JPH0156756B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0156756B2 JPH0156756B2 JP58165066A JP16506683A JPH0156756B2 JP H0156756 B2 JPH0156756 B2 JP H0156756B2 JP 58165066 A JP58165066 A JP 58165066A JP 16506683 A JP16506683 A JP 16506683A JP H0156756 B2 JPH0156756 B2 JP H0156756B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- bacillus brevis
- pub110
- dna
- bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 53
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical group 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドを用いてバチルス・ブレビ
スを形質転換する方法に関する。 バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）は表
層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。 本発明者らは、バチルス・ブレビスのこのよう
な性質に着目し、本菌は組換えDNAの受容菌と
して好適なものであると考えた。 しかるに、これまでにバチルス・ブレビスにお
いてはコピー数の多いプラスミドは見出されてい
ない。このような事情のため、バチルス・ブレビ
スのDNA受容菌としてのすぐれた性質は利用さ
れていなかつた。 そこで、バチルス・ブレビス細胞内でよく増殖
できるプラスミドベクターの開発が強く要望され
ている。 本発明者らは、スタフイロコツカス・アウレウ
ス由来のプラスミドであつてバチルス・ズブチリ
スを宿主とするベクターとして広く使用されてい
るpUB１１０（Gryczan、T.J.、S.Contente
and D.Dubnau（1978）J.Bacteriol.134、318−
329）に注目し、このプラスミドベクターpUB１
１０を用いてバチルス・ブレビスを形質転換した
ところ、pUB１１０はバチルス・ブレビス細胞
内で極めてよく増殖することならびに該プラスミ
ドpUB１１０に外来遺伝子を挿入し、このプラ
スミドを用いてバチルス・ブレビスを形質転換せ
しめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく
発現することを見出した。 本発明はバチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝
液で処理した後にバチルス・ブレビスの細胞内に
プラスミドpUB１１０のドライブユニツト領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを
特徴とするバチルス・ブレビスの形質転換方法を
提供するものである。 ここで、ドライブユニツト領域とはori領域と
同義であり、宿主細胞内でプラスミドが増殖しう
る機能を司るDNA領域を意味する。本発明にお
いてプラスミドpUB１１０のドライブユニツト
領域を少なくとも有するプラスミドとしてドライ
ブユニツト領域のほかに薬剤耐性などの宿主細胞
内に導入されたときに、その宿主を形質転換して
当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出
来るようにするための、いわゆるマーカー遺伝子
が含まれているものを用いることが望ましい。さ
らに、プロモーター配列を入れておくこともで
き、そのほか発現させるべき蛋白質をコードする
遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌せしめるに必要な
DNAなどが挿入されていてもよい。すなわち、
これらマーカー遺伝子、プロモーター配列、外来
遺伝子および／または蛋白質分泌のためのDNA
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明に
おけるプラスミドに含まれるものである。 本発明に用いるpUB１１０由来の新しいプラ
スミドは具体的には次のようなものがある。すな
わち、第１図に制限酵素切断地図を示したプラス
ミドpEB−２はpUB１１０とpBR３２２を結合
したものであり、大腸菌（E.coli）とバチルス・
ブレビス（BaCillus brevis）におけるシヤトル
ベクターであり、いずれの細菌においてもコピー
数が多いという特色がある。図中、Amprはアン
ピシリン耐性、Tcrはテトラサイクリン耐性、
Nmrはネオマイシン耐性を示す。第２図に、本
発明に用いる新しいプラスミドであるPEB−３
およびpHT−１の制限酵素切断地図およびその
造成経過を示す。pHT−１はpUB１１０と同様
にバチルス・ブレビスでコピー数の多いプラスミ
ドであり、ネオマイシン耐性遺伝子（Nmr）の
ほかにエリスロマイシン耐性遺伝子（Emr）を含
んでいる。さらに、pUB１１０DNAに存在した
制限酵素切断部位以外にHindにより１個所切
断される部位をもつている。また、pUB１１０
とα−アミラーゼを結合させて得たプラスミド
pBAM−１０２の制限酵素切断地図を第３図に
示す。 上記各プラスミドを導入した大腸菌およびバチ
ルス・ブレビスはいずれも微工研に寄託されてお
り菌株名と寄託番号は以下の通りである。 【表】 本発明において宿主として用いるバチルス・ブ
レビスにはたとえばバチルス・ブレビス４７
（FERM−7224）のほかバチルス・ブレビス４８
１，１４４，８９９などがある。また、プラスミ
ドベクターの例としては上記した４種類のプラス
ミドがある。 バチルス・ブレビスを形質転換する方法として
は以下のような方法がある。 高滲透圧液（高張溶液とも云う。）に浮遊した
細胞にリゾチームを作用させて生じたプロトプラ
スト（細胞壁を失なつた裸の細胞）にポリエチレ
ングリコールを用いてプラスミドDNAを導入す
る方法もあるが、本発明では、後述するように、
アルカリ性緩衝液、たとえばアルカリ性トリス塩
酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除去した細胞
（細胞壁の蛋白質のみを失なつた細胞）にポリエ
チレングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入する方法が好ましい。 本発明のプラスミドを用いることによつてバチ
ルス・ブレビスを容易に形質転換することができ
る。このバチルス・ブレビスは蛋白質を菌体外に
多量に生産する能力を有しており、しかもプロテ
アーゼ活性がないので、生成した蛋白質が分解さ
れない。したがつて、動物、植物および微生物由
来の遺伝子を組込んだ場合、その遺伝子の有する
遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生成した蛋
白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、本
発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチル
ス・ブレビスの培養は通常のバチルス・ブレビス
の培養と同じ方法で行なえばよい。 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ 第２図に示したように、プラスミドpHC７９
（Hohn、B.and Collins、J.（1980）Gene11、291
−298）とプラスミドpUB１１０（Gryczan、T.
J.、S.Contente and D.Dubnau（1978）J.
Bacteriol.134、318−329）とをEcoR部位で結
合したものをHind、Claで切断し、これに
Hind、Claで切断して得たプラスミドpHW
１（Horinouchi、Ｓ and B.Weisblum（1982）
J.Bacteriol.150、804−814）由来のエリスロマイ
シン耐性遺伝子を挿入することによつてシヤトル
ベクターpEB３を得た。 次いで、このプラスミドpEB３から6.9Kbの
BamH断片を除去することによりプラスミド
pHT−１を得た。 実施例 ２ プラスミドpBR３２２とプラスミドpUB１１
０を用い、実施例１と同様にしてこれらをEcoR
部位で結合することにより、第１図に示したプ
ラスミドpEB２を得た。 実施例 ３ (1) 好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離 バチルス・ステアロサーモフイラス（B.
stearothermophilus）DY−５の好熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpHI３０１よ
りα−アミラーゼ遺伝子を以下のようにして調
製した。 プラスミドpHI３０１（特願昭58−50148号
明細書参照）を制限酵素EcoRで部分的に加
水分解後、再びBamHで部分的に加水分解
し、種々の長さのDNAを調製し、これをα−
アミラーゼ遺伝子として用いた。 (2) バチルス・ズブチリスとバチルス・ブレビス
４７への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクロー
ニング ベクター・プラスミドとしてpUB１１０を
用いた。まず、プラスミドpUB１１０を制限
酵素EcoRおよびBamHで切断し、5′未満
のリン酸基をバクテリアル・アルカリ・ホスフ
アターゼ処理により除去し、線状プラスミド
pUB１１０を調製した。 前記好熱性アミラーゼDNAと線状プラスミ
ドpUB１１０を混合し、T4DNAリガーゼで両
DNAを連結した。 連結したDNAを枯草菌（B.subtilis）1A２
８９（α−アミラーゼ陰性株）にChang、S.
and Cohen、S.N.のプロトプラスト法
（Molec.Gen.Genet.168、111−115（1979））で
形質転換し、カナマイシン耐性により多数の形
質転換株を得た。これらの形質転換株を１％可
溶性デンプンと10μｇ／mlカナマイシンを含む
Difco Antibiotic medium ３ プレート上に
レプリカし、１夜培養後、ヨードデンプン反応
によりコロニーの周辺が無色になつているもの
を検索することによつてα−アミラーゼ生産株
を選択した。第３図はα−アミラーゼ遺伝子の
入つたプラスミドpBAM−１０２の制限酵素
切断地図である。 上記α−アミラーゼ遺伝子の入つたプラスミ
ドを有する枯草菌よりプラスミドをBirnboim、
H.C.and Doly、J.の方法（Nucleic Acids
Res.、７、1513−1523（1979））により抽出し、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド超
遠心分離法でさらにプラスミドDNAを精製し
たのちバチルス・ブレビス４７菌の形質転換に
使用した。 まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩衝液に
よる処理によつてバチルス・ブレビスの表層蛋
白質を除去し、残されたペプチドグリカン層と
細胞質膜によつてのみ囲まれた細胞にポリエチ
レングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入した。すなわち、T2培地に前培養したバチ
ルス・ブレビスの菌液を新しいT2培地５mlに
100分の１希釈し、37℃で振とう培養を行ない、
対数増殖後期（O.D.660nｍ＝1.9）に達したと
き、菌体を遠心（3000ｇ、５分、室温）によつ
て集め、50ｍＭのトリス塩酸緩衝液（PH7.5）
５mlにより洗浄した後、50ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（PH8.5）に懸濁し、37℃で振とうした。
60分後、菌体を遠心（3000ｇ、５分、室温）に
よつて集め、0.5mlのTP培地（0.953％
KH2PO4、0.426％Na2HPO4、0.5％肉エキス、
１％ポリペプトン、0.2％酵母エキス、１％グ
ルコース）に懸濁した。これにプラスミド
DNA溶液（10ｍＭトリス塩酸緩衝液、PH7.5、
１ｍＭ EDTA）とTP培地の１：１混合液
100μを加えて混合した。次いで、直ちに40
％ポリエチレングリコール溶液（0.953％
KH2PO4、0.426％Na2HPO4、40％（ｗ／ｖ）
ポリエチレングリコールPEG6000）1.5mlを加
えて撹拌し、37℃で10分間振とうした。しかる
後、遠心（3000ｇ、５分、室温）により菌体を
集め、20ｍMMgCl2を添加したT2培地に懸濁
した。37℃で150分間振とうした後、形質転換
体選択用の寒天培地（60μｇ／mlのネオマイシ
ンを含むT2培地プレート（ポリペプトン１％、
肉エキス0.5％、酵母エキス0.2％、グルコース
１％、ウラシル0.01％、PH７））に0.1mlずつ散
布した。37℃で30時間培養してネオマイシン耐
性株を得た。これらの形質転換株を１％可溶性
デンプンと60μｇ／mlネオマイシンを含むT2培
地プレート上にレプリカし、１夜培養後、ヨー
ドデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
つたものを検索することによつてα−アミラー
ゼ生産株（バチルス・ブレビス４７／pBAM
−１０２（FERM Ｐ−7225））を選択した。 (3) α−アミラーゼの生産性 第３図に示すプラスミドを有する枯草菌なら
びにバチルス・ブレビス４７菌を60μｇ／mlネ
オマイシンまたは10μｇ／mlカナマイシンを含
むT2液体培地に接種し、37℃で22時間培養し、
遠心分離により培養濾液を調製して培養濾液中
のα−アミラーゼ活性を不破の方法（J.
Biochem.41、583−603（1954））により40℃で
測定した。結果を第１表に示す。 【表】 枯草菌およびバチルス・ブレビス４７菌で作
られるα−アミラーゼはすべて菌体外に分泌さ
れ、耐熱性を示した。第１表に示したように、
α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラスミドの
存在によつてバチルス・ブレビス４７菌を宿主
とした場合には、枯草菌におけるよりも約10倍
に及ぶ多量のα−アミラーゼが生産された。
スを形質転換する方法に関する。 バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）は表
層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。 本発明者らは、バチルス・ブレビスのこのよう
な性質に着目し、本菌は組換えDNAの受容菌と
して好適なものであると考えた。 しかるに、これまでにバチルス・ブレビスにお
いてはコピー数の多いプラスミドは見出されてい
ない。このような事情のため、バチルス・ブレビ
スのDNA受容菌としてのすぐれた性質は利用さ
れていなかつた。 そこで、バチルス・ブレビス細胞内でよく増殖
できるプラスミドベクターの開発が強く要望され
ている。 本発明者らは、スタフイロコツカス・アウレウ
ス由来のプラスミドであつてバチルス・ズブチリ
スを宿主とするベクターとして広く使用されてい
るpUB１１０（Gryczan、T.J.、S.Contente
and D.Dubnau（1978）J.Bacteriol.134、318−
329）に注目し、このプラスミドベクターpUB１
１０を用いてバチルス・ブレビスを形質転換した
ところ、pUB１１０はバチルス・ブレビス細胞
内で極めてよく増殖することならびに該プラスミ
ドpUB１１０に外来遺伝子を挿入し、このプラ
スミドを用いてバチルス・ブレビスを形質転換せ
しめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく
発現することを見出した。 本発明はバチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝
液で処理した後にバチルス・ブレビスの細胞内に
プラスミドpUB１１０のドライブユニツト領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを
特徴とするバチルス・ブレビスの形質転換方法を
提供するものである。 ここで、ドライブユニツト領域とはori領域と
同義であり、宿主細胞内でプラスミドが増殖しう
る機能を司るDNA領域を意味する。本発明にお
いてプラスミドpUB１１０のドライブユニツト
領域を少なくとも有するプラスミドとしてドライ
ブユニツト領域のほかに薬剤耐性などの宿主細胞
内に導入されたときに、その宿主を形質転換して
当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出
来るようにするための、いわゆるマーカー遺伝子
が含まれているものを用いることが望ましい。さ
らに、プロモーター配列を入れておくこともで
き、そのほか発現させるべき蛋白質をコードする
遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌せしめるに必要な
DNAなどが挿入されていてもよい。すなわち、
これらマーカー遺伝子、プロモーター配列、外来
遺伝子および／または蛋白質分泌のためのDNA
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明に
おけるプラスミドに含まれるものである。 本発明に用いるpUB１１０由来の新しいプラ
スミドは具体的には次のようなものがある。すな
わち、第１図に制限酵素切断地図を示したプラス
ミドpEB−２はpUB１１０とpBR３２２を結合
したものであり、大腸菌（E.coli）とバチルス・
ブレビス（BaCillus brevis）におけるシヤトル
ベクターであり、いずれの細菌においてもコピー
数が多いという特色がある。図中、Amprはアン
ピシリン耐性、Tcrはテトラサイクリン耐性、
Nmrはネオマイシン耐性を示す。第２図に、本
発明に用いる新しいプラスミドであるPEB−３
およびpHT−１の制限酵素切断地図およびその
造成経過を示す。pHT−１はpUB１１０と同様
にバチルス・ブレビスでコピー数の多いプラスミ
ドであり、ネオマイシン耐性遺伝子（Nmr）の
ほかにエリスロマイシン耐性遺伝子（Emr）を含
んでいる。さらに、pUB１１０DNAに存在した
制限酵素切断部位以外にHindにより１個所切
断される部位をもつている。また、pUB１１０
とα−アミラーゼを結合させて得たプラスミド
pBAM−１０２の制限酵素切断地図を第３図に
示す。 上記各プラスミドを導入した大腸菌およびバチ
ルス・ブレビスはいずれも微工研に寄託されてお
り菌株名と寄託番号は以下の通りである。 【表】 本発明において宿主として用いるバチルス・ブ
レビスにはたとえばバチルス・ブレビス４７
（FERM−7224）のほかバチルス・ブレビス４８
１，１４４，８９９などがある。また、プラスミ
ドベクターの例としては上記した４種類のプラス
ミドがある。 バチルス・ブレビスを形質転換する方法として
は以下のような方法がある。 高滲透圧液（高張溶液とも云う。）に浮遊した
細胞にリゾチームを作用させて生じたプロトプラ
スト（細胞壁を失なつた裸の細胞）にポリエチレ
ングリコールを用いてプラスミドDNAを導入す
る方法もあるが、本発明では、後述するように、
アルカリ性緩衝液、たとえばアルカリ性トリス塩
酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除去した細胞
（細胞壁の蛋白質のみを失なつた細胞）にポリエ
チレングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入する方法が好ましい。 本発明のプラスミドを用いることによつてバチ
ルス・ブレビスを容易に形質転換することができ
る。このバチルス・ブレビスは蛋白質を菌体外に
多量に生産する能力を有しており、しかもプロテ
アーゼ活性がないので、生成した蛋白質が分解さ
れない。したがつて、動物、植物および微生物由
来の遺伝子を組込んだ場合、その遺伝子の有する
遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生成した蛋
白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、本
発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチル
ス・ブレビスの培養は通常のバチルス・ブレビス
の培養と同じ方法で行なえばよい。 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ 第２図に示したように、プラスミドpHC７９
（Hohn、B.and Collins、J.（1980）Gene11、291
−298）とプラスミドpUB１１０（Gryczan、T.
J.、S.Contente and D.Dubnau（1978）J.
Bacteriol.134、318−329）とをEcoR部位で結
合したものをHind、Claで切断し、これに
Hind、Claで切断して得たプラスミドpHW
１（Horinouchi、Ｓ and B.Weisblum（1982）
J.Bacteriol.150、804−814）由来のエリスロマイ
シン耐性遺伝子を挿入することによつてシヤトル
ベクターpEB３を得た。 次いで、このプラスミドpEB３から6.9Kbの
BamH断片を除去することによりプラスミド
pHT−１を得た。 実施例 ２ プラスミドpBR３２２とプラスミドpUB１１
０を用い、実施例１と同様にしてこれらをEcoR
部位で結合することにより、第１図に示したプ
ラスミドpEB２を得た。 実施例 ３ (1) 好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離 バチルス・ステアロサーモフイラス（B.
stearothermophilus）DY−５の好熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpHI３０１よ
りα−アミラーゼ遺伝子を以下のようにして調
製した。 プラスミドpHI３０１（特願昭58−50148号
明細書参照）を制限酵素EcoRで部分的に加
水分解後、再びBamHで部分的に加水分解
し、種々の長さのDNAを調製し、これをα−
アミラーゼ遺伝子として用いた。 (2) バチルス・ズブチリスとバチルス・ブレビス
４７への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクロー
ニング ベクター・プラスミドとしてpUB１１０を
用いた。まず、プラスミドpUB１１０を制限
酵素EcoRおよびBamHで切断し、5′未満
のリン酸基をバクテリアル・アルカリ・ホスフ
アターゼ処理により除去し、線状プラスミド
pUB１１０を調製した。 前記好熱性アミラーゼDNAと線状プラスミ
ドpUB１１０を混合し、T4DNAリガーゼで両
DNAを連結した。 連結したDNAを枯草菌（B.subtilis）1A２
８９（α−アミラーゼ陰性株）にChang、S.
and Cohen、S.N.のプロトプラスト法
（Molec.Gen.Genet.168、111−115（1979））で
形質転換し、カナマイシン耐性により多数の形
質転換株を得た。これらの形質転換株を１％可
溶性デンプンと10μｇ／mlカナマイシンを含む
Difco Antibiotic medium ３ プレート上に
レプリカし、１夜培養後、ヨードデンプン反応
によりコロニーの周辺が無色になつているもの
を検索することによつてα−アミラーゼ生産株
を選択した。第３図はα−アミラーゼ遺伝子の
入つたプラスミドpBAM−１０２の制限酵素
切断地図である。 上記α−アミラーゼ遺伝子の入つたプラスミ
ドを有する枯草菌よりプラスミドをBirnboim、
H.C.and Doly、J.の方法（Nucleic Acids
Res.、７、1513−1523（1979））により抽出し、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド超
遠心分離法でさらにプラスミドDNAを精製し
たのちバチルス・ブレビス４７菌の形質転換に
使用した。 まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩衝液に
よる処理によつてバチルス・ブレビスの表層蛋
白質を除去し、残されたペプチドグリカン層と
細胞質膜によつてのみ囲まれた細胞にポリエチ
レングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入した。すなわち、T2培地に前培養したバチ
ルス・ブレビスの菌液を新しいT2培地５mlに
100分の１希釈し、37℃で振とう培養を行ない、
対数増殖後期（O.D.660nｍ＝1.9）に達したと
き、菌体を遠心（3000ｇ、５分、室温）によつ
て集め、50ｍＭのトリス塩酸緩衝液（PH7.5）
５mlにより洗浄した後、50ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（PH8.5）に懸濁し、37℃で振とうした。
60分後、菌体を遠心（3000ｇ、５分、室温）に
よつて集め、0.5mlのTP培地（0.953％
KH2PO4、0.426％Na2HPO4、0.5％肉エキス、
１％ポリペプトン、0.2％酵母エキス、１％グ
ルコース）に懸濁した。これにプラスミド
DNA溶液（10ｍＭトリス塩酸緩衝液、PH7.5、
１ｍＭ EDTA）とTP培地の１：１混合液
100μを加えて混合した。次いで、直ちに40
％ポリエチレングリコール溶液（0.953％
KH2PO4、0.426％Na2HPO4、40％（ｗ／ｖ）
ポリエチレングリコールPEG6000）1.5mlを加
えて撹拌し、37℃で10分間振とうした。しかる
後、遠心（3000ｇ、５分、室温）により菌体を
集め、20ｍMMgCl2を添加したT2培地に懸濁
した。37℃で150分間振とうした後、形質転換
体選択用の寒天培地（60μｇ／mlのネオマイシ
ンを含むT2培地プレート（ポリペプトン１％、
肉エキス0.5％、酵母エキス0.2％、グルコース
１％、ウラシル0.01％、PH７））に0.1mlずつ散
布した。37℃で30時間培養してネオマイシン耐
性株を得た。これらの形質転換株を１％可溶性
デンプンと60μｇ／mlネオマイシンを含むT2培
地プレート上にレプリカし、１夜培養後、ヨー
ドデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
つたものを検索することによつてα−アミラー
ゼ生産株（バチルス・ブレビス４７／pBAM
−１０２（FERM Ｐ−7225））を選択した。 (3) α−アミラーゼの生産性 第３図に示すプラスミドを有する枯草菌なら
びにバチルス・ブレビス４７菌を60μｇ／mlネ
オマイシンまたは10μｇ／mlカナマイシンを含
むT2液体培地に接種し、37℃で22時間培養し、
遠心分離により培養濾液を調製して培養濾液中
のα−アミラーゼ活性を不破の方法（J.
Biochem.41、583−603（1954））により40℃で
測定した。結果を第１表に示す。 【表】 枯草菌およびバチルス・ブレビス４７菌で作
られるα−アミラーゼはすべて菌体外に分泌さ
れ、耐熱性を示した。第１表に示したように、
α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラスミドの
存在によつてバチルス・ブレビス４７菌を宿主
とした場合には、枯草菌におけるよりも約10倍
に及ぶ多量のα−アミラーゼが生産された。
第１図は本発明のプラスミドpEB−２の制限酵
素切断地図、第２図は本発明のプラスミドpEB−
３およびpHT−１の制限酵素切断地図およびこ
れらプラスミドの造成経過を示すものである。第
３図は本発明のプラスミドpBAM−１０２の制
限酵素切断地図である。
素切断地図、第２図は本発明のプラスミドpEB−
３およびpHT−１の制限酵素切断地図およびこ
れらプラスミドの造成経過を示すものである。第
３図は本発明のプラスミドpBAM−１０２の制
限酵素切断地図である。
Claims (1)
- １ バチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝液で処
理した後にバチルス・ブレビスの細胞内にプラス
ミドpUB１１０のドライブユニツト領域を少な
くとも有するプラスミドを導入することを特徴と
するバチルス・ブレビスの形質転換方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6058074A JPS6058074A (ja) | 1985-04-04 |
| JPH0156756B2 true JPH0156756B2 (ja) | 1989-12-01 |
Family
ID=15805214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58165066A Granted JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6058074A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07108224B2 (ja) * | 1985-11-07 | 1995-11-22 | 重三 鵜高 | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 |
| EP0919623A3 (en) * | 1997-11-17 | 1999-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Procedure and kit for cloning of DNA fragments |
| EP0916733A1 (de) * | 1997-11-17 | 1999-05-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten |
| DE602004025838D1 (de) | 2003-11-11 | 2010-04-15 | Higeta Shoyu Kk | Neuer brevibacillus choshinensis sowie verfahren zur herstellung von protein unter verwendung der mikrobe als wirt |
| EP1767640A4 (en) | 2004-07-06 | 2008-03-26 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PREPARING A PROTEIN-A-like PROTEIN USING A BACTERIUM OF THE GENUS BREVIBACILLUS |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58165066A patent/JPS6058074A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6058074A (ja) | 1985-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5217878A (en) | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes | |
| AU570709B2 (en) | Cloning and expression in industrial species | |
| EP0283075B1 (en) | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes | |
| EP0127328A2 (en) | The use of chromosomal integration to stabilize heterologous genes | |
| EP0686195B1 (en) | Method and system for enhanced production of commercially important exoproteins in gram-positive bacteria | |
| JP2727391B2 (ja) | 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| US5017477A (en) | Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene | |
| US6083718A (en) | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them | |
| Tanaka et al. | prtR enhances the mRNA level of the Bacillus subtilis extracellular proteases | |
| JPH0156756B2 (ja) | ||
| US5238833A (en) | Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species | |
| EP0149241B1 (en) | Dna base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant dna including the whole or a part of the dna base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant dna | |
| IE863080L (en) | Expression in lactic acid bacteria | |
| US5084383A (en) | Bacillus subtilis strain whose extracellular protease activities are reduced, method for obtaining the strain and method for secreting proteins by using the strain | |
| JPH05284973A (ja) | 組換プラスミドおよびこれをベクターとして用いる異種蛋白質の分泌生産方法 | |
| EP1555320B1 (en) | Expression system derived from the lipase regulation cascade of Pseudomonas alcaligenes | |
| JPS592690A (ja) | Ｄｎａフラグメント | |
| JPS61181374A (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| JPH0634720B2 (ja) | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 | |
| JP2537764B2 (ja) | 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 | |
| JPS61166400A (ja) | 蛋白生産の方法 | |
| JPS60145090A (ja) | Ｄνａ | |
| WO1988006622A1 (en) | Stable expression vectors |