljárással, például ioncserés kromatográfiával, affinitáskromatográfiával vagy hasonlókkal végzett tisztítás követ.
További szempontból a találmány kapcsolatos az általános formájú X4-aprotinin (1-58) egy új aprotinin analógjával, ahol X4 egy vagy több aminosavból álló N-terminális extenziót képvisel, mely aminosavak közül legalább egy a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav. Az X4 egy 1-6 aminosavból álló szekvenciát képvisel, előnyösen 1 -4 aminosavból állót, és a fent leírt jelentések vala6
HU 215 538 Β melyikét tartalmazhatja. A különösen előnyben részesített X4 jelentés a Glu-Leu és Glu-Leu-Asp-Leu.
A következőkben megadjuk a találmány ábráinak rövid ismertetését.
A találmányt a továbbiakban a következő példákban írjuk le a csatolt rajzokra hivatkozva, melyekben:
1. ábra: az aprotinin (1-58) DNS- és aminosavsorrendjét szemlélteti. A DNS-szekvenciában látható lépcsőzetes vonalak azokat a helyeket jelölik, ahová a szintetikus oligonukleotidokból képzett duplexeket ligái tűk.
2. ábra: A pKFN-802 és a pKFN-803 plazmid szerkezetét mutatja.
3. ábra: a pKFN-849 és a pKFN-855 plazmid szerkezetét mutatja.
4. ábra: a pKFN-849 és a pKFN-855 plazmidokból való 406 bpár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS-szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezajlik.
5A és 5B ábra: a tripszin és plazmin aprotinin általi gátlását mutatja, · a szarvasmarha pankreatikus aprotinint jelöli, x a GluLeu aprotinint jelöli és Δ a GluLeuAspLeu aprotinint jelöli.
6. ábra: a pKFN-852 és pKFN-858 plazmidok szerkezetét mutatja.
7. ábra: a pKFN-852 és a pKFN-858 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRÍ-Xbal fragment DNS-szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezajlik.
8. ábra: A pKFN-995 és a pKFN-998 plazmidok szerkezetét mutatja.
9. ábra: A pKFN-995 és a pKFN-998 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS-szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezajlik.
NOR-760
NOR-754
NOR-354
NOR-355
NOR-356
NOR-357
NOR-358
NOR-359
NOR-360
NOR-361
CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC TTACATGGACCAGTGTATGGAGGT TCCAAACAGAAATCAGGCCTTCTTTTGGC ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTT TCGTTTACGGTGGCT
CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
GC AGAGCTA AGAG AAAC AAC TTC AAGT
AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
CTGCTGAAGACTGCATGAGAACT TGTGGTGGTGCCTAAT
CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC
10. ábra: A pKFN-1000 és a pKFN-1003 plazmidok szerkezetét mutatja.
11. ábra: a pKFN-1000 és a pKFN-1003 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS-szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció alatt a proteolitikus hasítás történik.
12. ábra: A szintetikus aprotinin (3-58) gén DNSszekvenciáját mutatja. A lépcsőzetes vonal azt a helyet jelöli a szekvencián belül, ahová a 10 szintetizált oligonukleotidból képzett 5 duplexet ligáltuk.
13. ábra: A pKFN-305 és pKFN-374/375 plazmidok szerkezetét mutatja.
14. ábra: A pMT636 plazmid szerkezetét mutatja.
15. ábra: A pLaC240 plazmid szerkezetét mutatja.
16. ábra: A pLaC240-ből való módosított vezető inzulin prekurzor gén DNS-szekvenciáját mutatja.
17. ábra: A pKFN-458 plazmidból való 508 bázispár hosszúságú £coRT-A7wjI fragment DNS-szekvencíáját mutatja, mely az MFal-jel-vezető(l—85)-öt és az inzulin analóg prekurzor B(l-29, lGlu+27Glu)AlaAlaLys-A(l — 21 )-et kódolja.
A következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt.
7. példa
A KFN-837 élesztőgombatörzsből való
Glu-Leu-aprotinin(l-58) termelés
a) A pKFN-802 plazmid megszerkesztése
Ligálással 10 oligonukleotidból szerkesztettünk meg egy az aprotinin(l -58)-at kódoló szintetikus gént.
Az oligonukleotidokat automata DNS-szintetizálón szintetizáltuk foszforamidit kémiát alkalmazva szabályozott pórusos üveg segítségével (Beaucage, S. L. and Caruthers, Μ. H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).
A következő 10 oligonukleotidot szintetizáltuk:
Öt duplexet A-E hoztunk létre a fenti 10 oligonukleotidból, melyek az 1. ábrán láthatók.
pmol-t képeztünk a duplexek mindegyikéből A-E, 5’ foszforilált oligonukleotidok megfelelő párjaiból 5 percig tartó hevítéssel 90 °C hőmérsékleten, melyet szobahőmérsékletre való hűtés követett 75 perces időtartam alatt. Az 5 duplexet összekevertük és T4 DNS-ligázzal kezeltük. A szintetikus gént a ligációs keverék 2%os agarózgélen való elektroforézisét követően izoláltuk, mint egy 191 bázispár hosszúságú sávot. A nyert szintetikus gént az 1. ábra mutatja.
A szintetikus gént ligáltuk egy a pLaC212spx3 plazmidból származó 209 bázispár hosszúságú EcoRl-NcoI fragmenthez és a pUC19 plazmid 2,7 kbázisú EcoRl-Xbal fragmentjéhez (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33. (1985), 103-119).
A pLaC 212spx3 plazmid a WO 89/02463 számú közzétételi irat 3. példájában került leírásra.
A pLaC212spx3 plazmid 209 bpár hosszúságú TscoRI-TVcoI fragmentje egy szintetikus élesztőgomba vezető peptidet kódol.
HU 215 538 Β
A lígációs elegyet kompetens E. coli(r , m+) törzsek transzformálására használtuk és ampicillin rezisztenciára szelektáltuk. Egy 32R-Xbal-EcoRA fragment szekvenálásra (Maxam, A. and Gilbert, W., Methods Enzymol, 65 (1980) 499-560) azt mutatta, hogy a kapott telepekből származó plazmidok tartalmazzák az aprotinin (1-58) helyes DNS-szekvenciáját.
Egy pKFN-802 plazmidot izoláltunk további használat céljából. A 2. ábra mutatja a pKFN-802 plazmid szerkezetét.
b) A pKFN-849, pKFN-855 plazmidok és a KFN-837 élesztőgombatörzs megszerkesztése.
A pKFN-802 3,0 kbázisú Ncol-Stul fragmentjét ligáltuk a NOR-790/791 szintetikus ffagmentjéhez T4 DNS-ligázzal:
Μ A K R E L R
CATGGCTAAGAGAGAAT T GAGA CGATTC T C TC T TAACTCT
A ligációs elegyet a Stul restrikciós enzimmel emésztettük, hogy csökkentsük a pKFN-802 bármilyen hátterét és a nyert elegyet kompetens E. coli (ra, m+) törzsek transzformálására használtuk, ampicillin rezisztenciára való szelektálással. A nyert telepek egyikéből származó pKFN-849 plazmidról DNS-szekvenálással mutattuk ki [Sanger, F., Micklen, S., and Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad Sci. USA 74 (1977) 5463-5467], hogy a szintetikus élesztőgomba vezető génhez helyesen fuzionálva tartalmazza a Glu-Leu-Aprotinin(l-58) DNSszekvenciát. A pKFN-849 plazmid szerkezetét a 3. ábra illusztrálja.
A pKFN-849 plazmidot vágtuk az £coRI-gyel és Xbal-gyel és a 406 bpár hosszúságú ffagmentet ligáltuk a pMT636-ból való 9,5 kbázisú Ncol-Xbal fragmenthez és a pMT636-ból való 1,4 kbázisú Ncol—EcoRI ffagmenthez, mely a pKFN-855 plazmidot eredményezte, lásd a 3. ábrát. A pMT636 plazmid a PCT/DK88/00138 számú bejelentésben került leírásra.
A pMT636 egy E. coli - S. cerevisiae hordozó vektor, mely tartalmazza a Schizosaccharomyces pombe TPI-gént (PÓT) (Russell, P. R„ Gene 40 (1985), 125-130), a
S. cerevisiae trióz-foszfát izomeráz promotert és terminátort, a TPI-t és TPIT-t (Alber, T., and Kawasaki, G., J. Mól. Appl. Gén. 1 (1982), 419-434). A pKFN-855 plazmid a következő szekvenciát tartalmazza:
TPIp- LaC212spx3 j el-vezető-Glu-Leu-aprotinin (1—58)-TPIT, ahol LaC212spx3 jel-vezető az a szintetikus élesztőgomba vezető, ami a WO 89/02463 számú közzétételi iratban került leírásra. A pKFN-849 és a pKFN-855 plazmidokból származó 406 bázispár hosszúságú EcoRI-Xbal fragment DNS-szekvenciáját a 4. ábra mutatja.
A S. cerevisiae MT663 (E2-7B XE11 -36 a/, tpi tpi, pép 4-3/pep 4-3) törzset YPGal-on (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktát) szaporítottuk 600 nm hullámhosszon mért 0,6 O. D. értékig.
100 ml tenyészetből gyűjtöttük össze a sejteket centrifugálással, 10 ml vízzel mostuk, újra centrifugáltuk és 1,2 M szorbitot, 25 mM Na2EDTA-t pH = 8,0 és 6,7 mg/ml ditiotreitolt tartalmazó 10 ml oldatban szuszpendáltuk. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten 15 percig inkubáltuk, centrifugáltuk és a sejteket 10 ml 1,2M szorbit 10 mM Na2EDTA-t 10,1 M Na-citrátot, pH=5,8 és 2mg NovozymR-234-et tartalmazó elegyben reszuszpendáltuk. Az elegyet 30 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 10 ml 1,2 M szorbitot és 10 ml CAS-t (1,2 M szorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl [Tris=Tris (hidroximetil)aminometán pH=7,5] tartalmazó elegyben mostuk és 2 ml CAS-ben reszuszpendáltuk. A transzformáláshoz 0,1 ml CAS-ben reszuszpendált sejtet kevertünk megközelítően 1 pg pKFN-855 plazmiddal és a keveréket 15 percig szobahőmérsékleten hagytuk. 1 ml 20%-os polietilén glikol 4000-ret, 20 mM CaCl2-t, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl-ot, pH=7,5 tartalmazó elegyet adtunk hozzá és a keveréket további 30 percig szobahőmérsékleten hagytuk. A keveréket centrifugáltuk és a pelletet 0,1 ml SOS-ben (1,2 M szorbit, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 pg/ml leucin) reszuszpendáltuk és 2 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A szuszpenziót ezután centrifugáltuk és a pelletet 0,5 ml 1,2 M-os szorbitban reszuszpendáltuk. Ezután 52 °C hőmérsékleten 6 ml fedő agart [Sherman etal., SC tápközege, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981), mely 1,2 M szorbitot +2,5% agart tartalmaz, adtunk hozzá, majd a szuszpenziót ugyanezen agarral szilárdított szorbittartalmú tápközeget tartalmazó lemezek tetejére öntöttük. A transzformáns telepeket 30 °C hőmérsékleten való 3 napig tartó inkubálás után újra izoláltuk és folyékony tenyészetek inokulálásához használtuk. Egy ilyen KFN-837 transzformánst szelektáltunk a további jellemzéshez.
A KFN-837 élesztőgomba-törzset YPD tápközegen [1% élesztőkivonat, 2% pepton (Difco Laboratoriestól) és 6% glükóz] szaporítottuk. A törzs tenyészetének 200 ml mennyiségét rázattuk 250 rpm fordulaton 30 °C hőmérsékleten 3 napig 600 nm hullámhosszon mért 20 O. D. értékig (a száraz élesztőgomba biomassza 18,8 g/liter). Centrifugálás után a felülúszót analizáltuk FPLC ioncserés kromatográfiával. Az élesztőgomba felülúszót 0,22 pm Millex GV szűrőegységen szűrtük keresztül és 1 ml-t 20 mM Bicine-nel (pH=8,7) equlibrált MonoS kationcserés oszlopra (0,5 χ 5,0 cm) helyeztük. Az equlibrációs pufferrel való mosás után az oszlopot equlibrációs pufferben lineáris NaCl-grádienssel (0-1 M) eluáltuk. A tripszin inhibitor aktivitást spektrofotometriás vizsgálattal [Kassel, B., Methods Enzymol. 19 (1970), 844-852) határoztuk meg az eluált frakcióban, majd a továbbiakban a 280 nm hullámhosszon mért abszorpció integrálásával a következő egyenletből:
1%
E2g()(aprotmin)=8,3
A hozam 120 mg/liter Glu-Leu-aprotinin(l -58) volt.
Az aminosavanalízishez és az N-terminális szekvenáláshoz a gradiens eluált Glu-Leu-aprotinin(l-58)at koncentráltuk és fordított fázisú oszlopon (Vydac C4 4,6x250 mm) végzett HPLC-vel tisztítottuk. Az eluálást 0,1%-os TFA-ban CHjCN-grádienssel végeztük. Az összegyűjtött frakciókat 100 pl-re koncentráltuk
HU 215 538 Β be vákuumcentrifugálással és a mintákat N-terminális szekvenáláshoz és aminosavanalízishez használtuk.
Az N-terminális szekvenálással a következő szekvenciát találtuk:
Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-TyrThr-Gly-Pro-X-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-TyrAsn-Ala-Lys-Ala megerősítve, hogy az N-terminális vég helyes. A félcisztein maradékokat nem határoztuk meg ezzel a módszerrel, melyeket a vak ciklusokkal (X) megegyezően a 7-es és 16-os számú maradékokra kaptunk.
Az aminosavanalízist az 1. táblázat mutatja. Ebből a táblázatból kitűnik, hogy a terméknek a várt aminosavösszetétele van, például több Glu és Leu. A kicsit alacsonyabb Ile-tartalom legvalószínűbben az Ile (18)-Ile(19) nem teljes hidrolízisének tulajdonítható (ez jól ismert a tudomány számára). Az Arg szintén egy kevéssel több, mint vártuk. Ez azonban a természetes aprotinin esetén is látható (lásd táblázat, 3. oszlop).
Ha Kassel fent említett módszerével összehasonlítjuk, a Glu-Leu-aprotinin(l-58) specifikus aktivitása megegyezik a kísérleti hibán belül a természetes aprotinin aspecifikus aktivitásával. A Glu-Leu-aprotinin (1-58) tipszin és plazmin gátlása a később leírtak szerint meghatározott titrálási görbe szempontjából elkülöníthetetlen volt a szarvasmarha pankreáz aprotininétől (Aprotinin Novo). Az enzim aprotininnel vagy annak analógjával való 30 percig tartó inkubálása után 0,6 mM S 2251-et (KabiVitrum) adtunk és az aktivitást mint a nitroanilin-termelés arányát határoztuk meg. Az aktivitást az aprotininkoncentráció függvényeként ábrázoltuk az 5A és 5B ábrákban. Mind a 3 inhibitorral mindkét enzim teljes gátlását figyeltük meg.
2. példa
A Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l -58)
KFN-840 élesztőgombatörzsben való termelése
Egy a Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l-58)-at kódoló szintetikus gént az 1. példában leírtak szerint szerkesztettük meg. A NOR.793/794 szintetikus fragmentet használtuk a NOR-790/791 helyett:
MAKRELDLR
CATGGCTAAGAGAGAATTGGACTTGAGA CGATTC TC T CT TAACC TGAACTCT
A pUC19 eredetű pKFN-852 plazmidot a pKFN-849 plazmidhoz hasonló módon szerkesztettük meg.
Az 1. példa eljárását követve egy pKFN-858 plazmidot nyertünk, mely a következő szerkezetet tartalmazza: TPIp-La C212spx3-jel-vezető-GluLeuAspLeu-aprotinin(l-58)-TPIT.
A pKFN-852 és pKFN-858 plazmidok megszerkesztését a 6. ábra illusztrálja. A pKFN-852 és pKFN-858 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRI- Xbal fragment DNS-szekvenciáját a 7. ábrában adtuk meg.
A pKFN-858 plazmidot az MT663 élesztőgombatörzsbe transzformáltuk, mely a KFN-840 élesztőgomba-törzset eredményezte. A KFN-840 200 ml tenyészetét YPD-tápközegben rázattuk 250 rpm fordulaton 30 °C hőmérsékleten, 3 napig 600 nm hullámhosszon mért 18 O. D. értékig (a száraz biomassza 16,7 mg/liter). A felülúszó FPLC ionkromatográfiája, ahogy fent leírtuk, 90 mg/liter Glu-Leu-Asp-Leu-aptotinin(l-58) hozamot eredményezett.
Az aminosav savanalízis az 1. táblázatban látható és megerősíti a várt aminosav-összetételt.
A Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l-58) tripszin és plazmin gátlási titrációs görbéi elkülöníthetetlenek voltak a szarvasmarha pankreáz aprotininétől (Aprotinin Novo), lásd az 5A és 5B ábrákat.
3. példa
A KFN-1006 élesztőgomba-törzsből való aprotinin(l-58) termelése
A pKFN-995 plazmidot a pKFN-802 plazmidból szerkesztettük meg, a 3,0 kbázis hosszúságú Ncől-Stul fragment NOR—848/849 szintetikus fragmenthez való ligálásával:
MA KE LEKRR
CATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGG CGATTC C T TAACC TCTTCTCTTCC
A ligációs elegyet a Ball restrikciós enzimmel emésztettük, hogy csökkentsük a pKFN-802 bármilyen hátterét.
A pKFN-998 élesztőgomba expressziós plazmidot alapjában véve az 1. példában leírtak szerint szerkesztettük meg, amint azt a 8. ábra mutatja:
TPIP-LaC212spx3 jel-vezető(l-47) Lys-Glu-LeuGlu (Lys-Arg)-Aprotinin(l -58)-ΤΡΙγ
A pKFN-995 és pKFN-998 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoBl-Xbal fragment DNSszekvenciáját a 9. ábrán adtuk meg.
A pKFN-998 plazmidot az MT663 élesztőgombatörzsbe transzformáltuk az 1. példában leírtak szerint, mely a KFN-1006 élesztőgombatörzset eredményezte. A transzformált kKFN-1006 törzs YPD tápközegben való tenyésztését és az aprotinin(l-58) felülúszóban való analízisét a fent leírtak szerint végeztük.
Az aporintin(l-58)-hozam 30 mg/liter volt.
A tisztított anyag aminosavanalízise megerősítette a várt aminosav-összetételt.
4. példa
A KFN-1008 élesztőgomba-törzsből való aprotinin(l-58)-termelés
A pUC eredetű pKFN-1000 plazmidot az 1. példában leírtak szerint szerkesztettük meg a pKFN-802 plazmid 3,0 kbázisú Ncől-Stul fragment NOR-850/851 szintetikus fragmenthez való ligálásával:
MAERLE K RR
CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGG
CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Az 1. és 3. példa eljárását követve egy pKFN-1003 élesztőgomba expressziós plazmidot nyertünk, mely a következő szerkezetet tartalmazta:
TPIP-LaC212spx3-jel-vezető(l -47)-GluArgLeu Glu (Lys-Arg)-aprotinin(l-58)-TPIT.
HU 215 538 Β
A pKFN-1000 és pKFN-1003 plazmidok szerkezetét a 10. ábra illusztrálja. A pKFN-1000 és pKFN-1003 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRI-Xbal fragment DNS-szekvenciáját all. ábrán adtuk meg.
A pKFN-1003 plazmidot az MT663 élesztőgombatörzsbe transzformáltuk a fent leírtak szerint, mely a KFN-1008 élesztőgomba-törzset eredményezte.
A transzformált KFN-1008 törzs YPD-tápközegben való tenyésztését és az aprotinin (1-58) felülúszóban való analízisét a fent leírtak szerint végeztük. Az aprotinin(l -58)-hozam 020 mg/liter volt.
A tisztított anyag aminosavanalízise igazolta a várt aminosav-összetételt. Továbbá a teljes elsődleges szerkezet igazolását a redukált piridiletilált polipeptid gáz fázisú szekvenálásával nyertük.
Továbbá a rekombináns aprotinin(l-58)tripszinnel szembeni specifikus gátló aktivitása megkülönböztethetetlen volt a szarvasmarha pankresz aprotininétól.
5. példa
A KFN- 783 élesztőgomba-törzsből való aprotinin(1 - 58)-termelés
A pKFN-802 plazmidot (lásd az 1. példát) £coRIgyel és ΑόαΙ-gyel vágtuk és a 400 bázispár hosszúságú ífagmentet a pMT636 plazmidból származó 9,5 kbázisú Ncől-Xbal fragmenthez és a pMT636 plazmidból származó 1,4 kbázisú Ncol-EcoRl fragmenthez ligáltuk, mely a pKFN-803 plazmidot eredményezte, lásd a 2. ábrát. A pKFN-803 a következő szerkezetet tartal15 mázzá:
TPIP-LaC212spx3 jel-vezető-aprotinin(l -58)-TPIT.
1. táblázat Aminosav-összetétel
| Aminosav | Aprotinin Elméleti | Aprotinin Mért | KFN-83 7 Mért | KFN-840 Mért |
| Asp | 5 | 5,00 | 4,95 | 5,93 (+1) |
| Thr | 3 | 2,86 | 2,84 | 2,85 |
| Ser | 1 | 0,94 | 0,92 | 0,93 |
| Glu | 3 | 3,04 | 3,97(+1) | 3,99(+1) |
| Pro | 4 | 4,18 | 3,90 | 3,86 |
| Gly | 6 | 5,95 | 5,91 | 5,94 |
| Alá | 6 | 5,85 | 5,92 | 5,94 |
| Cys | 6 | 5,20 | 5,21 | 5,22 |
| Val | 1 | 0,99 | 1,00 | 1,01 |
| Met | 1 | 0,83 | 0,65 | 0,67 |
| He | 2 | 1,39 | 1,58 | 1,58 |
| Leu | 2 | 1,97 | 3,00(+1) | 4,00(+2) |
| Tyr | 4 | 3,84 | 3,74 | 3,71 |
| Phe | 4 | 3,98 | 3,94 | 3,92 |
| Lys | 4 | 3,92 | 3,99 | 3,99 |
| Arg | 6 | 6,39 | 6,35 | 6,34 |
| Összesen | 58 | 56,33 | 57,87 | 59,88 |
A fent leírtak szerint transzformáltuk az MT663 élesztőgomba-törzsbe a pKFN-803 plazmidot. A fent le- 50 írtak szerint tenyésztettük a transzformált KFN-783 törzset YPD-tápközegben és a felülúszó FPLC ionkromatográfiáját a fent leírtak szerint végezzük. Az aprotinin (1-58) mennyiségi meghatározását a szarvasmarha pankreázból tisztított autentikus aprotinin standardizált 55 oldatának kromatográfiájával való összehasonlítással végeztük. Az aprotinin(l-58) hozama 1 mg/liter alatt volt.
6. példa
Az aprotinin(3—58) termelése
Az aprotinin(3-58) szintetikus génjét ligálással szerkesztettük meg, számos oligonukleotidból.
HU 215 538 Β
Az 1. példában leírtak szerint szintetizáltuk a következő 10 oligonukleotidot:
I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCAT ACACTGGTCC 35-mer II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCA AACAGAAACT 38-mer III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG 35-mer IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATT CTAGC 34-mer V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCG TTTACGGTGGCT 39-mer VI: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 40-mer VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT 27-mer VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG 26-mer IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGG TGGTGCCTAAT 39-mer X: CTAGATTAAGGCACCACCACAAGTTCT CATGCAGTCTTC 38-mer
Öt duplexet A-E hoztunk létre a fenti oligonukleotidokból, amint azt a 12. ábra mutatja.
A duplexek A-E mindegyikéből 20 pmol mennyiséget hoztunk létre az 5’-foszforilált oligonukleotidok I-X megfelelő párjaiból 5 percig tartó 90 °C hőmérsékleten való hevítéssel, melyet 75 percig tartó szobahőmérsékletre való hűtés követett. Az 5 duplexet összekevertük és T4 ligázzal kezeltük. A szintetikus gént mint egy 176 bázispár hosszúságú sávot izoláltuk a ligációs keverék 2%-os agarózgélen való elektroforézise után. A nyert szintetikus gént a 12. ábrán mutatjuk.
A szintetikus 176 bázispár hosszúságú gént ligáitok egy a S. cerevisiae al párosodási faktor jelvezető (1-85) szekvenciát [Markussen, J. et al., ProteinEngineering 1. (1987), 215-223] kódoló pKFN-9 plazmidból származó 330 bázispár hosszúságú EcoRI-Hgal ffagmenthez és a pUC19 (Yanisch-perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33 103-119) plazmidból származó 2,7 kbázisú EcoRl-Xbal ffagmenthez. Az MFal vezető szekvencia után közvetlenül egy Hga\ helyet tartalmazó pKFN-9 szerkezete az EP 214826 számú szabadalomban került leírásra.
A ligációs keveréket egy kompetens E. coli (r~, m+) törzs transzformálására használtuk ampicillin rezisztenciára való szelektálással. A 32Ρ-Λ2>αΙ fragment szelektálása [Maxam, A., and Gilbert, W., Methods Enzymol 65 (1980), 499-560) azt mutatta, hogy a nyert telepekből származó plazmidok az aprotinin(3-58) helyes DNS-szekvenciáját tartalmazzák.
Egy plazmidot, a pKFN305 plazmidot, szelektáltok további használat céljából. A pKFN305 plazmid szerkezetét a 13. ábrán illusztráltok.
A pKFN305 plazmidot £coRI-gyel és Xbál-gyel vágtuk és a 0,5 kbázisú fragmentet ligáitok a pMT636 plazmidból származó 9,5 kbázisú Ncol-Xbal fragmenthez és a pMT636 plazmidból származó 1,4 kbázisú Ncol-EcoRl ffagmenthez, mely a pKFN374 plazmidot eredményezte, lásd a 13. ábrát. A pMT636 plazmidot a pMT608 plazmidból a LEU-2 gén deléciója után és a pMT479 plazmidból szerkesztettük meg, lásd a 14. ábrát. A pMT608 plazmid az EP 195691 számú szabadalomban került leírásra. A pMT479 plazmid az EP 163529 számú szabadalomban került leírásra. A pMT479 plazmid tartalmazza a Schizosaccharomyces pombe TPI-gént (PÓT), a S. cerevisiae triózfoszfát izomeráz promotert és terminátort, a TPIP-t és a TPIT-t [Alber, T. and Kawasaki, G., J. Mól. Appl. Gén. 1 (1982), 419-434], A pKFN374 plazmid a következő TPIp-MF 1 -j el-vezető( 1 - 85)-aprotinin(3 - 5 8)-TPIT, ahol MFal a 5. cerevisiae 1 párosodási faktort kódoló szekvencia [Kuijan, J. and Herskowitz, I., Cell 30 (1982), 933-943), ajel-vezető(l-85) azt jelenti, hogy a szekvencia tartalmazza az MFal jel vezető szekvencia első 85 aminosavmaradékát és az aprotinin(3-58) egy az első két aminosavmaradékkal nem rendelkező aprotininszármazékot kódoló szintetikus szekvencia.
A S. cerevisiae MT663 törzsét (E2-7B XE11 -36 a/α Δ tpiAtpi, pep4-3/pep4-3) YPD-tápközegen (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% glaktóz, 1% laktát) szaporítottuk 600 nm hullámhosszon mért 0,6 O. D. értékig.
A nyert tenyészet 100 ml mennyiségéből a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, 10 ml vízzel mostok, újra centrifugáltuk és 10 ml 1,2 M szorbitot, 25 mM Na2EDTA-t (pH=8,0) és 6,7 mg/ml ditiotreitolt tartalmazó oldatban reszuszpendáltuk. A szuszpenziót 15 percig 30 °C hőmérsékleten inkubáltok, centrifugáltuk, és a sejteket 10 ml 1,2 M szorbitot, 10 mM Na2EDTA-t, 0,1 M nátrium-citrátot (pH=5,8) és 2 mg NovozymR 234-et tartalmazó oldatban reszuszpendáltok. A szuszpenziót 30 percig 30 °C hőmérsékleten inkubáltok, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 10 ml 1,2 ml 1,2 M szorbit és 10 ml CAS {1,2 M szorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl [Tris - Tris(hidroximetil)aminometán]pH=7,5} elegyében mostok és 2 ml CAS-ben reszuszpendáltuk. A transzformációhoz a 0,1 ml CAS-ben reszuszpendált sejteket összekevertük megközelítően 1 pg pKFN 374 plazmiddal és 15 percig szobahőmérsékleten hagytok. Egy ml 20% polietilén glikol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (pH=7,5) elegyét adtuk hozzá, és a keveréket további 30 percig szobahőmérsékleten hagytok. A keveréket centrifugáltok és a pelletet 0,1 ml SOS-ben (1,2 M szorbit, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 pg/ml leucin) reszuszpendáltuk és 2 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáltok. A szuszpenziót ekkor centrifugáltuk és a pelletet reszuszpendáltuk 0,5 ml 1,2 M-os szorbitban. Ezután 6 ml fedő agart (Sherman et al. -féle SC-tápközeg (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, 1981), mely 1,2 M szorbitot +2,5% agart tartalmaz, adtunk 52 °C hőmérsékleten hozzá, és a szuszpenziót ugyanezen agarral szi11
HU 215 538 Β szorbittartalmú tápközeget tartalmazó lemezek felületére öntöttük. A transzformáns telepeket 30 °C hőmérsékleten 3 nap után újra izoláltuk és folyadéktenyészetek indításához használtuk őket. Egy ilyen KFN-322 transzformánst szelektáltunk további jellemzés céljából.
A KFN-322 élesztőgomba-törzset YPD-tápközegen szaporítottuk [1% élesztőkivonat, 2% pepton (a Difco Laboratoriestól) és 2% glükóz], A törzs 10 ml tenyészetét 30 °C hőmérsékleten rázattuk, 600 nm hullámhosszon mért 32 O. D. értékig. Centriíugálás után a felülúszót FPLC ioncserés kromatográfiával vizsgáltuk. Az élesztőgomba felülúszót 0,22 pm-es MillexR GV szűrőegységen szűrtük át és 1 ml-t adtunk egy MonoS kationcserés oszlopra (0,5x5 cm), melyet 20 mM-os Bicine-nel (pH=8,7) equlibráltunk. Az equlibrációs pufferrel való mosás után az oszlopot equlibrációs pufferben levő lineáris NaCl-grádienssel (0-1 M) eluáltuk.
A tripszin inhibitor-aktivitás mennyiségi meghatározását az eluált frakciókban spektrofotometriás vizsgálattal végeztük, majd a továbbiakban a 280 nm hullámhosszon mért abszorpció integrálásával a következő egyenletből:
10/ E280 (aProt'n'n) = 83
A hozam körülbelül 3 mg/liter aprotinin(3-58) volt.
7. példa
Az inzulin prekurzor B(l-29)-AlaAlaLys-A(l—21) termelése a LaCl667 élesztőgomba- törzsből
A WO 89/02463 számú iratban leírt pLac 212spx3 plazmidból izoláltuk az 589 bpár hosszúságú
Sphl-Ncol és a 172 bpár hosszúságú Hpal-Xbal fragmenteket. Ezeket a fragmenteket kapcsoltuk a szintetikus adapterhoz:
MA KE LE KRFV NOR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATT CGTT NOR-964 CGATTCCTTAACCTTTTCTCTAAGCAA és a pMT-743 plazmidból való a WO 89/02463 számú iratban leírt 10 kbázisú Xbal-Sphl ffagmenthez, mely a pLaC240 plazmidot eredményezte (lásd a 15. ábrát). A pLaC240 plazmidból való módosított vezető inzulin prekurzor gén DNS-szekvenciáját a 16. ábra mutatja.
Az MT 663 élesztőgomba-törzs pLaC240 plazmiddal való transzformálása egy inzulin prekurzort szekretáló törzshöz, a LaC1667-hez (MT663/PlaC240) vezetett, melynek produktivitása 165%-a a WO 89/02463 számú iratban leírt módosítás nélküli vezető inzulin prekurzort kódoló gént tartalmazó LaC1414 (MT663/pLaC212spx3) törzshöz viszonyítva.
A következő 10 oligonukleotidot szintetizáltuk:
8. példa
Az inzulin analóg prekurzor B(l-29, lGlu + 27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) termelése a KFN—470 élesztőgomba-törzsből
Tíz oligonukleotid ligálásával egy az inzulin analóg prekurzor B(l—29, lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A (1—21)-et kódoló szintetikus gént szerkesztettünk meg.
A B(l-29, 1G1u+27G1u) a humán inzulin B láncának (melyben Glu maradékokkal helyettesítették a BIPhe és a B27Thr maradékokat) első 29 aminosav-maradékát tartalmazó polipeptidet juttatja kifejezésre. Az A (1-21) a humán inzulin A lánca. Az AlaAlaLys tripeptid a
B29Lys maradékot kapcsolja az AlGly maradékhoz.
NOR-542: AAAGAGAAGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC NOR-543: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACTTC NOR- 69: TTGGTTG AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT NOR-73: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC NOR-315: TCTACGAACCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGCT NOR-316: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACGTTC
NOR-70: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT NOR-71: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC NOR-78: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT NOR- 72: CT AGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGC AGTAG
Öt duplexet képeztünk a fenti 10 oligonukleotidból és a duplexeket az 1. példában leírtakhoz hasonló módon ligái tűk.
A szintetikus 175 bázispár hosszúságú gént ligáltuk a S. cerevisiae 1 párosodási faktor jel-vezető (1-85) szekvenciát. [Markussen, J. et al., Protein Engineering 1 (1987), 215-223] kódoló pKFN-9 plazmidból való 330 bázispár hosszúságú EcoBA-Hgal ffagmenthez és a pUC19 plazmid [Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33 (1985), 103-119] 2,7 kbázisú EcoRI-Xbal fragmentjéhez.
A ligációs keveréket egy kompetens E. coli (r~m+) törzs transzformálására használtuk, ampicillin-rezisztenciára szelektálva. A32 P-YfeaI-£coRI fragment szekvenálása [Maxam, A. and Gilbert, W., Methods Enzymol, 65 (1980) 499-560] azt mutatta, hogy a ka55 pott telepekből származó plazmidok tartalmazták az inzulin analóg prekurzor helyes DNS-szekvenciáját.
Egy plazmidot, a pKFN-456 plazmidot szelektáltuk további használatra.
Az 1. példa eljárását követve egy élesztőgomba 60 expressziós plazmidot, a pKFN-458 plazmidot nyer12
HU 215 538 Β tűk, mely a következő expressziós kazettát tartalmazza: TPIp-MF 1-jel-vezető (l-85)-B (1-29, 1G1u+27G1u)AlaAlaLys-A (1-21)-TPIT.
A pKFN-456 és pKFN-458 plazmidokból származó 508 bázispár hosszúságú EcoRI-Xbal fragment DNS-szekvenciáját a 17. ábrában adtuk meg.
A pKFN-458 plazmidot az MT663 élesztőgombatörzsbe transzformáltuk a fent leírtak szerint, mely a KFN-470 élesztőgomba-törzset eredményezte.
A KFN-470 transzformált törzs YPD-tápközegen való tenyésztését a fent leírtak szerint végeztük. A felülúszóban levő inzulin analóg prekurzor hozamot a leírtak szerint [L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987), 329-332) HPLC-vel határoztuk meg.
A 2. táblázatban az inzulin analóg prekurzorok a B (1-29, lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) ésB(l-29, 27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) és az inzulin prekurzor B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-21) expressziós szintjeit hasonlítottuk össze. Mind a három prekurzort ugyanabban a gazdatörzsben, az MT663-ban expreszszáltuk és az expressziós kazettát tartalmazó plazmidokat tartalmazó
S. pombe TPI-génnel transzformáltuk. Az expressziós kazetta:
TPIp-MF 1-jel-vezető (l-85)-prekurzor-TPIT.
2. táblázat
Élesztőgomba transzformánsokban lévő inzulin és inzulin analóg prekurzorok expressziós szintjei
| Prekurzor | Expressziós szint* |
| B(1 -29)-AlaAlaLys-A(l -21) | 100% |
| B(1 -29), 27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) | 148% |
| B( 1 -29,1 Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A( 1-21) | 479% |
*Az expressziós szinteket az inzulin prekurzor B(l-29)-AlaAlaLysA( 1 -21) expressziós szintjének százalékában adtuk meg, melyet önkényesen 100%-nak vettünk.
Claims (10)
1. Eljárás heterológ protein vagy polipeptid előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy valamely, a jel peptid - vezető peptid -X1 -X2 -X3 -X4 - heterológ proteinszerkezettel rendelkező polipeptidet - ahol X1 peptidkötés, vagy egy vagy több, azonos vagy különböző aminosav,
X2 és X3 azonos vagy különböző bázikus aminosav, és jelentésük Lys vagy Arg, és együttesen egy élesztőgomba-feldolgozási helyet határoznak meg, és
X4 peptidkötés, vagy egy vagy több, azonos vagy különböző aminosav, azzal a feltétellel, hogy X1 és/vagy X4 legalább egy aminosav, és ezen aminosavak legalább egyike negatív töltésű aminosav, így Glu vagy Asp, továbbá azzal a feltétellel, hogy ha X1 peptidkötés, akkor X4 Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-AlaGlu-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg és Glu-Ala-Glu-AlaSer-Leu-Asp peptidtől eltérő, és ha X4 peptidkötés, akkor X1 Ser-Leu-Asp peptidtől eltérő, továbbá azzal a feltétellel, hogy a jel peptid - vezető peptid -X1 peptid jelentése az alábbi szekvenciáktól eltérő: α-faktor jel és vezető (l-85)-Glu-Ala-Glu-Ala-SerLeu-Asp, α-faktor jel és vezető (l-85)-Pro-Leu-Asp, α-faktor jel és vezető (l-85)-Gln-Leu-Asp, Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-LeuPhe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp, kódoló DNS-szerkezetet tartalmazó vektorral transzformáit élesztőt a heterológ protein vagy polipeptid kifejezésének megfelelő körülmények között alkalmas tápközegben tenyésztünk, majd a kapott proteint vagy polipeptidet kinyerjük a tápközegből.
(Elsőbbsége: 1989.03. 03.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén Glu vagy Asp aminosavat tartalmazó polipeptidet kódol.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén BA aminosavakat tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A Glu vagy Asp, és B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén CBA aminosavakat tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A Glu vagy Asp, B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu, és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén DCBA négy aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B és C a 4. igénypontban megadott, és D jelentése valamely, a 4. igénypontban C-ként megadott aminosav.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén EDCBA öt aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B, C és D az 5. igénypontban megadott, és E jelentése valamely, a 4. igénypontban C-ként megadott aminosav.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X1 helyén FEDCBA hat aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B, C, D és E a 6. igénypontban megadott, és F jelentése valamely, a 4. igénypontban C-ként megadott aminosav. (Elsőbbsége: 1989.03.03.)
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén Glu vagy Asp aminosavat tartalmazó polipeptidet kódol.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
HU215 538 B
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén AB aminosavakat tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A Glu vagy Asp, és B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzaljellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén ABC aminosavakat tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A Glu vagy Asp, B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu, és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén ABCD négy aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B és C a 10. igénypontban megadott, és D jelentése valamely, a 10. igénypontban C-ként megadott aminosav.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén ABCDE öt aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B, C és D a 11. igénypontban megadott, és E jelentése valamely, a 10. igénypontban C-ként megadott aminosav. (Elsőbbsége: 1989. 03.03.)
13. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely X4 helyén ABCDEF hat aminosavból álló szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, ahol A, B, C, D és E a 12. igénypontban megadott, és F jelentése valamely, a 10. igénypontban C-ként megadott aminosav.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol X1 és/vagy X4 egynél több aminosavat jelent, a közvetlenül X2 mellett álló aminosav Glu vagy Asp, a közvetlenül X3 mellett álló aminosav Glu vagy Asp, vagy mindkettő Glu vagy Asp. (Elsőbbsége: 1989.03.03.)
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol ha X1 és/vagy X4 egynél több aminosavat jelent, vagy X1 vagy X4, vagy mindkettő egynél több Glu-t vagy Asp-t tartalmaz.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol X1 és X4 egyaránt egy vagy egynél több aminosavat jelent.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol X1 és X4 szimmetrikusan azonos.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol X4 egy vagy több aminosavat jelent, és X4 és a heterológ protein N-terminálisa között még egy további feldolgozási hely van.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol a jel peptid az afaktor jel peptid, az egémyál amiláz, a karboxipeptidáz vagy az élesztő BARI szignál peptidje.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol a vezető peptid valamely természetes vezető peptid, előnyösen az afaktor vezető peptid.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t tartalmazó élesztőt tenyésztünk, mely olyan polipeptidet kódol, ahol a vezető peptid valamely szintetikus vezető peptid, előnyösen az
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-GluGly-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala,
B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-AsnThr-Thr-Leu-Ala,
C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala,
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-AsnThr-Thr-Leu-AIa-Asn-Val-Ala-Met-Ala vagy
E. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-AsnThr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
22. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy polipeptidként vagy heterológ proteinként aprotinint vagy más proteáz inhibitort, inzulint vagy inzulin prekurzort, humán vagy szarvasmarha növekedési hormont, interleukint, szövet plazminogén aktivátort, glükagont, VII, VIII vagy XIII faktort, vérlemezkéből származó növekedési faktort, enzimeket, vagy ezen proteinek valamely funkcionális analógját 55 állítjuk elő.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
23. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy polipeptidként aprotinint vagy valamely funkcionális analógját állítjuk elő.
60 (Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
HU 215 538 Β
24. A 22. igénypont szerinti eljárás azzaljellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, ahol X1 Glu-ArgLeu-Glu vagy Lys-Glu-Leu-Glu.
(Elsőbbsége: 1989. 03. 03.)
25. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, ahol X4 Glu-Leu vagy Glu-Leu-Asp-Leu.
(Elsőbbsége: 1989. 10.06.)
26. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy polipeptidként vagy heterológ proteinként inzulint vagy inzulin prekurzort vagy funkcionális analógjait állítjuk elő.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
27. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, ahol X1 Glu-ArgLeu-Glu vagy Lys-Glu-Leu-Glu.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
28. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, ahol X4 Glu. (Elsőbbsége: 1989.03.03.)
29. A 26-28. igénypontok bármelyike szerinti eljá5 rás azzal jellemezve, hogy polipeptidként vagy heterológ proteinként az inzulin analóg prekurzor B (l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-29)-t állítjuk elő, ahol X1 Lys-Glu-Leu-Glu.
(Elsőbbsége: 1989.03.03.)
10 30. A 26-28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy polipeptidként vagy heterológ proteinként az inzulin analóg prekurzor B (l-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(l-29)-t állítjuk elő, ahol X1 Lys-Glu-Leu-Glu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK105489A DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Polypeptid |
| DK494189A DK494189D0 (da) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | Polypeptid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU902376D0 HU902376D0 (en) | 1991-11-28 |
| HUT58370A HUT58370A (en) | 1992-02-28 |
| HU215538B true HU215538B (hu) | 1999-01-28 |
Family
ID=26065137
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU902376A HU215538B (hu) | 1989-03-03 | 1990-03-01 | Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel |
| HU95P/P00592P HU211600A9 (en) | 1989-03-03 | 1995-06-29 | Yeast expressing system |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00592P HU211600A9 (en) | 1989-03-03 | 1995-06-29 | Yeast expressing system |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5395922A (hu) |
| EP (1) | EP0461165B2 (hu) |
| JP (1) | JP2609367B2 (hu) |
| KR (1) | KR970005928B1 (hu) |
| AT (1) | ATE110414T1 (hu) |
| AU (1) | AU624694B2 (hu) |
| CA (1) | CA2050336C (hu) |
| CZ (1) | CZ285239B6 (hu) |
| DD (1) | DD296965A5 (hu) |
| DE (1) | DE69011853T3 (hu) |
| DK (2) | DK105489D0 (hu) |
| ES (1) | ES2062514T5 (hu) |
| FI (1) | FI104985B (hu) |
| HU (2) | HU215538B (hu) |
| IE (1) | IE66469B1 (hu) |
| IL (1) | IL93609A (hu) |
| NO (2) | NO304236B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ232742A (hu) |
| PL (1) | PL163532B1 (hu) |
| RU (1) | RU2194758C2 (hu) |
| UA (1) | UA27706C2 (hu) |
| WO (1) | WO1990010075A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA901476B (hu) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| JPH04507341A (ja) * | 1989-05-19 | 1992-12-24 | バイオテクノロジー リサーチ アンド ディヴェロプメント コーポレーション | ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾部位を有する融合タンパク質及び製造及び精製方法 |
| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| DK300090D0 (da) * | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| FI92601C (fi) * | 1992-03-11 | 1994-12-12 | Marja Makarow | Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista |
| US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
| DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| ZA954983B (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
| DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
| EP1365028B1 (en) * | 1996-12-13 | 2009-03-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method for expression of PDGF or IGF proteins in yeast |
| EP0946735B1 (en) * | 1996-12-20 | 2006-02-08 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| AU5549998A (en) * | 1997-01-24 | 1998-08-18 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
| US6046000A (en) | 1997-11-07 | 2000-04-04 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Method for identifying genes encoding signal sequences |
| JP2003525570A (ja) | 1998-01-23 | 2003-09-02 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法 |
| PL356005A1 (en) | 1999-12-29 | 2004-05-31 | Novo Nordisk A/S | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast |
| EP1278544A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-08-18 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) * | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7595172B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| EP1463752A4 (en) * | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| EP2277910A1 (en) | 2001-12-21 | 2011-01-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| ATE492631T1 (de) | 2002-09-13 | 2011-01-15 | Cornell Res Foundation Inc | Verwendung von mutationen zur verbesserung von aspergillus-phytasen |
| EP1687428A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
| ATE517119T1 (de) | 2003-12-03 | 2011-08-15 | Novo Nordisk As | Einzelketteninsulin |
| WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| ATE557037T1 (de) | 2006-02-27 | 2012-05-15 | Novo Nordisk As | Insulin derivate |
| US20080026376A1 (en) * | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Huaming Wang | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| US8198046B2 (en) | 2006-07-11 | 2012-06-12 | Danisco Us Inc. | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| CN101541830A (zh) | 2006-09-22 | 2009-09-23 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶抗性的胰岛素类似物 |
| WO2008037735A1 (en) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making maturated insulin polypeptides |
| ES2425413T3 (es) | 2006-11-22 | 2013-10-15 | Novo Nordisk A/S | Método para preparar carboxipeptidasa activada |
| EP2170945A1 (en) | 2007-07-16 | 2010-04-07 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, pegylated insulin analogues |
| EP2178909B1 (en) | 2007-08-13 | 2015-10-21 | Novo Nordisk A/S | Rapid acting insulin analogues |
| WO2009022006A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids |
| CN101784562B (zh) | 2007-08-15 | 2016-07-13 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物 |
| US8501449B2 (en) | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| EP2910571B1 (en) | 2008-03-18 | 2016-10-05 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| JP5818681B2 (ja) | 2008-04-01 | 2015-11-18 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | インスリンアルブミンコンジュゲート |
| WO2011089170A2 (en) | 2010-01-22 | 2011-07-28 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing fgf-21 with low degree of o-glycosylation |
| KR101702342B1 (ko) * | 2009-03-12 | 2017-02-03 | 빅텍 프라이빗 리미티드 | 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 및 이의 방법 |
| PL2340033T3 (pl) | 2009-06-26 | 2014-03-31 | Novo Nordisk As | Preparat zawierający insulinę, nikotynamid i argininę |
| ES2550761T3 (es) | 2009-11-25 | 2015-11-12 | Novo Nordisk A/S | Método para producción de polipéptidos |
| JP5973427B2 (ja) | 2010-06-23 | 2016-08-23 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 追加のジスルフィド結合を含有するインスリン類似体 |
| WO2011161083A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Human insulin containing additional disulfide bonds |
| BR112012033107A2 (pt) | 2010-06-23 | 2016-10-11 | Novo Nordisk As | derivados de insulina contendo ligações dissulfeto adicionais. |
| KR20140030125A (ko) | 2010-12-14 | 2014-03-11 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 인슐린, 니코틴아미드 및 아미노산을 포함하는 제제 |
| US20130331320A1 (en) | 2010-12-14 | 2013-12-12 | Novo Nordisk A/S | Fast-acting insulin in combination with long-acting insulin |
| WO2012171994A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Novo Nordisk A/S | Multi substituted insulins |
| RU2460795C1 (ru) * | 2011-07-06 | 2012-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека |
| WO2013186138A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Novo Nordisk A/S | Preparation comprising insulin, nicotinamide and arginine |
| EP2925345B1 (en) | 2012-12-03 | 2018-09-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues |
| CN103254277B (zh) | 2013-05-03 | 2017-02-08 | 南京工业大学 | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 |
| WO2014195452A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| PL233560B1 (pl) | 2014-12-05 | 2019-10-31 | Mabion Spolka Akcyjna | Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka |
| EP3268384B1 (en) | 2015-03-10 | 2021-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
| EP3303380B1 (en) | 2015-06-02 | 2020-01-15 | Novo Nordisk A/S | Insulins with polar recombinant extensions |
| US20180244743A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-08-30 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
| JP2018531900A (ja) | 2015-08-25 | 2018-11-01 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 |
| EP3341401A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-07-04 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives and the medical uses hereof |
| KR102043067B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-11 | 엘지전자 주식회사 | 차량용 사이드 미러 및 차량 |
| EP3668892A1 (en) | 2017-08-17 | 2020-06-24 | Novo Nordisk A/S | Novel acylated insulin analogues and uses thereof |
| BR112022009510A2 (pt) | 2019-12-11 | 2022-08-16 | Novo Nordisk As | Análogo de insulina, composição farmacêutica, e, método de tratamento, prevenção ou alívio de uma doença ou distúrbio ou condição |
| WO2023144240A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited | Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5712580A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-09 | James Joseph Connell | Engine charging and scavenging |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| WO1984004330A1 (en) * | 1983-04-22 | 1984-11-08 | Amgen | Secretion of exogenous polypeptides from yeast |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| JPS61264000A (ja) * | 1985-03-21 | 1986-11-21 | イミユネツクス コ−ポレイシヨン | 標識ペプチドによるタンパク質の合成 |
| JPS6236183A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-02-17 | ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| DK175535B1 (da) * | 1987-03-04 | 2004-11-29 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid |
| AU1987088A (en) * | 1987-06-24 | 1989-01-19 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| DK450187D0 (da) * | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| DK463887D0 (da) * | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
| DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
| JP3092811B2 (ja) * | 1988-07-23 | 2000-09-25 | デルタ バイオテクノロジー リミテッド | ペプチドおよびｄｎａ配列 |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
-
1989
- 1989-03-03 DK DK105489A patent/DK105489D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-02-27 ZA ZA901476A patent/ZA901476B/xx unknown
- 1990-03-01 NZ NZ232742A patent/NZ232742A/xx unknown
- 1990-03-01 WO PCT/DK1990/000058 patent/WO1990010075A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-01 DK DK90904258.2T patent/DK0461165T3/da active
- 1990-03-01 AU AU52612/90A patent/AU624694B2/en not_active Ceased
- 1990-03-01 HU HU902376A patent/HU215538B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 UA UA5010019A patent/UA27706C2/uk unknown
- 1990-03-01 KR KR1019910701029A patent/KR970005928B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 DE DE69011853T patent/DE69011853T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 EP EP90904258A patent/EP0461165B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 CA CA002050336A patent/CA2050336C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-01 AT AT90904258T patent/ATE110414T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 RU SU5010019/13A patent/RU2194758C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 JP JP2504527A patent/JP2609367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 ES ES90904258T patent/ES2062514T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-02 IE IE74990A patent/IE66469B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 IL IL9360990A patent/IL93609A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 CZ CS901039A patent/CZ285239B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 DD DD90338353A patent/DD296965A5/de unknown
- 1990-03-02 PL PL90284146A patent/PL163532B1/pl not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-02 FI FI914125A patent/FI104985B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-02 NO NO913427A patent/NO304236B1/no unknown
-
1994
- 1994-02-15 US US08/196,887 patent/US5395922A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-02 US US08/397,597 patent/US5514585A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-02 US US08/397,595 patent/US5510249A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 HU HU95P/P00592P patent/HU211600A9/hu unknown
-
1997
- 1997-10-23 NO NO974899A patent/NO974899D0/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU215538B (hu) | Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel | |
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| US5631144A (en) | Application of novel DNA fragments as a coding sequence for a signal peptide for the secretion of mature proteins by recombinant yeast, expression cassettes, transformed yeast and corresponding process for the preparation of proteins | |
| US5162498A (en) | Synthetic yeast leader peptides | |
| RU2143495C1 (ru) | Способ получения гетерологичного белка | |
| US5639642A (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| JP2001527387A (ja) | 合成リーダーペプチド配列 | |
| EP0946735B1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0868523B1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell | |
| EP1097228B1 (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |