JPH04126083A - プロテアーゼインヒビター遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物並びに該微生物を用いるプロテアーゼインヒビターの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、プロテアーゼインヒビターの遺伝子情報を担
うＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ新規ベクタ４該ベクタ
ーを導入した微生物、及び、該微生物を用いてプロテア
ーゼインヒビターを製造する方法に関する。

〈従来技術及び問題点〉 細胞内の蛋白質分解は、細胞内で起こる非常に多くの生
理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回転、外来性蛋白質
・ペプチドの分解、異常蛋白質の除去、細胞内小器管と
分泌蛋白質のプロセッシング、情報伝達、細胞増殖・分
化などの酵素反応あるいは調節に関与している。細胞内
は多数のコンパートメントからなる複雑な構造をしてお
り、直接、蛋白質分解に関与するプロテアーゼは厳密な
コントロールが必要となる。プロテアーゼインヒビター
はプロテアーゼの作用をただちに抑制する物質としてき
わめて有効であり１重要なプロテアーゼの制御系の一要
素である。

また微生物工業や発酵工業において、微生物が目的とす
る蛋白質をたとえ分泌生産しても、同時にプロテアーゼ
を生産する場合には、このプロテアーゼによって目的蛋
白質が分解されてしまう。

しかしながらこのような系においてプロテアーゼインヒ
ビターが存在すれば、プロテアーゼの作用が抑制され、
その結果として目的蛋白質が効率的に得られることにな
る。

プロテアーゼインヒビターは動物・植物・微生物界に広
く存在し、特にトリプシン、キモトリプシン、パパイン
に対応するインヒビターの存在が良くしられている。そ
の有用性が確認されつつあるが、まだ産業上必要な量を
供給する迄に至っていないのが現状である。

〈問題点を解決するための手段〉 プロテアーゼインヒビターの有利な製造方法を開発する
ため鋭意検討を進め、その結果、遺伝子工学による方法
に着目するに至った。

そして１本発明は、更に研究を進めた結果なされたもの
で、プロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ、更に、該ＤＮＡを組み込んだベクター、該ベ
クターを導入した形質転換体、該形質転換体を用いてプ
ロテアーゼインヒビターを製造する方法を開発する目的
でなされたものである。

本発明者らは、上記の目的を達成するため、先ずはじめ
にプロテアーゼインヒビター生産菌のスクリーニングを
行い、その結果、バチルス・プレビスが菌体外にプロテ
アーゼインヒビターを生産していることを見いだした。

具体的には、バチルス・プレビスとしてはバチルス・プ
レビス）ＩＰＤ３１　（バチルス・プレビス旧０２、Ｆ
ＥＲＮ　ＢＰ−１０８７）、バチルス・プレビス４７　
（ＦＥＲにＰ−７２２４）が例示される。

これらの知見にしたがい、本発明者らは、プロテアーゼ
インヒビター生産菌よりプロテアーゼインヒビター遺伝
子をクローン化するのに成功した。

そして更に該遺伝子をベクターに組み込んで宿主微生物
に導入し、得られた組み換え体微生物を培養することに
よりプロテアーゼインヒビターを生産させることにも成
功し、本発明を完成した。

以下、本発明を具体的に説明する。

１、本遺伝子のクローン化 プロテアーゼインヒビター生産能を有する微生物、動物
及び植物より染色体ＤＮＡを調整し、この染色体ＤＮＡ
を、適当な制限酵素で切断して得たＤＮＡ断片と、同様
にしてベクターを切断して得られたベクター断片とを、
例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、プ
ロテアーゼインヒビター遺伝子を含む組換えＤＮＡを形
成する。

具体的には、例えばバチルス属に属する菌株を培養し、
遠心分離等によって得られた菌体より染色体ＤＮＡを抽
出し、この染色体ＤＮＡを制限酵素（例えば５ａｕ３Ａ
Ｉ）を用いて部分分解する。このＤＮＡ断片をプラスミ
ドまたはファージを用いてサブクローニングする。サブ
クローニング用のベクターとしては、例えば多コピー・
プラスミド系のプラスミドベクターＰＢＲ３２２やｐｕ
ｃシリーズの他１本鎖ＤＮＡファージであるＭ１３ファ
ージのファージベクター等、サブクローニングに常用さ
れる各種ベクターが適宜使用される。

その結果得られたプラスミドについて、挿入断片の塩基
配列を決定する。そして、常法に従って組換えＤＮＡが
導入された形質転換体微生物を得るのである。

プロテアーゼインヒビター遺伝子の供与体としては上記
のバチルス属の菌株の他、プロテアーゼインヒビター生
産能を遺伝子組換えにより導入した形質転換微生物を供
与体微生物として利用することもできる。

本発明を実施するに際し、供与体微生物由来のＤＮＡは
、供与体微生物を、例えば、液体培地で約手〜３日間通
気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、
次いでこれを溶菌させることによって潤製することがで
きる。溶菌方法は、例えばリゾチームやβ−グルカナー
ゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超音波処理などが
用いられる。また、必要によりプロテアーゼ、リボヌク
レアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤が併用される。また凍結融解処理を施す
こともある。

このようにして得られる溶菌物からＤへＡを分離、精製
するには、常法にしたがって、例えばフェノール抽出、
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることによって行うことができる。

ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができる。切断後、必要に応
じてホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵素
が用いられる。また種々のリンカ−やアダプターを用い
ることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えることが
できる。

切断されたＤＮＡ断片から、蔗糖密度勾配遠心法や電気
泳動したゲルからの抽出等によって最適な長さの断片の
みが得られる。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るフ
ァージまたはプラスミドが適している。

ファージとしては、既知のものが適宜使用でき、例えば
、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）を宿主微生物とする場合には、　λファージやＭ
１３ファージなどが使用出来る。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア　コ
リを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ
１８、ｐＬＩｃ１１８やそれらの派生体などが使用でき
、バチルス　プレビスの場合には、ｐＵＢｌｌｏやそれ
らの派生体などが使用できる。

更に、例えば、エシェリヒア　コリ、バチルスプレビス
などの二種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例
えば、ｐ）ＩＹ３００ＰＬＫ、　ＹＩｐ５、ＹＥＰ１３
などのベクターのほか、各種の既知のシャトルベクター
を利用することも可能である。このようなベクターを、
　先に述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、ベ
クター断片を得る。

ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、
　　ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの後、
生体外で適当なりＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮ
Ａを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微
生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組
換えＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればどのよう
なものでもよい。

宿主微生物に組換えＤＮＡ　を導入する方法は、公知の
方法、例えば、宿主微生物がエシェリヒアコリの場合に
はカルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ。

ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、　；　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、　＋１９．１０７２゜（１９７４））
などを採用することができる。

λフアージＤＮＡであれば、イン　ビトロ　パッケイジ
フグ法（Ｈｏｒｎ、　Ｂ、；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

６８、２９９．　（１９７９））によりλフアージ粒子
を形成し。

このλフアージ粒子をエシェリヒア　コリの培養菌懸濁
液に添加して、プロテアーゼインヒビター生産能を保有
する特殊形質導入ファージを得ることができる。

宿主菌がバチルス　プレビスである場合、トリス−ＰＥ
Ｇ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｖ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ
＋Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．。

］５６．１１３０−１１３４（１９８３））またはＥｌ
ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法によって導入することが
できる（Ｔａｋａｇｉ＋　Ｉ’ｌ。

ｅｔ　　ａｌ；　　Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｊｏｌ、　　Ｃ
ｈｅｗ、、　　５３（１１）、　　３０９９−３１００
（１９８９））。

組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、液体選択培地で培養し、培養液中のプロテアーゼイン
ヒビター活性を測定する。液体選択培地にはベクター上
のマーカーによって、最小培地や、抗生物質添加培地が
適宜用いられる。

また、精製したプロテアーゼインヒビターを抗原として
得られた兎抗体登用いたコロニーイムノアッセイ（Ｄ、
　Ｍ、　Ｈｅｌｆｍａｎ　ｅｔａｌ　；　Ｐｒｏｃ、　
ＮａｔｌＬ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　８０．３ｌ−３５（
１９８３））で選択できる。

得られたプロテアーゼインヒビター生産菌を液体培地に
て３０℃で培養し、公知の方法、例えば、アルカリ抽出
法（Ｂｉｒｎｏｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ
、　Ｊ、；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　７
．１５１３．（１９７９））によってプラスミドを得る
ことができる。

プロテアーゼインヒビターを含む組換えＤＮＡは上記の
方法で、適宜制限酵素で切断し、他のベクターに組込ん
だり、他の宿主に導入することができる。

２、プロテアーゼインヒビターの調製 プロテアーゼインヒビターは、次のようにして調製する
ことができる。

すなわち上記により調製したプロテアーゼインヒビター
産生能を獲得した形質転換微生物を液体培養する。形質
転換微生物を培養する培地としては、微生物の通常の培
養に用いられるものであればいずれでもよいが、例えば
、炭素源としては澱粉、液体澱粉、グルコース、グリセ
リン、糖蜜、廃糖蜜なとがあり、窒素源としては各種蛋
白分解物、大豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩
、アンモニウム塩、酵母エキス、コーンステイープリカ
ーなどがある。その他、ビチオンなどの栄養素や微量金
属などが適宜利用される。

培養後、プロテアーゼインヒビターが菌体内にある場合
には、培養液を遠心分離して菌体を得、超音波や細胞壁
溶解酵素等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗
プロテアーゼインヒビター含有液とする。

また、プロテアーゼインヒビターが培地中にある場合に
は、培養液を遠心分離にて菌体を除き、以後の精製を行
う。

得られた粗プロテアーゼインヒビター含有液から、塩析
、透析、イオン交換樹脂、アフィニティークロマトグラ
フ処理等−射的な蛋白質精製法によりプロテアーゼイン
ヒビターを得ることができる。

次に本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例］。

プロテアーゼインヒビター遺伝子のクローン化バチ／ｌ
／ス　　プレビスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＮ　ＢＰ−１０
８７）　ヲ液体培地（グルコース１％、ペプトン１％、
酵母エキス０．２％、肉エキＸ０．５％、ｐＨ７，０）
チー夜振どう培養し、遠心分離にて集菌、洗浄し、得ら
れた菌体から、５ａｉｔｏ、　Ｍｉｕｒａの方法（Ｓａ
ｉｔｏ、　Ｈ，ａｎｄＭｉｕｒａ、　Ｋ、；　Ｂｉｏｃ
ｈｅ＋ｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７２．６
１９（１９６３））によって染色体ＤＮＡを分離し、こ
れにょリドリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵
素５ａｕ３Ａ　Ｉ　（宝酒造社製）を添加し、３７℃で
部分分解した後、分解物をアガロースゲル電気泳動し、
約２ｋｂ以上の染色体ＤＮＡ断片をゲルより分離抽出し
た。

ベクターはｐＵｃ１１８（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで
切断後、アルカリフォスファターゼで処理し、上記で得
た約２ｋｂ以上の染色体断片と混合後Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼで凍結処理し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ
を形質転換した。得られた形質転換株について、精製し
たプロテアーゼインヒビターを抗原として作製した兎抗
体を用いてコロニーイムノアッセイを行い、抗体と反応
する菌株を得た。

ここで得られたプラスミドＰＹＡＳＯＩを、更に第２図
に示す様にｐＹＡｓＯ］を制限酵素ＥｃｏＲＩ　、　Ｂ
ａｍＨＩ、Ｐｓｔ　Ｉで処理しｐＵｃ１１８またはｐＵ
ｃ１］９と連結後、各々大腸菌にサブクローニングする
ことにより、プラスミドＰＹＡＳＯ２、ｐＹＡｓＯ３、
ＰＹＡＳＯ４を得た。プラスミドｐ’／ＡＳＯ４が導入
されたエシェリヒア　コリは、プロテアーゼインヒビタ
ーを生産することが確認された。本菌株をエシェリヒア
　コリ　ｐＹＡｓＯ４と称する。

次いで、ｐＹＡｓＯ４の断片ＢａＩＩＩＨＩ　−Ｐｓｔ
　Ｉの１５１７ｂｐの塩基配列を決定した。塩基配列は
第１図に示される。第１図において、８３２の位置（Ｔ
ＴＣ：フェニルアラニン）から１４４６の位置（ＧＡＡ
　：グルタミン酸）までがプロテアーゼインヒビター活
性を示す。

アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列、７７８の位置（Ａ
ＣＣ：スレオニン）から１４４６の位置（ＧＡＡ　：グ
ルタミンａｌｌりまでが同様プロテアーゼインヒビター
活性を示す。アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列、５４
１の位置（ＡＣＣ：スレオニン）から１４４６の位置（
ＧＡＡ　：グルタミン酸）までが同様プロテアーゼイン
ヒビター活性を示すアミノ酸配列に対応する最長のＤＮ
Ａ配列であり、また、４６９の位ｆｌ（ＡＴＧ：メチオ
ニン）の翻訳開始点から１４４６の位置までがプロテア
ーゼインヒビターの構造遺伝子に対応するＤＮＡの配列
である。

また、第１図の塩基配列には、３９２〜３９７（ＴＴＧ
ＡＡＡ）、４１４〜４１９　（ＴＣＧＴＣＣ）に転写翼
部領域、４５４〜４５８　（ＧＧＡＧＧ）の翻訳調節領
域を含み、そして、且つ、４６９〜４７１（ＡＴＧ：メ
チオニン）に翻訳開始点を含んでいる。

実施例２゜ Ｂ＋ｂｒｅｖｉｓへの形質転換 エシェリヒア　コリ　ｐＹＡｓＯ４を３７℃で一夜培養
し、培養液を遠心分離し、集菌し、洗浄後、分離菌体か
らアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｏｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａ
ｎｄＤｏｌｙ、　Ｊ、；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、、　７．１５１３．（１９７９））によって
プラスミドｐＹＡｓＯ４を分離した。

このプラスミドにＢａｍＨＩ　＋　Ｈｉｎｄｌｎ　（宝
酒造社製）を添加し、３７℃で反応させることにより切
断し、ＢａｍＨＩ　−ＨｌｎｄＩ［Ｔ　１．５ｋｂの断
片を得た。

別に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓで発現可能なベ
クターＰＮＨ３００をＢａｍＨＩ　、　Ｈｉｎｄｍ　（
宝酒造社製）で切断後、アルカリフォスファターゼ（宝
酒造社製）で処理し、これにプロテアーゼインヒビター
遺伝子を含むＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄｍ　１．５ｋｂの
断片を混合し、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
で連結処理し、エレクトロポーレション法（Ｔａｋａｇ
ｉ、　ｈ、Ｉ　ｅｔ　ａｌ；　Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　５３（１１）、　３０９９
（１９８９））によりＢａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ　
１（ＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）１
１０２　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０８７）に形質転換し、形
質転換株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｊｓＨＰＤ３１−
５５／ｐＹｓＯ１を得た。

なお、ベクターｐＮＨ３００の作製は、以下の様に行っ
た。　ｐＮＬＩ２００（Ｙａｍａｇａｔａ、　Ｈ，ｅｔ
　ａｌ、；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．３５８９〜３５
９３．１９８９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理後、Ｋｌ
ｅｎｏｗ酵素を用いて切断部分（粘着末端）を埋めた後
（ｆｉｌｌ　ｉｎ）制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍで処理し、Ｂ
、　ｂｒｅｖｉｓ　４７のＭＶＰ　（７）プｏモーター
及びシグナルペプチドの一部を含む３５０ｂｐ断片を得
た。ｐＢＡＭｌｏｌ（Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ、Ｎ、　ｅ
ｔ　ａｌ、；　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６４．
１１８２〜１１８７．１９８５）を制限酵素Ｂａｇ）ｉ
　Ｉで処理後、　Ｋｌｅｎｏｔｉ酵素を用いて切断部分
を埋め、次いで制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍで処理し、３．３
ｋｂ断片を得、これと先に得た３５０ｂｐ断片をＴ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　
ＨＰＤ３１を形質転換し、　２断片の結かったプラスミ
ドｐＮＨ３００を得た。

実施例３゜ プロテアーゼインヒビターの生産 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　ＨＰＤ３１−５５／
ｐＹｓＯ１をネオマイシン（６０ｐ　ｇ／ｍＱ）を含む
Ｔ２液体培地２００ｍＱ（グルコース１％、ペプトン１
％、酵母エキス０．２％、肉エキス０．５％、ｐＨ７，
０）で３０℃、３日間培養後、遠心分離することにより
菌体を除き、培養上澄１８ｏ」Ωを得た。この培養液の
プロテアーゼインヒビター活性を測定したところ１１０
０ｕ／ｍＱの活性を示した。

プロテアーゼインヒビター活性は、０．０１Ｍの塩化カ
ルシウムを含む０．１Ｍ　トリス・塩酸（ρｌ（７，５
）緩衝液６００μρ、プロテアーゼインヒビターを含有
する試料１０μΩ、トリプシン（２００μｇＩｒｎＱｍ
液）５μΩを混合、５分後、基質（０，０２Ｍ　Ｎ−ｂ
ｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｊｔｒｏ
ａｎＨｉｄｅ）１０　μｎを加え、直ちに４０５ｒ＋ｍ
の吸光度を測定する。

対照としてプロテアーゼインヒビターを含まない時の活
性（ＯＤ値の増加）を測定し、１μｇのトリプシンの活
性を５０％抑える時のプロテアーゼインヒビターの量を
１　ｕｎｉｔとして示した。

この上澄液に０．８飽和になるように硫安を加え。

遠心分離することによって沈殿画分を集めた。この沈殿
画分を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｌ（ｐＨ７，５）緩
衝液で溶解し、同一の緩衝液に対し透析した。この透析
により脱塩後の試料をＤＥＡＥ−セルロースに吸着後、
０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配により溶出し、プロテアー
ゼインヒビターの活性画分を集めた・ この活性画分に更に０．８飽和になるように硫安を加え
、沈殿画分を遠心で集め２０１１ｆｉＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）に溶解し、０．ＩＭ　ＮａＣ１含有２
０ｍＭ　トリス緩衝液で平衡化したトヨパール−ＨＷ−
５５によるゲル濾過クロマトグラフィーによってプロテ
アーゼ活性部分を集めた。集めた活性画分は培養上澄か
ら約３００倍精製されほぼ純粋のインヒビターを得た。

〈発明の効果〉 本発明によって、プロテアーゼインヒビターを大量に生
産することがはじめて可能となった。

したがって、本発明は、プロテアーゼ制御系の解明に有
用であるばかりでなく、医薬としての利用も大いに期待
することができる。またこのインヒビターを利用すれば
、微生物利用工業において分泌生産された目的とする蛋
白質がプロテアーゼによって破壊変成することがなくな
るので、従来得られなかったりあるいは充分量得ること
ができなかった蛋白質も自由に得ることも可能となる。

また本発明に係るプロテアーゼインヒビター遺伝子を各
種微生物に導入することにより、該微生物が生産するプ
ロテアーゼが不活化され、もって構造遺伝子の発現がき
わめて効率的に行われる。

その結果、目的とする蛋白質を著量生産できるようにな
るばかりでなく、プロテアーゼによって破壊されていた
蛋白質も生産可能となり、従来未知の生理活性物質が発
現される可能性も非常に高くなる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプロテアーゼインヒビター遺伝子を含む塩基配
列を示し、第２図はベクター、ＰＹＡＳＯＩ〜０４のフ
ィジカルマツプを示す。 代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）プロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子。 （２）第１図の塩基配列で示される８３２の位置（ＴＴ
   Ｃ：フェニルアラニン）から始まり最終位置１４４４の
   位置（ＧＡＡ：グルタミン酸）で終了するプロテアーゼ
   インヒビターのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列。 （３）第１図の塩基配列で示される７７７の位置（ＡＣ
   Ｃ：スレオニン）から始まり最終位置１４４４の位置（
   ＧＡＡ：グルタミン酸）で終了するプロテアーゼインヒ
   ビターのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列。 （４）第１図の塩基配列で示される５４１の位置（ＡＣ
   Ｃ：スレオニン）から始まり最終位置１４４４の位置（
   ＧＡＡ：グルタミン酸）で終了するプロテアーゼインヒ
   ビターのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列。 （５）第１図の塩基配列で示される４６９の位置（ＡＴ
   Ｇ：メチオニン）の翻訳開始点から始まり、最終位置１
   ４４４の位置（ＧＡＡ：グルタミン酸）で終了するプロ
   テアーゼインヒビターの構造遺伝子に対応するＤＮＡ配
   列。 （６）第１図の塩基配列で示される３９２〜３９７（Ｔ
   ＴＧＡＡＡ）、４１４〜４１９（ＴＣＧＴＣＣ）の転写
   調節領域、４５４〜４５８（ＧＧＡＧＧ）の翻訳調節領
   域を含みそして、かつ、４６９〜４７１（ＡＴＧ：メチ
   オニン）の位置の翻訳開始点を含み、そして、更に５４
   １の位置から始まり２４５１で終了するアミノ酸組成に
   対応するＤＮＡ配列。（７）最初のコドンＧＧＡから最
   終コドンＣＡＧに至る第１図に示したＤＮＡ配列。 （８）第２図に示した制限酵素切断地図で示すＤＮＡ断
   片、ｐＹＡＳ０１、ｐＹＡＳ０２、ｐＹＡＳ０３及び／
   又はｐＹＡＳ０４。 （９）第２図に示した制限酵素切断地図で示すＤＮＡ断
   片を含む形質転換体。 （１０）第２図に示した制限酵素切断地図で示すＤＮＡ
   断片を含む形質転換体を培養することによりプロテアー
   ゼインヒビターを生産させることを特徴とするプロテア
   ーゼインヒビターの製造法。