MXPA99000966A - Activador de plasminogeno capaz de ser activado por la trombina - Google Patents
Activador de plasminogeno capaz de ser activado por la trombinaInfo
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Abstract
La invención se refiere a un activador de plasminógeno activable por la trombina, agentes farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas, composiciones farmacéuticas las cuales contienen tal activador de plasminógeno y su uso.
Description
ACTIVADOR DE PLASMINOGENO CAPAZ DE SER ACTIVADO POR LA TROMBINA
La invención se refiere a un activador de plasminogeno activable por la trombina, agentes farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas, composiciones farmacéuticas las cuales contienen tal activador de plasminogeno y su uso.
El activador de plasminogeno de tejido (t-PA) es una serina proteasa compuesta por varios dominios, los cuales catalizan la conversión de plasminogeno en plasmina y se usan para la terapia fibrinolítica.
Numerosas variantes y mutaciones del t-PA se conocen, véase por ejemplo los artículos examinados por T.J.R. Harris (1987) y J. Krause (1988) .
Con respecto al mecanismo de acción del t-PA se conoce entre otras cosas que la fibrinolisis parcialmente se regula por la interacción entre el t-PA y el inhibidor del activador de plasminogeno 1 (PAI-1, un inhibidor de serina proteasa de la familia serpina) . El PAI-1 se une al t-PA principalmente vía los aminoácidos 296 - 302. Una mutación de esta región reduce el efecto inhibitorio del PAI-1 sobre el t-PA (E.L. Madison et al. (1990) ) . Se han llevado a cabo amplias investigaciones sobre el Kef . 29286 mecanismo de interacción entre la región de aminoácido 296 - 302 del t-PA y el PAI-1 (véase también E.L. Madison, Nature 339
(1989) 721 - 723; R. V. Schohet, Thrombosis and Haemostasis 71
(1994) 124 - 128; C.J. Refino, Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 313 - 319; N.F. Paoni , Protein Engineering 6 (1993)
529 - 534 y Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307 - 312;
W.F. Bennett, J. Biol. Chem. 266 (1991) 5191 - 5201, D. Eastman,
Biochemistry 31 (1992) 419 - 422) .
El t-PA de humano no modificado (denotado t-PA en lo siguiente) se compone de 527 aminoácidos en la forma la cual se presenta en plasma y se puede dividir por la plasmina en dos cadenas las cuales por lo tanto todavía se mantienen entre sí por un puente de disulfuro. La cadena A (también llamada cadena pesada) se compone de cuatro dominios estructurales. El dominio finger (aminoácidos 1 - 49) tiene ciertas similitudes con las estructuras "finger" en la fibronectina. El dominio factor de crecimiento (aminoácidos 50 - 86) es hasta cierto punto homologo a la murina y a los factores de crecimiento epidérmicos de humano. Los dominios kringle (aminoácidos 87 - 261) son en gran parte homólogos al cuarto y quinto dominios kringle del plasminogeno. Los dominios finger y kringle 2 del t-PA de manera particular están comprendidos en el enlace de fibrina y en la estimulación de la actividad proteolítica por la fibrina. La cadena B del t-PA (aminoácidos 276 - 527, dominio proteasa) es una serina proteasa y de manera substancial homologa a las cadenas B de uroquinasa y plasmina (T.J.R. Harris (1987) y J. Krause (1988) ) .
La actividad enzimática del t-PA (activación catalítica de plasminogeno a plasmina) es baja en la ausencia de fibrina o productos de desdoblamiento de fibrina, pero de manera substancial se puede incrementar en la presencia de estos estimuladores (por más de un factor de 10) . El mecanismo de acción del t-PA in vivo se describe por ejemplo en Korninger y Collen, Thromb. Haemostasis 46 (1981) 561 - 565. El t-PA activa el plasminogeno a plasmina. La plasmina divide la fibrina para formar productos de desdoblamiento de fibrina. El t-PA se divide por la proteasa/plasmina presente en la sangre entre el aminoácido 275 (arginina) y 276 (isoleucina) y por lo tanto se activa. En este proceso las dos cadenas parciales quedan unidas vía un puente de cisteina.
La capacidad para estimular la actividad por la fibrina y productos de desdoblamiento de fibrina es una característica esencial del t-PA, la cual distingue el t-PA de los otros activadores de plasminogeno conocidos tales como, por ejemplo, la uroquinasa o estreptoquinasa. La potencia estimulante se puede además mejorar modificando la secuencia de aminoácido del t-PA. Una medida de la potencia estimulante es la proporción de la eficiencia catalítica en la presencia y en la ausencia de fibrina. Kcat es la constante de proporción de la reacción catalítica y Km es la constante de Michaelis. La potencia estimulante del t-PA se puede incrementar por 19 veces hasta 81 veces modificando los aminoácidos 292 y/o 305 (E.L. Madison et al., Science 262 (1993) 419 - 421).
Los derivados de t-PA se conocen de la patente US 5,501,853 los cuales se modifican en la región de los aminoácidos 272 - 280, en particular en la región 274 - 277 y de manera adicional en la región de los sitios de glicosilación (117 - 119 y 184 - 186) . Tales derivados de t-PA tienen una actividad proteolítica y plasminogenolítica mejorada, una sensibilidad reducida a la inhibición, una afinidad mejorada por la fibrina y/o una dependencia a la fibrina mejorada de la actividad plasminogenolítica.
Los activadores de plasminogeno activables por la trombina se describen por Wen-Pin Yang et al., en Biochemistry 33 (1994) 2306 - 2312. Este activador de plasminogeno quimérico (59 D8-scu PA-t) se prepara a partir del fragmento Fab de un anticuerpo antifibrina (59 D8) y la parte de C-terminal de un activador de plasminogeno uroquinasa de cadena única molecular bajo activable por la trombina (scu PA-t) el cual se obtiene por supresión de los aminoácidos Phe-157 y Lys-158 a partir del activador de plasminogeno uroquinasa de cadena única molecular bajo (scu PA) por mutagénesis dirigida de sitio.
Los mutantes de plasminogeno activables por la trombina se describen por K.N. Dawson et al., en J. Biol. Chem. 269 (1984)
15989 - 15992. Estos derivados de plasminogeno se obtienen substituyendo los aminoácidos P3 , P2 y Pl ' del sitio de segmentación por una secuencia hendible por la trombina.
N.F. Paoni et al., describe en Protein Engineering 5
(1992) 259 - 266 la modificación del t-PA en la región de aminoácido 296 - 299. Como resultado se obtiene una especificidad de fibrina mejorada.
Los activadores de plasminogeno activables de trombina se describen en la patente US 5,200,340 los cuales se modifican de tal modo que contienen un sitio de segmentación por la trombina para la activación. También se afirma que aunque el dominio factor de crecimiento (dominio EGF) se puede suprimir en tales derivados de t-PA, deben protegerse el dominio enlace de fibrina (dominio finger) y las estructuras kringle.
Se conoce del documento WO 91/09118 y WO 94/10318 que el plasminogeno se puede activar por la trombina para formar la plasmina introduciendo un sitio de segmentación de trombina. Ya que la trombina está contenida en la sangre, se tiene el propósito de que esta activación principalmente tenga lugar en la sangre. Sin embargo, la desventaja de tal método es que el plasminogeno modificado tiene que ser administrado al paciente en grandes cantidades para esto.
El objetivo de la invención es proporcionar activadores de plasminogeno mejorados los cuales son capaces de disolver los coágulos in vivo con una alta especificidad y eficacia.
El objetivo se consigue por un activador de plasminogeno el cual, basado en el activador de plasminogeno tipo tejido de humano,
a) se modifica de tal modo que el activador de plasminogeno se puede dividir por la trombina y se convierte por tal segmentación en la forma de dos cadenas ,
b) se modifica de tal modo que la zimogenicidad es más alta por un factor de al menos 1.2, de manera preferible por un factor de 2 comparado con el t-PA de humano y c) su enlace de fibrina se reduce hasta un punto que el activador de plasminogeno puede penetrar por más de 50% en el coágulo.
Tal activador de plasminogeno actúa de manera especial sobre el coágulo y por lo tanto tiene de manera substancial menos efectos laterales que los activadores de plasminogeno conocidos .
El punto de inicio es la secuencia del activador de plasminogeno tipo tejido de humano. Por lo tanto, "basado en el activador de plasminogeno tipo tejido de humano" de acuerdo a la invención significa que la secuencia del activador de plasminogeno de la invención se deriva a partir de la secuencia del activador de plasminogeno de humano. Esto implica por otra parte que las características estructurales (dominios) características para el t-PA son al menos parcialmente de manera estructural conservadas. Por ejemplo, se ha encontrado que los activadores de plasminogeno en los cuales la estructura de los dominios kringle 2 y/o proteasa todavía se conservan y los cuales además tienen las modificaciones de acuerdo a la invención se pueden usar en el sentido de la invención. También es posible que los dominios adicionales se conserven y las características de acuerdo a la invención son ocasionadas por supresiones, mutaciones y/o adiciones de aminoácidos. Los cambios de la secuencia de aminoácido se pueden efectuar por los métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida de sitio o PCR.
En una modalidad preferida, el activador de plasminogeno de acuerdo a la invención se modifica en comparación al activador de plasminogeno tipo tejido de humano de tal modo que se reduce el grado de facilidad para dividirse del activador de plasminogeno de acuerdo a la invención por la plasmina entre los aminoácidos Pl (275) y Pl ' (276). De manera preferible, el grado de facilidad para dividirse por la plasmina en los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención se reduce por 10% o más, de manera más preferible por 20% o más, y de manera más preferible por 50% o más. En esta conexión, no es necesario que completamente se suprima el grado de facilidad para dividirse por la trombina. En particular la activación de trombina se puede mejorar por un grado de facilidad para dividirse por la trombina del activador de plasminogeno de acuerdo a la invención.
Sin embargo, también se prefiere que el grado de facilidad para dividirse se reduzca hasta el punto que la segmentación pertinente fisiológicamente ya no tenga lugar in vivo. Como resultado es posible reducir drásticamente los efectos laterales. Por lo tanto, la degradación de los parámetros de coagulación se reducen drásticamente in vivo y el tiempo de sangría de manera significativa no se incrementa como es el caso con los activadores de plasminogeno conocidos.
El grado de facilidad para dividirse por la plasmina se puede determinar en una prueba in vivo. Para esto, el activador de plasminogeno se incuba durante 5 minutos a 25°C con cantidades crecientes de plasmina y por lo tanto se lleva a cabo una electroforesis de SDS se lleva a cabo en gel de acrilamida que contiene acrilamida al 12.5 - 15% dependiendo del tamaño del activador de plasminogeno (U. Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93 - 100) .
La modificación del activador de plasminogeno de tal modo que ya no, o solamente hasta un punto reducido, se pueda dividir por la plasmina entre Pl y Pl ' (nomenclatura de acuerdo a
Schechter, J. Y Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27
(1967) 157 - 162) se puede llevar a cabo de un modo conocido para cualquier persona experta en la técnica. La plasmina divide la secuencia R 275 - I 276 (nombres de aminoácido en el único código a cambio de letra) . Por ejemplo, el grado de facilidad para dividirse por la plasmina se puede suprimir o al menos drásticamente reducir modificando uno o ambos aminoácidos.
El grado de facilidad para dividirse por la plasmina también se puede reducir modificando las posiciones P4 - P3 • (aminoácidos 272- 278) . En este caso P2 de manera preferible se convierte en un aminoácido hidrofóbico y/o no aromático preferiblemente, pequeño tal como P. Como resultado de manera sorprendente también es posible lograr un grado de facilidad para dividirse por la trombina, además de la reducción del grado de facilidad para dividirse por la plasmina.
En este proceso uno o más de las siguientes condiciones generales están de manera preferible unidas a:
(P) P4 : cualquier aminoácido (pero no P, sí P2 es P, de manera preferible L, I, V) (Q) P3 : cualquier aminoácido (F) P2 : aminoácido hidrofóbico (F, H, G, V, L, I, T, A o P, de manera particular preferiblemente P) (R) Pl: R o K, de manera preferible R (I) Pl': V o I, de manera preferible I (K) P2 * : V, L, I, o K, de manera preferible V (G) P3' : G
De manera particular preferiblemente P4 se convierte en V, P2 en P y P2 ' en V. Este resultado en el sitio de segmentación preferido particularmente (272 - 278) VQPRIVG. (SEC ID NO: 1) Un sitio de segmentación de trombina también se puede introducir de acuerdo a la declaración de la técnica. Sin embargo, una mutación apropiada de manera preferible se introduce en la región de los aminoácidos 264 - 288.
Una modificación del t-PA que introduce una afinidad por la trombina también se puede lograr modificando el bucle 459 - 471, el bucle de autolisis 417 - 425 y/o los aminoácidos Q 475, K 505 y/o E 506.
La especificidad de una enzima por su substrato esencialmente depende de la secuencia del sitio de segmentación (secuencia primaria) . En el caso de las serina proteasas tal como la trombina y la plasmina, el residuo Pl es el determinante especifico importante. La especificidad de los substratos de proteina plegados también depende del contacto característico entre la enzima (trombina o plasmina) y substrato (activador de plasminogeno) , así como de la conformación y flexibilidad del sitio de segmentación. Ya que las especificidades primarias de la plasmina y trombina son muy similares (ambas se dividen después de la arginina en la posición Pl) , no es fácilmente posible obtener los activadores de plasminogeno en los cuales la segmentación por plasmina (grado de facilidad para activarse por la plasmina) se reduce y la segmentación por la trombina (grado de facilidad para activarse por la trombina) se presenta o de manera substancial es mayor que el grado de facilidad para activarse por la plasmina (al menos un factor de 2 - 10) . Sin embargo, de manera sorprendente se encuentra que tales propiedades se pueden obtener modificando los sitios de enlace secundarios entre la enzima y el substrato y modificando las propiedades estructurales y dinámicas del bucle de activación.
La introducción de un sitio de desdoblamiento especifico por la trombina, mientras que de manera simultánea reduce el grado de facilidad para dividirse por la plasmina de manera preferible se lleva a cabo cambiando la especificidad primaria por mutaciones en el bucle de activación entre los aminoácidos 264 y 288. En este caso son de manera particular preferidas las mutaciones mencionadas en la región 272 - 277 (P4 - P2 ' ) .
El grado de facilidad para dividirse por la trombina se puede mejorar modificando la flexibilidad y/o accesabilidad del bucle de enlace. Para esto de manera particular es preferible modificar el G 265 (la mutación lleva a una flexibilidad inferior) o el R 267 (la mutación lleva a un cambio o segmentación del puente de sal entre el G 265 y el E 410) . También son preferidas las inserciones en la región entre 264 y 267. El R 267 de manera particular es preferiblemente modificado en S (D. Lamba et al., J. Mol. Biol. 258 (1996) 117 - 135).
Una mutación la cual se puede usar para incrementar la flexibilidad es cambiar el R 267 en S de manera preferible en combinación con las mutaciones de P4 en F, P3 en G, P2 en P y P2' en V.
El grado de facilidad para dividirse por la trombina y especificidad se puede además mejorar cambiando los sitios de enlace específicos secundarios. Para esto, por ejemplo se puede suprimir completamente o parcialmente el bucle 459 - 471. Este bucle se compone de los aminoácidos
GDTRSGGPQANLH (SEC ID NO: 2)
La región PQANLH (SEC ID NO: 3) en este bucle se suprime de manera preferible completamente o al menos parcialmente (en donde H es de manera preferible protegido) o se modifica su secuencia de aminoácido.
Las siguientes secuencias de manera preferible se usan en la región de los aminoácidos 272 - 277:
GIPRIV (SEC ID NO: 4) AQPRIK (SEC ID NO: 5)
También es ventajoso usar la secuencia GLSQASQGIPRIV (SEC ID NO : 7)
en la región de aminoácido entre 265 y 277 (la secuencia original del t-PA GLRQYSQPQFRIK (SEC ID NO: 6)). La secuencia
GLRQYSQAQGIPRIV (SEC ID NO: 8)
también se prefiere para esta región. En esta secuencia, los aminoácidos G y I se insertan entre Q y P (secuencia original: Q y F) para extenderse. Tal inserción de manera preferible se lleva a cabo en cualquier sitio en la región entre 264 y 267.
También de manera particular se prefieren los compuestos de acuerdo a la invención en los cuales el sitio de segementación (SEC ID NO: 1) se combina con uno o más, de manera preferible todos, de las mutaciones P4 en F, P3 en G, P2 en P y
P2 ' en V y la mutación R 267 en S.
En una modalidad preferida de la invención, el activador de plasminogeno adicionalmente contiene una mutación la cual drásticamente reduce la actividad de la forma de una cadena pero no la actividad de la forma de dos cadenas y por lo tanto mejora la zimogenicidad por un factor de 1.2, de manera preferible por un factor de 2 o mayor.
La zimogenicidad se entiende como el cociente de la actividad de la forma de dos cadenas y la actividad de la forma de una cadena. La actividad es de manera amidolítica determinada. Tal activador de plasminogeno logra una alta selectividad y eficacia de disolución de trombo in vivo con efectos laterales reducidos drásticamente. Las mutaciones preferidas y apropiadas de la forma de una cadena se describen por ejemplo en E.L. Madison et al., Science 262 (1993) 419 - 421.
Para incrementar la zimogenicidad (proporción de la actividad amidolítica de la forma de dos cadenas a la actividad de la forma de una cadena del activador de plasminogeno) es de manera particular preferido (también para todos los activadores de plasminogeno derivados a partir del activador de plasminogeno tipo tejido de humano) modificar el K 429 en Q y/o H 417 en T y/o suprimir o interferir con la interacción entre K 429 y H 417.
De manera particular los compuestos preferidos de acuerdo a la invención contienen los sitios de segementación (272 - 278) VQPRIVG (SEC ID NO: 1) con la mutación adicional K 429 en Q y/o H 417 en T.
El enlace de fibrina se puede reducir suprimiendo el dominio del t-PA el cual es especifico para el enlace de fibrina (dominio enlace de fibrina, dominio finger) o por mutación de tal modo que el enlace de fibrina vía el dominio finger no puede tener lugar o solamente hasta un ligero grado (sin dominio finger activo funcionalmente) . La reducción del enlace de fibrina permite al activador de plasminogeno penetrar en el coágulo (de manera preferible hasta un punto de más de 50%) y dispersarse uniformemente. Este se divide por la trombina y exhibe su actividad en la forma de dos cadenas activa. Por lo tanto un activador de plasminogeno cuyo enlace de fibrina se reduce de este modo, ya no exhibe un enlace de fibrina de alta afinidad típico del t-PA. Este mecanismo especifico de acción incrementa la potencia del activador de plasminogeno y en particular drásticamente reduce los efectos laterales. La penetración del activador de plasminogeno de acuerdo a la invención en un coágulo se puede determinar en un modelo in vitro. El grado de penetración del coágulo y la distribución en el coágulo se puede determinar visualmente. Para la valoración, el activador de plasminogeno descrito en la patente US 5,223,256 se usa como un estándar, el cual penetra en el coágulo, se dispersa de manera homogénea y por lo tanto representa el valor al 100% de acuerdo a la definición (como se determina en una concentración de 3µg/ml) . El activador de plasminogeno tipo tejido de humano recombinante de acuerdo al documento EP-B 0 093 619 se usa como un estándar adicional, el cual de acuerdo a la definición no penetra en el coágulo y de manera esencial se une a la superficie. El procedimiento descrito en el ejemplo 3c se usa para examinar la penetración del coágulo. Una comparación de estos estándares revela que "ninguna penetración en el coágulo" significa que la parte mayor por mucho (80% o más) del activador de plasminogeno se presenta en la primera cuarta parte del coágulo, mientras que en el caso de una "distribución homogénea" al menos 50% del activador de plasminogeno penetra además en el coágulo y por lo tanto se presentan en las otras tres cuartas partes .
La especificidad y eficacia de la disolución del coágulo se incrementa además si se usa un activador de plasminogeno de acuerdo a la invención, el cual además no tiene o solamente un muy ligero y no específico enlace de fibrina. Tales moléculas penetran en el interior del coágulo y por lo tanto aseguran que el plasminogeno de manera eficiente se active por la plasmina en el coágulo. Tales activadores de plasminogeno se basan por ejemplo en el dominio proteasa del t-PA (documento WO 96/17928) o en una substancia la cual de manera esencial contiene el dominio kringle 2 y el dominio proteasa pero no el dominio finger como los dominios del t-PA (documento WO 90/09437, patente US 5,223,256, EP-B 0 297 066, EP-B 0 196 920).
En una modalidad preferida, el activador de plasminogeno de acuerdo a la invención de manera adicional se modifica de tal modo que no se puede inhibir por el PAI-1. Tal modificación de manera preferible se logra por una mutación de los aminoácidos 296 - 302 (Madison, E.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3530 - 3533) y de manera particular preferiblemente substituyendo los aminoácidos 296 - 299 (KHRR) por AAAA (documento WO 96/01312) .
Los compuestos de acuerdo a la invención son proteínas activas trombolíticamente las cuales de manera preferible, en contraste al t-PA (Alteplasa) , son apropiadas para la administración como una inyección de bolo intravenosa. Estas son efectivas en una dosis inferior y tienen de manera práctica la misma acción trombolítica como una infusión clínicamente estándar de Alteplasa.
El incremento de la especificidad y la reducción asociada de los efectos laterales del flujo de sangre hace a los compuestos de acuerdo a la invención un agente trombolítico valioso excepcionalmente para el tratamiento de todas las enfermedades tromboembólicas . En contraste a los agentes trombolíticos que han sido de manera previa mejorados solamente para enfermedades que amenazan la vida extremadamente tales como infartación cardiaca y embolismo pulmonar severo, el uso de tales variantes proporciona una oportunidad de tratar la trombolisis por los compuestos de acuerdo a la invención, incluso para enfermedades que amenazan la vida menos agudas, tales como, por ejemplo, la trombosis de la vena profunda. Además los agentes trombolíticos basados en los compuestos de acuerdo a la invención se pueden usar sobre una base mucho más amplia que todavía desde que una mayor razón que previene su uso extenso es el riesgo de las complicaciones del flujo de sangre. Con respecto a esto, los compuestos de acuerdo a la invención también se pueden usar de manera ventajosa en las enfermedades agudas, tales como infartación cardiaca o embolismo pulmonar.
Los activadores de plasminogeno usados de acuerdo a la invención se pueden producir por métodos familiares para una persona experta en la técnica en células eucarióticas o procarióticas. Los compuestos de acuerdo a la invención son de manera preferible producidos por ingeniería genética. Tal proceso se describe por ejemplo en el documento WO 90/09437, EP-A 0 297 066, EP-A 0 302 456, EP-A 0 245 100 y EP-A 0 400 545 los cuales son un tema de la descripción de tales procesos de producción. Las mutaciones se pueden introducir por mutagénesis específica de sitio dirigida de oligonucleotido en el cDNA del t-PA o un derivado del mismo. La mutagénesis especifica de sitio es por ejemplo descrita por Zoller y Smith (1984) , modificada de acuerdo a T.A. Kunkel (1985) y Morinaga et al (1984) . También es apropiado el proceso de mutagénesis PCR, el cual por ejemplo se describe en Ausubel et al. (1991) .
El ácido nucleico obtenido de este modo se usa para expresar el activador de plasminogeno de acuerdo a la invención cuando se presenta en un vector de expresión apropiado para la célula huésped usada.
La secuencia de ácido nucleico de la proteína de acuerdo a la invención se puede de manera adicional modificar. Tales modificaciones son por ejemplo:
Modificación de la secuencia de ácido nucleico para introducir varias secuencias de reconocimiento para la limitación de enzimas para facilitar los pasos de ligación, clonación y mutagénesis.
Modificación de la secuencia de ácido nucleico para incorporar los codones preferidos para la célula huésped.
Extensión de la secuencia de ácido nucleico por elementos de regulación y transcripción adicionales para optimizar la expresión en la célula huésped.
Todos los pasos de proceso adicionales para la producción de los vectores de expresión apropiados y para la expresión son planteados de la técnica y familiares para una persona experta en la técnica. Tales métodos se describen por ejemplo en Sambrook et al. "Expression of cloned genes in E coli" en Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
La producción de los activadores de plasminogeno glicosilados usados de acuerdo a la invención se lleva a cabo en células huésped eucarióticas. La producción de los activadores de plasminogeno no glicosilados usados de acuerdo a la invención se lleva a cabo ya sea en células huésped eucarióticas en las cuales el producto glicosilado que es de manera inicial obtenido tiene que ser desglicosilado por métodos familiares para una persona experta en la técnica o de manera preferible por expresión en células huésped no glicosilantes, de manera particular preferiblemente en células huésped procarióticas.
E. coli, streptomyces spec. o bacillus subtilis son por ejemplo apropiados como organismos huésped procarióticos. Para producir la proteína de acuerdo a la invención, las células procarióticas se fermentan del modo usual y la proteína es aislada del modo usual después de que se ha destruido por la acción de lisinas la bacteria. Si la proteína se produce en una forma inactiva (corpúsculos de inclusión) se solubiliza y restaura hasta su naturaleza inicial de acuerdo a los métodos familiares para una persona experta en la técnica. También es posible excretar la proteína como una proteína activa de los microorganismos de acuerdo a los métodos familiares para una persona experta en la técnica. Un vector de expresión apropiado para esto de manera preferible contiene una secuencia de señales la cual es apropiada para la secreción de proteínas en las células huésped usadas y la secuencia de ácido nucleico la cual codifica por la proteína. La proteína expresada con este vector ya sea se segrega en el medio (en el caso de bacteria grampositivo) o en el espacio periplasmático (en el caso de bacteria gramnegativo) en este proceso. Es conveniente que se presente una secuencia entre la secuencia de señales y la codificación de secuencias para el derivado de t-PA de acuerdo a la invención, la cual codifica por un sitio de segmentación el cual permite que la proteína se divida ya sea durante el procesamiento o por tratamiento con una proteasa.
La selección del vector base en la cual se introduce la codificación de secuencias del DNA para el activador de plasminogeno de acuerdo a la invención, depende de las células huésped las cuales son luego usadas para la expresión. Las plasmidas apropiadas, así como los requerimientos mínimos para tal plasmida (por ejemplo, origen de reproducción, sitios de segmentación de restricción) son familiares para una persona experta en la técnica. También es posible dentro del alcance de la invención usar un cosmido en lugar de una plasmida, la forma de hebra doble de duplicación de fagos (?, M13) u otros vectores conocidos para una persona experta en la técnica.
Cuando los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención se producen en procariotes sin secreción es preferible separar los corpúsculos de inclusión que se forman de las partículas de célula solubles, solubilizar los corpúsculos de inclusión que contienen el activador de plasminogeno por el tratamiento con agentes de desnaturación bajo condiciones de reducción, posteriormente se convierte en un derivado con GSSG y restaura hasta su naturaleza original el activador de plasminogeno adicionando GSH y agentes de desnaturación en concentración sin desnaturación o L-arginina. Tales procesos para activar el t-PA y derivados a partir de los corpúsculos de inclusión se describen por ejemplo en el documento EP-A 0 219 874 y EP-A 0 241 022. Sin embargo, también se pueden usar otros procesos para aislar la proteína activa de los corpúsculos de inclusión.
Los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención de manera preferible se purifican en la presencia de L-arginina, en particular en una concentración de arginina de 10 - 1000 mmoles/litro.
Las proteínas extrañas son de manera preferible separadas por cromatografía de afinidad y de manera particular preferiblemente por una columna de adsorbedor en la cual se inmobiliza el ETI (inhibidor de eritrina tripsina) . Sepharose® es por ejemplo usado como un material de apoyo. La ventaja de purificar por medio de una columna de adsorbedor con ETI es que el material de la columna de adsorbedor con ETI directamente se puede cargar con la mezcla de renaturación concentrada incluso en la presencia de concentraciones de arginina tan altas como
0.8 moles/litro. Los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención de manera preferible se purifican por medio de una columna de adsorbedor con ETI en la presencia de arginina
0.6 - 0.8 moles/litro. La solución usada en este proceso de manera preferible tiene un pH de más de 7, de manera particular preferiblemente entre 7.5 y 8.6.
Los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención se eluyen a partir de la columna con ETI disminuyendo el pH en la presencia, así como en la ausencia de arginina. En este proceso, el valor de pH de manera preferible está en el rango ácido, de manera particular preferiblemente entre pH 4.0 y 5.5.
Un tema adicional de la invención es una composición farmacéutica que contiene una proteína activa trombolíticamente de acuerdo a la invención, en donde la proteína de manera preferible contiene el dominio proteasa y de manera opcional el dominio kringle 2 del activador de plasminogeno tipo tejido de humano como la única estructura que produce la actividad trombolítica.
Los activadores de plasminogeno usados de acuerdo a la invención se pueden formular de un modo familiar para una persona experta en la técnica para producir agentes terapéuticos en donde los compuestos de acuerdo a la invención son de manera usual combinados con un portador aceptable farmacéuticamente. Tales composiciones de manera típica contienen una cantidad efectiva de 0.1 - 7 mg/kg, de manera preferible 0.7 - 5 mg/kg y de manera especial preferiblemente 1 - 3 mg/kg de peso del cuerpo como la dosis. Las composiciones terapéuticas usualmente están en la forma de soluciones acuosas estériles o formulaciones secas solubles estériles, tales como liofilisatos. Las composiciones de manera usual contienen una cantidad apropiada de una sal aceptable farmacéuticamente, la cual se usa para preparar una solución isotónica. Además los amortiguadores tales como el amortiguador de arginina, amortiguador de fosfato se pueden usar para estabilizar un valor de pH apropiado (de manera preferible 5.5 - 7.5). El nivel de la dosificación de los compuestos de acuerdo a la invención se determina sin dificultad por cualquier persona experta en la técnica. Es por ejemplo dependiente del tipo de aplicación (infusión o bolo) y la duración de la terapia. Debido a sus periodos de vida media extensos (con respecto a la degradación in vivo) los compuestos de acuerdo a la invención son de manera particular apropiados para la aplicación de bolo (bolo único, bolo múltiple) . Una forma apropiada para una aplicación de bolo es por ejemplo una ampolleta la cual contiene 25 - 1000 mg del compuesto de acuerdo a la invención, una substancia que incrementa la solubilidad del activador de plasminogeno (tal como, por ejemplo la arginina) y amortiguador. La administración es de manera preferible intravenosamente pero también subcutáneamente, intramuscularmente o intraarterialmente. Además los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención se pueden instilar o aplicar localmente.
Los compuestos de acuerdo a la invención se pueden administrar como un bolo múltiple (de manera preferible como un bolo doble) . Los intervalos de tiempo apropiados están entre 20 y 180 minutos, un intervalo entre 30 y 90 minutos es de manera particular preferido y un intervalo entre 30 y 60 minutos es completamente de manera especial preferido. Además también es posible administrar los compuestos de acuerdo a la invención como una infusión durante un periodo de 1 h - 2 días.
Los compuestos de acuerdo a la invención son de manera particular apropiados para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas, tales como por ejemplo infartación cardiaca aguda, infartación del cerebro, embolismo pulmonar, trombosis de la vena profunda de la pierna, oclusión arterial aguda, etc. Los compuestos de acuerdo a la invención son de manera particular preferiblemente usados para tratar enfermedades tromboembólicas subcrónicas, en las cuales tiene que llevarse a cabo una trombolisis más larga.
Es preferible usar los compuestos de acuerdo a la invención en combinación con un inhibidor de coagulación (anticoagulante) tal como, por ejemplo, la heparina y/o un inhibidor de segregación de plaquetas, el cual incrementa el efecto vasodilatorio con pocos efectos laterales. La administración de anticoagulantes puede tener lugar de manera simultánea o en un tiempo diferente a la administración del compuesto de acuerdo a la invención. También se prefiere la adición de substancias que estimulan el flujo de sangre o substancias que mejoran la microcirculación.
Los siguientes ejemplos, publicaciones, el listado de la secuencia y los dibujos además aclaran la invención al alcance de protección del cual deriva de las reivindicaciones de la patente. Los procesos descritos se entienden como ejemplos, los cuales todavía también describen el tema de la invención después de las modificaciones.
Por "r-PA" se entiende en los siguiente como un activador de plasminogeno recombinante el cual consiste de los dominios K2 y P del t-PA de humano. La producción de tales activadores de plasminogeno se describen en la patente US 5,223,256 por ejemplo.
Por r-PA (F274P, K277V) se entiende que el aminoácido 274 (F) en el activador de plasminogeno que consiste de los dominios K2 y P se reemplaza por el aminoácido P y el aminoácido 277 (K) se reemplaza por el aminoácido V (designación de aminoácido análogo a T.J. Harris (1987)).
La Figura 1 es una representación esquemática de la penetración del coágulo de plasma y el modelo de lisis. Para evitar la coagulación de plasma debida al esfuerzo cortante, la presión se produce por una cámara de amortiguador (área rayada) . El mezclado del amortiguador con el plasma en todo el coágulo (área punteada) se evita incorporando una trampa de burbujeo. l:depósito de amortiguador; 2: bomba peristáltica; 3: trampa de burbujeo; 4: jeringa de inyección para el agente fibrinolítico; 5: punta de pipeta con coágulo (área rayada en cruz); 6: abrazadera de tubo; 7: elemento de presión.
La Figura 2 muestra la segmentación del r-PA (F274P, K277V) (A) y del r-PA (B) respectivamente por la trombina (Para detalles véase el ejemplo 8) .
La Figura 3 muestra la segementación del r-PA (F274P, K277V) (A) y r-PA (B) respectivamente por la plasmina (Para detalles véase el ejemplo 9) .
La Figura 4 muestra la segmentación del r-PA (P272V, F274P, K277V) por la trombina (Para detalles véase el ejemplo 10) .
Ejemplo 1
Producción recombinante de los compuestos de acuerdo a la invención
a) Construcción de la plasmida de expresión
La plasmida inicial pA27fd descrita en el documento EP 0 382 174 contiene los siguientes compuestos: promotor tac, región del operador lac que contiene un codón de inicio ATG, la región de codificación para la muteina del t-PA que comnprende un dominio kringle 2 y el dominio proteasa y el terminador de transcripción fd. El vector inicial es la plasmida pkk 223-3.
El método de Morinaga et al. Biotechnology (1984) 636 es de manera esencial usado para introducir las mutaciones. Para la formación heterodúplex, dos fragmentos apropiados son aislados de la pA27fd (por ejemplo, el fragmento A: el fragmento BamHl grande, fragmento B: el vector linealizado con la Pvul) .
Los oligonucleotidos que se usan y las mutaciones que resultan de ellos se listan en la tabla 1.
La preparación heterodúplex se transforma conjuntamente con la plasmida pUBS520 en E. Coli (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109) . Los transformantes se seleccionan adicionando ampicilina y canamicina (50 µg/ml en cada caso) al medio nutriente.
Las plasmidas que resultan de cada una de las preparaciones también se muestran en la tabla 1.
b- Expresión en E. coli
Para examinar la producción de expresión, el E. Coli que contiene la plasmida respectiva (véase la tabla 1) y la pUBS520 se cultivan en el medio LB (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring harbor) en la presencia de ampicilina y canamicina (50 µg/ml de cada uno) hasta un OD en 550 nm de 0.4. La expresión se inicia adicionando IPTG 5 mmoles/litro.
El cultivo se incuba durante un adicional de 4 horas. Posteriormente las células E. Coli se colectan por centrifugación y se vuelven a suspender en amortiguador (Tris-HCl 50 mmoles/litro pH 8, EDTA 50 mmoles/litro); las células se destruyen por la acción de lisinas por sonicación. Las fracciones de proteína insolubles se colectan por centrifugación nuevamente y se vuelven a suspender en el amortiguador mencionado anteriormente por sonicación. La suspensión se mezcla con amortiguador de aplicación de volúmenes de 1/4 (Tris-HCl 250 mmoles/litro pH 6.8, EDTA 10 mmoles/litro, SDS al 5%, mercaptopetanol al 5%, glicerol al 50% y azul de bromofenol al 0.005%) y se analiza con la ayuda de un gel de poliacrilamida de SDS al 12.5%. Como un control, la misma preparación se lleva a cabo con un cultivo de E. Coli que contiene las plasmidas respectivas las cuales no se inducen con IPTG y se separan en el gel. Un substrato distinto con un peso molecular de aproximadamente 40 kD se puede ver en la preparación del cultivo inducido por el IPTG después de colorar el gel con coomassie blue R250 (disuelto en metanol al 30% y ácido acético al 10%) ; este substrato no se presenta en la preparación de control .
Los pasos adicionales para producir el compuesto activo corresponden a los ejemplos 2 y 3 del documento EP-A 0 382 174.
Tabla 1
tó
1) SEC ID NO: 9 2) SEC ID NO: 10 3) SEC ID NO. 11 4) SEC ID NO: 12
Ejemplo 2
Caracterización in vivo
El modelo de conejo de trombolisis de la vena yugular establecido por D. Collen (J. Clin. Invest. 71 (1983) 368-367) se usa para examinar la potencia trombolítica y eficiencia de las proteínas de acuerdo la invención. En este método, un trombo marcado radioactivamente se produce en la vena yugular de los animales. Los animales de manera subcutánea son anticoagulados con 100 IU/kg de heparina. La Alteplasa (activador de plasminogeno tipo silvestre recombinante, "t-PA", comercialmente disponible como Actilyse® de la Thomae Company, Biberach, Alemania) , la proteína descrita en el ejemplo 1, estreptoquinasa (comercialmente disponible como Streptase® de la Behring Company, Marburg, Alemania) o solvente (amortiguador de fosfato de arginina 0.2M) se administran de manera intravenosa a lo conejos .
El grupo de placebo recibe una inyección de bolo única intravenosa de lmg/kg de solvente . El grupo de Alteplasa se administra de manera intravenosa con una dosis total de 1.45 mg/kg, 0.2 mg/kg del mismo como una inyección de bolo inicial, 0.75 mg/kg como una infusión de 30 minutos directamente seguida por 0.5 mg/kg como una infusión continua de 60 minutos (infusión total: 90 minutos). El grupo de estreptoquinasa recibe una infusión intravenosa de 60 minutos de 64,000 IU/kg. El grupo con la proteína de acuerdo a la invención recibe una inyección de bolo única intravenosa. En el caso de la Alteplasa y Estreptoquinasa hay reglas estándares reconocidas .
Dos horas después del inicio de la terapia, el trombo residual se elimina y el grado de disolución del trombo (trombolisis) se determina por medio de la disminución de la radioactividad en el trombo. Las muestras de sangre para obtener el plasma se toman antes de la terapia y dos horas después del inicio de la terapia. El tiempo de tromboplastina activada se mide por medio de procedimientos estándares . Además se cuantifica la perdida de sangre debida a la terapia trombolítica. Para esto se hace una incisión en la piel de 4 centímetros de longitud y 0.3 centímetros de profundidad en el muslo de los animales antes de la administración de los agentes trombolíticos con la ayuda de un patrón y un escalpelo. El flujo de sangre el cual este causa llegar a una detención debida a la coagulación natural. Después de que ha iniciado la terapia se coloca una esponja sobre la herida, la cual absorbe la sangre del flujo de sangre el cual se inicia nuevamente debido a la trombolisis. La cantidad de sangre la cual sale se mide pesando la esponja (después de restar su peso neto) y por lo tanto se describe el grado del efecto lateral del flujo de sangre.
La Alteplasa, así como las proteínas de acuerdo a la invención del ejemplo 1 son substancias trombolíticas altamente activas y de manera significativa disuelven el trombo en comparación al control de solvente .
Ejemplo 3
Comparación de la actividad de lisis en el coágulo
a) Procedimiento del ensayo de lisis en el coágulo
En el ensayo de lisis en el coágulo, se determina la actividad del t-PA y las proteínas recombinantes del ejemplo 1.
La muestra se ajusta a la concentración de la proteína requerida en casa caso adicionando amortiguador (Na2HP0 0.06 M, pH 7.5, BSA 5 mg/ml (albúmina de suero de bovino), Tween® 80 al 0.01%). 0.1 ml de la muestra se mezcla con 1 ml de solución de fibrinogeno de humano (IMCO) (Na2HP0 0.006 M 2 mg/ml, pH 7.4, BSA 0.5 mg/ml, Tween® 80 al 0.01%) y se incuba durante 5 minutos a 37°C. Posteriormente se adicionan 100 µl cada uno de una solución de plasminogeno (Na2HP04/H3P04 0.06M 10 IU/ml, pH 7.4, BSA 0.5 mg/ml, Tween® 80 al 0.01%) y una solución de trombina (Na2HP0 0.06 M 30 U/ml, pH 7.4, BSA 0.5 mg/ml, Tween® 80 al 0.01%) y la mezcla de prueba nuevamente se incuba a 37°C. Después de dos minutos una pelota de Teflon® se coloca sobre el coágulo de fibrina y se detiene el tiempo tomado por la pelota para alcanzar la base del tubo de prueba.
bl Determinación de la actividad en un modelo de plasma dinám-r-r-
En este modelo de plasma dinámico, las substancias de acuerdo a la invención se examinan bajo condiciones las cuales son completamente similares a las condiciones in vivo. Las substancias se adicionan al plasma vía el coágulo, bajo la acción de una presión peristáltica la cual es similar a la presión causada por el latido del corazón.
200 µl de plasma de citrato se mezcla con 20 µl de una solución de CaCl2 0.25 moles/litro y se incuba a 37 °C. 0.16 U de trombina se adiciona y la mezcla se coloca en una punta de pipeta de 1 ml (Eppendorff, Hamburg, GER) . La punta de pipeta se mantiene verticalmente durante 2 minutos a 23 °C, se incuba durante 60 minutos en Tris/HCl 0.01 moles/litro, pH 7.4, NaCl2 0.15 moles/litro, CaCl2 0.025 moles/litro, Tween® 80 al 0.01% y se coloca en el aparato de lisis en el coágulo. La actividad de lisis en el coágulo se determina en un sistema de conmutación (figura 1) compuesto de tubos elásticos. El flujo se produce por una bomba peristáltica y se divide en dos ramales paralelos. El ramal A contiene la punta de pipeta de 1 ml llena con el coágulo de plasma la cual cierra este ramal. El ramal B es una línea invisible la cual se mueve paralela al ramal A. La presión en el ramal B se ajusta a 10 mbares por medio de una abrazadera de tubo. El plasma (1 ml) se aplica al coágulo. La bomba se conecta y la estabilidad de cada coágulo individual se inspecciona durante 15 minutos. El agente fibrinolítico (concentración del plasma final entre 0.5 y 10 y cuidadosamente se inyectan 20 µg/ml para las proteínas del ejemplo 1 o CHO-t-PA) en el plasma por medio de una jeringa de tuberculina de 1 ml con una aguja hipodérmica para la inyección intramuscular (Braun, Melsungen, GER) . El tiempo de lisis en el coágulo se calcula como la diferencia de tiempo entre la adición de la enzima fibrinolítica y la reducción de presión hasta 50% del valor antes de la adición del agente fibrinolitico. La presión se determina por medio de un sistema de detección de presión piezoeléctrica calibrado con agua y documentado por medio de un programa de documentación auxiliado por una computadora.
h) Penetración del coágulo en un modelo estático
800 µl de plasma de citrato de humano (donador saludable) se mezclan con 75 µl de amortiguador de Ca (Tris/HCl 50 mmoles/litro, pH 7.2, CaCl2 0.25 moles/litro), 20 µl de solución de gelatina (10% peso/volumen en NaCl al 0.9%) y 100 ml de solución de trombina (citrato de sodio/HCl 0.05 moles/litro, 8 U/ml, pH 6.5, NaCl 0.15 moles/litro). 800 µl de esta mezcla cuidadosamente se transfieren a una columna de 2 ml (Pierce, Rockfort, IL, USA) . Una coágulo de plasma se forma incubando durante tres horas a 37°C. 2 ml de amortiguador (Na2HP0 0.008 moles/litro, KH2P04 0.001 moles/litro, KCl 0.003 moles/litro, NaCl 0.137 moles/litro, albúmina de suero de bovino al 0.1%, Tween® 80 al 0.01%) se ajusta con el activador de plasminogeno, el cual previamente se inhibe con Glu-Gly-Arg-clorometilcetona, hasta las concentraciones deseadas (0, 0.5, 1, 2 y 3 µg/ml) y 1 ml de esta solución se aplica a la superficie del coágulo. Se descarga el amortiguador sobrante. La superficie del coágulo se lava con 2 ml de amortiguador de PBS (Na2HP04 0.008 moles/litro, KH2P04 0.001 moles/litro, KCl 0.003 moles/litro y NaCl 0.137 moles/litro) y la proteína se fija adicionando 2 ml de solución de glutaraldehido en PBS. Posteriormente la superficie del coágulo se lava con 2 ml de Tris/HCl 50 mmoles/litro, pH 8.0 y se incuba con 1 ml de anticuerpos policlónicos marcados por la peroxidasa contra el t-PA (250 mU/ml) . Después de lavar el coágulo con 1 ml de PBS, la proteína de enlace de anticuerpo se determina incubando con 3-amino-9-etilcarbazol, el cual se convierte por la peroxidasa en un pigmento rojo insoluble.
Los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención no se concentran en la superficie del coágulo sino más bien penetran en el coágulo y se dispersan de manera uniforme. La intensidad de la parte manchada inmunológicamente del coágulo incrementa con concentraciones crecientes de los activadores de plasminogeno de acuerdo a la invención en el plasma.
Ejemplo 4
Comparación del enlace de fibrina
En este ejemplo, las proteínas activas trombolíticamente del ejemplo 1 se examinan por su facilidad para enlazar a la fibrina y también se comparan con la Alteplasa con respecto a su propiedad.
Las muestras de Alteplasa y una proteína de acuerdo a la invención se prepara como soluciones de 1.5 µg de proteína/ml. Posteriormente las muestras (100 µl) de la proteína activa trombolíticamente se mezclan cada una con 770 µl de amortiguador (Tris/HCl 0.05M, pH 7.4, 0.15 NaCl, Tween® 80 al 0.01%), 10 µl de solución de albúmina de suero de bovino (100 mg/ml) , 10 µl de aprotinina (3.75 mg/ml), 10 µl de trombina de bovino (concentración 100 U/ml) y cantidades crecientes de fibrinogeno (10 µg/ml hasta 300 µg/ml). Todas las soluciones son acuosas. Se conoce que la trombina convierte el fibrinogeno en un coágulo de fibrina insoluble.
Los componentes se mezclan e incuban durante 1 hora a 37°C. Posteriormente el sobrenadante se separa del coágulo de fibrina por centrifugación (15 minutos, 13,000 rpm, a 4°C) y la cantidad de la proteína del activador de plasminogeno presente en el sobrenadante se determina por una prueba ELISA estándar.
Ejemplo 5
Comparación de la actividad plasminogenolítica y la estimulabilidad
Un procedimiento conocido para determinar la estimulabilidad de la actividad plasminogenolitica se describe por Verheijen et al. en Throm. Haemost . 48 (1982) 266-269.
Los fragmentos de fibrinogeno los cuales actúan como un estimulador se preparan tratando el fibrinogeno de humano con bromuro de cianogeno (1 g de fibrinogeno de humano, 1.3 g de CNBr en 100 ml de agua) en ácido fórmico al 70% v/v durante un periodo de 17 horas a temperatura ambiente con subsecuente diálisis contra agua destilada.
Cuando el ensayo se lleva a cabo, 5 ng/nl de t-PA o una concentración equivalente de las proteínas del ejemplo 1 se incuban en 1 ml de Tris/HCl 0.1 moles/litro (pH 7.5), que contiene Tween® 80 al 0.1% v/v, Glu-plasminogeno 0.13 µmoles/litro, 0.3 mmoles de substrato S2251 (substrato cromogénico HCL de H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida) y fragmentos de fibrinogeno 120 µg/ml. Las mezclas se incuban durante 2 horas a 25 °C y la proporción de absorbancia a 405 nm se mide contra los valores supuestos de control sin interrumpir la reacción. La segmentación del substrato cromogénico S2251 se mide como una medida de la actividad plasminogenolítica de la enzima. La estimulabilidad se calcula como la actividad con los fragmentos de fibrinogeno divididos por la actividad sin los fragmentos de fibrinogeno.
En cada caso 25 µl de la muestra de manera apropiada prediluidos con Tris 0.1 moles/litro, pH 7.5, Tween® 80 al
0.15% se pipetean en un pozo de una placa de microtitra.
Posteriormente 200 µl de mezcla de reactivo se adiciona y se determina la absorbancia a 405 nm contra el valor propuesto durante un periodo de 2 horas (25 µl, Tris 0.1 moles/litro, pH 7.5, Tween® 80 al 0.15% con 200 µl de mezcla de reactivo).
Amuestra = (A^uestra t ~Asvt ) " ( fnuesCra 0 " Ag o )
Amuestra t = valor de la muestra después de 2 horas ABV t = valor propuesto del reactivo después de 2 horas Ai-uestra o = valor de la muestra en el tiempo t=0 ABv O = valor propuesto del reactivo en el tiempo t=0
Mezcla del reactivo:
ml de amortiguador de prueba (Tris 0.1 moles/litro, pH 7.5,
Tween® 80 al 0.15%) 1 ml de estimulador de t-PA (fragmentos de bromuro de cianogeno de fibrinogeno de humano 1 mg/ml) 1 ml de solución de substrato (S2251 3 mmoles/litro, H-D-Val- Leu-Lys-pNA; Chromogenix, Moelndal, SE). 1 ml de solución de plasminogeno (plasminogeno 7 U/ml, Boehringer Mannheim GmbH) .
Cálculo del factor de estimulación:
Para calcular el factor de estimulación, la actividad en la presencia del estimulador de t-PA se divide por la actividad en la ausencia del estimulador de t-PA. En cada caso la dilución debe ser tal que de manera aproximada la misma absorbancia se consigua en ambas preparaciones. 1 ml de H20 se adiciona en lugar de 1 ml de estimulador de t-PA a la mezcla de reacción sin estimulador de t-PA.
La actividad se mide del mismo modo en la ausencia, así como en la presencia del estimulador. El factor de estimulación F se calcula como sigue:
Amuestra con estimulador x Ql lUClónmuestra con estimulador F = Amuestra sin estimulador x Q-i lUC lOIlp-uestra sin estimulador
La actividad especifica es el cociente de la actividad plasminogenolítica (KU/ml) y la concentración de proteína (mg/ml) .
Ejemplo 6
La inyección de bolo de las proteínas recombinantes del ejemplo 1 del activador de plasminogeno de tejido produce una trombolisis efectiva y confiable en un modelo de perro de trombosis coronaria.
La trombosis causada por las proteínas del ejemplo 1 producidas en E. Coli se pueden evaluar en un modelo de perro de una trombosis de la arteria coronaria izquierda por estimulación eléctrica.
Ejemplo 7
Determinación de la actividad amidolítica
Para determinar la actividad amidolitica, 200 ml de amortiguador (Tris/HCl 0.1 moles/litro, pH 7.5, Tween® 80 al 0.15 %) y 200 µl de la solución del activador de plasminogeno (diluido con amortiguador hasta una concentración de 1 - 12 µg/ml) se incuban durante 5 minutos a 37°C. La determinación se inicia adicionando 200 µl de S2288 (diclorhidrato de H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina, 6 mmoles/litro, Kabi Vitrum, suecia) . El substrato de S2288 se preequilibra a 37 °C. La actividad amidolítica se calcula del incremento de la absorbancia a 405 nm dentro de los primeros 2.5 minutos con un coeficiente de extinción para la p-nitroanilina de 9750 1/mol/cm.
Ejemplo 8
Segmentación del r-PA (F274P, K277V) por la trombina
1. Procedimiento
En cada caso, 44 µg de r-PA (F274P, K277V) y r-PA (estándar) se preincuban durante 15 minutos a 37°C y se mezclan con la unidades de trombina de humano (Sigma) fijadas a continuación, las cuales también se preincuban durante 15 minutos a 37 °C, y se incuban durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente las muestras se mezclan a una proporción de 1:1 (v/v) con amortiguador de muestra de SDS (Tris/HCl 0.125 moles/litro, pH 8.8,
SDS al 4.6% (peso/volumen), urea 4 moles/litro, azul de bromofenol al 0.1%, ditioeritritol 0.3 moles/litro), se incuban durante 3 minutos a 95 °C y se analizan por electrofóresis con gel de poliacrilamida de SDS.
2. Resultados
El desdoblamiento del r-PA (F274P, K277V) por la trombina se muestra en la Figura 2. Los datos demuestran que las cantidades crecientes de la trombina convierten el r-PA
(F274P, K277V) completamente en la forma de dos cadenas. Los dominios proteasa y kringle 2 del r-PA (F274P, K277V) divididos por la trombina están colocados en el mismo nivel que los dominios correspondientes del r-PA en la forma de dos cadenas (r-PA (te)) preparados por digestión de plasmina.
De una manera diferente al r-PA (F274P, K277V) (A) , bajo las condiciones descritas, el r-PA (B) el cal se usa aquí como un estándar no se divide por la trombina.
A:
Línea 1: peso molecular estándar* Línea 2: r-PA Línea 3: r-PA (te)** Línea 4: r-PA (F274P, K277V) Línea 5: r-PA (F274P, K277V) + amortiguador de trombina
Línea 6: r-PA (F274P, K277V) + 0.055 NIH unidades de trombina
Línea 7: r-PA (F274P, K277V) + 0.55 NIH unidades de trombina
Línea 8: r-PA (F274P, K277V) + 2.74 NIH unidades de trombina
Línea 9: trombina (5 NIH unidades) Línea 10 : peso molecular estándar*
B:
Línea 1 : peso molecular estándar* Línea 2: r-PA Línea 3: r-PA (te) ** Línea 4: r-PA + amortiguador de trombina Línea 5: r-PA + 0.055 NIH unidades de trombina Línea 6: r-PA + 0.55 NIH unidades de trombina Línea 7: r-PA + 2.74 NIH unidades de trombina Línea 8: trombina (5 NIH unidades) Línea 9 : peso molecular estándar*
*) Peso molecular estándar: lisozima (14,307 Da), inhibidor de tripsina de soya (20,100 Da), triosa fosfato isomerasa (26,626 Da), aldolasa (39,212 Da), deshidrogenasa de glutamato (55,562 Da), fructosa-6-fosfato-quinasa (85,204 Da), ß-galactosidasa (116,353 Da), a-2-macroglobulina (170,000 Da) .
**) r-PA (te) : forma de dos cadenas del r-PA la cual se obtiene por incubación del r-PA con plasmina.
Ejemplo 9
Segmentación del r-PA (F274P, K277V) por plasmina
1. Procedimiento En cada caso, 25 µg de r-PA (F274P, K277V) y r-PA (estándar) se preincuban durante 15 minutos a 37 °C y se mezclan con la unidades de plasmina (humano) fijadas a continuación, las cuales también se preincuban durante 15 minutos a 37 °C, y se incuban durante 10 minutos a 37°C. Posteriormente las muestras se mezclan a una proporción de 1:1 (v/v) con amortiguador de muestra de SDS (Tris/HCl 0.125 moles/litro, pH 8.8, SDS al 4.6% (peso/volumen), urea 4 moles/litro, azul de bromofenol al 0.1%, ditioeritritol 0.3 moles/litro), se incuban durante 4 minutos a 95°C y se analizan por electrofóresis con gel de poliacrilamida de SDS.
2. Resultados
La segmentación del r-PA (F274P, K277V) (A) , y del r-PA (B) usados aquí como un estándar, por la plasmina se muestra en la Figura 3.
Los datos demuestran que el r-PA (B) se convierte en la forma de dos cadenas por incubación con cantidades crecientes de plasmina. Bajo las condiciones empleadas, la cantidad aplicada del r-PA se convierte completamente en la forma de dos cadenas por 25 mU de plasmina.
En contraste a esto, el r-PA (F274P, K277V) (A) exhibe una segmentación más desfavorable notablemente por la plasmina. Cuando se incuba con 0.025 U y 0. ÍU de plasmina, ninguna segmentación significante del r-PA (F274P, K277V) por la plasmina se observa todavía. Incluso cuando se incuban 25 µg de r-PA (F274P, K277V) con 25 mU de plasmina, no se presenta segmentación completa.
Los dominios proteasa y kringle 2 del r-PA (F274P, K277V) divididos por la trombina están colocados en el mismo nivel que los dominios correspondientes del r-PA en la forma de dos cadenas (r-PA (te) ) preparada por digestión con la sefarosa de plasmina, de modo que tiene que asumirse que la segmentación del variante tiene lugar entre los aminoácidos 275 y 276 (numeración de acuerdo a Harris, Prot. Engineering 1, 449-458 (1987)), como en el r-PA.
Línea 1 : peso molecular estándar* Línea 2: r-PA Línea 3: r-PA (te)** Línea 4: r-PA (F274P, K277V) Línea 5: r-PA (F274P, K277V) + 0.25 mU de plasmina Línea 6: r-PA (F274P, K277V) + 0.25 mU de plasmina Línea 7: r-PA (F274P, K277V) + 12.5 mU de plasmina Línea 8: r-PA (F274P, K277V) + 25 mU de plasmina
B:
Línea 1: peso molecular estándar* Línea 2: r-PA Línea 3: r-PA (te)** Línea 4: r-PA + 0.25 mU de plasmina Línea 5: r-PA + 2.5 mU de plasmina Línea 6: r-PA + 12.5 mU de plasmina Línea 7: r-PA + 25 mU de plasmina
*) Peso molecular estándar: lisozima (14,307 Da), inhibidor de tripsina de soya (20,100 Da), triosa fosfato isomerasa
(26,626 Da), aldolasa (39,212 Da), deshidrogenasa de glutamato
(55,562 Da), fructosa-6-fosfato-quinasa (85,204 Da), ß-galactosidasa (116,353 Da), a-2-macroglobulina (170,000 Da).
**) r-PA (te) : forma de dos cadenas del r-PA el cual se obtiene por incubación del r-PA con sefarosa de plasmina.
Ejemplo 10
Segmentación del r-PA (P272V, F274P, K277V) por trombina
1. Procedimiento
44 µg de r-PA (P272V, F274P, K277V) se preincuban durante 15 minutos a 37°C y se mezclan con la unidades de trombina de bovino (Sigma) fijadas a continuación las cuales también se preincuban durante 15 minutos a 37 °C, y se incuban durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente las muestras se mezclan a una proporción de 1:1 (v/v) con amortiguador de muestra de SDS
(Tris/HCl 0.125 moles/litro, pH 8.8, SDS al 4.6% (peso/volumen), urea 4 moles/litro, azul de bromofenol al 0.1%, ditioeritritol 0.3 moles/litro), se incuban durante 3 minutos a 95°C y se analizan por electrofóresis con gel de poliacrilamida de SDS.
2. Resultados
La segmentación del r-PA (P272V, F274P, K277V) por la trombina se muestra en la Figura 4. Los datos demuestran que las cantidades crecientes de trombina convierten el r-PA (P272V, F274P, K277V) completamente en la forma de dos cadenas. Los dominios proteasa y kringle 2 del r-PA (P272V, F274P, K277V) divididos por la trombina están colocados en el mismo nivel que los dominios correspondientes del r-PA en la forma de dos cadenas (r-PA (te)) preparados por digestión de plasmina.
Línea 1 : peso molecular estándar* Línea 2: r-PA Línea 3: r-PA (te)** Línea 4: r-PA (P272V, F274P, K277V) Línea 5: r-PA (P272V, F274P, K277V) + amortiguador de trombina Línea 6: r-PA (P272V, F274P, K277V) + 0.055 NIH unidades de trombina Línea 7: r-PA (P272V, F274P, K277V) + 0.55 NIH unidades de trombina Línea 8: r-PA (P272V, F274P, K277V) + 2.74 NIH unidades de trombina Línea 9: peso molecular estándar*
*) Peso molecular estándar: lisozima (14,307 Da), inhibidor de tripsina de soya (20,100 Da), triosa fosfato isomerasa (26,626 Da), aldolasa (39,212 Da), deshidrogenasa de glutamato (55,562 Da), fructosa-6-fosfato-quinasa (85,204 Da), ß-galactosidasa (116,353 Da), a-2-macroglobulina (170,000 Da).
**) r-PA (te) : forma de dos cadenas del r-PA la cual se obtiene por incubación del r-PA con plasmina.
Lista de Referencias
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Lamba, D. et al., J. Mol. Biol. 258 (1996) 117-135 Madison, E.L. et al., Science 262 (1993) 419-421 Madison E.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3530-3533 Madison, E.L., Nature 399 (1989) 721-723 Morinaga et al., Biotechnology 21 (1984) 634 Paoni, N.F. et al., Protein Engineering 5 (1992) 259-266 Paoni, N.F. Protein Engineering 6 (1993) 529-534 Paoni, N.F., Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 307-312 Refino, C.J., Thrombosis and Haemostasis 70 (1993) 313-319
Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. Coli" in
Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor
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(1967) 157-162 Schohet, R.V., Thrombosis and Haemostasis 71 (1994) 124-128
US-Patent 5,200,340 US-Patent 5,223,256 US-Patent 5,501,853 Wen-Pin Yang et al., Biochemistry 33 (1994) 2306-2312 WO 90/09437 WO 91/09118 WO 94/10318 WO 96/01312 WO 96/17928 Zoller and Smith, DNA 3 (1984) 479-488 LISTADO DE SECUENCIA
(1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH (B) CALLE: Sandhofer Str. 116 (C) CIUDAD: Mannheim (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : D-68305 (G) TELEFONO: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Activador de plasminogeno capaz de ser activado por la trombina
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 12
(iv) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco blando (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30B (EPO) (iv) DATOS DEL SOLICITANTE ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: EP 96112487.2 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 de Agosto de 1996
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
Val Gln Pro Arg He Val Gly 1 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His
1 5 10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 3
Pro Gln Ala Asn Leu His 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4
Gly He Pro Arg He Val 1 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) Tipo DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
Ala Gln Pro Arg He Lys 1 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg He Lys 1 5 10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : péptido
(xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID NO : 7 :
Gly Leu Ser Gln Ala Ser Gln Gly He Pro Arg He Val
1 5 10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Ala Gln Gly He Pro Arg He Val 1 5 10 15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleotido"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
GTACAGCCAG GTTCAGCCTC GCATCGTTGG AGGGCTCT
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleotido"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
CTGCGGCCTG AGCCAGTACA GCCAGTTTGG CCCTCGCATC GTTGGAGGGC TCT
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleotido" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
GGAGCGGCTG CAGGAGGCTC ATG
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleotido"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12
CTACGGCAAG ACCGAGGCCT TGT
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
Claims (11)
1. El activador de plasminogeno de una cadena, caracterizado porque, basado en el activador de plasminógeno tipo tejido de humano, se modifica por eliminación, mutaciones y/o adiciones de aminoácidos de tal forma que a) el activador de plasminogeno se puede dividir por la trombina y se convierte por tal segmentación en la forma de dos cadenas, b) la zimogenicidad es más alta por un factor de al menos 1.2 comparado con el activador de plasminogeno de humano y c) su enlace de fibrina se reduce hasta el punto que el activador de plasminogeno puede penetrar por más de 50% en un coágulo.
2. El activador de plasminogeno de conformidad a la reivindicación 1, caracterizado porque se modifica de tal modo que su facilidad para dividirse por la plasmida entre los aminoácidos Pl (275) y Pl'(276) se reduce por más de 10%, de manera preferible por más de 20%.
3. El activador de plasminogeno de conformidad a la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque de manera uniforme penetra un coágulo.
4. El activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-3, caracterizado porgue la región de aminoácido entre G 264 y A 288 se modifica de tal modo que el activador de plasminogeno se puede dividir por la trombina.
5. El activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque se modifican las regiones de aminoácido 459-471, 417-425 y/o los aminoácidos Q 475, K 505 y/o E 506.
6. El activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los aminoácidos G 265 y/o R 267 se modifican y/o al menos un aminoácido se inserta en la región entre 264 y 267.
7. El activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque se suprime el dominio finger.
8. El activador de plasminogeno de conformidad a la reivindicación 7, caracterizado porque el activador de plasminogeno solamente contiene el dominio proteasa o el dominio kringle 2 y el dominio proteasa del activador de plasminogeno tipo tejido de humano.
9. El uso de un activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-8 para producir una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas .
10. El proceso para la producción recombinante de un activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque una célula huésped procariótica o eucariótica se transforma con un vector el cual es capaz de expresar el activador de plasminogeno de tejido, esta célula se cultiva y es aislado el activador de plasminogeno.
11. La composición farmacéutica de un activador de plasminogeno de conformidad a las reivindicaciones 1-8 en una cantidad efectiva terapéuticamente y substancias, substancias de relleno o aditivos auxiliares farmacéuticas opcionalmente.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96112487.2 | 1996-08-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA99000966A true MXPA99000966A (es) | 1999-09-20 |
Family
ID=
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