JPS6398389A - 酵母における改良遺伝子発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明の　　　び　− 分子生物学的技術は種々の起源の比較的大量のポリペプ
チドを微生物宿主中で生産させることを可能にした。遺
伝子のクローニング及び発現の初期の努力は主として原
核生物宿主、特にその微生物の遺伝学上の特徴及び理解
の程度からＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に向けられていた
。しかしながら宿主としてＥ、コリの使用はいくつかの
欠点を有している。例えば、Ｅ、コリは名目上ヒトの腸
管の居住生物であり潜在的に病原性であるので、Ｅ、コ
リ中にクローン化したＤＮＡに由来する産物を大量生産
することはある程度の健康上の危険をもたらすかもしれ
ない。非病原性株の場合でもＥ、コリ　エンドトキシン
が生産され該微生物によって生産される特定のポリペプ
チドを汚染する。Ｅ。

コリはまたペリプラズム間隙に細胞外酵素を保持し、そ
れにより外因性ポリペプチドの単離精製を困難にする。

これらの困難を完服すべく、ダラム陽性菌バチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の
クローニングベクターの宿主としての可能性が検討され
た。Ｂ、ズブチリス中でのクローニング技術はＥ、コリ
はと開発されていないが、い（つかの利、αが明らかに
された。最初にＢ、ズブチリスは非病原性であり、又潜
在的汚染性のエンドトキシンを生産しない。重要なこと
に、Ｂ、ズブチリスは生産したポリペプチドを培養培地
中に分泌し、単離精製を容易にする。しかしながら種々
の欠点が付随した。それらの欠点の１つとして、一旦宿
主中に形質転換されたプラスミドが不安定なことがあり
、そのため培養を何回も移しかえる（曽ａｎｙ　　ｃｕ
ｌｔｕｒｅ　　ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）間にプラスミドの
複製を維持していくことが困難となる。又、異種ＤＮＡ
はＢ。

ズブチリス中で十分維持されず、クローン化されたＤＮ
Ａはしばしば予期せざるほどに失われる。

さらにＢ、ズブチリスについては利用できる効率的な制
御系が現時点ではご（わずかしかないので、その発現ベ
クターとしての利用を疑わしくしている。

技術の進展に伴って、酵母のような下等の真核生物宿主
が検討されるようになった。クローニングベクターの宿
主生物としての酵母、特にサツカロマイセスもセレビシ
ェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏＢｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の利用はいくつかの明白な利点をもたらす。

例えば、酵母は真核生物なので生産されたポリペプチド
の種々の翻訳ｆ＆修飾（例えばグリコジル化）を行うの
に必要な細胞機能（ｃｅｌｌｕｌａｎ　　ｌｌ１ａｃｈ
ｉｎｅｒｙ）を有するなど高等真植生物と多くの類似点
を有しており、かくして成熟形態のポリペプチドの生産
を可能とする。さらに、酵母の醗酵技術は七分確立され
ており、選ばれたポリペプチドの酵母中での商業規模で
の生産が容易となる。重要なことに、酵母はべりプラズ
ム間隔又は菌体培地中に内因性ポリペプチドを分泌する
ということが報告されている（Ｓ　ｃｈｅｋｍａｎ　　
ｅｔ　　ａｌ、１９８２）。菌体生長培地中に分泌され
る酵母ポリペプチドは酵母７工ロモン接合因子の及び色
、７エロモンベプチダーゼ及び「キラー毒素」を包含す
るとのことである。

ペリプラズム間隙に輸送される酵母ポリペプチドには、
インベルターゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、及び抑制及び
構成形態のホスファターゼ（ｔ　ｂ　ｅ　　ｒ　ｅｐｒ
ｅｓｓｉｂｌｅ　　ａｎｄ　　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ
ｅ　　ｆｏｒＩｌｌｓ　　ｏｆ　　ａｃｉｄ　　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓｅ）がある。ある種の酵母はべりブラズ
ム間隙に存在し又菌体から外へも分泌されることが知ら
れている。この例としてα−がラクトシダーゼ、エキソ
−１，３−β−グルメナーゼ及びエンド−１，３−β−
グルメナーゼがある。この情報と酵母が内因性ポリペプ
チドを哺乳類の系と類似の方法で細胞内加工することが
できる事実との組合せは、酵母中の内因性及び外因性ポ
リペブチＹの発現及び分泌の遺伝学への興味をもつたて
た。

例えば、Ｋｕｒｊａｎら（米国特許第４，５４６，０８
２号）は酵母サツカロミセス・セレビシェからの分泌ポ
リペプチドであるポリペプチドα−因子の遺伝子のクロ
ーニングを記述している。酵母における接合は細胞分裂
サイクルの０１期における、対応する接合形の菌体の分
裂停止（ａｒｒｅｓｔ）を引き起こす７エロモン（接合
因子）によって容易になるようである。酵母α−菌体は
２つの形態の、すなわち長さで１３及び１２のし一アミ
ノ酸（ｆｉ者はベプチドのアミ７末端Ｔｒｙ残基を欠く
）よりなるα−因子を生産する。ａ−因子は酵母を町−
菌体によって生産され、長さＣ◆１１のアミノ酸からな
り、６番目の残基（Ｌｅｕ又はＶａｌ）で異なる２つの
形態を有している。α−因子の合成には細胞ＲＮＡ及び
タンパク貿合戒が必要であるといわれている。これらの
観察及び哺乳動物のペプチドホルモンとの類似性から、
Ｋｕｒｊａｎらは酵母接合因子がより大きな前駆体から
タンパク質加水分解によって生ずるとする提案には支持
があると述べている。かくしてα−因子構造遺伝子のク
ローニングが成しとげられ、前駆体の遺伝子構造が決定
された。この仕事に基いて、ａ−前駆体遺伝子が各々ス
ペーサーヌクレオチド領域によって分離されている、α
−因子をコードする４、っの配列よりなることが見い出
された。これらのスペーサー領域が酵母加水分解系の基
質となると考えられる。かくして、α−因子前駆体中の
α−因子コード領域を取り除き、スペーサーコード領域
の間に他の有用なタンパク質をコード化する遺伝子を挿
入するか、これらの領域に融合することによって、得ら
れる融合ポリペプチドは発現され、酵母加水分解系で処
理されて究極的に菌体から分泌される。

Ｋｕｒｊａｎらの仕事以来、他の研究者らはα−因子の
酵母中での発現及び分泌のメカニズムを明らかにするこ
とを試みはじめた。例えばＥｍｒら（１９８３）はａ−
因子及びインベルターゼ（β−Ｄ−７ラクト７ラノシド
　７ラクトヒドロラーゼ）をコード化する構造遺伝子の
イン−フレーム融合（ｉ　ｎ　−ｆ　ｒａｖｅ　　ｆｕ
ｓｉｏｎ）を記述している。α−因子前駆体の細胞内タ
ンパク質加水分解のために必要であるとして示唆された
部位が保持され、またそのキメラ遺伝子がペリプラズム
間隙に分泌される活性インベルターゼを高い水準で合成
することが見い出された。同様に、Ｂ　ｒａｋｅら（１
９８４）は成熟した、ヒト上皮細胞成長因子をコード化
する配列が酵母α−因子の前駆体の光導域（プレプロ断
片）をコード化する種々の配列と接合したハイブリッド
遺伝子を含有するプラスミドの構築を記述している。こ
のプラスミドはサツカロミセス・セレビシェ菌体を形質
転換するのに用いられ、得られた形質転換体は確かにハ
イブリッドタンパク質を有し、培地中に成熟した、生物
活性を有する、ヒト上皮細胞成長因子を効率よく分泌し
た。さらにａ−因子プロモーターを利用する別の遺伝子
構築物がＢｉｔｔｅｒら（１９８４）によって報告され
た。α−因子構造遺伝子とβ−エンドルフィン又はα−
インターフェロン遺伝子との融合が、成熟α−因子に含
有されるタンパク質加水分解開裂部位を維持しながら行
われた。該α−因子プロモーターはサツカロミセス・セ
レビシェ中で融合遺伝子を発現させ、培養培地中に異種
タンパク質が効率よく分泌された。

最後に酵母中の分泌タンパク質の細胞外への輸送に必要
な遺伝情報を定義する試みとして、Ｅｎｒら（１９８４
）は酵母ＳＵＣ２遺伝子（インベルターゼをコード化し
て、いる）とＥ、コリＩａｃＺ遺伝子（細胞質酵素β−
ガラクトシダーゼをコード化している）の一連の融合物
を構築した。しかしながら、発現したインベルターゼ−
β−ガラクトシグダーハイブリッドタンパク質は栄養培
地中には分泌されず小胞体に捕らされて留まる傾向を示
した。

上記背景技術の説明から明らかなごとく、酵母のような
真核生物宿主が生化学的に重要な異種ポリペプチドの発
現及び細胞外分泌のための、生育可能な媒体（ｖｅｈｉ
ｃｌｅｓ）の役をつとめるかどうかが問題として残って
いる。しかしながら、分子生物学の進歩により得られる
利益についての約束が商業的規模で実現される前に、例
えば発現水準を改良し、正確な翻訳後加水分解と最終的
な細胞外分泌を提供することによって興味あるポリペプ
チドを大量生産する進歩を継続的に提供することが必要
である。本発明はインベルターゼシグナル配列の１０３
塩基対断片にタンデムに連結した、酵母接合因子α−１
プレプロコード配列よりなる遺伝子構築物を提供するこ
とによる改良に関する。該構築物は、そのインベルター
ゼ断片の下流に直接゛、選択されたポリペプチドをコー
ド化する構造遺伝子を置くことによって、その構造遺伝
子の非常に高いレベルでの発現で指示することができる
。

λ里ｐ−概−］ 本発明は構造遺伝子の酵母中での商レベルの、発現を指
示することができるＤＮＡ１ｌＩＩ築物（ｃ　ｏ　ｎ　
ｓ　ｔ、　？　ｕｃｔ）に関する。該ＤＮＡ構築物はイ
ンベルターゼ遺伝子の３４個のアミノ末端アミノ酸をコ
ード化する酵母ＳＵＣ２遺伝子の１０３塩基対領域にタ
ンデムに連結した酵母接合因子α−１プレプロ−コード
配列と、それと共に選択されたポリペプチドを解読枠（
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）にコード化している構造遺
伝子からなる。

選択されたポリペプチドをコード化する遺伝子の発現水
準を、該遺伝子を含有する酵母菌体を１もしくはそれ以
上のアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩化物の
存在下に培養する。二とによって高める方法も又開示し
、クレームする。

λ町へ拝上ｙ澗遂− 上記にほのめかしたごとく、本発明のＤＮＡ構築物は選
択されたポリペプチドをコード化する構造遺伝子の高水
準の発現を指示することができる、３部分よりなる遺伝
子（１，ｒｉｐｎｒｔｉｌ：ｅ　　ｇｅｎｅ）である。

該３部分よりなる遺伝子は酵母ＳＵＣ２遺伝子断片の１
０３塩基対断片にフレームで融合した、酵母接合因子ａ
−１のプレプロ・コード配列を含有する。そして選択さ
れたポリペプチドをコード化する構造遺伝子がＳＵＣ２
遺伝子断片のすぐ下流に融合されている。

ここで用いる、酵母接合因子α−１のプレプロ−コード
配列とは該遺伝子の塩基１から塩基２６３のＨｉｎｄｌ
ｌ（開裂部位（すなわち、ＧＡ’Ａ）までの断片をいう
。このことは第１図に図式的に示しである。このプレプ
ロコード配列内にＡＴＧ翻訳開始コドン及びアミノ酸２
０位（すなわちａｌａ−ｘ）に推定上のシグナルペプチ
ドの開裂部位がある。機能的な固有の（ｎａｔｉｖｅ）
プレプロコード配列は塩基１〜２４９に亘っている。塩
基２５０〜２６３の領域はａ−因子前駆体分子をコード
化する４、っのコード領域の各々のすぐ前に先行するス
ペーサーヌクレオナト領域の最初の部分を表す。ここで
用いるプレプロコード配列なる語はかかる、塩基２５０
〜２６３のスペーサーヌクレオチド領域のかがる部分を
含めで解釈される。

酵母接合因子α−１のプレプロコード配列はＫｕｒ　、
ｉ　ａ　ｎらによって記述されたごとき、クローン化さ
れたα−因子前駆体から以下のようにして得ることがで
きる。酵母ＤＮＡの任意なデ７ム断片を含有するクロー
ンバンクを高コピー数プラスミドＹＥｐ１．３に挿入す
る。このプラスミドは酵母２Ｍレプリコンの複製の開始
点（ｏｒｉｇｉｎ）を含んでおり、菌体あたり３０〜５
０コピー存在する。つぎに酵母株（例えばり±α−２Ｉ
ｅｕ２）を該クローンバンク由来プラスミドＤＮＡで形
質転換１１、Ｉｅｕ＋形質転換体を選択し、プールし、
ロイシンを欠く選択培地上でＶ板培養する。α−因子を
分泌できるコロニーを４菌体の叢（１賎１１）上での輪
形成（ｈａｌｏ　　ｔ。

ｒ＋＋＋ａｔｉｏｎ）によってスクリーニングした。輪
形成に関与する遺伝子は生産性プラスミド（ｐｒｏｄｕ
ｃ　ｉｎｇｐｌａｓｍｉｄ）の１．７キロベース（ｋｂ
）ＥｃｏＲＩ断片−にに位置している。このＥｃｏＲＩ
断片はＩ（ｉｎｄＩＩＩによる開裂によって不活性化さ
れるが、このことはＨｉｎｄｌ１１部位がａ−因子生産
に関与する遺伝子内にあることを示している。第１図に
示す、Ｍａｘａ＋ａ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定の結果は
α−因子前駆体分子のコード領域の残余部からのプレプ
ロコード配列の開裂及び単離を都合よくする、塩基２６
３でのＩ］１ｎｄｌＩ［部位を記述するが、このことは
当業界ではあり鯵たつのことである。

酵母接合因子α−１のプレプロコード配列に、酵母ＳＵ
Ｃ２遺伝子の１０３塩基対断片をフレームに（７レーム
が合うように）融合させる。このＳＵＣ２遺伝子断片は
１９のシグナル配列アミノ酸のうちＪ５と１つの潜在的
（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）グリコジル化部位（ａｓｎ−Ｘ
−ｔｂｒ）を含有する、酵素インベルターゼの３４．の
アミ７末端アミノ酸をコード化している。この断片のヌ
クレオチド配列を第２図に示す。ＳＵＣ２遺伝子はＹＥ
ｐ１３酵母ライブラリーからクローン化された。５ｔＪ
Ｃ２遺伝子の全ヌクレオチド配列は決定されている［Ｃ
ａｒｌｓｏら（１９８２）及びＴａｕｓｓｉｇら（１９
８３）］、この情報に基づいて、本発明で用いる、Ｓ　
ｔＪ　Ｃ２遺伝予断片を、クローン化されたＳＵＣ２Ｄ
ＮＡの７ミ／末端断片のＢａＮ３：Ｉ制限酵素消化によ
って容易に得ることがでトる。この断片をついで標準的
技術１によって酵母接合因子α−１プレプロコード配列
に連結する。

以下のコントロール研究で示されるごとく、選ばれたポ
リペプチドをコード化する遺伝子の高い発現水準は本発
明の３部分よりなる遺伝子構築物中のＳＵＣ２ＵＣ２遺
伝子弁在に直接帰結することができる。ここに開示した
１０３ヌクレオチド断片の一部分のみを利用する構築物
を調製すること、又はより大きな数のＳＵＣ２遺伝子の
アミ／末端アミノ酸を用いる構築物を調製し、さらに選
ばれた遺伝子の高水準での発現を指示することができる
構築物を得ることは熟練した技工にとって容易なことで
ある。ＳＵＣ２遺伝子の７ミノ末端の一部をコード化す
る特定の１０３ヌクレオチド断片がここに記述されてい
るが、この断片の意図された等個物はその任意の部分を
含むか、又は選ばれたポリペプチドをコード化する遺伝
子の南水準の発現を指示する能力を保持する、該アミ７
末端のより長い断片を含む。

選ばれたポリペプチドをコード化する構造遺伝子はＳＵ
Ｃ２ＵＣ２遺伝子弁ぐ後の下流に融合する。かかる融合
は例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９Ｂ２）に記述されて
いるような標準的連結技術によってなされる。かかる構
造遺伝子は、必要的ではないが代表的には酵母にとって
異種であり、原核生物もしくは真核生物のポリペプチド
、例えば成長ホルモン、ソマトスタチン、上皮細胞成長
因子、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホル毫ン、リラキ
シン、セクレチン、オキシトシン、インシュリン、パッ
プレシン、レニン、カルシトシン、造血因子（エリスロ
ボイエチン等）、種々のりンボカイン、イム７グロプリ
ン、ア７レブミン、インターフェロン、エンドルフィン
、子牛エキジン、キシロースイソメラーゼ、α−アミラ
ーゼ、β−がラクシトダーゼ等をコード化している。

かくして形成された３つの部分よりなる遺伝子はついで
酵母宿主中に安定に導入すべく、形質転換用ベクター中
に投入される。この操作は例えば形質転換用ベクターを
３部分よりなる遺伝子に相補的な粘着末端を生ずる制限
酵素で切断するか、ベクター又は３部分よりなる遺伝子
の末端な相補的になるように修飾し、相補的配列同志を
アニル化し、ついで得られる形質転換ベクターをつなぐ
ことによって行われる。適当な形質転換ベクターは３部
分よりなる遺伝子を酵母中に安定に投入し、選ばれたポ
リペプチドをコード化する構造遺伝子を最終的に発現す
ることができるベクターを包含する。かかるベクターは
例えばプラスミドｐＹαＥ　ｓ　ｐＹ　ｃ　ＣＩ　Ｅ　
Ｓｐ　Ｊ　Ｙ　６、ＹＥ９１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ１
９（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手
し得る）等である。

形質転換ベクターはついで選ばれた宿主酵母菌体中に移
入される。選ばれる特定の酵母は本発明にとって臨界的
でなく、クローン化遺伝子の発現のための宿主として通
常用いられる酵母、例えばサツカロミセスの種々の種及
びその変異株、特にサツカロミセス・セレビシエ及びそ
の変異株のいずれかを用いることができる。３部分より
なる遺伝子を移入したベクターによる酵母宿主の形質転
換は常法例えばエビら（１９Ｂ３）に記述の方法によっ
て行うことができる。得られる形質転換体はついで選ば
れたポリペプチドをコード化する構造遺伝子の発現を容
易にする条件ドに培養するが、かかる条件も当業界では
ありきたりのことである。

しかしながら、選ばれる一般的培養条件は常套的である
が、１種もしくはそれ以上のアルカリ金属もしくはアル
カリ土類金属の塩化物の培養培地への添加がかかる塩化
物の不存在下に達成されるよりも有意に高い水準で遺伝
子発現を増加させることが見い出された。かかる塩化物
は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の
一価もしくは二価の塩化物を包含する。塩化物は好まし
くはアルカリ金属塩化物であり、もつとも好ましくは塩
化ナトリウム又は塩化カリウムである。該塩化物は培養
菌体に好ましくない作用を及ぼすことなく、３ｇ分から
なる遺伝子中の、選ばれたポリペプチドをコード化する
構造遺伝子の発現の水準を増加させるに十分な量はど培
養培地中に存在させる。塩化ナトリウム及び塩化カリウ
ムについては、この量は培養培地中の濃度で好ましくは
約１００ｍＭ−約ＩＭ、より好ましくは約２００ｍＭ〜
約８００ａ＋Ｍである。かかる塩化物の特定の最適量は
常用の方法によって容易に確認することができる。得ら
れる発現生産物が培養培地中に分泌される場合には培地
から直接回収することがでト、又細胞内（例えばベリプ
フズム間隙）に維持される場合には菌体を酵素［例えば
ザイモラーゼ（７，ＱＯＩａｓｅ）］で処理することに
よって溶菌し、生産物を例えば遠心分離によって回収す
ることができる、単離されたポリペプチドは引き続き、
濾過、り四マドグラフィー、電気泳動、透析、溶媒抽出
等をはじめとする常用技術によって精製する。

以下の実施例は本発明を例示するために提供するもので
あり、それに限定されるものと解すべきでない。

実施例１ ａ）　β−〃ラクトシグーダ一ついての、３部分よりな
る遺伝子コードの構築 酵素β−がラクトシダーゼをコード化し、プラスミドｐ
ＪＳ１２上に存在する、３部分よりなる遺伝子を第３図
に図式的に示したごとくに調製した。

酵母接合因子α−１構造遺伝子（及びプレプロコード配
列）を含有する細菌プラスミドであるプラスミドｐｃＹ
１．７をＫｕｒｊａｎら、１９８２及び米国特許第４，
５４６，０８２に記述されたようにして調製した。該プ
ラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄｌｎで消化して、ＥｅｏＲＩ部位（酵母接合因子α
−１コード領域のＡＵＧ闇始コドンから９５０塩基対（
ｂｐ）上流）からプレプロコード配列のすぐドのド流に
あるＨｉｎｄＩＩ［部位までを含む１１００ｂｐの断片
を得た。酵母接合因子α−１プレプロコード配列を含有
するこの断片をクロマトグラフィー及び電気泳動溶出に
よって単離した。同様に、Ｓ　Ｕ　Ｃ２−１ａｃＺ融合
体（ｎ　　Ｓ　Ｕ　Ｃ２−１ａｃＺ　　ｆｕｓｉｏｎ）
を含有する酵母クローニング用運搬体ＤＣＫ８０６をＥ
ｍｒら、１９８４に記述されたようにして調製した。こ
のクローニング用運搬体をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｎｌ
で消化し、ついでア〃ロースデル精製して８　、５　ｋ
ｂの断片を得た。この断片は酵母２μレプリコン、ＵＲ
Ａ３遺伝子、及びβ−ガラクトシグダーについてのＥ、
コリ１ａｃＺ構造遺伝子コードをコード化するｌ］ＢＲ
３２２配列（その８つのアミノ末端アミノ酸のコード配
列を欠く）を含有している。なお、このｎａｃ　Ｚ構造
遺伝子は第３図に示すごとく、酵母ＳＵＣ２遺伝子の１
０３塩基対断片（その５゛末端にＢａｍＨＩリンカ−を
含有する）とフレーム融合されている。

先に単離したプラスミドｐＣＹ１７からのＥｃ。

ＲＩからＨｉｎｄｌｌｌまでの１１００ｂｐの断片をプ
ラスミドｐｃＫ８０６からのＥｃｏＲＩからＨｉｎｄ■
まで８　、５　ｋｂの断片につなぎ、それによって、酵
母β−ガラクトシグダーをコード化するＥ、コリ１ａｃ
Ｚ構造遺伝子が融合した、酵母ＳＵＣ２遺伝子の１０３
塩基対断片に、融合した酵母接合因子ａ−１のプレプロ
コード配列を含有する、３部分よりなる遺伝子を含有す
るプラスミドｐＪｓ１２を生成させた。プラスミドｐ、
Ｊｓ１２はアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託され寄託番号２Ｆ１− ６７２１０が与えられている。

ｂ）　プラスミドｐＪｓ１２による酵母の形質転換及び
宿主菌体の培養 酵母サツカロミセス拳セレビシェＪＲＹｊ、８８ｓ （ＭＡＴα、５ｉｒ３−８　　　、ｕｒａ３−５２、（
！ｅｕ　２、ｔｒｐＳｈ　ｉｓ　４、ｒｍｅｌ）を、Ｉ
ｔｏら（１９８３）を若干修正した方法でプラスミドｐ
Ｊ’ｓ　ｉ　２を用いて以下のごとく形質転換した。新
鮮な対数増殖期の培養物１０　ｚｌ（２Ｘ　１０　’ｃ
ｅｌｌｓ／　ＩＮ）を室温下で１０分間７０００ｒｐｍ
で遠心分離した。得られるペレットを、トリスＨＣｆｌ
Ｏ＋ｎＭを含有する緩衝液（ｐＨ７，５）（ＥＤＴＡｌ
ｍＭ及び酢酸リチウム１００　＋。

Ｍも含有する）で１回洗浄し、同緩衝液０．１ｍｌに懸
濁し、３０℃で６０分インキュベートした。プラスミド
ＤＮＡ（すなわち、ｐ、ｌ５１２）を鮭精子ＤＮＡ５０
μｇの存在下に最ＩＩ＋濃度が１〜１０μｇとなるよう
に酵母菌体に加え、菌体を３０゛Ｃで３０分インキュベ
ートした。これに５０％ポリエチレングリコール３３５
０　（Ｓ　ｉｇ＋ｎａ　　Ｃ１＋ｅ＋ａｉｃａｌＣｏｍ
ｐａｎｙ、セントルイス、ミズーリ、米国）１Ｍ酢酸リ
チウム及び１００＋ｅＭ）リストＩＣ１（ｐＨ７。

５．１０ｖａＭ　　ＥＤＴＡを含有）の８：１：１の混
合物０．７　ｘｌを加えた。混合物をちょっとの滑動さ
せ（ｗａｓ　　ｖｏｒｔｅｘｅｄ）、３０℃で６０分イ
ンキュベートした。ついで菌体に４２°Ｃで５分間熱シ
ヨツクを与え、Ｔ　Ｅ緩衝Ｑ（すなわちｆｏｏ＋Ｍ）リ
スＨＣ１、ｐＩ−（７，５、Ｅｌ）Ｔ’Ａ１ｍＭ含有）
０　、５　ｘｌ、で２回洗浄し、ついでＴＥ緩衝液０．
１　ｚｌに再懸濁した。菌体をヒスチジン、トリプトフ
ァン及びロイシンを補給した酵母最少培地（アミノ酸を
含有せず、グルコース２％を含有する０、６７％１）ｉ
ｆｃ。

酵母窒素基本培地（Ｄ　１ｆｃｏ　　ｙｅａｓｔ　　ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ　）を含有する寒天平板上で平
板培養した。プフスミド含有ＪＲＹ１８８菌体を選択し
、振Ｖｋフラスコ中３７℃、３００　ｒｐｌｌｌで増殖
させた。飽和培養物を新鮮培地（］−記と同じ）で１：
１．００に希釈し、２５°Ｃで目的とする光学密度（Ａ
Ｓ。。）単位になるまで増殖させた。

Ｃ）　β−がラクトシダーゼ単離及び分析既知少量の上
記菌体を増殖培地から７０００ｒｐｍで遠心分離し、６
０ｕＭ　　Ｎａ、ＨＰＯ４・７Ｈ２０、４０ｍＭ　　　
ＮａＨ２Ｐ　Ｏ＋　φＨ、Ｏ−１，０ｍＭ　　　ＫＣＬ
　　１ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏ＜　１１７Ｈ２０及び１２５ｍ
Ｍジチオスレイトールを含有する緩衝液と混合して最終
容積１１．１とした。菌体をクロロホルム３滴の添加に
よって透過性にし、２秒間激しく滑動させた。

ついで混合物で２８℃で５分インキュベートした。

β−がラクトシダーゼ活性はＭ　１ｌｌｅｒ、　Ｊ　、
（１９７２）記載の方法によって定量した。Ｏ−ニトロ
フェニル−β−ガラクトシド（４ｍｇ／　ｚｌ）　０　
、２　ｙｌを１〜記インキユベ一シヨン混合物に加えた
。溶液かうすい黄色に変化した時点で反応をｉ　Ｍ　Ｎ
　ａ　２　ＣＯ３０，５１βの添加によって停止させ、
反応の正嫂な持続時間を記録した。菌体をｌ　Ｏ（’）
　Ｏｒｐｍの回転で沈降させ、透明な上清液の４２０ｎ
ｍでの光学書７１ｆｆｉ（０１））を記録した。β−〃
ラクトシグーダー牲１単位は０−ニトロフェニル−β−
〃ラクトシト１ｎＭを２８℃で１分間に加水分解する酵
素の量である。

ｄ）結果 プラスミドｐＪｓ１２を担持するＪＲＹＩ８８形質転換
体について」１記で分析したβ−〃ラクトシグーダー性
はＡ　ｒｔｏｏ密度１．０に増殖させた菌体についてｌ
　９３　ｕｎｉｔ：ｓ／μｇタンパク質であった。

この酵素活性水準を意味のあるコントロールと比較する
ために、プラスミドｐＪｓ１２をＨｉｎｄｌｌｌ及びＢ
ａｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、それによってＳ
ＵＣ２ＵＣ２遺伝子犬Ｊｓ１２から除去した。得られる
Ｈｉｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩ梢化ｐＪＳ１２の粘着末端
にデオキシヌクレオチドを補充しくｗｅｒｅ　　　ｆｉ
ｌｌｅｄ　　　ｉｎ　　　ｕ＋ｉｔｌ＋　　　ｄｅｏｘ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、自己連結させて、今から
はｐ、Ｊｓ２１２と称するプラスミド上に担持された接
合因子α−１プレプロコード配列−１ａｃ　Ｚ融合ハイ
ブリッド遺伝子を得た。プラスミドｐＪＳ２１２をサツ
カロミセス・セレビシェＪＲ’１８８中に形質転換し、
上記と同様に培養した。β−がラクトシダーゼを単離し
、酵素活性を測定した。ＳＵＣ２ＵＣ２遺伝子犬くプラ
スミドｐＪＳ２１．２は７７　ｕｎｉｔｓ／　ＩＪ　Ｂ
タンパク質のβ−〃フクトシグーダー性しか生産しない
ことが見い出された。このように、プラスミドｐＪ　Ｓ
　ｉ　２上に担持された、３部分よりなる遺伝子中にお
けるＳＵＣ２ＵＣ２遺伝子犬在はプラスミドｐＪｓ２１
２によって生産された酵素活性に対しほぼ３倍の酵素活
性の増加、すなわち１９旦および７７　ｕｎｉｔｓ／μ
ｇタンパク質の差をもたらすことができた。

実施例２ タンパク質発現に対するＮａＣ１の作用タンパク質発現
水準に対するＮａＣ１の作用を調べるために、実施例１
の実験手法をプラスミＰ・ｐＪＳ１２及びｐＪｓ２１２
双方についてくり返した。しかしながら、形質転換体は
培養培地に添加した４００ｖａＭ　　ＮａＣ１の存在下
に増殖させた。

β−ガラクトシグダー活性を上記と同様にして’ｔ＞析
したところ、ｐＪｓ１２で形質転換した菌体ｌ、。

ついては１０１５　ｕｎｉｔ８／μｇタンパク質であっ
た。

一方、プラスミドｐＪｓ２１１２で形質転換した菌体に
ついては、活性は３３１　ｕｎｉｔ！１／μｇタンパク
質であった。どちらのプラスミドを用いた場合にもＮａ
Ｃ１の使用がβ−がラクトシダーゼの発現水準を増加さ
せたことが明らかである。培養培地中へのＮ　ａ　Ｃ１
の添加により、ｐ　Ｊ　Ｓ　２１２　（Ｓ　Ｕ　Ｃ２遺
伝予断片を欠く）からの発現水準も増加したことは興味
深いことである。同様の増加はＮａＣ１の代りにＫＣＩ
を用いた場合にも観察された。

関係書誌 本明細書中で言及した以下の刊行物を参考としてここに
含める。

（１）　　Ｂｉｔｔｅｒ、　Ｇ、　ｅｔ　　ａｌ、Ｐ　
ｒｏｅ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　３５，５３３０−５３３
（２）　　Ｂｒａｋｅ、　Ａ、　ｅｔ　　ａｌ、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８
上−１４６４２−４６４４（１（３）　　Ｃａｒｌｓｏ
ｎ、　Ｍ、　ｅｔ　　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　　２．、−８
．１４５−１５４（１９８２＞ （４）　　ＥｍｒｌＳ、　ｅｔ　　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８０．７
０８０−７０８４（，１（５）　　Ｅ＋ａｒ、　　Ｓ、
　ｅｔ　　ａｌ、Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂ　ｉｏ
ｌ。

４（Ｎｏ、１１）、２３４７−２３５５（１，９８４）
（６）　　Ｉｔｏ、Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、　　１−り−、１６３−１６８（１９８
２） （７）　　ＫｕｒｊａｎＳＪ、ｅｔ　　ａｌ、　　Ｃｅ
１ｌ　　：％０−１９（８）　　Ｋｕｒｊａｎ、　　Ｊ
、　　ｅｔ　　ａｌ、Ｕ　、　Ｓ　、　Ｐ　ａｔｅｎｔ
４．５４６，０８２（１９８５） （９）　　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｔ、　ｅｔ　　ａｔ
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２）（１０）　　Ｍｉｌｌｅｒ、　　Ｊ、＋　　Ｅｘ
ｐ９Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｌ、３５２　　ｅＬ　　５ｅｑ
（１９’７２）（１１）　　Ｓｃｈｅｋｍａｎ、　ｅｔ
　　ａｔ、”ｌ″ｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｙｅａｑｔ、　　Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｌＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　ａｎ
ｄ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”。

Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｒ＋ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｐｒ
ｅＳｓ（１９８２）（１２）　　Ｔａｕｓｓｉｇ、　　
Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、ＮｕｃｌｅｉＣＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ、　　１１．１９４３−１９５４（１，９

【図面の簡単な説明】

第１図はプレプロコード配列を含有する酵母接合因子α
−１のヌクレオチド配列である。 第２図は酵母ＳＵＣ２遺伝子のアミノ末端アミノ酸をコ
ード化するヌクレオチド配列である。 第３図はプラスミドｐＪＳ１２構築の説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インベルターゼ遺伝子の３４個のアミノ末端アミノ
   酸をコード化している酵母ＳＵＣ２遺伝子の１０３塩基
   対領域にタンデムに連結した酵母接合因子α−１プレプ
   ロ−コード配列と、それと共に選ばれたポリペプチドを
   解読枠にコード化している構造遺伝子とからなることを
   特徴とするＤＮＡ構築物。 ２、少なくとも、インベルターゼ遺伝子の３４個のアミ
   ノ末端アミノ酸をコード化している酵母ＳＵＣ２遺伝子
   の１０３塩基対領域にタンデムに連結した酵母接合因子
   α−１プレプロ−コード配列と、それと共に選ばれたポ
   リペプチドを解読枠にコード化している構造遺伝子とを
   包含することを特徴とするＤＮＡ発現ベクター。 ３、少なくとも、インベルターゼ遺伝子の３４個のアミ
   ノ末端アミノ酸をコード化している酵母ＳＵＣ２遺伝子
   の１０３塩基対にタンデムに連結した酵母接合因子α−
   １プレプロ−コード配列と、それと共に選ばれたポリペ
   プチドを解読枠にコード化している構造遺伝子とを包含
   することを特徴とするＤＮＡ発現ベクターで形質転換さ
   れた酵母株。 ４、プラスミドＰＪＳ１２。 ５、選ばれたポリペプチドをコード化している遺伝子を
   含有する酵母菌体を、１又はそれ以上のアルカリ金属又
   はアルカリ土類金属の塩化物の存在下に培養することを
   特徴とする、選ばれたポリペプチドをコード化する遺伝
   子の発現水準を高める方法。 ６、該塩化物が塩化ナトリウム又は塩化カリウムである
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該塩化物を約１００ｍＭ〜約１Ｍの濃度で存在させ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該塩化物を約２００ｍＭ〜約８００ｍＭの濃度で存
   在させる特許請求の範囲第７項記載の方法。