JPH0156756B2 - - Google Patents
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- JPH0156756B2 JPH0156756B2 JP58165066A JP16506683A JPH0156756B2 JP H0156756 B2 JPH0156756 B2 JP H0156756B2 JP 58165066 A JP58165066 A JP 58165066A JP 16506683 A JP16506683 A JP 16506683A JP H0156756 B2 JPH0156756 B2 JP H0156756B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドを用いてバチルス・ブレビ
スを形質転換する方法に関する。 バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)は表
層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。 本発明者らは、バチルス・ブレビスのこのよう
な性質に着目し、本菌は組換えDNAの受容菌と
して好適なものであると考えた。 しかるに、これまでにバチルス・ブレビスにお
いてはコピー数の多いプラスミドは見出されてい
ない。このような事情のため、バチルス・ブレビ
スのDNA受容菌としてのすぐれた性質は利用さ
れていなかつた。 そこで、バチルス・ブレビス細胞内でよく増殖
できるプラスミドベクターの開発が強く要望され
ている。 本発明者らは、スタフイロコツカス・アウレウ
ス由来のプラスミドであつてバチルス・ズブチリ
スを宿主とするベクターとして広く使用されてい
るpUB110(Gryczan、T.J.、S.Contente
and D.Dubnau(1978)J.Bacteriol.134、318−
329)に注目し、このプラスミドベクターpUB1
10を用いてバチルス・ブレビスを形質転換した
ところ、pUB110はバチルス・ブレビス細胞
内で極めてよく増殖することならびに該プラスミ
ドpUB110に外来遺伝子を挿入し、このプラ
スミドを用いてバチルス・ブレビスを形質転換せ
しめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく
発現することを見出した。 本発明はバチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝
液で処理した後にバチルス・ブレビスの細胞内に
プラスミドpUB110のドライブユニツト領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを
特徴とするバチルス・ブレビスの形質転換方法を
提供するものである。 ここで、ドライブユニツト領域とはori領域と
同義であり、宿主細胞内でプラスミドが増殖しう
る機能を司るDNA領域を意味する。本発明にお
いてプラスミドpUB110のドライブユニツト
領域を少なくとも有するプラスミドとしてドライ
ブユニツト領域のほかに薬剤耐性などの宿主細胞
内に導入されたときに、その宿主を形質転換して
当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出
来るようにするための、いわゆるマーカー遺伝子
が含まれているものを用いることが望ましい。さ
らに、プロモーター配列を入れておくこともで
き、そのほか発現させるべき蛋白質をコードする
遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌せしめるに必要な
DNAなどが挿入されていてもよい。すなわち、
これらマーカー遺伝子、プロモーター配列、外来
遺伝子および/または蛋白質分泌のためのDNA
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明に
おけるプラスミドに含まれるものである。 本発明に用いるpUB110由来の新しいプラ
スミドは具体的には次のようなものがある。すな
わち、第1図に制限酵素切断地図を示したプラス
ミドpEB−2はpUB110とpBR322を結合
したものであり、大腸菌(E.coli)とバチルス・
ブレビス(BaCillus brevis)におけるシヤトル
ベクターであり、いずれの細菌においてもコピー
数が多いという特色がある。図中、Amprはアン
ピシリン耐性、Tcrはテトラサイクリン耐性、
Nmrはネオマイシン耐性を示す。第2図に、本
発明に用いる新しいプラスミドであるPEB−3
およびpHT−1の制限酵素切断地図およびその
造成経過を示す。pHT−1はpUB110と同様
にバチルス・ブレビスでコピー数の多いプラスミ
ドであり、ネオマイシン耐性遺伝子(Nmr)の
ほかにエリスロマイシン耐性遺伝子(Emr)を含
んでいる。さらに、pUB110DNAに存在した
制限酵素切断部位以外にHindにより1個所切
断される部位をもつている。また、pUB110
とα−アミラーゼを結合させて得たプラスミド
pBAM−102の制限酵素切断地図を第3図に
示す。 上記各プラスミドを導入した大腸菌およびバチ
ルス・ブレビスはいずれも微工研に寄託されてお
り菌株名と寄託番号は以下の通りである。 【表】 本発明において宿主として用いるバチルス・ブ
レビスにはたとえばバチルス・ブレビス47
(FERM−7224)のほかバチルス・ブレビス48
1,144,899などがある。また、プラスミ
ドベクターの例としては上記した4種類のプラス
ミドがある。 バチルス・ブレビスを形質転換する方法として
は以下のような方法がある。 高滲透圧液(高張溶液とも云う。)に浮遊した
細胞にリゾチームを作用させて生じたプロトプラ
スト(細胞壁を失なつた裸の細胞)にポリエチレ
ングリコールを用いてプラスミドDNAを導入す
る方法もあるが、本発明では、後述するように、
アルカリ性緩衝液、たとえばアルカリ性トリス塩
酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除去した細胞
(細胞壁の蛋白質のみを失なつた細胞)にポリエ
チレングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入する方法が好ましい。 本発明のプラスミドを用いることによつてバチ
ルス・ブレビスを容易に形質転換することができ
る。このバチルス・ブレビスは蛋白質を菌体外に
多量に生産する能力を有しており、しかもプロテ
アーゼ活性がないので、生成した蛋白質が分解さ
れない。したがつて、動物、植物および微生物由
来の遺伝子を組込んだ場合、その遺伝子の有する
遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生成した蛋
白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、本
発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチル
ス・ブレビスの培養は通常のバチルス・ブレビス
の培養と同じ方法で行なえばよい。 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 1 第2図に示したように、プラスミドpHC79
(Hohn、B.and Collins、J.(1980)Gene11、291
−298)とプラスミドpUB110(Gryczan、T.
J.、S.Contente and D.Dubnau(1978)J.
Bacteriol.134、318−329)とをEcoR部位で結
合したものをHind、Claで切断し、これに
Hind、Claで切断して得たプラスミドpHW
1(Horinouchi、S and B.Weisblum(1982)
J.Bacteriol.150、804−814)由来のエリスロマイ
シン耐性遺伝子を挿入することによつてシヤトル
ベクターpEB3を得た。 次いで、このプラスミドpEB3から6.9Kbの
BamH断片を除去することによりプラスミド
pHT−1を得た。 実施例 2 プラスミドpBR322とプラスミドpUB11
0を用い、実施例1と同様にしてこれらをEcoR
部位で結合することにより、第1図に示したプ
ラスミドpEB2を得た。 実施例 3 (1) 好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離 バチルス・ステアロサーモフイラス(B.
stearothermophilus)DY−5の好熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpHI301よ
りα−アミラーゼ遺伝子を以下のようにして調
製した。 プラスミドpHI301(特願昭58−50148号
明細書参照)を制限酵素EcoRで部分的に加
水分解後、再びBamHで部分的に加水分解
し、種々の長さのDNAを調製し、これをα−
アミラーゼ遺伝子として用いた。 (2) バチルス・ズブチリスとバチルス・ブレビス
47への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクロー
ニング ベクター・プラスミドとしてpUB110を
用いた。まず、プラスミドpUB110を制限
酵素EcoRおよびBamHで切断し、5′未満
のリン酸基をバクテリアル・アルカリ・ホスフ
アターゼ処理により除去し、線状プラスミド
pUB110を調製した。 前記好熱性アミラーゼDNAと線状プラスミ
ドpUB110を混合し、T4DNAリガーゼで両
DNAを連結した。 連結したDNAを枯草菌(B.subtilis)1A2
89(α−アミラーゼ陰性株)にChang、S.
and Cohen、S.N.のプロトプラスト法
(Molec.Gen.Genet.168、111−115(1979))で
形質転換し、カナマイシン耐性により多数の形
質転換株を得た。これらの形質転換株を1%可
溶性デンプンと10μg/mlカナマイシンを含む
Difco Antibiotic medium 3 プレート上に
レプリカし、1夜培養後、ヨードデンプン反応
によりコロニーの周辺が無色になつているもの
を検索することによつてα−アミラーゼ生産株
を選択した。第3図はα−アミラーゼ遺伝子の
入つたプラスミドpBAM−102の制限酵素
切断地図である。 上記α−アミラーゼ遺伝子の入つたプラスミ
ドを有する枯草菌よりプラスミドをBirnboim、
H.C.and Doly、J.の方法(Nucleic Acids
Res.、7、1513−1523(1979))により抽出し、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド超
遠心分離法でさらにプラスミドDNAを精製し
たのちバチルス・ブレビス47菌の形質転換に
使用した。 まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩衝液に
よる処理によつてバチルス・ブレビスの表層蛋
白質を除去し、残されたペプチドグリカン層と
細胞質膜によつてのみ囲まれた細胞にポリエチ
レングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入した。すなわち、T2培地に前培養したバチ
ルス・ブレビスの菌液を新しいT2培地5mlに
100分の1希釈し、37℃で振とう培養を行ない、
対数増殖後期(O.D.660nm=1.9)に達したと
き、菌体を遠心(3000g、5分、室温)によつ
て集め、50mMのトリス塩酸緩衝液(PH7.5)
5mlにより洗浄した後、50mMのトリス塩酸緩
衝液(PH8.5)に懸濁し、37℃で振とうした。
60分後、菌体を遠心(3000g、5分、室温)に
よつて集め、0.5mlのTP培地(0.953%
KH2PO4、0.426%Na2HPO4、0.5%肉エキス、
1%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、1%グ
ルコース)に懸濁した。これにプラスミド
DNA溶液(10mMトリス塩酸緩衝液、PH7.5、
1mM EDTA)とTP培地の1:1混合液
100μを加えて混合した。次いで、直ちに40
%ポリエチレングリコール溶液(0.953%
KH2PO4、0.426%Na2HPO4、40%(w/v)
ポリエチレングリコールPEG6000)1.5mlを加
えて撹拌し、37℃で10分間振とうした。しかる
後、遠心(3000g、5分、室温)により菌体を
集め、20mMMgCl2を添加したT2培地に懸濁
した。37℃で150分間振とうした後、形質転換
体選択用の寒天培地(60μg/mlのネオマイシ
ンを含むT2培地プレート(ポリペプトン1%、
肉エキス0.5%、酵母エキス0.2%、グルコース
1%、ウラシル0.01%、PH7))に0.1mlずつ散
布した。37℃で30時間培養してネオマイシン耐
性株を得た。これらの形質転換株を1%可溶性
デンプンと60μg/mlネオマイシンを含むT2培
地プレート上にレプリカし、1夜培養後、ヨー
ドデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
つたものを検索することによつてα−アミラー
ゼ生産株(バチルス・ブレビス47/pBAM
−102(FERM P−7225))を選択した。 (3) α−アミラーゼの生産性 第3図に示すプラスミドを有する枯草菌なら
びにバチルス・ブレビス47菌を60μg/mlネ
オマイシンまたは10μg/mlカナマイシンを含
むT2液体培地に接種し、37℃で22時間培養し、
遠心分離により培養濾液を調製して培養濾液中
のα−アミラーゼ活性を不破の方法(J.
Biochem.41、583−603(1954))により40℃で
測定した。結果を第1表に示す。 【表】 枯草菌およびバチルス・ブレビス47菌で作
られるα−アミラーゼはすべて菌体外に分泌さ
れ、耐熱性を示した。第1表に示したように、
α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラスミドの
存在によつてバチルス・ブレビス47菌を宿主
とした場合には、枯草菌におけるよりも約10倍
に及ぶ多量のα−アミラーゼが生産された。
スを形質転換する方法に関する。 バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)は表
層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。 本発明者らは、バチルス・ブレビスのこのよう
な性質に着目し、本菌は組換えDNAの受容菌と
して好適なものであると考えた。 しかるに、これまでにバチルス・ブレビスにお
いてはコピー数の多いプラスミドは見出されてい
ない。このような事情のため、バチルス・ブレビ
スのDNA受容菌としてのすぐれた性質は利用さ
れていなかつた。 そこで、バチルス・ブレビス細胞内でよく増殖
できるプラスミドベクターの開発が強く要望され
ている。 本発明者らは、スタフイロコツカス・アウレウ
ス由来のプラスミドであつてバチルス・ズブチリ
スを宿主とするベクターとして広く使用されてい
るpUB110(Gryczan、T.J.、S.Contente
and D.Dubnau(1978)J.Bacteriol.134、318−
329)に注目し、このプラスミドベクターpUB1
10を用いてバチルス・ブレビスを形質転換した
ところ、pUB110はバチルス・ブレビス細胞
内で極めてよく増殖することならびに該プラスミ
ドpUB110に外来遺伝子を挿入し、このプラ
スミドを用いてバチルス・ブレビスを形質転換せ
しめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく
発現することを見出した。 本発明はバチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝
液で処理した後にバチルス・ブレビスの細胞内に
プラスミドpUB110のドライブユニツト領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを
特徴とするバチルス・ブレビスの形質転換方法を
提供するものである。 ここで、ドライブユニツト領域とはori領域と
同義であり、宿主細胞内でプラスミドが増殖しう
る機能を司るDNA領域を意味する。本発明にお
いてプラスミドpUB110のドライブユニツト
領域を少なくとも有するプラスミドとしてドライ
ブユニツト領域のほかに薬剤耐性などの宿主細胞
内に導入されたときに、その宿主を形質転換して
当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出
来るようにするための、いわゆるマーカー遺伝子
が含まれているものを用いることが望ましい。さ
らに、プロモーター配列を入れておくこともで
き、そのほか発現させるべき蛋白質をコードする
遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌せしめるに必要な
DNAなどが挿入されていてもよい。すなわち、
これらマーカー遺伝子、プロモーター配列、外来
遺伝子および/または蛋白質分泌のためのDNA
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明に
おけるプラスミドに含まれるものである。 本発明に用いるpUB110由来の新しいプラ
スミドは具体的には次のようなものがある。すな
わち、第1図に制限酵素切断地図を示したプラス
ミドpEB−2はpUB110とpBR322を結合
したものであり、大腸菌(E.coli)とバチルス・
ブレビス(BaCillus brevis)におけるシヤトル
ベクターであり、いずれの細菌においてもコピー
数が多いという特色がある。図中、Amprはアン
ピシリン耐性、Tcrはテトラサイクリン耐性、
Nmrはネオマイシン耐性を示す。第2図に、本
発明に用いる新しいプラスミドであるPEB−3
およびpHT−1の制限酵素切断地図およびその
造成経過を示す。pHT−1はpUB110と同様
にバチルス・ブレビスでコピー数の多いプラスミ
ドであり、ネオマイシン耐性遺伝子(Nmr)の
ほかにエリスロマイシン耐性遺伝子(Emr)を含
んでいる。さらに、pUB110DNAに存在した
制限酵素切断部位以外にHindにより1個所切
断される部位をもつている。また、pUB110
とα−アミラーゼを結合させて得たプラスミド
pBAM−102の制限酵素切断地図を第3図に
示す。 上記各プラスミドを導入した大腸菌およびバチ
ルス・ブレビスはいずれも微工研に寄託されてお
り菌株名と寄託番号は以下の通りである。 【表】 本発明において宿主として用いるバチルス・ブ
レビスにはたとえばバチルス・ブレビス47
(FERM−7224)のほかバチルス・ブレビス48
1,144,899などがある。また、プラスミ
ドベクターの例としては上記した4種類のプラス
ミドがある。 バチルス・ブレビスを形質転換する方法として
は以下のような方法がある。 高滲透圧液(高張溶液とも云う。)に浮遊した
細胞にリゾチームを作用させて生じたプロトプラ
スト(細胞壁を失なつた裸の細胞)にポリエチレ
ングリコールを用いてプラスミドDNAを導入す
る方法もあるが、本発明では、後述するように、
アルカリ性緩衝液、たとえばアルカリ性トリス塩
酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除去した細胞
(細胞壁の蛋白質のみを失なつた細胞)にポリエ
チレングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入する方法が好ましい。 本発明のプラスミドを用いることによつてバチ
ルス・ブレビスを容易に形質転換することができ
る。このバチルス・ブレビスは蛋白質を菌体外に
多量に生産する能力を有しており、しかもプロテ
アーゼ活性がないので、生成した蛋白質が分解さ
れない。したがつて、動物、植物および微生物由
来の遺伝子を組込んだ場合、その遺伝子の有する
遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生成した蛋
白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、本
発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチル
ス・ブレビスの培養は通常のバチルス・ブレビス
の培養と同じ方法で行なえばよい。 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 1 第2図に示したように、プラスミドpHC79
(Hohn、B.and Collins、J.(1980)Gene11、291
−298)とプラスミドpUB110(Gryczan、T.
J.、S.Contente and D.Dubnau(1978)J.
Bacteriol.134、318−329)とをEcoR部位で結
合したものをHind、Claで切断し、これに
Hind、Claで切断して得たプラスミドpHW
1(Horinouchi、S and B.Weisblum(1982)
J.Bacteriol.150、804−814)由来のエリスロマイ
シン耐性遺伝子を挿入することによつてシヤトル
ベクターpEB3を得た。 次いで、このプラスミドpEB3から6.9Kbの
BamH断片を除去することによりプラスミド
pHT−1を得た。 実施例 2 プラスミドpBR322とプラスミドpUB11
0を用い、実施例1と同様にしてこれらをEcoR
部位で結合することにより、第1図に示したプ
ラスミドpEB2を得た。 実施例 3 (1) 好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離 バチルス・ステアロサーモフイラス(B.
stearothermophilus)DY−5の好熱性α−ア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpHI301よ
りα−アミラーゼ遺伝子を以下のようにして調
製した。 プラスミドpHI301(特願昭58−50148号
明細書参照)を制限酵素EcoRで部分的に加
水分解後、再びBamHで部分的に加水分解
し、種々の長さのDNAを調製し、これをα−
アミラーゼ遺伝子として用いた。 (2) バチルス・ズブチリスとバチルス・ブレビス
47への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクロー
ニング ベクター・プラスミドとしてpUB110を
用いた。まず、プラスミドpUB110を制限
酵素EcoRおよびBamHで切断し、5′未満
のリン酸基をバクテリアル・アルカリ・ホスフ
アターゼ処理により除去し、線状プラスミド
pUB110を調製した。 前記好熱性アミラーゼDNAと線状プラスミ
ドpUB110を混合し、T4DNAリガーゼで両
DNAを連結した。 連結したDNAを枯草菌(B.subtilis)1A2
89(α−アミラーゼ陰性株)にChang、S.
and Cohen、S.N.のプロトプラスト法
(Molec.Gen.Genet.168、111−115(1979))で
形質転換し、カナマイシン耐性により多数の形
質転換株を得た。これらの形質転換株を1%可
溶性デンプンと10μg/mlカナマイシンを含む
Difco Antibiotic medium 3 プレート上に
レプリカし、1夜培養後、ヨードデンプン反応
によりコロニーの周辺が無色になつているもの
を検索することによつてα−アミラーゼ生産株
を選択した。第3図はα−アミラーゼ遺伝子の
入つたプラスミドpBAM−102の制限酵素
切断地図である。 上記α−アミラーゼ遺伝子の入つたプラスミ
ドを有する枯草菌よりプラスミドをBirnboim、
H.C.and Doly、J.の方法(Nucleic Acids
Res.、7、1513−1523(1979))により抽出し、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド超
遠心分離法でさらにプラスミドDNAを精製し
たのちバチルス・ブレビス47菌の形質転換に
使用した。 まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩衝液に
よる処理によつてバチルス・ブレビスの表層蛋
白質を除去し、残されたペプチドグリカン層と
細胞質膜によつてのみ囲まれた細胞にポリエチ
レングリコールを用いてプラスミドDNAを導
入した。すなわち、T2培地に前培養したバチ
ルス・ブレビスの菌液を新しいT2培地5mlに
100分の1希釈し、37℃で振とう培養を行ない、
対数増殖後期(O.D.660nm=1.9)に達したと
き、菌体を遠心(3000g、5分、室温)によつ
て集め、50mMのトリス塩酸緩衝液(PH7.5)
5mlにより洗浄した後、50mMのトリス塩酸緩
衝液(PH8.5)に懸濁し、37℃で振とうした。
60分後、菌体を遠心(3000g、5分、室温)に
よつて集め、0.5mlのTP培地(0.953%
KH2PO4、0.426%Na2HPO4、0.5%肉エキス、
1%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、1%グ
ルコース)に懸濁した。これにプラスミド
DNA溶液(10mMトリス塩酸緩衝液、PH7.5、
1mM EDTA)とTP培地の1:1混合液
100μを加えて混合した。次いで、直ちに40
%ポリエチレングリコール溶液(0.953%
KH2PO4、0.426%Na2HPO4、40%(w/v)
ポリエチレングリコールPEG6000)1.5mlを加
えて撹拌し、37℃で10分間振とうした。しかる
後、遠心(3000g、5分、室温)により菌体を
集め、20mMMgCl2を添加したT2培地に懸濁
した。37℃で150分間振とうした後、形質転換
体選択用の寒天培地(60μg/mlのネオマイシ
ンを含むT2培地プレート(ポリペプトン1%、
肉エキス0.5%、酵母エキス0.2%、グルコース
1%、ウラシル0.01%、PH7))に0.1mlずつ散
布した。37℃で30時間培養してネオマイシン耐
性株を得た。これらの形質転換株を1%可溶性
デンプンと60μg/mlネオマイシンを含むT2培
地プレート上にレプリカし、1夜培養後、ヨー
ドデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
つたものを検索することによつてα−アミラー
ゼ生産株(バチルス・ブレビス47/pBAM
−102(FERM P−7225))を選択した。 (3) α−アミラーゼの生産性 第3図に示すプラスミドを有する枯草菌なら
びにバチルス・ブレビス47菌を60μg/mlネ
オマイシンまたは10μg/mlカナマイシンを含
むT2液体培地に接種し、37℃で22時間培養し、
遠心分離により培養濾液を調製して培養濾液中
のα−アミラーゼ活性を不破の方法(J.
Biochem.41、583−603(1954))により40℃で
測定した。結果を第1表に示す。 【表】 枯草菌およびバチルス・ブレビス47菌で作
られるα−アミラーゼはすべて菌体外に分泌さ
れ、耐熱性を示した。第1表に示したように、
α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラスミドの
存在によつてバチルス・ブレビス47菌を宿主
とした場合には、枯草菌におけるよりも約10倍
に及ぶ多量のα−アミラーゼが生産された。
第1図は本発明のプラスミドpEB−2の制限酵
素切断地図、第2図は本発明のプラスミドpEB−
3およびpHT−1の制限酵素切断地図およびこ
れらプラスミドの造成経過を示すものである。第
3図は本発明のプラスミドpBAM−102の制
限酵素切断地図である。
素切断地図、第2図は本発明のプラスミドpEB−
3およびpHT−1の制限酵素切断地図およびこ
れらプラスミドの造成経過を示すものである。第
3図は本発明のプラスミドpBAM−102の制
限酵素切断地図である。
Claims (1)
- 1 バチルス・ブレビスをアルカリ性緩衝液で処
理した後にバチルス・ブレビスの細胞内にプラス
ミドpUB110のドライブユニツト領域を少な
くとも有するプラスミドを導入することを特徴と
するバチルス・ブレビスの形質転換方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6058074A JPS6058074A (ja) | 1985-04-04 |
JPH0156756B2 true JPH0156756B2 (ja) | 1989-12-01 |
Family
ID=15805214
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58165066A Granted JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6058074A (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07108224B2 (ja) * | 1985-11-07 | 1995-11-22 | 重三 鵜高 | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 |
EP0919623A3 (en) * | 1997-11-17 | 1999-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Procedure and kit for cloning of DNA fragments |
EP0916733A1 (de) * | 1997-11-17 | 1999-05-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten |
DE602004025838D1 (de) | 2003-11-11 | 2010-04-15 | Higeta Shoyu Kk | Neuer brevibacillus choshinensis sowie verfahren zur herstellung von protein unter verwendung der mikrobe als wirt |
EP1767640A4 (en) | 2004-07-06 | 2008-03-26 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PREPARING A PROTEIN-A-like PROTEIN USING A BACTERIUM OF THE GENUS BREVIBACILLUS |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58165066A patent/JPS6058074A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6058074A (ja) | 1985-04-04 |
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