CN103249427A - 速效胰岛素联合长效胰岛素 - Google Patents

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Abstract

包含长效胰岛素化合物、速效胰岛素化合物、烟碱化合物和氨基酸的胰岛素制剂。

Description

速效胰岛素联合长效胰岛素
发明领域
本发明涉及包含长效胰岛素化合物、速效胰岛素化合物、烟碱化合物和氨基酸的胰岛素制剂。本发明还涉及制备具有长效特性和速效特性的胰岛素制剂的方法，及制备用于治疗糖尿病的药用组合物的方法。
发明背景
糖尿病是其中利用葡萄糖的能力部分或完全丧失的代谢障碍（metabolic disorder）。所有人中约5%患有糖尿病，并且该障碍接近流行比例。
自从20世纪20年代引入胰岛素以来，在糖尿病治疗中已作出连续改善。为了帮助避免高血糖水平，糖尿病患者经常实行多次注射治疗，由此每餐给予胰岛素。由于糖尿病患者已经用胰岛素治疗了几十年，因此主要需要安全和改善生活质量的胰岛素制剂。在市售的胰岛素制剂中，可提及速效、中效和长效制剂。
目前，糖尿病（1型糖尿病和2型糖尿病）的治疗越来越大程度上依赖于所谓的强化胰岛素治疗。根据该方案，患者经每日多次胰岛素注射治疗，包括每日1次或2次注射长效胰岛素以满足基本胰岛素需求，辅以推注速效胰岛素以满足进餐相关的胰岛素需求。
在糖尿病的治疗中，已经提出和使用许多种胰岛素药用制剂，如普通胰岛素（如Actrapid®）、低精蛋白锌胰岛素（称为NPH）、胰岛素锌混悬液（如Semilente®、Lente®和Ultralente®）、和双相低精蛋白锌胰岛素（如NovoMix®）。也已开发人胰岛素类似物和衍生物，针对特定的作用特性即速效或长效设计。长效胰岛素类似物德谷胰岛素目前处于 3a期临床（Begin™），而德谷胰岛素和速效门冬胰岛素的双相制剂DegludecPlus已进入3期临床（BOOSTTM）。包含速效胰岛素类似物的一些市售胰岛素制剂包括NovoRapid®（B28Asp人胰岛素制剂）、Humalog®（B28LysB29Pro人胰岛素制剂）和Apidra®（B3LysB29Glu人胰岛素制剂）。包含长效胰岛素类似物的一些市售胰岛素制剂包括Lantus®（甘精胰岛素制剂）和Levemir®（地特胰岛素制剂）。
国际申请WO 91/09617和WO/9610417（Novo Nordisk A/S）公开了含有烟酰胺或烟酸或其盐的胰岛素制剂。
通常胰岛素药用制剂通过皮下注射给药。对于患者重要的是胰岛素的作用特性，指胰岛素对葡萄糖代谢的作用作为从注射开始的时间的函数。在该特性中，起效时间、最大值和总作用持续时间尤其重要。在推注胰岛素的情况下，患者期望和要求具有不同作用特性的多种胰岛素制剂。一个患者在同一天可能使用具有非常不同的作用特性的胰岛素制剂。所期望的作用特性例如取决于当天的时间和患者进餐的量和组成。
胰岛素的独特性质是其缔合成六聚体的能力，以这种形式，在生物合成和储存期间防止激素化学和物理降解。胰岛素的X射线晶体学研究表明，六聚体由通过3次旋转轴关联的3个二聚体组成。这些二聚体通过位于3次轴中心上2个锌离子的相互作用紧密缔合。当人胰岛素以高浓度药用制剂的形式注射到皮下组织时，它自我缔合，而相对较慢地解离成单体。胰岛素的六聚体和二聚体比单体较慢透过毛细血管壁。
WO 2003/094956 和WO 2003/094951公开了速效和长效的稳定的胰岛素（酰化胰岛素、地特胰岛素）。WO 2007/074133公开了包含长效酰化胰岛素（德谷胰岛素）和速效胰岛素（门冬胰岛素）的组合物。
对于患者同等重要的是胰岛素制剂的化学稳定性，例如由于大量使用笔式注射装置，如含有Penfill®药筒的装置，所述药筒中储存胰岛素制剂直至整个药筒变空，对于含有1.5-3.0 ml药筒的装置可能是至少1-2周。在储存期间，胰岛素结构中发生共价化学变化。这可导致形成可能活性较低和/或潜在免疫原性的分子，如脱酰胺产物和较高分子量的转化产物（二聚体、聚合物）。此外，胰岛素制剂的物理稳定性也是重要的，因为长期储存可最终导致形成无生物活性和潜在免疫原性的不溶性原纤维。
发明概述
本发明涉及包含长效胰岛素化合物、速效胰岛素化合物、烟碱化合物和/或其盐和氨基酸的胰岛素制剂。
本发明涉及具有改善的速效胰岛素化合物的吸收速率，同时维持长效胰岛素化合物的长效特性的胰岛素制剂。本发明还涉及具有有利的化学和物理稳定性的制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及胰岛素制剂，其包含：
长效胰岛素化合物，其为酰化胰岛素或酰化胰岛素类似物，
速效胰岛素化合物，其为胰岛素类似物或人胰岛素，
烟碱化合物，和
精氨酸。
在另一个实施方案中，本发明还考虑治疗受试者糖尿病或降低受试者血糖水平的方法，包括给予受试者或哺乳动物根据本发明的胰岛素制剂。
附图说明
图1表示通过在制剂中包含80 mM（点线）、120 mM（实线）和230 mM（虚线）烟酰胺（实施例3），提高了Boost™制剂（灰线）中门冬胰岛素的吸收速率。
图2表示通过包含230 mM烟酰胺（虚线），改变了Boost™制剂（灰线）中德谷胰岛素的动力学特性，而包含80 mM（点线）或120 mM（实线）烟酰胺的制剂与对照制剂类似（实施例3）。
图3表示通过包含230 mM（虚线）或120 mM烟酰胺（实线），减少了根据表1的与门冬胰岛素结合的制剂中德谷胰岛素的多六聚体形成，而根据利用Superose 6PC柱上尺寸排阻色谱的缓冲盐水中的体外模型，包含80 mM（点线）或40 mM烟酰胺（点划线）的制剂的多六聚体复合物的峰高，与不含烟酰胺的对照制剂（灰实线）大致相同（实施例5）。
发明详述
本发明涉及包含长效胰岛素化合物、速效胰岛素化合物、烟碱化合物和/或其盐和氨基酸的胰岛素制剂。
意外发现本发明胰岛素制剂中的速效胰岛素化合物在皮下注射后的吸收快于对照胰岛素制剂的吸收。这种性质可用于速效胰岛素，特别是与每餐前给予胰岛素的多次注射方案有关。由于起效更快，可以比传统速效胰岛素溶液更接近进餐方便地使用胰岛素。此外，胰岛素的更快消失可以减少餐后低血糖的风险。同时，本发明胰岛素制剂中长效胰岛素化合物的多六聚体的形成，仍然有利于长效胰岛素化合物。
本发明的胰岛素制剂是包含长效胰岛素化合物诸如德谷胰岛素、速效胰岛素化合物诸如门冬胰岛素、烟碱化合物诸如烟酰胺，和氨基酸精氨酸的混合制剂。在一个实施方案中，本发明的胰岛素制剂可包含其它氨基酸。这些胰岛素制剂具有比现有疗法更接近地模拟正常生理学的快速吸收和超长效特性。此外，本发明的胰岛素制剂具有适合市售药用制剂的化学和物理稳定性。
本发明的胰岛素制剂与现有胰岛素疗法相比，提供甚至更快的速效胰岛素化合物的起效，而不改变长效胰岛素化合物的超长效特性。制剂中的超速效胰岛素化合物具有恢复第一相胰岛素释放、注射方便和停止肝葡萄糖生成的优点。通过猪的若干PK/PD实验表明，本发明的胰岛素制剂与诸如BOOSTTM的常规制剂相比，具有从皮下组织到血浆的有利的吸收速率，初始吸收速率的增长为1.5-3倍。这种更快的吸收速率可以改善血糖控制和便利性，并可以允许从餐前给药转为餐后给药。本发明部分基于以下意外发现，即尽管添加烟酰胺提高了速效胰岛素类似物的吸收速率，但它还通过明显增加HMWP的量对化学稳定性产生负面影响。本发明的胰岛素制剂通过添加精氨酸具有改善的化学稳定性，这反映在例如储存后二聚体和聚合物和脱酰胺胰岛素的形成减少。
在猪模型中，添加高浓度烟酰胺表现出改变德谷胰岛素的长效特性，然而，低浓度烟酰胺对德谷胰岛素的特性没有影响，而且仍然提高门冬胰岛素的吸收速率。同样地，在较高烟酰胺浓度下，减少了组合物中德谷胰岛素多六聚体的形成，而在较低烟酰胺浓度下，对组合物中多六聚体的形成影响小。
在本发明的一个实施方案中，烟碱化合物在组合物中以小于260 mM或小于230 mM的浓度存在。
在一个实施方案中，胰岛素制剂包含长效胰岛素化合物、速效胰岛素化合物或其组合，烟碱化合物和/或其盐，和精氨酸和/或其盐。
本发明提供胰岛素制剂，其包含根据本发明的速效胰岛素化合物和长效胰岛素化合物，上述化合物以约0.1 mM至约10.0 mM的浓度存在，并且其中所述制剂具有3-8.5的pH。该制剂还包含烟碱化合物和精氨酸。该制剂可进一步包含金属离子、缓冲体系、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂。
在一个实施方案中，长效胰岛素是酰化胰岛素类似物。
在另一个实施方案中，酰化胰岛素类似物是NεB29-十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素。
在一个实施方案中，根据本发明的胰岛素制剂包含NεB29-十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素的水溶液、B28Asp人胰岛素、烟酰胺和精氨酸。本发明的制剂中NεB29-十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素的含量可以是15-500国际单位(IU)/ml，例如在注射用制剂中30-333 lU/ml。本发明的溶液中B28Asp人胰岛素的含量可以是15-500 国际单位(IU)/ml，例如在注射用制剂中30-333 IU/ml。然而，对于肠胃外给药的其它目的，胰岛素化合物的含量可以更高。
在上下文中单位“IU”对应于6 nmol。
术语“德谷胰岛素（insulin degludec）”或“德谷胰岛素（degludec） ”是指酰化人胰岛素类似物NεB29-十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素。
术语“门冬胰岛素（insulin aspart）”或“门冬胰岛素（aspart）”是指人胰岛素类似物B28Asp人胰岛素。
术语“起效”是指从注射直至PK曲线转为增长的时间。
术语“吸收速率”是指PK曲线的斜率。
根据本发明的“胰岛素化合物”本文中被理解为人胰岛素、胰岛素类似物和/或其任何组合。
本文所用术语“人胰岛素”指结构和性质公知的人体激素。人胰岛素具有通过半胱氨酸残基间的二硫桥相连的两条多肽链，即A链和B链。A链是21氨基酸肽，而B链是30氨基酸肽，这两条链通过3个二硫桥相连：一个在A链的6位和11位的半胱氨酸之间，第二个在A链的7位半胱氨酸和B链的7位半胱氨酸之间，而第三个在A链的20位半胱氨酸和B链的19位半胱氨酸之间。
将激素合成为由以下组成的单链前体胰岛素原(前胰岛素原)：24个氨基酸的前肽，接着是含有86个氨基酸的胰岛素原，其构型为前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是将连接肽从A链和B链分裂的分裂位点。
本文所用术语“基础胰岛素”是指在糖尿病标准模型中时效超过15小时并且适于满足夜间和餐间胰岛素需求的胰岛素肽制剂。优选地，基础胰岛素的时效为至少20小时。优选地，基础胰岛素的时效为至少10小时。优选地，基础胰岛素的时效为15-48小时。优选地，基础胰岛素的时效类似于或长于NPH胰岛素或Nε B29-十四烷酰基desB30人胰岛素的市售药用组合物的时效。
本文所用术语“推注用胰岛素”、“餐时胰岛素”或“速效胰岛素”是指速效且适于满足餐时或餐后胰岛素需求的胰岛素肽。
本文所用术语“双相胰岛素”是指包含“推注用胰岛素”和“基础胰岛素”的混合物的药用组合物。
本文所用术语“不钝化”是指当配制在一种制剂中时，速效胰岛素和酰化胰岛素的作用特性都与速效胰岛素和酰化胰岛素按单独制剂给药时的作用特性一致或基本一致。
本文所用术语“OAD”或“OAD(s)”是指一种或多种口服抗糖尿病药物。OAD(s)的非限制性实例可以是磺酰脲（SU）、双胍如二甲双胍、或噻唑烷二酮类（TZD）。
术语“可编码氨基酸”或“可编码氨基酸残基”用于指能由核苷酸三联体（“密码子”）编码的氨基酸或氨基酸残基。
hGlu是高谷氨酸。
α-Asp是L型-HNCH(CO-)CH2COOH。
β-Asp 是L型-HNCH(COOH)CH2CO-。
α-Glu是L型-HNCH(CO-)CH2CH2COOH。
γ-Glu是L型-HNCH(COOH)CH2CH2CO-。
α-hGlu是L型-HNCH(CO-)CH2CH2CH2COOH。
δ-hGlu 是L型-HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-。
β-Ala是-NH-CH2-CH2-COOH。
Sar是肌氨酸（N-甲基甘氨酸）。
表述“在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基”是指诸如Asp、Glu和hGlu的氨基酸残基。这些氨基酸可以是L-或D-构型。如果没有指明，应理解为该氨基酸残基是L构型。
表述“具有中性侧链的氨基酸残基”是指诸如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基。
当根据本发明的胰岛素衍生物被称为“生理pH值下可溶”时，是指胰岛素衍生物可用于制备生理pH值下完全溶解的可注射胰岛素组合物。这种有利的溶解性可能是由于胰岛素自身的内在性质，或是由于胰岛素衍生物与溶媒中含有的一种或多种成分之间有利的相互作用。
表述“高分子量胰岛素”或“hmw”是指人胰岛素复合物、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的分子量大于人血清白蛋白，大于胰岛素类似物或胰岛素衍生物的十二聚体复合物，或大于约70 kDalton。
表述“中等分子量胰岛素”或“mmw”是指人胰岛素复合物、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的分子量介于约胰岛素六聚体至约胰岛素十二聚体之间，即24-80 kDalton之间。
术语“低摩尔量胰岛素”或“lmw”是指人胰岛素复合物、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的分子量小于24 kDalton。
表述“净电荷”是指分子的总电荷。在pH 7.4时，人胰岛素的负净电荷约为-3，或者当形成六聚体时，约为每个胰岛素单体-2.5。
本说明书和实施例使用下列缩写词：
hGlu 高谷氨酸
Sar 肌氨酸（N-甲基甘氨酸）
S.c. 皮下
Acyl ins 酰化胰岛素
Ins 胰岛素。
根据本发明的“胰岛素”本文中被理解为人胰岛素、胰岛素类似物和/或其任何组合。
本文所用术语“人胰岛素”指结构和性质公知的人体激素。人胰岛素具有通过半胱氨酸残基间的二硫桥相连的两条多肽链，即A链和B链。A链是21氨基酸肽，而B链是30氨基酸肽，这两条链通过3个二硫桥相连：一个在A链的6位和11位的半胱氨酸之间，第二个在A链的7位半胱氨酸和B链的7位半胱氨酸之间，而第三个在A链的20位半胱氨酸和B链的19位半胱氨酸之间。
将激素合成为由以下组成的单链前体胰岛素原(前胰岛素原)：24个氨基酸的前肽，接着是含有86个氨基酸的胰岛素原，其构型为前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是将连接肽从A链和B链分裂的分裂位点。本文所用“胰岛素类似物”是指从天然存在的胰岛素的原始结构，如人胰岛素的原始结构通过突变衍生的多肽。通过删除和/或取代天然存在的胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基，和/或通过添加至少一个氨基酸残基，进行一种或多种突变。添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基或其它天然存在的氨基酸残基。
在一个实施方案中，胰岛素类似物与母体胰岛素相比，包含少于8个修饰（取代、删除、添加和其任何组合），或者与母体胰岛素相比少于7个修饰，或者与母体胰岛素相比少于6个修饰，或者与母体胰岛素相比少于5个修饰，或者与母体胰岛素相比少于4个修饰，或者与母体胰岛素相比少于3个修饰，或者与母体胰岛素相比少于2个修饰。
胰岛素分子中的突变通过说明链（A或B）、位置和取代天然氨基酸的氨基酸的三字母编码表示。“desB30”或“B(1-29)”是指缺失B30氨基酸残基的天然胰岛素B链或其类似物，而B28Asp人胰岛素是指其中B链28位的氨基酸残基被Asp取代的人胰岛素。
德谷胰岛素说明书第4页：本发明的酰化胰岛素化合物相互缔合形成包含锌的复合物。这些胰岛素-锌复合物在药用组合物中可以以六聚体、十二聚体或比十二聚体更高分子量的复合物存在。各种胰岛素与锌形成复合物，如人胰岛素、酰化胰岛素（胰岛素衍生物）和胰岛素类似物。
在本发明的一个实施方案中，至少85%的酰化胰岛素以复合物存在，该复合物是酰化胰岛素十二聚体或比酰化胰岛素十二聚体更高分子量的复合物。
在本发明的一个实施方案中，至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的酰化胰岛素以复合物存在，该复合物是酰化胰岛素十二聚体或比酰化胰岛素十二聚体更高分子量的复合物。
在本发明的一个实施方案中，药用组合物可包含表面活性剂。表面活性剂可以以基于药用组合物重量0.0005–0.01%的量存在。在一个实施方案中，表面活性剂可以以基于组合物重量0.0005–0.007%的量存在。表面活性剂的一个实例是聚山梨醇酯20，它在组合物中可以以基于组合物重量0.001-0.003%的量存在。另一个实例是泊洛沙姆188，它可以以基于组合物重量0.002-0.006%的量存在。
本发明的长效胰岛素可以在胰岛素分子的不同位置被酰化。在一个实施方案中，长效胰岛素在位于母体胰岛素分子B链中Lys残基的ε-氨基上被酰化，例如，在人胰岛素分子B29赖氨酸基团的ε-氨基上。然而，根据本发明的其它方面，酰化可发生在长效胰岛素分子的其它位置上，如B1位的α-氨基上或长效胰岛素分子中天然氨基酸残基被赖氨酸残基取代的位置上，前提是B29从赖氨酸变为另一种氨基酸残基。
在一个实施方案中，长效胰岛素在B1位的α-氨基上或者在胰岛素分子A链或B链中赖氨酸残基的游离ε-氨基上被酰化。
在一个实施方案中，长效胰岛素在胰岛素分子B29位的赖氨酸残基的游离ε-氨基上被酰化。
酰基是亲脂性基团，且通常为具有约6个至约32个碳原子、包含至少一个游离羧酸基团的脂肪酸部分或在中性pH下带负电荷的基团。脂肪酸部分更通常具有6-24、8-20、12-20、12-16、10-16、10-20、14-18或14-16个碳原子。
在一个实施方案中，药用组合物包含至少一种游离羧酸或在中性pH下带负电荷的基团。在另一个实施方案中，药用组合物包含衍生自具有4-32个碳原子的二元脂肪酸的酰基。
在另一个实施方案中，脂肪酸部分衍生自具有约6至约32、6-24、8-20、12-20、12-16、10-16、10-20、14-18或14-16个碳原子的二元脂肪酸。
在一个实施方案中，药用组合物包含通过酰胺键由连接基连接至胰岛素的酰基。
酰基可以直接连接至所述游离氨基。然而，酰基也可以通过酰胺键由将胰岛素分子的游离氨基和所述酰基连接在一起的连接物连接。
长效酰化胰岛素与人胰岛素相比，通常具有至少1个或2个额外的负净电荷，且更通常其具有2个额外的负电荷。额外的负电荷可以由脂肪酸的游离羧酸基团或连接基提供，该连接基可包含1个或多个氨基酸残基，其中至少一个含有游离羧酸或在中性pH下带负电荷的基团。在另一方面，该酰基衍生自二元脂肪酸。
在一个实施方案中，药用组合物包含长效胰岛素，其中该胰岛素具有侧链和可能的1个或多个连接基，所述侧链通过酰胺键连接到B链的N端氨基酸残基的α-氨基上，或者连接到母体胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基上，该侧链包含至少一个游离羧酸基团或者在中性pH下带有负电荷的基团，脂肪酸部分在碳链中具有约4个至约32个碳原子；所述连接基通过酰胺键将侧链各个部分连接在一起。
在一个实施方案中，该长效胰岛素分子及其任何Zn2+复合物具有连接到母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基上的侧链，该侧链具有通式：
–W–X–Y–Z2
其中W为：
• 在侧链上具有羧酸基团的α-氨基酸残基，该残基用其一个羧酸基团与母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基一起形成酰胺基团；
• 由2个、3个或4个α-氨基酸残基通过酰胺羰基键连接在一起所组成的链，其中链通过酰胺键连接到母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基上，W的氨基酸残基选自具有中性侧链的氨基酸残基和在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基，使得W具有至少一个在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基；或者
• 自X至母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基上的共价键；
X是：
• –CO–、
• –CH(COOH)CO–、
• ―CO–N(CH2COOH)CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO–、
• ―CO–NHCH(COOH)(CH2)4NHCO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2 CO–、或
• ―CO–N(CH2COOH)CH2CH2 CO–，
其中
a) 当W是氨基酸残基或氨基酸残基链时，通过下划线碳上的键与W的氨基形成酰胺键，或者
b) 当W是共价键时，通过下划线羰基碳上的键与母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键；
Y是：
• –(CH2)m–，其中m是6-32范围内的整数；
• 二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中10-32个碳原子总数；且
Z2是:
• –COOH、
• –CO–Asp、
• –CO–Glu、
• –CO–Gly、
• –CO–Sar、
• –CH(COOH)2、
• –N(CH2COOH)2、
• –SO3H、或
• –PO3H，
前提是W是共价键且X是–CO–时，则Z不同于–COOH。
在本发明的一个实施方案中，B30氨基酸残基缺失，该酰化胰岛素是desB30胰岛素。
在本发明的一个实施方案中，W是具有4-10个碳原子的α-氨基酸残基，而在另一方面，W选自α-Asp、β-Asp、α-Glu、γ-Glu、α-hGlu和δ-hGlu。
在本发明的一个实施方案中，X是–CO–。
在本发明的一个实施方案中，Z2是–COOH。
侧链–W-X-Y-Z2的亚结构Y可以是式–(CH2)m–的基团，其中m是6-32、8-20、12-20或12-16范围内的整数。
在本发明的一个实施方案中，Y是二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中6-32、10-32、12-20或12-16个碳原子总数。
在本发明的一个实施方案中，Y是式–(CH2)vC6H4(CH2)W–的二价烃链，其中v和w是整数或其中之一为0，使得v和w之和在6-30、10-20或12-16的范围内。
另一方面，W选自α-Asp、β-Asp、α-Glu和γ-Glu；X为-CO-或-CH(COOH)CO；Y为–(CH2)m–，其中m是12-18范围内的整数，而Z2是–COOH或–CH(COOH)2。
酰化胰岛素化合物的非限制性实例为：
Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)desB30人胰岛素；Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、(Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、和Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]desB30人胰岛素。
在本发明的一个实施方案中，侧链可包含至少一个芳基或至少一个双官能PEG基团。下文中，聚乙二醇使用缩写词“PEG”。
在本发明的一个实施方案中，用于药用组合物的酰化胰岛素及其任何Zn2+复合物具有式：
Figure 432114DEST_PATH_IMAGE001
其中，Ins是母体胰岛素部分，其通过B链N端氨基酸残基的α-氨基或胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基通过酰胺键与侧链上的CO-基团结合；
X4是：
• –(CH2)n ，其中n为1、2、3、4、5或6；
• NR，其中R是氢或–(CH2)p–COOH、–(CH2)p–SO3H、–(CH2)p–PO3H2、-(CH2)p-O-SO3H2、-(CH2)p-O-PO3H2、被1个或2个-(CH2)p-O-COOH 基团取代的亚芳基、–(CH2)p–四唑基，其中p是1-6范围内的整数；
• -(CR1R2)q-NR-CO-，其中R1和R2彼此独立且独立于q的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q为1-6，且R如上定义；
• -((CR3R4)q1-NR-CO)2-4-，其中R3和R4彼此独立且独立于q1的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q1为1-6，且R如上定义；或
• 化学键
W1是亚芳基或亚杂芳基，其可被1个或2个选自-COOH、-SO3H、-PO3H2和四唑基的基团取代，或者W1是化学键；
m为0、1、2、3、4、5或6；
X5是
• –O–；
• 或
Figure 117491DEST_PATH_IMAGE003
其中R如上定义；或
• 化学键；
Y1是
• -(CR1R2)q-NR-CO-，其中R1和R2彼此独立且独立于q的各个取值，可以是H、-COOH、化学键或OH，q为1-6，且R如上定义；
• NR，其中R如上定义；
• -((CR3R4)q1-NR-CO)2-4-，其中R3和R4彼此独立且独立于q1的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q1为1-6，且R如上定义；或
• 化学键；
Q7是：
• –(CH2)r–， 其中r是4-22范围内的整数；
• 二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中4-22个碳原子总数；或
• 式–(CH2)s–Q8-(C6H4)v1–Q9-(CH2)W–Q10-(C6H4)v2–Q11-(CH2)t–Q12-(C6H4)v3–Q13-(CH2)z的二价烃链，
其中Q8-Q13彼此独立，可以是O、S或化学键；其中s、w、t和z彼此独立，为0或1-10之间的整数，使得s、w、t和z之和在4-22范围内，而v1、v2和v3彼此独立，可以是0或1，前提是W1为化学键时，则Q7不为式–(CH2)v4C6H4(CH2)W1–的二价烃链，其中v4和w1是整数，或其中之一为0，使得v4和w1之和在6-22的范围内；且
Z1是：
–COOH、
–CO–Asp、
–CO–Glu、
–CO–Gly、
–CO–Sar、
–CH(COOH)2、
–N(CH2COOH)2、
–SO3H、
–PO3H2、
–O-SO3H、
–O-PO3H2、
–四唑基、或
–O-W2，
其中W2是被一个或两个选自-COOH、-SO3H、和-PO3H2和四唑基的基团取代的亚芳基或亚杂芳基；
前提是如果W1是化学键，v1、v2和v3都为0且Q1-6都是化学键，则Z1是O-W2。
在本发明的一个实施方案中，W1是亚苯基。在本发明的另一个实施方案中，W1是含有氮、氧或硫的5-7元杂环环系。在本发明的另一个实施方案中，W1是含有至少1个氧的5元杂环环系。
在本发明的一个实施方案中，Q7是–(CH2)r–，其中r是4-22、8-20、12-20或14-18范围内的整数。在本发明的一个实施方案中，Q8、Q9、Q12和Q13都是化学键，v2为1且v1和v3为0。在本发明的一个实施方案中，Q10和Q11为氧。
在本发明的一个实施方案中，X4和Y1是化学键，而X5是
其中R是–(CH2)p–COOH，其中p为1-4。
在本发明的一个实施方案中，Z1是–COOH。
在本发明的一个实施方案中，药用组合物的酰化胰岛素选自下列：
0100-0000-0496 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0515 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)13CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0522 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)15CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0488 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0544 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-C6H4CO]desB30人胰岛素、和0100-0000-029 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-CH2-(亚呋喃基)CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0552 Nε B29-{4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)-癸酰氨基]-丁酰基}desB30人胰岛素。
在本发明的一个实施方案中，药用组合物中存在的酰化胰岛素及其任何Zn2+复合物具有式：
Figure 564838DEST_PATH_IMAGE005
其中Ins为母体胰岛素部分，其通过B链N端氨基酸残基的α-氨基或胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基通过酰胺键与侧链上的CO-基团结合；
每个n独立地为0、1、2、3、4、5或6；
Q1、Q2、Q3和Q4彼此独立，可以是：
• (CH2CH2O)s–、(CH2CH2CH2O)s–、(CH2CH2CH2CH2O)s–、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s–或(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s–，其中s为1-20；
• –(CH2)r–，其中r为4-22的整数；或二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中4-22个碳原子总数；
• –(CH2)t–或–(CH2OCH2)t–，其中t为1-6的整数；
• -(CR1R2)q-，其中R1和R2彼此独立，可以是H、-COOH、(CH2)1-6COOH，并且每个碳上的R1和R2可以不同，且q为1-6，
• -((CR3R4)q1)1-(NHCO-(CR3R4)q1-NHCO)1-2-((CR3R4)q1)1或-((CR3R4)q1)1-(CONH-(CR3R4)q1-CONH)1-2-((CR3R4)q1-)-、-((CR3R4)q1)1-(NHCO-(CR3R4)q1-CONH)1-2-((CR3R4)q1)1或-((CR3R4)q1)1-(CONH-(CR3R4)q1-NHCO)1-2-((CR3R4)q1)1，其中R3和R4彼此独立，可以为H、-COOH，并且每个碳上的R3和R4可以不同，且q1为1-6，或
• 化学键；
前提是Q1-Q4不相同；
X1、X2和X3独立地为：
• O；
• 化学键；或
•
Figure 299576DEST_PATH_IMAGE006
或
Figure 908412DEST_PATH_IMAGE007
其中R为氢或–(CH2)p–COOH、–(CH2)p–SO3H、–(CH2)p–PO3H2、-(CH2)p-O-SO3H、-(CH2)p-O-PO3H2或–(CH2)p–四唑-5-基，其中每个p独立于其它p，为1-6范围内的整数；且
Z是：
–COOH、
–CO–Asp、
–CO–Glu、
–CO–Gly、
–CO–Sar、
–CH(COOH)2、
–N(CH2COOH)2、
–SO3H、
–OSO3H、
–OPO3H2、
–PO3H2、或
–四唑-5-基。
在本发明的一个实施方案中，s在2-12、2-4或2-3的范围内。在本发明的一个实施方案中，s优选为1。
在本发明的一个实施方案中，Z是–COOH。
在本发明的一个实施方案中，药用组合物的酰化胰岛素选自Nε B29-(3-[2-{2-(2-[ω-羧基十五烷酰基-γ-谷氨酰基-(2-氨基乙氧基)]乙氧基)乙氧基}乙氧基]丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-{2-(2-[ω-羧基十七烷酰基-γ-谷氨酰基-(2-氨基乙氧基)]乙氧基)乙氧基}乙氧基]丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29–{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-十七烷酰基-α-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-十七烷酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十七烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[7-羧基庚酰胺基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(7-羧基庚酰胺基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[9-羧基壬酰胺基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(9-羧基壬酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(9-羧基壬酰胺基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(2-[3-(2-(2-{2-(7-羧基庚酰胺基)乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基))desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[ω-羧基十五烷酰氨基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(ω-羧基十一烷酰氨基)丙氧基]丁氧基丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(ω-羧基十三烷酰氨基)丙氧基]丁氧基丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十一烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-D-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(7-羧基庚烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(9-羧基壬酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十一烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素。
本发明的酰化胰岛素可以如WO 2007/074133中所述制备。
母体胰岛素分子是人胰岛素或其类似物。人胰岛素的非限制性类似物是desB30类似物、其中B30位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是除Cys、Met、Arg和Lys以外的任何可编码的氨基酸的胰岛素类似物、其中A21位的氨基酸残基是Asn的胰岛素类似物、和其中B3位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Glu的胰岛素类似物。
在另一组母体胰岛素类似物中，B28位的氨基酸残基是Asp。该组母体胰岛素类似物的具体实例是EP 214826中公开的AspB28人胰岛素。
在另一组母体胰岛素类似物中，B28位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Pro。该组母体胰岛素类似物的具体实例是LysB28ProB29人胰岛素。
在另一组母体胰岛素类似物中，B30位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是除Cys、Met、Arg和Lys以外的任何可编码的氨基酸。一个实例是其中B29位的氨基酸残基是Thr且B30位的氨基酸残基是Lys的胰岛素类似物。该组母体胰岛素类似物的具体实例是ThrB29LysB30人胰岛素。
在另一组母体胰岛素类似物中，B3位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Glu。该组母体胰岛素类似物的具体实例是LysB3GluB29人胰岛素。胰岛素类似物的实例是其中B链28位的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala突变，和/或B29位的Lys被Pro、Glu或Asp突变的那些。此外，B3位的Asn可被Thr、Lys、Gln、Glu或Asp突变。A21位的氨基酸残基可被Gly突变。B1位的氨基酸可被Glu突变。B16位的氨基酸可被Glu或His突变。胰岛素类似物的另外的实例是缺失类似物，如其中人胰岛素的B30氨基酸缺失的类似物（des(B30)人胰岛素）、人胰岛素中B1氨基酸缺失的胰岛素类似物（des(B1)人胰岛素）、des(B28-B30)人胰岛素和des(B27)人胰岛素。其中A链和/或B链具有N端延长的胰岛素类似物，和其中A链和/或B链具有C端延长（如在B链C端添加2个精氨酸残基）的胰岛素类似物，也是胰岛素类似物的实例。另外的实例是包含上述突变的组合的胰岛素类似物。其中A14位的氨基酸是Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His，B25位的氨基酸是His，且其任选进一步包含一个或多个额外的突变的氨基酸类似物是胰岛素类似物的另外的实例。其中A21位的氨基酸残基是Gly且其中氨基酸类似物在C端由2个精氨酸残基进一步延长的人胰岛素的胰岛素类似物也是胰岛素类似物的实例。
胰岛素类似物的更多的实例包括但不限于：DesB30人胰岛素、AspB28人胰岛素、AspB28,desB30人胰岛素、LysB3,GluB29人胰岛素、LysB28,ProB29人胰岛素、GluA14,HisB25人胰岛素、HisA14,HisB25人胰岛素、GluA14,HisB25,desB30人胰岛素、HisA14,HisB25,desB30人胰岛素、GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰岛素、GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素、GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素、HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素、HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素、HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素和HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰岛素。
根据本发明的药用组合物包含治疗有效量的酰化胰岛素和药学上可接受的载体，用于治疗需要这种治疗的患者的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其它病症。
在本发明的另一方面，提供用于治疗需要这种治疗的患者的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其它病症的药用组合物，该药用组合物包含治疗有效量的如上定义的酰化胰岛素衍生物和胰岛素或速效胰岛素类似物的混合物，以及药学上可接受的载体和添加剂。
因此，药用组合物可包含两种胰岛素组分的混合物：一种是延缓胰岛素作用的基础胰岛素，而另一种是快速起效的推注用胰岛素。该混合物的实例是门冬胰岛素，AspB28人胰岛素和对应于WO 2005/012347中公开的LysB29Nε-十六烷二酰基-γ-Glu desB30人胰岛素的Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素的混合物。该混合物的另一个实例是赖脯胰岛素，LysB28ProB29人胰岛素和LysB29Nε-十六烷二酰基-γ-Glu desB30人胰岛素的混合物。该混合物的第三个实例是赖谷胰岛素，LysB3GluB29人胰岛素和LysB29Nε-十六烷二酰基-γ-Glu desB30人胰岛素的混合物。
在本发明的一个实施方案中，至少85%的速效胰岛素以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
在本发明的一个实施方案中，至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99,5%的速效胰岛素以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
酰化胰岛素衍生物和速效胰岛素类似物可按约90%/10%、约75%/25%、约70%/30%、约50%/50%、约25%/75%、约30%/70%或约10%/90%的摩尔比混合。
在一个实施方案中，根据本发明的药用组合物的pH介于约6.5至约8.5之间。另一方面，pH为约7.0至约8.2，pH为约7.2至约8.0或约7.4至约8.0，或pH为约7.4至约7.8。
本发明还包括包含酰化胰岛素的药用组合物的制备方法，其中将多于约4个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的另一方面，将多于约4.3个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或将多于约4.5个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或将多于约5个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。在另一方面，将多于约5.5个锌原、或多于约6.5个锌原子、或多于约7.0个锌原子或多于约7.5个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括将多达约12个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括将约4.3个至约12个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的又一方面，将约4.5个至约12个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或将约5个至约11.4个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或将约5.5个至约10个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的一个实施方案中，酰化胰岛素选自Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu) desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、(Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、和Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]desB30人胰岛素。
术语“烟碱化合物”包括烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺和维生素B3和/或其盐和/或其任何组合。
根据本发明，烟碱化合物和/或其盐的浓度为约1 mM至约300 mM或约5 mM至约200 mM。
术语“精氨酸”或“Arg”包括氨基酸精氨酸和/或其盐。
在一个实施方案中，胰岛素制剂包含1-100 mM的精氨酸。
在一个实施方案中，胰岛素制剂包含1-20 mM的精氨酸。
在一个实施方案中，胰岛素制剂包含20-90 mM的精氨酸。
在一个实施方案中，胰岛素制剂包含30-85 mM的精氨酸。
本文所用术语“药用制剂”或“胰岛素制剂”指包含速效胰岛素化合物、长效胰岛素化合物、烟碱化合物和氨基酸，任选诸如防腐剂、螯合剂、等渗调节剂、填充剂、稳定剂、抗氧化剂、聚合物和表面活性剂的其它赋形剂、金属离子、油性溶媒和蛋白质（如人血清白蛋白、明胶或蛋白质）的产物，通过给予人所述胰岛素制剂，所述胰岛素制剂用于治疗、预防或降低疾病或障碍的严重度。因此，胰岛素制剂在本领域也被称为药用制剂、药用组合物或组合物。
缓冲剂可选自但不限于醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体的缓冲剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。
本发明的胰岛素制剂可进一步包含对于胰岛素制剂常见的其它成分，如锌络合剂诸如柠檬酸盐，和磷酸盐缓冲剂。
甘油和/或甘露醇和/或氯化钠可以以对应于0-250 mM、0-200 mM或0-100 mM浓度的量存在。
稳定剂、表面活性剂和防腐剂也可以在本发明的胰岛素制剂中存在。
本发明的胰岛素制剂可进一步包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂可以以足以获得防腐效果的量存在。胰岛素制剂中防腐剂的量可以从例如本领域的文献和/或如市售产品中已知的防腐剂的量确定。这些具体的防腐剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。例如在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995中描述了防腐剂在药用制剂中的用途。
在本发明的胰岛素制剂中存在的防腐剂可以与迄今为止的常规胰岛素制剂中的一样，例如苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯。
本发明的胰岛素制剂可进一步包含螯合剂。螯合剂在药用组合物中的用途为技术人员公知。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
本发明的胰岛素制剂可进一步包含稳定剂。本文所用术语“稳定剂”是指加入到含多肽的药用制剂中以使肽稳定，即提高该制剂的保质期和/或使用时间的化学品。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
本发明的胰岛素制剂可进一步包含表面活性剂。本文所用术语“表面活性剂”是指由水溶性（亲水性）部分、头部和脂溶性（亲脂性）部分组成的任何分子或离子。表面活性剂优选在界面处累积，亲水性部分朝向水（亲水相）而亲脂性部分朝向油相或疏水相（即玻璃、空气、油等）。表面活性剂开始形成胶束的浓度被称为临界胶束浓度或CMC。此外，表面活性剂降低了液体的表面张力。表面活性剂也被称为两亲性化合物。术语“洗涤剂”一般被用作表面活性剂的同义词。表面活性剂在药用制剂中的用途对技术人员是公知的。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明胰岛素化合物的水溶液和缓冲剂的胰岛素制剂，其中所述胰岛素化合物以0.1 mM或以上的浓度存在，且其中所述制剂在室温（约25℃）下具有约3.0至约8.5的pH。
本发明还涉及制备本发明的胰岛素制剂的方法。
在一个实施方案中，制备本发明的胰岛素制剂的方法包括：
a) 通过将胰岛素化合物分别溶于水或缓冲剂中或将胰岛素化合物的混合物溶于水或缓冲剂中制备溶液；
b) 通过将二价金属离子溶于水或缓冲剂中制备溶液；
c) 通过将1种、2种或多种防腐剂溶于水或缓冲剂中，或将防腐剂分别溶于水或缓冲剂中制备溶液；
d) 通过将等渗剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；
e) 通过将缓冲剂溶于水中制备溶液；
f) 通过将表面活性剂和/或稳定剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；
g) 通过将烟酰胺溶于水或缓冲剂中制备溶液；
h) 混合溶液a)和溶液b)、c)、d)、e)、f)和g)中的一种或多种；
最后将h)中混合物的pH调节到期望的pH，然后无菌过滤。
在一个实施方案中，制备本发明的胰岛素制剂的方法包括：
a) 通过将胰岛素化合物单独溶于水或缓冲剂中或将胰岛素化合物的混合物溶于水或缓冲剂中制备溶液；
b) 通过将二价金属离子溶于水或缓冲剂中制备溶液；
c) 通过将1种、2种或多种防腐剂溶于水或缓冲剂中，或将防腐剂分别溶于水或缓冲剂中制备溶液；
d) 通过将等渗剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；
e) 通过将缓冲剂溶于水中制备溶液；
f) 通过将表面活性剂和/或稳定剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；
g) 通过将吸收速率促进剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；
h) 混合溶液a)和溶液b)、c)、d)、e)、f)和g)中的一种或多种；
最后将h)中混合物的pH调节到期望的pH，然后无菌过滤。
在一个实施方案中，制备本发明的胰岛素制剂的方法包括以下顺序步骤：
a) 以长效胰岛素化合物制备溶液，在加入锌之前，向a)中加入1种、2种或多种酚类防腐剂，最后加入等渗剂、缓冲剂、稳定剂和烟酰胺；
c) 在约pH7.4或以上加入锌；
d) 如果加入锌发生在pH 7.4，等待1小时至过夜，或者如果加入锌时pH为约7.8，降至几分钟；
e) 加入速效胰岛素化合物；和
f) 加入烟酰胺。
在一个实施方案中，制备本发明的胰岛素制剂的方法包括以下顺序步骤：
a) 以德谷胰岛素制备溶液；
b) 在加入锌之前，向a)中加入苯酚和间甲酚；
c) 在pH 7.4或以上加入锌；
d) 验证所有德谷胰岛素是二六聚体的形式；
d) 如果加入锌发生在pH 7.4，等待1小时至过夜，或者如果pH为约7.8，降至几分钟；
e) 加入门冬胰岛素；和
f) 加入烟酰胺。
在一个实施方案中，制备本发明的胰岛素制剂的方法包括以下顺序步骤：
a) 以地特胰岛素配制溶液；
b) 通过将醋酸锌或氯化锌溶于水或缓冲剂制备溶液；
c) 通过将防腐剂溶于水或缓冲剂制备溶液；
d) 通过将等渗剂溶于水或缓冲剂制备溶液；
e) 通过将表面活性剂和/或稳定剂溶于水或缓冲剂制备溶液；
f) 混合溶液a)和溶液b)、c)、d)和e)中的一种或多种；
g) 制备门冬胰岛素溶液；
h) 混合g)和b)至大约3 Zn/6ins，加入防腐剂溶液，并调节pH至7.4；
h) 混合含有锌和防腐剂的地特胰岛素溶液和含有锌和防腐剂的门冬胰岛素溶液；
i) 加入烟酰胺；
最后将i)中混合物的pH调节到期望的pH，然后无菌过滤。
本文所用术语“吸收速率促进剂”指提高从皮下组织到血液中的吸收速率的物质。吸收速率促进剂的实例是烟酰胺、透明质酸酶、EDTA（依地酸盐）和柠檬酸盐。
本发明的胰岛素制剂可用于通过肠胃外给药治疗糖尿病。建议给予患者的本发明的胰岛素制剂的剂量应由医生选择。
肠胃外给药可以用注射器，任选笔式注射器，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。或者，肠胃外给药可通过输液泵进行。作为另一种选择，含有本发明胰岛素化合物的胰岛素制剂也可适应于透皮给药，如通过无针注射或由贴剂（任选离子电渗贴剂）给药，或经粘膜如口腔给药。
可以将根据本发明的胰岛素制剂在几个部位给予需要这种治疗的患者，例如在局部部位，如皮肤和粘膜部位，在绕开吸收的部位，如动脉内、静脉内、心脏内给药，和在涉及吸收的部位，如皮肤内、皮肤下、肌肉内或腹腔内给药。
本发明的胰岛素制剂可以与OAD(s)或GLP-1同时或序贯给药。要素可以以单一剂型提供，其中单一剂型包含两种化合物，或者以套装药盒（kit of parts）的形式，其包含药用组合物的制剂，该制剂包含含有酰化胰岛素的药用组合物和含有OAD作为第二单位剂型的药用组合物。无论何时本说明书中提及第一单位剂量或第二单位剂量或第三单位剂量等，都不表示优选的给药顺序，而仅仅是为方便起见。
含有酰化胰岛素的药用组合物的制剂和OAD(s)或GLP-1制剂“同时”给药是指以单一剂型给予化合物，或者给予第一药剂后给予第二药剂，时间间隔不超过15分钟、10分钟、5分钟或2分钟。可以先给予任一要素。
“序贯”给药是指给予第一药剂后给予第二药剂，时间间隔超过15分钟。可以先给予两种单位剂型的任一种。优选地，两种产品通过同一静脉通路注射。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素制剂与OAD(s)或GLP-1每日1次同时或序贯给药。在本发明的另一个实施方案中，给予胰岛素制剂可多达每日5次。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素制剂是水性制剂，即含有水的制剂。这种制剂通常是溶液或混悬液。在本发明的另一个实施方案中，胰岛素制剂是水溶液。
术语“水性制剂”定义为含有至少50%w/w水的制剂。同样地，术语“水溶液”定义为含有至少50%w/w水的溶液，而术语“水性混悬液”定义为含有至少50%w/w水的混悬液。
水性混悬液可含有与适合制备水性混悬液的赋形剂混合的活性化合物。
在一个实施方案中，本发明的胰岛素制剂非常适用于用于胰岛素注射疗法的笔式装置。
本文所用术语胰岛素制剂的“物理稳定性”是指由于蛋白质暴露于热-机械应力和/或与失稳的界面和表面（如疏水表面和界面）相互作用，蛋白质形成无生物活性和/或不溶性蛋白质聚集体的倾向。水性蛋白质制剂的物理稳定性通过在不同温度下将填充在合适容器（如药筒或小瓶）中的制剂暴露于机械/物理应力（如搅拌）不同时间段后，通过目测和/或浊度测量来评价。制剂的目测用黑色背景在强聚焦光下进行。通过例如以0-3的标度对浊度程度视觉评分来表征制剂的浊度（不出现浑浊的制剂对应于视觉评分0，而在日光下出现可见浑浊的制剂对应于视觉评分3）。当制剂在日光下出现可见浑浊时，将其分类为对于蛋白质聚集物理不稳定。或者，可以通过技术人员公知的简单浊度测量评价制剂的浊度。通过使用蛋白质构象状态的分光试剂或探针也能评价水性蛋白质制剂的物理稳定性。探针优选是与蛋白质的非天然构象异构体优先结合的小分子。蛋白质结构的小分子分光探针的一个实例是硫黄素T（Thioflavin T）。硫黄素T是已被广泛用于淀粉样原纤维检测的荧光染料。在原纤维和可能其它蛋白质构型的存在下，硫黄素T与原纤维蛋白形式结合时，在约450 nm产生新的激发最大值并在约482 nm产生增强的发射。未结合的硫黄素T在该波长基本上无荧光。
本文所用术语蛋白质制剂的“化学稳定性”是指共价蛋白质结构的改变，其导致形成与天然蛋白质结构相比具有潜在的更小的生物学效价和/或潜在的增加的免疫原性的化学降解产物。根据天然蛋白质的类型和性质及蛋白质暴露的环境，可形成各种化学降解产物。在蛋白质制剂的储存和使用过程中，经常看到化学降解产物的量增加。大多数蛋白质容易脱酰胺，即其中谷氨酰胺酰基（glutaminyl）或天冬酰胺酰基（asparaginyl）残基中的侧链酰胺基水解形成游离羧酸，或天冬酰胺酰基残基水解形成IsoAsp衍生物的过程。其它降解途径包括形成高分子量产物，其中2个或多个蛋白质分子相互之间通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用共价结合，导致形成共价结合的二聚体、低聚物和聚合物降解产物（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992）。作为化学降解的另一种变形可提及氧化（例如蛋氨酸残基的氧化）。通过在暴露于不同环境条件（经常通过例如提高温度加速降解产物的形成）后，在不同时间点测定化学降解产物的量可以评价蛋白质制剂的化学稳定性。经常通过根据分子尺寸和/或电荷用各种色谱技术（如SEC-HPLC和/或RP-HPLC）分离降解产物来测定每个单独的降解产物的量。由于HMWP产物是潜在免疫原性和无生物活性的，因此低HMWP水平是有利的。
术语“稳定的制剂”是指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的制剂。一般来说，制剂在使用和储存（按照推荐的使用和储存条件）过程中必须稳定直至达到有效期。
术语“糖尿病（diabetes）”或“糖尿病（diabetes mellitus）”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病（怀孕过程中）和其它引起高血糖症的病况。该术语用于代谢障碍，其中胰腺产生不足量的胰岛素，或其中机体细胞对胰岛素不能适当应答由此妨碍细胞吸收葡萄糖。因此，葡萄糖在血液中累积。
1型糖尿病，也称为胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）和青少年发作型糖尿病，由B-细胞破坏引起，通常导致绝对的胰岛素缺乏。
2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖性糖尿病（NIDDM）和成人发作型糖尿病，与胰岛素抵抗为主伴有相对胰岛素缺乏和/或胰岛素分泌不足为主伴有胰岛素抵抗有关。
本文所用术语“药学上可接受的”是指适合于正常药学应用，即不在患者中产生任何严重的不良事件。
本文所用术语“治疗疾病”是指管理和护理已发生疾病、病况或障碍的患者，包括治疗、预防或缓解疾病。治疗的目的是对抗疾病、病况或障碍。治疗包括给予活性化合物以消除或控制疾病、病况或障碍以及缓解与疾病、病况或障碍相关的症状或并发症，和预防疾病、病况或障碍。
在最广泛的意义上，本文所用术语“危重患者”是指由于疾病或损伤已遭受或可能遭受急性危及生命的单或多器官系统衰竭的患者、正在手术且随后发生并发症的患者和在过去一周内重要器官动过手术或在过去一周内经历过大手术的患者。在更严格的意义上，本文所用术语“危重患者”是指由于疾病或损伤已遭受或可能遭受急性危及生命的单或多器官系统衰竭的患者或正在手术且随后发生并发症的患者。在还更严格的意义上，本文所用术语“危重患者”是指由于疾病或损伤已遭受或可能遭受急性危及生命的单或多器官系统衰竭的患者。同样地，这些定义适用于例如“患者危重症”和“患者病危”的类似表述。危重患者的实例是需要心脏手术、脑部手术、胸部手术、腹部手术、血管手术或移植的患者，或患有神经系统疾病、脑外伤、呼吸功能不全、腹腔腹膜炎、多发性创伤或严重烧伤、或重大疾病多发性神经病的患者。
本文所用术语“合成代谢”是指从较小单元构成分子的一组代谢途径。这些反应需要能量。不管在细胞、器官或个体水平，一种方式将代谢过程归类为“合成代谢”或相反的“分解代谢”。合成代谢由分解代谢提供能量，其中大分子被分解为较小的部分，然后在呼吸中消耗。许多合成代谢过程由三磷酸腺苷（ATP）提供能量。合成代谢过程倾向于“构建”器官和组织。这些过程引起细胞生长和分化及体型增大，即涉及复杂分子合成的过程。合成代谢过程的实例包括骨的生长和矿化及肌肉质量的增加。内分泌学家传统上将激素分类为合成代谢的和分解代谢的，取决于它们刺激代谢的哪个部分。合成代谢和分解代谢的平衡也由昼夜节律调节，通过过程如葡萄糖代谢的波动来匹配动物整天的正常活动周期。这些激素的“合成代谢作用”的一些实例是增加氨基酸到蛋白质的合成，提高食欲，促进骨重建和生长，和刺激骨髓增加红血球的产生。合成代谢激素通过许多机制刺激肌肉细胞的形成，因此引起骨骼肌尺寸的增大，导致强度增加。
在另一个实施方案中，根据本发明的胰岛素类似物作为药物用于延迟或预防2型糖尿病的疾病进展。
在本发明的一个实施方案中，提供根据本发明的胰岛素制剂作为药物用于治疗或预防高血糖症，包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病和烧伤、手术创伤及其它在治疗中需要合成代谢作用的疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病及其它心血管疾病。
在本发明的另一个实施方案中，提供治疗或预防高血糖症的方法，所述高血糖症包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病和烧伤、手术创伤及其它在治疗中需要合成代谢作用的疾病或损伤、心肌梗死、冠心病和其它心血管疾病、中风，该方法包括给予需要这种治疗的患者该治疗有效量的根据本发明的胰岛素制剂。
采用根据本发明的胰岛素制剂的治疗还可与第二种或更多种药理活性物质结合，所述药理活性物质例如选自抗糖尿病药、减肥药、食欲调节剂、抗高血压药、治疗和/或预防糖尿病导致或相关的并发症的药剂和治疗和/或预防肥胖症导致或相关的并发症和障碍的药剂。
采用根据本发明的胰岛素制剂的治疗还可与减肥手术结合，即影响葡萄糖水平和/或脂质稳态的手术，如胃囊带术或胃旁路术。
多肽如胰岛素的制备在本领域公知。根据本发明的胰岛素化合物例如可以通过经典肽合成，如使用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成，或其它完善的技术制备，参见例如Greene和Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999。胰岛素化合物还可以通过以下方法制备，该方法包括在允许胰岛素化合物表达的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码类似物的DNA序列和能够表达该胰岛素化合物的宿主细胞。对于包含非天然氨基酸残基的胰岛素化合物，应当修饰重组细胞以便将非天然氨基酸并入化合物中，如通过使用tRNA突变体。因此，简言之，与已知胰岛素化合物的制备类似地制备根据本发明的胰岛素化合物。
几种方法可用于制备胰岛素化合物。例如WO2008034881中公开了用于在微生物中制备胰岛素的三种主要方法。其中两种涉及大肠杆菌，通过在细胞质中表达大型融合蛋白（Frank et al. (1981) in Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. pp 729-739)，或者使用信号肽以实现分泌到壁膜间隙（Chan et al. (1981) PNAS 78:5401-5404）。第三种方法利用酿酒酵母分泌胰岛素前体进入培养基内(Thim et al. (1986) PNAS 83:6766-6770)。现有技术公开了大量在大肠杆菌或酿酒酵母中表达的胰岛素前体，参见U.S5,962,267、WO 95/16708、EP 0055945、EP 0163529、EP 0347845和EP0741188。
胰岛素化合物按照如US 6500645中公开的公知技术通过在合适的宿主细胞中表达编码所述胰岛素化合物的DNA序列来制备。胰岛素化合物直接表达或作为前体分子表达，前体分子在B链上具有N端延长或在B链上具有C端延长。N端延长可具有提高直接表达产物的收率的功能，且可长至15个氨基酸残基。N端延长在从培养肉汤中分离后体外裂解，因此具有紧邻B1的分裂位点。US 5,395,922和EP 765,395中公开了适合本发明的类型的N端延长。C端延长可具有保护成熟胰岛素或胰岛素类似物分子免受宿主细胞外蛋白酶的细胞内蛋白酶解加工的功能。C端延长在培养肉汤中被分泌的活性羧肽酶细胞外裂解，或者在从培养肉汤中分离后体外裂解。WO 08037735公开了制备在B链上具有被羧肽酶脱除的C端延长的成熟胰岛素和胰岛素化合物的方法。该方法的目标胰岛素产物可以是双链人胰岛素或双链人胰岛素类似物，其可能有或可能没有B链上的短的C端延长。如果目标胰岛素产物没有B链上的C端延长，则所述C端延长应能随后在进一步纯化步骤前从B链裂解。
本发明还考虑实施方案的下列非限制性列举，其在本文其它地方被进一步描述：
1. 胰岛素制剂，其包含：
• 酰化胰岛素或其类似物，
• 人胰岛素或胰岛素类似物，
• 烟碱化合物，和
• 精氨酸。
2. 根据实施方案1的胰岛素制剂，其中该酰化胰岛素或其类似物是位于母体胰岛素分子B链中Lys残基的ε-氨基被酰化的胰岛素。
3. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中该酰化胰岛素或其类似物的酰基包含至少一个游离羧酸或在中性pH下带负电荷的基团。
4. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中该酰化胰岛素或其类似物的酰基衍生自具有4-32个碳原子的二元脂肪酸。
5. 根据实施方案1或5中任一项的胰岛素制剂，其中该酰化胰岛素或其类似物的酰基通过连接基由酰胺键连接到胰岛素分子上。
6. 根据实施方案1或6中任一项的胰岛素制剂，其中连接基包含至少一个游离羧基或在中性pH下带负电荷的基团。
7. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素分子具有侧链和可能的一个或多个连接基，所述侧链通过酰胺键连接到B链N端氨基酸残基的α-氨基上，或者连接到母体胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基上，所述侧链包含至少一个游离羧酸基团或在中性pH下带负电荷的基团，脂肪酸部分在碳链中具有约4个至约32个碳原子；所述连接基通过酰胺键将侧链各个组分连接在一起。
8. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中该侧链包含至少一个芳基。
9. 根据实施方案1-7中任一项的胰岛素制剂，其中该侧链包含至少一个双官能PEG基团。
10. 根据实施方案1-7中任一项的胰岛素制剂及其任意Zn2+复合物，其中胰岛素分子具有连接到母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε氨基上的侧链，该侧链具有通式：
–W–X–Y–Z2
其中W为：
• 在侧链上具有羧酸基团的α-氨基酸残基，该残基用其一个羧酸基团与母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基一起形成酰胺基团；
• 由2个、3个或4个α-氨基酸残基通过酰胺羰基键连接在一起所组成的链，其中链通过酰胺键连接到母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基上，W的氨基酸残基选自具有中性侧链的氨基酸残基和在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基，使得W具有至少一个在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基；或者
• 自X至母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基上的共价键；
X是：
• –CO–、
• –CH(COOH)CO–、
• ―CO–N(CH2COOH)CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO–、
• ―CO–NHCH(COOH)(CH2)4NHCO–、
• ―CO–N(CH2CH2COOH)CH2 CO–、或
• ―CO–N(CH2COOH)CH2CH2 CO–，
其中
a) 当W是氨基酸残基或氨基酸残基链时，通过下划线碳上的键与W上的氨基形成酰胺键，或者
b) 当W是共价键时，通过下划线羰基碳上的键与母体胰岛素B链中存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键；
Y是：
• –(CH2)m–，其中m是6-32范围内的整数；
• 二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中10-32个碳原子总数；且
Z2是:
• –COOH、
• –CO–Asp、
• –CO–Glu、
• –CO–Gly、
• –CO–Sar、
• –CH(COOH)2、
• –N(CH2COOH)2、
• –SO3H、或
• –PO3H，
前提是W是共价键且X是–CO–时，则Z不同于–COOH。
11. 根据实施方案1-7和10中任一项的胰岛素制剂，其中Z2是–COOH。
12. 根据实施方案1-7和10-11中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素选自Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)desB30人胰岛素；Nε B29–(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素、(Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)desB30人胰岛素、Nε B29–(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]desB30人胰岛素、和Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]desB30人胰岛素。
13. 根据实施方案1-8中任一项的胰岛素制剂及其任意Zn2+复合物，其中酰化胰岛素具有式
Figure 268855DEST_PATH_IMAGE008
其中，Ins是母体胰岛素部分，其通过B链N端氨基酸残基的α-氨基或胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基通过酰胺键与侧链上的CO-基团结合；
X4是：
• –(CH2)n ，其中n为1、2、3、4、5或6；
• NR，其中R 是氢或–(CH2)p–COOH、–(CH2)p–SO3H、–(CH2)p–PO3H2、-(CH2)p-O-SO3H2、-(CH2)p-O-PO3H2、被1个或2个-(CH2)p-O-COOH 基团取代的亚芳基、–(CH2)p–四唑基，其中p是1-6范围内的整数；
• -(CR1R2)q-NR-CO-，其中R1和R2彼此独立且独立于q的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q为1-6，且R如上定义；
• -((CR3R4)q1-NR-CO)2-4-，其中R3和R4彼此独立且独立于q1的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q1为1-6，且R如上定义；或
• 化学键；
W1是亚芳基或亚杂芳基，可被1个或2个选自-COOH、-SO3H、和-PO3H2和四唑基的基团取代，或者W1是化学键；
m为0、1、2、3、4、5或6；
X5是
• –O–；
•
Figure 279536DEST_PATH_IMAGE009
或
Figure 185176DEST_PATH_IMAGE010
其中R如上定义；或
• 化学键；
Y1是
• -(CR1R2)q-NR-CO-，其中R1和R2彼此独立且独立于q的各个取值，可以是H、-COOH、化学键或OH，q为1-6，且R如上定义；
• NR，其中R如上定义；
• -((CR3R4)q1-NR-CO)2-4-，其中R3和R4彼此独立且独立于q1的各个取值，可以是H、-COOH或OH，q1为1-6，且R如上定义；或
• 化学键；
Q7是：
• –(CH2)r– ，其中r是4-22范围内的整数；
• 二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中4-22个碳原子总数；或
• 式–(CH2)s–Q8-(C6H4)v1–Q9-(CH2)W–Q10-(C6H4)v2–Q11-(CH2)t–Q12-(C6H4)v3–Q13-(CH2)z的二价烃链，
其中Q8-Q13彼此独立，可以是O、S或化学键；其中s、w、t和z彼此独立，为0或1-10的整数，使得s、w、t和z之和在4-22范围内，而v1、v2和v3彼此独立，可以是0或1，前提是W1为化学键时，则Q7不为式–(CH2)v4C6H4(CH2)W1–的二价烃链，其中v4和w1是整数，或其中之一为0，使得v4和w1之和在6-22的范围内；且
Z1是：
–COOH、
–CO–Asp、
–CO–Glu、
–CO–Gly、
–CO–Sar、
–CH(COOH)2、
–N(CH2COOH)2、
–SO3H、
–PO3H2、
–O-SO3H、
–O-PO3H2、
–四唑基、或
–O-W2，
其中W2是被一个或两个选自-COOH、-SO3H、和-PO3H2和四唑基的基团取代的亚芳基或亚杂芳基；
前提是如果W1是化学键，v1、v2和v3都为0且Q1-6都是化学键，则Z1是O-W2。
14. 根据实施方案1或13中任一项的胰岛素制剂，其中W1是亚苯基。
15. 根据实施方案1或13中任一项的胰岛素制剂，其中W1是含有氮、氧或硫的5-7元杂环环系。
16. 根据实施方案1、13和15中任一项的胰岛素制剂，其中W1是含有至少一个氧的5元杂环环系。
17. 根据实施方案13-16中任一项的胰岛素制剂，其中Q7是–(CH2)r–，其中r是4-22、8-20、12-20或14-18范围内的整数。
18. 根据前述实施方案13-16中任一项的胰岛素制剂，其中Q8、Q9、Q12和Q13均为化学键，v2为1，且v1和v3为0。
19. 根据实施方案18的胰岛素制剂，其中Q10和Q11为氧。
20. 根据实施方案13-19中任一项的胰岛素制剂，其中X4和Y1是化学键，且X5是
Figure 281308DEST_PATH_IMAGE011
其中R是–(CH2)p–COOH，其中p为1-4。
21. 根据实施方案13-20中任一项的胰岛素制剂，其中Z1是–COOH。
22. 根据实施方案1-7和9中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物及其任何Zn2+复合物具有式
Figure 179862DEST_PATH_IMAGE012
其中Ins是母体胰岛素部分，其通过B链N端氨基酸残基的α-氨基或胰岛素部分B链中存在的Lys残基的ε-氨基通过酰胺键与侧链上的CO-基团结合；
每个n独立地为0、1、2、3、4、5或6。
Q1、Q2、Q3和Q4彼此独立，可以是：
• (CH2CH2O)s–、(CH2CH2CH2O)s–、(CH2CH2CH2CH2O)s–、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s–或(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s–，其中s为1-20；
• –(CH2)r–，其中r为4-22的整数；或二价烃链，包含1个、2个或3个–CH=CH–基团和多个-CH2-基团，所述多个-CH2-基团足以提供链中4-22个碳原子总数；
• –(CH2)t–或–(CH2OCH2)t–，其中t为1-6的整数；
• -(CR1R2)q-，其中R1和R2彼此独立，可以是H、-COOH、(CH2)1-6COOH，并且每个碳上的R1和R2可以不同，且q为1-6，
• -((CR3R4)q1)1-(NHCO-(CR3R4)q1-NHCO)1-2-((CR3R4)q1)1或-((CR3R4)q1)1-(CONH-(CR3R4)q1-CONH)1-2-((CR3R4)q1-)-、-((CR3R4)q1)1-(NHCO-(CR3R4)q1-CONH)1-2-((CR3R4)q1)1或-((CR3R4)q1)1-(CONH-(CR3R4)q1-NHCO)1-2-((CR3R4)q1)1，其中R3和R4彼此独立，可以为H、-COOH，并且每个碳上的R3和R4可以不同，且q1为1-6，或
• 化学键；
前提是Q1-Q4不相同；
X1、X2和X3独立地为：
• O；
• 化学键；或
• 或
Figure 121590DEST_PATH_IMAGE014
其中R为氢或–(CH2)p–COOH、–(CH2)p–SO3H、–(CH2)p–PO3H2、-(CH2)p-O-SO3H、-(CH2)p-O-PO3H2或–(CH2)p–四唑-5-基，其中每个p彼此独立地为1-6范围内的整数；且
Z是：
–COOH、
–CO–Asp、
–CO–Glu、
–CO–Gly、
–CO–Sar、
–CH(COOH)2、
–N(CH2COOH)2、
–SO3H、
–OSO3H、
–OPO3H2、
–PO3H2、或
–四唑-5-基。
23. 根据实施方案1或22中任一项的胰岛素制剂，其中s在2-12、2-4或2-3的范围内。
24. 根据实施方案1或22中任一项的胰岛素制剂，其中s优选为1。
25. 根据实施方案22-24中任一项的胰岛素制剂，其中Z是–COOH。
26. 根据任一项实施方案的胰岛素制剂，其中母体胰岛素是desB30人胰岛素类似物。
27. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中母体胰岛素选自人胰岛素、desB1人胰岛素、desB30人胰岛素、GlyA21人胰岛素、GlyA21 desB30人胰岛素、AspB28人胰岛素、猪胰岛素、LysB28 ProB29人胰岛素和LysB3 GluB29人胰岛素或AspB28 desB30人胰岛素。
28. 根据前述实施方案1-8、13-21和26-27中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物选自0100-0000-0496 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0515 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)13CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0522 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)15CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0488 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-CH2-C6H4CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0544 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-C6H4CO]desB30人胰岛素、和0100-0000-029 Nε B29–[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-CH2-(亚呋喃基)CO]desB30人胰岛素、0100-0000-0552 Nε B29-{4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)-癸酰氨基]-丁酰基}desB30人胰岛素。
29. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物选自Nε B29-(3-[2-{2-(2-[ω-羧基十五烷酰基-γ-谷氨酰基-(2-氨基乙氧基)]乙氧基)乙氧基}乙氧基]丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-{2-(2-[ω-羧基十七烷酰基-γ-谷氨酰基-(2-氨基乙氧基)]乙氧基)乙氧基}乙氧基]丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29–{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-十七烷酰基-α-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-十七烷酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十七烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[7-羧基庚酰氨基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(7-羧基庚酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[9-羧基壬酰氨基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(9-羧基壬酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(9-羧基壬酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(2-[3-(2-(2-{2-(7-羧基庚酰氨基)乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基))desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{2-[2-(3-[ω-羧基十五烷酰氨基]丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(ω-羧基十一烷酰氨基)丙氧基]丁氧基丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(3-{4-[3-(ω-羧基十三烷酰氨基)丙氧基]丁氧基丙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十一烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-(3-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)丙酰基-γ-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十五烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-D-谷氨酰基)desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(7-羧基庚酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(9-羧基壬酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十一烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素、Nε B29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-羧基十三烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基-γ-谷氨酰基}desB30人胰岛素。
30. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物是NεB29–十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素。
31. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物是地特胰岛素 (Nε B29–十四烷酰基)desB30人胰岛素)。
32. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少85%的酰化胰岛素或其类似物以复合物存在，该复合物为酰化胰岛素十二聚体或分子量高于酰化胰岛素十二聚体的复合物。
33. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少92%的酰化胰岛素或其类似物以复合物存在，该复合物为酰化胰岛素十二聚体或分子量高于酰化胰岛素十二聚体的复合物。
34. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少95%的酰化胰岛素或其类似物以复合物存在，该复合物为酰化胰岛素十二聚体或分子量高于酰化胰岛素十二聚体的复合物。
35. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少97%的酰化胰岛素或其类似物以复合物存在，该复合物为酰化胰岛素十二聚体或分子量高于酰化胰岛素十二聚体的复合物。
36. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中该胰岛素是人胰岛素或胰岛素类似物。
37. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素类似物是B28Asp人胰岛素。
38. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素类似物是B28LysB29Pro人胰岛素。
39. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素类似物是B3LysB29Glu人胰岛素。
40. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少85%的人胰岛素或胰岛素类似物以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
41. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少92%的人胰岛素或胰岛素类似物以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
42. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少95%的人胰岛素或胰岛素类似物以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
43. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少97%的人胰岛素或胰岛素类似物以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
44. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中至少99%的人胰岛素或胰岛素类似物以速效胰岛素六聚体或分子量小于速效胰岛素六聚体的复合物存在。
45. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以选自下列的范围存在：0.1-10.0 mM、0.1-3.0 mM、0.1-2.5 mM、0.1-2.0 mM、0.1-1.5 mM、0.2-2.5 mM、0.2-2.0 mM、0.2-1.5 mM、0.3-3.0 mM、0.3-2.5 mM、0.3-2.0 mM、0.3-1.5 mM、0.5-1.3 mM和0.6-1.2 mM。
46. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约10.0 mM的量存在。
47. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约3.0 mM的量存在。
48. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约2.5 mM的量存在。
49. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约2.0 mM的量存在。
50. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中长效和速效胰岛素化合物以约0.1 mM至约1.5 mM的量存在。
51. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.2 mM至约2.5 mM的量存在。
52. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.2 mM至约2.0 mM的量存在。
53. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.2 mM至约1.5 mM的量存在。
54. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.3 mM至约3.0 mM的量存在。
55. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.3 mM至约2.5 mM的量存在。
56. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约2.0 mM的量存在。
57. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约1.5 mM的量存在。
58. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.15 mM至约1.3 mM的量存在。
59. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.15 mM至约1.2 mM的量存在。
60. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.15 mM至约1.2 mM的量存在。
61. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.15 mM至约0.5 mM的量存在。
62. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.3 mM的量存在。
63. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素、其类似物和人胰岛素或其类似物以约0.6 M的量存在。
64. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物以约0.42 mM的量存在，且速效胰岛素化合物以约0.18 mM的量存在。
65. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物以约0.18 mM的量存在，且人胰岛素或其类似物以约0.42 mM的量存在。
66. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物以约0.84 mM的量存在，且人胰岛素或其类似物以约0.36 mM的量存在。
67. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物以约0.36 mM的量存在，且人胰岛素或其类似物以约0.84 mM的量存在。
68. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物和人胰岛素或其类似物总共以约0.6 mM的量存在。
69. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物和人胰岛素或其类似物总共以约1.2 mM的量存在。
70. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素或其类似物以70%存在，且人胰岛素或其类似物以约30%存在。
71. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物选自烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺和微生物B3和/或其盐和/或其任意组合。
72. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物选自烟酰胺和烟酸和/或其盐和/或其任意组合。
73. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物是烟酰胺和/或其盐。
74. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物以选自下列的范围存在：1-300 mM、5-200 mM、10-150 mM、20-140 mM或20-100 mM。
75. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约300 mM的烟碱化合物。
76. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8 mM至约260 mM的烟碱化合物。
77. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约10 mM至约200 mM的烟碱化合物。
78. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约10 mM至约150 mM的烟碱化合物。
79. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5 mM至约20 mM的烟碱化合物。
80. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20 mM至约120 mM的烟碱化合物。
81. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40 mM至约120 mM的烟碱化合物。
82. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20 mM至约40 mM的烟碱化合物。
83. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40 mM至约80 mM的烟碱化合物。
84. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20 mM至约100 mM的烟碱化合物。
85. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30 mM至约130 mM的烟碱化合物。
86. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8 mM、20 mM、40 mM、100 mM或120 mM的烟碱化合物。
87. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8 mM的烟碱化合物。
88. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30 mM、70 mM、100 mM或130 mM的烟碱化合物。
89. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40 mM的烟碱化合物。
90. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约80 mM的烟碱化合物。
91. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约120 mM的烟碱化合物。
92. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约150 mM的烟碱化合物。
93. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含下列范围的精氨酸化合物：1-100 mM、5-120 mM、8-50 mM、5-50 mM、5-30 mM、8-30 mM、10-30 mM、30-60 mM或10-40 mM。
94. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含下列范围的精氨酸化合物：1-120 mM、8-85 mM或1-40 mM。
95. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约120 mM的精氨酸。
96. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约100 mM的精氨酸。
97. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5 mM至约80 mM的精氨酸。
98. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20 mM至约80 mM的精氨酸。
99. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5 mM至约25 mM的精氨酸。
100. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8 mM至约85 mM的精氨酸。
101. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约10 mM至约60 mM的精氨酸。
102. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约10 mM至约40 mM的精氨酸。
103. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约40 mM的精氨酸。
104. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中精氨酸以选自下列的范围存在：1 mM、 2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、12 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、35 mM或40 mM、45 mM、50 mM、55 mM或60 mM。
105. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM的精氨酸。
106. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约2 mM的精氨酸。
107. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约3 mM的精氨酸。
108. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约4 mM的精氨酸。
109. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5 mM的精氨酸。
110. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约6 mM的精氨酸。
111. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约7 mM的精氨酸。
112. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8 mM的精氨酸。
113. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约10 mM的精氨酸。
114. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约15 mM的精氨酸。
115. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20 mM的精氨酸。
116. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约25 mM的精氨酸。
117. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30 mM的精氨酸。
118. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约35 mM的精氨酸。
119. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40 mM的精氨酸。
120. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约45 mM的精氨酸。
121. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约50 mM的精氨酸。
122. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约55 mM的精氨酸。
123. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约60 mM的精氨酸。
124. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还包含缓冲剂。
125. 根据实施方案124的胰岛素制剂，其中所述缓冲剂是Tris。
126. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约2 mM至约50 mM的Tris。
127. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约3 mM至约40 mM的Tris。
128. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约20 mM至约30 mM的Tris。
129. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约7 mM、10 mM、20 mM、30 mM或40 mM的Tris。
130. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约7 mM的Tris。
131. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约10 mM的Tris。
132. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约20 mM的Tris。
133. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约30 mM的Tris。
134. 根据实施方案125的胰岛素制剂，其包含约40 mM的Tris。
135. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还包含金属离子。
136. 根据实施方案135的胰岛素制剂，其中该金属离子是锌。
137. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中每6个胰岛素化合物存在少于约6个锌离子。
138. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中每6个胰岛素化合物存在少于约5个锌离子。
139. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中每6个胰岛素化合物存在少于约4.5个锌离子。
140. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中每6个胰岛素化合物存在约4.2个锌离子，其中长效胰岛素化合物的百分比为70%，且速效胰岛素化合物的百分比为30%。
141. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中约4.7个锌离子/ 6个长效胰岛素化合物与约3个锌离子/ 6个速效胰岛素化合物组合。
142. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约2:6至约6:6。
143. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约3:6至约5:6。
144. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中组合前锌：胰岛素摩尔比对长效胰岛素化合物为约4:6至约6:6，而对短效胰岛素化合物低于4:6。
145. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约2.5:6。
146. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约3:6。
147. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约3.5:6。
148. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约4:6。
149. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约4.5:6。
150. 根据实施方案136的胰岛素制剂，其中锌：胰岛素摩尔比为约5:6。
151. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还包含稳定剂。
152. 根据实施方案151的胰岛素制剂，其中该稳定剂是非离子型洗涤剂。
153. 根据实施方案152的胰岛素制剂，其中该洗涤剂是聚山梨醇酯20（吐温20）或聚山梨醇酯80（吐温80）。
154. 根据实施方案152的胰岛素制剂，其中该洗涤剂是聚山梨醇酯20（吐温20）。
155. 根据实施方案152的胰岛素制剂，其中该洗涤剂是聚山梨醇酯80（吐温80）。
156. 根据实施方案153-155中任一项的胰岛素制剂，其包含约5-100 ppm、约10至约50 ppm或约10至约20 ppm的聚山梨醇酯。
157. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还包含一种或多种防腐剂。
158. 根据实施方案157的胰岛素制剂，其中所述防腐剂是酚类化合物。
159. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约0至约6 mg/ml或约0至约4 mg/ml的量存在。
160. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约5至约70 mM的量存在。
161. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约5至约50 mM的量存在。
162. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约5至约30 mM的量存在。
163. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约16 mM的量存在。
164. 根据实施方案158的胰岛素制剂，其中所述酚类化合物以约19 mM的量存在。
165. 根据实施方案157的胰岛素制剂，其中所述防腐剂是间甲酚。
166. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约0.5至约4.0 mg/ml的量存在。
167. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约5至约70 mM的量存在。
168. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约5至约50 mM的量存在。
169. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约5至约30 mM的量存在。
170. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约16 mM的量存在。
171. 根据实施方案165的胰岛素制剂，其中间甲酚以约19 mM的量存在。
172. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还以约0.5%至约2.5%的量含有甘油。
173. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还以约0.7%至约2.0%的量含有甘油。
174. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还以约0.8%至约1.6%的量含有甘油。
175. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其还以约1.1%的量含有甘油。
176. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为中性至弱碱性。
177. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.0至约8.0。
178. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.0。
179. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.1。
180. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.2。
181. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.3。
182. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.4。
183. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.5。
184. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.6。
185. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.7。
186. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.8。
187. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.9。
188. 根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约8.0。
189. 制备包含酰化胰岛素和速效胰岛素的药用组合物的方法，其中将多于约4个锌原子/6分子各化合物加入到组合物中。
190. 根据实施方案189的方法，其中将多达12个锌原子/6分子各胰岛素化合物加入到组合物中。
191. 根据实施方案189-190中任一项的方法，其中将约4.3至约12个锌原子/6分子各胰岛素化合物加入到组合物中。
192. 根据实施方案189-191中任一项的方法，其中在加入防腐剂之前将锌加入到组合物中。
193. 根据实施方案189-192中任一项的方法，其中在加入防腐剂之前加入的锌原子的数量为多于1个锌原子/6分子酰化胰岛素。
194. 根据实施方案189-193中任一项的方法，其中在加入防腐剂之前加入的锌原子的数量为多于2个锌原子/6分子酰化胰岛素。
195. 根据实施方案189-194中任一项的方法，其中在加入防腐剂之前加入的锌原子的数量为多于3个锌原子/6分子酰化胰岛素。
196. 根据实施方案189-195中任一项的方法，其中在加入防腐剂之前加入的锌原子的数量为多于4个锌原子/6分子酰化胰岛素。
197. 根据实施方案189-196中任一项的方法，其中在加入防腐剂之后将锌加入到组合物中。
198. 根据实施方案189-197中任一项的方法，其中在加入防腐剂后将至少0.5个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
199. 根据实施方案189-198中任一项的方法，其中在加入防腐剂后将至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
200. 根据实施方案189-199中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入一部分的锌，并在加入防腐剂后加入一部分的锌。
201. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中该防腐剂是苯酚和/或间甲酚。
202. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中将多达14个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物加入到组合物中。
203. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中将约4.3至约14个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物加入到组合物中。
204. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂前将锌加入到组合物中。
205. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入的锌原子的数量为多于1个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物。
206. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入的锌原子的数量为多于2个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物。
207. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入的锌原子的数量为多于4个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物。
208. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入的锌原子的数量为多于5个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物。
209. 根据实施方案189-200中任一项的方法，其中在加入防腐剂后将锌加入到组合物中。
210. 根据实施方案209的方法，其中在加入防腐剂后将至少0.2个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物加入到组合物中。
211. 根据实施方案209的方法，其中在加入防腐剂后将至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素或其类似物加入到组合物中。
在本发明的另一方面，在加入防腐剂后将多于约2个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或在加入防腐剂后将多于约3个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或在加入防腐剂后将多于约4个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中。
在本发明的另一方面，在加入防腐剂后将约4.5个至约12个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或在加入防腐剂后更优选将约5个至约11.4个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中，或在加入防腐剂后还更优选将约5.5个至约10个锌原子/6分子酰化胰岛素加入到组合物中.
212. 根据前述实施方案中任一项的方法，其中在加入防腐剂前加入部分锌，并在加入防腐剂后加入部分锌。
在一个实施方案中，该方法包括在加入防腐剂前加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少2-3个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入多达约11个锌原子/6分子酰化胰岛素。
在一个实施方案中，该方法包括在加入防腐剂前加入至少2个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少2个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少2-3个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少2个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入多达约10个锌原子/6分子酰化胰岛素。
在一个实施方案中，该方法包括在加入防腐剂前加入至少3个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少1个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少3个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入至少2-3个锌原子/6分子酰化胰岛素，或在加入防腐剂前加入至少3个锌原子/6分子酰化胰岛素，并在加入防腐剂后加入多达约9个锌原子/6分子酰化胰岛素。
213. 根据实施方案212的方法，其中该防腐剂是苯酚和/或间甲酚。
214. 通过给予需要这种治疗的患者治疗有效剂量的根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂降低哺乳动物中血糖水平的方法。
215. 治疗受试者中糖尿病的方法，其包括给予受试者根据前述实施方案中任一项的胰岛素制剂。
216. 根据前述实施方案中任一项的方法，用于肠胃外给药。
217. 根据实施方案1-188中任一项的胰岛素制剂，用于治疗或预防高血糖症，其包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、烧伤、手术创伤和在治疗中需要合成代谢作用的和其它疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病和其它心血管疾病，和治疗危重糖尿病和非糖尿病患者。
218. 根据实施方案1-188中任一项的胰岛素制剂，用于治疗或预防高血糖症，其包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、和烧伤、手术创伤和其它疾病、心肌梗死、中风、冠心病和其它心血管疾病。
本发明的另外的实施方案涉及以下：
219. 胰岛素制剂，其包含
• 长效胰岛素化合物，
• 速效胰岛素化合物，
• 烟碱化合物，和
• 精氨酸。
220. 根据实施方案219的胰岛素制剂，其中该长效胰岛素是酰化胰岛素。
221. 根据实施方案219-220的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素是位于母体胰岛素分子B链中Lys残基的ε-氨基被酰化的胰岛素。
222. 根据实施方案221的胰岛素制剂，其中母体胰岛素选自人胰岛素、desB1人胰岛素、desB30人胰岛素、GlyA21人胰岛素、GlyA21desB30人胰岛素、AspB28人胰岛素、猪胰岛素、LysB28 ProB29人胰岛素、GlyA21 ArgB31 ArgB32人胰岛素和LysB3 GluB29人胰岛素或AspB28desB30人胰岛素。
223. 根据实施方案222的胰岛素制剂，其中酰化胰岛素是NεB29–十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素。
224. 根据实施方案222的胰岛素制剂，其中长效胰岛素选自Nε B29–十四烷酰基(desB30)人胰岛素和A21GlyB31ArgB32Arg人胰岛素。
225. 根据实施方案219-224中任一项的胰岛素制剂，其中速效胰岛素是人胰岛素或胰岛素类似物。
226. 根据实施方案219-225中任一项的胰岛素制剂，其中速效胰岛素是B28Asp人胰岛素。
227. 根据实施方案219-226中任一项的胰岛素制剂，其中速效胰岛素化合物选自B28LysB29Pro人胰岛素和B3LysB29Glu人胰岛素。
228. 根据实施方案219-227中任一项的胰岛素制剂，其中长效和速效胰岛素化合物以约0.1 mM至约10.0 mM的量存在。
229. 根据实施方案219-228中任一项的胰岛素制剂，其中长效胰岛素化合物以约70%存在，而速效胰岛素化合物以约30%存在。
230. 根据实施方案219-229中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物选自烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺和维生素B3和/或其盐和/或其任意组合。
231. 根据实施方案219-230中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约120 mM的精氨酸。
232. 根据实施方案219-231中任一项的胰岛素制剂，其进一步包含缓冲剂和/或金属离子、和/或稳定剂、和/或防腐剂、和/或等渗剂。
233. 通过给予需要这种治疗的患者治疗有效剂量的根据实施方案219-230中任一项的胰岛素制剂降低哺乳动物中血糖水平的方法。
234. 治疗受试者中糖尿病的方法，其包括给予受试者根据实施方案219-231中任一项的胰岛素制剂。
235. 根据实施方案219-232中任一项的胰岛素制剂，用于治疗或预防高血糖症，其包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、烧伤、手术创伤和在治疗中需要合成代谢作用的其它疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病和其它心血管疾病，和治疗危重糖尿病和非糖尿病患者。
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应视为限制性。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用全部结合到本文中，如同将每个参考文献单独和具体地指出通过引用结合，并在本文将其全部阐述的程度（达到法律允许的最大程度）。
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实施例
实施例 1
制备药用制剂
本发明的药用制剂可以由长效胰岛素化合物添加苯酚和/或酚类防腐剂以及随后添加醋酸锌或氯化锌的中间制剂结合速效胰岛素化合物的中间制剂配制。该组合制剂必须包含烟酰胺和精氨酸，其可以加入到中间制剂的一种或两种中或单独加入。组合制剂可进一步包含缓冲剂，如三羟甲基氨基甲烷（Tris），并用例如甘油制成等渗的。
制备制剂 A-H
通过将2566 mg胰岛素化合物（152 nmol/mg）悬浮于120 mL注射用水（水）中，并加入0.2 N氢氧化钠至pH 7.4，随后加入注射用水至130.5 g相当于3000 µM制备德谷胰岛素原液。将溶液通过0.22 µm无菌过滤器过滤。
制备赋形剂原液包括调节pH至约7.4，甘油至2100 mmol/kg，苯酚至320 mmol/kg，间甲酚至160 mmol/kg，精氨酸盐酸盐至500 mmol/kg，氯化钠至500 mmol/kg，和烟酰胺至2400 mmol/kg。最后制备10 mM醋酸锌溶液。
将除烟酰胺和醋酸锌以外的赋形剂原液混合，例如，对于制剂D：3.91 g甘油溶液、2.16 g苯酚溶液（采用系数1.03校正制备中防腐剂损失）、4.32 g间甲酚溶液、1.2 g精氨酸盐酸盐溶液和10 g水，然后加入8.4 g 3000 µM德谷胰岛素。按每2分钟1 Zn/6 ins分份加入醋酸锌溶液至4.7 Zn/6德谷胰岛素，用0.2 N氢氧化钠调节pH至7.4，加水至40.2 g。与18.1 g 600 µM含防腐剂和锌的门冬胰岛素制剂混合前，将溶液储存过夜，并最后与2.0 g 2400 mmol/kg烟酰胺原液混合。最后将组合制剂通过无菌过滤器过滤，并转移到注射系统用安瓿瓶中。
通过将1192 mg门冬胰岛素（151 nmol/mg）悬浮于60 g水中，并加入5.4当量盐酸、0.5当量醋酸锌和水至150 g，然后加入30.9 g间甲酚原液和15.45 g苯酚原液，用0.2 N氢氧化钠调节pH至7.4，加水至300.9 g制备门冬胰岛素中间制剂。
表1 根据本发明的胰岛素制剂的组成
。
制备制剂 I-J
制剂 I
通过将2114 mg胰岛素化合物（141.9 nmol地特胰岛素/mg、2.3 Zn/6ins、1苯酚/ins）溶于55 g水中，调节pH至7.4，加水至75 g相当于4000 µM制备地特胰岛素原液。将溶液通过0.22 µm无菌过滤器过滤。
制备赋形剂原液包括调节pH至约7.4，甘油至2100 mmol/kg，苯酚至320 mmol/kg，间甲酚至160 mmol/kg，精氨酸盐酸盐至500 mmol/kg,，tris至500 mmol/kg，且烟酰胺至2400 mmol/kg。最后制备10 mM醋酸锌溶液。
通过在加入地特胰岛素前，混合除烟酰胺和醋酸锌以外的赋形剂原液：3.53 g甘油溶液、2.25 g苯酚溶液、5.14 g间甲酚溶液、1.2 g精氨酸盐酸盐溶液、0.84 g tris溶液和25.2 g 地特胰岛素原液（4000 µM）制备地特胰岛素中间制剂。加入359 µL醋酸锌溶液（9.37 µM）至2.5 Zn/6地特胰岛素，用0.2 N氢氧化钠调节pH至7.4，并加水至42.2 g。
通过将1192 mg门冬胰岛素（151 nmol/mg）悬浮于60 g水中，并加入5.4当量盐酸、0.5当量醋酸锌和水至150 g，然后加入30.9 g间甲酚原液和15.45 g苯酚原液，用0.2 N氢氧化钠调节pH至7.4，并加水至300.9 g制备门冬胰岛素中间制剂。
与18.1 g 600 µM含防腐剂和锌的门冬胰岛素中间制剂混合前，将地特胰岛素中间制剂储存过夜。最后，将组合制剂通过无菌过滤器过滤，并转移到注射系统用安瓿瓶中。
制剂 J
与制剂I同样地制备制剂J，除了对地特胰岛素中间制剂用水调节总重量减少2.0 g，以及将2.0 g 2400 mmol/kg烟酰胺原液加入到混合的地特胰岛素和门冬胰岛素制剂中。
表2 根据本发明的胰岛素制剂的组成
Figure 141685DEST_PATH_IMAGE016
。
制备制剂 1-7
通过将834 mg胰岛素化合物（151 nmol/mg）悬浮于100 mL水中，并加入0.2 N氢氧化钠至pH 7.8，然后在调节pH至7.4后加入21.6 g苯酚溶液（320 mmol/kg）、10.53 g醋酸锌溶液（9.37 mM）、21.0 g烟酰胺溶液（2600 mmol/kg）和水至180.5 g，制备德谷胰岛素中间制剂。将溶液通过0.22 µm无菌过滤器过滤。
通过将397 mg门冬胰岛素（151 nmol/mg）悬浮于20 g水中，并加入324 µL 1 N盐酸、3.20 g醋酸锌溶液（9.37 mM）和水至50 g，然后加入10.3 g苯酚原液（320 mmol/kg），用0.2 N氢氧化钠调节pH至7.4，加入10.0 g烟酰胺溶液（2600 mmol/kg）和水至100.3 g制备门冬胰岛素中间制剂。将溶液通过0.22 µm无菌过滤器过滤。
用氢氧化钠/盐酸调节pH制备pH 7.4的500 mmol/kg的盐酸精氨酸、谷氨酸和甘氨酸原液和300 mmol/kg的组氨酸原液。将原液通过0.22 µm无菌过滤器过滤。
通过18.0 g德谷胰岛素中间制剂加入氨基酸原液和最终的水至3.0 g，并最终与9.0 g门冬胰岛素中间制剂混合制备表3中所示的最终制剂。将制剂转移到注射系统用安瓿瓶中，并在37℃或5℃储存2周以测定物理和化学稳定性。
表3 根据本发明的另外的胰岛素制剂的组成
Figure 64642DEST_PATH_IMAGE017
。
实施例 2
胰岛素化学稳定性的分析
尺寸排阻色谱
在Waters胰岛素（300 × 7.8 mm、部件 nr wat 201549）上，用含有2.5 M乙酸、4 mM L-精氨酸和20%（V/V）乙腈的洗脱液，在流速1 ml/min和室温下，进行高分子量蛋白质（HMWP）和单体门冬胰岛素的定量测定。用可调吸光度检测仪（Waters 486）在276 nm进行检测。注射体积是40 μl和600 μM人胰岛素标准品。在每个取样点测量HMWP和制剂的浓度。
反相色谱
在HPLC系统上，使用RP C18 4.6 × 150 mm柱，粒度3.5 μm，Waters Sunfire，以流速1 ml/min，在43℃和214 nm检测进行门冬胰岛素相关杂质的测定。用以下组成的流动相进行洗脱：
A. 7.7%（w/w）乙腈、2.8%（w/w）硫酸钠、0.27%（w/w）正磷酸、pH 3.6，
B. 42.8%（w/w）乙腈。梯度：0-20 min用58%/42% A/B等梯度（调节门冬胰岛素主峰至约16 min），20-32 min线性变化为10%/90% A/B，32-33 min线性变化为初始条件，运行时间40 min。
B28异天冬氨酸、脱酰胺和其它相关杂质的量被测定为测量的吸光度面积在防腐剂洗脱后至28 min测定的总吸光度面积中的百分比。德谷胰岛素在约30 min洗脱。
在HPLC系统上，使用RP C8 4.6 × 150 mm柱，粒度3.5 μm，Waters Symmetry Shield，以流速1 ml/min，在40℃和214 nm检测进行德谷胰岛素相关杂质的测定。用以下组成的流动相进行洗脱：
A. 7.7%（w/w）乙腈、1.42%（w/w）硫酸钠、1.38%（w/w）磷酸二氢钠一水合物，用氢氧化钠调节至pH 5.9，
B. 42.8%（w/w）乙腈。梯度：0-45 min用50%/50% A/B等梯度（调节德谷胰岛素主峰至约20 min），45-50 min线性变化为20%/80% A/B，51 min迅速变为初始条件，运行时间60 min。
德谷胰岛素亲水性杂质的量被测定为在约10 min洗脱间甲酚后至主峰的吸光度面积在总吸光度面积中的百分比，疏水性杂质1测定为从主峰到梯度开始的吸光度面积在总吸光度面积中的百分比，疏水性杂质2测定为梯度洗脱的峰面积在总吸光度面积中的百分比。
对表3所示制剂分析门冬胰岛素和德谷胰岛素的化学杂质，测定为在安瓿瓶内在37℃和5℃储存2周后制剂间的差异。结果示于表4。
表4. 表3的胰岛素制剂（实施例1）的物理和化学稳定性
Figure 374400DEST_PATH_IMAGE018
。
加入精氨酸减少了形成的降解产物的量，特别是HMWP和脱酰胺形式。在10-50 mM范围内提高精氨酸浓度导致降解的进一步减少。
物理稳定性（ThT分析中测定为滞后时间）在加入30 mM和50 mM精氨酸后降低，而在加入10 mM精氨酸时无变化。
如表3所示，在减少降解产物的形成方面，50 mM精氨酸的综合性能优于50 mM甘氨酸或50 mM谷氨酸，而30 mM精氨酸优于30 mM组氨酸。
实施例 3
在 LYD 猪模型中的药代动力学（ PK ） / 药效学（ PD ）研究和血浆分析测定
在 LYD 猪中的 PK/PD 研究
在重55-110 kg的LYD杂交的雌性驯养（domestic）猪上进行PK/PD研究。在研究开始前至少2天通过耳静脉将导管插入猪的颈静脉内。将研究开始前的最后一餐在注射测试制剂前约18小时给予动物，在禁食期间和测试期间的所有时间让动物自由饮水。
在时间0小时将测试制剂在颈部侧面皮下给予。在给药前和给药后以规律的时间间隔抽取血样，样品从导管抽取，并取样到预涂肝素的1.5 ml玻璃管中。将血样保存在冰水中直至在4℃ 3000 rpm离心分离血浆10 min，这在最初30分钟内完成。将血浆样品在4℃短期（2-3小时）储存或在-18℃长期储存，在YSI或Konelab 30i上分析葡萄糖并通过LOCI分析门冬胰岛素浓度。
用于门冬胰岛素和德谷胰岛素定量的发光氧通道免疫测定（ LOCI ）
门冬胰岛素和德谷胰岛素LOCI是基于单克隆抗体的夹层免疫测定，并应用两种珠（bead）（涂铕的受体珠和涂链霉亲和素的供体珠）的近似性。受体珠涂有抗人胰岛素和识别血浆样品中门冬胰岛素的特异性抗体。第二种生物素化抗体与门冬胰岛素特异性结合并和涂链霉亲和素的珠一起，它们组成夹层。照射珠-聚集体-免疫复合物以从供体珠释放单态氧，其通入受体珠中并触发化学发光。测量化学发光，产生的光量与门冬胰岛素的浓度成比例。同样利用对德谷胰岛素的特异性LOCI测定。
与III期产品BoostTM（制剂A、不含烟酰胺）相比，本发明中包括的含有230 mM、120 mM或80 mM烟酰胺的制剂（制剂B、C和D）的门冬胰岛素的初始吸收速率较快（图1）。
在相同的猪实验中，测量德谷胰岛素的吸收特性。在230 mM高烟酰胺浓度，动力学特性变为德谷胰岛素的中间高血浆浓度，然而120 mM和80 mM烟酰胺不影响德谷胰岛素特性（图2）。
实施例 4
用于评价蛋白质制剂的物理稳定性的 ThT 原纤化测定的一般介绍
肽的低物理稳定性可导致淀粉样原纤维形成，这观察为样品中非常有序的线状大分子结构，最终导致凝胶形成。传统上这通过目测样品测量。然而，那种测量非常主观，且取决于观察者。因此，应用小分子指示探针有利得多。硫黄素T（ThT）正是这种探针，并当与原纤维结合时具有明显不同的荧光标记[Naiki et al. (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284]。原纤维形成的时程可通过S型曲线用以下等式描述[Nielsen et al. (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]：
等式（1）
这里，F是在时间t的ThT荧光。常数t0是达到50%最大荧光所需的时间。描述原纤维生成的两个重要参数是通过t0 – 2τ计算的滞后时间和表观速率常数k app = 1/τ。
原纤维形成的时程
Figure 708919DEST_PATH_IMAGE020
肽的部分折叠中间体的形成提示为原纤化的一般启动机理。少数那些中间体成核以形成模板，更多的中间体可在它上面组装，而原纤化继续进行。滞后时间对应于其中核的临界质量积累的间隔，而表观速率常数是原纤维本身形成的速率。
样品制备
每次测定前新制备样品。在每个实施例中描述每种样品组成。用适量的浓NaOH和HClO4或HCl调节样品的pH至期望的值。将硫黄素T从H2O中的原液加入样品中至1 μM最终浓度。
将200 μl样品等分试样置于96孔微量滴定板（Packard OptiPlateTM-96、白色聚苯乙烯）中。通常，将每种样品的4或8个复制品（对应于1种测试条件）置于1列孔中。用Scotch Pad（Qiagen）封闭板。
培养和荧光测量
在给定温度下培养，在Fluoroskan Ascent FL荧光读板仪或Varioskan读板仪（Thermo Labsystems）中进行振荡和ThT荧光发射的测量。调节温度至37℃。在所有呈现的数据中将轨道振荡调节至960 rpm，振幅为1 mm。利用通过444 nm滤光器激发和通过485 nm滤光器测量发射进行荧光测量。
每次运行通过将板在测定温度下培养10 min启动。每20分钟测量板达期望的一段时间。在每次测量之间，将板按照描述振荡和加热。
数据处理
将测量点保存于Microsoft Excel格式用于进一步处理和绘制曲线，并使用GraphPad Prism进行拟合。当不存在原纤维时，来自ThT的背景发射可以忽略不计。数据点通常是4或8个样品的平均数，并用标准偏差栏表示。只有在同一个实验（即同一块板上的样品）中获得的数据才呈现在同一个图形中，确保实验之间原纤化的相对量度。
可以将数据集拟合成等式（1）。然而，由于在测量时间期间不总是获得完整S型曲线，因此这里从ThT荧光曲线目测ThT荧光不同于背景水平的时间点作为滞后时间。
初始和最终浓度的测量
在应用于ThT原纤化测定前（“初始”）和ThT原纤化完成后（“ThT测定后”）都测量每种被测制剂的肽浓度。通过反相HPLC方法使用普兰林肽标准品为参比测定浓度。在完成之后在测量之前，从每种复制品收集150μl，并转移到微量离心管（Eppendorf）中。将这些在30000 G离心40 min。用于HPLC系统前，将上清液通过0.22 μm过滤器过滤。
实施例 5
体外模型
尺寸排阻色谱已被用作体外模型，用于地特胰岛素从皮下仓库消失进入血液腔（参考Pharmaceutical Research, 21(2004)1498-1504），以及用于在从药用制剂中除去防腐剂苯酚和间甲酚后胰岛素化合物自缔合成高分子量复合物[Pharmaceutical Research, 23(2006)49-55]。PCT WO 2007/074133中描述了通过尺寸排阻色谱评价长效和速效胰岛素化合物的混合物或组合，而对于根据本发明的德谷胰岛素和门冬胰岛素的参比制剂，德谷胰岛素在Superose 6柱的排阻极限（约为大于5百万道尔顿蛋白质的高分子量复合物的尺寸）洗脱。在除去苯酚后形成的高分子量复合物预计是形成多六聚体胰岛素化合物延长的主要因素。速效胰岛素化合物在色谱图末端胰岛素单体区域内洗脱。
SEC体外模型被用于表1中所含的制剂，并将实施例示于图3。通过含有230 mM（虚线）或120 mM烟酰胺（实线）减少了根据表1的与门冬胰岛素组合的制剂中德谷胰岛素的多六聚体形成，然而对于含有80 mM（点线）或40 mM烟酰胺（点划线）的制剂，多六聚体复合物的峰高与不含烟酰胺的参比制剂（灰实线）大致相同。
方法：色谱柱：Superose 6PC (0.32*30 cm)。洗脱剂：用10 mM tris缓冲的盐水、37℃。流速：80 µL/min。进样体积：20 µL和在276 nm处 UV检测。
实施例 6
测定药用制剂中二六聚体胰岛素含量的方法
在Waters BEH200 SEC柱上，在室温下，利用140 mM氯化钠、2 mM苯酚和10 mM tris 在pH 7.3，以300 µL/min的流速进行尺寸排阻色谱。注射20 µL样品，并在276 nm处UV检测。参比是单体胰岛素（AspB9、GluB27、人胰岛素，RT = 5.9 min）、Co(III)胰岛素六聚体（六聚体 RT = 4.9 min，二六聚体 RT = 4.4 min），和人白蛋白（白蛋白 RT = 4.2 min，白蛋白二聚体 RT = 3.7 min）。区域被分成涉及胰岛素的四六聚体和更高分子量的缔合物、二六聚体胰岛素、六聚体胰岛素、和单体和二聚体胰岛素的峰。

Claims (16)

1.胰岛素制剂，其包含：
• 酰化胰岛素或其类似物，
• 人胰岛素或其类似物，
• 烟碱化合物，和
• 精氨酸。
2.根据权利要求1的胰岛素制剂，其中所述酰化胰岛素或其类似物是位于母体胰岛素分子B链中Lys残基的ε-氨基被酰化的胰岛素。
3.根据权利要求2的胰岛素制剂，其中所述母体胰岛素选自人胰岛素、desB1人胰岛素、desB30人胰岛素、GlyA21人胰岛素、GlyA21 desB30人胰岛素、AspB28人胰岛素、猪胰岛素、LysB28 ProB29人胰岛素、LysB3 GluB29人胰岛素和AspB28 desB30人胰岛素。
4.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述酰化胰岛素是NεB29–十六烷二酰基-γ-Glu-(desB30)人胰岛素。
5.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述酰化胰岛素是NεB29–十四烷酰基(desB30)人胰岛素。
6.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述胰岛素类似物是B28Asp人胰岛素。
7.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述胰岛素类似物选自B28LysB29Pro人胰岛素和B3LysB29Glu人胰岛素。
8.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述人胰岛素或其类似物和酰化胰岛素或其类似物以约0.1 mM至约10.0 mM的量存在。
9.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述酰化胰岛素或其类似物以约70%存在，且所述人胰岛素或其类似物以约30%存在。
10.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述烟碱化合物选自烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺和维生素B3和/或其盐和/或其任何组合。
11.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其中所述烟碱化合物是烟酰胺。
12.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其包含约1 mM至约120 mM的精氨酸。
13.根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂，其进一步包含缓冲剂和/或金属离子、和/或稳定剂、和/或防腐剂和/或等渗剂。
14.降低哺乳动物中血糖水平的方法，其通过给予需要这种治疗的患者治疗有效剂量的根据前述权利要求中任一项的胰岛素制剂。
15.治疗受试者中糖尿病的方法，其包括给予受试者根据权利要求1-13中任一项的胰岛素制剂。
16.根据权利要求1-13中任一项的胰岛素制剂，用于治疗或预防高血糖症，包括应激诱发高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、和烧伤、手术创伤和在治疗中需要合成代谢作用的其它疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病和其它心血管疾病，及治疗危重糖尿病和非糖尿病患者。
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