JP2001238683A - フリンによるタンパクの微生物的生産方法及びその生産のための細胞 - Google Patents

フリンによるタンパクの微生物的生産方法及びその生産のための細胞

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】エンドタンパク分解活性を有するフリンによる
タンパクの微生物的生産のための方法、及びプロ−タン
パクをエンドタンパク分解活性酵素でプロセシングする
細胞の提供。 【解決手段】フリンをエンコードする組換えDNA及びプ
ロ‐形のタンパクをエンコードする組換えDNAを真核宿
主細胞へ導入すること、該細胞を培養して該フリン及び
該プロ-タンパクの両者の発現を得ること、及び該フリ
ンによる該プロ-タンパクのプロセシングの結果として
得られたタンパクを単離することを含むタンパクの微生
物的生産のための方法、及び該プロ-タンパクが該フリ
ンによってタンパクへプロセシングされるところの哺乳
類細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンドタンパク分
解活性(endoproteolytic activity)を有するフリンによ
るタンパクの微生物的生産のための方法、及びプロ-タ
ンパクをエンドタンパク分解活性酵素でプロセシングす
る細胞に関する。
【０００２】
【従来技術】本文に記載された発明は、フリン(furin)
(欧州特許出願A-0246709 号公報に記載されたヒトタン
パク、それはヒトfes ／fps 癌原遺伝子の上流のゲノム
中に位置するｆｕｒ遺伝子の発現生成物である)の可能
な生理的意味へのさらなる研究の結果である。同じ研究
グループにより言及された特許出願及び他の出版物〔ロ
イブロイク(Roebroek)他、Molec.Biol.Rep. 11巻( 1986
年),117-125 頁；ロイブロイク他、EMBO J.5巻(1986
年),2197-2202 頁；及び、シャルケン(Schalken)他、J.
Clin.Invest. 80巻(1987年),1545-1549 頁〕は、当時入
手し得た限られたＤＮＡデータに基づき、ｆｕｒ遺伝子
の生成物の機能を決定するのは不可能であったと言うこ
とを示している。決定され得たことは、フリンはおそら
く、特定の認識構造（recognition struc-tures）が役
割を演じるところの機能を有する膜関連タンパク(membr
ane -associated protein）であると言うことである。
その時にまた、ｆｕｒ遺伝子は、肝臓、腎臓、脾臓、胸
腺及び脳中で 4.5kbメッセンジャーＲＮＡとして発現さ
れ、肺組織での発現は非常に僅かであることが観察さ
れ；一方、非小細胞肺癌において非常に増加した発現の
起こることが見出され、それに基づいて、ｆｕｒ遺伝子
は腫瘍マーカーとしての有用性を有することが示唆され
た。
【０００３】上記の研究の枠内において、ｆｕｒ遺伝子
を含有する約21 kbpのゲノムＤＮＡフラグメントの完全
なヌクレオチド配列が決定された〔ファン・デン・オウ
エランド(Van denOuweland)他、Nuc.Acids Res. 17 巻
(1989年),7101-7102頁〕一方で、対応するｆｕｒ相補Ｄ
ＮＡのヌクレオチド配列がまた決定された〔ファン・デ
ン・オウエランド他、Nucl.Acids Res. 18巻( 1990年),
664 頁〕。
【０００４】
【課題を解決するための手段】それに基づき、ｆｕｒ遺
伝子を、ゲノム組織化構造のレベルの及びエンコードす
る配列のレベルの両者にて完全に同定することが、現
在、可能である。これらのエンコードするヌクレオチド
配列より、フリンのアミノ酸配列がまた導かれる。
【０００５】このアミノ酸配列のコンピューター分析に
より、フリンは、クリュイフェロマイセス・ラクティス
(Kluyveromyceslactis)のKEX1遺伝子及びサッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のKEX2遺伝
子により酵母中でエンコードされるような、ズブチリシ
ン類似プロテアーゼに非常に類似であり、フリンは明ら
かにこれらエンドプロテアーゼのより真核的な形（ヒト
及び動物例えばサル、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ
及びショウジョウバエ中に見られる）であると言うこと
が今、驚くべきことに示された。より詳しくは、該フリ
ンは、従来記載されたバクテリアズブチリシン（約20の
酵素）例えばサーモアクチノミセス・ブルガリス(Therm
oactinomyces vulgaris)のサーミターゼ(thermitase)及
びバチルス・アミロリクイファシエンス(Bacillus amyl
oliquefaciens)のズブチリシンBPN'の触媒的ドメインと
ある程度の相同を示し、ズブチリシン類似プロテアーゼ
例えば酵母クリュイフェロマイセス・ラクティス(Kluyv
eromyces lactis)のKEX1遺伝子の発現生成物及び酵母サ
ッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e）のKEX2遺伝子の発現生成物と顕著に高い相同を示す
と言うことが見出された。該フリン（794 のアミノ酸を
含有する）は、該アミノ酸97〜577 のドメイン中、前記
KEX1遺伝子の発現生成物のアミノ酸 123〜584 と約80.0
％の総体的相同（すなわち、41.6％の同一のアミノ酸及
び38.3％の保存的置換）及び前記KEX2遺伝子の発現生成
物のアミノ酸 134〜597 と約78.9％の総体的相同（すな
わち、39.4％の同一のアミノ酸及び39.5％の保存的置
換）を示す。酵母プロテアーゼのこれらアミノ酸領域
は、ズブチリシン類似触媒的ドメインを含む。フリンの
ズブチリシン類似ドメインは、アミノ酸 108〜464 を含
有するアミノ末端フリンフラグメント中に位置する。
【０００６】該ズブチリシン類似プロテアーゼに関し
て、以下の出版物が参照される：タンギュイ-ロイギュ
ー(Tanguy-Rougeau)他、FEBS Letters 234巻(1988年),4
64-470頁；ミズノ(Mizuno)他、Biochem. Biophys. Res.
Commn. 156巻（1988年）,246-254頁；メロウン(Melou
n)他、FEBS Letters 183巻（1985年）,195-200 頁；マ
ークラン(Marklan) 他、J.Biol. Chem.242巻(1967 年),
5198-5211 頁；ミズノ他、Biochem.Biophys.Res.Commn.
159巻（1989年）,305-311 頁；バサースト(Bathurst)
他、Science 235 巻（1987年）,348-350 頁；トーマス
(Thomas)他、Science241 巻（1988年）,226-230 頁；フ
ォスター(Foster)他、Biochemistry 29 巻（1990年）,3
47-354頁；フュラー(Fuller)他、PNAS USA 86 巻（1989
年）,1434-1438 頁；ジュリアス(Julius)他、Cell 37
巻（1984年）,1075-1089 頁；ボーボネイス(Bourbonnai
s) 他、J.Biol.Chem. 263巻（1988年）,15342-15347
頁；コスマン(Cosman)他、Dev.Biol.Stand. 69巻（1988
年）,9-13頁；シューベルト・ライト(Schubert Wright)
他、Nature 221巻（1969年）,235-242 頁；カニンガム
(Cunningham)他、 Yeast ５巻（1989年）,25-33 頁；
デビッドソン(Davidson)他、Nature 333巻（1988年）,9
3-96 頁。
【０００７】上記刊行物により示されるように、良く研
究されかつ同定されてきたのは、特に、酵母種サッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のKEX2
遺伝子の発現生成物である。それは、膜関連の、カルシ
ウムイオンに依存する、対を成す塩基性アミノ酸残基の
ための酵素特異性を有するエンドペプチダーゼであり；
基質のタンパクは、アルギニンを含有する塩基性アミノ
酸対のカルボキシル部位でこの酵素〔それはここで、
“制限”エンドペプチダーゼ（所定のヌクレオチド配列
がＤＮＡの開裂の決定因であるところの制限エンドヌク
レアーゼにおける命名法に対する類比より）と定義され
る〕によって開裂される。該酵素の配置は、恐らくゴル
ジ複合体の構造中にある。ズブチリシン類似ドメイン及
びＣａ２＋活性化配列は、該タンパクのアミノ末端部分
にある。酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc
es cerevisiae)においては、エンドペプチダーゼは、キ
ラー毒素及び対を成すフェロモンα因子の前駆体、すな
わちプロキラー毒素及びプロα因子のタンパク分解プロ
セシングに関与する。さらに、該エンドペプチダーゼ
は、特定の変異哺乳類細胞系中に阻害された(disturbe
d)タンパク分解プロセシングで導入された後、マウスニ
ュロエンドシンペプチド前駆体プレプロ‐オピオメラノ
コルチン(opiomelanocortin)を正確に開裂することが可
能であり、プロアルブミンを成熟アルブミンへとプロセ
シングすることが可能であり、血漿Ｃタンパクの前駆体
をプロセシングすることが可能であることが見出され
た。
【０００８】上記の公知のエンドペプチダーゼとフリン
との間の確立された類似性に基づいて、フリンは、タン
パクのプロセシング、特にポリペプチドホルモン、成長
因子、毒素、酵素または他のタイプの生物学的に関連す
るタンパクの前駆体のプロセシングのために使用するこ
とのできる制限エンドペプチダーゼであるとみなされ
る。この関係において、一方でインビトロでの使用が、
他方で治療上の処理の体系内での使用を包含するインビ
ボでの使用が考えられる。そのような使用のために、ヒ
トフリンは、ヒト以外の源の上記の公知のエンドペプチ
ダーゼよりも適当であり得、より一般的に、動物“フリ
ン”は下等有機体からのエンドペプチダーゼよりも適当
であり得る。同じことは、そのフリンが最初に見出され
た代表であるところの制限エンドタンパク分解酵素のよ
り大きな族に属する、まだ単離されていないフリンの類
似体または関連物（本文中ではフリン類似酵素と称す
る）にも当てはまる。この族の種々のものが高い構造上
の類似を示すであろうが、配列の相同は極めて低く、多
分50％未満のような低い相同であろう。この族中におい
て、いくつかの酵素のクラス、例えば構造的に分泌され
たタンパクのプロセシングに関与するフリン類似酵素の
群、及びその分泌が調節されている（分泌顆粒を通じて
の分泌）タンパクのプロセシングに関与するフリン類似
酵素の群を区別することが可能であろう。これらフリン
類似酵素の夫々を、酵素がプロセシング酵素として活性
であるところの限定された数の細胞タイプにおいて特徴
的に発現されることができる。これら酵素の細胞及び組
織分布の間における限定された程度の重複がまた考えら
れ、細胞のタイプに依存する前駆体の差別的プロセシン
グの公知の現象の原因に、非常になり得る。
【０００９】下垂体タンパクPC1 及びPC2 〔最近、セイ
ダ(Seidah)他により、DNA and CellBiol. 9巻(1990
年),415-424 頁に記載された〕は、上記フリン類似酵素
の例を構成する。
【００１０】組換えＤＮＡ法を通じて、多量のタンパク
フリンを得ることが可能である。原核生物において、ｆ
ｕｒ遺伝子はβ-ガラクトシダーゼ(pURベクター系)また
はアントラニレートシンセターゼ（pATHベクター系）と
共に融合(fusion)タンパクとして発現され得る。他の可
能性は、融合タンパクグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェ
ラーゼ‐フリン（pGEX）の合成である。このアプローチ
の利点は、フリンがトロンビンによって切断されること
である。フリンはまた、原核生物中で、相補ＤＮＡを正
しい様式で適当なプロモーターの後に置くことによって
そのまま合成することができる。pUR 及びpATHベクター
系は、先に述べた欧州特許出願公報中に記載されてい
る。pGEXは市販されている。強いSV40プロモーターを用
いると、ｆｕｒ相補ＤＮＡは適当な真核細胞中で発現し
得る。タンパクのグリコシル化に関連して、このアプロ
ーチは特定の目的のために好ましい。
【００１１】フリンは、標準的な生化学的方法により、
タンパク分解酵素阻害剤の存在下で精製することができ
る。フリンは、（分泌顆粒中で起こるような）5.5 のpH
の比較的酸性の媒質中で活性であるが、該タンパクはpH
7.5においてもまた、その活性を保つ。これによって、
0.2 Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）またはトリス
‐ＨＣｌ緩衝液(7.0)をインビトロで使用することがで
きる。酵素フリンの活性は、Ｃａ2+イオンの存在に依存
する。インビトロでの酵素活性のために、２〜５ mＭの
カルシウム濃度が最適であると見出された。ＥＤＴＡの
ような金属キレーターの存在はフリンの活性を著しく阻
害する。さらに、重金属イオン例えばＺｎ2+、Ｈｇ2+及
びＣｕ2+の存在は避けるべきである。o-フェナントロリ
ン物質はＣａ2+以外の重金属と結合し、それ故フリンの
酵素活性に悪影響を有さない。５mＭまでの低濃度のフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び
ジイソプロピルフロロホスフェート（ＤＦＰ）は、阻害
作用を有さない。ＰＭＳＦのより高い濃度において、酵
素機能は阻害される。開裂されるべきタンパクのプロセ
シングのためには、37℃で２時間のインビトロでのイン
キュベーションで十分である。
【００１２】フリンは、種々のタンパクのエンドタンパ
ク分解プロセシングに使用することができる。これによ
り、例えば、インビトロで作られた前駆タンパクを特異
的に開裂して、該前駆体が全くまたは不十分な程度にし
か開裂されないところの病気の処置のための付加的な剤
として使用し得る生物学的に活性な組成物を生じること
が可能となる。概して、フリンは生物学的に関連するタ
ンパクのプロセシングに適していると言って良い。
【００１３】タンパクフリンはまた、医薬としての用途
が見出され、それ故、エンドプロテアーゼの不足した患
者をフリンの投与によって処置することができ、それ
故、前駆タンパクの適当なプロセシングがなおも可能で
ある。その結果、開裂生成物はそれらの機能を行い得、
妨害的に高いレベルの前駆タンパクを減じることができ
る。
【００１４】フリンはまた、（例えば血液循環系中の）
基質タンパクの沈着を除去するために適する可能性があ
り、それ故、生命維持組織の閉塞症をフリンの投与によ
って治療することができる。
【００１５】フリンはさらにまた、あらゆる種類の生物
学的に活性な物質（例えば他の酵素）の工業的製造にお
いて、もしプロセシングがそれにおける製造工程である
のならば、使用できる。
【００１６】以下に、フリンをエンコードする組換えDN
A及びプロ‐形のタンパクをエンコードする組換えDNAを
真核宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞へ導入すること、
該細胞を培養して該フリン及び該プロ-タンパクの両者
の発現を得ること、及び該フリンによる該プロ-タンパ
クのプロセシングの結果として得られたタンパクを単離
することを含むタンパクの微生物的生産のための方法に
ついて説明し、さらにフリンをエンコードする、組換え
DNAで誘導されたDNA及びプロ‐形のタンパクをエンコー
ドする、組換えDNAで誘導されたDNAを含み、該フリン及
び該プロ‐タンパクの両者を発現する能力のある哺乳類
細胞であって、該プロ-タンパクが該フリンによってタ
ンパクへプロセシングされるところの哺乳類細胞につい
ても説明する。
【００１７】タンパク分解活性は、その中にトランスメ
ンブランドメインを伴うカルボキシ末端領域が分離され
ても、保持される。それ故、本発明に従い、完全なフリ
ンまたはフリン類似酵素の代わりに、タンパク分解活性
の原因となる部分を尚も含有する酵素のフラグメントを
用いることができる。一つの適当なフラグメントは、例
えば、アミノ酸108〜464から成るフリンフラグメントで
ある。
【００１８】フリンまたはフリン類似酵素、またはその
エンドタンパク分解活性なフラグメントの活性は、さら
に変異の導入によって操作することができる。それ故、
本発明はまた、なおもエンドタンパク分解活性を有する
フリンまたはフリン類似酵素の誘導体に及ぶ。
【００１９】フリンもしくはフリン類似酵素、またはエ
ンドタンパク分解活性を有するフリンもしくはフリン類
似酵素のフラグメントもしくは誘導体は、フリン、フリ
ン類似酵素、フリンまたはフリン類似酵素のフラグメン
トまたは誘導体を発現する能力を組換えＤＮＡまたはＲ
ＮＡを用いての遺伝子工学を通して獲得した原核生物の
または真核生物の細胞から、融合タンパクの形でまたは
そうでなく得られて来た。ここで、フリン、フリン類似
酵素、フリンまたはフリン類似酵素のフラグメントまた
は誘導体が融合タンパクとして細胞により作られる場合
には、該融合タンパクはプロセシングされて、該融合タ
ンパクからのフリン、フリン類似酵素、フリンまたはフ
リン類似酵素のフラグメントまたは誘導体を分離する。
【００２０】しかしながら他の可能性は、用いられるフ
リンまたはフリン類似酵素の源が本来フリンまたはフリ
ン類似酵素を作ることのできる細胞例えば適当な腫瘍細
胞系であることである。
【００２１】本発明はさらに、タンパクをエンドタンパ
ク分解活性な酵素で処理することによるタンパクのイン
ビトロでの開裂のための方法（そこにおいて、本発明に
従い、該タンパクはＣａ2+イオンの存在下で、エンドタ
ンパク分解活性な酵素としてのフリンもしくはフリン類
似酵素またはフリンもしくはフリン類似酵素のエンドタ
ンパク分解活性なフラグメント、誘導体もしくは融合タ
ンパクで処理される）に関する。該処理は普通、生理的
に生じるpH及び温度の値、すなわち４〜９の範囲内のpH
及び約37℃の温度にて行われる。好ましくは、該処理は
５〜7.5 、より好ましくは 5.5〜7.0 のpHで行われる。
また、本発明に従い、処理を20〜50℃、より好ましくは
30〜40℃の温度で行うのが好ましい。さらに、本発明に
従い、該処理を１〜10 mＭ、より好ましくは２〜５ mＭ
のカルシウム濃度で行うのが好ましい。本発明の特に好
ましい態様に従い、該処理は、o-フェナントロリン、ま
たはカルシウム以外の重金属に結合するための同等の試
剤の存在下で行うのが好ましい。
【００２２】本発明に従う方法は、プロセシングされる
基質そのものをフリン（またはフリン類似酵素）そのま
まで、すなわち単離されたまたは精製された形のフリン
で処理することを含み、しかしまた、フリンが発現され
る細胞特に、遺伝子工学された哺乳類の細胞を用いての
またはその中での処理をも含む。好ましくは、これらは
注意深く選択された、 ｆｕｒ遺伝子及びプロセシング
される基質をエンコードする遺伝子の高レベルの発現を
伴う、遺伝子工学された哺乳類の細胞（例えばCOS-1細
胞、CHO 細胞及び内皮細胞）である。当業者に周知なよ
うに、遺伝子増幅によりまたは強いプロモーターを用い
ることにより、非常に強められた発現を認識することが
できる。本発明はトランスジェニックな動物を包含する
用途にさえも及び、それ故インビトロでのタンパク製造
及びタンパク開裂プロセスに限定されない。本発明はそ
れ故、フリンまたはフリン類似酵素をエンコードし、フ
リンまたはフリン類似酵素を発現し得る組換えＤＮＡか
ら生じるＤＮＡを含有する哺乳類の細胞及び哺乳動物を
また含む。内皮細胞は、それらの体全体にわたる（血管
表面、肺組織等における）分布の故に、及びそれらと体
液循環（血流等）におけるあらゆる種類の成分との相互
作用のために、例えば治療用遺伝子(therapeutic gene
s) 及び遺伝子生成物の体内の輸送のための哺乳類の細
胞として特に理想的である。それ故、プロ‐タンパクの
プロセシングにおける阻害よりもたらされる病気に苦し
む患者の内皮細胞を、活性ｆｕｒ遺伝子を導入すること
によって該欠陥を治療するため、体から単離した後に遺
伝子工学することができ、続いて、遺伝子修飾された細
胞を患者に再移植することができる。そのような遺伝子
治療は、しかしながら、内皮細胞に限定されない。
【００２３】本発明の好ましい態様は、フリンをエンコ
ードする組換えDNA及びプロ‐形のタンパクをエンコー
ドする組換えDNAを真核宿主細胞へ導入すること、該細
胞を培養して該フリン及び該プロ-タンパクの両者の発
現を得ること、及び該フリンによる該プロ-タンパクの
プロセシングの結果として得られたタンパクを単離する
ことを含むタンパクの微生物的生産のための方法であ
る。この目的のために、原核及び真核細胞の両者を使用
することができるが、より高等な真核の細胞が好まし
い。例えば、酵母細胞またはより良い植物細胞を使用す
ることができる。しかしながら、使用に特に好ましいの
は、遺伝子工学された哺乳類の細胞である。即ち、フリ
ンをエンコードする、組換えDNAで誘導されたDNA及びプ
ロ‐形のタンパクをエンコードする、組換えDNAで誘導
されたDNAを含み、該フリン及び該プロ‐タンパクの両
者を発現する能力のある哺乳類細胞であって、該プロ-
タンパクが該フリンによってタンパクへプロセシングさ
れるところの哺乳類細胞である。
【００２４】“プロ‐形”と言う言葉は、プロセシング
により所望のタンパクへと転化されるべきまたはされ得
るタンパクの形を意味する。それはタンパクの自然のプ
ロ‐形またはプレプロ‐形であり得るが、所望のタンパ
クをコードする遺伝子が、付加されたシグナルまたはリ
ーダーシークエンスによって先行されるところの組換え
ＤＮＡ構造物の結果であるところの合成プロ‐形でも良
い。
【００２５】プロセシングされる基質に関して、概し
て、対を成す塩基性アミノ酸残基を有するタンパク分を
基質として供することができる。開裂部位に対して−４
位（すなわち開裂部位の４位前）での塩基性アミノ酸残
基の追加的な存在は、より高い有効性を導き出すであろ
う。以下の例は、フリンによるプロセシングのための可
能な基質として挙げられるが、これらが総てではない：
成長及び分化因子の形質転換成長因子β(TGF-β)遺伝子
の族（例えばTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TG
F-β5、アクチビブ(activiv) 、インヒビン、アフリカ
ツメガエル(Xenopus laevis) Vg1遺伝子生成物、抗ミュ
ラー管ホルモン(MIS)、ショウジョウバエ胚と骨形態形
成タンパクのデカペンタペプチド遺伝子複合体、スポー
ン(Sporn)及びロバーツ(Roberts)の Anal.N.Y.Acad.Sc
i. 593 巻（1990年）,1-6 頁を見よ）によりエンコード
された前駆体、成長因子の前駆体、例えばβ-神経成長
因子(β-NGF)及びインシュリン、血液凝固(clotting)因
子の前駆体例えばフォンウィルブランド因子、タンパク
Ｃ、第IX因子及び第Ｘ因子、ホルモン及び神経ペプチ
ド、例えばプロオピオメラノコルチン、プロエンケファ
リン(Proenkephalin) 、プロダイノルフィン(Prodynorp
hin)、プロバソプレシン(Provasopressin)、プロオキシ
トシン (Prooxytocin)、プロCRF(ACTH放出ホルモン)、
プロGRF （成長ホルモン放出因子）、プソソマトスタチ
ン(Prosomatostatin) 、プログルカゴン、プロカルシト
ニン(Procal citonin)、プロCGRP（カルシトニン遺伝子
関連ペプチド）、プロVIP(血管作働性腸管ペプチド)、
プロカエルリン(Procaerulin)及びプロELH(タマゴにあ
るホルモン(egg laying hormone))、インターロイキ
ン、インターフェロン、及び造血因子。
【００２６】本発明はまた、それ自身がエンドタンパク
分解プロセシングを必要としないタンパクにも適用する
ことができる。例は、良好なプロセシング（グリコシル
化）または迅速な精製（分泌）の故に、所望のタンパク
をエンコードする配列が、先に提案されたような適当な
シグナル配列、例えばエリオット(Elliott) 他〔Gene79
巻（1989年）,167-180 頁〕によって酵母細胞中のエリ
スロポイエチンの製造のために、遺伝子構造である。そ
の出版物において、遺伝子構造はエリスロポイエチン配
列の前に置かれたプレプロ‐α因子のリーダー領域から
記載されている。生じた合成前駆体のプロセシングは、
そこに存在するKEX2遺伝子生成物により酵母細胞中で実
施される。
【００２７】本発明のさらなる説明が、付随した図面を
参照して与えられる、ここで、図１は 794のアミノ酸か
ら成るプリンのアミノ酸配列（一文字コードにて）を示
し；図２はフリン遺伝子、相補ＤＮＡ及びタンパクを図
式的に示す。 ａ．ｆｕｒ遺伝子の一部のゲノム構成。エクソン1(約12
0bp）はエクソン2 の 7.2kb上流に位置する。エクソン2
上の星印は、開始コドンの位置を、エクソン16上の三
角は停止コドンを示す。コードしない配列は、黒い箱に
より表されている。Ｂ＝BamHI ；Ｅ＝EcoRI ；Ｋ＝Kpn
I；Ｓ＝SalI；Ｐ＝PstI；Ｘ＝XbaIである。 ｂ．ｆｕｒの相補ＤＮＡ中でのエクソンの分布図。 ｃ．フリン中の種々のタンパクドメインの推定上の配
置。最大のエクソン（エクソン16）は、システインに富
むドメインほぼ全体、トランスメンブランドメイン及び
細胞質ドメインを暗号化する。エクソン２〜12は、推定
されるプレプロ及び触媒ドメインを示し、エクソン５、
７及び10に夫々活性部分残基Asp46(D)、His87(H)及びSe
r261(S) のためのコドンを有する。このイントロン／エ
クソン分布は、セリンプロテアーゼのトリプシン族にお
いて観察されるのと同じ程度の複雑さのものである。垂
直の矢印は、潜在的自動プロセシング部位である塩基性
残基の対（Arg-Arg、Lys-Arg）を示し；塩基性アミノ酸
残基の対 Arg310-Lys311及びArg341-Lys342 はたぶんタ
ンパク分解的開裂に関与する。提案された開裂部位に対
して−４位のアルギニン残基（arg104）が開裂能率を促
進することが見出されたので、成熟タンパクのＮ‐末端
は、潜在的開裂部位(Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg)のトリ
プレットのすぐ後のアミノ酸残基108 で開始すると考え
られる。
【００２８】フリン、及び Kex1[クリュイフェロマイセ
ス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)]及び Kex2[サ
ッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)]のアミノ酸配列が類似性を示すところの領域は、一
部のプレプロドメイン、触媒的ドメイン全体（322 の残
基中の47％の同一性）及び中間ドメイン全体（138 の残
基中の26〜31％の同一性）の一部を含む。トランスメン
ブランと細胞質ドメインには有意の類似性がなく、一
方、システインに富むドメインは二つの酵母タンパク中
には存在しない。
【００２９】図３は、（hfur）ヒトフリン、（kex1）Ke
x1プロテアーゼ、（kex2）Kex2プロテアーゼ、（ther）
サーミターゼ、（subC）ズブチリシン・カールスベルグ
(subtilisin Carlsberg)、及び（subB）ズブチリシンBP
N'のアミノ酸配列の比較を含む。
【００３０】右手側に、成熟酵素の想定Ｎ‐末端からの
アミノ酸残基の番号を示し、フリンについては上にも示
す。おそらく、フリンは配列Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg
（それは自動活性化のための三つの潜在的開裂部位を有
する）で停止する107 の残基のプレプロセグメントを有
する。
【００３１】（▽）六つ総ての配列における同一の残基
及び（．）保存的置換(conservativesubstitution) ；
（：）少なくとも四つの配列における同一の残基。フリ
ン、Kex1及びKex2における塩基性残基の対は、下部の小
文字にて示されている。配列の配置は、セリンプロテア
ーゼの20を越えるズブチリシン族の複合配置、及びＸ‐
線結晶解析より決定されたサーミターゼ、ズブチリシン
・カールスベルグ及びズブチリシンBPN'の三次元構造の
重ね合わせから取られる。この三次元構造の重ね合わせ
は、実線により示されるように、拡張された一致する核
(extended consensus core) を導き、位相学的に等しい
Ｃα原子間の距離は 1.5Ａ未満である。三つの総てのタ
ンパクに共通の二次の構造要素は、（α）α-ヘリック
ス、（β）β-シート、（ｔ）β-ターン及び（ｓ）ベン
ドとして示されている。
【００３２】サーミターゼ、ズブチリシン・カールスベ
ルグ及びズブチリシンBPN'中に主鎖または側鎖の相互作
用を通じて結合している基質またはインヒビター中に含
まれることが公知の残基は、星印でマークしてある。活
性部位（Ｄ、Ｈ及 びＳ）及びオキシアニオンホール(o
xyanion hole)(Ｎ)の主要な残基は下線を付してある。
サーミターゼ中の最強のＣａイオン結合部位に相当する
ループは、〈==Ｃａ==〉により示されている。
【００３３】フリンの推定的な触媒的ドメインの配列を
エンコードするエクソンの境界は、残基17、60、86、11
5 、173 、244 、278 、311 及び352 の後に位置する。
【００３４】図４はフリンの触媒ドメインのモデル図を
示す。該モデルは、ズブチリシンの帯状図に基づく。残
基Asp46 His87及びSer261から成る活性部位は、中央上
部に位置する。追加的なドメインを含有するＣ末端延伸
（ダッシュで示す）は、触媒ドメインの反対側から始ま
る。
【００３５】ズブチリシンに対して延長されたＮ末端を
含む、８の短い挿入の予測される位置（黒ベタ）は、表
面ループ中及び保存されたα‐ヘリックスとβ‐シート
二次構造要素との間の結合中に位置して見える。
【００３６】二つの安定化カルシウムイオン（サーミタ
ーゼにおけるようなＣａ１及びＣａ２）の予測される位
置は、外のループ98〜105 及び68〜77の夫々において、
斜線付きの球により示されている。サーミターゼ中のこ
れら二つのカルシウムイオンに配位するために必要な総
ての側鎖カルボキシル基はまた、フリン中にこれらルー
プ中の位相的に等しい残基中に存在し；さらに、サーミ
ターゼ及びズブチリシンにおけるようにAsp8及びAsp55
がＣａ１に配位するために存在し、そこでは位相的に等
しい位置において配位子はGln またはAsp である。
【００３７】予測されるジスルフィド架橋Cys104-Cys25
3 及びCys196-Cys226 （またはCys198-Cys226 ）は、点
線にて示す。フリン分子の基質結合部位（上部）上のマ
イナスに帯電した側鎖基は、フォーク状の柄で示し、残
基46、47、84、121 、123 、126 、150 、151 、152 、
192 、194 、199 、241 、248 及び 255に対応する。こ
れらの電荷の殆どは、ズブチリシン及びサーミターゼに
おける同等の位置には存在しない。これらのマイナスに
帯電した残基の多くは、それらがおそらくはリシン及び
／またはアルギニンのP1及びP2結合ポケット中にまたは
近くに位置するので、基質中の対を成す塩基性残基と直
接相互作用することができる。
【００３８】フリンの触媒的ドメインのために記載され
たモデルはまた、上記の重要な要素の本質的に総てが三
つ総てのタンパク中に存在する故に、Kex1及びKex2プロ
テアーゼにも妥当する。
【００３９】図５は、野生型のフォンウィルブランド因
子のプレプロ-vWF（上部）及び変異vWFgly763 のプレプ
ロ-vWFgly763（下部）の構造上の構成を図式的に示す。
内側の相同なドメインは、四角い枠により示され；Ａ
１、Ａ２及びＡ３は三重のドメインを表し；Ｂは相同な
ドメインＢ１、Ｂ２及びＢ３を表し；Ｃ１及びＣ２は二
重のドメインを表し；Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は四つ
の繰り返しドメインを表し、Ｄ' は部分的に重複するド
メインを表す。実線は残りのアミノ酸配列を示す。アミ
ノ末端部分は22のアミノ酸残基のシグナルペプチドを含
有する。位置763のアルギニン残基の後の開裂部位（そ
れは一対の塩基性アミノ酸残基から成る）は、矢印でマ
ークしてある。開裂部位の周囲のＤＮＡ領域のヌクレオ
チド配列が示されており、推定されるアミノ酸配列は一
文字の命名法により表されている。プロ-vWFgly763中の
点変異は、星印でマークしてある。
【００４０】以下に、フリンのエンドタンパク分解活性
が基質としてのフォンウィルブランド因子の前駆体（プ
ロ-vWF）のプロセシングに用いられるところの本発明に
従う方法の例が与えられる。プレプロ、プロ及び成熟vW
F の構造に関して、フェルベ(Verweij) 他、EMBO J. 5
巻(1986年),1839-1847頁、及びフェルベ他、J.Biol.Che
m. 263巻（1988年),7921-7924 頁が参照される。プロ-v
WFは、プロ‐ポリペプチド(741アミノ酸残基）及び（Ｃ
末端での）成熟vWF （2050アミノ酸残基）から成る。上
記の文献において説明されているように、成熟vWF は対
を成す塩基性アミノ酸Lys762-Arg763 の隣のタンパク分
解プロセシングによりプロ-vWFから生成し、COS-1 細胞
はプレプロ-vWF相補ＤＮＡ全長のトランスフェクション
の後に構造的に分泌されるvWF の合成のための宿主とし
て適している。エンドタンパク分解プロセシングにおけ
るフリンの活性を、フォールベルグ（Voor berg) 他に
より記載された〔EMBO J. 9 巻（1990年),797-803 頁〕
プロ-vWF及び変異プロ-vWFgly763の両者について試験し
た。この変異プロ-vWFgly763をコードするＤＮＡは、全
長プレプロ-vWF相補ＤＮＡの2407位置に、アデノシンの
代わりにグアノシンを含有する。この変異の結果とし
て、プロポリペプチドの開裂部位 Lys762-Arg763は、プ
ロ-vWF前駆タンパク変異体中の Lys762-Gly763によって
置き換えられる。
【００４１】
【実施例】 COS-1細胞へとトランスフェクションされた
全長ｆｕｒ相補ＤＮＡによりエンコードされた翻訳生成
物の同定 ｆｕｒ遺伝子生成物フリンをさらに同定するために、こ
のタンパクを真核細胞中、SV40後期プロモーターの制御
下で合成し、その機能を明らかにするためのアプローチ
にこの物質を使用する実験を行った。ｆｕｒ遺伝子の翻
訳生成物を同定するために、免疫学的なアプローチを選
択した。“物質及び方法”中に記載されたような、組換
えフリンハイブリッドタンパクに対してラビット中で生
じたポリクロナール抗血清を用いた。pMJ109、pMJ119ま
たはpEW1ＤＮＡでトランスフォームされたバクテリアの
全溶解物中のタンパクのウエスタンブロット分析におい
て、ポリクロナール抗血清は夫々、β-gal-Δ フリン1
、336trpE-AS-Δフリン1及び GST-Δフリン2 を認識し
た。対照実験において、該抗血清はアントラリネートシ
ンセターゼまたはグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラー
ゼの trpE-エンコードされたポリペプチド鎖と反応しな
かった。この抗血清を用いて、pSVLｆｕｒでトランスフ
ェクションされたCOS-1 細胞中のｆｕｒ遺伝子でエンコ
ードされたタンパクを検出するために、ウエスタンブロ
ット分析を行った。ｆｕｒ相補ＤＮＡのヌクレオチド配
列データに基づき、87kDa の計算値の分子量を有する主
たる翻訳生成物の合成を予期することができる。夫々約
97kDa 及び100kDaの見掛けの分子量を有する二つのタン
パクを、トランスフェクションされたCOS-1 細胞中で、
トランスフェクションされていないCOS-1 細胞と比較し
て検出した（結果は記載しない）。
【００４２】pSVLｆｕｒＤＮＡでトランスフェクション
されたCOS-１細胞中のフリンの二つの形の存在は、フリ
ンが翻訳後修飾を受けていると言うことを示す。100kDa
タンパクが約90kDa の主生成物のグリコシル化された形
であることが可能である。しかしながら、100kDaポリペ
プチドがプロ‐形を表し、一方 90kDaポリペプチドが残
基107 と108 の間のペプチド結合のタンパク分解的（自
動）プロセシングにより生じた成熟フリンを表すと考え
ることも、また魅力的である。トランスフェクションさ
れていないCOS-1 細胞はまた、90、60及び40 kDaの見掛
け分子量を有する小量の免疫反応性物質を含有すると言
うことが注意される。これらタンパクの同一性は確定さ
れなければならないが、90kDa のタンパクは少量の内在
性フリンを表すと言うことが考えられる。データは、ト
ランスフェクションされたｆｕｒ遺伝子配列は、実際、
複写され翻訳されて、ｆｕｒ生成物の生物的機能を試験
することを可能とする。
【００４３】フリンのタンパクプロセシング活性 10μgのpSVLvwf ＤＮＡを用いてのトランスフェクショ
ン実験において、360kDaのプロ-vWF前駆タンパク及び26
0kDa成熟vWF タンパクが、調整した媒質中でほぼ等割合
にて見出された。トランスフェクションにより得られた
細胞中の成熟vWF の生成は、内在性フリン（それは、CO
S-1 細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡのノーザ
ンブロック分析により及びポリクロナールラビット抗フ
リン血清を用いての免疫沈降分析により示されるよう
に、COS-1 細胞中で発現される）によるプロセシングに
帰せられる。
【００４４】10μgのpSVLvWFgly763 ＤＮＡを用いてのC
OS-1 細胞の類似のトランスフェクション実験におい
て、プロ-vWFgly763が生じ、培養媒質中で360kDaタンパ
クとして構造的に分泌された。成熟vWF(260kDa)へのエ
ンドタンパク分解プロセシングはなかった。
【００４５】５μgのpSVLvWFgly763 ＤＮＡ及び５μgの
pSVLfur ＤＮＡを用いての同時トランスフェクションを
行った場合に、同じ結果が見出された。プロ-vWFgly763
の成熟vWF へのプロセシングは観察されなかった。
【００４６】一方、COS-1 細胞を５μgのpSVLvWF ＤＮ
Ａ及び５μgの pSVLfur ＤＮＡを用いて同時トランス
フェクションする場合、プロ-vWFの成熟vWF への完全な
プロセシングが見出された。
【００４７】物質及び方法 分子クローニング pSVLfur は、4.1 kbの全長ｆｕｒ相補ＤＮＡフラグメン トを含有し、ＡＧＴ出発コドンの上流の117 ヌクレオチ
ドから出発し、pSVLのEcoRI 部位にクローンされたポリ
‐Ａ付加部位の下流の21ヌクレオチドで終わる〔ウェル
ズ(Wells) 他、Nucl.Acids Res. 11巻（1983年）,7911-
7925 頁〕。pSVLfur において、ｆｕｒ相補ＤＮＡ配列
の発現は、SV40後期プロモーターの制御下にある。pMJ1
09は、プラスミドpUR291のHindIII部位へと分子的にク
ローンされた 2.2kbのSmaI／SmaIヒトｆｕｒ相補ＤＮＡ
フラグメントから成り；該2.2kb ｆｕｒ相補ＤＮＡはフ
リンのカルボキシ末端領域を包含し、pMJ109中のそれ
は、lacZ中の停止コドンの直前に構成されたポリリンカ
ー領域を用いてβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)エンコー
ディング配列に相中(in phase)融合される。pMJ119は、
同じ2.2kb のｆｕｒ相補ＤＮＡフラグメントから成る
が、しかし、ここで、プラスミドpATH1 のSmaI部位へと
分子的にクローンされており、これはアントラニレート
シンセターゼのtrpE‐エンコードされた部分の初めの 3
36アミノ酸残基（336trpE-AS）へのフリンの相中融合を
もたらす。最後に、pEW1の場合において、3.5kb のBglI
I／EcoRI ｆｕｒ相補ＤＮＡフラグメントがpGEX‐3Xへ
とクローンされ、そしてグルタチオン‐Ｓ‐トランスフ
ェラーゼ(GST)へと相中融合される。
【００４８】pMJ109、pMJ119またはpEW1でトランスフォ
ームされたバクテリアにおけるタンパク合成を適当に誘
導すると、比較的多量の β-gal-Δフリン1(分子量170k
Da)、336trpE-AS-Δフリン1(分子量 90kDa）及び GST-
Δフリン2(分子量100kDa）の生成が夫々観察された。
【００４９】ポリクロナール抗フリン抗体の調製及び免
疫ブロッティング ポリクロナール抗フリン抗体を、pMJ109でトランスフォ
ームされたバクテリア中で合成された β-gal-Δフリン
1 ハイブリッドタンパクに対してラビット中で生じさせ
た。免疫化のために、部分的に精製したハイブリッドタ
ンパク調製物を使用した。SDA-PAGEによるバクテリアタ
ンパクのサイズ分別の後に、ハイブリッドタンパクを含
有するゲル領域は切除され、該タンパク含有分は電気泳
動により除去された。トランスフェクションされたCOS-
1 細胞の抽出物を用いてのウエスタンブロット実験を以
下のようにして行った。10μgのpSVLfur ＤＮＡでトラ
ンスフェクションされたCOS-1 細胞を、血清不含の媒質
中で48時間のトランスフェクション後処理に保った。こ
の時点で、該細胞を10 mＭのリン酸ナトリウム（pH7.
4）、0.14ＭのＮａＣｌで二回洗浄し、次に 10mＭのト
リス‐ＨＣｌ（pH 7.8）、150mＭのＮａＣｌ、5mＭのＥ
ＤＴＡ、１％(v/v）Nonidet P-40、 10 mＭのベンザミ
ジン、5mＭのＮ‐エチルマレイミド及び1mＭのフェニル
メチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）から成る
“免疫沈降緩衝液（ＩＰＢ）”中で溶解した(lyzed) 。
細胞の抽出物の一部を８％(w/v）のＳＤＳ‐ポリアクリ
ルアミドゲル上の還元条件下で処理し、続いて、タンパ
クをニトロセルロースへと移した〔シュライヒャー(Sch
leicher)及びシュール(Schuell) 〕。フリンの検出は、
該ブロット(blot)を上記のラビット抗フリン血清を用い
てインキュベートすることにより行った。
【００５０】ＤＮＡトランスフェクション、細胞の放射
性同位元素によるラベル及び免疫沈降分析 サルの腎臓のCOS-1 細胞を、牛胎仔血清（10%v/v）及び
抗生物質〔ペニシリン(100Ｕ／ml)及びストレプトマイ
シン(100マイクロｇ／ml)〕を補われたイスコーブの修
飾された(Iscove's modified) 最少培地中で増殖させ
た。播種の後24時間経つと、半集密的細胞(semi-conflu
ent cell) を、200 μg／mlのDEAE‐デキストランを補
われた２mlのイスコーブの修飾された最少培地中で、20
μgのＤＮＡを用いてトランスフェクションした。用い
たトランスフェクション操作は、クロロキンショック
〔ルスマン(Luthman) 及びマグナッソン(Magnusson) 、
Nucl.Acids Res. 11巻（1983年）,1295-1308 〕を包含
した。トランスフェクションの後、細胞を上記の培地中
に48時間保った。放射性同位元素によるラベル(radiola
belling)に先立ち、培地を除去し、細胞をＲＰＭＩ培地
中メチオニンなしで１時間インキュベートした。続い
て、［３５Ｓ］メチオニン（10μＣｉ／ml、比放射能＞
800 Ｃｉ／mmol）の存在下で４時間細胞をラベルし、続
いてラベルされていないメチオンニン（最終濃度1mＭ）
で14時間追跡した。13,000×ｇで５分間の遠心分離の
後、ラベルされた培養培地を１×ＩＰＢに調節した。ゼ
ラチン‐セファロース(gelatin-Sepharose) を用いて、
続いてラビット免疫前血清とプロテインＡ‐セファロー
ス(Protein A-Sepharose) との予備生成した複合体を用
いて二回インキュベートすることにより、培地の予備ク
リアランスを行った。放射性同位元素でラベルされたvW
F-関連タンパクの免疫沈降を、ラビット抗-vWF〔ダコパ
ッツ(Dakopatts) 、グロストラプ(Glostrup)、デンマー
ク〕とプロテインＡ‐セファロースとから誘導されたIg
G 調製物の予め形成された複合体により、行った。免疫
沈降物をＩＰＢを用いて徹底的に洗浄し、夫々 0.5％の
デスオキシコレート(desoxy-cholate)及び 10mＭのトリ
ス‐ＨＣｌ（pH 7.8）を補われたＩＰＢ中に溶解された
非連続的な10〜20％(w/v)のショ糖勾配によりペレット
化した。免疫沈降物は、還元条件下、５％ＳＤＳ‐ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月１２日（２００１．６．１
２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 フリンのアミノ配列図。
【図２】 フリン遺伝子、相補ＤＮＡ及びタンパクを図
式的に示す図。
【図３】 （ｈｆｕｒ）ヒトフリン、（ｋｅｘ１）ｋｅ
ｘ１プロテアーゼ、（ｋｅｘ２）ｋｅｘ２プロテアー
ゼ、（ｔｈｅｒ）サーミターゼ、（ｓｕｂＣ）ズブチリ
シン・カールスベルグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒ
ｌｓｂｅｒｇ）、及び（ｓｕｂＢ）ズブチリシンＢＰ
Ｎ’のアミノ酸配列の比較を示す図。
【図４】 フリンの触媒ドメインのモデル図。
【図５】 野生型のフォンウィルブランド因子のプレプ
ロ−ｖＷF（上部）及び変異・ｖＷＦｇｌｙ７６３のプ
レプロ−ｖＷＦｇｌｙ７６３（下部）の構造上の構成を
図式的に示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファン デ フェン，ウィレム，ヤン，マ リー ベルギー国，3051 セント ジョリス−ベ ールト，カステールストラート 19 (72)発明者 ファン デン オウェランド，アンナ，マ リア，ウィルヘルミナ オランダ国，6668 エーエヌ ランドヴィ ーク，カークストラート 17 (72)発明者 ファン デューインホヘン，ヨハネス，ラ ンベルタス，ペトラス オランダ国，5703 シーゼット ヘルモン ド，ウェルシャップレイン 26 (72)発明者 ロイブロイク，アントニウス，ヨハネス, マリア オランダ国，6121 エックスシー ボル ン，ハンズブロイク 22 (72)発明者 コニング，ピエト，ニコ，マリア オランダ国，2343 ジェイビー エーゲス トゲースト，アブツポエルホフ ８

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】フリンをエンコードする組換えDNA及びプロ
    ‐形のタンパクをエンコードする組換えDNAを真核宿主
    細胞へ導入すること、該細胞を培養して該フリン及び該
    プロ-タンパクの両者の発現を得ること、及び該フリン
    による該プロ-タンパクのプロセシングの結果として得
    られたタンパクを単離することを含むタンパクの微生物
    的生産のための方法。
  2. 【請求項2】真核宿主細胞が哺乳類細胞であるところの
    請求項1に従う方法。
  3. 【請求項3】フリンをエンコードする、組換えDNAで誘導
    されたDNA及びプロ‐形のタンパクをエンコードする、
    組換えDNAで誘導されたDNAを含み、該フリン及び該プロ
    ‐タンパクの両者を発現する能力のある哺乳類細胞であ
    って、該プロ-タンパクが該フリンによってタンパクへ
    プロセシングされるところの哺乳類細胞。
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