JPH03224489A - 真核生物発現系 - Google Patents

真核生物発現系

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JPH03224489A
JPH03224489A JP2228485A JP22848590A JPH03224489A JP H03224489 A JPH03224489 A JP H03224489A JP 2228485 A JP2228485 A JP 2228485A JP 22848590 A JP22848590 A JP 22848590A JP H03224489 A JPH03224489 A JP H03224489A
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Graaff Leendert Hendrik De
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学の分野に関し、そしてポリガラクチ
ュロナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列
、及び／又はそれに天然に連結されているプロモーター
、シグナル及び／又は転写ターミネータ−配列を含んで
成る新規なりＮＡ分子を提供する。この新規なりＮＡ分
子は、糸状真菌においてポリガラクチュロナーゼの製造
のため、又は外来遺伝子の発現のための発現カセットの
作成のために有用である。
〔従来の技術〕
遺伝子工学技術においては原核性又は真核性宿主のため
の多くのポリペプチド発現系が知られているが、従来の
系に卓越する利点を有する新規な系が常に必要とされて
いる。
非常に広く使用されている宿主は原核生物である大腸菌
（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）及び真核生物で
ある酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｗ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であ
り、これらのために多数の異る発現バイブリドベクター
が開発されており、そのほとんどがプラスミドである。
大腸菌宿主の欠点は、それらがポリペプチドをグリコジ
ル化できないこと、及び外来遺伝子の細胞内発現が宿主
細胞内での蓄積を導きそして更なる増殖を妨害すること
である。酵母はグリコジル化を行うが、しかしながら大
腸菌と同様にポリペプチドを分泌せず、例外的に少量の
み培地中にではなくペリプラズム空間に分泌するのみで
ある。哺乳類癌細胞のごときより高等な真核宿主はグリ
コジル化を行いそして培地中に分泌することができるが
、しかしながらその培養は遅く、高価であり、そして発
癌性核酸が目的ペプチドと一緒に単離される危険が存在
する。
他の宿主の研究において、糸状真菌（ｆｉｌａｓｅｎｔ
ｏｕｓｆｖｎｇｉ）、例えばニューロスポラ・クラッチ
（７ｃｒａｓｓａ）　、アスペルギルス・ニドランス（
勧ｎ」匡■Ｕｎｉｄｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・
ニガー（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ１１圧）も研究されて
いる。遺伝子工学技術におけるこれらの適用は、適当な
形質転換系が存在しないことを主な理由として、遅れて
いる。サツカロミセス・セレビシェ−とは異り、糸状真
菌は外来遺伝子の導入及び表現型選択のために使用し得
るプラスミドを含有しない、しかしながら、糸状真菌を
選択マーカー遺伝子を含有する外来プラスミドにより形
質転換することは可能である。糸状真菌のために今まで
記載されているほとんどのベクターは酵母のそれのよう
に自律複製できず、真菌染色体に組込まれる。この現象
は一般に低頻度で起こる。しかしながら、組込み形質転
換は、非選択的条件下においてさえ形質転換体を有糸分
裂的に非常に安定なものとする。百を超えるコピーの安
定な組込みが報告されている。
糸状真菌のための記載された最初のベクターは選択マー
カーとして二ニーロスボラ・クラッチのｑａ−２遺伝子
を含有していた（Ｃａｓｅ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｓｃｈｗｅ
ｉｚｅｒ。
Ｍ、、　Ｋｕｓｈｎｅｒ、　Ｓ、Ｒ，及びＧ１１ｅｓ、
　Ｎ、Ｈ，（１９７９）　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６、５２５９
−５２６３　；　Ｃａ５ｅ、　Ｍ、Ｅ。
（１９８２Ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｇｅｓｆｏｒ　　
Ｃｈｅｓｉｃａｌｓ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、　　Ａ−＋
　　ＤｅＭｏｓｓ＋　　Ｄ、。
Ｋａｍｐｌａｎ＋　ｓ、ｌ　Ｋｏｎｉａｋｙ、　Ｊ、Ｉ
　Ｓａｖａｇｅ、　ｏ、及びＷｄｆｅ。
Ｒ，Ｓ、纒）　　、８７−１００頁、Ｐｌｅｎｕｍ〕　
。
性周期を有しそしてそれ故に古典的な遺伝的操作を可能
にするアスペルギルス・ニドランスにおいては、負及び
正の両者の選択系が記載されている　（Ｂａｌｌａｎｃ
ｅら、　ＢＢＲＣ１１２，２８４，１９８３ＳＴｉｌｂ
ｕｍら、Ｇｅｎｅ　２６．２０５．１９８３　　ＨＹｅ
ｌｔｏｎら、ＰＮＡＳ　８１゜１４７０、１９８４　；
　Ｙｅｌｔｏｎ及びＴ１ｍｂｅｒｌａｋｅ＋　Ｊ、Ｃｅ
１ｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ１．　９Ｃ＋　　１７３＋　
　１９８５　　；　　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、ＥＭＢＯ
Ｊ、　　４．　１３０７．　１９８３　；　　Ｔｉ１ｂ
ｕｒ−ら、　Ｇｅｎｅ　　２６＋２０５、１９８３　Ｈ
Ｗｅｒｎａｒｓら、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、　９＋　３
６１゜１９８５　；　Ｋｅｌｌｙ、　Ｊ、Ｍ、ら、ＥＭ
ＢＯＪ、　４．４７５．１９８５）。
Ａ、クラッチ又はＡ、ニドランスに比べて、Ａ。
ニガーは例えば食品工業において使用するための酵素類
の工業的製造において広く使用されているため非常に重
要な生物である。Ａ、ニガーは、種々の加水分解酵素、
例えばグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、ペクチナー
ゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、ナリンジナーゼ、ベントサナーゼ、酸性プロテア
ーゼ及びリグナーゼを分泌することが知られており、グ
ルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体は最も重要なも
のである。
Ａ、ニガーの性周期は知られていない、従って、減数分
裂組換えにより変異を導入することはできない、しかし
ながら、古典的な変異及び選択法により加水分解酵素の
分泌における非常な菌株改良が達成されている。
Ａ、ニガー酵素の遺伝子の内、グルコアミラーゼ（Ｂｏ
ｅｌら、ＥＭＢＯＪ、　３．１５８１．１９８４）並び
にアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＯ８
６１０６０９７）のみがそれらのプロモーター及びシグ
ナル配列と共に特徴付けられており、そしてＡ、ニドラ
ンス及びＡ、ニガーを用いる形質転換実験において使用
されている。
Ａ、ニガーのための選択マーカーとして、いずれもＡ、
ニドランスから得られたヘテロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）ａｍｄｓ遺伝子（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅ
ｓ＋　ＥＭＢＯＪ、　４．４７５．１９８５）、及び肛
■遺伝子（Ｂａｘｔｏｎら、Ｇｅｎｅ　３７．２０７．
１９８５　；　ＥＰ　１８４４３８　；　Ｎｏ　８６１
０６０９７）が使用されている。
Ａ、ニガーは、ペクチン分解酵素、例えばポリガラクチ
ュロナーゼ、ペクチンリアーゼ又はペクチンエステラー
ゼの工業的製造のための最も重要な生物である。ペクチ
ンは、α−１，４−グリコシド結合したＤ−ガラクチュ
ロン酸ポリマーから成る高分子（２０００〜４０００　
Ｄ　）のポリガラクチュロニドである。ウロン酸基の幾
つかはメタノールによりエステル化されており、これは
ペクチンエステラーゼにより開裂され得る。ペクチンは
高等植物細胞の構成成分として天然に存在し、これらは
、−次細胞壁及び中間ラメラに主として存在するセルロ
ース分子に結合している。ペクチンが特に豊富なのはレ
モン及びオレンジの皮であり、これらは約３０％のこの
ポリサッカライドを含有している。
ペクチン酵素はα−１，４−グリコシド結合の加水分解
（エンド−及びエキソ−ポリガラクチュロナーゼ）又は
トランスエレミネーション（ｔｒａｎｓｅｌｅｓｉｎａ
ｔｉｏｎ）　（ペクチンリアーゼ）のいずれかにより炭
水化物ポリマー基質を分解し、飽和の及びα−４，５−
不飽和のポリ又はオリゴガラクチュロニドを導く、エン
ド−ポリガラクチュロナーゼの組織的名称は（ポリ−（
１，４−α−Ｄ−ガラクチュロニド））グリカンヒドロ
ラーゼ（ＥＣ３，２，１，１５）であり、エキソ−ポリ
ガラクチュロナーゼのそれは（ポリ−（１，４−α−り
一ガラクチュロニド））−ガラクチュロ／ヒドロラーゼ
（ＥＣ３、２、１，６７）である、他の関連あるペクチ
ン分解ガラクチュロナーゼ酵素は、α−Ｄ−ガラクチュ
ロネートとＬ−ラムノースとの間の結合を加水分解する
ラムノガラクチェロナーゼである。
ペクチンリアーゼは高度エステル化ペクチンに対して特
異的であるが、ポリガラクチュロナーゼは低エステル化
ペクチンを加水分解する。ペクチンエステラーゼ及びポ
リガラクチュロナーゼの組合わされた作用がまた、高度
エステル化ペクチンを脱型台することができる。
果物及び野菜加工におけるポリガラクチュロナーゼ及び
酵素混合物の使用は、圧搾後のジュース及び色素の高収
量を確保するため及び圧搾原料ジュースの清澄化のため
に軟質果実を処理するためのペクチン酵素のもともとの
使用から発展した。
これらの加工のための使用における技術的酵素調製物に
は種々の量のペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロ
ナーゼ及びペクチンリアーゼ、並びに他の酵素、例えば
アラビナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、β−
１，４−グルカナーゼ、グリコシダーゼ及びプロテアー
ゼが含まれる。
主としてエンドポリガラクチュロナーゼを含み、そして
ペクチンエステラーゼを含有しない真菌ペクチナーゼ調
製物は、機械的−熱的工程により製造される製品に比べ
て可溶性固形分、色素及び栄養の含量が高（且つよりな
めらかなキメを有するバルブ状ネクターの製造のための
軟化酵素として好結果に使用される。
■−上−表（参考文献３２より） 果実及び野菜工業におけるポリガラクチュロナーゼ及び
その混合物の使用 酵　　　　素　　　　　　　　　　　　用　　　　途ペ
クチンエステラーゼ／ボリガラクチェロナーゼの組合せ
の一般的脱重合活性のため、ペクチンエステラーゼの存
在は純粋なポリガラクチュロナーゼの軟化活性を細胞分
解活性に変える。
ペクチン酵素及びセルロース分解酵素の使用により、果
実バルブの細胞壁はほとんど完全な液化の段階まで分解
され得る。エンド−及びエキソ−β−１，４−グルカナ
ーゼ（セルラーゼ）の両者及びペクチン酵素の存在が必
須である（参考文献３１）。
ポリガラクチュロナーゼ及びその酵素混合物はまた、バ
イオマスの液化又は糖化のため、例えば植物細胞からの
発酵性ポリサッカライドの製造（参考文献３３）のため
、又はペクチンの修飾のため（概観のためには参考文献
３２を参考のこと）にも有用である。キシラナーゼと組
合わされたポリガラクチュロナーゼはまた、例えば紙パ
ルプ工業においても有用である（参考文献４４）。
Ａ、ニガーにおいては、ペクチン複合体の蛋白質は構成
的に発現されない、ペクチン又はその分解生成物を用い
る誘導条件下において、他の炭素源、例えばグルコース
又はシェークロースが増殖制限的である場合に、Ａ、ニ
ガーは上記の酵素を発現する６表面培養において、ペク
チン酵素は外部細胞壁に合金したままでいる傾向がある
。
Ｒｅｘｏｖ＆−Ｂｅｎｋｏｖ＆及び？ｔａｒｋｏｖｉｃ
　（参考文献２９）並びにＲｏｓｂｏｕｔｓ及びＰｉｌ
ｎｉｋ　（参考文献１５）の両者は、アスペルギルス・
ニガー及び他の真菌並びに細菌及び植物から得られた多
数のポリガラクチュロナーゼを開示しており、これらは
精製されたと記載されている。しかしながら、構造的デ
ーターが与えられていないので、高い比活性を有する単
一ポリガラクチュロナーゼの必要性がなお存在する。
有利には、それらはそれらのアミノ酸配列の決定が可能
なだけ十分に純粋であるべきである。
以後、ポリガラクチュロナーゼ類はＰＣとも称する。
〔発明の対象〕
本発明の対象は天然宿主から又は形質転換された宿主か
らの精製された単一ＰＧである。
本発明は、単一ＰＧｌ［、例えばＰＧＩ、ＰＧＩ［。
ＰＧＩＩ　Ａ　、　ＰＧＩｆｉ　Ｂ　、　ＰＧＩＶ、特
ニＰＧＩ又ハＰＧＩ［）精製又は部分的構造決定に基礎
を置いており、これは蛋白質重の有意義な部分をコード
するＤＮＡプローブの合成を可能にするものである。
本発明の１つの対象は、ＰＧＴＩ又はＰＧＩをコードす
るＤＮＡ配列を、最終的にはそのプレー及びポスト配列
と共に、Ａ、ニガーの遺伝子ライブラリーから、ＤＮＡ
プローブを用いてスクリーニングし又は単離することで
ある。他の対象は、ＰＧＭ遺伝子（ｆｌ！！ｌｌと称す
る）又はＰＣＩ遺伝子（ｆｆｌ　Ｉと称する）の部分を
真菌株の、例えばＡ、ニガーの遺伝子ライブラリーとハ
イブリダイズせしめることにより更なるＰＣ遺伝子を同
定することである。
更なる対象は、ポリガラクチュロナーゼの構造遺伝子、
そしてさらに場合によってはＰＧ遺伝子のイントロン配
列、及び／又は制御配列、例えばプロモーター、シグナ
ル配列及び又は転写ターミネータ−配列を含んで成るポ
リガラクチュロナーゼ遺伝子発現カセットをコードする
組換えＤＮＡ分子である０本発明の更なる組換えＤＮＡ
分子は、例えば、本発明のＰＧ遺伝子に由来するＤＮＡ
を含んで成るバイブリドベクターである。
更なる対象は、前記ベクターにより形質転換された宿主
特に糸状真菌、例えばアスペルギルス宿主、組換えＤＮ
Ａ分子及び形質転換された宿主の製造方法、並びに新規
な発現カセット又はバイブリドベクターの製造のための
組換えＤＮＡ分子の使用である。
本発明の対象はまた、例えばアスペルギルス種でのＰＧ
の過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）　、及び
他のＰＣが夾雑していない単一ＰＣ又はその所定の人為
的混合物の使用である。
他の対象は、その構造遺伝子が本発明の組換えＰＧ　Ｄ
ＮＡの制御のもとで発現され得る任意の外来蛋白質の製
造に関する。
本発明の種々の対象は以後の本発明の詳細な記載から明
らかになるであろう。
〔発明の詳細な記載〕
皿喚友旦に人光予 本発明は、 ａ　）　　ｐ（Ｊ１８００又はｐＧＷ１９００のアスペ
ルギルス・ニガー（ハ朋」田はＵ慣１肛）ＤＮＡ挿入部
、ｂ）前記ａ）のＤＮＡ挿入部に含まれる成熟ＰＧ■又
はＰＧＩのコード領域にハイブリダイズし、そしてガラ
クチェロナーゼ又はポリガラクチュロナーゼ活性を有す
るポリペプチドの構造遺伝子並びに場合によってはプロ
モーター、シグナルもしくはリーダーペプチドのための
コード領域及び／又は転写ターミネータ−を含んで成る
ＤＮＡ配列、Ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義された
ＤＮＡ配列の誘導体、又は ｄ）成熟ＰＣ又はそのシグナルペプチドもしくはリーダ
ーペプチドをコードし、そして前記ａＬｂ）又はＣ）の
ＤＮＡ配列に関して遺伝子コードの意味において縮重し
ている〜ＤＮＡ配列、から選択されたＤＮＡ配列を含ん
で成る組換えＤＮＡ分子に関する。
さらに具体的には、本発明は、 ａ　）　　ｐＧＷ１８００のアスペルギルス・ニガー（
勧」」匡■赳ｒＡｈ扛）ＤＮＡ挿入部、ｂ）前記ａ）の
ＤＮＡ挿入部に含まれる成熟ＰＧｎのコード領域にハイ
ブリダイズし、そしてポリガラクチュロナーゼ活性を有
するポリペプチドの構造遺伝子並びに場合によってはプ
ロモーターシグナルもしくはリーダーペプチドのための
コード領域及び／又は転写ターミネータ−を含んで成る
ＤＮＡ配列、 Ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたＤＮＡ配列の
誘導体、又は ｄ）成熟ＰＧ又はそのシグナルペプチドもしくはリーダ
ーペプチドをコードし、そして前記ａ）＋ｂ）又はＣ）
のＤＮＡ配列に関して遺伝子コードの意味において縮重
しているＤＮＡ配列、から選択されたＤＮＡ配列を含ん
で成る組換えＤＮＡ分子；あるいは、 ａ　）　　ｐＧＷ１９００のアスペルギルス・ニガー（
Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　獲ｌＥ）　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入部
、ｂ）前記ａ）のＤＮＡ挿入部に含まれる成熟ＰＣＩの
コード領域にハイブリダイズし、そしてポリガラクチュ
ロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子並びに
場合によってはプロモーターシグナルもしくはリーダー
ペプチドのためのコード領域及び／又は転写ターミネー
タ−を含んで成るＤＮＡ配列、 Ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたＤＮＡ配列の
誘導体、又は ｄ）成熟ＰＧ又はそのシグナルペプチドもしくはリーダ
ーペプチドをコードし、そして前記ａＬｂ）又はＣ）の
ＤＮＡ配列に関して遺伝子コードの意味において縮重し
ているＤＮＡ配列、から選択されたＤＮＡ配列を含んで
成る組換えＤＮＡ分子に関する。
プラスミドｐＧＷ１８００及びｐＧＷ１９００は大腸菌
株ＪＭ１０９／　ｐＧＷ１８００及びＤＨ５αＦ’　／
ｐＧＷ１９００にそれぞれ含有されており、Ｄｅｕｔｓ
ｈｅ　Ｓａｍｓｌｕｎｇ　ｆｕｒＭｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｇｅｅｎ　ｕｎｔ　Ｚｅｌｋｕｌｔｖｒｅｎ　（Ｄ
ＳＭ）に寄託されている。
本明細書において、ポリガラクチュロナーゼ活性を有す
るポリペプチドはまたポリガラクチュロナーゼ（ＰＣ）
とも称する。この用語は、天然のポリガラクチュロナー
ゼの断片又は変異体であって酵素活性を維持しているも
のをも包含する０本明細書において使用する場合、ポリ
ガラクチュロナーゼ又はＰＧなる用語はまた、ガラクチ
ュロネートを含有するオリゴ又はポリサッカライドを基
賞として有する他のガラクチェロナーゼ、例えばガラク
チュロネートを開裂せしめるオリゴガラクチュロナーゼ
又はラムノースとガラクチュロネートとのコポリマーを
開裂せしめるラムノガラクチュロナーゼ、あるいは酵素
活性を維持しているこれらの断片又は変異体をも包含す
る。「リーダーペプチド」とは、成熟ＰＣの形成の間に
切断されるプレブローＰＧの配列を意味する。「シグナ
ルペプチド」は小胞体中の「シグナルペプチダーゼ」に
より最初の段階において切断される。
本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えば、ｐｌＪ１８００
又はｐｌＪ１９００のアスペルギルス・ニガーＤＮＡ挿
入部を含んで成る。
ｐｈｃ１８００　（第２図）の４．１ｋｂ長のＡ、ニガ
−Ｎ４００挿入部はＸｈａ　１制限部位（マツプ位置１
）からＥｃｏＲＩ制限部位（マツプ位置４１００）に伸
びる。
この挿入部はＰＧ■遺伝子のプロモーター及び転写ター
ミネータ−領域■ｌｌ並びにイントロンを含むプレプロ
ーＰＧＩ［のコード領域を含んで成る。第２図に示すお
よそマツプ位置ｌから始まりそしておよそマツプ部位３
０５０のＰｖｕ　ＩＩで終るｍ目１１を含んで成るＡ、
ニガー挿入部のＤＮＡ配列は決定されており、そして配
列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ｋ＞　　２のもとに配列表（Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｌｉｓｔｉｎｇ）に記載されている。
四■のプロモーター領域は配列番号（ＳＥＱ　１ＯＮｌ
ｌ）　２のこのＤＮＡ配列の１３５７位まで伸びる。プ
レプローＰＣＩＩのリーダーペプチドのコード領域は１
３５７位から１４３７位にわたる、シグナルペプチドは
ヌクレオチド１３５７〜１４１９によりコードされてい
る。
成熟ＰＧ■のコード領域は位置１４３８位から２４９４
位に伸びる０次に、２４９９位から始まる転写ターミネ
ータ−領域が存在する。
ｐｃ％１１１９００　（第３図）の８．６ｋｂｐ長のＡ
、ニガ−Ｎ４００挿入部は、第３図に示されるマツプ位
置１のＢａｓ＋ＩＩ　Ｉからおよそマツプ位置８６００
のＢａｍＨＩまで伸びる。およそマツプ位置６２８０か
らおよそ３８８０位まで伸びるＤＮＡ配列は配列番号（
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｉ１）ｌのもとに配列表に示される。
８、６　ｋｂｐ挿入部のプロモーター領域は配列番号（
ＳＥＱ　１０階）１のＤＮＡ配列の９１０位まで伸びる
。
プレプロ−ＰＣＩの３１アミノ酸長のリーダーペプチド
のコード領域は９１０位から１００２位まで伸びる。
シグナルペプチドはヌクレオチド９１０〜９６３により
コードされている。成熟ＰＣＩのコード領域は１００３
位で始まりそして２１２７まで伸びる。転写ターミネー
タ−領域は位置２１３１から始まる。
ｐＧＷ１９００又はｐＧＷ１８００のＡ、ニガ−Ｎ４０
０挿入部に由来するＰＣＩ又はＰＣＩ［をコードするＤ
ＮＡ配列は、ＰＣＩ又はＰＧＩＩ遺伝子の又はＡ、ニガ
ーＮ４００由来のその断片のコード領域と、ホモロガス
（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）条件下でハイブリダイズする
。Ａ。
ニガーＮ４００　ＰＧ　Ｉ又はＰＧＩＩコード領域に少
なくとも部分的に相同でありそしてＰＣ活性を有する蛋
白質をコードするＤＮＡ配列はＰＧ遺伝子群の構成員で
ある０部分的にのみ相同なりＮＡ配列は、Ａ、ニガーＮ
４００　ＰＧ　Ｉ又はＰＧＩＩ由来配列と、ホモロガス
条件よりストリンジエンシーの低いいわゆる「ヘテロロ
ガス」（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）条件下でハイブリ
ダイズする。「ヘテロロガス」条件下でのみハイブリダ
イズするＰＧ遺伝子群の構成員は、ＰＣＩ又はＰＧＩ［
以外のＡ、ニガーＮ４００のＰＧ遺伝子、あるいはＡ、
ニガーＮ４００以外のＰＣ生産性真菌株のＰＧＩ、ＰＧ
ＩＩ又は他のＰＧ遺伝子であることができる。この欅な
真菌株は、例えば、アスペルギルスの種、例えばＡ、ジ
ャポニカス（紅Ｄｙ霞工姐）、Ａ、オリゼー（紅肛Ｕ耗
）、Ａ。
ニドランス、又はＮ４００以外のＡ、ニガー株、トリコ
デルヌ・スペシス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　且μ−）
、ボトリティス・スペシス（ｈ江口ｎ号関し）　、スフ
レロチニア・スペシス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　鼾μ
Ｌ）、フザリウム・スペシス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　杢Ｊ
リシ５４４）　、あるいは他の植物病原性真菌並びに酵
母、ＰＣ生産性タルイベロミセス・スペシス（Ｋｌｏ　
ｖｅｒｏｖｌｃｅｓ朋μ−）、例えばに、フラギリス（
Ｋ、１ＬＪｉＵｉｉｉ）に由来することができる。この
様な株の好ましい例はＡ、ニガーＮＷ７５６でる。従っ
て、本発明のＰＧ遺伝子群は、ＰＧＩ　、ＰＧＩ［、Ｐ
ＧＩ［［Ａ、ＰＧＩ［ＩＢ　。
ＰＧＩＶ及び他のＰＧｌ［であって好ましくはアスペル
ギルス・スペシス、さらに好ましくはＡ、ニガー最も好
ましくはＮ４００又は１ｔｌ１７５６株、しかしさらに
他のＰＧ生産性真菌株に由来するものをコードする遺伝
子を含んで成る。ＰＧ遺伝子群の構成員をｒＰＧ遺伝子
」と称する。
ＰＧ遺伝子群の構成員の蛋白質生成物には、ガラクチュ
ロネートを含有するオリゴ−又はポリサッカライドを開
裂させることができる酵素（ガラクチュロナーゼ）、例
えばオリゴガラクチュロナーゼ、ラムノガラクチュロナ
ーゼ、そして特にポリガラクチュロナーゼが包含される
。
常用のハイブリダイゼーシッン法は、例えばＢｅｎ　ｔ
ｏｎ及びＤａｖｉｓ（参考文献７）により記載されてい
る。ホモロガス及びヘテロロガスハリブリダイゼーショ
ン条件は後でさらに正確に定義される。
「誘導体」なる語は、本発明の新規なりＮＡ配列に関し
て使用される場合、フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）
配列を含むより長い誘導体、該ＤＮＡ断片の断片及び変
異体、特に人工変異体を包含することが意図される。
新規ＤＮＡ断片のより大きな誘導体は、Ａ、ニガーのゲ
ノムから切り出され、そしてｐｃｗｉｓｏｏ又ハｐＧＷ
１９００のアスペルギルス・ニガーＤＮＡ挿入部に含有
される成熟ＰＧｎ又はＰＧＩのコードＩｍとハイブリダ
イズしそしてポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードしそしてｐｃｗｔｓｏｏ又はｐＧＷ１
９００のアスペルギルス・ニガーＤＮＡ挿入部と同じか
又はそれとは異るプロモーター、シグナル及び／又は転
写ターミネータ−配列を含有することがあるＤＮＡ配列
を含んで成るものである。この様な誘導体は、核酸の断
片化、適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ　＊　Ｂａｗ
ｌ　Ｉ又はＢｉｎｄｌ［［により該断片の処理、適当な
ベクター、例えばλファージ又はプラスミドｐＢＲ３２
２への連結、例えば大腸菌へのクローニング及び適当な
制限酵素による再度の切り出しにより得られるＡ、ニガ
ーＮ４００又はＮＷ７５６のゲノムライブラリー中に見
出すことができる。
「ヘテロロガス」条件下でＡ、ニガーＮ４００のＰＧＩ
又はＰＧＩ［遺伝子のコード領域とハイブリダイズする
ＤＮＡ配列の誘導体の好ましい例は、λＰＧ−Ａ９．　
　λＰＧ−ＡＩＯ，λＰＧ−Ａ４３．　　λＰＧ　−８
４，λＰＧ−８３５゜λＰＧ−８３６，λＰＧ−Ｃ１，
λＰＧ−Ｃ１６，λＰＧ−Ｃ２０，λＰＧ−Ｃ３７，λ
ＰＧ−ＤＢ、　　λＰＧ−Ｄｌｌ、　　λＰＧ−０１２
，λＰＧ−Ｅ６゜λＰＧ−Ｅ３８．　　λＰＧ−Ｆ５．
　　λＰＧ−Ｇ１７．　　λＰＧ−Ｇ２７．　　λＰＧ
−ｘ３１．λＰＧ−Ｘ３３．　ｐ（Ｊ１７５６及びｐＧ
Ｗ１９１０から成るベクターの群から選択されたベクタ
ーの挿入部又はその断片である。最後の１つはλＰＧ−
Ｃ２０に由来するＡ、ニガーＮ４００　ＰＧＣをコード
する構造遺伝子■Ｃを含んで成る。ｐＧＷ１７５６　（
第６図）は、Ａ、ニガーＮ４００　ＰＧＩ［遺伝子とは
異る制限パターン及びＤＮＡ配列（配列番号３を参照の
こと）を示すＡ、ニガーＮＷ７５６由来ＰＧＩＩ遺伝子
を含んで成る。従って、ＮＷ７５６及びＮＷ４００は密
接には類縁ではなく、そして糸状真菌の異る種に属する
であろう。従って、Ａ、ニガーＮ４００　ＰＧ　Ｉ又は
ＰＧＩ［構造遺伝子はへテロロガス条件下で他の種のＰ
Ｃ遺伝子ともハイブリダイズすることができる。
プラスミドｐＧＷ１７５６は約４．０００ｂｐ長のｐＥ
ＭＢＬ１８ベクター断片及び約５．５００ｂｐ長のＡ、
ニガーＮＷ７５６ＤＮＡ断片から構成されている。ＰＧ
ｎコード遺伝子加１１は約３．３００ｂｐ長の旧ｎｃＩ
ｌ制限断片内に位置する。　　ｐＧＷ１７５６はＤＳＭ
に寄託されている。
Ａ、ニガーＮＷ７５６上■のプロモーター領域は配列表
に示される配列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎａ）　　３のＤ
ＮＡ配列中のヌクレオチド８８９の前に伸びる。プレブ
ローＰＧｎのリーダーペプチドのコード領域はおそら＜
８９０位から９７０位まで伸び、他方シグナルペプチド
はヌクレオチド８９０〜９５２によりコードされている
。成熟蛋白質のコード領域はヌクレオチド９７１から始
まり２０２８位の終止コドンで終り、そしておそらく１
個のイントロンを含有する。コード領域に続き、２０３
１位から始まる転写ターミネータ−領域が存在する。
プラスミドルｃ匈１９１０　（第７図）はλＰＧ−Ｃ２
０由来の約７，８００ｂｐ長の挿入部とベクターｐＵＣ
９とから成る。Ａ、ニガ−Ｎ４００挿入部内にポリガラ
クチュロナーゼ遺伝子■Ｃが位置する。はぼ完全な■Ｃ
遺伝子のＤＮＡ配列が配列表中に配列番号（ＳＥＱ　１
０　ＮＩＩＬ）　　４のもとに与えられている。
Ａ、ニガーＮ４００Ｉ！ＪＬ！ＬＣのプロモーターはヌ
クレオチド６６３の前に延びる＊　　ｐｇａＣによりコ
ードされるブレプローＰＧのリーダーペプチドはおそら
くヌクレオチド６６３がら７８２まで伸び、そしてシグ
ナルペプチドをコードする６６３位〜７１０位のＤＮＡ
配列を含む、成熟ＰＣはヌクレオチド７８３から１９９
５まで伸びそして幾かのイントロンを含む配列によりコ
ードされる。転換ターミネータ−領域は１９９９位の終
止コドンの後から始まる。
本発明に含まれるハイブリダイズするＤＮＡ配列の誘導
体は、ｐＧ紳１８００又はｐＧＷ１９００中のものと同
じプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネータ
−配列又はポリガラクチュロナーゼ遺伝子群の他の遺伝
子に由来するであろう他のプロモーター、シグナル及び
／又は転写ターミネータ−配列を含んで成る。さらに、
所望のＰＧが発現されるべき宿主に依存して、他のプロ
モーター、シグナル及び／又は転写ターミネータ−配列
を、ハイブリダイズするＤＮＡ配列に付加することがで
きる。
広範囲の種類のプロモーター、シグナル配列及び転写タ
ーミネータ−を用いることができる。プロモーターは一
般に原核性、真核性又はウィルス性遺伝子の５′−非コ
ード領域から得られ、他方転写ターミネータ−は３′−
非コード領域から得られる。シグナル配列は、細胞の分
泌経路に導入される蛋白質の５′−コード領域から得ら
れる。
プロモーターの例を後に記載する。
本発明に関してシグナル配列は、本発明のプレプローＰ
Ｇのシグナルペプチド又はリーダーペプチドをコードす
るＤＮＡ配列である。
本発明の意味においてフランキング配列はさらに、ゲノ
ム中のＰＣ遺伝子を挾む（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列に由
来しない配列である。この様なフランキング配列は例え
ば制御機能、例えばプロモーター機能を有し、又はペプ
チドをコードし、例えば構造遺伝子であり、又は制御配
列と構造遺伝子とを正しいリーディングスレーム及び距
離にお（リンカ−であり、又は発現プラスミドの作製に
おいて使用されるベクター、例えばファージ又はプラス
ミドに由来する配列である。この様なフランキング配列
は発現カセット又は融合遺伝子に生ずるであろう。
「断片」なる語は、新規ＤＮＡに関して使用する場合、
より大きな誘導体の断片、特にプロモーター、シグナル
、構造又は転写ターミネータ−機能を保持しているもの
をも包含する。これらは２個の制限部位間に伸びるであ
ろう。
好ましいＤＮＡ断片は、プロモーター領域を含み、プレ
プロ−ＰＧのリーダー又はシグナルペプチドをコードし
、又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードし、又は転写ターミネータ−領域を含むもの
である。従って、本発明のＤＮＡ配列はまたこれらの断
片の任意の組合せを含有するものであり、例えばプロモ
ーター及び／又はリーダーもしくはシグナルペプチドの
コード領域、及び／又はＰＧのコード領域、及び／又は
転写ターミネータ−１等を含有するものである。
ＰＧプロモーター領域を含んで成る断片はＤＮＡ配列中
をプレブローＰＧ構造遺伝子の前から約２０００まで、
好ましくは約５００〜１４００ヌクレオチド上流まで伸
びる。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼ及び制御
蛋白質と結合する。
ＰＣＩ遺伝子ＦＪｉｄｌのプロモーター領域を含んで成
る断片は例えば配列番号（ＳＥＱ　１０　ｌ＋４［Ｌ）
　　１の配列の１位から９０９位まで伸びる。Ａ、ニガ
ーＮ４００のＰＧＩ［遺伝ｍｌｌのプロモーター領域を
含んで成る断片は、例えば配列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎ
［Ｌ）　　２の配列の１位から１３５６位まで伸びる。
ｐＧＷ１７５６のＡ、ニガーＮＷ７５６挿入部において
、ｐｇａ　ＩＩのプロモーター領域ｎ域を含んで成る断
片は配列番号（ＳＥＱ　ＩＮ　Ｎｕ）３における１位か
ら８８９位まで伸びる。ｐｌＪ１９１０のＡ、ニガー挿
入部において、ｍ巳Ｃのプロモーター領域を含んで成る
断片は配列番号Ｃ３ＥＱ　ＩＤ　Ｆ’ｋｘ”）４の配列
の１位から６６２位まで伸びる。
プレプロ−ＰＧのリーダーペプチドをコードするＤＮＡ
配列を含んで成る断片は例えばプロモーターの終点と成
熟蛋白質をコードする配列の始点との間に伸びる。シグ
ナルペプチドのコード領域は対応するリーダーペプチド
のそれよりも短い。
これもプロモーターの終点で始まり、そしてシグナルペ
プチド開裂部位のコード領域まで伸びる。
Ａ、ニガーＮ　４００ブレプローＰＧＩＩにおいて、リ
ーダーペプチドは２７アミノ酸を含んで成る。リーダー
ペプチドをコードするＤＮＡ断片は例えば、配列番号（
ＳＥＱ　ＩＤ患）２のＤＮＡ配列の１３５７位のＡＴＧ
：！　Ｆンから１４２９位のＸｈｏ　Ｉ開裂部位まで伸
びる。プレプロ−ＰＣＩにおいて、リーダーペプチドは
３１アミノ酸を有する。このリーダーペプチドをコード
するＤＮＡ断片は例えば配列番号（ＳＥＱ　１ＯＮａ）
ＩのＤＮＡ配列＋７）　９２０位と１００２位との間で
伸びる。Ａ、ニガーＮＷ７５６ブレプローＰＧｎのリー
ダーペプチドはおそら（２７アミノ酸を有し、そしてそ
れ故に該リーダーペプチドをコードするＤＮＡ断片は配
列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎ１１）　３のＤＮＡ配列の８
８９位と９７１位との間に伸びる８ｌ−ｂｐ長のＤＮＡ
断片である。Ａ、ニガーＮ　４００の用ｃ生成物のおそ
らり４０アミノ酸のリーダーペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片は配列番号（ＳＢＱ　１０　Ｎｉ１）　　４の配
列の６６３位から７８２位まで伸びる。
それぞれのシグナルペプチドのコード領域は、例えば、
次のアミノ酸断片上に位置する：配列番号（ＳＥＱ　１
０漱）１中の９１１位〜９６３位、配列番号（ＳＥＱ　
１０磁）２中の１３５８位〜１４１９位、配列番号（Ｓ
ＥＱ　１０阻）３中の８９０〜９５２、及び配列番号（
ＳＥＱ　１０　ＮＩＬ）　　４中の６６３〜７１００成
熟ＰＣＩのための完全なコード領域を含んで成る断片は
、例えば、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　階）　　１の配列
の１００３位から２１２７位まで伸びる。成熟Ａ。ニガ
ーＮ４００ＰＧＩ［のための完全なコード領域を含んで
成る断片は、例えば配列番号（ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＣＬ）
　　２の配列の１４３０位から２４９７位まで伸びる。
成ＰＡ、ニガーＮＷ７５６　ＰＧｎは、例えば、配列番
号（ＳＥＱ　１０　Ｎａ）３の配列の９５３位から２０
２７位に伸びるＤＮＡ断片によりコードされ、そして成
熟ツ巳Ｃ遺伝子生成物は、例えば、配列番号（ＳＥＱ　
ＩＱ　Ｎｃｔ）　　４の配列の塩基阻７８２とＮｃｔｌ
、９９６との間に位置するＤＮＡ断片によりコードされ
ている。
ＰＧｎ又はＰＣＩ及び他のＰＣ類の構造遺伝子は、多く
の真菌遺伝子と同様にイントロンを含有する場合がある
。しかしながら、イントロンを有しないＰＧ構造遺伝子
、例えばゲノムＤＮＡ配列としてイントロンを含有しな
いもの又はｃＤＮＡから得ることができるものも本発明
の範囲に含まれる。
転写ターミネータ−を含んで成る断片は、例えば、ＰＣ
のコード領域の終点の終止コドン、例えばＴＡＡ、　Ｔ
ＡＧ又はＴＧＡから下流方向に約２００〜２０００、好
ましくは約５００−１０００塩基対まで伸びる。
この様な断片は、例えば、配列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎ
ｉ１）１の配列の塩基位置２１３１から２４９５位まで
、配列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎａ）　　２の配列中の２
４９８位から３０３１位まで、配列番号（ＳＥＱ　１０
　Ｆ４ａ’）　３　ノ配列中（７）２０３１位かう３０
４７位マチ、そして配列番号（ＳＥＱ　ＩｒＪｌｌｈ）
　４の配列中の１９９９位から２３０４位まで、それぞ
れ伸びる。
しかしながら、前記の断片は天然５′−フランキング配
列によって延長されることができ、５′−又は３′−末
端において短縮されることができ、そしてそれにも拘ら
ずプロモーター又は転写ターミネータ−活性を維持する
ことができ、あるいはコードされたポリペプチドはシグ
ナルペプチド又はガラクチュロナーゼ活性を維持するこ
とができる。この様な断片もまた本発明の範囲に含まれ
る。
前記の断片は、他のＤＮＡ分子への好結果の連結を提供
しそして／又は制御機能を有するがもしくはポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片、例えばプロモーター及び構
造遺伝子を正しいリーディングフレーム又は距離に置く
リンカ−を含有することができ、又は末端に有すること
ができる。
前記断片への適当なリンカ−は、断片が連結されるべき
ＤＮＡの制限部位に適合するＤＮＡ配列を有する。
本発明のＤＮＡ配列の変異体は例えば天然変異体である
。本発明はまた、類似の又は同一の疎水性プロフィール
を有するシグナル又はリーダーペプチドのコード領域の
天然又は合成変異体を含み、この場合例えば、橿性アミ
ノ酸であるヒスチジン（Ｈ’ゝ）、チロシン（Ｙ’−）
及びアルギニン（Ｒ＃”）のコドンが類似の電価を有す
る他のアミノ酸のコドンと交換されており、そして疎水
性アミノ酸であるアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）及び
スレオニン（Ｔ）のコドンが他の疎水性アミノ酸のコド
ンにより置き換えられている。例えば、正に荷電したリ
ジンのコドンをアルギニンのコドンにより置き換えるこ
とができそしてこの逆も可能であり、負に荷電したチロ
シンのコドンをグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の
コドンにより置き換えることができ、モして／又は非極
性疎水性アラニンのコドンをスレオニン、プロリン、バ
リン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はフェニ
ルアラニンのコドンの１つにより置き換えることができ
る。
本発明の組換えＤＮＡ分子はまた、コードされるアミノ
酸配列を変えることなく多数のヌクレオチドが他のヌク
レオチドにより置き換えられるように遺伝子コードの意
味において縮重しているＤＮＡ配列をも含む。この様な
縮重ＤＮＡ配列はそれらの異る制限部位のために、又は
特定の宿主における好ましいコドンの使用のために有用
である。
本発明の組換えＤＮＡ分子は、ｐｌＪ１８００゜ｐＧＷ
１９００．　ｐＧＷ１７５６．　ｐ（Ｊ１９１０．　　
λＰＧ−Ａ９．　　λＰＧ−ＡＩＯλＰＧ−Ａ４３．　
　λＰＧ−Ｂ４．　　λＰＧ−Ｂ３５．　　λＰＧ−Ｂ
３６．　　λＰＧ−ＣＩ、　　λＰＧ−Ｃ１６，λＰＧ
−Ｃ２０，λＰＧ−Ｃ３７，λＰＧ−０８゜λＰＧ−Ｄ
１１．　　λＰＧ−Ｄ１２．　　λＰＧ−８６，λＰＧ
−２３８，λＰＧ−Ｆ５゜λＰＧ−Ｇ１７．　　λＰＧ
−Ｇ２７．　　λＰＧ−Ｘ３１、及びλＰＧ−Ｙ３３か
ら成るバイブリドベクターの群から選択されたバイブリ
ドベクターのアスペルギルス・ニガーＤＮＡ挿入部、又
はＰＧ遺伝子のプロモーター領域を含んで成るその断片
、又はシグナルペプチド、リーダーペプチド、ブレプロ
ーＰＧ、ＰＣもしくはポリガラクチュロナーゼ活性を有
するＰＧの断片のためのコード領域、又はＰＧ遺伝子の
転写ターミネータ−領域を主として含んで成る。
本発明はまた、前記のベクターの群から選択された１つ
のベクターに主として由来する本発明のプロモーター領
域、リーダー又はシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
断片、構造遺伝子及び／又は転写ターミネータ−領域を
含んで成る発現カセットである組換えＤＮＡ分子に関す
る。
「発現カセット」なる語は、ポリペプチドを発現するこ
とができそしてプロモーター、所望によりシグナル配列
、さらに構造遺伝子、所望により転写ターミネータ−１
及び場合によっては転写エンハンサ−、リボゾーム結合
部位及び／又は更なる制御配列を含んで成るＤＮＡ配列
を意味する。
本発明の発現カセットにおいては、ＰＧ遺伝子由来の機
能的断片が他の遺伝子に由来する機能的断片と組合わさ
れる場合がある。
宿主細胞の性質に依存して広範囲の種類のプロモーター
配列を用いることができる０強力であり且つ同時によく
制御されるプロモーターが最も有用である。翻訳の開始
のための配列は例えばシャインーダルガーノ（Ｓｈ　１
ｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇａｎｏ）配列である。
転写の開始及び停止並びに■ＲＮＡの安定化のために必
要な配列は一般に、例えば発現宿主からのウィルス性又
は真核性ｃＤＮＡのそれぞれ非コード５′領域及び３′
−領域から得られる。
プロモーターの例は、λＰＬ＋　　λＰｍ＋　大腸菌１
ａｃ。
ｔｒｐ、　ｔａｃ、酵母ＴＲＰＩ−，ＡＤＨＩ−、ＡＤ
ＨＩＩ−、ＰＩＩ０３−。
Ｐ）１０５−又は解糖系プロモーター、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）　
、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホ
スホフラクトキナーゼ、グリコース−６−ホスフェート
イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼの遺伝子
のプロモーター、あるいは真核性ウィルス、例えばＳＶ
４０、ラウス肉腫ウィルス、アデノウィルス２、ウシパ
ピローマウィルス、パボバウィルス及びサイトメガロウ
ィルス由来のプロモーター、又は哺乳類細胞由来のプロ
モーター、例えばアクチン、コラーゼン、ミオシン又は
β−グロビン遺伝子由来のプロモーターである。真核性
プロモーターを増強配列（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　５ｅｑ
ｕｅｎｃｅ）、例えば酵母上流活性化配列（ＵＡＳ）あ
るいはウィルス性又は細胞性エンハンサ−１例えばサイ
トメガロウィルスＩＢエンハンサ−１ＳＶ４０エンハン
サ−１免疫グロブリン遺伝子エンハンサ−等と組合わせ
ることができる。
エンハンサ−は、例えば、ウィルス、例えばシミアン（
Ｓｉ繻ｊａｎ）ウィルス、ポリオーマウィルス、ウシパ
ピローマウィルスもしくはモロネー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）
肉腫ウィルス由来の、又はゲノム由来の、転写刺激ＤＮ
Ａ配列である。エンハンサ−配列また、フィザリウム・
ポリセファルム（ハ■肛憇匹鉦憇助旦憇）の染色体外リ
ボゾームＤ　Ｎ　Ａ　（ＰＣＴ／ＨＰ　８５００２７Ｂ
）又はＰＨ０５，ｔｒｐ、　ＰＨ５−ＧＡＰＤＨバイブ
リド（ＥＰ出願Ｎα８６１１１Ｂ２０．６）　、又は類
似のプロモーターからの上流活性化部位であることがで
きる。
シグナル配列は、例えば、ポリペプチドの分泌を指令す
るブレ配列又は分泌リーダー、等である。
シグナル配列は、例えば、プレプロ−ＰＧＩ、プレプロ
ーＰＧｎ又はブレプローＰＧＣのシグナル又はリーダー
ペプチドである。更なるシグナル配列は文献から既知で
あり、例えばｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、、　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．４６８３（１９
８６）中に編集されているものである。
これに関連して、構造遺伝子は、ＰＣＩ又はＰＣＩＩを
コードするものの外に、他のＰＧｌｉ及び誘導体、特に
ＰＧ活性を有するその断片をコードするもの又は他のア
スペルギルス遺伝子、及びウィルス、原核細胞又は真核
細胞に由来しそしてゲノムＤＮＡ又は―ＲＮＡルートを
介して調製されるｃＤＮＡから誘導することができ又は
化学的に合成することができ、特に高等真核生物特に哺
乳類、例えば動物又は特にヒト由来の、グリコジル化ポ
リペプチドを含めての広範な有用なポリペプチド、例え
ば、栄養の製造のため及び化学において酵素反応を行う
ための酵素、ヒト及び動物の疾患の治療又は予防のため
に有用で且つ価値があるポリペプチド、例えばホルモン
、免疫調節性を有するポリペプチド、抗−ウィルス性及
び抗−腫瘍性蛋白質、抗体、ウィルス抗原、ワクチン、
凝固因子、食品等をコードする構造遺伝子である。
この様な構造遺伝子の例は、例えば、ホルモン、例えば
セクレチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン、黄
体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノコルチコ
トロビン、色素細胞刺激ホルモン、β−リボトロピン、
ウロガストロンもしくはインシュリン、成長因子、例え
ば上皮細胞成長因子、インシュリン様成長因子ＣＩＦＧ
）例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−Ｉ［、マスト細胞成長
因子、神線成長因子、ダリア由来神経細胞成長因子、又
は形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦβ、成長
ホルモン、例えばヒト又はブタ成長ホルモン、インター
ロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−２、
ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インター
フェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例えばイ
ンターフェロンαＡ、αＢ、αＤもしくはαＦ、β−イ
ンターフェロン、γ−インターフェロン又はバイブリド
インターフェロン、例えば、αＡ−αＤ−又はαＢ−α
Ｄ−バイブリドインターフェロン、特にバイブリドイン
ターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼインヒビター、
例えば、α。
−アンチトリプシン、ＳＬＰ　１等、肝炎ウィルス抗原
、例えば肝炎Ｂウィルス表面もしくはコアー抗原又は肝
炎Ａウィルス抗原、又は肝炎非Ａ−非Ｂ抗原、プラスミ
ノーゲン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性
化因子もしくはウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトス
タチン、レニン、β−エンドルフィン、免疫グロブリン
、例えば免疫グロブリン口、ＥもしくはＧのライト鎖及
び／又はヘビー鎖、又はヒト−マウスバイブリド免疫グ
ロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロブ
リンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連
ペプチド、血液凝固因子、例えばファクター■もしくは
■。、エリスロボイエチン、ニグリン、例えばニグリン
Ｃ１ヒルジン、デスルファトヒルジン、例えばデスルフ
ァトヒルジン変形体ＨＶ４．ＨＶ２又はＦＡ、ヒトスー
パーオキシドジスムターゼ、ウィルスチミジンキナーゼ
、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ等をコー
ドする遺伝子である。好ましい遺伝子は、ヒトα−イン
ターフェロン又はバイブリドインターフェロン、特にバ
イブリドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウィルス表面
抗原（ＨＢＶｇＡｇ）、インシュリン様成長因子Ｉ及び
■、ニグリンＣ及びデスルファトヒルジン、例えば変形
体ＨＶＩをコードする遺伝子である０本発明のバイブリ
ドベクターにおいては、本発明のプロモーター及び／又
はシグナル配列がポリペプチドコード領域に作用可能に
連結されており、これによりポリペプチドの効率的な発
現が保証される。
本発明はまた、組換えベクターあるいはバイブリドベク
ターとも称される組換えＤＮＡ分子に関し、該ベクター
は、 ａ　）　　ｐＧＩ１１１８００又はｐＧＷ１９００のア
スペルギルス・ニガーＤＮＡ挿入部、 ｂ）前記ａ）のＤＮＡ挿入部に含まれる成熟ＰＧＩＩ又
はＰＧＩのコード配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列
、 Ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたＤＮＡ配列の
誘導体、又は ｄ）成熟ＰＧ又はそのシグナルペプチドもしくはリーダ
ーペプチドをコードしそして遺伝子コードの意味におい
て縮重している前記ａ）、ｂ）又はＣ）のＤＮＡ配列、 から選択されたＤＮＡ配列を含んで成る。
これらは、細菌、真菌又は動物細胞のごとき宿主でのク
ローニング及び／又は発現のために有用である。
これらのバイブリドベクターは、遺伝子工学の分野にお
いて有用な任意のベクターから、例えばウィルス、ファ
ージ、コスミド、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、例えば
ＳＶ４０の誘導体、ヘルペスウィルス、パピローマウィ
ルス、レトロウィルス、バキュロウィルス、ファージλ
、例えばＮＭ９８９もしくはＥＭＢＬＬ　、又はファー
ジＭ１３、例えばＢａｍ１ｌ　Ｉ消化により線状化され
たＭ１３ｇｇｐ８ファージＤＮＡ（参考文献１５）、細
菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２゜ｐＵｃｌＢ、又は
酵母プラスミド、例えば酵母２μプラスミド、又はさら
にアスペルギルスの種例えばＡ、ニガーのごとき糸状真
菌に由来する染色体ＤＮＡ、例えばＥＰ　１８４．４３
８に記載されているもの、あるいは欠陥のあるウィルス
、ファージ又はプラスミドの複製を可能にするヘルパー
ウィルス、ファージ又はプラスミドの存在下での欠陥を
有するウィルス、ファージ又はプラスミド、例えばＭ１
４ＫＯ７ヘルパーフアージの存在下でのＭ１３（＋）Ｉ
ｓベクター、から誘導することができる。
本発明のバイブリドベクターは、染色体外要素として又
は宿主染色体への組込みによって、適当な宿主中での目
的のＤＮＡの複製及び場合によっては発現をもたらす０
本発明のクローン化ＤＮＡの組込み及び発現のために幾
つかの可能なベクター系が利用可能である。原理的には
、選択された宿主中で本発明の発現カセット中に含まれ
る目的のポリペプチド遺伝子を複製及び／又は発現する
すべてのベクターが適当である。ベクターは、形質転換
のために予想される宿主細胞に依存して選択される。一
般に、この様な宿主細胞は原核性又は真核性の微生物、
例えば細菌、真菌、例えば酵母又は糸状真菌、又は高等
真核性の細胞、例えばを推動物例えば哺乳類の細胞であ
る。適当な宿主細胞は後でさらに詳細に検討する。原理
的には、本発明のバイブリドベクターは、前記のような
りＮＡ、複製起点又は自律複製配列、優性マーカー配列
、場合によっては、目的のＤＮＡの転写及び翻訳のため
に必須の発現制御配列、及び場合によっては、目的の生
成物の分泌のための配列、及び場合によっては、追加の
制限部位を含んで成る。
複製起点又は自律複製配列（染色体外要素に自律複製能
力を付与するＤＮＡ要素）は、シミアンウィルス（ＳＶ
４０）又は他のウィルス源由来のごとき異種源を含める
ベクターの作製により、あるいは宿主細胞の染色体機構
によって提供される。
本発明のバイブリドベクターは、形質転換され、選択さ
れそしてクローン化されるべき宿主に依存して選択マー
カーを含有することができる。マーカーの表現型発現に
より形質転換体の選択を促進する任意のマーカー遺伝子
を用いることができる。
適当なマーカーは特に、例えばテトラサイクリンもしく
はマンピシリンに対する抗生物質耐性を示すもの、又は
栄養要求性真菌変異株の場合には、宿主の欠陥を補完す
る遺伝子である。対応する遺伝子は例えば、抗生物質シ
クロヘキシミドに対する耐性を提供し、又は栄養要求酵
母変異体、例えばガ立ｌ、違凹ｉ、加１１又はお１上遺
伝子において原栄養性を提供する。形質転換されるべき
宿主がマーカーにより発現される生成物について栄養要
求性であれば、自律複製セグメントと関連する構造遺伝
子をマーカーとして用いることも可能である。
特に重要なものは、Ａ、ニガー宿主の欠陥を補完するマ
ーカー遺伝子、例えば、Ａ、ニガーもしくはＡ、ニドラ
ンス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ
をコードする但ＩＢ遺伝子（ＥＰ　１８４．４３８）、
又はＮ、クラッサ（Ｎ、　ｃｒａｓｓａ）ｍ遺伝子に相
同なＡ、ニドランスＤＮＡ断片である。
本発明の好ましい具体例は本発明の発現カセットを含ん
で成るバイブリドベクターであり、例えば構造遺伝子及
び／又はプロモーター及び／又はリーダーもしくはシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ配列及び／又は本発明
のＰＧ遺伝子由来の転写ターミネータ−を含んで成るも
のである。
本発明の発現カセットを含んで成るバイブリドベクター
の例は、ｐ（Ｊ１８００．　　ｐＧＷ１９００．　　ｐ
ＧＷ１９１０゜ｐＧＩ［−１ＰＮ　ＡＭ１１９．　ｐＧ
Ｉ［５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９．　ｐＧＷ１７５６゜λ
ＰＧ−ＡＩＯ，λＰＧ−＾４３．λＰＧ−Ｄ８　、及び
λＰＧ−Ｄｌｌである。
本発明の対象は、前記のＰＧ遺伝子由来挿入部を含んで
成る組換えＤＮＡ分子のみならず、ＰＧ生産性真菌株、
例えばアスペルギルスの種、例えばＡ、ジャポニクス（
Ａ、ｉｗ頗亙姐）、Ａ、オリゼー（Ａ、　竺Ｈ並）　、
Ａ、＝トランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）Ａ、ニガー
（Ａ、ｎｅｇｅｒ）、トリヵデルマ・スペシス（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ　　邊」シ生Ｓ４工）　、ボトリチス
・スペシス（ｈ豆ムロ」旦−）　、スフレロチニア・ス
ペシス（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　５問−）　、フザリ
ウム・スペシス（Ｆｕｓａｒｉｕｗημ−）、又は他の
植物病原真菌、並びに酵母、例えばＰＣ生産性タルイベ
ロミセス・スペシス（Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ　１
」リシＳ２工）　、例えばＫ。
フラギリス（Ｋ、　す■旦ｎ）から単離することができ
る、ＰＧ遺伝子又はその機能的断片を含んで成るＤＮＡ
分子、例えばプロモーター、シグナルペプチド、リーダ
ーペプチド又はＰＧ活性を有する蛋白質のコード領域又
は転写ターミネータ−領域それ自体を含んで成るもので
ある。Ａ、ニガーから単離されるＤＮＡ分子が好ましい
。
本発明のＤＮＡ分子及び断片を含めてのその誘導体は、
更なる＊ｍのＤＮＡ又はｍＲＮＡを得るために、ＤＮＡ
遺伝子ライブラリー又は閣ＲＮＡをスクリーニングする
ために用いることができる。
えＤＮＡ　　　　の　　゛ 本発明の更なる対象は前記の組換えＤＮＡ分子の製造方
法であり、この方法は、そのような組換えＤＮＡ分子に
より形質転換された宿主を培養し、又はそれをインビト
ロで合成することを含んで成る。
宿主の培養は、非形質転換体すなわち目的のＤＮＡ分子
を欠（宿主からの形質転換体すなわち目的のＤＮＡ分子
を選択マーカーと共に含有する宿主の負の又は正の選択
を可能にする化学物質を補充した又はこれを欠く常用の
栄養培地中で行われる。
当業界において有用な任意の形質転換可能な宿主、例え
ば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサツカロミセス・
セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）　、タルイベロミセス・ラクチス（Ｕ可ｖ
目１匹競１ａｃｔｉｓ）　、又は特に糸状真菌、例えば
アスペルギルス、例えばＡ、ニドランス、Ａ、オリゼー
、Ａ、アワモリそして特にＡ、ニガーを使用することが
できる。好ましい宿主は後にさらに記載するシェＡ遺伝
子を欠く変異株であるＡ、　ニガーＡｎ８、又はＡ、ニ
ガーＮ５９３である。
宿主の形質転換は常法により行われる。
本発明の組換えＤＮＡ分子中に含まれるＤＮＡ配列はポ
リガラクチュロナーゼを発現する真菌のゲノムから得る
ことができ、又は本発明の組換えＤＮＡ分子により形質
転換された宿主を培養しそして所望によりそこから目的
のＤＮＡを単離するか、又はヌクレオチド縮合による化
学合成により製造することができる。
特に、この様なりＮＡは、 ａ）適当な真菌細胞からゲノムＤＮＡを単離し、例えば
ＤＮＡプローブを用いて又は適当な発現系を用いて目的
のＤＮＡを選択し、そして目的のポリペプチドの発現に
ついて選択し；あるいは、ｂ）適当な真菌細胞からｍＲ
ＮＡを単離し、例えばＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーシヨンにより又は適当な発現系での発現により目的
のｍＲＮＡを選択しそして目的のポリペプチドの発現に
ついてスクリーニングし、その−ＲＮＡに対して相補的
な単鎖ｃＤＮＡを調製し、次にそこから二本鎖ｃＤＮＡ
を調製し；あるいは、 Ｃ）　ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離し、そ
して例えばＤＮＡプローブを用いて又は適当な発現系を
用いて目的のｃＤＮＡを選択し、そして目的のポリペプ
チドの発現についてスクリーニングし；そして／又は ｄ）前記段階ａ）、ｂ）又はＣ）の二本鎖ＤＮＡを適当
なベクターに導入し； ｅ）得られたバイブリドベクターにより適当な宿主細胞
を形質転換し； ｆ）目的のＤＮＡを含有する形質転換された宿主細胞を
未形質転換宿主細胞から選択し、そして形質転換された
宿主細胞を増幅し；そして、所望により、 ｇ）目的のＤＮＡを単離し、そして／又は該ＤＮＡをそ
の変異体又は断片に転換する；ことにより製造すること
ができる。
ゲノムＤＮＡを単離しそして目的のＤＮＡについてスク
リーニングすることができる（段階ａ）。
ゲノムＤＮＡは、ＰＣ活性を有する蛋白質を発現する適
当な真菌株から単離される。そこから、確立された方法
に従っての適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化及
び適当なベクターへの導入によりゲノムＤＮＡライブラ
リーを調製する。このゲノムＤＮＡライブラリーを後記
のＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、又は適当
な発現系において発現せしめそして得られたポリペプチ
ドを常法に従ってスクリーニングする。ゲノムライブラ
リーからの本発明のＤＮＡ分子の単離については後で詳
細に記載する。
ポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡは既知の方法によ
り適当な細胞から単離される（段階ｂ）。
単離方法は、例えば、洗剤及びリボヌクレアーゼ阻害剤
、例えばヘパリン、グアニジニウムイソチオシアナート
又はメルカプトエタノールの存在下でホモジナイズし、
場合によっては塩及び緩衝液、洗剤及び／又は陽イオン
キレート剤の存在下で適当なりロロホルムーフェノール
混合物によりｍＲＮＡを抽出し、そして−ＲＮＡを残り
の水性塩含有相からエタノール、イソプロパツール等に
よりｍＲＮＡを沈澱せしめることを含む。単離されたー
ＲＮＡは、塩化セシウムグラジェント中での遠心分離及
びそれに続くエタノール沈澱及び／又はクロマトグラフ
ィー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、例
えばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファ
ロース上でのクロマトグラフィーによりさらに精製する
ことができる。好ましくは、このようにして精製された
全−ＲＮ＾を、勾配遠心分離により、例えば直線シュー
クロース勾配中で、又は適当なサイズ画分カラム、例え
ばアガロースゲル上でのクロマトグラフィーにより、サ
イズに従って分画する。
目的の−ＲＮＡは、ＤＮＡプローブを用いてｍＲＮＡを
直接スクリーニングすることにより、あるいは適当な細
胞系又は無細胞系での翻訳及び得られたポリペプチドの
スクリーニングにより、選択される。
目的ｍＲＮＡの選択は好ましくはＤＮＡハイブリダイゼ
ーシジンプローブを用いて行われ、これにより追加の翻
訳段階が回避される。適当なりＮＡプローブは、少なく
とも１７ヌクレオチドから成る既知ヌクレオチド配列の
ＤＮＡ、例えば合成りＮＡ、目的のポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、又は天然源からもしく
は遺伝子操作された微生物から単離された隣接ＤＮＡ配
列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片である。
合成りＮＡプローブは、後記のように既知の方法に従っ
て、好ましくは固相ホスホトリエステル法、ホスファイ
トトリエステル法又はホスホラミダイト法を用いる段階
的縮合により例えばホスホトリエステル法によるジヌク
レオチドカップリングユニットの縮合により合成される
。これらの方法は、Ｙ、Ｉｋｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＬ　４７’Ｌ１９８３
）により記載されているように適切な縮合段階での対応
するジヌクレオチドカップリングユニット又は保護され
た形の２，３又は４ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ，ｄＧ及び
／又はｄＴの混合物を用いることにより、目的のオリゴ
ヌクレオチドの混合物を合成するように適合される。
ハイブリダイゼーシヨンのため、ＤＮＡプローブは標識
される０例えばよく知られているキナーゼ反応により放
射能標識される。標識を含有するＤＮＡプローブとサイ
ズ分画されたｍＲＮＡとのハイブリダイゼーシヨンは既
知の方法に従って、すなわち緩衝液、及び助剤、例えば
カルシウムキレータ−１粘度調節剤、蛋白質、ヘテロロ
ガスＤＮＡ等を含有する塩溶液中で、選択的ハイブリダ
イゼーションに好都合な温度、例えばＯ℃〜８０°Ｃ１
例えば２５°Ｃ〜５０℃又は約６５℃、好ましくはハイ
ブリド二本鎖ＤＮＡの溶融温度より約２０″Ｃ低い温度
において行われる。
分画されたｍＲＮＡは、細胞、例えばカエル細胞中で、
又は無細胞系、例えば網状赤血球溶解物又は小麦胚芽抽
出物系において翻訳され得る。得られたポリペプチドは
、酵素活性について、又は生来のポリペプチドに対して
生じた抗体との反応について、例えばイムノアッセイ、
例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は
蛍光マーカーを用いるイムノアッセイにおいてスクリー
ニングされる。これらのイムノアッセイ並びにポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体の製造方法は当業界
においてよく知られており、そしてそれ故に適用される
。
選択されたｍＲＮＡ鋳型からの単鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）の調製は当業界においてよ（知られており、単鎖
ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製も同様である。−ＲＮ
Ａ鋳型は、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、場
合によっては放射能標識されたデオキシヌクレオシドト
リホスフェート（反応の結果をスクリーニングできるよ
うにするため）、プライマー配列、例えば−ＲＮ＾のポ
リ　（Ａ）テイルとハイブリダイズするオリゴｄＴ残基
、及び適当な酵素、例えばトリ骨髄芽球溶解ウィルス（
ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｖｕｓ
　：　ＡＭＶ）からの逆転写酵素、の混合物と同にイン
キエベートする。例えばアルカリ加水分解による鋳型ｍ
ＲＮＡの分解の後、ｃＤＮＡをデオキシヌクレオシドト
リホスフェート及び適当な酵素との混合物と共にインキ
エベートして二本ｌＤＮＡを得る。適当な酵素は例えば
、逆転写酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片又はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼである０通常、
単鎖ｃＤＮＡにより自然に形成されるヘアービンループ
構造が第二鎖の合成のためのブライマーとして作用する
。
このヘアーピン構造はＳ１ヌクレアーゼによる消化によ
って除去される。あるいは、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解に
先立って単１ＩＤＮＡの３′−末端がまずホモポリマー
デオキシヌクレオチドテイルにより延長され、そして次
に第二ｃＤＮＡｌ［が合成される。
あるいは、ｃＤＮＡライブラリーから二本鎖ｃＤＮＡが
単離されそして目的ｃＤＮＡについてスクリーニングさ
れる（段階Ｃ）。このｃＤＮＡライブラリーは、適当な
細胞からｍＲＮＡを単離し、そしてそこから前記のよう
にして単鎖及び二本１［ｃＤＮＡを調製することにより
作製される。このｃＤＮＡは適当な制限エンドヌクレア
ーゼにより消化され、そして確立されている方法に従っ
てλファージ、例えばλシャロン４Ａ又はλｇｔｌｌに
導入される。ニトロセルロース膜上に複製されたｃＤＮ
Ａライブラリーは、上記のＤＮＡプローブを用いてスク
リーニングされ、あるいは適当な発現系により発現され
そして得られたポリペプチドが目的化合物に対して特異
的な抗体との反応についてスクリーニングされる。
二本１１［ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを適当な宿主に導
入する（段階ｄ）のための種々の方法が当業界において
知られている０例えば、対応するデオキシヌクレオシド
トリホスフェート及び酵素、例えばターミナルヌクレオ
チジルトランスフェラーゼの存在下で二本１１ＤＮＡ及
びベクターＤＮＡの両者に相補的ホモポリマートラクト
を付加する０次に、相補的ホモポリマーチイル間の塩基
対合によりベクター及び二本鎖ＤＮＡを連結し、そして
最後に、リガーゼのごとき特異的連結酵素により結合さ
せる。他の可能性は、平滑末端連結又は接着末端連結に
よる、二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカ−の付加又は
ベクターへの二本鎖ＤＮＡの導入である。適当なベクタ
ーは後で詳細に記載する。
得られたバイブリドベクターによる適当な宿主細胞の形
質転換（段階ｅ）並びに形質転換された宿主細胞の選択
及び増加（段階ｆ）は当業界においてよ（知られている
。これらの方法の例を後に記載する。バイブリドベクタ
ー及び宿主細胞はＤＮＡの製造、又は目的ポリペプチド
の製造のために特に適当なものであることができる。
本発明に従う目的ＤＮＡ、変異体及びその断片の単離は
当業界において知られている方法、例えばフェノール及
び／又はクロロホルムにより抽出により行われる。場合
によっては、変異体を得るための変異剤による処理、又
は断片を得、ベクターへの導入を容易にするために一方
又は両方の末端を変更し、逆転配列を除去する、等のた
めの制限酵素による消化、によりＤＮＡをさらに操作す
ることができる。
本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列は、それ自体既知の
方法により、例えば末端標識ＤＮＡを用いるＭａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ法又はＳａｎｇｅｒのジデオキシ。
チエイン・ターミネーシジン法により決定することがで
きる。
本発明のＰＣ遺伝子配列はまた、常法によるインビトロ
合成により製造することができる。インビトロ合成は特
に、ＰＧ発現カセットのより小さい断片、例えば、前記
のＤＮＡ分子特にλ−シャロン中に含まれるＰＧ遺伝子
の例えば、ＰＣＩ。
ＰＧＩ［又は」目Ｃ遺伝子のプロモーター又はシグナル
ペプチドあるいはその変異体をコードするＰＣ遺伝子の
ＤＮＡ配列の調製のために特に適当である。
ＤＮＡの合成のための適当な方法はＳ、Ａ、Ｎａｒａｎ
ｇ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９．３．１９８３）に
より要約の形で提示されている。既知の合成技法は、１
２０塩基までの長さのポリヌクレオチドの良好な収率で
の、高純度での且つ比較的短時間での調製を可能にする
。
適切に保護されたヌクレオチドはホスホジエステル法（
Ｋ、Ｌ、Ａｇａｒｗａｌら、Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｗｉ
ｅ　８４＋　４８！Ｌ１９７２）　、より効率的なホス
ホトリエステル法（Ｃ，Ｂ。
Ｒｅｅｓｅ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３４＋　３１
４３＋　１９７２）　、ホスファイトトリエステル法（
Ｒ，Ｌ、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ、Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　９Ｂ、　３６５５．１９７６）　
、又はホスホラミダイト法（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ
及びＭ、Ｈ，Ｃａｒｒｕｔｂｅｒｓ。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　２２．１８５９．１９８１）
により相互に連結される。ヌクレオチド鎖が適当なポリ
マーに結合される面相法によりオリゴヌクレオチド及び
ポリヌクレオチドの合成の簡素化が可能にされる。Ｈｏ
Ｒｉｎｋら　（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　１２．６３６９．１９８４）は個々のヌクレオチド
の代りにトリヌクレオチドを用い、そしてそれらを面相
合成においてホスホトリエステル法により連結している
。こうして、ポリヌクレオチドを短時間に高収量で得る
ことができる。実際の二本鎖ＤＮＡは両ＤＮＡ鎖からの
化学的に調製されたオーバーラツプするオリゴヌクレオ
チドから酵素的に組立てられ、この場合それらは塩基対
合により正しい配置で一緒に保持されそして次に酵素Ｄ
ＮＡリガーゼにより化学的に連結される。
もう一つの可能性は、２つのＤＮＡ鎖からのオーバーラ
ツプする単一オリゴヌクレオチドを、必要な四種類のデ
オキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ■、ポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、又はＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼ、又はＡＭＶ　（トリ骨髄芽球溶解ウィルス）逆
転写酵素と共にインキユベートすることを含んで成る。
これにより、二本のオリゴヌクレオチドが塩基対合によ
って正しい配置で一緒に保持され、そして必要なヌクレ
オチドが酵素により補充されて完全な二本ｖＡＤＮＡが
得られる（Ｓ、Ａ、Ｎａｒａｎｇら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　１２１＋３５６、１９８２）。
次に、ゲノムライブラリーからの本発明の組換えＤＮＡ
分子の調製並びにＰＧ遺伝子群の構成員を同定するため
のホモロガス及びヘテロロガスハイブリダイゼーション
条件をさらに詳細に記載する。
ゲノムライブラリーは、例えば、Ａ、ニガー株例えばＮ
Ｗ７５６又はＮ４００のゲノムＤＮＡを例えばＳａｕ　
３Ａ　Ｉ又はＭｂｏ　Ｉにより部分消化し、そして高分
子量ＤＮＡ断片を適当なベクター、例えば大腸菌プラス
ミドｐｕｓ　１２１又はλベクター、例えば！！ＭＢＬ
　４にクローニングすることにより調製することができ
る。
所望のＰＧを生産する他の真菌株、例えばアスペルギル
ス・スペシス、例えばＡ、ジャポニクス、Ａ、オリゼー
、Ａ、ニドランス、Ａ、キガ−トリコデルス・スペシス
、ボトリチス・スペシス、スフレロチニア・スペシス（
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　」閂−）、フザリウム・スペ
シス又は他の植物病原真菌、並びに酵母、例えばＰＣ生
産性タルイベロミセス・スペシス、例えば、Ｋ、フラギ
リスがゲノムライブラリー源として役立つことができ、
そして他の適当なベクター、例えば前に記載したものが
断片のための受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として使用
され得る。
ＰＣ類をコードするＤＮＡ配列についてゲノムライブラ
リーを好結果にスクリーニングするためにはハイブリダ
イズするＤＮＡプローブが必要である。目的のＰＣのア
ミノ酸配列又はその部分が知られていればそれは合成り
ＮＡであることができ、あるいは目的のＰＣ遺伝子にハ
イブリダイズする他のＰＣ遺伝子又はその部分であるこ
とができる０本発明の前に、ＰＧ配列及びＰＧ遺伝子又
はその部分のいずれも知られていなかったので、ＰＧの
精製、ＰＧのＮ−末端配列の決定及び有用なりＮＡプロ
ーブの調製の問題がまず解決された。
本発明のＰＣ類の精製のため、それを含有する任意の入
手源を用いることができる０例えば、粗原料、例えばア
スペルギルス・ニガーから得うれる酵素混合物、例えば
市販のペクチン分解酵素混合物であるラビダーゼ（Ｒａ
ｐｉｄａｓｅ）　（商標）が原料として役立つ。
精製は常用の精製法、例えば塩析、脱塩、異る塩の形成
における再沈澱、クロマトグラフィー例えば架橋アルギ
ン酸上でのアフィニティークロマトグラフィー、例えば
ＤＥＡｆ！−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）又
はセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上でのイ
オン交換クロマトグラフィー、例えばセファクリル（Ｓ
ｅｐｈａｃｒｙ　１）カラム上でのゲル浸透クロマトグ
ラフィー、例えば５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルを用
いる電気泳動、等電点沈澱等、又はこれらの組合わせに
従う。
本発明においては、ラビダーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ）　
（商標）からＰＣＩ　、　ＰＧ■、ＰＧＩＩＩＡ　、Ｐ
ＧＩＢ、及びＰＧＩＶが単離された。前記ＰＣ！ｌは次
の理化学的性質を有するエンド−ポリガラクチュロナー
ゼ（ＬＣ，３２，１，１５）である、ＰＣＩは分子量５
５に１等電点（ＩＥＰ）　３．２〜３．５、及び酵素活
性のための最適ｐＨ４，９を有する。ＰＧＩ［の値は、
分子量３８に、　ＩＥＰ４．６〜５．９、最適ｐＨ４，
８テアｌ）　；　ＰＣＩＩ［Ａハ、分子量５７ＫＳＩｌ
ｌ！Ｐ　３．３、及び最適ｐＨ４，３を有し；ＰＧｌ［
［Ｂは、分子量５７Ｋ、ＩＩＩＰ３．３、及び最適ｐＨ
４，５を有する。最後に、ＰＧＩＶは分子量５９に、　
Ｉｆ！Ｐ３．７及び最適ｐＨ４，８を有する０分子量は
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲルにより決定されたもの
であり、ＩＥＰは薄層等電点沈澱による。
ＰＣＩのＮ−末端配列決定は次の配列：ａｌａ’−５ｅ
ｔ−ｔｈｒ−Ｘ’−ｔｈｒ’−ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｓｅｒ
−ａｌａ’を示した。ＰＧＩの２１ｋＤａのＢｒＣＮ−
断片のＮ−末端配列決定は次の配列： ａｌａ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−Ｘ’−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｔｈ
ｒ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｕすなわち、ＰＣＩ
のＮ−末端配列を示し、そして５、５　ｋＤａのＢｒＣ
Ｎ−断片の配列決定は、次の配列：ａｌａ−ａｓｐ−ｇ
ｌ　Ｖ−ａｌａ−ｖａｌ−ｔ　Ｉｓ−ａｓｐ−ｇｌｙ−
ａｓｐ−ｇｌｙ−ｓｅｒを示した。
ＰＧＭのＮ−末端配列決定は次の配列：ａｓｐ’−５ｅ
ｔ−Ｘ’−ｔｈｒ−ｐｈｅ’−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ａｌａ
−ａｌａ−ａｌａ”ａｌａ−１ｙｓ−ａｌａ” を示し、そして１７ｋＤａのＢｒＣＮ−断片の配列決定
は次の配列： ａｌａ−ｐｈｅ−５ｅｒ−ｖａ　１−ｇ　ｌｎ−ａｌａ
−ａｓｎ−ａｓｐ−ｉ　ｌｅ−ｔｈｒ−ｐｈｅを示した
。
配列中のＸ３及びＸ４はその当時同定されなかった。
ＰＣＩの５．５　ｋＤａのＢｒＣＮ−断片のアミノ酸配
列に基いて、次のオリゴヌクレオチド混合物を合成した
。
ＰＣＩＩの１７ｋＤａのＢｒＣＮ−断片のアミノ酸配列
に基いて次の２種類のオリゴヌクレオチド混合物を合成
した。
上記オリゴヌクレオチド配列において、■はイノシンで
あり、ＲｏはＴ又はＣであり、Ｒ２はＡ又はＧであり、
そしてＲ８はＴ、Ｑ又はＡである。
上記混合物を放射能標識し、そしてアスペルギルス・ニ
ガーＮ４００のゲノムライブラリーをそれぞれＰＣＩ遺
伝子及びＰＧＩＩ遺伝子についてスクリーニングするた
めに使用した。
次に、同定された遺伝子及び遺伝子断片を常法に従って
配列決定する。Ａ、ニガーＮ４００のＰＧＩ遺伝子及び
ＰＧＩＩ遺伝子の配列を、それぞれ配列番号（ＳＥＱ　
ＩＤ阻）１及び配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ［Ｌ）　２
の配列として配列表に示す。
スクリーニング目的のため、ＤＮＡプローブ゛は、当業
界において知られている方法により、例えば、使用され
るプローブのタイプに依存してＴ　”Ｐ−ＡＴＰとＴ４
キナーゼ、又はα”Ｐ−ｄＡＴＰと大腸菌ポリメラーゼ
Ｉを用いて標識される０本発明の核酸を挿入部として担
持する宿主微生物は遺伝子ライブラリーのフィルターレ
プリカ上で、標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーションにより同定される。
１又は複数のＤＮＡプローブに対してハイブリダイゼー
ション応答を示すクローンを単離しそして増幅する。
使用されるハイブリダイゼーション条件は常用のもので
あり幾分ストリンジェントであることができる。
ストリンジェント条件は、高度な相同性を有するＤＮＡ
配列のみがハイブリダイズし得るようなもの（「ホモロ
ガス」（ｈＯ■ｏｌｏｇｏｕｓ）ハイブリダイゼーショ
ン条件）である、「ヘテロロガス（ｈｅｔｅ−ｒｏｌｏ
ｇｏｕｓ）又は低ストリンジェント条件下では低度の相
同性を有する関連するＤＮＡ配列をもハイブリダイズす
ることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジ
エンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄
温度、ホルムアミド又は塩の濃度、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
、ハイブリダイゼーション時間の長さ及びＤＮＡプロー
ブの長さにより影響される。限定的ではな（例示として
「ホモロガス」及び「ヘテロロガス」ハイブリダイゼー
ション条件を実施例において記載する。
ＰＣＩ又はＰＧｎ遺伝子由来の１又は複数のＤＮＡプロ
ーブ、特にそのコード領域の少な（とも部分を含んで成
るものを用いて、例えばＡ、ニガーの、好ましくはＡ、
ニガーＮ４００又はＡ、ニガーＮＷ７５６のゲノムライ
ブラリー由来のハイブリダイズするクローンを同定する
ことができ、そして相同性の程度及び観察されるハイブ
リダイズする制限断片に基いて、異るクラスに分けるこ
とができる。Ａ。
ニガーＮ　４００ライブラリーに由来する好ましいクロ
ーンの例は、λＰＧ−Ａ９．　　λＰＧ−ＡＩＯ，λＰ
Ｇ−Ａ４３゜λＰＧ−Ｂ４．　　λＰＧ−８３５，λＰ
Ｇ−Ｂ３６．　　λＰＧ−Ｃ１，λＰＧ−Ｃ１６゜λＰ
Ｇ−Ｃ２０，λＰＧ−Ｃ３７，λＰＧ−Ｄ８．　　λＰ
Ｇ−Ｄｌｌ、　　λＰＧ−Ｄ１２．　　λＰＧ−Ｅ６．
　　λＰＧ−Ｅ３Ｂ、　　λＰＧ−Ｐ５．　　λＰＧ−
Ｇ１７゜λＰＧ−Ｇ２７．　　λＰＧ−Ｘ３１及びλＰ
Ｇ−Ｙ３３である。これらの調製は実施例において詳細
に記載する。Ａ、ニガーＮＷ７５６に由来する好ましい
クローンの例はプラスミドｐＧＩ４１７５６である。
これらのクローン並びにプラスミドｐＧＷ１８００゜ｐ
ＧＷ１８０３．　ｐＧＷ１９００．　ｐＧ縁１９０２及
びｐｌＪ１９１０を用いて本発明の他の組換えＤＮＡ分
子、特にこれらに含まれるＰＣ遺伝子配列の断片を含有
するものを調製することができる。この様な他の組換え
ＤＮＡ分子は常法に従って、常用の制限酵素、リンカ−
１連結、増幅及び単離法を用いて調製される。
好ましくは、原核性もしくは真核性ベクター又は原核細
胞及び真核細胞の両者において増加するためのシャトル
ベクターである発現ベクターが調製される。この様なシ
ャトルベクターの例は当業界においてよ（知られている
０発現ベクターは同種性又は異種性遺伝子を含有するこ
とができる。この様の遺伝子の例は後で記載する。
本発明の組換えＤＮＡ分子の挿入部又はその断片は常法
により、例えば組換えＤＮＡを適当な制限酵素により開
裂せしめそして所望のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動により単離した後に得ることができる。
新たな制限部位を含む本発明の特にＰＣ遺伝子のＤＮＡ
分子の変異体はまた常法による部位特定変異誘導により
インビトロで調製することができるＣＭ、Ｊ、Ｚｏｌｌ
ｅｕ及びＭ、５ｓｉｔｈ＋　Ｍｏｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ。
１００、４６８（１９８３）の総説ｉ　Ｄ、Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎ及びり、５ｈｏｒｔｌｅＳｃｉｅｎｃｅ　２２９
．１１９３（１９８５）　ｉ又はに、Ｎｏｒｒｉｓら、
Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．５１０３（１
９８３）を参照のこと〕。
本発明はまた、構造遺伝子の発現のためのバイブリドベ
クターの製造のための本発明の組換えＤＮＡ分子の使用
に関する。
艮ｌ軟換Ｎれ立置ま さらに、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を増幅す
るため、特に本発明の組換えＤＮＡ分子中に含まれる発
現カセットを発現させるための形質転換された宿主細胞
に関する。
特に本発明の組換えＤＮＡ分子の増幅のために適当な宿
主の例には、制限酵素又は修飾酵素が欠けているか又は
少ない微生物、例えば細菌、特に大腸菌の株、例えばＥ
、コリ（Ｅ、　ｃｏ■）　Ｘ１７７６、Ｅ、コリ　Ｙ１
０９０、Ｅ、コリー３１１０、Ｅ、−ｘリ　ＨＢＩＯＩ
／ＬＭ１０３５、Ｅ。コリＪＡ２２１、Ｅ、コリＤＨ５
α、又は好ましくはＥ、　　：２　’）　ＤＨ５αＦ’
　、　ＪＭ１０９．　ＭＨＩもしくはＩＩＢＩＯＩ、又
はＥ、コリに１２株、バラルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｇｕｂｔｉｌｉｓ）　、バラルス・ステアロ
サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−田
、、匹旦ヨ）、シュードモナス（Ｐｓｅａｄｏｍｏｎａ
ｓ）、ヘモフィルス（勤μ四五■■）、ストレプトコッ
カス（釘バ１皇遼劇憇）等、及び酵（と、例えばサツカ
ロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ　ｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えばＳ、セレビシェ−Ｇ
ＲＦ１８である。更なる適当な宿主細胞は高等生物の細
胞、特に樹立された永続ヒト又は動物セルライン、例え
ばヒト胎児肺線維芽細胞Ｌ１３２、ヒト性黒色腫Ｂｏｗ
ｅｓ細胞、吐ｅＬａ細胞、アフリカミドリザルの５Ｖ４
００ウイルスで形質転換された腎細胞ＣＯ３−７、又は
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）細胞である。
本発明の発現カセットの発現のために適当な宿主の例は
前記の細胞、そして特に糸状真菌、例えばペニシリウム
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　％セファロスポリウム（
Ｃｅ　ｈａｌｏｓ　ｏｒｉｕｗ）又は好ましくはアスペ
ルギルス・スペシス、例えばＡ、カルボナリウム（Ａ、
　ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｍ）　、Ａ、アワモリ又は好ま
しくはＡ、ニガー、Ａ、ニドランスもしくはＡ、オリゼ
ーである。
好ましい形質転換された宿主はｐＧＷ１８００もしくは
ｐＧＷ１８０３により形質転換されたＥ、コリＭｌ　１
　。
ｐＧ１１１８００もしくはｐｌＪ１８０３により形質転
換されたＥ、コリＪＭ１０９．　ｐＧＷ１９００．１９
０１１７５６もしくは１９１０、　ｐＧＩＩ−ＩＦＮ　
ＡＭ１１９又はｐＧ　Ｉｆ　５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９
により形質転換されたＥ、コリＤＨ５αｐ　Ｉ、又はｐ
ＧＩ［−ＩＦＮ　ＡＭ１１９もしくはｐｃ　ｎ　５ｓ−
ＩＦＮ　ＡＭ１１９及び場合によっては選択マーカープ
ラスミドｐＣＧ５９Ｄ７により形質転換されたアスペル
ギルス・ニガーＡｎ８もしくはＮ５９３又はアスペルギ
ルス、・ニドランスである。
本発明はまた、この様は形質転換体の製造方法に関し、
この方法は適当な宿主細胞を形質転換条件下で本発明の
組換えＤＮＡ分子、特に本発明のバイブリドベクターに
より、場合によっては選択マーカー遺伝子と一緒に処理
し、そして場合によっては形質転換体を選択する、こと
を含んで成る。
微生物の形質転換は文献に記載されているように常法に
従って、例えばＳ、セレビシェ−（＾。
Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ＋　７５＋　　１９２９＋１９７８）　、Ｂ
、ズブチリス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕら、Ｊ
。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８１．７４１．１９６１）、及
び大腸菌（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、　５３．１５９．１９７０）について記載されている
ようにして行われる。
従って、大腸菌の形質転換法は、例えば、ＤＮＡの取込
みを可能にするためのＣａ”による細胞の処理、及びバ
イブリドベクターとのインキエベーションを含む、形質
転換された細胞の次の選択は例えばベクターＤＮＡのマ
ーカー配列の性質に依存して親細胞からの形質転換細胞
の分離を可能にする選択増殖培地への細胞の移送によっ
て達成することができる。好ましくは、ベクターを含有
しない細胞の増殖を許容しない増殖培地が使用される。
酵母の形質転換は、例えば、グリコシダーゼによる酵母
細胞壁の酵素的除去の段階、ポリエチレングリコール及
びＣａ”の存在下でのベクターによる得られたスフェロ
プラストの処理、並びに寒天へのスフェロプラストの封
埋による細胞壁の再生を含む。好ましくは、再生寒天は
、上記の形質転換された細胞の再生と選択を同時に可能
にするように調製される。
高等真核細胞、例えば哺乳類セルラインの形質転換は好
ましくはトランスフェクシゴンにより行われる。トラン
スフェクシゴンは常用技法により、例えばリン酸カルシ
ウム沈澱、マイクロインゼクション、プロトプラスト融
合、エレクトロボレーシラン、すなわち細胞膜の透過性
を一時的に増加せしめる短い電気パルスによるＤＮＡの
導入により、又はヘルパー化合物、例えばジェチルアミ
ノエチルギキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセ
ロールもしくはポリエチレングリコール等の存在下で行
われる。トランスフェクション法の後、選択マーカーの
性質に依存して選択される選択培地、例えば対応する抗
生物質を含有する標準的培養培地、例えばダルベコの改
変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　　ｅ＋ｏｄｉ
ｆｉｅｄ　　Ｅａｇｌｅ　　ｍｅｄｉｕｍ　　：　　Ｄ
ＭＥＭ）　　、最少必須培地、ＲＰＭ１１６４０培地等
での培養により同定されそして選択される。
培地は好ましくは、選択圧を生じさせそして形質転換さ
れなかったか又はバイブリドベクターを失った細胞の増
殖を防止するように選択される。
すなわち、例えば、バイブリドベクターがマーカーとし
て抗生物質耐性遺伝子を含有する場合には抗生物質が培
地に添加される０例えば、必須アミノ酸について栄養要
求性である宿主細胞が使用され、バイブリドベクターが
宿主の欠陥を補完する酵素をコードする遺伝子を含有し
ている場合、形質転換された細胞を培養するために該ア
ミノ酸を欠く最少培地が使用される。
高等真核生物の細胞、例えば哺乳類細胞は、場合によっ
ては増殖促進物質及び／又は哺乳類血清が補完された市
販の培地、例えばダルベコ改変イーグル培地（Ｄ月間）
、最少必須培地、ＲＰ？１１１６４０培地等を用いて組
織培養条件下で培養される。組織培養条件下での細胞培
養の技法は当業界においてよく知られており、そして、
これには例えば、エアーリフト反応器もしくは連続撹拌
反応器中での均一懸濁培養、又は中空繊維中、マイクロ
カプセル中、アガロースマイクロビーズ上、多孔性ガラ
スピーズ上、セラミックカートリッジ上又は他のマイク
ロキャリヤー上での固定化もしくは捕捉細胞培養が包含
される。
培養は当業界において知られている方法により行われる
。培養条件例えば温度、培地のｐ）値、及び発酵時間は
、本発明のポリペプチド又は誘導体の最大力価が得られ
るように選択される。すなわち、大腸菌又は酵母株は好
ましくは好気的条件下液中培養により、振とう又は撹拌
を行いながら約２０℃〜４０℃の温度にて、好ましくは
約３０’Ｃ及び４〜８の９Ｈ値、好ましくは約ｐＨ７に
て、約４〜３０時間、好ましくは本発明のポリペプチド
又は誘導体の最大収量が達成されるまで培養される。
非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を可能にする
ため、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを含有し、あ
るいは、そのようなマーカーを含有する第二のベクター
により細胞が同時形質転換される。他の系におけるのと
同様に、この様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝子
であり、該遺伝子の発現されたポリペプチド（酵素）が
受容生物に対して毒性の化合物に対する耐性を提供し、
又は該遺伝子はそのような必須ポリペプチドを欠く変異
株の酵素系を完全なものにする。形質転換された糸状真
菌細胞の選択のために適当なこれらのマーカー遺伝子は
例えば既知の■」＋　ＤＩＣ１肛１．ｔｚｇ、　ａｍ＋
（ト）又は肛ｕ遺伝子である。
ｆ！Ｐ２７８．３５５に記載されているように、肛１と
称するマーカー遺伝子は、酵素オロチジン５′−ホスフ
ェートデカルボキシラーゼを生産する、Ａ。
ニドランスのＪｍＧ及びＮ、クラッテの７に関連してお
りそしてＷ４４ｍの機能を有するものであり、Ａ、ニガ
ーのゲノムライブラリーから単離されたものである。こ
の酵素はオロチジン５′−ホスフニートのウリジル酸（
ウリジン５′−ホスフェート）への脱カルボキシル化及
びフルオロ−オロチン酸の毒性フルオロ−ウリジンへの
脱カルボキシル化を触媒する。肛１遺伝子を含有する大
腸菌クローンが、肛己遺伝子の部分を含有するｐＤＪＢ
２（参考文献２５）　の１．１　ｋｂ　Ｈｉｎｄｍ断片
とのハイブリダイゼーションによって同定された。しか
しながら、オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキ
シラーゼをコードする他の任意のｆｆｉ遺伝子を使用す
ることができる。Ｅ。コリ　８７５１８３／　ｐｃＧ５
９Ｄ７と称する陽性クローンから、■が遺伝子を含んで
成るプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７が単離され、そしてＡ、
ニガーｐｙｒＡ”変異株の同時形質転換のために使用さ
れた。この様なｐｙｒＡ−変異株はオロチジン５′−ホ
スフェートデカルボキシラーゼ遺伝子に欠陥を有し、そ
してそれ故に対応する酵素を生産することができない、
この変異株は、Ａ、ニガーＮ７５６の分生胞子を変異性
Ｕ　Ｖ−ａ村のもとで処理し、そしてフルオロオロチン
酸及びウリジンの存在下で生存するコロニーを選択する
ことにより調製された。フルオロオロチン酸の存在下及
びウリジンの非存在下で生存するコロニーは除去される
。残ったウリジン要求変異株は、形質転換可能性につい
てのその能力によって２つの相補群カニＡ及びｆｆ１Ｂ
に属し、それぞれ変異株Ａｎ８及びＡｒ１１Ｏにより代
表される。これらをそのプロトプラストの形で形質転換
条件下でシェＡ含有プラスミドｐＣＧ５９Ｄ７により処
理する。Ａｎ８コロニーのみが形質転換されそしてｆｆ
１Ａ遺伝子を含有することが見出された。これはその消
化されたＤＮＡとｐｔｌＮ１２１のＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションにより証明された。
ポリペプチドの　゛ 本発明はさらに、ポリペプチドの製造方法に関し、この
方法は本発明の発現カセットに挿入された前記の意味に
おける同種又は異種構造遺伝子が適当な形質転換された
宿主中で常法に従って発現されることを特徴とする。必
要な場合、ポリペプチドが常法に従って単離される０発
現カセットの構成に依存して、生成物が生産されるか、
あるいはシグナル配列が存在する場合には生産されそし
て分泌される。通常、発現カセットはバイブリドベクタ
ー中に含まれ、しかしまた形質転換後宿主のゲノムに組
込まれる場合がある。
同種又は異種構造遺伝子の発現のために本発明のＰＧ遺
伝子由来のプロモーター又は糸状真菌由来の他のプロモ
ーターが使用される場合、適当な宿主は例えば真菌、例
えば糸状真菌、特にアスペルギルスの株である。しかし
ながら、他のプロモーター、例えば原核生物又は高等真
核生物由来のプロモーターが使用される場合、他の宿主
、例えば細菌、例えば大腸菌、又は他の真核細胞がそれ
ぞれ適当である。
Ａ、ニガーのＰＧ遺伝子のプロモーターはＡ。
ニガー細胞中で誘導的である。すなわち、それに連結さ
れた構造遺伝子、例えばＰＧ又は任意の外来遺伝子をコ
ードする構造遺伝子は培地へのペクチン又はペクチン分
解生成物の添加によって誘導される。しかしながら、Ａ
、ニガーの株、例えばＡｎ８又はＮ５９３が宿主として
使用される場合、十分なグルコースの存在下ではプロモ
ーターは誘導されない。このことは、Ａ、ニガーＰＧプ
ロモーターの制御下にある遺伝子はＡ、ニガー中では「
カタボライト抑制」されている、ことを意味する。しか
しながら、他のアスペルギルスの株、好ましくはＡ、オ
リゼー又は最も好ましくはＡ、ニドランスが使用される
場合、Ａ、ニガーＰＧプロモーターの制御のもとにある
遺伝子は構成的に発現される。すなわち、ペクチンの非
存在下及び／又はグルコースの存在下でも発現される。
従って、アスペルギルス・ニガーＰＧプロモーターの制
御のもとにある遺伝子をＡ、ニガー以外のアスペルギル
ス宿主、好ましくはＡ、オリゼー、そして最も好ましく
はＡ、ニドランスにおいて発現させるのが有利である。
なぜなら、例えば、目的遺伝子の発現中にエネルギー源
及び炭素源としてペクチンではなくグルコースを栄養培
地に加えることができるからである。
本発明のＰＣ遺伝子に由来しないプロモーターが、例え
ばＰＧをコードする構造遺伝子を含んで成る本発明の発
現カセットの作製において使用される場合、発現宿主と
して他の宿主を用いることができる。適当な宿主は使用
されるプロモーターに依存し、そして例えば細菌、例え
ば大腸菌、又は酵母、例えばＳ、セレビシェ−又はタレ
イベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｓ　ｃｅｓ
　１ａｃｔｉｓ）である０本発明のポリペプチドの製造
のために適当な宿主及びプロモーターはまた、前記の形
質転換のためにも適当である。
今や１又は複数の目的ＰＧを過剰発現せしめることが可
能であり、このために種々の方法を用いることができる
。純粋な単一ＰＧはＰＣを含有するペクチン分解酵素混
合物を常用の精製法にかけることにより製造することが
できる。単一ＰＧ。
主としてＰＧｌ、ＰＧｎ又はＢ！ＬＣ遺伝子の生成物の
製造のための他の方法は、いかなるＰＣも発現すること
ができず、又はＰＧを少量発現し、又は導入されたＰＧ
遺伝子のために用いられる誘導条件下でＰＧを発現しな
い適当な宿主を、ＰＧ、例えばＰＣＩ、ＰＧｎもしくは
ｐｇａＣ遺伝子生成物、又はＰＧ活性を有するＰＣの断
片をコードする構造遺伝子を含んで成るバイブリドベク
ターにより形質転換し、そして該構造遺伝子を発現させ
ることを特徴とする。いかなるＰＧも発現することがで
きない宿主が使用される場合、対応する単一ＰＣを純粋
な形で得ることができ、これは他のＰＣにより汚染され
ないことを意味する。単一ではなく二基上の目的とする
ＰＣ遺伝子を場合によっては他の酵素をコードする遺伝
子と共に、形質転換された宿主中で発現させることによ
り、ＰＣの所望の混合物を場合によっては他の酵素と一
緒に製造することができる。所定の混合物はまた、ＰＣ
及び／又は他の酵素、例えばペクチンエステラーゼ、ペ
クチンリアーゼ、セルラーゼ、混合エンドグルカナーゼ
、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラ
クタナーゼ、α−及びβ−グリディジダーゼ（ｇｌｙｃ
ｏｄｉｄａｓｅ）等のための１又は複数の目的とする遺
伝子を、１つの宿主株中で、場合によっては酵素生産の
ある種のバックグラウンドを有する宿主中で、発現せし
めることによっても製造することができる。
本発明の単離されたＰＣ遺伝子を用いて、当業界でよく
知られている技法である「遺伝子分裂」（ｇｅｎｅｄｉ
ｓｒｕｐｔｉｏｎ　）により宿主中で特定のＰＣ遺伝子
を分裂させることにより、酵素の所定の混合物を得るこ
とができる。
ＰＣも発現することができない宿主は、対応する遺伝子
を有しない微生物、例えばＰＧ−アスペルギルス株、他
のＰＧ−非一アスベルギルス真菌、又は他のＰＧ−真核
性又は原核性細胞であるか、あるいは、アスペルギルス
の株、例えばＡ、オリゼー又はＡ、ニドランスであって
、その内因性ＰＧ遺伝子の発現が適切に制限された増殖
培地中で抑制され、例えば「カタボライト抑制」され（
ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｒｅｐｒｅｓｓｅｄ）そして／又
は誘導されず、他方目的のＰＧ構造遺伝子に作用可能に
連結された外来ＰＣプロモーター、例えばＡ、ニガー由
来プロモーターがこれらの条件下で活性であるか又はＰ
Ｇ遺伝子が他のプロモーターと融合しているようなもの
である。
ＰＣの製造のための他のプロモーター及び株は、発現カ
セットの説明において前に記載したものと同じである。
ポリペプチド　び ペクチン分解酵素混合物から、好ましくはアスペルギル
ス・ニガー由来のペクチン分解酵素混合物から特にラピ
ダーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ）　（商標）から精製された
単一ＰＧ、並びに本発明のＤＮＡ配列によりコードされ
たＰＧ及びＰＧ活性を有するその誘導体、特にそのよう
なＰＣ又はＰＧ活性を有するその誘導体をコードする発
現バイブリドベクターにより形質転換された適切な宿主
において生産されたもの、及び生理的に許容されるその
塩も本発明の対象である。アスペルギルス・ニガーの純
粋な形のＰＣＩ　、　ＰＧｎ　、　ＰＧＩＩ［Ａ　、　
ＰＧＩ［［Ｂ及びＰＧＩＶが特に好ましい。本発明に、
本発明の方法により製造された前記ポリペプチドに関す
る。
本発明はまた、この様な単一ＰＧ及び／又はＰＣ活性を
有するその誘導体及び／又は生物学的に許容されるその
塩の１つ又は複数を、場合によってはＰＣ活性以外の活
性を有する１又は複数の適当な酵素との所定の組合わせ
において含んで成る酵素組成物に関する。
前記酵素組成物の製造のために適当なＰＧ活性以外の活
性を有する酵素は植物細胞壁ポリマーを分解又は修飾す
るものである。この様な酵素は例えばペクチンエステラ
ーゼ、ペクチンリアーゼ、セルラーゼ、混合エンド−グ
ルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナ
ーゼ、ガラクタナーゼ、α−及びβ−グリコデイダーゼ
等である。
本発明はさらに、常法により前記酵素組成物の製造に関
する。
前記単一ＰＣ及び／又はＰＧ活性を有するその誘導体及
び／又は前記酵素組成物の植物材料加工における使用も
本発明の対象である。
本発明の単一ＰＣ及び／又はＰＣ活性を有するその誘導
体又はこのようなＰＧもしくは誘導体を含んで成る酵素
組成物は、例えば、野菜又は果物ジュースの清澄化、野
菜又は果物ジュース製造におけるジュース収率の増強、
含油種子又は果実の圧搾収率の増強、野菜又は果物ジュ
ースの安定化、野菜又は果物ジュースの粘度の低下、バ
イオマスの液化、軟化（ｓａｃｅｒａｔｉｏｎ）　、天
然色素、香料及び味料のごとき天然産物の抽出の強化、
バイオマス、食品又は飼料の安定化（ｖａｌｏｒｉｚａ
ｔｉｏｎ）　、純パルプ製造におけるセルロース繊維の
回収の改良、等のために有用である。
本発明の最良の形態を後の実施例において記載する。
以後に記載する実施例は本発明を説明するものであって
、本発明をなんら制限するものではない。
略号は次の意味を有する。
Ａｍｐ　　アンピシリン ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−ｔｒｉｓ　（ヒ
ドロキシメチル）メタンＢＳＡ　　ウシ血清アルブミン ＤＴＴｌ、４−ジチオスレイトール ＥＤＴＡ　　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩Ｉ
ＰＴＧ　　イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド ｋｂｐ　　キロ塩基対 ＰＥＧ　　ポリエチレングリコール ＰＴ）Ｉ　　フェニルチオヒダントインＳＯ３ドデシル
硫酸ナトリウム Ｔｅｔ　　テトラサイタリン ＴＦＡ　　　）リフルオロ酢酸 ＴＰ　　　）リプシン分解ペプチド Ｔｒｉｓトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＸ−
ｇａｌ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−ガラクトシド ′、土、薬 ＳＭ　　　１００ｍＭ　ＮａＣｆ、８．１　ｍＭ　Ｍｇ
５Ｏｎ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５
）　、０．０１％ゼラチンＬＢ　　　１％トリブチカー
ゼペプトン（ＢＢＬ）　、０．５％酵母エキス（ＢＢＬ
）　、１％ＮａＣｊ！及び０．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
／！　（ｐＨ７，５）ＬＭ　　　１％トリブチカーゼペ
プトン、０．５％酵母エキス（ＢＢＬ）　、１０ａ＋Ｍ
　ＮａＣ１及び１０ｇｚＭ　Ｍｇ（Ｊ　。
ＰＢＳＨｚ０１ｆ！当り０．３７ｇ　Ｎａ）ｌ、ＰＧ４
．２．７ｇＮａｇＨＰＯｎ　　、　　８．５　ｇ　　Ｎ
ａＣｆｆ１ＳＳＣ０，１５Ｍ　ＮａＣｆ！、　　０．０
１５Ｍクエン酸三ナトリウム ＰＳＢ　　　　１０ｍＭ　　↑ｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７
，６）　　、　１００ｍＭ　　　ＮａＣ１１゜１０ｗＭ
　ＭｇＣｊ！　ｚ　、０．０５％（ｗ／ｖ）ゼラチンＴ
Ｅ　　　　　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８
，０）　　、　０．１　ａ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，
０） 最少培地 １１当り１．５　ｇ　ＫＨｚＰＯａ　、０．５　ｇ　Ｋ
Ｃｊ！、０、５　ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０，０，９ｍ
ｇ　Ｚｎ５Ｏａ　＊　７Ｈｇ０゜０、２１ｇ　ＭｎＣ１
ｚ　　・４ＨｔＯ，０，０６１ｇ　ＣｏＣｊ！　ｔ６Ｈ
２０，０，０６ｍｇ　ＣＬＩＳＯ４・５ＨｚＯ１０，２
９■ＣａＣ１２ｔ・６２ＨｚＯ，０，２＠　Ｐｅ５ｏ４
’　ＩＨｚＯ、テキストに記載されている窒素源及び炭
素源又は６ｇＮａＮＯｓ、及び１０ｇグルコース（これ
らの源が明示的に示されていない場合）　、ＮａＯＨニ
よりｐＨ６，０に調整 完全培地 ｉ当り６ｇのＮａＮＯｓ及び１０ｇのグルコースを含有
する最少培地＋！当り２ｇトリプチカーゼペプトン（Ｂ
ＢＬ）　、１　ｇカザミノ酸（デイフコ）、１ｇ酵母エ
キス（ＢＢＬ）、０．５ｇ酵母からのリボ核酸ナトリウ
ム塩（ＩＣＮ、　１ｅｖｅｌａｎｄ、米国）、２ｄビタ
ミン溶液、ＮａＯＨによりｐｎｅ、ｏに調整 ビタミン溶液 １００１当り１０■チアミン、１００■リボフラビン、
１０■パントテン酸、２■ビオチン、１０■　Ｐ−アミ
ノ安息香酸、１００■ニコチンアミド、５０■ピリドキ
シン−ＨＣｆＴＢＥ　　１１当り４　ｄ（７）　ｏ、　
５　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）１０．８　ｇ　Ｔ
ｒｉｓ及び５．５　ｇ　Ｈ＊ＢＯｓフェノール Ｍａｎｉａｔｉｓら（参考文献６，４３８頁）により記
載されているようにして処理したフェノール サンプル緩衝液 １０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１００＋ｓＭ　ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８，０）及び０．０１％ブロモフェノールブル
− ＲＮアーゼＡ Ｍａｎｉａｔｉｓら（参考文献６，４５１頁）により記
載されているようにして処理したＲＮアーゼＡ の　　　　　　　　　る： Ａ、ニガーＮ４００ 野性型 Ａ、ニガーＮ４０２ ！１ｉ２Ａ Ａ。ニガーＮＷ７５６ 高ペクチナーゼ生産株 Ａ、ニガーＮ７５６ 高ペクチナーゼ生産株 Ａ、ニガーＡｎ８ ＤＳＭ３９１７　、ペクチナーゼ複合体高住産性株Ａ、
ニガーＮ７５６のウリジン要求変異体Ａ、ニガーＮ５９
３ μ和Ａ・尻Ａ 大腸菌ＮＭ５３９ ｗｅｔＢ＋　５３ｙＥ＋　ｈｓｄＭ”、　ｈｓｄＲ−、
Ｊ卸Ｆ、（Ｐ２ｃｏｘ３）大腸菌ＬＥ３９２ Ｆ−、ｈｓｄＲ５１４（ｒｋ−、＋ａｋつ、　■Ｅ４４
＋　Ｊ徂Ｆ５８＋１ａｃＹ１＋　％（ＩａｃｌＺＹ）６
．　ｖｄＫ２＋　幻ｄＴ２２＊　ａ＋ｅｔＢ１＋ｉ！ｌ
Ｊ！Ｒ５５，λ− 大腸菌ＤＨ５αＦ′ Ｆ’　　、　　ｅｎｄＡｌ、　　ｈｓｄＲ１７，Ｃｒｗ
−＊　　Ｌ＋”Ｌ　　旦旦ＰＥ４４＋ｔｈｉ−１，ｒｅ
ｃＡ１＋　９工Ｌ　ｒｅｌＡｌ、）８０φ１ａｃＺＭ１
５゜Ａ　（ｌａｃＺＹＡ−ＪＩＰ）０１６９．　　λ−
大腸菌ＪＭ１０９ ｅｎｄＡｌ、　ｒｅｃＡ１＋　幻！Ａ９６．　ｔｈｉ、
　ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−。
ｍｋ”）、　ｒｅｌＡ１＋　５ｇ４Ｅ４４＋　　λ−１
（ハ上１四ＡＢ）　。
ＣＦ’　、　ｔｒａＤ３６．　Ｊ遼ＡＢ、　ｌａｃｌｑ
ＺＭ１５）大腸菌ＪＭＩＩＯ ±Ｌ・μ匹・ｌｅｕ、謝状・１ａｃＹ、　１１・Ｔ＊幻
１・ｔｏｎＡ、　ｔｓｘ＋　ｄａｍ＋　ｄｃｍ、　ＬＬ
Ｉ！［４４１（ハ！１匹ＡＢ）＋（Ｆ’　、　ｔｒａＤ
３６．　Ｊ！！ａ１３．１ａｃｌｑＺＭ１５：１このベ
クターはＧｏｏｓｅｎら（参考文献１３）により記載さ
れている。
Ｍｌａ−フ　−ジ Ｍ１３ｓｐ１８及びＭ１３蒙ｐ１９ベクター（Ｎｏｒｒ
ａｎｄｅｒら、文献２４）は単鎖ＤＮＡバタテリオファ
ージＭ１３の誘導体であり、多才なポリリンカ一部位に
おける種々のＤＮＡ断片のクローニング及び同じ制限断
片の可能な両方向でのクローニンを可能にすることによ
りＤＮＡの配列決定を促進するように設計されている。
これらのベクターにクローン化された配列は、標準的オ
リゴデオキシリボヌクレオチドブライマー及び大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ−断片を用いる単鎖プ
ローブの製造又は配列決定反応のための鋳型として容易
に使用することができる。ベクターＤＮＡは大腸菌１ａ
ｃ−オペロンプロモーター及びβ−ガラクトシダーゼの
最初の１４５アミノ酸の遺伝情報を担持している。多数
制限部位を含有するポリリンカー配列が１ａｃＺ配列に
挿入されている。該ポリリンカーはＩａｃＺリーディン
グフレームを維持しており、そして該ベクターはＬａｃ
Ｚａ宿主株の対立遺伝子相補性を提供し、ＩＰＴＧ及び
χ−ｇａ１を含有するプレート上で青色プラ−りをもた
らす、リーディングフレームを破壊するか又はそれとは
別に１　ａｃＺａペプチドの発現を妨害する挿入部を含
有する組換えファージは無色のプラークとして示される
。
搏胆剥 このプラスミドはｐＧＷ６１３の短い変形体である。
このものはｆｆ１Ａ遺伝子を含有している。これはＧｏ
ｏｓｏｎら（参考文献４２）により記載されている。
ＭＢＬ　４ ＩＥＭＢＬ　４は、９〜２４ｋｂｐのクローニング容量
を有するλ組換えベクターである（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ
ら、参考文献９）。このものは、λアームと非−必須ス
タッファ−（ｓｔｕｆｆｅｒ）　６５域との間に多クロ
ーニング領域を含有する。これは、外来ＤＮＡ挿入部が
挿入された時にベクターアームへのスタッファ−の再連
結が低下する様な態様で多数制限酵素消化が達成される
ことを可能にする。このベクターはまた組換体の直接選
択を提供するためにＳｓｕフェノタイプを用いる（Ｚｉ
ｓｓｌｅｒら、参考文献２１）。
１９４１反１メｉＭＢＬ１９ これらのプラスミドはＤｅｎｔｅら（参考文献１０゜２
２及び２３）により記載されている。
後記のようにして得られる酵素画分中の酵素活性は改変
フェリジアミド試験（Ｒｏｂｙｔら、参考文献３）を用
いて前に記載されている（Ｒｏｚｉｅら、参考文献２）
ようにして決定する。
ポリガラクチュロナーゼ１．Ｉ［、Ｉ［ＩＡ、ＩＩＢ及
び■を、アスペルギルス・ニガーがら得られるペクチン
分解酵素の市販混合物であるラビダーゼ（Ｒａｐｉｄａ
ｓｅ）　（商標）（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ＋　５
４ｃｌｉｎ　、フランス）から精製する。５０ｇの粗酵
素粉末（ロット番号に２ＢＯ７８）を１９０１ｄの２０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，６）に溶解し、２
５．０００Ｘｇに１０分間遠心分離して固形物を除去し
、そして同じ緩衝液中で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−５０カラム（５Ｘ９０ＣＩｌ）上で脱塩する。
精製法の第一段階は、Ｒｏ閣ｂｏｕｔｓら（文献１）に
記載されているようにして調製された架橋アルギネート
を用いるアフィニティークロマトグラフィー段階である
。５．２１ｄ／ｇのベツドボリウムを有する架橋アルギ
ネートをやはり２０ｓ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３，６）により平衡化する（カラム寸法２．５×３０ｃ
ｍ）、脱塩された酵素を二〇カラムに付加し、そして次
にそれぞれｐＨ４，２及びｐＨ５，６の１０ｈＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（各４００１）を適用することにより洗
浄する。ＰＧＩ及びＰＧＩ［はアルギネートマトリクス
に吸着するが、ＰＧｎＩＡ、ｌ１ｌｂ及び■は吸着しな
い。
スｍ工にム　ＰＧＩ　　びＰＧＩ［の 吸着されたＰＣＩ及びＰＧＩ［蛋白質を架橋アルギネー
トカラムから、前に使用された方法ＣＲｏｍｂｏｕ　ｔ
ｓら、参考文献１）のわずかに変えた変法である１００
＋＋＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｆ１５．６）中直線
塩化ナトリウムグラジェント（０〜ＬＭ）によす溶出す
る。ＰＣＩはＰＧＩＩと同時に約０．５ＭＮａ（ｆ！に
て溶出する。
ＰＣＩ及びＰＧＩ［を含んで成る酵素画分を２０ｉ＊Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，７）に対して透析し、
そして同じ緩衝液中で平衡化されたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＡ−５０カラム（２，５Ｘ３０Ｃ１１）に適用
する。直線ＮａＣ１グラジエント（０〜０．６　Ｍ　）
を用いて酵素を溶出する。ＰＣＩは約０．３ＭＮａＣｊ
！にて溶出し、ＰＧＩＩは約０．２Ｍにて溶出する。Ｐ
ＣＩを含有する酵素画分及びＰＧＩ［を含有する酵素画
分の別々に集め、２０ｇｅＭｂｉｓ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
２緩衝液（ｐＨ５，８）に対して透析し、そして同じ緩
衝液中で平衡化されたＤＩ！ＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム上でクロマトグラフ処理する
。
ＮａＣｉグラジェントを適用する際、ＰＧＩ［は約１２
０５Ｍ　ＮａＣｊ！にて溶出し、ＰＣＩは約２５０ｍＭ
にて溶出する。ＰＧＩ又はＰＧＩ［を含有する活性酵素
画分を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，７）
に対して透析した後に、小ＤＥ＾Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（１，６Ｘ１０ｃｍ）上
でこの緩衝液中ＩＭＮａＣｆにより溶出することによっ
て最終体積２０−に濃縮する。
２種類の酵素ＰＧＩ及びＰＧＩ［のそれぞれの最終精製
を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，２）中５ｅｐｈ
ａｃｒｙ１５２００　（１，６Ｘ　９０Ｃ１）上でのゲ
ル浸透クロマトグラフィーにより行う。
ＰＧＩＩは、５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に際して単一バンドを示し、そして３８ｋＤａの見かけ
分子量を有する。　　０．０７５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４，２）において決定された比活性は２．７６
０Ｕ／■蛋白質である０等電点電気泳動の際、この酵素
はわずかな不均一性（ｓｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｉ　ｔｙ）を示す、約ｐｏｓ、ｚにおける顕著な主成分
のほかに、多数の微小バンドがｐＨ４，６〜５．９のｐ
Ｈ範囲において観察される。
ＰＣＩもまた、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において単一バンドを示す、この酵素は５５ｋＤａの
見かけ分子量を有する。　　０．０７５Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，２）において決定された比活性は５
５０　Ｕ　／■蛋白質である０等電点電気泳動の際、こ
の酵素もわずかな不均一性を示す、ｐＨ３，２〜３．５
のｐＨ範囲において数本のバンドが観察される。
１．１．２．　　ＰＧｎｌＡ、ＰＧＩ［［Ｂ　　びＰＧ
ＴＶ１７）未結合のＰＣｌｉ［を含有する架橋アルギネ
ートカラム（実施例１．１．　）の流出液を１Ｍ水酸化
ナトリウムによりｐＨ５，７に調製し、そして０．０２
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，７）中で平衡化した
ＤＥＡＲ３ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０カラム（２，５Ｘ
３０Ｃ１１）上に付加する。酵素をＤＥ！ＡＥ−５ｅｐ
ｈａｄｅｘカラムから、直線塩化ナトリウムグラジェン
ト（０〜１Ｍ）により溶出する。ＰＧＩＶは０．３８Ｍ
塩化ナトリウムで溶出し、そＬｒＰＧｎＩＡ及びＰＧｎ
［Ｂは０．５　Ｍで溶出する。
５ｄづつの２個の酵素画分を０．１　Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ４，２）中５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０カラム（１，６Ｘ９０Ｃ１ｍ）上で脱塩する。活性画
分をプールし、蒸留水で４倍に稀釈し、そして０．０２
Ｍ　ｂｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｊ！緩衝液（ｐＨ５，８）中
で平衡化したＭＯＮＯロカラム〔ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルス；（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、アプラサ（Ｕｐｐｓａｌａ）、
スエーデン〕に付加する。２０Ｍ１の直線塩化ナトリウ
ムグラジェント（０，１〜０．４Ｍ）を適用する際、Ｐ
ＧＩＶは０．３２Ｍ塩化ナトリウムにて溶出し、他方Ｐ
ＧＩ［ＩＡ及びＰＧＩＩ［Ｂは０．４Ｍ塩化ナトリウム
にて溶出する。
両酵素画分を別々に、上記と同じ条件下でＭＯＮＯＱカ
ラムにより再クロマトグラフ処理する。ＰＧ活性を含有
する両分をプールし、０．０２５Ｍピペラジン／ＨＣＩ
Ｉ緩衝液（ｐＨ６，０”）に対して透析し、そして同じ
緩衝液中で平衡化した？ｌｌ０ＮＯＰカラム（ファルマ
シア・ファイン・ケミカルス、アブサラ、スエーデン）
で付加する。このカラムを１０％（Ｖ／Ｖ）ポリ緩衝液
７４（ファルマシア・ファイン・ケミカルス、アブサラ
、スエーデン）（ｐＨ３，０）により０．７５ａｆ／ｄ
の流速で溶出する。
０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，２）中で
平衡化したｒｓｇ　Ｇ３０００　ｓ＆４カラム（０，７
５Ｘ　３０Ｃ１）（ＬＫＢ、プロンマ（Ｐｒｏｓｓａ）
、スエーデン〕上で０．５ａｆ／分の流速でゲル浸透ク
ロマトグラフィーを行うことにより、最終精製を行う。
カラムを、次の蛋白質標準、すなわちウシ血清アルブミ
ン（６８ｋＤａ）　、卵アルブミン（４５ｋＤａ）及び
キモトリプシノーゲンＡ　（２５ｋＤａ）により換算す
る。
ゲル浸透クロマトグラフィーによりＰＧＩＶについて５
３ｋＤａの見かけ分子量が決定される。ＰＧＩＶは５Ｏ
５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の際に単一バンド
を示し、そして１５％ポリアクリルアミドゲル上での電
気泳動により決定された見かけ分子量５９ｋＤａを有す
る０、０７５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２）中
で決定された比活性は７８０　Ｕ　／■蛋白質である０
等電点電気泳動の際、この酵素はｐＨ３，７においてシ
ャープな単一バンドを示す。
ＰＧＩＶについて記載したのと同じ条件下で、換算され
たＴＳＫ　Ｇ　３００ＯＳ−カラム上テノ、ＰＧｎＩＡ
及びＰＧＩ［ＩＢを含有する活性画分のゲル浸透クロマ
トグラフィーは、それぞれ見かけ分子量３２ｋＤａ及び
５２ｋＤａの２種類の酵素の分離をもたらす。しかしな
がら、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５
％ポリアクリルアミドゲル）の際、両酵素は５７ｋＤａ
の同じ分子量の単一バンドを示す。０．０７５Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４，２）中で測定する場合、ＰＧ
Ｉ［Ａ及びＩ［［Ｂはそれぞれ１５０　Ｕ　／■蛍白質
及び２５０　Ｕ　／■蛋白質の比活性を有する０等電焦
電気泳動の再、両酵素は３．３のｐＨ値においてシャー
プな単一バンドを示す。
５０ｇのラビダーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ）　（Ｇｉｓｔ
−ｂｒｏｃａｄｅｓ＋５ｅｃｌｉｎ、フランス）から出
発して５種類のエンドポリガラクチュロナーゼを例１．
１．に記載したようにして精製する。これらの精製され
た酵素の性質を第２表に要約する。
Ｊ−又−１ Ａ、ニガーのポリガラクチュロナーゼ類の理化学的性質
及び至適ＰＨ ＰＣＩ　　　　　５５Ｋ　　　　３．２−３．５　　　
　４．９ＰＧＩＩ　　　　　３８Ｋ　　　　４．６−５
．９　　　　４．８ＰＧＩ［ＩＡ　　　５７Ｋ　　　　
　３．３　　　　　　４．３ＰＧｎｌＢ　　　　５７Ｋ
　　　　　　３．３　　　　　　４．５注。
（ａ）： ５ＤＳ−ゲル電気泳動により決定された外挿値。
（ｂ）薄層等電点電気泳動により決定された等電点。
ＰＧ■がより小さい蛋白質（３８ｋＤａ）と見られるの
を除き、すべての精製酵素は１５％５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で５５〜５９ｋＤａの範囲の見かけ分子
量を有する。ＰＧｎの特殊な性質は、他のポリガラクチ
ュロナーゼ類について決定される低い等電点値に対して
比較的高い等電点により強調される。
すべてのポリガラクチュロナーゼの至適ｐＨは同じ範囲
（４，３〜４．９）内にある。
精製されたＰＧＩ及びＰＧＩＩに対する特異的抗体を、
Ｕｉｔｚｅｔｔｅｒ（文献３６）により記載されている
免疫方式に従って、ニューシーラント・ホワイト・ラビ
ットにおいて生じさせる。これら２つの抗血清と５種類
の精製ポリガラクチュロナーゼとの間の交叉反応性を下
に要約するようにして観察する。
０、４〜１．　Ｏｔａｒの精製蛋白質を１０％５ＯＳ−
ポリアクリルアミドゲル上に付加し、そして電気泳動の
後ゲルからニトロセルロース膜に、Ｂｏｗｅｎら（参考
文献３７）により記載されている方法により移行せしめ
た。特異的抗血清とニトロセルロースプロットとのイン
キュページ四ン、及びこれに続くパーオキシダーゼ標識
ヤギ抗−ラビットＩｇＧによる染色をＵｉｔｚｅｔｔｅ
ｒ（参考文献３６）に従って行う、ＰＣＩ特異的抗血清
とのインキュベーシヨンの後、ＰＣＩ　。
並びにＰＧＩＡ、ＰＧＩ［Ｂ及びＰＧＩＶについて強い
シグナルが見られる。ＰＧｎはこの抗体についてわずか
に弱いシグナルを与える。ＰＧＩ［特異的抗血清とプロ
ットとのインキュベーシヨンはＰＧＭについては高強度
のバンドをもたらすが、他の４種類のポリガラクチュロ
ナーゼについては弱いバンドのみをもたらす。
約１００ＲのＰＧＩ［を１５０１１１の７０％蟻酸に溶
解し、そして固体シアノゲンプロミドを、メチオニン（
酵素分子当り４残基存在する）の負惜モル過剰で加える
。この反応混合物を２４時間室温にて密閉反応バイアル
中で撹拌する。２４時間後水を加え、そして調製物をＮ
ｔによりフラッシュする。この段階を反復して蟻酸を除
去する。
１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動
の後、クマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｓａ
ｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）により１０
個の個々のバンドを染色することができる。　３８ｋＤ
ａの分子量を有する無傷の蛋白質のほかに、３３　、３
０　、２７　、１９　。
１？、１２．１０．７．５　、６、及び５　ｋＤａのバ
ンドが観察される。２４時間の反応期間中規則的間隔で
サンプルを採取し、そしてそれらを５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析することによって、部
分反応性成物及び最終反応生成物が現われる順序並びに
それらの相互位置が決定された。１７ｋＤａ断片は内部
断片であり、他方５　ｋＤａ断片はＣ−末端又はＮ−末
端のいずれかに位置する０次に２４時間処理の断片を、
マツダイラら（参考文献４）により記載されている方法
に従って、ポリビニリデンジフルオリド膜（ミリホア）
であるＩｓｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐにプロットする。３種の
断片、すなわち１７ｋＤａ中間断片及び２個の小断片（
５及び６　ｋＤａ）を気相配列決定のために使用する。
アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステムス１２０
Ａ　ＰＴ）１分析器にオンライン接続されたアプライド
・バイオシステムスモデル４７０Ａ蛋白質配列決定機に
より決定される。０．５〜−１　ｎｍｏｌｅの特定のペ
プチドを含有する膜断片を洗浄し、気相配列決定機に付
加し、そしてＡｓｏｎｓ　（参考文献５）に記載された
プログラムに従って配列分析にかける。
５　ｋＤａ断片について下記の配列が得られる。
位　　置：１５ アミノ酸：　ａｓｐ−ｓｅｒ−Ｘ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｔ
ｈｒ−ｔｈｒ−ａｌａ−ａｌａ−位　　置：１０　　　
　１２　　　　　１３アミノ酸：　ａｌａ−ａｌａ−１
ｙｓ（ａｌａ）−（ａｌａ）３位（Ｘ）にはアミノ酸が
検出されない、使用した配列決定プログラムは、蛋白質
があらかじめＳ−ピリジルエチル化されている場合にの
みシスティン残基を検出するから、３位はシスティンで
あろう（Ａｓｏｎｓ、参考文献５）、１２位及び１３位
には痕跡のａｌａが見出され、これをカッコ内に示す。
１２位の痕跡は明らかに前段階の不完全な反応から生ず
るが、１３位のａｌａはペプチドの１３位のアミノ酸ａ
ｌａを示す。
１７ｋＤａ断片の配列は下記の通りである。
位　　　置：１５ アミノ酸：　ａｌｐ−ｐｈｅ−ｓｅｒ−ｖａｌ−ｇｌｎ
−ａｌａ−ａｓｎ−ａｓｐ−位　　置：１０ アミノ酸：　ｔｉｅ−ｔｈｒ（ｔｉｅ）−ｐｈｅ（ｔｈ
ｒ）最後の２段階で観察される、カッコを付した痕跡の
イソロイシン及びスレオニンは明らかに、前段階の不完
全な反応から生じたものである。
実施例１．１．１．に従って精製された１００ｎのＰＣ
Ｉをミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｒｅ）濾過した水１１に対
して３回透析し、そして凍結乾燥する。実施例１．３．
に記載したようにしてアミノ酸配列を決定する。この酵
素について、下記のアミノ酸配列が決定された。
位　　　置＝　１　　　　　　　５　　　　　　　　　
９アミノ酸：　ａｌａ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−Ｘ−ｔｈｒ−
ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ａｌａ蛋白質中のシスティン
残基は修飾されていないので検出されない。配列の４位
（Ｘ）にシスティンが存在するようである。ＰＣＩのＮ
−末端アミノ酸配列は、ラピダーゼから単離されたＰＣ
ＩＩの５　ｋＤａシアノゲンブロミド断片のアミノ酸配
列（実施例１、３．　）及びＡ、ニガー形質転換体Ｎ５
９３　／ｐＧＷ１８００−２７から単離されたＰＧ■の
Ｎ−末端アミノ酸配列と相同性を示す、この相同性は下
記のスキームで要約され、ここではそれぞれＰＧＩ配列
及びＰＧ■配列の４位及び３位にシスティンが存在する
ものと仮定している。
ＰＧＩ　　ａｌａ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−
ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ａｌａＰＧＩＩ　　ａｓｐ−
ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ａ
ｌａポリガラクチュロナーゼ■配列中の２位のセリン残
基と３位の推定上のシスティン残基との間の空欄は、両
配列を並置するために導入される。
ＰＣＩ配列中の８位セリン残基はＰＧｎ配列の対応する
位置（７位）に存在しないが、後者の場合には類似タイ
プのアミノ酸、すなわち小形のヒドロキシアミノ酸（ス
レオニン）が存在する。
従って、ＰＧＩ及びＰＧＩＩのＮ−末端アミノ酸配列は
相同性を示すがしかし同一ではない。この相違は、これ
らが単一遺伝子の産物の部分的修飾、例えば部分的蛋白
質分解的開裂、の結果ではあり得ないようなものである
。ＰＧＩ及びＰＧＩＩは同じ類の異る遺伝子によりコー
ドされている。
約１００■のＰＣＩを１５０４の７０％蟻酸に溶解し、
そして実施例１．３．に記載したようにして固体シアノ
ゲンブロミドを加えて蛋白質の断片を調製する。
酵素分子当り４個のメチオニン残基が存在する。
１５％５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びク
マッシー・ブリリアント・ブルーによる染色の後、３９
．５　、３５　、２１　、１９．５及び５．５　ｋＤａ
の分子量を有する主バンドが観察される。
実施例１．３．に記載したのと同じ装置及び方法を用い
て２１ｋＤａ及び５．５　ｋＤａ断片を配列決定する。
２１ｋＤａ断片のアミノ酸配列は下記の通りである。
位　　置＝　１ アミノ酸：　ａｌａ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−Ｘ−ｔｈｒ−ｐ
ｈｅ−位　　　置：１０ アミノ酸：　ｔｈｒ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｕ
実施例１．３．及び１．４．において記載したように、
配列の４位（Ｘ）にシスティンが存在するであろう、　
２１ｋＤａ断片のアミノ酸配列は、実施例１．４．に記
載した無傷のＰＣＩ蛋白賞のＮ−末端アミノ酸配列と同
一である。
５、５　ｋＤａ断片は次の配列を有する。
位　　置；１５ アミノ酸：　ａｌａ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｖａｌ
−ｉｌｅ位　　　置：１０ アミノ酸：　ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ｓｅｒ
これらの配列から、５．５ｋＤａ断片はこの蛋白質のＮ
−末端に対応しないと結論される。
ＰＧＩＩを０．５％（Ｖ／Ｖ）蟻酸に対して透析するこ
とにより部分的に変性せしめ、そして次に凍結乾燥する
。この酵素（１■）をｌｄの０．２ＭＮ−エチルモルホ
リノ−アセテート緩衝液（ｐＨ８，０）中に懸濁し、そ
して次にＰＧ■に対して１：５００モル比で添加したト
リプシン（シグマ）と共に３７℃にてインキュベートす
る。２４時間後、酢酸の添加（最終濃度３０％）により
消化を停止せしめる。この消化物を凍結乾燥する。この
消化物のサンプルを、２．５ｍＭジチオスレイトールを
含有する０、１％トリフルオロ酢酸に溶解し、そして３
７℃にて少な（とも１時間保持する。トリプシン分解ペ
プチド（１００〜２０ＯＲの蛋白質を含有するサンプル
１００〆）を、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（
４，６Ｘ　１５０ｍ）　（Ｓｕｐｅｌｃｏ）及びＶｙｄ
ａｃガードカラム（Ｃｈｒｏ＠ｐａｃｋ）を装着した５
ｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ＳＰ　８０００　ＨＰ
ＬＣを用いて分離する。
カラム温度２５℃、流速２ｗ１／分、及び５０分間で１
００％溶剤Ａ（水中０．１％ＴＦＡ　）から５０％溶剤
Ａ＋５０％溶剤Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）
への直線グラジェントを用いる。ペプチドを２１４ｎｓ
でのＵＶ吸収により検出する。消化中に後期に放出され
るペプチドの１つはこのクロマトグラムにおいて約２１
％アセトニトリルにて他のピークから良好に分離される
。２５℃にて乾燥空気でフラッシュすることによりこの
ペプチドを乾燥し、そして配列決定する。
実施例１．４．に記載した方法によりアミノ酸配列が決
定される０次のアミノ酸配列が得られる。
位　　置　　：１５ アミノ酸配列：　ｔｈｒ−ｔｉｅ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａ
ｌａ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ・位　　置　　：　　　
　１０　　　　　　　　　１４アミノ酸配列：　ｖａｌ
−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｉｌｅ−ｔｈｒ−ｔｙｒアスペルギ
ルス・ニガーＮ４００株の分生胞子を２００ｊｄの最少
培地に最終胞子密度が１０６胞子／ｄとなるように接種
し、そして１１のエルシンマイヤーフラスコ中で２８℃
にて２４時間、３００ｒｐ−にてＮｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗ
ｉｃｋロータリーシェーカーを用いて振とうする。ミラ
クロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ）を付したプフナー漏斗を
用いる濾過により菌糸を収得し、冷無菌塩水で洗浄し、
液体窒素中で凍結し、そして−６０℃にて貯蔵するか、
又はすぐに使用する。ゲノムライブラリーを調製するた
めにＤＮＡの単離に用いた方法はＹｅｌｔｏｎら（参考
文献１８）により記載された方法に基（。
ライブラリーの作製のため、１０ｇの菌糸を１ｇずつ、
ブラウン（Ｂｒｏｕｎ　）マイクロ−膜破砕機中で液体
窒素中で粉砕する。粉砕された菌糸を、２０〇−の抽出
緩衝液（５０■Ｍ　ＨＤＴＡ（ｐＨ８，５）　、０．２
％ＳＯＳ　）　及ヒ２００ｄのジエチルピロカーボネー
トを含む１２の無菌エルレンマイヤーフラスコに移す。
この混合物を徐々に室温まで加温し、そして時々振とう
しながら、２０分で６８℃に加熱する。懸濁液を室温に
冷却し、そして１２．０００Ｘ　ｇにて１５分間遠心分
離する。この懸濁液に１／１６容量の８Ｍ酢酸カリウム
（ｐＨ４，２）を添加し、そして混合物を氷上に１時間
置く、遠心分離（２０分間Ｓ　Ｌ６．０ＯＯＸ　ｇ　：
４℃）により沈澱を除去する。氷上で１５分間０．６容
量のイソプロパツールと共にインキュベートすることに
より上清から核酸を沈澱せしめる。沈澱した核酸を遠心
分離により集め（１０分間；６．０００×ｇ；４℃）、
７０％エタノールにより洗浄し、そして短時間乾燥する
。ペレットを、２０ｚ／ｙｄのルナーゼ（Ｒｎａｓｅ）
　Ａ　（ヘーリンガー・マンハイム）を含有する１０１
ｄのＴＥ中に懸濁し、そして１５分間３７℃にてインキ
エベートする。ＤＮＡをヌクレアーシネ含有プロナーゼ
（最終濃度１■／ａｄ）（Ｋｏｃｈｌｉｇｈｔ　Ｃｏ１
ｎｂｒｏｏｋ）により３７℃にて１時間処理する。ＴＥ
緩衝液中プロナーゼストック溶液は、ヌークレアーゼを
消化するために３７℃にて１時間前インキエベートされ
た酵素２０■／−を含有する。
８．５ｇのＣｓＣｊ！を、得られたＤＮＡ溶液９−に溶
解し、０．２　ｍの１０■／ｄエチジウムプロミドを添
加し、そしてこの溶液をベックマンＳ−４１０−ター中
で３３．０ＯＯｒｐ−にて６０時間、又はベックマン５
０Ｔｉローター中で４５．０００ｒｐ−にて４０時間遠
心分離する。ＤＮＡバンドを集め、そしてエチジウムプ
ロミドを、水中ＮａＣ１飽和溶液で平衡化したイソプロ
パツールでの多段抽出により除去する。５容量のＴＥを
添加し、ＤＮＡ溶液をＴＥ飽和フェノール／イソアミル
アルコール（２４：１）フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５：　２４）、クロラムフェニ
コールにより処理する。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５，２）及び２．５容量のエタノールの添加並
びに−２０℃にて一夜のインキュベーションによりＤＮ
Ａを沈澱せしめる。沈澱を遠心分離（１時間；　３０．
０００ｘ　ｇ　；　４℃）により集め、乾燥し、そして
４００　ｄのＴＥ中に溶解する。
１３．６〜２３ｋｂｐのＤＮＡ断片を最も多くもたらす
Ｍｂｏ　ｌ濃度について試験するため、１尾ずつのＡ。
ニガーＮ４００のＤＮＡを提供者により推奨される適当
な緩衝液中で、減少する量のＭｂｏｌ（０，５〜ｏ、ｏ
ｏｉｖ）を用いて３７℃にて１時間１０ｍの容量で消化
する。ＩＩの０．２５Ｍ　ＨＤＴＡの添加により反応を
停止し、そしてサンプルを、ｌｘ／ａｄのエチジウムプ
ロミドを含有するＴＢＥ緩衝液０．６％アガロースゲル
に付加する０便利なサイズマーカーはλＤＮＡ及びＢｇ
ｌＩ［により消化されたλＤＮＡの混合物であり、この
ものは４９　、２２．８　、１３．６　、９．８及び２
．３　ｋｂｐのバンド並びに０．４ｋｂｐの見えない断
片を提供する。目的とする１３．６〜２３ｋｂｐ断片を
高収量で提供するために必要なＭｂｏ　ｌ濃度は約０．
０２Ｕ／、　ＤＮＡである。従って、全容２ｉｄ中２０
０ｘのＤＮＡを消化し、そして酵素の添加直後に２０個
の等量のアリコートに分ける。３７℃にて１時間の後、
消化物を氷上に置り、１１１１のサンプルをゲル上で泳
動させることにより適切な消化についてチエツクした後
、ＩＩ！ＤＴＡを最終濃度２５ｍＭとなるように添加し
、酵素を６５℃にて１０分間熱失活せしめ、サンプルを
プールし、そしてＤＮＡを沈澱せしめ、洗浄し、そして
４００ｉ１１のＴＥに溶解する。
断片化されたＤＮＡを０．４％分取用アガロースゲル（
中央ウェル１２０Ｘ　１．５腫）上で分離する。
マーカーとしてＢｇｌ［［消化λＤＮＡを用いて、４℃
及び４０Ｖ　（３Ｖ／Ｃ１ｍ）での電気泳動後に部分消
化ＤＮＡ断片のサイズを決定する。正しいサイズの断片
を含有するゲル領域をゲルから切り取り、そしてこのＤ
ＮＡを無菌透析チューブ中の２ＭＩＴＢＥ中で１００ｖ
にて２〜３時間電気溶出する。電流を３０秒間逆転せし
め、そしてＤＮＡを含有する緩衝液を集める０次に、断
片をエタノール沈澱により濃縮しそして１００ｄのＴＥ
中に溶解する。
Ａ、ニガーＮ４００株のゲノムライブラリーをλベクタ
ーｆ！ＭＢＬ　Ａ中に作製する。９〜２３ｋｂｐのクロ
ーニング容量を有するこのベクターはＦｒ１ｓｃｈａｕ
ｆら（参考文献９）及びＫａｒｎら（参考文献１９）に
より記載されており、そしてプロメガ・バイオチック社
（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）から販
売されている。
ゲノムの異る部分に由来する二重挿入を回避するため、
最少断片長１３．６ｋｂｐをクローニングのために用い
る。
１０ＩＩＩＫのλＥ？ＩＢＬ４　ＤＮＡを５０ユニツト
の９ｇｍＨＩにより、供給者により推奨される緩衝液中
で１００４の容量にて３７℃で２時間消化する。酵素を
６５℃にて１０分間不活性化する。　　ＮａＣｊ！濃度
を１５０ｍＭに上げ、そして５０ユニツトの５ａｉｌを
添加し、そして３７℃でのインキュベーションをさらに
２時間続ける。
ＥＤＴＡを２５■Ｈまで添加しそして酵素を不活性化（
６５℃にて１０分間加熱）した後、溶液を等容量のフェ
ノール（ＴＥ飽和）、フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール２５：２４：１）、ｌ’り。
ロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）により抽
出する。小Ｂａａ＋ＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉポリリンカー
断片を除去するため、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，２）を添加した後０．６容量のイソプロパツ
ールによりＤＮＡを沈澱せしめる。１５分間氷上に置き
そして１２．ＯＯＯＸｇ及び４°Ｃにて１５分関連心分
離した後、沈澱を７０％エタノールにて十分に洗浄し、
乾燥し、そして４０ｄのＴＥに溶解する。
実施例２．３．に従って調製されたベクターのｃｏｓ部
位が連結反応に先立ってアニールされることが必須であ
る。ベクターを１００ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐ
Ｈ７゜５）及び１０＋ｓＭ　ＭｇＣ／！　を中テロ５℃
ニテ１ｏ分間加熱し、そして次に４２°Ｃにて１時間ア
ニールする。試験連結の結果から、約１８１（重量）の
ベクター対断片の比率が最も多くの組換体をもたらすこ
とが見出される。連結は、５０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
！　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，ｘ　、１
０ｍＭ　ＤＴＴ及び１　ｍＭ　ＡＴＰ中で９．５４のベ
クター及びＬｏｇのＤＮＡ断片を用いて全容１００ｉ！
ｉ中で行われる。ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を０、５　
Ｕ／ｑｒ　ＤＮａの濃度で加え、そして連結混合物を１
４℃にて一夜インキエベートする。連結について試験す
るため、連結されたＤＮＡのサンプルをアガロースゲル
上で泳動せしめる。さらに、対照として、０．５　ｔｔ
ｔｘのベクターを、断片を加えないで５バの容量にて連
結する。
大容量連結混合物をエタノール沈澱により濃縮しそして
２０ｉｄのＴＥに溶解した後インビトロパッケージング
のために用いる。インビトロパッケージングはＰｒｏｍ
ｅｇａ　Ｐａｃｋａｇｅｎｅ抽出物により、製造者の指
示に従うて、ＩＮのＤＮＡをパッケージするために１ｏ
Ｉずつ用いて行う、抽出物と共に提供されるＩＲの高分
子対照ファージλｃ　Ｉ　８５７　Ｓａｓ＋　７を別途
対照としてパッケージする。パッケージングの後、５０
０　ｄのファージ溶液緩衝液（ＰＳＢ）及び５バのクロ
ロホルムを加える０組換えファージストックは４℃にて
貯蔵することができる。得られるライブラリーは２つの
別々の連結実験から作製する。
大腸菌ＮＭ５３９の細胞を、０．２％マルトース、１〇
−ｎ　Ｍｇ５Ｏ，及びｌ　ｍＭ　ＣｕＣｊ！　ｔを含有
するＬＢ培地上で１．０の光学濃度（６００ｎｍ）まで
増殖せしめる。この培養物の０．２　ｍのアリコートを
ＰＳＢ中の適当なファージ稀釈物０．１　ｉｄに加える
。３７℃にて２０分間のファージの吸着の後、４５℃の
温度の３−の０．６％ＬＢ上昇寒天を加え、混合物をＬ
Ｂ寒天プレートにプレートし、そしてこれらを３７℃に
て一夜インキエベートする。ファージ懸濁液ｄ当りのプ
ラーク形成単位（ｐｆｕ）数は、実施例１．４．に従っ
て調製された２つのファージストックについてそれぞれ
１２　Ｘ　１０’及び４．２　ＸＩＯ’である。断片を
含まない対照連結物から計算されるバックグラウンド（
それぞれ１７％及び４０％）を差引いて、組換体の絶対
数は６×１０％である０組換体中に含まれるＤＮＡは２
００個以上のアスペルギルス・ニガーのゲノムと同等で
ある。
このライブラリーを増幅するため、両パッケージストッ
クの８０ｉｔ１のアリコートを用いて大腸菌ＮＭ５３９
に感染せしめ、これをＬＢ寒天プレート上のＬＢ上層ア
ガロ・−スにプレートし、そして次に３７℃にて一夜イ
ンキエベートする。プレートをプレート当り５ａｆのＰ
ＳＢと共に室温にて１時間おだやかに振とうすることに
よりファージをアガロースから溶出する。ＰＳＢを集め
、遠心分離（６，０ＱＯＸ　ｇにて１０分間）して細菌
を除去し、そしてクロロホルムを加える（最終濃度０．
５％）、およそ同程度に増幅された両ファージストック
を混合しく４０ｄストツク）、力価検定しく８Ｘ１０’
ｐｆｕ／ａｍ）そして４℃で貯蔵する。
実施例λに従って調製されたアスペルギルス・ニガーの
ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのオリゴ
ヌクレオチドを、ホスホラミダイト法（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ、参考文献８）を用いてアプライド・バイ
オシステム（モデル３８０Ｂ）オリゴヌクレオチド合成
機により合成する。実施例１．２に記載の１７ｋＤａ　
シアノゲンプロミド断片は内部に位置するペプチドであ
る。従って、実施例１．４．において決定されたアミノ
酸配列をメチオニン残基を有するＮ−末端において延長
することができる。
遺伝コードの縮重を考慮して、合成されるオリゴヌクレ
オチドは複雑な混合物である。技術的な理由のため、混
合物中のオリゴヌクレオチドの数を減少させる必要があ
る。１０位及び１１位における悪い組合わせＴＧ及びＡ
Ｃを有するオリゴヌクレオチドを除外するため、及び混
合物のサイズを限定するため、遺伝コードの縮重を考慮
しながら、コード鎖中の配列に相当するオリゴヌクレオ
チドの２つの別個の混合物を合成する。合成される２９
−ｓｅｔの４つの異る位置にウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）
塩基としてイノシンを導入することにより必要なオリゴ
ヌクレオチドの数をさらに減少せしめる。それ故に各混
合物は１６種の異るオリゴヌクレオチドから成る（オー
ツカら、参考文献１６）　、　ＨＲ６１９５及びＨＲ６
１９６と称する２つの混合物は下記のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを代表しそして下記の組成を有する。
上記配列中、■はイノシンであり、Ｒ１はＴ又はＣであ
り、そしてＲ１はＡ又はＧである。
実施例１．５．に記載の５．５　ｋＤａシアノゲンブロ
ミ ド断片はＣＮＢｒ開裂により調製される内部に位置する
ペプチドである。従って、そのアミノ酸配列はメチオニ
ン残基を有するＮ−末端において延長され得る。必要と
されるオリゴヌクレオチドの数は、合成される３２−ｅ
ｒの５つの異る位置においてウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）
塩基としてイノシンを導入することにより減少される。
これが、混合物を２４種の異るオリゴヌクレオチドに限
定する。　ＨＲ６２９Ｂと称する混合物は下記アミノ酸
配列をコードするＤＮＡを代表し、そして下記の組成を
有する。
アミノ酸配列：　　　　ｍｅｔ　ａｌａ　ａｓｐ　　ｇ
ｌｙ　ａｌａ　ｖａｌＨＲ６２９Ｂ　：　　５’　（ｄ
）ＡＴＧ　ＧＣＩ　ＧＡＲ＋　ＧＧＩ　ＧＣＩ　ＧＴＩ
配列中、■はイノシンであり、Ｒ３はＴ又はＣであり、
そしてＲ８はＴ、Ｃ又はＡである。
［オリゴヌクレオチドのｊｔ冨ｐ− 凍結乾燥されたオリゴヌクレオチド１ｌＲ６１９５。
ＨＲ６１９６及び■Ｒ６１９Ｂを２９岸の濃度で蒸留水
に溶解する。これらの溶液のサンプルを１０倍稀釈して
反応混合物を調製する０反応混合物は、５０５Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，６）　　、　１０曽Ｍ　　Ｍ
ｇＣ１ｔ、　　５蒙門、　　ＤＴＴ、　　０．１　鵬Ｈ
ＥＤＴＡ及びＱ、　ｌ　ｍＷスペルミジン（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、参考文献６．１２２頁）から成るキナーゼ緩
衝液５０ｄ中、２０ｐｓｏｌｅのオリゴヌクレオチドｌ
’１Ｒ６１９５と２０ｐｍｏｌｅのＢＲ６１９６との組
合わせか又は４０ｐｍｏｌｅのＩ’１Ｒ６２９Ｂ単独の
いずれか、３４ｐｍｏｌｅの（Ｔ　−”Ｐ）　−ＡＴＰ
（ＮＥＭ。
６．０００Ｃｉ／ｓｍｏｌ）　、及び３０ユニツトのポ
リヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）から構成される。イ
ンキュベーシッンは３７℃にて３０分間行う、４ｄの５
ＭＢＤＴＡ　（ｐＨ８，０）点加により反応を停止せし
める。
ゲノムライブラリーをスクリーニングするため（実施例
３．４．　）又はササンプロット（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ）をプローブするため（実施例３．６．　）に
精製することなく反応混合物を使用する。
前記アスペルギルス・ニガーＮ４００株ゲノムライブラ
リーの一部分を３Ｍ中に稀釈し、そして約２．０ＯＯｐ
ｆｕを含有する。、　ｉ　ｌｉずつをプレートする。
０、２％のマルトースを補充されたＬＢ培地５０ａｄに
ＬＢ培地中大腸菌ＮＭ５３９の一夜培養物０．５　ｍを
接種し、そして２５０ｒｐ−にて４時間、ガレンヵンプ
（Ｇａｌｌｅｎｋａｓｐ）回転振とう機上で３７℃にて
振とうし、次ニ０．５　ｄｌ　（Ｄ　Ｉ　Ｍ　Ｍｇ５Ｏ
ａ及び０．５ｍ（７）０．５ＭＣａＣｊ！、を添加する
ことにより宿主細胞を調製する。これらの細胞の０．２
　ｉｄのアリコートをそれぞれ０．　ｌ　ｄづつのファ
ージ懸濁液と混合し、そしてこれらの混合物を室温にて
０．５時間インキエベートする０次に、４７℃のＬＭ培
地中０．７％アガロース３１ｄを加え、短時間渦動撹拌
し、そしてＬＭ寒天プレート上にすぐにプレートする。
これらのプレートを３７°Ｃにて一夜インキユベートし
そして２時間４°Ｃに冷却する。
各プレートから、Ｂｅｎ　ｔｏ口及びＤａｖｉｓのブラ
ークハイプリダイゼーシッン法（参考文献７）に従って
２枚のレプリカを作る。第一のフィルター（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｅｌｌ　ＢＡ８５）はプレートの
上面に１分間置き、第二のレプリカは２分間置き、そし
てレプリカの位置をインディアインクを用いて標識する
。フィルターを除去した後、これらを、１００ａｄの変
性溶液（Ｉ　Ｍ　ＮａＣｊ！　、　０．５　Ｍ　Ｎａ０
Ｈ）を含有する皿に５分間入れ、そして次に１００ｉｄ
の中和溶液（０，５Ｍ　Ｔｒｔｓ４１Ｃｆ　（ｐＨ７゜
５）、１．５ＭＮａＣ１）を含む皿に入れられる。フィ
ルターを、３ｘｓｓｃを含有する皿に移し、細菌破片を
除去するためグローブをつけた手で穏やかにこすり、そ
して３ｘｓｓｃによりすすぐ、フィルターをプロットし
、室温にて１０分間乾燥し、そしてオープン中ワットマ
ン３ＭＭペーパー上で８０℃にて２時間乾熱する。
乾熱したフィルターを３ｘｓｓｃ中で湿し、この溶液中
で室温にて１時間洗浄し、そして次に２５０威のあらか
じめ加温（６５℃）されたプレハイブリダイゼーシッン
混合物を入れた皿に移す。プレハイブリダイゼーシッン
混合物は、オリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１９５及び
ＨＲ６１９６が使用される場合には２ｘｓｓｃから成り
、そしてオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６２９Ｂが使用
される場合には１ｘｓｓｃから成り、さらに１０×デン
ハート（０，２％ＢＳＡ、べ一リンガー画分Ｕ　；　０
．２％Ｆｉｃｏｌｌ　４００　、ファルマシア；０．２
％ポリビニルピロリドン−１Ｏ、シグマ）、０．１％Ｓ
ＤＳ、及び０．１■／ｄの剪断されそして新たに変性さ
れたニシン精子ＤＮＡを含む、プレハイブリダイゼーシ
ッンを６５℃にて５時間、振とう水浴中で行う０次に、
フィルターを２５０ｄのあらかじめ加温したハイブリダ
イゼーション混合物中で０．５時間洗浄する。このハイ
ブリダイゼーシッン混合物はニシン精子ＤＮＡが含まれ
ない点を除きプレハイブリダイゼーシッン混合物と同じ
である０次に、フィルターを１５０ｍのあらかじめ加温
（６５℃）されたハイブリダイゼーシッン混合物を含む
別の皿に入れる。このハイブリダイゼーシッン混合物に
は、あらかじめ標識され一緒にされたオリゴヌクレオチ
ド混合物ＨＲ６１９５及びＨＲ６１９６（実施例３．１
．）、又は標識された混合物ＨＲ６２９Ｂが新しく加え
られている。
ＨＲ６１９５及びＨＲ６１９６が使用される場合、皿を
６５℃の振とう水浴に入れ、サーモスタットを４７℃に
調整しそしてハイブリダイゼーシヨンを１４時間進行さ
せる。フィルターを２５０ｍのあらかじめ加温した（４
７℃）ハイブリダイゼーション混合物中で４７℃にて０
．５時間１回洗浄し、次に２５０ｉｄの２ＸＳＳＣを２
回交換してそれぞれ４５分間ずつ室温にて洗浄する。２
５０１ｄのあらかじめ加温された（６３°Ｃ）６ｘｓｓ
ｃ　、　ｏ、ｏｓ％ビロリン酸ナトリウムを含む皿にフ
ィルターをまず移し、そして次に６３℃の振とう水浴中
で３０分間インキュベートすることによりストリンジェ
ント洗浄を行う０次に、フィルターを室温にて２ｘｓｓ
ｃを２回交換してそれぞれ３０分づつ洗浄する。フィル
ターを空気乾燥し、ワットマン３ＭＭペーパーのサポー
ト上に固定し、プラスチックラップで覆い、そして増強
スクリーンを使用してコダックＸＡＲ５フィルムに一６
０℃にて３日間暴露する。
こうして、スクリーニングされた６枚のプレートから６
個の陽性シグナルが得られる。インクマーカーを用いて
オートラジオグラム上にプレートを注意深く置くことに
より無菌パスツールピペットを用いて陽性プラークを打
ちぬく。陽性プラークを含む寒天片を１−のＳＭに加え
、２．５４のりロロホルムを加える。室温にて１時間時
々渦動撹拌しながら、ファージを寒天から拡散せしめ、
次に４°Ｃにて一夜インキエベートする。５分間遠心分
離することにより寒天及び細菌細胞破片を除去し、２．
５１１１のクロロホルムを加え、そしてファージストッ
クを４℃にて貯蔵する。
陽性クローンをλＣ〜λＧ及びλＩと命名する。
ファージが高密度でプレートされているため、陽性プラ
ークを低密度でプレートし、そしてレプリカプレート、
ハイブリダイゼーション及び陽性プラークの拾い上げの
完全な手順を２回繰り返すことにより陽性プラークを純
化する。
オリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６２９Ｂを使用する場合
、皿を６５°Ｃの振とう水浴に入れ、サーモスタットを
５２℃に調整し、そしてハイブリダイゼーションを１４
時間進行させる０次に、フィルターを１回２５０ｄのあ
らかじめ加温された（５２℃）ハイブリダイゼーシ目ン
混合物中で０．５時間５２℃にて洗浄し、次に室温にて
２５０ｊｄの２ＸＳＳＣを２回交換してそれぞれ４５分
間洗浄する０次に、２５０ｄのあらかじめ加温した（６
４℃）　４　Ｘ５ＳＣ，０，０５％（Ｗ／Ｖ）ピロリン
酸ナトリウムを含む皿にフィルターを移しそして次にそ
れを振とう水浴中６４℃にて０．５時間インキエベート
することによりストリンジェント洗浄を行う０次に、フ
ィルターを室温にて２×ＳＳＣを２回交換してそれぞれ
３０分間洗浄する。フィルターを空気乾燥せしめ、ワッ
トマン３ＭＭペーパーのサポート上に固定し、プラスチ
ックラップで覆い、そして増強スクリーンを用いてコダ
ックＸＡＲ５フイルムに一６０℃にて３日間暴露する。
こうして、スクリーニングした６枚のプレートから９個
の陽性シグナルが得られる。インクマーカーを用いてオ
ートラジオグラム上にプレートを注意深く置くことによ
り、無菌パスツールピペットを用いて陽性プラークを打
ちぬ（、陽性プラークを含有する寒天片をｌｉｄのＳＭ
に加え、２．５Ｉのクロロホルムを加える。室温にて１
時間、時々渦動撹拌しながらファージを寒天から拡散せ
しめ、そして次に４°Ｃにて一夜インキエベートする。
５分間の遠心分離により寒天及び細菌細胞破片を除去し
、２．５ｍのクロロホルムを加え、そしてファージスト
ックを４℃にて貯蔵する。
陽性クローンをＰＣＩ−λ１〜９と命名する。ハイブリ
ダイゼーションのためのへテロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）プローブとしてｐＧＷ１８０３　（実施例
３．８．を参照のこと）の１．２　ｋｂｐのＢａｉ＋Ｈ
Ｉ　／　ＥｃｏＲ１断片を用いて低密度でプレートする
ことにより陽性プラークをさらに純化する。このハイブ
リダイゼーションは６０℃にて行い、洗浄は２ｘｓｓｃ
中で６０℃にて行う。
！Ａｌｔ盃１１叩Ｌ■皇鳳 組換えクローンからＤＮＡを単離するため、ファージを
まず増幅する。この目的のため、１０ｍＭ）ＩｇＳＯａ
及び０．２％マルトースを補充したＬＢ培地中で大腸菌
ＬＥ３９２宿主細胞を１．０の光学濃度（６００ｉｓ）
まで増殖せしめる０次に、５０ｍの純化ファージのスト
ックを実施例２．５．に記載したようにして別々にプレ
ートする。３７℃にて一夜インキエベートした後、５ｙ
ｄのＳＭをプレートに拡げそして穏やかに振とうしなが
ら２時間インキエベートすることにより非−コンフルエ
ントのプレートからファージを溶出する。溶出されたフ
ァージを収得し、＋して０．１ｍのクロロホルムを加え
る。混合物を短時間渦動撹拌しそして遠心分離により細
胞片を除去する。上清を回収し、クロロホルムを０．３
％になるように加え、そして得られるプレート溶解物を
４°Ｃにて貯蔵する。
ファージＤＮＡの単離のための出発材料としてコンフル
エントに近いプレートを得るため、１０１１１の前記プ
レート溶解物を大腸菌ＬＥ３９２宿主細胞と共にプレー
トする。３７℃にて一夜のインキュベーションの後、コ
ンフルエントに近いプレート３枚からアガロース上層を
かき取る。これらの層を一緒にし、・そして２０１ｄの
ＳＭ及び０．４　ａｄのクロロホルムを加え、そして得
られる混合物を３７°Ｃにて３０分間振とうする。遠心
分離により細胞破片及びアガロースを除去し、上清を回
収し、そしてその体積をＳＭにより１８Ｗ１に調整する
。同体積のＳＭ中２Ｍ　ＮａＣｊ！、　２０％ＰＥＧ　
６０００（ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ、英国）を加え、そして
この溶液を混合しそして氷上に置く。７５分間の後、１
２．０００Ｘ　ｇ及び４℃にて２０分間の遠心分離によ
りファージをペレット化する。上清をデカント除去し、
そして残留する流体をクリーネックス（Ｋｌｅｅｎｅｘ
）テイクスにより除去する。
ベレットを３１１のＳＭに再懸濁し、そして次に３戚の
クロロホルムにより抽出する。水相をＲＮアーゼ（６７
ｇ／ｄ）及びＤＮＮアーゼ（３３躍／−）により３７°
Ｃにて２０分間処理する０次に、２ｎｄのフェノールを
加え、渦動撹拌し、ｌａｉのクロロホルムを加え、再び
渦動撹拌しそして遠心分離によって２相を分離すること
により前記混合物を抽出する。水相をさらに２回それぞ
れ３Ｉｄのフェノール／クロロホルム（１：１）及び３
１ｄのクロロホルムにより抽出する０次に、０．３　ｄ
の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，２）及び６１ｄ
のエタノールを次々に添加することにより水相からＤＮ
Ａを沈澱せしめる。この混合物を４　’Ｃにて１６時間
置き、そして次に遠心分離（１０分間、１２．０００Ｘ
　ｇ、４℃）によりＤＮＡを回収する。ペレットを０．
４　ｄのＴＥ緩衝液に溶解し、ＲＮアーゼを２００ｘ／
ａｄとなるように加え、そして３７℃にて１時間インキ
ュベートする。３８Ｉｔ１の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５，２）及び０．８　ｍのエタノールを添加する
ことにより４℃にて１時間ＤＮＡを沈澱せしめる。
遠心分離によりＤＮＡを回収し、そして次に１００メの
ＴＥ緩衝液に溶解する。
ＰＧＩＩ遺伝子配列を含有する陽性ファージから、λＤ
＆びλＥを選択してさらに分析する。まず、両ファージ
がＡ、ニガーのゲノムの同じ領域からの挿入部を含有す
ることを確立し、そして次にλＥの部分的制限地図を作
製する。
２４のファージＤＮＡを２０ユニツトのＥｃｏＲＩもし
くはＢａｍＨＩ又はこれらの酵素の組合せにより１００
４の容量中３７℃にて３時間、供給者（ＢＲＬ）の推奨
する緩衝液中で且つ０．８■／Ｍ１のＲＮＮアーゼの存
在下で消化する０次に、１０Ｉｄの３Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，２）を添加し、そしてこの混合物を８
０１ｄのクロロホルムで抽出する。２５０Ｉのエタノー
ルの添加により水相からＤＮＡを沈澱せしめ、そして混
合物を氷上に１時間置＜、ＤＮＡを遠心分離により集め
、２５Ｉのサンプル緩衝液中に溶解し、そして６５゛Ｃ
にて１０分間加熱する。
ＨｉｎｄＩ［［により消化したＩＲのλＤＮＡ　（ＢＲ
Ｌ）をサイズマーカーとして使用して、サンプルを０．
７％アガロースゲル上で泳動せしめる。ポラロイド６６
７フイルムを用いてＵＶ）ランスイルミネーター上でゲ
ルの写真をとる。Ｍａｎｉａｔｉｓら（参考文献６．３
８２−３８６頁）に記載されているようにして５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ（１９７５）の方法に従って、ＤＮＡを５ｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｖｅｌｌ　Ｂ＾８５ニトロセ
ルロース膜に移す０次に、この膜を乾熱し、そして実施
例３．３．に記載したように一緒にされ、標識されたオ
リゴヌクレオチド混合物１１Ｒ６１９５及びＨＲ６１９
６とハイブリダイズさせる。
写真及びオートラジオダラムから既知マーカーバンドと
の比較により断片の長さを計算する。
ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｗｌ　Ｉ及びこれらの酵素の組合
わせによりファージλＤ及びλＥから単離される、ＤＮ
Ａ消化の後に得られる５ｋｂｐより小さい断片のサイズ
を第３表に示す。使用した電気泳動系の解像力によれば
より大きなサイズの断片を比較するのは無意味である。
第３表に示されるＥｃｏＲＩ消化物中の低い強度の少数
のバンドの存在から判断して、ＥｃｏＲＩはＤＮＡを完
全には消化していない。
ＩＩ！ｃｏＲＩ　／　Ｂａ５Ｈに重消化物中に存在する
が単独消化物のいずれか１方には存在しない断片は、同
じサイズ範囲中のＢａｍＨＩ断片のそれに匹敵する強度
を有する。従って、これらは完全消化生成物を代表しな
ければならない、λＥの場合、組合わされたオリゴヌク
レオチド混合物ＨＲ６１９５及び６１９６とハイブリダ
イズする断片は、ＢａｍＨＩ消化物中の１０ｋｂｐより
大きい断片、ＢｃｏＲＩ消化物中の７．４　ｋｂｐＥｃ
ｏＲＩ断片及びｔｏｋｂｐより大きい断片、並びにＢａ
５ＨＩ　／　ＥｃｏＲに重消化物中の２．８　ｋｂｐ断
片及び１０ｋｂｐより大きい断片である。λＤの場合、
組合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１９５及
びＨＲ６１９６とハイブリダイズする断片は、ＢａｍＨ
Ｉ消化物中の１０ｋｂｐより大きな断片、ＥｃｏＲＩ消
化物中の５、８　ｋｂｐ断片及び１０ｋｂ、より大きな
断片、並びにＢａ＋ｍｌｌ　Ｉ　／　ＥｃｏＲｌ二重消
化物中の１．２　ｋｂｐ断片及び１０ｋｂｐより大きな
断片である０例えばＥｃｏＲＩによる消化物中で更なる
断片が観察される場合、該−層大きな断片は部分開裂か
ら生じた生成物と見なされる。λＤ及びλＥから得られ
る同じサイズの断片のオリゴヌクレオチド混合物とのハ
イブリダイゼーションは観察されない。
上に列挙したファージλＤとλＥとの間の相違から、フ
ァージλＤ及びλＥは同一ではないと結論される。しか
しながら、第３表は、λＤ及びλＥ中の同じサイズを有
する２個のＥｃｏＲｌ断片、３個のＢａ５Ｈｌ断片及び
少なくとも４個のＢａｍＨ１−ＥｃｏＲｌ断片を示して
いる。アスペルギルスＤＮＡをベクターに挿入するため
に使用されたＢａｍＨ１部位及びこれらのＢａｍＨ１部
位を挟みそしてそれ故に挿入部を挾むＥｃｏＲ１部位の
ほかにはこのベクターはＥｃｏＲＩ又はＢａｗｌ　Ｉ部
位を含有しない（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら、参考文献９）
から、前記の断片は前記のファージの挿入部から生じた
ものに違いない。従って、ファージλＤ及びλＥの挿入
部はＡ、ニガーのゲノムの同じ領域に由来すると結論さ
れる。λＤからの意味のあるハイブリダイズするＢａ５
ｉｎ　Ｉ　−１１！ｃｏＲｌ断片がλＥからの対応する
断片より小さい、すなわち１．２　ｋｂｐ対２．８　ｋ
ｂｐであることと相まって、そして制限パターンにおい
て観察される相違がクローニングの人工的な結果ではな
いと仮定すれば、λＤのハイブリダイズする１、　２　
ｋｂｐ　Ｂａ間ｌ１１４ｃｏＲｌ断片のＢｃｏＲ１部位
はＡ、ニガーＤＮＡに由来するのではなく、そしてそれ
はこのファージの挿入部を挾むＥｃｏＲ１部位の１つで
ある。さらに、一つの方向において、λＤの挿入部は、
オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズする配列を
越えて最大１．２　ｋｂｐ延びていることになる。さら
に、オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズするλ
Ｅの配列は、ハイブリダイズする１８ｋｂｐＢａｍＨＩ
　−ＥｃｏＲｌ断片の端のＢａｗｌ　Ｉから１．２　ｋ
ｂｐ以内に位置すると推論される。
】−」Ｌ−表 λＤ ３．８ λＥ ３．８ ３．５（Ｐ） λＤ λＥ λＤ ４．４ λＥ ４．４ ３．２（Ｐ） ２．４ ２．４ ２．８ ２．４　　　　　　　　　２．４ ２．２　　　　２．２　　２．２　　　２．２１．６　
　　　１．６　　　１．６　　　１．６１．５　　　１
．５ １．２ ０．９８ ０．８４　　　０．８４ ０．７２　　　０．７２ ０．６８０．６８ ０．６２　　　０．６２　　０．６２　　０．６２λＥ
の部分的制限地図を作成するため、ファージＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ　、　　Ｘｂａ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［［並びにこ
れらの酵素の可能なすべての組合せにより消化する。
これを２段階で行う、まず、６可のＤＮＡを３７℃にて
１０５分間、２００ＵのＥｃｏＲＩの存在下又は非存在
下で、供給者（ＢＲＬ）により推奨される緩衝液及びＲ
ＮアーゼＡ（２■／ｍ）を含有する２００−の容量中で
インキユベートする０次に、この反応混合物ｔ−１００
４のフェノール／クロロホルム（１：１）により抽出し
そして次に１００１１１のクロロホルムにより抽出する
。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液及び２容量の
エタノールの添加により水相からＤＮＡを沈澱せしめる
。氷上に１０分間装いた後、遠心分離により沈澱を集め
る。ペレットを空気乾燥し、そして１００ＩのＴＥ緩衝
液中に溶解する０次に、これらの溶液を、制限酵素の非
存在下（ＥｃｏＲＩで消化された材料のみ）、又は旧ｎ
ｄｌ［。
Ｘｂａ　Ｉもしくはこれらの酵素の組合わせの存在下で
のインキュベーションのために使用する。このインキュ
ベーションは３７℃にて２時間、１０１１１の対応する
ＤＮＡ溶液、ＲＮアーゼＡ（２■／ｄｉ）、１０Ｕの対
応する制限酵素及び供給者（ＢＲＬ）により推奨される
緩衝液を含有する２０メの容量において行う、５倍濃度
のサンプル緩衝液５Ｉの添加によりインキュベーション
を停止し、そして次にサンプルを前記のようにして分析
する。
旧ｎｄＩ［１，Ｘｈａｌ又はこれら２種類の酵素の組合
わせによる消化物中には１０ｋｂｐより大きい単一のハ
イブリダイズするバンドがオートラジオグラム上に検出
される。他のすべての消化物中に、強度は低いがおよそ
同じサイズの１個のバンドが存在し、このことは、これ
ら酵素がＤＮＡを完全には消化しなかったことを示して
いる。ＥｃｏＲＩ消化物中の第２のそして最も強くハイ
ブリダイズするバンドは７．４ｋｂｐ断片を示す、この
バンドは、より低強度ではあるが、ＥｃｏＲＩと第二の
酵素との消化物中にも存在し、やはり不完全消化を示し
ている。
さらに、ＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ二重消化物及び
ＥｃｏＲＩ　／）１ｉｎｄＩ［［／Ｘｂａｌ三重消化物
は３．６　ｋｂｐのハイブリダイズする断片を与える。
酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉによる二重消化物中に４
．１　ｋｂｐのハイブリダイズする断片が検出される。
この断片はまた、非常に低強度ではあるが、酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　、　Ｈｉｎｄｌ［［及びＸｂａ　１による三重消
化物中にも存在する。後者の場合、４、　ｔ　ｋｂｐ断
片は部分的開裂生成物であると考えられる。
組合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１９５及
びＨＲ６１９６とハイブリダイズする７、　４　ｋｂｐ
　ＥｃｏＲＩ断片は酵素Ｘｂａ　Ｉ　、　ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ又はＢａｍＨＩのいずれか１つによっても開裂され得
ること、及びこれらの酵素の開裂部位の位置が第１図に
示される通りでなければならないことが結論される。こ
の図は部分的制限地図を与えているに過ぎず、例えば７
．４ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片は酵素Ｂｉｎｄｌ［［、Ｘ
ｈａｌ及びＢａｍＨＩのいずれか１つについて１個より
多くの開裂部位をなお含有するかも知れず、この場合組
合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１９５及び
ＨＲ６１９６とハイブリダイズする特定の配列に最も近
い部位のみが示される。
ファージλＤについてはＸｂａ　Ｉ又はＨｉｎｄＩ！［
消化は行われないが、ファージλＥにおけるのと同様に
Ｘｂａ　Ｉ及びＨｉｎｄＩ［Ｉ制限部位が位置すると予
想される。
ＰＣＩ遺伝子配列を担持している９個の陽性クローンか
ら４個のファージＰＧＩ−λ４．−λ５゜λ６及び−λ
７を選んでさらに解析する。まず、これらのファージが
Ａ、ニガーのゲノムの同じ領域に由来する挿入部を含有
することを確立し、そして次にファージＤ及びＥを含む
ＰＧＩ［遺伝子配列について上に記載したようにしてλ
５の部分的制限地図を作成する。ＤＮＡを酵素の供給者
により推奨されるようにして制限酵素（酵素については
第４表を参照のこと）により消化する。前記のようにし
て、断片をアガロースゲル上で分離しそしてニトロセル
ロース上にプロットする０次に、膜を乾熱し、次に、Ｐ
Ｇｎをコードする構造遺伝子のあらかじめニック−トラ
ンスレーシランした１、２ｋｂ　ＢａｍＨＩ　／Ｂｃｏ
ＲＩ断片とハイブリダイスセシメる。この断片は、実施
例３．８．に記載したプラスミドｐＧ１１１８０３に由
来する。この断片をアガロースゲルのスライスから単離
し、そして５０ｎｇのこの断片をＭａｎｉａｔｉｓら（
参考文献す、　１０９〜１１２頁）により記載されてい
るようにしてニックトランスレーションする。これをハ
イブリダイゼーシッン混合物に添加する前に、このニッ
クトランスレーションされたＤＮＡを沸騰水浴中で１０
分間変性させる。
ニトロセルロースフィルターを実施例３．８．に記載し
たようにして放射性プローブとハイブリダイズさせるが
、但しプレハイプリダイゼーシッン及びハイブリダイゼ
ーシヨンの温度は６０℃とする０次に、膜を６０℃にお
いて一連のあらかじめ加温した緩衝液を用いて洗浄する
。まず膜を６ＸＳＳＣ中ですすぎ、そしてハイブリダイ
ゼーシッン緩衝液中で０．５時間２回洗浄する０次にフ
ィルターを４×ＳＳＣ及び２ＸＳＳＣ中で次々と各緩衝
液につき３０分間ずつ洗浄する。これらの緩衝液は０．
１％ＳＤＳ及び０．１％ＮａａＰｔＯ？・１０８ｚＯの
両方を含有する。最終洗浄の後、膜をｏ、　ｉ　ｘｓｓ
ｃ中で短時間すすぎ、そしてこれらを乾燥させ、そして
次にＸ−線フィルムに暴露する。
使用したプローブはＰＧ■プロモーター領域（２００ｂ
ｐ）の小部分及びコード配列の大部分を代表する。
記載したハイプリダイゼーシツン条件下で、このプロー
ブは、ＰＣＩ遺伝子配列を含有する上に単離されたすべ
てのファージ（実施例３．４．を参照のこと）と共に強
いシグナルを与える。
写真及びオートラジオダラムから、既知マーカーバンド
との比較により断片の長さを計算する。
第４表にハイブリダイズする断片とそれらのおよそのサ
イズを挙げる。
フ ァ ン ＢａｍＨＩ ＥｃｏＲＩ 以遠Ｒ１／Ｂａ５ＨＩ Ｘｈｏ　１ 遠駈Ｉ／は遼Ｒ１ ８，６ ６，４ ６，４ ≧２３ ２．０ ８．６ ６．４ ６．４ ≧２３ ２．０ ≧２３ ６．４ ６．４ ≧２３ Ｏ ８，６ ６，４ ６，４ ≧２３ ２．０ すべてのファージが６．４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片及び
２、　ＯｋｂｐのＸｈｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片を含
有し、他方ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨに重消化も６．４
　ｋｂｐ断片をもたらすことが第３表から明らかである
。ファージλ４゜λ５及びλ７はまた、ＢａｍＨＩ　（
８，６ｋｂｐ）及びＢａ＋ｍＨｌ　／　Ｂｇｌ　Ｉｆ　
（７，５ｋｂｐ）で消化された時、同じ断片を有する。
このベクターは、アスペルギルスＤＮＡの断片を挿入す
るのに使用されたＢａＩＩＨ１部位以外にＢａｗｌ　Ｉ
を含有しない（Ｆｒｉｓｈａｕｆら、参考文献９）。従
って、これら３個のファージの挿入部はＡ、ニガーのゲ
ノムの同じ領域に由来すると考えられる。
部分的制限地図を作成するため、λ５ファージＤＮＡを
さらにＫｐｎｌ　、５ｓａｌ　、５ｓｔｌ及びＳａｌ　
１　％並びにこれらの酵素とＢａｗｌ　Ｉとの組合わせ
により消化する。さらにＢａ１Ｕ／ＸｈｏＩ消化物を分
析する。
５ＩＩａ　Ｉの場合（３０℃）を除きこれらすべてのイ
ンキュベーションを３７℃にて３時間、１ｇのファージ
ＤＮＡを含有する２０ｄの容量中で行う。６０°Ｃにて
ＰＧＩ［プローブとハイブリダイズする断片を第５表に
挙げる。
Ｂａ蒙ＨＩ シ１■ 拘副Ｉ ＥｃｏＲＩ ｅａ　Ｉ ｓｔＩ ａｉｌ 影ｔ＋ｍＨＩ　／シＬＬＩＩ シｕｓＨＩ　／遠遼■ シσ■／珈■ シｖＨＩ　／七通■ シｉｍＨＩ　／影１１ ８．６ ９．７ ５．１；２．７ ６．４ ４．７ ９．９ ８．９ ７．５ ４．２ ３．０ ４．８ｉ２．８ ８．３ ハイブリダイズする断片からＰＣＩ−λ５の制限地図を
デザインすることができ、その制限地図から、ポリガラ
クチュロナーゼＩをコードする遺伝子が８．６　ｋｂｐ
　Ｂａｓ＋ＨＩ断片上に位置すると結論することができ
る。
亥１Ｊ１［互　ＧＷ１８００　　びＧＷ１８０３のファ
ージλＤ及びλＥの有意義なＥｃｏＲ１−Ｘｂａ　Ｉ制
限断片をｐＨＭＢＬベクター（Ｄｅｎ　ｔｅ及びＣｏｒ
ｔｅｓｅ、参考文献１０）に挿入して、それぞれプラス
ミドｐＧＷ１８０３及びｐＧｓ１１８００を得る。
第１図及び実施例３．５．から、ファージλＤは、ファ
ージλＥの４．１　ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ
断片の一部分と同じ２．５　ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｘ
ｂａ　Ｉ断片を有するに相違ないことが推定される。６
ＲのλＤ　ＤＮＡを６０ＵのＸｂａ　Ｉを用いて２時間
２００Ｉの容量中で、ＢＲＬにより推奨される緩衝液＋
ＲＮアーゼＡ（１，５■／Ｍ１）中で消化する。次に、
ＮａＣｉ濃度を１４０ｍＭに調整し、濃反応緩衝液を添
加して体積の増加を補償し、６０ＵのＥｃｏＲＩを加え
、そして２３０ハの容量にて２．５時間インキュベーシ
ョンを続ける０次に、反応混合物を１００ｉｔ１のクロ
ロホルムで抽出し、そして０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，２）及び２容量のエタノールの添
加により水相からＤＮＡを沈澱せしめる。４℃にて１６
時間のインキュベーシヨンの後、遠心分離によりＤＮＡ
を回収し、ベレットを空気乾燥し、そして次にサンプル
緩衝液に溶解する。エチジウムプロミドを含有する０、
５ＸＴＢＢ緩衝液中０．６％低融点アガロース（ＢＲＬ
）ゲル上で制限断片を分離する。ＤＮＡ断片をＵＶ光の
もとて可視化し、そして２．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　−
Ｘｂａ　Ｉ断片を含有するゲル片を単離する。
前記と実質的に同様にして、ファージλＥ　ＤＮＡを制
限酵素Ｘｂａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩと共にインキエベート
する。クロロホルムによる抽出の後、ＤＮＡを沈澱せし
め、遠心分離によりペレット化し、サンプル緩衝液に溶
解し、そしてＩＸＴＢＥ緩衝液中０．６％アガロースゲ
ル上での電気泳動にがける。
４、１　ｋｂｐのＸｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片を含有
するゲル片を回収し、そして−２０″Ｃにて貯蔵する。
シラン処理した（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ）ガラス綿の栓を
、６０ａｄの高ＴＥ緩衝液（１００ｓＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！　（ｐｌ［、０）、　１０５Ｍ　ＥＤＴＡ）を含
む０．５　ｊｌｆのマイクロ−遠心試験管に付す、ゲル
片を解凍し、前記試験管に入れ、そして試験管を液体窒
素中で凍結する。前記小さい試験管の底に小孔を空け、
そして１．５　ｍのマイクロ−遠心試験管に入れ、そし
てゲル片からのＤＮＡ及び緩衝液を遠心分離により集め
る。ゲル片の残りを５０ｄの高ＴＥ緩衝液に再懸濁し、
この懸濁液を液体窒素中で再度凍結し、そして遠心分離
により緩衝液を集める０次に、これらの溶出液を一緒に
し、そして１００Ｉのクロロホルムで抽出する。ＤＮＡ
を水相から沈澱せしめ、遠心分離により集め、そして４
０ｄのＴＥ緩衝液に溶解する。Ｈｉｎｄｎ［により消化
したλＤＮＡ　（ＢＲＬ）を参照として用いて、ＤＮＡ
濃度をアガロースゲル電気泳動により予想し、そしてＵ
Ｖ光のもとでのバンドの可視化を行う。
供給者（ＢＲＬ）により推奨される条件下でＸｂａ　Ｉ
及びＥｃｏＲＩにより逐次消化することによりｐＥＭＢ
Ｌ１８及びｐＥＭＢＬ１９を調製する。フェノール、フ
ェノール／クロロホルム（１：　１）及びクロロホルム
によるＤＮＡの抽出、並びにエタノールによるＤＮＡの
沈澱をＭａｎｉａｔｉｓ　（参考文献６）に記載されて
いるようにして行うが、クロロホルム溶液からイソアミ
ルアルコールを省略し、そしてＤＮＡの沈澱に用いる温
度は４℃とする。
ＢＲＬにより推奨される緩衝液＋ＡＴＰ（１ｍＭ）、１
．５ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）　、前記のよ
うにして記載した１００ｎＨのベクターＤＮＡ、及び前
記の有意義な制限断片を含有する２５ハの反応容量中で
ＤＮＡ断片を対応するベクターに連結する。Ｘｂａｌと
ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＥＭＢＬ１８及び当量の
λＥの精製された４、　１　ｋｂｐのＸｂａ　Ｉ　−Ｅ
ｃｏＲＩを用いてｐＧＷ１８００を作製する。
反応混合物を１６℃にて１６時間インキュベートし、そ
して次に１２５１１１の蒸留水を添加して凍結すること
により反応を停止する。ＸｂａｌとＥｅｏＲＩにより消
化されたｐＥＭＢＬ１９をｐｃ簑１８０３の作製に用い
る。
この場合、λＤの２．５１ｃｂｐのＸｂａ　Ｉ　−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を含有するアガロース片を６０℃にて溶融し
、そして約１５ｎｇのＤＮＡを含有する４ｄをｌｉｄの
蒸留水に添加し、次に反応混合物の他の成分を加える。
　２０°Ｃにて１４時間連結反応を進行せしめ、そして
さらに１ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加える０反
応をさらに７時間続け、そして次に前記のようにして反
応を停止せしめる。
ＢＲＬ　Ｍ１３クローニング／ジデオキシ・シーケンシ
ング・マニュアル（参考文献１１．３０〜３３頁）に記
載されているようにして、５０〆の前記連結反応混合物
を用いて大腸菌を形質転換する。但し、フラスコを氷上
に置く前に大腸菌ＤＨ５αＦ′及び大腸菌ＪＭ１０９を
それぞれ０．７及び０．９のｏｏｓｓｏ値に増殖せしめ
る。前記の菌株はλＤの断片を含む連結反応混合物によ
り形質転換され、そして後者の菌株はλＥの断片を含む
連結反応混合物を用いて形質転換される。ヒートショッ
クの後、細胞を氷上で２分間インキエベートし、そして
次にｌｌ１１のＬＢ培地を添加し、そして細胞を３７℃
にて１時間インキュベートする。細胞を低速遠心分離に
よりペレット化し、ｌｉｄの上清を除去し、そして細胞
を穏やかに再懸濁する。次に、１００に／ｉｄのアンピ
シリンを含有するＬＢ寒天プレート上に細胞をプレート
し、この上にＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌ溶液（２００ｄのＨ
＊０．２％のＸ−ｇａｌを含有するジメチルホルムアミ
ド３０ｉ！１および水中２４１ｇ／＋ｄ（７）ＩＰＴＧ
溶液２０ｄ）を拡げる。プレートを３７℃にて一夜イン
キユベートする。
数個の単一白色コロニーを用いて、０．１％グルコース
及びＴ５ｐｘ／ｄｌアンピシリンを補充したＬＢ培地中
で一夜培養物を調製する。　ｎｏｉｓｅｓ及びＱｕｉｇ
ｌｅｙ（参考文献１２）のミニプレツブ（ｗｉｎｉｐｒ
ｅｐ）法を用いて、これらの培養物からプラスミドを単
離する。供給者（ＢＲＬ）の推奨に従って且っＲＮａｒ
ｅａ（０，５ｍ／＋ｄ）の存在下で、プラスミドを幾つ
かの制限酵素により消化し、そして生成物をアガロース
ゲル上で分析する。予想されるサイズのＸｂａ　Ｉ　−
ＥｃｏＲＩ断片、ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ断片及びＨ
ｉｎｄＩ［［断片を生ずるプラスミドを選択し、そして
それらを担持する大腸菌細胞を一２０℃にてグリセロー
ル上に保持する。
２個の新規なプラスミドが作製される。ｐＧＷ１８００
はベクターｐＥＭＢＬ１ＢにファージλＥの４．１　ｋ
ｂｐＸｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片が挿入されたもので
あり、ｐｌＪ１８０３はベクターｐＥＭＢＬ１９にファ
ージλＤの２．５　ｋｂｐ　Ｘｂａ　Ｉ　−ＢｃｏＲ１
断片が挿入されたものである。
亥ｍ叛　Ｇ賀１８００　　びＧＷ１８０３のｐ（Ｊ１８
００とｐｌＪ１８０３との間の関係が延長された制限分
析により確認される。組合わされたオリゴヌクレオチド
ＨＲ６１９５及びＨＲ６１９６とハイブリダイズする特
定の配列がｐＧＷ１８０３の特定の領域に帰属される。
プラスミドｐＧＷ１８００から得られる制限断片とＡ、
ニガーＮ４００　ＯＮＡから得られる制限断片との比較
により、クローニングの人工物、例えばＡ。
ニガー由来ＤＮＡ断片の欠失又は連結、が存在しないこ
とが確立される。
ｐＧＷ１８００及びｐＧＷ１８０３をそれぞれ大腸菌、
７Ｍ１０９株及びＤＨ５αＦ′株中で増加させ、そして
Ｍａｎｉａｔｉｓら（参考文献６．９０〜９１頁）に記
載されているようにして０．１％グルコース及び１００
〜／戚アンピシリンを補充されたＬＢ培地中での一夜培
養物２５０１ｄからプラスミドを回収し、そして最後に
ＴＥ緩衝液に再懸濁する。　　ｐＧＷ１８００はまたＡ
、ニガーを形質転換するためにも使用されるので、それ
を塩化セシウム勾配でのバンド形成により精製する。Ｔ
Ｅ中ＤＮＡ溶液２．５ｄに３．３ｇのＣｓＣｊ！及びｌ
ｌ１１のエチジウムプロミド（１０■／１ｄ水）を加え
る。ベックマンＶＴｉ　６５．２０一ター中２０℃ニテ
１６時間、４５．０ＯＯｒｐ−にて遠心分離を行う、Ｕ
Ｖ光のもとで見える２本の蛍光バンドの内、共有結合に
より閉じられた環状プラスミドＤＮＡを含有する低い方
のバンドを、チューブの横に孔を空けることにより回収
する。ＤＮＡ溶液（約１ｌＩＮ）を水飽和ブタノールに
より５回抽出することによりエチジウムプロミドを除去
する０次に、体積を水で１５Ｍ１に調整し、そしてＤＮ
Ａを３０Ｍ１のエタノールの添加により沈澱せしめる。
ＤＮＡを遠心分離により集め、そして次にペレットを７
５％エタノールでで１回洗浄し、そして次にそれをＴＥ
緩衝液に溶解しそして一２０℃にて貯蔵する。　ｐＧＷ
１８０３はＣｓＣ１勾配から単離されないが、しかしこ
れをより速い方法にかける。ＲＮアーゼＡを４ｄのＤＮ
Ａ溶液に１００■／ｄの濃度に加え、そしてこの混合物
を３７°Ｃにて１時間インキュベートし、そして次に等
量のフェノール、フェノール／クロロホルム（１：ｌ）
及びクロロホルムにより抽出する。次に、０．４ｄの３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び８１ｄのエタノー
ルの添加によりＤＮＡを水相から沈澱せしめる。ＤＮＡ
を遠心分離により集め、生ずるペレットを７５％エタノ
ールにより洗浄し、空気乾燥し、そして次にＴＥ緩衝液
中に溶解する。
植物ＲＮＡを単離するのに使用された方法（Ｓｌａｔｅ
ｒ、参考文献２１）をわずかに改変した方法によりＡ、
ニガーＤＮＡを単離する。菌糸を塩水で洗浄し、液体窒
素中で凍結し、そして２．５ｇを小型膜破砕機（Ｂｒａ
ｕｎ）により破砕する。菌糸粉末を新たに調製した抽出
緩衝液により抽出する。抽出後緩衝液は次のようにして
調製する。５ｄのトリーイソプロピルナフタレンスルホ
ン酸（ＴＮ３２０■／ｄ）を５ｄのｐ−アミノサリチル
酸（ＰＡＳ）（１２０■／ｄ）及び２．５ａｅの５ＸＲ
ＮＢ緩衝液（５×ＲＮＢは１！中に１２１．１　ｇのＴ
ｒｘｓ＋　７３−０４　ｇのＮａＣ４２及び９５．１の
ＥＧＴＡを含有する；ｐＨ８，５）と混合する。
７、５　ｄのフェノールを添加した後、抽出緩衝液を５
５°Ｃにて１０分間平衡化する０次に、温緩衝液を菌糸
粉末に加え、そして懸濁液を２分間混合する。
次に、５ｄのクロロホルムを加え、そして２分間混合す
る。遠心分離（１０分間、１０．０００Ｘ　ｇ　）によ
り相を分離し、そして水相を１０ｄのフェノール／クロ
ロホルム（１：１）によりもう−度、そして次にクロロ
ホルムにより２回抽出する。
水相はＲＮＡ及びＤＮＡの両者を含有する。
ＤＮＡを２容量のエタノールにより室温にて沈澱せしめ
、そして遠心骨Ｍ（１０分間、１０，０ＯＯＸ　ｇ　）
により集め、そして無菌蒸留水中での再溶液及びエタノ
ールによる沈澱を行うことにより２回洗浄する。最終溶
液にＲＮアーゼＡ　（２０ｘ／ａｔ）を添加することに
よりＲＮＡを除去する。
ｐＧＷ１８００及びｐＧＷ１８０３の物理的地図を作製
するため、約ＩＲのプラスミドＤＮＡ、１■／ｄ濃度の
ＲＮアーゼＡ　（ｐｌＪ１８０３の場合のみ）、ＢＲＬ
により推奨される緩衝液及び１０ユニツトの制限酵素を
含有する幾つかの反応混合物を調製する。この場合、個
々の反応混合物のために異るＤＮＡを選択する。幾つか
の場合、２種類の異る酵素の組合わせを用い、あるいは
プラスミドＤＮＡをある一種類の酵素又は複数の酵素の
組合わせにより消化し、次に酢酸ナトリウム及びエタノ
ールの存在下でＤＮＡを沈澱せしめ、続いて遠心分離に
よりＤＮＡを再度集め、次にこの材料を第二又は第三の
制限酵素の基質として使用する０反応混合物を３７°Ｃ
にて１時間インキエベートし、次に５倍濃度のサンプル
緩衝液の添加により反応を停止し、そして次に反応生成
物をＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲル上で分析する。
特定の断片の計算されたサイプから、ユニークＸｂａ　
１部位に便宜上選択された参照点に対する個々の制限酵
素部位を推定する。ｐＧＷ１８００の制限地図を第２図
に示す。ｐ（Ｊ１８０３のＡ、ニガー由来ＤＮＡの制限
地図（示してない）は、ｐＧＷ１８００の１位のＸｂａ
　１部位から２０００位の旧ｎｃＩ［部位までの地図と
同一である。しかしながら、ｐｃｗｉａｏａはｐＧＷ１
８００中の２４００位に存在するＢｇＩＩ［部位を含有
しない。ｐＧｍ１８００の０．４ｋｂｐのＨｉｎｃ　ｍ
　−Ｂｇｌ　Ｉ［断片は、Ａ、ニガー由来挿入ＤＮＡの
末端に位置するｐＧＷ１８０３の旧ｎｃ　ＩＩ　−Ｅｃ
ｏＲＩ断片と同じ電気泳動移動度を示した。　　ｐＧ１
１１８０３のＡ、ニガー由来ＤＮＡは、１位のＸｂａ　
Ｉと２４００位に非常に近いがこれを含まない位置との
間において、ｐｌＪ１８００のＡ、ニガー由来ＤＮＡと
同一であると結論される。従って、ファージλＤのＥｃ
ｏＲｌ　−Ｘｂａ　Ｉ断片の予想されるサイズ２．５ｋ
ｂｐ（実施例３．６）はわずかに大きすぎる予想を示す
。
組合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１９５及
びＨＲ６１９６とハイブリダイズする特定の配列の位置
を決定するため、ｐＧＷ１８０３のＤＮＡを制限酵素処
理し、そして生ずる断片を前記のようにして分離する。
次に、ＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、そして前記
のようにして組合わされ標識されたオリゴヌクレオチド
混合物ＨＲ６１９５及びＨＲ６１９６とハイブリダイズ
せしめる。組合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ
６１９５及びＨＲ６１９６とハイブリダイズする断片は
、Ｈｉｎａｌｌ消化物中の０．６４ｋｂｐのＨｉｎｃｌ
Ｉ断片及びＮｃｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲに重消化物中の０
．６２ｋｂｐのＮｅｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片中に存在
する。組合わされたオリゴヌクレオチド混合物ＨＲ６１
９５及びＨＲ６１９６とハイブリダイズする特定の配列
はｐＧＷ１８０３の制限地図の１７５０位のＮｃｏ　１
部位と２０００位のＨｉｎｃ　Ｕ部位との間に位置する
と結論され、この座標はｐＧＷ１８００制限地図の同じ
配列に対応する。
ｐｃｗｉｓｏｏからの制限断片をＡ、ニガーＮ　４００
のＤＮＡから得られる制限断片と比較することにより、
クローニングの人工物が存在しないことが確立される。
　　ｐＧＷ１８００の消化物を前記のようにして調製す
る。Ｎ４００株の染色体ＤＮＡの消化物を、２ＩＩＩｌ
のＤＮＡ、０．５■／ｄのＲＮアーゼＡ、ＢＲＬにより
供給される反応緩衝液（Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｘｂａ　Ｉ　
。
ＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩ［のためにはＲＥａｃｔｌｌ衝
液２；にｐｎＩのためにはＲＥａｃｔ緩衝液４；そして
ＥｃｏＲ１及びＳａｌ　ＩのためにはＲＥａｃｔ緩衝液
３）及び８０ユニツトの各制限酵素から成る２００４の
反応容量において３７℃にて調製する０反応混合物を２
時間インキュベートし、そして次に１００ｄのクロロホ
ルムで抽出する０次に、２０ｄの３Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５，２）及び０．５　ｄのナトリウムの添加
並びにこれに続＜４５分間の氷上放置によりＤＮＡを沈
澱せしめる０次に、ＤＮＡを遠心分離により集めそして
空気乾燥する。ＤＮＡをサンプル緩衝液に溶解し、そし
てこれらのサンプル及びｐＧＷ１８００の消化物並びに
λＤＮＡサイプマーカーをＴＢＥ緩衝液中０．７％アガ
ロースゲル上に付加する。電気泳動の後、生ずるパター
ンを記録し、そしてＡ。
ニガー染色体ＤＮＡの消化物を含むレーン中のＤＮＡを
ニトロセルロース膜に移行せしめる。いずれも前記のよ
うにして行う。膜を乾熱し、そして２つの部分に切断し
、これらを異るプローブとハイブリダイズせしめる。
ハイブリダイゼーションのために用いたプローブは、ｐ
ＧＷ１８００のニックトランスレーションされた１、　
４５ｋｂｐ及び２．０５ｋｂｐのＥｃｏＲＶ　−Ｂｇｌ
　Ｉ［断片である。前記のようにして断片をアガロース
ゲルからあらかじめ単離し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら
（参考文献６．１０９〜１１２頁）により記載されてい
るようにして１１００ｎの断片を別の反応でニックトラ
ンスレーションする。ハイブリダイゼーション混合物に
加える前、ニックトランスレーションされたＤＮＡを沸
騰水浴中で１０分間変性する。
乾熱されたニトロセルロースフィルターを３×ｓｓｃ中
で湿し、そして次に、６　Ｘ５ＳＣ，１０＋＋Ｍ　ＥＤ
ＴＡ。
０．１■ＺＩＩ＆新しく加えられ、剪断されそして変性
されたニシンノ精子ＤＮＡ、０．１％０）　Ｎａ４Ｐｇ
Ｏｔ　・１０Ｈ！Ｏ，０，５％のＳＤＳ及び５×デンハ
ート〔０，１％ＢＳＡ　（ベーリンガーフラクション■
）、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ　４００（ファルマシア、０
．１％ポリビニルピロリドン−１０（シグマ）〕から成
る１００ａｄのあらかじめ加熱（６８℃）されたハイブ
リダイゼーション緩衝液を含む別々の皿に移す。プレパ
イプリダイゼーションを６８°Ｃにて２時間振とぅ水浴
中で行い、そして次にハイブリダイゼーション緩衝液を
新しい緩衝液（７５ｄ）と交換し、これにニックトラン
スレーションされたプローブを加える。
ハイブリダイゼーションを６８℃にて少なくとも１６時
時間待せしめる。次に膜を６８℃にて、いずれも０．１
％ＳＤＳ及び０．１％Ｎａ４Ｐ１０ｙ　’　ｌ０ＬＯを
含有するがしかし減少する量のＳＳＣを含有する一連の
あらかじめ加温された緩衝液を用いて洗浄する。
まず膜を４ＸＳＳＣ中ですすぎ、そして次にそれらを４
ｘｓｓｃ中で２回１０分間洗浄する。次に、フィルター
を４　Ｘ５ＳＣ，２Ｘ５ＳＣ，０，５Ｘ５ＳＣ，０，２
Ｘ５ＳＣ及び０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣ中で、緩衝液当り３０
分間次々と洗浄する。最終洗浄の後、膜を０．　Ｉ　Ｘ
５ＳＣ中で短時間すすぎ、そして次にこれらを乾燥させ
、そして次にＸ−線フィルムに暴露する。
１．４５ｋｂｐのＥｃｏＲＶ　　Ｂｇｌ　ＩＩ断片によ
りプローブされた膜は次のハイブリダイズする断片を含
有する＝Ｘｈｏ　Ｉ消化物中の２．４　ｋｂｐ断片、Ｋ
ｐｎ　Ｉ消化物中の２．８　ｋｂｐ断片及び１．２　ｋ
ｂｐ断片、並びにＢｇｌ　ＩＩ／ＥｃｏＲＶ二重消化物
中の１．３　ｋｂｐ断片。２．０５ｋｂｐのＥｃｏＲＶ
−Ｂｇｌ　ＩＩ断片によりプローブされた膜は次の断片
を含有する：　ＥｃｏＲＩ　／Ｓａｌ　に二重消化物中
の約１１ｋｂｐノ断片、Ｘｈｏ　Ｉ消化物中の２．３　
ｋｂｐ断片及び２．１　ｋｂｐ断片、Ｘｈｏ　Ｉ　／　
Ｘｂａ　に二重消化物中の２．３ｋｂｐ断片及び１．４
　ｋｂｐ断片、Ｋｐｎ　Ｉ消化物中の１．２　ｋｂｐ断
片、並びにＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌ　Ｉ［二重消化物中の２
．０　ｋｂｐ断片。
ハイブリダイズする断片の内の４断片、すなわち使用さ
れたプローブと相同性を有するがしかしその一端がｐＧ
Ｗ１８００中に存在する配列の外側にある断片について
は、その存在及び最小サイズのみがｐＧＷ１８００の制
限地図から推定することができる。
これらの断片は、２．０５ｋｂｐのＥｃｏＲＶ　−Ｂｇ
ｌ　Ｉｆプローブの場合にはＥｃｏＲＩ　／　Ｓａｌ　
Ｉ中の断片、Ｘｈｏ　Ｉ消化物中の２．１　ｋｂｐ断片
及びＫｐｎ　Ｉ消化物中の３．２ｋｂｐ断片であり、そ
して１．４５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩプロ
ーブの場合にはＫｐｎ　Ｉ消化物中の２．８　ｋｂｐ断
片である。これらの断片はいずれも、ｐＧＷ１８００の
制限地図から推定される最小サイズより大である。Ａ。
ニガーのゲノムＤＮＡの異るハイブリダイズする断片を
ｐＧＷ１８００の消化物中に存在する関連づけることが
でき、そしてすべてがｐＧＷ１８００の制限地図から推
定されるサイプに非常に近い計算されたすイズを有する
。　　ｐＧＷ１８００のＡ、ニガー由来ＤＮＡはＡ、ニ
ガーがＮ４００のゲノムの部分の忠実な代表であること
が確認される。
ＰＧｎコード配列とハイブリダイズするファージＰＣＩ
−λ７の８．６　ｋｂｐ　Ｂａａ＋ＨＩ制限断片（実施
例３．６８、第４表を参照のこと）をベクターｐｕｃ　
９（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、
１９８２．　Ｇｅｎｅ　１９＋２５９−２６８）に挿入
して、逆方法の挿入部を有するプラスミドｐＧＷ１９０
０　（第３図を参照のこと）及びｐｌＪ１９０１を得る
。５Ｉ１１のＴＥ緩衝液中、１．５尾のＰＣＩ−λ７　
　ＤＮＡに、スペルミジンの１０ａ＋Ｍストック溶液１
ｉ１１．２０ＵのＢａｍＨＩ、ＢＲＬにより推奨される
反応緩衝液及び無菌蒸留水を加えて最終容量３０バとす
る。消化されたサンプルに４分の１　（ｖ／Ｖ）のロー
ディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）（ロ
ーディング緩衝液＝Ｈ２０中０．２５％ブロモフェノー
ルブルー、０．２５％キシレンシアツール及び１５％Ｆ
ｉｃｏｌｌ）を加える。反応断片をエチジウムプロミド
（ｌｘ／ｌ１１）を含有するＩＸＴＡＥ緩衝液（１！当
り５０　Ｘ　ＴＡＲ緩衝液＝２４２ｇのＴｒｉｓ、５７
．１ｄの酢酸及び１００１ｄの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ、
　ｐＨ８，０）中０．６％アガロースゲル上で分離する
。
ＤＮＡ断片をＵＶ光のもとで可視化し、そして８．６ｋ
ｂｐのＢａｍ１ｌ　Ｉ断片を含有するゲル片を単離する
。ＤＮＡ断片、常法に従って電気泳動的に単離し、溶出
を１００Ｕにて１時間わたって行う、　ＤＮＡを集め、
そして２容量のエタノールで沈澱せしめる。エッペンド
ルフ遠心管中で３０分間遠心した後、沈澱を集め、５ｐ
ｅｅｄｖａｃ中で乾燥せしめ、そして１０ｍのＴＥ緩衝
液に溶解する。ベクターｐＬＩｃ　９（層）を、ｌ０Ｌ
ＪのＢａｍｔｌ　Ｉを用いて３７℃にて１．５時間、２
０ｄの合計反応容量中で推奨されるＢＲＬ緩衝液を用い
て線状化する。次に、ＩＩのＣＩＰ溶液（約２Ｕ）を加
え、そして混合物を３７℃にて３０分間インキュベート
する。線状化されたベクターも電気泳動により調製する
。これを約５０ｎｇ／１１１のＤＮＡ濃度に相当する２
０ｄのＴＥに溶解する。連結反応において、１ｉ！１の
線状化されそしてＣＩＰ処理されたｐｕｃ　９ベクター
（５０ｎｇ）及び４ＩのＢａｍＨＩ断片（約１０１００
ｎを適当なりガーゼ緩衝液中で１．２ＵのＤＮＡリガー
ゼにより連結する０反応を１４℃にて１４時間進行せし
め、そして次にこの混合物をＴＥにより５０ｄに稀釈す
る。
５０ｄの得られる連結反応混合物を用いて、ＢＲＬＭ３
０クローニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考
文献１１．３０〜３３頁）に記載されているようにして
大腸菌を形質転換する。但し、フラスコを氷上に置く前
に大腸菌ＤＨ５ａＦ　’を０．５〜０．７の０Ｄｓｓｏ
値に増殖せしめる。ヒートショックの後、細胞を氷上で
２分間インキエベートしそして次に１１１のＬＢ培地を
加え、そして細胞を３７℃にて１時間インキュベートす
る。細胞を低速遠心分離によりペレット化し、ｌａｄの
上清を除去し、そして細胞を穏やかに再懸濁する０次に
、１００ａ＋ｇ／ｄのアンピシリンを含有するＬＢ寒天
プレートであって、その上にＩＰＴＧ／　Ｔ−ｇａｌ溶
液（２００ｄのＨ，０１３０Ｉｉの２％Ｘ−ｇａｌ含有
ジメチルホルムアミド及び２（ｌｄの水中２４Ｗｇ／ｄ
　ＩＰＴＧ溶液）が拡げられたものの上にプレートする
。このプレートを３７°Ｃにて一夜インキエベートする
。数個の単一白色コロニーを用いｒ、０．１％グルコー
ス及び７５Ｉａｌ／ｄアンピシリンを補充したＬＢ培地
中で一夜培養物を調製する。これらの培養物を用いてＨ
ｏｌｍｅｓ及びＱｕｉｇｌｅＶ（参考文献１２）のミニ
プレツブ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）法によりプラスミドを単
離する。供給者（ＢＲＬ）の推奨に従って且つＲＮアー
ゼＡ（０，５■／−）の存在下で幾つかの制限酵素によ
りプラスミドを消化し、そして生成物をアガロースゲル
上で分析する。予想通りのＢａｗｌ　Ｉ断片を生じさせ
るプラスミドを選択し、そしてこれらを担持する大腸菌
細胞を一２０゛Ｃにてグリセロール上に保持する。逆方
向に挿入部を有するこの新規プラスミド（ｐｌＪ１９０
０（第３図に示す）１及びｐ（、Ｗ１９０１を更なる実
験に用いる。
ｐＧＷ１９００を大腸菌ＤＨ５ａＦ　’中で増加せしめ
、そしてＭａｎｉａｔｉｓら（参考文献６．９０〜９１
頁）により記載されているようにして、０．１％グリコ
ース及び１００ｇ／ｉｄアンピシリンを補充したＬＢ培
地中での２５０１１の一夜培養物からプラスミドＤＮＡ
を回収し、そして最後にＴＥ緩衝液に再懸濁する。
ｐＧＷ１９００はＡ、ニガーを形質転換するためにも使
用されるので、塩化セシウム勾配中でのバンドの形成に
よりこれを精製する。ＴＥ中２．５ｄのＤＮＡ１液に３
．３ｇのＣｓＣ１及びｌＨｌのエチジウムプロミド（水
中１０■／ｄ）を加える。ベックマンＶＴｉ　６５．２
０−ター中で２０℃にて１６時間４５．０００ｒｐａｇ
にて遠心分離を行う、Ｕ■光のもとで見ることができる
２本の蛍光バンドの内、共有結合により閉じられた環状
プラスミドＤＮＡを含有する低い方のバンドを、チュー
ブの溝に孔を空けて回収する。
ＤＮＡ溶液（約１ｍ）を水飽和ブタノールで５回抽出し
てエチジウムプロミドを除去する。次に、体積を水によ
り１５Ｍ１に調整し、そしてＤＮＡを３０−のエタノー
ルの添加により沈澱せしめる。ＤＮＡを遠心分離により
集め、そして次にペレットを７５％エタノールで１回洗
浄し、そしてこれをＴＥ緩衝液に溶解し、−２０℃にて
貯蔵する。
さらに、ｐＧＷ１９００のＫｐｎ　Ｉ消化物から、２．
７　ｋｂｐのＫｐｎｌＤＮ＾断片をアガロースゲルの片
から電気泳動的に単離し、そして９ＨＭＢＬ１Ｂ（Ｄｅ
ｎｔｅ及びＣｏｒｔｅｓｅ。
参考文献１０）に挿入してプラスミドｐＧＷ１９０２　
（第４図を参照のこと）及びｐＧＷ１９０３をそれぞれ
得る。
ｐＧＷ１９００及びｐｃ％１１９０２の物理的地図を作
成するため、約１尾のプラスミドＤＮＡ、　ＢＲＬによ
り推奨される適切な緩衝液、及び１０ユニツトの制限酵
素又は２種類の異る制限酵素の組合せを含有する幾つか
の反応混合物を調製する。反応生成物をＴＡＢ緩衝液中
１％アガロースゲル上で分析する。特定の断片の計算さ
れたサイズから、第３図及び第４図に示す個々の制限酵
素部位をそれぞれ確立する。
Ａ、ニガーＮＷ７５６のゲノムＤＮＡを、プローブとし
てＡ、ニガーＮ４００のｐｇａ　１１遺伝子（すなわち
、ｐＧＷ１８００の１．２　ｋｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｂ
ｇｌ　Ｉｎ断片）を用いてササンプロット分析により分
析する。実施例７．１．に記載されている事項について
２つの変更を行う、この場合、Ａ、−ガーＮ４００　ｐ
ｇａｌｌ遺伝子の構造部分内で切断する制限酵素を選択
し、そしてハイブリダイゼーション条件を一層ストリン
ジェントにする。すなわち、実施例７．２．に記載の「
ホモロガス」条件を用いる。ここで、Ｂａ５ＨＩ消化物
中に３．３ｋｂｐの単一のハイブリダイズする断片が検
出される。これらのハイブリダイゼーション条件下で単
一の配列が検出され、従ってこの配列をＡ、ニガーＮＷ
７５６のｐｇａ　ＩＩ遺伝子と定義する。
３、３　ｋｂｐの単一のハイブリダイズする旧ｎｃＩＩ
断片が観察され、これは構造遺伝子中にＨｉｎｃＩ［部
位が存在しないことを示す。ハイブリダイズするＸｈｏ
　Ｉ　−Ｂｇｌ　ｎ断片は５．５ｋｂｐである。これら
の結果は実施例３．７．に示されるデータ配列表の配列
番号（ＳＥＱ　１０阻）２に示されるＡ、ニガーＮ　４
００のｐｇａ　ＩＩのＤＮＡ配列と一致しない、及び従
って、Ａ、ニガーＮＷ７５６のｐｇａ　ＩＩ遺伝子はＡ
、ニガーＮ４００のｐｇａ　Ｉ［遺伝子と同一ではない
と結論される。
実施例λにおいてＮ４００株について記載した方法にわ
ずかな変更を加えてＡ、ニガーＮｗ７５６のゲノムライ
ブラリーを作製する。アスペルギルスのＤＮＡを消化す
るためにＳａｕ　３Ａ　Ｉがそのイソシツオマ−（ｉｓ
ｏｓｈｉｚｏｓｅｒｌ）　Ｍｂｏ　Ｉの代りに使用され
る。
ＮＷ７５６株のライブラリーはＨ）’１ＢＬ４　（参考
文献９）の密接に関連するλでクローＥＭＢＬ　３にお
いて作製される。すでにＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによ
り消化されそしてホスファターゼにより処理されたＩ！
ＭＢＬ　３ＤＮＡがプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から販
売されている。
実施例３．３．に記載したようにして、得られるライブ
ラリーの部分をプレートしそしてプラークリフトを調製
する。次に、実施例７．２．に記載したホモロガス条件
を用いて、フィルターをｐＧＷ１８０３の１、２　ｋｂ
ｐ　ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲｎ断片とハイブリダイズせ
しめる。陽性ファージを再スクリーニング段階において
精製し、そして次にこれらのファージのＤＮＡを実施例
３．４．に記載されているようにして精製する。酵素Ｂ
ｇｌｎ及びＸｈｏ　Ｉを用いてＤＮＡを制限分析にかけ
る。次に、この断片を含有するＮ性”７ｙ−シ（７）１
ツ（Ｄ５．５ｋｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｂｇｌ■断片を実施例
３．６．に記載したようにして単離する。次にこの断片
を、Ｂａ５ＨＩ及びＳａｌ　Ｉで消化した１）ＥＭＢＬ
１８に連結し、そして得られる連結混合物を用いて大腸
菌ＪＭ１０９　（実施例３．６．　）を形質転換する。
次に、形質転換体を、実施例７．３．において記載した
ようにして「ヘテロロガス」条件下でのコロニーハイブ
リダイゼーシッンにより分析する。陽性クローンのプラ
スミドＤＮＡを精製し、そして次にこれを用いて物理的
地図を作成する（実施例３．７．）。
ｐＧＷ１７５６の制限地図を第６図に示す、　　ｐ（Ｊ
１７５６は、Ａ、ニガーＮＷ７５６　ｐｇａＩＩ遺伝子
を含有する５、５ｋｂｐのＸｈｏ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ
断片をベクターｐＥＭＢＬ１Ｂに挿入したものである。
ｐＧＷ１８００及びｐＧＷ１８０３の適当な制限断片を
用いてアガロースゲル電気泳動から単離し、そしてベク
ターに対して２〜１０倍過剰の断片を用いてＭ１３ｍｐ
１８ＲＦ及びＭ１３＋ｅｐ１９ＲＦベクターに連結する
。
前記のようにして大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行う。
すなわち、ヒートショックの後、ＢＲＬ　Ｍ１３クロー
ニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考例１１．
３４頁）に記載されているようにして細胞を直接プレー
トする。Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら（参考文献４０、セクショ
ン７　、３　、９）により記載されているようにして組
換えファージからの単鎖ＤＮＡ鋳型の単離を行う。上清
と共に細胞を収得し、そして次にこれらの細胞を一２０
°Ｃにてグリセロール培養物として貯蔵する。
次に、こうして得られた、ｐＧＷ１８０３の２．４　ｋ
ｂｐＸｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片をＭ１３ｗｐ１８の
ポリリンカーに挿入して成るクローンの１つを、それぞ
れＨｌ　ｎ　ｄ　Ｉ［［＊Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｂａａ＋Ｈ
Ｉ及びＮｃｏ　１部位からの配列決定データーが得られ
るように操作する。大腸菌ＪＭ１０９及び意味のあるク
ローンからＹＭ培地での別々の一夜培養物を調製し、後
者の場合には前記グリセロール培養物の一部を接種物と
して使用する０次に、２００１ｄの２ＸＹＴ培地に０．
４　ａｄ！のＪＭ１０９培養物を接種し、そして次にこ
の培養物を３７°Ｃにて回転振とう機中で２．５時間イ
ンキュベートする。次に意味のあるクローンの一夜培養
物２０ｙｄを加え、そして回転振とう機中でのインキュ
ベーションを５時間続ける０次にｐＧＷ１８０３につい
て前に記載したようにして複製型ＤＮＡをこれらの細胞
から単離する。次に、このＤＮＡをそれぞれ旧ｎｄＩ［
［。
Ｐｓｔ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　１により消化
する。次に、ＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　Ｉにより消化され
たＤＮＡをＳａｌ　Ｉにより消化し、次にフェノール／
クロロホルム（１：　１）及びクロロホルムにより抽出
し、そして次にエタノール沈澱を行う０次に、非適合付
着末端を５ユニツトのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを用い
てＭａｎｉａｔｉｓら（参考文献６．１１７頁）により
記載されている緩衝液中でそして０．１ｍＭずつのｄＣ
ＴＰ　。
ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下でフィル
−インする。
２５ｄの反応混合物を３７℃にて５分間インキュベート
し、そして次に５１！１００．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ
８，０）を添加し、そしてこの混合物をフェノール抽出
する。
こうして得られた４個のＤＮＡ１ｌ製物中に存在する小
ＤＮＡ断片を０．７％低融点アガロースゲル（ＢＲＬ）
での電気泳動により除去し、そして大断片を含有するゲ
ル片を単離する。次に、これらのＤＮＡ断片をＴ４　Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて環化する。
次に、得られる連結反応混合物を用いて、前記のように
して大腸菌ＪＭ１０９を形質転換する。
Ｂｃｌ　Ｉは基質のメチル化に対して感受性であるので
、このものは大腸菌ＪＭ１０９または大腸菌ＤＨ５αＦ
′から単離されたプラスミドＤＮＡを切断することがで
きない。従って、すでに単離されたｐＧＷ１８００及び
ｐＧＷ１８０３を用いて大腸菌ＪＭＩＩＯ（Ｙａｎｔｓ
ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、参考文献２９）を形質転換し、
そして次に実施例３．８．に記載したようにしてプラス
ミドＤＮＡを単離する。但し、大腸菌ＪＭＩＩＯの増殖
のために用いられるすべての培地には、０．１％のカザ
ミノ酸を加える。大腸菌ＪＭＩＯＩから単離されたプラ
スミドＤＮＡを用いて、Ｂｃｌ　１部位からの配列分析
を可能にするサブクローンを得る。
得られるクローンを、ファルマシカ製のＴ７Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ　（商標）キットにより、供給者により推奨
される条件下で配列決定する。幾つかのケースにおいて
は、こうして得られた配列決定データ−を用いて、Ｃａ
ｒｕ　ｔｈｅｒｓ　（参考文献８）の方法による特異的
オリゴヌクレオチドの合成をプログラムする。これらの
オリゴヌクレオチドは：ＨＲ６４２５５’（ｄ）ＣＡＡ
ＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＣ３’１（Ｒ６４３
９５’（ｄ）ＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＴ
Ｇ３’ＨＲ６４４０５’（ｄ）ＡＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣ
ＴＴＣＴＴＴＣＣＧ３’である。次に、これらのオリゴ
ヌクレオチドを、関連する鋳型のための特異的配列決定
プライマーとして用いる。プライマーＨＲ６４３９はＭ
１３に対して使用された場合２個の二重の配列決定ラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）を提供し、そしてそれ故にこのプラ
イマーは、ファルマシアの指示に従ってアルカリ変性サ
レタｐＧＷ１８００の二本鎖配列決定のために使用され
る。
ｐＧＷ１８００上に位置するＰＧＩ［をコードする遺伝
子（」巳ＩＩ　）の配列を両ＤＮＡ鎖から得る。下流方
向（１位のＸｂａ　Ｉから約３０２８位のＰｖｕ　ＩＦ
の方向へ）の配列決定を、それぞれＸｂａｌ（１位）　
、ＥｃｏＲＶ（およそ３３４位）、旧ｎｄＩ［［（およ
そ５５７位）、Ｐｓｔｌ（およそ８２７位）、Ｂｃｌｌ
（およそ１０５６位）、ＢａｍＨＩ　　（およそ１１５
８位）、旧ｎｃＩＩ（およそ１３４４位及びおよそ１９
７４位）、ＫｐｎＩ（およそ１５６５位及びおよそ２７
０６位）、Ｎｃｏｌ（およそ１７４９位）及びＢｇｌｌ
［（およそ２３７９位）部位から行い、Ｂｇ１１１部位
の領域を配列決定するためにプライマーＨＲ６４２５を
用いる。逆方向の配列決定はＰｖｕＩＩ（およそ３０２
８位及びおよそ１４４２位）、にｐｎｌ（およそ２７０
６位及びおよそ１５６５位）、Ｂｇｌｌｌ（およそ２３
７９位）、１（ｉｎｃＩ［（およそ１９７４位）、Ｂａ
ｍＨＩ（およそ１１５８位）、ＢＣＩＩ（およそ１０５
６位）、Ｐｓｔｌ（およそ８２７位）、ＨｉｎｄＩ［Ｉ
　（およそ５５７位）、及びＥｃｏＲＶ　（およそ３３
４位）部位から行い、Ｈｉｎｃｌｌ　（およそ１９７４
位）及びＫｐｎＩ（およそ１５６５位）を越えて配列決
定するのにプライマーＨＲ６４３９及び１ＩＲ６４４０
をそれぞれ用いる。
■ＩＩの配列を配列表−配列番号（ＳＥＱ　１０１Ｉｋ
Ｌ＞　２に示す、　３０３１ｂｐの配列がｐｌＪ１８０
０の１位のＸｂａ　１の第一ヌクレオチドから始まり、
そしてｐＧＷ１８００の制限地図中のおよそのマツプ位
置３０５０に示されるＰｖｕ　Ｕ部位の最終ヌクレオチ
ドで終る。ｍυ■遺伝子は、プロモーターｗＩ域の１３
５６ヌクレオチド、構造部分の１１３８ヌクレオチド（
５２ヌクレオチドの仮定的イントロンを含む）及び転写
ターミネータ９１域の５３７ヌクレオチドを含んで成る
。
シグナル配列からすぐ下流の配列及びＷｈｏ　Ｉ開裂部
位は、システィンが３位に存在するであろうという予想
（実施例１．３．　）のちとに、ポリガラクチュロナー
ゼ■の５　ｋＤａ断片について得られる配列と完全に一
致する配列をコードしている。
ＤＮＡは２７個のアミノ酸のリーダーペプチドをコード
しており、アルギニンが成熟蛋白質配列の前の最後のア
ミノ酸である。このリーダーペプチドは蛋白質分解的開
裂により除去されなければならない、シグナルペプチド
開裂部位はアルギニン残基のすぐ後に見出されず、そし
て一般に荷電したアミノ酸のすぐ後ではない（ｖｏｎ　
Ｈｅ１ｊｎｅ　；参考文献３９）から、リーダーペプチ
ドは少なくとも２つの蛋白質分解段階で除去される。す
なわち、リーダーペプチドはプレプロ配列を表わす。こ
の場合、シグナルペプチダーゼはプレー配列、又はシグ
ナル−ペプチド、を開裂し、他方、残りのブロー配列は
他のプロテアーゼにより開裂される。
ポリガラクチュロナーゼ■構造遺伝子は１個のイントロ
ンを含有し、１９８７位〜２０３８位のヌクレオチド配
列から成る可能性が最も高い。この配列は、３種類すべ
ての可能なリーディングフレーム中の終止コドンを含む
。このイントロンの存在が、得られた蛋白質配列データ
ー（実施例１を参照のこと）と一致するようにリーディ
ングフレームを変える。イントロンの前のリーディング
フレームはシアノゲンブロミド断片のアミノ酸配列（実
施例１、３．　）により確認され、イントロン後のリー
ディングフレームはトリプシン分解ペプチドＴＰ４のア
ミノ酸配列（実施例１．５．　）により確認され、この
配列はまた２１８３位から２２２５位までのヌクレオチ
ド配列からも推定することができる。イントロンの５′
−スプライス部位ＧＴＡＡＧＣは真菌５′−コンセンサ
ス配列ＧＴＰｕＮＧＴに類似しており、他方３′−スプ
ライス部位ＴＡＧは真菌コンセンサス３′スプライス部
位ＰｙＡＧ　（参考文献４１）と完全に一致する）。
実施例３．９．に記載したようにしてｐＧＷ１９００及
びｐＧＷ１９０２からアガロースゲル電気泳動の後に適
当な制限断片を単離する。これらをＢＲＬ　Ｍ１３クロ
ーニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考文献１
１）に従ってＭ１３■ｐ１８ＲＰ及びＭ１３＋５ｐ１９
ＲＰベクターに連結する。Ｍ１３クローニング／配列決
定系についてのファルマシア・マニュアルに記載されて
いるようにしてコンピテント細胞を調製する。
Ｍｅｓｓｉｎｇら（参考文献３０により記載されている
ようにして大腸菌Ｊｌ’１ｌＯ１の形質転換を行う、常
法（例えば、参考文献１１．２９〜３４頁を参照のこと
）に従って組換えファージからの単鎖ＤＮＡ鋳型の単離
を行う。生ずるクローンの配列決定を、Ｔ７シーケンシ
ング（商標）キット、ファルマシア（ウプサラ、スエー
デン）により、供給者により推奨される条件を用いて行
う。
ｐＧＷ１９００を、およそのマツプ位置７５０のＥｃｏ
Ｒ１部位からおよそ３７９０位の旧ｎｄＩ［［部位の近
くに位置するおよそのマツプ位置３９００のＣ１ａ　１
部位まで配列決定する。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（参考文献
８）の方法を用いて幾つかのオリゴヌクレオチド（３０
４〜３０７）を合成する。これらのヌクレオチドは下記
の配列を有する： ｋ　３０４　５’　（ｄ）ＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＧ
ＴＣＡＡＴＣＣ３’Ｎａ　３０５　５’　（ｄ）ＡＣＣ
ＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣ３’８１１３０６
　５’　（ｄ）ＴＣＴＧＴＡＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＴ
Ｇ　３’階３０７　５’（ｄ）ＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡ
ＣＣＡＣＣＴＡＡＣ３’これらを関連する鋳型のための
特異的配列決定ブライマーとして使用する。
Ｔ７シーケンシングキツトについての供給者の指示に従
って、オリゴヌクレオチド３０７を用いて、アルカリ変
性したｐＧＷ１９００の二本鎖配列決定を行う。ｍｌ遺
伝子の完全な配列は配列表−配列番号（ＳＥＱ　１０　
ｋ”）　１に示される。この配列は両鎖について得られ
た配列決定データーに暴く。
２、４９５ｂｐの」通Ｉ配列はｐＧＷ１９００のおよそ
のマツプ位置６２８０のＥｃｏＲ１部位の第一ヌクレオ
チドから始まり、そして３８８０位に示されるＨｉｎｄ
　ｍ部位に近いＣｌａｌ部位の最後のヌクレオチドの後
にヌクレオチドで終る０里Ｉ配列は、プロモーター領域
の９０９ヌクレオチド、５２ｂｐ　（イントロンＡ）及
び６２ｂｐ　（イントロンＢ）の２個の仮定的イントロ
ンを含む構造部分の１２１８ヌクレオチド、並びに転写
ターミネータ−領域の３６６ヌクレオチドを含んで成る
。
成熟ポリガラクチュロナーゼ■（実施例１．４．を参照
のこと）及び２１ｋＤａシアノゲンブロミド断片（実施
例１．５．　）について得られるアミノ酸配列は、ヌク
レオチド配列から誘導することができ且つ１００３位か
ら始まるアミノ酸配列と完全に一致する。
従って、ＤＮＡ配列は３１個のアミノ酸のリーダーペプ
チドをコードし、リジンは成熟蛋白質が始まる前の最終
のアミノ酸である。リーダーペプチドがアルギニン残基
で終るＰＧｎの場合とＩＩ（Ｈの理由により、このＰＣ
Ｉリーダーペプチドは、やはり少なくとも２段階の蛋白
質分解段階において除去されるブレブロー配列を表わす
、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズする配列はヌクレオチド配列の１２７７位か
ら始まる。
実施例１．に記載した５、５ｋＤａシアノゲンブロミド
ベブチド断片について決定したＮ−末端アミノ酸配列ヌ
クレオチド配列にＴＥ＜仮定のアミノ酸配列との間に完
全な一致が存在する。
ポリガラクチェロナーゼＩ構造遺伝子は２個のイントロ
ンを含有する。イントロンＡは１１３８位〜１１８９位
のヌクレオチド配列から成る。５′−スプライス部位Ｇ
ＴＡＴＧＴは真菌５′−スプライス・コンセンサス配列
ＧＴＰｕＮＧＴ　（参考文献４１）と一致し、そしてラ
リアト（ｒａｒｉａｔ）配列ＧＣＴＡＡＣ及び３′−ス
プライス部位ＴＡＧも既知のコンセンサス配列ＰｕＣＴ
ＰｕＡＣ及びｐｙａｃと一致する。このイントロンの存
在が、より遠くに存在する５、５ｋＤａのシアノゲンブ
ロミド断片について得られる蛋白質配列データー（実施
例１．を参照のこと）と一致するようにリーディングフ
レームを変える。第二イントロン（Ｂ）はヌクレオチド
配列１６１０位〜１６７１位から成る。ラリアト配列及
び３′−スプライス部位の両者が既知のコンセンサス配
列と一致する。５′スプライス部位ＧＣＡＣＧＡはコン
センサス配列ＧＴＰｕＮＧＴと一致しないが、しかし５
′−スプライス部位のＧＣ及び５′−スプライス部位に
対して＋６位のＡは他の幾つかの遺伝子において見出さ
れている（参考文献４１及び４３を参照のこと）。
イントロンＢの存在は次の主張に苓＜：ａ）これがリー
ディングフレームを変え、他の２つのリーディングフレ
ーム中には早すぎる終止コドンが存在する。
ｂ　）　ｆｆｌ　ＩＦのイントロンが同じ位置に存在し
、そしてこのイントロンに先行するアミノ酸配列Ａｓｎ
−５ｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕは両蛋白質において同じであ
る。
この仮定のイントロンのすぐ後のヌクレオチド配列から
推定されるアミノ酸配列間に強い相同性の領域が見出さ
れる。
ＰＧ　　Ｉ　　　　５ｅｒ−Ｌｉ１ｙ−Ｌｉ１ｙ−１１
ｉｓ−１ｉ１ｙ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−１１ｅ−１ｉ１ｙｆ
ｆｉ　　Ａ、ニガーＮ４００のポリガラクチＡ、ニガー
から単離されるポリガラクチュロナーゼＰＣＩ及びＰＧ
ＩＩは、実施例１．２．に記載したように、同じ反応を
触媒しそして免疫学的に相互に関連する。
これらの酵素をコードする遺伝子もまた密接に関連する
。なぜなら、実施例７．２．に記載するように、ｍＩ■
遺伝子によりＡ、ニガーＮ４００ゲノムライブラリーか
ら他のポリガラクチュロナーゼ遺伝子が単離されるから
である。長さが２残基異るこれらの成熟酵素の仮定のＰ
ＣＩ及びＰＧｎアミノ酸配列配列較は高度な相同性を示
す。これらのデーターは、ＰＧｌ［をコードする遺伝子
が密接に関連しており、そしてポリガラクチュロナーゼ
遺伝子ファミリーの構成員を代表することを、明瞭に示
している。
ｐｌＪ６１３　（Ｇｏｏｓｅｎら、参考文献１３）の−
層短い変形体でありそしてやはりツエ／Ｉ遺伝子を含有
するプラスミドｐＧＷ６３５、及びポリガラクチュロナ
ーゼ■遺伝子を含有するプラスミドｐＧＷ１８００をそ
れぞれ大腸菌Ｍｌ（１及びＪＭ１０９において増加せし
める。プラスミドｐＧＷ１９００は大腸菌ＤＨ５αＦ′
において増加せしめる。　Ｍａｎｉａｔｉｓら（参考文
献６．９０〜９１頁）及び実施例３．７．に記載されて
いるようにして２５０ｄ−夜培養物からプラスミドＤＮ
Ａを回収する。
親株Ｎ４００の誘導体であるＡ、ニガーＮ５９３株（ｃ
ｓｐ＾＋　ｐｙｒＡ）は、Ｇｏｏｓｅｎら（参考文献１
３）により記載されているようにして、プリンの存在下
で酵母における場合（Ｂｏｅｋｅら、参考文献１４）と
同様にして毒性類似体５−フルオロ−オロチン酸に対す
る陽性選択により得られた。
０．５％酵母エキス、０．２％カザミノ酸、１０ｓ＋Ｍ
ウリジン（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ）及び５０ｍ
Ｍグルコースが補充された液体最少培地にＡ、ニガーＮ
５９３の分生胞子１０ｈ個／ｄを接種し、そして３０℃
にて２０時間、二ニー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ　Ｂ
ｒｕｎｓｗｉｃｋ）回転振とう機においてインキエベー
トする。菌糸をミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通
して濾過により収得し、そして１．３３Ｍソルビトール
、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７、５）　、５０
ｍＭ　ＣａＣｆ　ｔの組成を有する等張最少培地（ＳＴ
Ｃ）により洗浄する。１ｇの菌糸を２０−のＳＴＣに再
懸濁する。１５０ｄのフィルター除菌したノボチーム（
Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）　２３４　（ノボ・インダストリー
ズ、デンマーク）を添加し、そしてこの混合物を９５ｒ
ｐ−の振とう機で３０℃にてインキエベートすることに
より２時間以内に菌糸からプロトプラストを放出せしめ
る。ガラス綿の栓をした漏斗を用いて濾過することによ
り残留菌子からプロトプラストを分離する０次に、冷Ｓ
ＴＣを４０Ｈ１の容量まで加え、そして混合物を１０分
間氷上に置く、プロトプラストを遠心分離（２，５０Ｏ
ｒｐｍ、１ｏ分間）により回収し、そしてベレットを５
−のＳＴＣに再懸濁する。プロトプラストをもう一度ペ
レット化し、そして最後に１ｄの冷ＳＴＣに再懸濁する
。
形質転換のため、５Ｘ１０”個のプロトプラストを２０
０ｊｔｌとし、次ニコれを１　ｔｄ　（７）ｐ（Ｊ６３
５及び２０ｘのｐｌＪ１８００又はｐＧＷ１９００と共
にインキュベートする。プロトプラストにプラスミドＤ
ＮＡを添加した後、５０ＩｉのＰ　ＣＴ　（１０ｍＭ　
Ｔｒｉａ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、５０ｓ＋Ｍ　Ｃ
ａＣｆ　ｔ　、　２５％ＰＥＧ６０００）を加え、そし
てインキュベーシッン混合物を氷上に２０分間置く。次
に、他の２ｄのＰＣＴを加え、そして混合物を室温にて
さらに５分間インキエベートする。最後に、４ＩｄのＳ
ＴＣを加え、そして混合する。この最終形質転換溶液の
１１ｄのアリコートを、０．９５Ｍシェークロースで安
定化された液化した等張ＭＭ上層寒天４ｄと混合する。
このプロトプラスト混合物を、同し等張最少培地を含有
する寒天プレート上にプレートし、そしてこれらを３０
℃にてインキュベートする。適切な対照実験には、プラ
スミドＤＮＡを用いないで及び２．５ｍＭウリジンを含
む非−安定化最少培地上で同様に処理されたプロトプラ
ストを含む。
３０℃にて３日間の増殖の後、胞子を形成しよく増殖す
る形質転換体が出現する（１５０個の形質転換体／趨の
ｐＧＷ６３５）　、他方、多数のおそらく失敗の形質転
換体が出現する。　　ｐＧＷ１８００により約３００の
形質転換体が得られ、そしてｐＧＷ１９００により約１
００の形質転換体が得られる。　　ｐＧＷ１８００及び
ｐＧＷ１９００からのそれぞれの形質転換体の内、２０
個のコロニーを拾い上げ、個々の形質転換体の胞子を採
取し、そして５０ｍＭグルコース最少培地上で別々にプ
レートすることによりコロニーを得、これを再度純化し
そして次にこれを用いて更なる形質転換体分析のための
胞子を増加せしめる。
実施例５．２．により記載されたようにして得られた、
ｐＧＷ１８００により形質転換された約２００コロニー
及びｐＧＷ１９００により形質転換された約１００コロ
ニーを、先行する精製を伴わないコロニースクリーニン
グ法によりポリガラクチュロナ−ゼ活性の増加について
スクリーニングする。スクリーニングに使用される培地
は２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％リンゴペクチン
（エステル化度３４．８％、Ｏｂｉｐｅｃｔｉｎ、、Ｂ
１５ｃｈｏｆｆｓｚｅｌｌ）、最少培地塩及び胞子要素
、６　ｇ　／　１２　ＮａＮＯｓ、０．２％配列エキス
、０、２％ペプトン、０．００４％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００、及び１．２％の寒天を含んで成る。ベトリ皿の
中央に接種しそして３０℃にて２日間インキュベートす
る。
コロニーを一夜冷所に貯蔵する０次に、５Ｍｉの０．０
５％ルテニウムレッド溶液の上層を添加し、これを振と
うしながら５分間インキエベートする。
次に、薫留水にて５分間洗浄することにより未結合の色
素を除去する。これらの条件下でのポリガラクチュロナ
ーゼの生産は形成されたハローのサイズにより示される
。こうして分析された形質転換体の約５０％が野性タイ
プより強いポリガラクチュロナーゼ活性を有する。
ｐａｈｉｓｏｏ形質転換体の２０個のコロニー及びｐＧ
Ｗ１９００形質転換体の７個のコロニーをペクチン含有
固体培地上に形成されるハローのサイズに基いて拾い上
げられ、そして増殖の４５時後のこれらの陽性コロニー
の二次スクリーニングの後、形質転換体のそれぞれの６
個を最終的に拾い、そして実施例５．２．に記載されて
いるようにして純化される。
実施例５．２．又は５．３．に従って得られる形質転換
体並びに野性型株Ｎ４０２を、０．５％酵母エキス、０
、２％カザミノ酸、５０ｍＭグルコース及びＮａＮＯ３
（６ｇ／ｆ）を補完した溶体最少培地で培養する。３０
℃にて１８時間の増殖の後、ＤＮＡを抽出しそして同時
形質転換されたプラスミドの存在について分析する。前
にすでに記載したようにしてＡ、ニガーＤＮＡを単離す
る。
染色体ＤＮＡ　（２ｇ）の消化物を、５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，０）　　、　１０ｍＭ　　
ＭｇＣｆ　！　　、　　１００ｍＭ　　ＮａＣｊ！及び
４ｍＭスペルミジンから成る２００１１１の反応容量（
反応混合物に添加する前にＴｒｉｓ塩基によりｐｆ１７
．５に調整しである）中で３７℃にて調製する。２゜Ｕ
のＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉを添加し、そして反応混合
物を３７°Ｃにて２時間インキュベートする０次に、更
なる２０Ｕの両酵素を添加し、そしてインキュベージタ
ンをさらに２時間続ける０次に、反応混合物（２００ｉ
１１）を１００４のクロロホルムにより抽出する０次に
、１／１０（ｖ／ｖ）の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，２）及びλ５容量のエタノールの添加によりＤＮ
Ａを水相がら沈澱せしめる。４℃にて１時間のインキュ
ベーション及び遠心分離の後、ＤＮＡベレットを空気乾
燥し、そして２０１１１のサンプル緩衝液に溶解する。
　ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａｌ　Ｉにより消化されたＡ、ニ
ガーＮ　４０３のＤＮＡ及び形質転換体（７）ＤＮＡを
、ｐｃｎプローブとしｒ　ｐＧＷ１８００（７）１、２
　ｋｂｐ　Ｂａｍｔｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片との前
記ササングロットのハイブリダイゼーションにより分析
する。
同時形質転換頻度は７５％以上であることが見出される
。９形質転換体の幾つががササンプロットにより分析さ
れている。プローブはＮ４０２　ニおいて大ゲノム断片
とハイブリダイズする。ｐＧＷ１８００配列を含有する
形質転換体のゲノムプロットにおいて、４．１　ｋｂｐ
　ＥｃｏＲＩ　−５ａｌ　Ｉ断片が見出さレル。
コピー数に依存して、このバンドの強度が異る。
分析されたケースにおいて、野性型遺伝子を示すゲノム
断片が常に見出され、ヘテロロガス組込が示される。以
後Ｎ５９３／ｐＧＷ１８００−２７と称するＡ。
ニガー形質転換体におけるポリガラクチュロナーゼ■生
産の分析を詳細な例として記載する（実施例６．）。Ｄ
ＮＡ稀釈シリーズから、コピー数は２０オ一ダー以上で
あると推定される。野性型のハイブリダイズする断片及
び４．１　ｋｂｐ断片のほかに、少数の微量のハイブリ
ダイズする断片がこの株において見出され、これはタイ
プ■組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）現象又は転移（
ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）のボーダー断片を示す
。
実施例５．２．に記載した２０個のｐＧｈ！１８００形
質転換体及び実施例５．３．に記載した６個のｐＧＷ１
８００形賞転換体を、尿素（４，２ｇ／ｌ）、１％（ｗ
　／　ｖ　）リンゴペクチン（ｄ、ｅ、　６１．２％）
及び１％（ｗ／ｖ）小麦糠が添加された最少塩培地から
成る培地に増殖せしめる。　２５０ｒｐ−のガレンカン
ブ（Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ）回転振とう機を用いて３０
°Ｃにて４３時間培養物を増殖せしめ、そして培養濾液
を得る。ブフナー漏斗を用いミラクロス（Ｍｉｒａｃｌ
ｏｔｈ）により濾過して菌糸を除去する。これらのサン
プルのＰＧＩＩ含量をウェスタンブロッティングにより
行い、これはバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）指示マニュア
ルに従ってアルカリホスファターゼ検出法を用いて行う
、ウェスタンプロットのシグナルに基いて、実施例５．
２．において無作為に得られた２０個の形質転換体の内
、７０％カＡ、ニガーＮ４０２より実質的に多くのポリ
ガラクチュロナーゼ■を生産する。プラークスクリーニ
ング法（実施例５．３．を参照のこと）を用いてハロー
のサイズに基いて選択された形質転換体はすべてが、Ａ
、ニガーＮ４０２より実質的に多くの酵素を生産する。
Ａ、ニガーＮ４０２株、並びにＮ　５９３／　ｐＧＷ１
８００−２７、Ｎ５９３／ｐＧｌ１１８００−３０及び
Ｎ　５９３／　ｐＧＷ１８００−３７と称する３個の形
質転換体を選んでポリガラクチュロナーゼ活性を選択す
る。後者の３株は実施例５．２．において得られたｐＧ
Ｗ１８００形質転換体のセットからのものである。
Ｎ５９３／ｐＧ１１１８００−３０及びＮ　５９３／　
ｐＧＷ１８００−３７の両者はｐＧ１４１８００の多コ
ピーを含有するがＮ５９３／ｐＧＷ１８００−２７より
コピー数が少ない。これらの株を、１％（Ｗ／Ｖ）乾燥
し且つ粉砕した甜菜パルプを添加した１％ペクチン培地
（ｄ、ｅ、　６１．２％）で、前記の条件を用いて増殖
せしめる。還元糖及びＰＣ活性の阻害物質を除去するた
め、醗酵の後架橋アルギネートを用いてＰＧｎを部分精
製する。ＩＷｌｌの培養濾液をｌｌ１１の２０■Ｈ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２）により稀釈し、そして
次にこの緩衝液で平衡化した２ｄのベツドボリウムの架
橋アルギネー）（５，２ａｄ／ｇ）を含む小カラムに付
加する。次に、カラムを４１１の酢酸ナトリウム緩衝液
で洗浄し、そして次にＩＭＮａＣｆが添加された２０−
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，２）　４　ｄｌを用いてカ
ラムからＰＧ■をパルスする０次に、溶出液中のＰＧ活
性を記載されている（参考文献２）ようにして決定し、
得られた値から培養濾液中のＰＣ活性を計算する。
接種後２０時間で得られた培養濾液から次の活性が計算
された：Ｎ４０２株、Ｎ５９３／ｐＧ紳１８００−３０
株、Ｎ　５９３／　ｐＧＷ１８００−３７株及びＮ５９
３／　ｐＧＷ１８００−２７株につきそれぞれ２．２．
５．６．５．８及び１０．８ユニツト／ｄ。４０時間後
に得られた培養濾液については、これらの値は同じ順序
で２．８　、１３．５　、１６゜４及び３０．９ユニツ
ト／ｄであった。
従って、ｐＧＷ１８００を用いて好結果にＡ、ニガーを
形質転換することにより非常に高いＰＣ活性を生成せし
めることができることが明らかである。
実施例５．２．に記載したｐＧＷ１９００形質転換体１
７株及び実施例５．３．に記載したｐｌＪ１９００形質
転換体６株並びにＡ、ニガーＮ４０２株及びＮ５９３の
ｐｙｒ”形質転換体を、尿素（４，２ｇ／ｊｉ）、１％
（Ｗ／Ｖ）リンゴペクチン（ｄ、ｅ、　６１．２％）及
び１％甜菜パルプを添加した最少塩培地からなる培地に
増殖せしめる。培養物を３０゛Ｃにて６４時間、ガレン
カンブ回転振とう機を用いて２５０ｒｐｍにて増殖せし
め、そして培養濾液のサンプルを２０時間後及び３９時
間後に採取する。これらのサンプルのＰＣＩ含量を実施
例５．５．のＰＧ■含量としてウェスタンプロットによ
り試験する。
ウェスタンプロットのシグナルに基いて、２３個の形質
転換体の内６５％がＡ、ニガーＮ４０２より実質的に多
くのＰＣＩを生産する。ハローサイズに基いて選択され
た形質転換体のすべてがＡ、ニガーＮ４０２より多くの
ＰＣＩを生産し、そして６形質転換体の内４株が高生産
株である。活性が示すところによれば、この培地におい
て２０時間後の活性は３９時間後のそれよりも高い。１
２の異るＰＣＩ形質転換Ａ、ニガー株について、活性は
２．８〜７ｔＪ／ｄの間で異り、他方非形質転換株Ｎ４
０２及びＡ、ニガ−Ｎ５９３／ｐＧ讐６５３形賞転換体
にそれぞれ０．５及び０．８Ｕ／ｄを生産する。この活
性は少なくともＰＧＩ及びＰＧＩＩの両者の野性型レベ
ルの結果であり、他方形質転換体における増加は更なる
ＰＣＩ発現の結果である。
実施例５，４．に記載したＡ、ニガーＰＧ■形質転換体
Ｎ　５９３／　ｐＧＷ１８００−２７をペトリ皿中の完
全培地上で３０℃にて３〜４時間増殖せしめることによ
り分生胞子を生成せしめる。　　ｏ、ｏｏｓ％トウィー
ン８０／皿を含有する５−の無菌塩溶液中に分子胞子を
収得する。この胞子懸濁液をグリフイン振とう機上で２
０分間撹拌し、そして胞子を計数した後１０’胞子／ｉ
ｄを、３００１ｄの無菌増殖培地を含有する１１のシリ
コーン処理エルレンマイヤーフラスコに加える。この培
地は、窒素源としての７０ｍＭ塩化アンモニウム並びに
炭素源としての１％（Ｗ／Ｖ）リンゴペクチン（エステ
ル化の程度６１．２％）及び１％（ｗ／ｖ）甜菜バルブ
を含有する最少培地である。ガレンカンブ回転振とう機
を用い２００ｒｐ＠、３０°Ｃにて４３時間菌糸を増殖
せしめる。増殖後、ブフナー漏斗を用いミラクロスを通
して濾過することにより菌子を除去する。Ｉ　Ｎ　Ｎａ
ＯＨを用いて培養濾液を１）８４．２に調製する。微生
物の増殖を回避するため、その後のすべての段階におい
て０．０２％のナトリウムアジドを添加する。
培養濾液（約２．５　Ｉｔ）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，２）により平衡化した架橋アルギネ
ートカラム（２，５Ｘ２５Ｃ１ｌ）に適用する。付加の
後、カラムをｌベツドボリウムの平衡緩衝液、１ベツド
ボリウムの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，６
）、前記緩衝液中１．２００ｄの直線塩グラジェント（
０〜０．５　Ｍ　ＮａＣ１）　、及び最後に同じ緩衝液
中２７５−のＩＭＮａＣｊ！溶液により逐次溶出する。
６Ｉｌｉずつの両分を集め、そしてそれらの酵素活性に
ついて実施例１．１．に記載したようにして試験する。
活性画分の中心部分をプールし、そして２０■Ｍ　ｂｉ
ｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６，０）に対して３回
透析する０次に、最終酵素溶液（４７５ｄ）を、同じ緩
衝液で平衡化したＤＥＡＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａ
ｓｔ　Ｆｌｏ−カラム（ファルマシア）に適用する。洗
浄した後、ＮａＣｐＨグラジェントを同じ緩衝液中で適
用し、そしてポリガラクチュロナーゼ活性が約１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウムにおいて溶出する。活性画分を５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をにより分析する。
高ＰＧＭ含量のこれらの両分をプールしく５４ｄ）　、
２０５Ｍ　ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ４Ｃｊ！緩衝液（ｐＨ６，
０）に対し透析し、そしてさらに同じ緩衝液中で平衡化
されたモノＱカラム（ファルマシア）上で精製する。付
加した後、塩グラジェント（θ〜ＩＭＮａＣｊりを適用
することにより酵素を溶出する。塩化ナトリウムグラジ
ェントの０．２〜０．２６Ｍ部分及びグラジェントの０
．２６〜０．３４Ｍに対応する２個の異るプールＡ及び
Ｂに酵素を集める。両両分は５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の際単一バンドを示しこれはＰＧＭと同
じ位置である。
実施例６．２．に従って精製された一緒にされたプール
Ａ及びＢからの２００ＩのＰＧＩＩを、１２のミリホア
濾過された蒸留水に対して３回透析する。実施例１．３
．に記載されているようにしてアプライド・バイオシス
テム・モデル４７０Ａ気相蛋白質配列決定機を用いてア
ミノ酸配列を決定する。この酵素について下記のＮ−末
端アミノ酸配列が決定される： 位　　置＝１５ アミノ酸　ａｓｐ−ｓｅｒ−Ｘ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｔｈ
ｒ−ｔｈｒ−ａｌａ−位　　置　　　　１０１５ アミノ酸：　ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−１ｙｓ−ａｌａ
−ｇｌｙ−１ｙｓ−ａｌａ−位　　置：２０ アミノ酸：　１ｙｓ−Ｘ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−ｉｌｅこの
蛋白質中のシスティン残基は修飾されていなかったので
検出されない、これらは配列の３位（Ｘ）及び１８位（
Ｘ）に存在するようである（実施例１．３．を参照のこ
と）。最後の３アミノ酸残基は低レベルでのみ検出され
る。この純粋な酵素から得られた配列は、ＰＧＩＩ遺伝
子のヌクレオチド配列から推定されるＰＧＩＩのＮ−末
端のアミノ酸配列（実施例４．及び第４図、式■を参照
のこと）に正確に対応する。対応するヌクレオチド配列
はまた予想される位置、すなわち残基３及び１８にシス
ティン残基を示す。この配列はまた、５　ｋＤａシアノ
ゲンブロミド断片（実施例１．３．を参照のこと）につ
いて決定された配列に対応し、従ってこの配列は蛋白質
のＮ−末端に対応する。
実施例６．２．に従って精製された酵素を実施例１．１
．に記載したようにしてラピダーゼから精製した酵素と
比較する０両酵素は５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル上
で３８ｋＤａの同一の見かけ分子量を示す。ＰＧＩ［の
連続エピトープとのみ反応しそしてＰＣｌ、Ｉ［Ａ、Ｉ
［Ｂ又は■とは反応しないモノクロナール抗体はまた実
施例５．２．に従って精製された酵素と反応する。等電
点電気泳動の際、実施例６．１．及び６．２．に従って
生産されそして精製されたＰＧｕはＰＧＩＩの９１位（
ｐＩ＝５．２）と同じｐｔ値にシャープなバンドを示す
。ＰＧＩ［のわずかな不均一性のため、ｐＨ３−７又は
ｐＨ３−１０のｐＨグラジェントを使用する場合、 より低いｐ ■値が観察され た。
前記の方法を用いてＡ、ニガーＮＷ７５６からＤＮＡを
単離する。ＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩ　、　ＥｃｏＲＩ及
びこれらの酵素の組合わせにより、実施例５．４．に記
載されているようにして消化する０次に、ＤＮＡ断片を
０．６％アガロースゲル上で分離し、そして次にこれら
を実施例３．７．に記載したようにしてニトロセルロー
ス膜に移す、乾熱した膜をあらかじめ加温されたハイブ
リダイゼーション緩衝液中で６０°Ｃにて２時間プレハ
イブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション緩衝
液は、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧ１１ｂｅｒｔ（参考文献３８
）に記載されているように、１％ＢＳＡ　（ベーリンガ
ー）、１園Ｍ　ＢＤＴＡ　、　０．５Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，２，）　（１１当り８９．０　ｇのＮａＪ
ＰＯ４・２ＨｔＯ及び４Ｊｄの８５％Ｈ３Ｐ０．から成
る）及び７％ＳＯ５から成り、そしてこれに剪断されそ
して変性されたニシン精子ＤＮＡが新しく０．１■／ｄ
の濃度に添加される。次に、実施例３．７．に記載され
たようにして調製したｐＧＷ１８００のニック−トラン
スレーションされた１、　２　ｋｂｐ　Ｂａ５ｌｌ　１
−Ｂｇｌ　Ｉｆ断片を加え、そして穏やかに振とうしな
がらハイブリダイゼーションを６０℃にて４４時間進行
せしめる０次に、膜を２回あらかじめ加温された（６０
°Ｃ）ハイブリダイゼーション緩衝液（精子ＤＮＡを含
まない）中で２回洗浄する。次に、膜を２回２０分間６
０°Ｃにて、５　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ及び０．１
％Ｎａ４ＰｔＯｔ　　・ＩＯＨ！０から成るあらかじめ
加温された緩衝液中で洗浄する。次に、膜を乾燥し、そ
して−６０℃にて３日間コダックＸＡＲ５に暴露する。
これらの条件下で非特異的ハイブリダイゼーションは観
察されないが、これはハイブリダイズするＤＮＡ断片の
有意な汚れが存在せず、そしてλサイズマーカーとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションが存在しないためであ
る。各レーンにおいて幾つかのハイブリダイズするバン
ドが観察されるが、各レーンにおいて１つのバンドが他
のバンドに比べて非常に強い、これらの強いバンドはＢ
ａａ）Ｉ　ｌ消化物中の３．３ｋｂｐ断片、ＥｃｏＲｌ
消化物中の２０ｋｂｐより長い断片、及びＢａｍＨＩ　
／　！ｌ！ｃｏＲにｌ消化物中の３．３　ｋｂｐ断片に
相当する。低強度のバンドはＢａｍＨｌ消化物中の１７
．９．５．６．４及び２０ｋｂｐの断片、ＥｃｏＲｌ消
化物中の１５．６．５及び４．８　ｋｂｐの断片、並び
にＢａｍ１ｎ　Ｉ　／　ＥｃｏＲにｌ消化物中の７．６
．６．４　、４．０　、３．７及び２．０ｋｂｐの断片
に対応する。
特異的ハイブリダイゼーションシグナルが観察されると
いう事実から、Ａ、ニガーＮ４００のＰＧｎ遺伝子を用
いてＡ、ニガーＮＷ７５６から得られたＤＮＡ中の特異
的配列を検出することができる。
強いハイブリダイゼーションシグナルを与える断片はＰ
ＧＩ［遺伝子を担持していると推定される。原理的には
、使用したプローブと相同な領域内及びその末端に近い
ＤＮＡを制限酵素が開裂させた場合に弱いハイブリダイ
ゼーション断片が生じ得る。
しかしながら、これは本実施例において観察されるハイ
ブリダイズする大断片の数を十分に説明することができ
ない。従って、ＰＧｎ遺伝子と相同様を共有するがそれ
と同一ではない特定のＤＮＡ断片が検出されたことにな
る。これらのＤＮＡ配列は異るＰＧ遺伝子であると予想
され、これはＰＧ類が蛋白質レベルで相同性を有する（
実施例１．４゜を参照のこと）事実と一致する。
Ａ、ニガーＮ４００ライブラリーからの約ｌＸｌ０’フ
アージを大腸菌ＬＥ３９２を用いて５枚のプレート上に
プレートし、そして各プレートから実施例３．４．に記
載したようにして３枚のニトロセルロースのレプリカを
作る。この場合第三のフィルターはプレート上に５分間
インキュベートする。各プレートの第−及び第二のフィ
ルターは「ヘテロロガス」と称する条件を用いて処理す
る。第三のフィルターは「ホモロガス」と称するストリ
ンジェント条件にかける。ブレハイブリダイゼーション
、ハイブリダイゼーション及びフィルターの洗浄は、ヘ
テロロガス条件下６０°Ｃにおいて及びホモロガス条件
下６８℃において行う。乾燥後、フィルターを３ｘｓｓ
ｃ中で湿し、次に２時間、１０×デンハート（実施例３
．４．を参照のこと）　、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ
（ｐＨ７，５）　　、　２０ａＭ　　ＥＤＴ＾（ｐｔ１
８．ｏ）　　、　ＬＭ　　Ｎａ（Ｊ。
０、５％ＳＤＳ及び０．１％ビロリン酸ナトリウムから
成り、これに０．１■／−の剪断されそして変性された
ニシン精子ＤＮＡを新しく加えたあらかじめ加温したハ
イブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイズす
る０次に、フィルターを、ニシン精子ＤＮＡを含みｐＧ
１１１８００のニックトランスレーシランされたＢａｍ
ＦＩ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ断片があらかじめ添加されて
いる５０１ｄのハイブリダイゼーション緩衝液を含むフ
ラスコに一度に移す。ハイブリダイゼーションを４０時
間進行させ、そして次にフィルターをホモロガス条件又
はヘテロロガス条件を用いて洗浄する。ホモロガス洗浄
条件は次の通りである：フィルターを２　Ｘ５ＳＣ、０
，１％ＳＯＳ及び０．１％ピロリン酸ナトリウム中で０
．５時間ずつ２回、そして次に６．’２　Ｘ５ｓｃ　、
　０．１％ＳＤＳ及び０．１％ビロリン酸ナトリウム中
で０．５時間ずつ２回洗浄する。ヘテロロガス条件は次
の通りである：フィルターをハイブリダイゼーション緩
衝液中で０．５時間ずつ２回、そして次ニ４　Ｘ５Ｓｃ
　、　０．１　％　ＳＤＳ及びＯ１１％ビロリン酸ナト
リウム中で０．５時間、そシテ最後ニ２　Ｘ５ＳＣ、０
，１％ＳＤＳ及びｏ、　ｉ％ピロリン酸ナナトリウム中
洗浄する。フィルターを空気乾燥し、そして強化スクリ
ーンを用いて一６０″Ｃにて３日間コダックーχＡＲ５
フィルムに暴露する。
陽性シグナルを与えるファージを実施例３．４．に記載
したようにして回収する。
ホモロガス条件にかけたフィルター上に７個の陽性シグ
ナルが得られ、これらのシグナルはまた、ヘテロロガス
条件にかけたフィルターの対応する位置にも存在する。
これらのシグナルはＰＣＩＩ遺伝子を担持する組換λフ
ァージに由来すると見られる。これらのシグナルを除き
、３０個の陽性シグナルがヘテロロガス条件にかけたフ
ィルター上に観察され、そしてこれらのシグナルは両フ
ィルター上の対応する位置に存在する。これらの３０個
のシグナル間でシグナル強度は異る。これらのシグナル
の多くはＰＧＩＩ遺伝子とは異るＰＧ遺伝子を含有する
ファージによるものと見られる。
Ａ、ニガーＮ４００ゲノムライブラリーの二度目のスク
リーニングを行う、プラークリフトを前記のようにして
調製する。使用される温度を除き、前記のようにしてハ
イブリダイゼーションを行う。
１つのプレートから得られた２枚のフィルターの内の一
方についてはハイブリダイゼーション及び洗浄を６２℃
で行い、他のフィルターについては６８℃にてハイブリ
ダイゼーション及び洗浄を行う。
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを高ＳＳＣ（
ＨＳＳＣ）条件を用いて６２°Ｃ又は６８°Ｃのいずれ
かで洗浄する。　ａｓｓｃ条件は次の通りである。フィ
ルターを４ｘｓｓｃ中で５分間ずつ２回洗浄し、次にフ
ィルターを４ＸＳＳＣ中で０．５時間ずつ２回洗浄し、
そして次に２ｘｓｓｃ中で０．５時間ずつ２回清浄する
。ここで、使用されるＳＳＣ溶液はさらに０．１％ＳＤ
Ｓ及び０．１％ピロリン酸ナトリウムを含有する。
８６°Ｃ（ｒホモロガス」ハイブリダイゼーション条件
）にてインキュベートされたフィルター上には５個の強
い陽性クローンが得られ、これらはまた６２°Ｃにてイ
ンキュベートされたフィルター上の対応する位置にも存
在する。これらのファージの１つの制限分析が示すとこ
ろによれば、このファージはＰＧＩＩをコードする遺伝
子（ｐｇａ　ＩＩ　）が位置する挿入部を含む。従って
、これら５個のファージはすべて」巳１１を含有すると
考えられる。さらに、６２°Ｃ（ｒヘテロロガス」ハイ
ブリダイゼーション条件）にてインキュベートされたフ
ィルター上には１７個の陽性クローンが存在し、これら
は６８°Ｃにてインキュベートされた対応するフィルタ
ー上にはハイブリダイズしないか又は弱くハイブリダイ
ズするにすぎない。１７個のシグナル間のシグナル強度
は異る。
Ｊ巳Ｉ［を含有しない、第一スクリーニングからの１６
フアージ及び第ニスクリーニングからの１０フアージを
、選択してさらに特徴付ける。これらのファージを、そ
れらの最初の検出のために用いられた条件を用いて精製
する。特徴付けられたファージは第７表に挙げたファー
ジ及び８個の追加のファージ（Ｎ（Ｌ２　、３　、７．
３１，３３．４０．４１、及び４２）である。阻１〜３
０のファージはライブラリーの第一スクリーニングにお
いて得られ、他方それより大きい番号のファージは第ニ
スクリーニングにおいて得られた。
ポリガラクチュロナーゼＩ遺伝子を含有するファージと
他のポリガラクチュロナーゼ■関連配列を含有するファ
ージとを区別するため、選択されたファージのプラーク
リフトをｐＧＷ１９００のあらかじめニック−トランス
レージジンされた１、　８　ｋｂｐの旧ｎｄｌ［［断片
とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは６
２℃にて行い、他方洗浄も６２℃で行い、そしていずれ
も０．１％ＳＤＳ及び０．１ピロリン酸ナトリウムを含
有する一連の緩衝液（４×ＳＳＣ，２Ｘ５ＳＣ，Ｉ　Ｘ
５ＳＣ，０，５Ｘ５ＳＣ，０，２Ｘ５ＳＣ及び０．　Ｉ
　Ｘ５ＳＣ、インキュベーションは緩衝液当り０．５時
間である）を用いる。これらの条件を用いて、ファージ
２．３　　、７．４０．４１及び４２は、ｆｆ１ｌ遺伝
子を担持するファージＰＣＩ−λ７（実施例３．６．を
参照のこと）により得られるシグナルに匹敵する強いハ
イブリダイゼーションシグナルを与える。これらのファ
ージの１つから得られたＤＮＡの制限分析が示すところ
によれば、このファージはＩ！ＪＬ！Ｉ遺伝子を有する
挿入部を含有する。
分析された他のファージ（１、８，３１，３３，３５゜
３６、３７　、３８　、４３）はシグナルを与えるとし
ても弱いシグナルのみを与え、そしてそれ故にこれらの
ファージは」巳Ｉ遺伝子を含有しない。
どのファージが同じ断片を含有するかを見出すため、第
７表に示すファージから実施例３．５．に記載したよう
にしてＤＮＡを単離し、そして実施例３．６．に記載し
たようにして消化し、そして次に生ずる断片をササンプ
ロット分析により特徴付ける。
Ｈｉｎｆ　Ｉ及びＨｉｎｃＩＩ消化物の分析のため、ゲ
ルのアガロース含量を１％（Ｖ／Ｖ）に上げる。ササン
プロットを６０°Ｃにて、ｐＧＷ１８０３からあらかじ
めニック−トランスレーションされた１、　２　ｋｂｐ
　ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズせしめ
、洗浄は６０°Ｃにて前記のＨ５ＳＣ条件を用いて行う
。これらのファージの最初の分類を行うために有用であ
ることが見出された制限酵素は、ＢａｗＨＩとＢｇｌ　
Ｉｔとの組合わせ、並びにＨｉｎｆ　Ｉ及び旧ｎｃＩ［
であり、後二者は別々に使用される。旧ｎｃＩ［及びＨ
ｉｎｆ　Ｉは通常、小さい制限断片を生じさせ、今の場
合、これは生ずるハイブリダイズする断片が、」巨Ｉ［
関連配列に加えて、ＢＭＢＬ　４ベクターに由来するＤ
ＮＡを含有する機会を最小にする。
制限酵素 ９、１０．４３ ４．３５．３６ １゜ Ｈｉｎｃ　Ｉｔ １．２５ ２．４ １゜ Ｈｉｎｆ　Ｉ ０．７：０．３ １．１ １゜ （ａ）ｋ１６及び２０のファージはさらに１．６４ｋｂ
ｐ（ｂ） クラスＧファージは非ストリンジェントｎ、ｄ。
消化を行わず。
λ−ファージのクラス１ｍ） （−１Ｄ　　　　　Ｂ 各クラスに属するλファージ １６．２０，３７　　８．１１，１２　６．３８断　　
片　　　長 ？５　１．３；０．４ ２８　１．８ １．３；０．７Ｂ　　２．３ ０．６５　　　　０．６ （：、＜ｂ＞ １７．２７ Ｋｐｎ　Ｉ断片及び１．３８ｋｂｐ　Ｈｉｎｃ　Ｉ［／
　Ｋｐｒｉ　Ｉ断片を共有する。
・条件下でＰＧ■遺伝子と弱くのみ反応する。
第７判に示されるデーターから、はとんどのファージク
ラスについて幾つかの対応するファージが独立に単離さ
れていることが明らかである。最初のスクリーニングに
おいてすべてのハイブリダイズするシグナルの選択が取
られている事実から、各クラスについて見出されるλ−
ファージの数（クラスＡ：３；Ｂ：３：Ｃ：４；Ｄ：３
；Ｅ：２）は、異る遺伝子が類似の頻度で見出されるこ
とを示している。ＰＣＩ遺伝子の場合この数は高く（分
析された２６フアージ中６）、ＰＧｎ含有ファージが同
じ頻度（分析された５９フアージ中１２）で見出される
。クラスＧは、ＰＣＩ遺伝子由来のプローブ及びＰＧｎ
遺伝子由来のプローブのいずれとも一層弱（ハイブリダ
イズする。随１７及び２７のファージ中のそれぞれ３．
０及び４．９ｋｂのハイブリダイズする断片のほかに、
両ファージにおいて同一でありそして挿入部に由来する
幾つかの断片、すなわち５．６　ｋｂｐ、　５．１　ｋ
ｂｐ、　　１．４５ｋｂｐ、及び０．５７ｋｂｐの断片
がＢｇｌ　ＩＩ　／　ＢａｔａＨＩ消化物中に検出され
る。両ファージの旧ｎｃＩＩ消化物及び旧ｎｆｌ消化物
もほとんど同じである。
この実施例において単離されたファージは次の通りであ
る。
クラス　番号　名称 ファージλＰＧ−Ｃ２０（実施例７．２．、ファージ２
０、クラスＣ）をＢｇｌ　ＩＩにより消化し、そして生
ずる断片をアガロースゲル上で分離する。ハイブリダイ
ズする７、　８　ｋｂｐ　Ｂｇｌ　ＩＩを含有するゲル
片を回収し、そして次に断片を実施例３．６．に記載し
たようにして単離する。　　Ｂｇｌｎ断片を、ＢａｍＨ
Ｉで消化され且つＣＩＰ　（ウシ腸ホスファターゼ）処
理されたｐＵｃ　９に連結する。連結反応混合物を使用
して大腸菌ＪＭ１０９（実施例３．６．　”）を形質転
換する。生ずる白色コロニーの幾つかを、アンピシリン
が補充されたＹＴ寒天上にストリークする。−夜の増殖
ノ後、コロニーをニトロセルロースフィルターに吸着せ
しめる。次に、フィルター上のコロニーを溶解し、そし
て遊離したＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓら（参考文献６．
３１４頁）により記載されているようにして乾燥により
固定する。乾熱されたフィルターを２ｘｓｓｃ中で湿し
、そしてこれらを手袋を着けた手でこすって細菌細胞片
を除去する０次に、実施例７．２．に記載したヘテロロ
ガス条件（６０℃、２ｘ　ｓｓｃによる洗浄）を用いて
、前記フィルターをｐｃｗｔｓｏａの１．２　ｋｂｐの
Ｂａｄ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズせしめ
る。陽性クローンを選択し、そしてプラスミドＤＮＡを
前記の様にして精製する。
次に、このプラスミドを用いて制限分析を行うことによ
り物理的地図を作成する。
こうして、新規プラスミドを作製した。ｐＧＷ１９１０
（第７図）はファージλＰＧ−Ｃ２０の７．８　ｋｂｐ
　　Ｂｇｌ　ＩＩ断片をベクターｐｕｃ　９のＢａｗｌ
　１部位に挿入したものである。このサブクローンはフ
ァージλＰＧ−Ｃ２０のハイブリダイズする断片、例え
ば１．１　ｋｂｐのＳｗ＋ａ　Ｉ断片及び１．６　ｋｂ
ｐのＫｐｎ　Ｉ断片を含んで成る。　　ｐｌＪ１９１０
の物理的地図上のこれらの断片の位置から、このプラス
ミドが完全なＰＧＣ遺伝子（ＲｔＩＣ）を含有すること
が予想される。
下記のようにして、プラスミドｐＧＷ１８００をＥｃｏ
ＲＩにより消化し、そしてＴ４ポリメラーゼにより処理
する。このＤＮＡの連結及び大腸菌ＤＨ５αＦ′の形質
転換がプラスミドｐＧＷ１８００−Ｅの単離を可能にす
る。このプラスミドは、ＥｃｏＲＩ開裂部位が除去され
ている点を除きｐＧＷ１８００と同じである。
プラスミドｐＧＷ１８００４をＢｇｌ　Ｉｔで消化し、
そして５０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）及び
５０ｉｅＭ　ＮａＣｆの存在下で６５℃にて１時間細菌
アルカリホスファターゼで処理する。アルカリホスファ
ターゼをプロテイナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム
）による消化及びフェノール抽出によって不活性化する
。
次に、ＤＮＡをエタノール沈澱し、乾燥し、そして水中
に再溶解する０次に、下記のようにして接着末端をＴ４
　ＯＮＡポリメラーゼによりフィル−インする。
プラスミドｐＪＤＢ２０？−ＩＦＮ　ＡＭ１１９（ｆ！
Ｐ２Ｏ５４０４）をＨｉｎｄＩ［［及びＣ１ａ　Ｉによ
り消化する。これらの線状断片の接着末端を、０．１量
りずつのｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。
ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ並びに６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、（ｐＨ７，５）。
６．７一−ＭｇＣｌ　ｔ＋　１６−７１１Ｍ１６−７ｌ
１　ｔｓＯａ及び５ｍＭＤＴＴの存在下で３７°Ｃにて
３０分間フィルインする。６５°Ｃにて５分間加熱する
ことにより反応を停止する。
０．８％低ゲル化温度アガロース（バイオラド）ゲル中
で断片を分離し、そしてＩＦＮ　ＡＭ１１９コード領域
を含んで成る１　ｋｂｐ断片を切り出し、そしてＤＮＡ
をＥｌｕｔｉｐ　Ｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ
ｈｔ１１１）カラム上で精製し、そしてエタノール沈澱
する（Ｓｃｈｓｉｔｔ＆　Ｌｏｈｅｎ　％参考文献３４
）。
１１００ｎのＩＦＮ　ＡＭ１１９断片と調製されたｐＧ
Ｗ１８００−Ｂベクターとを、５ｉｔ１の２０ｅ＋Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＦＩＣｌ（ｐＨ７，５）。
１０■−ＭｇＣｊ！＊、　１０■Ｍ　ＤＴＴ、　　１ａ
Ｍ　ＡＴＰ及び１ユニツトの７４　ＯＮＡアーゼ（ベー
リンガーマンハイム）中で室温にて２時間連結する。こ
の混合物をコンピテント大腸菌ＤＢＳαＦ′細胞に形質
転換する。アンピシリン耐性形質転換体を、これらのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素消化によりスクリーニングし
てプラスミドｐＧ　ｎ　−ＩＦＮ　ＡＭ１１９の前駆体
を担持するプラスミドを同定する。
用いるＰＣＲ法はＲ，Ｍ、Ｈｏｒｔｏｎら（参考文献３
５）により記載されており、そして第５図に要約する。
ｐＧＷ１８００をＸｂａ　Ｉ消化により線状化し、そし
てエタノールにより沈澱せしめる。水中に再懸濁した後
、１１００ｎのこのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によりオリゴヌクレオチドＡ及びＢ（第５図）を
用いて、自動熱サイクルにおいて２５サイクル（それぞ
れ、９４℃にて１分間、４０℃にて２分間、及び７２°
Ｃにて３分間から成る）にわたり増幅にかけ、次に７２
℃にて１０分間処理する。供給者により推奨される反応
を用いて１００ｄの容量で各反応において１１００ｐの
各オリゴヌクレオチド及び０゜５ＩのＴａｑポリメラー
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｗｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いる
。これによりＤＮＡ　１が得られる（第５図）。
オリゴヌクレオチドＡ及びＣによりｐｃｗｘｅｏｏを同
様に処理することによりＤＮＡ　２が得られる。
同様に、ｐＪＤＢ２０７−ＩＦＮ　ＡＭ１１９をＢａｍ
Ｈ１により線状化し、そしてオリゴヌクレオチドＤ及び
Ｆ又はオリゴヌクレオチドＥ及びＦを用いてＰＣＨにか
けることによりそれぞれＤＮＡ３及びＤＮＡ　４を得る
。
これらの反応混合物をエタノールで沈澱せしめ、水に再
溶解し、そしてアリコートをゲル上でチエツクして混合
物中のＤＮＡ断片の濃度を決定する。
上記の同じ条件を用いてＤＮＡ　１及びＤＮＡ４をオリ
ゴヌクレオチドＡ及びＦと共にＰＣＲにかけてＤＮＡ５
を得、そして同じオリゴヌクレオチドと共にＤＮＡ　３
をＰＣＲにかけてＤＮＡ　６を得る（第５図）。
ＤＮＡ　５はＢａｍＨ１部位から始まりそしてＥｃｏＲ
１部位で終り、そしてＰＧＩＩプロモーター断片にリン
クしたもとの出発メチオニンコドンと成熟バイブリドイ
ンターフェロンＢＤＢＢのコード領域との完全なインフ
レーム融合を含む。
ＤＮＡ　５のＢａｗｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片を、実施
例＆１．において作製されたプラスミドｐＧＩＩ−ＩＦ
Ｎ　ＡＭ１１９前駆体であってＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲ
１で切断したものに連結してプラスミドｐＧ　ＩＩ　−
ＩＦＮ　ＡＭ１１９を作製する。
同様にして、ＰＧＩＩプロモーター断片にリンクしたＰ
Ｇｎシグナル配列とヒトバイブリドインターフェロンＢ
ＤＢＢのコード領域との完全なインフレーム融合を含む
ＤＮＡ　６のＢａｗｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片をｐＧ　
ＩＩ　−ＩＦＮ　ＡＭ１１９前駆体に挿入してプラスミ
ドｐＧ　ＩＩ　５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９を生じさせた
。
ウリジン栄養要求変異株Ａｎ８　（ＰＳＭ　３９１７．
　ＨＰ２７８３５５に開示されている）をプラスミドｐ
ＣＧ５９Ｄ７とプラスミドｐＧ　ＩＩ　５ｓ−ＩＦＮ又
はｐＧｎ−ｒｐＮＡＭ１１９とにより同時形質転換して
ウリジン系栄養株を得る。
Ａ、ニガー＾ｎ８の分生胞子を完全培地中で２８°Ｃに
て４日間十分に胞子を形成するまで増殖せしめる。Ｉｇ
／ｊ！のアルギニン及びウリジンを補充した２００１ｄ
の最少培地に２Ｘ１０”個の分生胞子を接種する。
２８℃及び１８０ｒｐ■にて２０時間の増殖の後、菌糸
をミラクロスを通しての濾過により収得し、１０ｊｄの
０、８　Ｍ　ＫＣ１，５０１Ｍ　ＣａＣｊ！　ｔにより
２回洗浄し、そして２０Ｈ１の０．８　Ｍ　ＫＣｊ！　
、　５０ｍＭ　ＣａＣｊ！　ｔ、　　０．５１ｇ／−ノ
ボチーム（Ｎｏｖｏｚｙｓ）　２３４（ノボ・インダス
トリーズ）中に再懸濁する。混合物を振とう水浴（３０
”Ｃ、５０ｒｐｍ）中で十分なプロトプラストが放出さ
れるまで（９０〜１２０分の後顕微鏡により観察される
）インキュベートする。プロトプラスト懸濁液を漏斗中
のガラス綿栓を通して濾過することにより菌糸片を除去
する。室温での穏やかな遠心分Ｊｌａｉ（１０分間、２
．００Ｏｒｐｍ）によりペレット化し、そして１゜ｄの
０．８　Ｍ　ＫＣｊ！　、　５０５Ｍ　ＣａＣｊ！　！
により２回洗浄する。最後にプロトプラストを２００〜
５００ｄの０．８　ＭＫＣｊ！、　５（１＋＋Ｍ　Ｃａ
Ｃ１ｚ中に再懸濁して濃度をｌＸｌ０”／１ｄにする。
形質転換のため、プロトプラスト懸濁液の２００Ｉのア
リコートを５〜のｐｃＧ５９Ｄ７．５ＯＮのｐＧｎｓｓ
−ＩＦＮ　ＡＭ１１９又はｐｃｎ　−ＩＦＮ　ＡＭ１０
９　ＤＮＡ、　５０ｉｒ１のＰＣＴ（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）、　５０５Ｍ　ＣａＣ１ｚ
中　２５％ＰＥＧ　６０００）と共にインキュベートす
る。インキュベーション混合物を氷上に２０分間置き、
さらに２ｄのＰＣＴを加え、そして混合物を室温にてさ
らに５分間インキュベートする。４ｍの０．８ＭＫＣｆ
、５０ｍＭＣａＣｊ！ｔを加え、最終形質転換溶液のＩ
Ｉｄのアリコートを、０．８ＭＫＣｊ２により安定化さ
れた液化した最少寒天培地〔最少培地＋Ｉｇ／２アルギ
ニン＋１０ｇ／バクトー寒天（デイフコ）〕と混合する
。次に、この混合物をすぐに同じ培地の寒天プレート上
に注ぎ、そして３０°Ｃにてインキュベートする。
２８℃にて２〜３日間の増殖の後、数百個の小さなおそ
らく失敗した形質転換体のバックグラウンド増殖の上に
旺盛に増殖しそして胞子を形成するコロニーが出現する
。
同時形、質転換実験（実施例８．３．　”）の形質転換
体を拾い上げ、そしてインターフェロンの発現について
分析する。ヒトＣＣＬ−２３細胞及びチャレンジウィル
スとしての水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を用いてＡ
ｒｍｓｔｒｏｎｇ（Ｊ、Ａ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　Ａ
汗ｉｔ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
…、　７３２（１９７１）の方法に従ってインターフェ
ロン活性を決定する。
形質転換体からの分生胞子を別々に５０ｍの前培養培地
（３ｇ／ｆ！のＰｅｃｔｉｎ　Ｓｌｏｗ　Ｓｅｔ　Ｌ（
Ｕｎｉｐｅｃｔｉｎ。
ＳＡ、　Ｒｅｄｏｎ　、フランス）、２ｇ／／！のＮＨ
ａＣｊ！、０．５ｇ／／！のＫＨｔＰＯｎ、０．５ｇ／
ｌのＮａＣ１２，０，５ｇ／ｌのＭｇ５Ｏｎ　・２Ｈ！
０．０．５ｇ／ｊ！のＣａＳＯ４・２Ｈｚ０（ｐＨ７，
０）、１％のアルギニン〕に前培養する。
この前培養物を２５Ｏｒｐｍ及び２８°Ｃにて７２時間
インキュベートする。１０％の前培養物を５０１ｄの主
培地（２０ｇ　／　ｌの大豆粉、５ｇ／２のＰｅｃｔｉ
ｎ　Ｓｌｏｗ　Ｓｅｔ１％のアルギニン）に接種する。
培養物を７２〜９６時間２５０ｒｐ−及び２８℃にて増
殖せしめる。
種々の時間（２０時間毎）にサンプルを採取し、遠心分
離により細胞をペレット化し、そして凍結及び解准によ
り破壊する。上滑及び細胞抽出物の両者を前記のように
してインターフェロン活性について試験する−　ｐＧｕ
ｓｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９を担持する形質転換体におい
てインターフェロン活性の大部分が培地に分泌され、他
方ｐＧＩＩ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９を担持する形質転換体
においてはそれは主として細胞抽出物に存在することが
見出される。
ｐＧＷ６３５を大腸菌ＭＨＩ中で、ｐＧＷ１８０Ｇを大
腸菌ＪＭ１０９中でそしてｐＧＷ１９００を大腸菌ＤＨ
５αＦ′中で増加せしめる。
Ａ、ニドランス変異株Ｇ　１９１（ｐｙｒＧ　、　ｐａ
ｂａＡｌ　。
ｆｗＡｌ　、　ｖａＹ９）はＢａ１ｌａｎｃｅ及び↑ｕ
ｒｎｅｒ、　１９８５　（参考文献２７）により記載さ
れている。
Ａ、ニガーについて記載されている（実施例５．２．を
参照のこと）ようにして菌糸を３７°Ｃにて培養せしめ
るが、培地１２当り２ｍのｐ−アミノ安息香酸を加える
。Ａ、ニガーについて記載した方法に従ってプロトプラ
ストを調製する。形質転換のため５Ｘ１０”個のプロト
プラストを２００ｍのＳＴＣ中にとり、次にこれをｌｘ
のｐＧＷ６３５と２０ａｇのｐｌＪ１８００又は２５■
のｐＧＷ１９００と共にインキユベートする。プレート
は３７°Ｃにて３日間インキュベートする。
この同時形質転換実験において１４のｐＧＷ６３５当り
約５０個の形質転換体が得られ、そして各実験において
２０個の形質転換体を５０−Ｍグルコース最少培地上で
さらに精製する０次に、これらの株を使用して、さらに
分析するために胞子を増加せしめる。
同時形質転換プラスミドとしてｐＧＷ１８００を用いて
実施例５．２．に従って得られた同時形質転換体を、２
■／２のｐ−アミノ安息香酸、窒素源としての７、５　
ｇ　／　ｊ！のＮ８４ＮＯ３並びに炭素源としての１％
（ｗ／ｖ）のリンゴペクチン（ｄ、ｐ、６１．２％）及
び１％（Ｗ／Ｖ）甜菜パルプを用いて７５ａｄの最少培
地中で１０’個／ｄの分生胞子から出発して液中培養す
る。ガレンカンプ回転振とう機を２５０ｒｐ−にて使用
し、そして増殖温度は３０℃に維持する。
増殖の４３時間後及び６８時間後にサンプルを取り、遠
心分離し、そして上清を４℃にて一夜、０．０２％（ｗ
／ｖ　”）のナトリウムアジドを含む５％Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐ１４６．５）に対して透析する。
これらのサンプルのＰＧｎ含量の分析を、ポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロ
ッティングにより試験する。モノクローナル抗体を用い
て試験した場合、対照として用いたＡ、ニドランスのサ
ンプルはＰＧ■交叉反応性物質を含有しない。
分析した２０個の形質転換体すべてがポリガラクチュロ
ナーゼ■を生産するが、量は形質転換体の間で異る。予
想される分子量（３８ｋＤａ）の主バンドのほかに、分
解生成物を示すと思われるより低分子の幾つかの弱いバ
ンドが観察される。最も多（の酵素を生産する形質転換
体はＡ、ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ１８００−１３で
ある。この形質転換体のポリガラクチュロナーゼ活性を
異る増殖培地を用いて受容細胞の活性と比較し、第８表
に示す。
］−」Ｌ−表 Ｇ１９１／ ｐＧＷ６３５−１ ３　　％ グルコース １％Ｎ＋！、Ｃｊ！ ｏ、ｄ。
Ｇ　１９１／ ｐｌＪ１８００−１３ ３　％ グルコース １％Ｎ８４Ｃｊ！ Ｇ１９１／ ｐＨＪ１１８００−１３ １％ペクチン＋　１％ＮＢ４Ｃｆｆｉ　　４０１％甜菜
パルプ １％ペクチン＋　１％Ｎ８４Ｃ１４０ １％甜菜バルブ む、ｄ。
形質転換体Ｇ　１９１／ｐ（Ｊ１８００−１３はペクチ
ン基質の存在下で高レベルのＰＧＩ［を合成するので、
他のＡ、ニドランス形質転換体のＰＧＩ［生産もさらに
分析する。この目的のため、１９個の形質転換体及びＣ
；１９１／ｐＧＷ６３５−１を、窒素源としての０．４
％Ｎｌｌ４Ｃ１及び炭素源としての５％グルコースを用
いる最少塩培地からなる培地にリン酸塩を高濃度に加え
て（１５ｇ　／　ｊ！　ＫＨ！ＰＯ４）培養する。４６
時間後及び６９時間後に培養濾液を得、そして次にこれ
らを、あらかじめ濾液の濃縮及び透析を行うことなく、
ウェスタンブロッティング及びモノクローナル抗体によ
るブロービングにより分析する。１９株のＡ。
ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ１８００の形質転換体の内
生なくとも１７株がグルコース培地でＰＧＩ［を合成し
、他方Ａ、ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ６３５−１では
シグナルが得られない、明瞭なシグナルが得られるとい
う事実は、実施例５．５．に記載したようなポリガラク
チュロナーゼ誘導条件下で増殖したＡ、ニガーＮ４０２
に比べて高い発現レベルを暗示する。なぜなら、未濃縮
濾液及びモノクローナル抗体を用いる場合、非形質転換
株の培養濾液のウェスタンプロット上で弱いＰＧＩＩシ
グナルのみが得られるからである。炭素源として５％グ
ルコースの代りに１％甜菜パルプ＋１％ペクチンを含む
上記の培地を用いてＡ、ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ１
８００−１３及び６個の他のＧ１９１／ｐＧＷ１８００
形質転換体のＰＣＩ［生産を前記のようにして分析する
。Ａ、ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ１８００−１３とは
対照的に、これら６個の形質転換体はペクチン及び甜菜
バルブを含有する培地でより多くのＰＧｎを生産するが
、やはりＡ。
ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ６３５−１についてはシグ
ナルは見出されない。
同時形質転換プラスミドとしてｐｌＪ１９００を用いて
、実施例９．２．に従って得られた形質転換体を２種類
の異る培地上で増殖せしめる。第一の培地は、ＮＨ，Ｃ
１（４，０ｇ＃り　　、　１％（ｗ／ｖ）リンゴペクチ
ン（ｄ、ｅ、６１．２％）及び１％（Ｗ／Ｖ）甜菜バル
ブを添加した高リン酸塩最少塩培地から成り、幾つかの
形質転換体はさらに、窒素源としてＮＨ４Ｃｆの代りに
尿素（４，２ｇ／ｊりを含むこの培地中で増殖せしめる
。前の低リン酸塩最少培地との相違は、１２当り１．５
ｇではなく１５ｇのＫＨｚＰＯ４を使用することである
。第二の培地もまた高リン酸塩最少塩培地から成り、こ
れに窒素源及び炭素源としてＮＨｎＣｊ！　（１０ｇ／
　ｌ　）及び３％（ｗ／ｖ）グルコースが添加されてい
る。いずれの培地にも２■／ｉのｐ−アミノ安息香酸が
添加される。ガレンカンプ回転振とう機２５０ｒｐ−を
用いて培養物を３０″Ｃにて４２時間増殖せしめ、そし
て培養濾液のサンプルを２０時間後及び４２時間後に採
取する。形質転換体と類似の条件下で増殖したＡ、ニド
ランスＧ　１９１のウェスタンプロットにおいて、精製
されたポリガラクチュロナーゼＩに対して生じたポリク
ローナル抗体と交叉反応する蛋白質はほとんど又は全く
検出されない、形質転換体の７５％の培養濾液において
、ＰＣＩが有意なレベルで観察される。
複合培地中でやはり高リン酸塩、及び尿素ではなく　Ｎ
Ｈ，Ｃ１を用いることにより、生産されるポリガラクチ
ュロナーゼＩの蛋白質分解的破壊がかなり低下する。ウ
エスタンプロツテイニグの結果及び活性測定に基き、形
質転換体Ｇ　１９１／　ｐＧＷ１９００−６は、第６表
に示すように！当り１ｇを超える酵素を生産すると真定
される。なぜなら、ＰＧＩＯ比活性は５．５０ｔＬ／ｗ
である（Ｋｅｓｔｅｒ及びＶｉｓｓｅｒ、　１９９０年
）からである。
】−」Ｌ−表 ｎ、ｄ、＝検出不能。
それぞれポリガラクチュロナーゼｌ及び■をコードする
ｍｌ及び」μ■遺伝子は、高遺伝子量を含む多コピー形
質転換体においてさえ、グルコース含有培地上Ａ。ニガ
ーにおいては発現されない。
しかしながら、それぞれＧ　１９１／　ｐＧＷ１９００
−６株及びＧ　１９１／ｐＧＷ１９００−１０株並びに
Ｇ１９１／ｐＧＷ１８００−１３及びＧ　１９１／　ｐ
ＧＷ１８００−２０株のごときＡ、ニドランス形質転換
体におけるこれらのＡ、ニガー遺伝子の発現は、Ａ、ニ
ドランスにおいてはこれらの遺伝子のカタボライト抑制
が妨害されていることを示している。このことは、これ
らの異るアスペルギルスの種間でカタボライト抑制系の
異る特異性を暗示する。これを、宿主自身のポリガラク
チュロナーゼの発現を回避する条件下でＡ、ニドランス
のごとき異る宿主において特定のＡ、ニガーポリガラク
チュロナーゼ遺伝子を発現させるために用いることがで
きる。こうして得られるポリガラクチュロナーゼ酵素は
特に純粋である。
Ａ、ニドランスＧ１９１／ｐＧＷ１８００−１３形質転
換体を、１．５ｇ／ｊ！ではなく　１５　ｇ　／　１　
ノＫＨ＊ＰＯａを用いる点を除き実施例５．３．に記載
した組成の１％甜菜パルプ＋１％ペクチン培地で１００
ｉｄの培養において増殖せしめる。同様に、この形質転
換体を低リン酸レベル及び高リン酸レベルで、炭素源と
して５％又は１％グルコースを用いる最少培地において
、増殖せしめる。これらの培地はＡ。ニガーＮ４０２に
おいては検出可能なポリガラクチュロナーゼ■を導かず
、Ａ、ニドランスＧ１９１自体は実施例９．３．に記載
したようにＰＧｎを生産することができない。
５％グルコース及び高リン酸塩を用い７２時間後に採取
したＡ、ニドランスＧ　１９１／　ｐＧＩＩ１１８００
−１３形質転換体の培養濾液のサンプル中には約８６０
　Ｕ　／ｄのＰＧ活性が見出され、他方低リン酸塩を用
いた場合この量は５５０　Ｕ　／　ｄである。１％グル
コース及び高リン酸塩を用いる場合に観察される低下し
たレベルは主として、４８時間後に炭素源が消耗された
場合の蛋白質のターンオーバーの増加によるものである
。１％グルコース及び低リン酸塩の場合、生産レベルは
全培養期間を通じて低いままである。５％グルコース及
び高リン酸塩を用いて培養濾液１２当りに得られる蛋白
質の量は約１ｇ／ｌである。ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動が示すところによれば、形質転換体の培養
濾液は、Ａ、ニガーＰＧＩＩに相当する分子量の１個の
蛋白質バンドを含む。
約４．９のｐＨ値を有する培養濾液（約２ｆ）を蓋留水
により５倍に稀釈し、そして次に２ＮＮａＯＨによりｐ
Ｈ６，０にする。酵素を濃縮するため、この溶液を、高
流速を可能にするためにブフナー漏斗に収容された、２
０−Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中で前平衡
化された６００ｊｌｌ！の５ｅｐｈａｄｅｘＤＩ！ＡＵ
−Ａ５０に付加する。すべての酵素活性がこのイオン交
換材料に吸着され、そして同じ緩衝液中ＩＭＮａＣｊ！
での溶出により３００１ｄに集められる（収率６５％）
０次に、この酵素溶液を１Ｏ−ＰＩ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ６，０）に対して透析し、そして同じ緩衝
液中で平衡化された５ｅｐｈａｓｏｓ　ＤＥＡＨＦａｓ
ｔ　Ｆｌｏｗカラム（ベツドボリウム６０＋ｄ）上に付
加する。緩衝液中θ〜０．５ＭＮａＣｊ！グラジェント
を適用することにより酵素活性はおよそ０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣｊ！において溶出する（総回数率５７％）。
実施例１０．２．に従って精製されたＰＧＩ［を、実施
例１．１．に記載したようにしてラビターゼ（Ｒａｐｉ
ｄａｓｅ）から精製した酵素（ＰＧ　ＩＩ−ケース）と
比較した。両酵素は５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上
で３８ｋＤａの同一の見かけ分子量を有し、そしてこれ
らはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（実施
例６．４．を参照のこと）と同様に反応する０等電点電
気泳動の際、Ａ、ニドランス形質転換体によって生産さ
れそして実施例１０．２．に従って精製されたＰＧＩ［
はＡ、ニガーにより生産された酵素に比べて非常に低い
マイクロヘテロゲナイテ４−　（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒ
ｏｇｅｎｉ　ｔｙ）を示す。なぜなら、主バンド（ｐ１
５．２）のほかにわずか１個の弱小バンドが見られるか
らである。
改変されたフェリシアニド試験を用い０．２〜１■／ｄ
の間でポリガラクチュロナーゼ濃度を変えながら２５℃
にて０．０７５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，２）中でポ
リガラクチュロナーゼ活性を測定することにより、両酵
素の力学的性質を比較した。ハビダーゼからのＡ、ニガ
ーＰＧＩ［についてはＶｓａｘは２、７６０　Ｕ　／■
蛋白質であり、Ｋｓｅは０．８■／ｄポリガラクチユロ
ネート（ＵＳＢ）である、形質転換体由来のＰＧＩＩに
ついては、Ｖ　ｗａｘはわずかに高くて３４．８００Ｕ
／ｄであり、そしてに鴎は同一である。
最後に、Ａ、ニドランス形質転換体から精製されたＰＧ
ｎを実施例１．３．（ＰＧＩＩ−ケース）に従ってシア
ノゲンブロミドで処理した。これは、ラピダーゼから精
製されたＰＧＭについて観察されたのと同し断片のパタ
ーンを導く。
ｐＧ％１１７５６　（実施例３．１０．）を用い、選択
ベクターとしてｐＧＷ６ａｓ　（実施例５８２．を参照
のこと）を用いてＡ、ニガーＮ５９３を形質転換する。
無作為に拾い上げた８個の形質転換体を精製し、そして
更なる分析のために使用する。これらを、塩化カンモニ
ウム（４，０ｇ／Ｊり、１％ペクチン（ｄ、ｅ、６１．
２）及び１％の乾燥され且つ粉砕された甜菜パルプを添
加した液体最少塩培地で、実施例５．５．に記載したよ
うにして増殖せしめる。ＰＧ■特異的抗体を用いるウェ
スタンプロットにより、形質転換体の培養濾液へのｐｃ
ｎの過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）が示さ
れる。２個のｐｃｎ過剰生産性形質転換体（Ｎ　５９３
／ｐＧＷ１７５６−６及びＮ　５９３／　ｐＧＷ１７５
６−７）を選択し、そしてこれらの株及び対照株Ｎ４０
２（実施例５．５．を参照のこと）をやはり前記の条件
を用いて増殖せしめる。接種後４４時間で培養濾液を得
、そして粗濾液中のポリガラクチュロナーゼ活性を記載
されている（参考文献２）ようにして決定し、この場合
、酵素反応混合物は５０−Ｈ酢酸ナトリウムを用いてｐ
Ｈ４，８に緩衝化する。
結果が示すところによれば、ｐＧＷ１７５６上の■ＩＩ
遺伝子は機能的であり、そしてこのプラスミドを用いて
Ａ、ニガーを形質転換してポリガラクチュロナーゼ活性
を過剰生産することができる。
実施例９．２．において記載したように、Ａ、ニドラン
スＧ１９１をウリジン原栄養性に形質転換するために設
計された実験において、Ａ、ニガーＮ４００のツ巳Ｃ遺
伝子を担持するプラスミドｐＧＷ１９１０を同時形質転
換プラスミドとして使用する。得られた形質転換体１０
株を純化し、そして次にこれらを用いて、さらに分析す
るために胞子を増加せしめる。
これらの株及びＧ１９１／ｐＧ％１６３５−１を、２■
／ｄのｐ−アミノ安息香酸、窒素源としての４．０ｇ／
ｌのＮＨ，ＣＩ！並びに炭素源としての１％甜菜バルブ
及び１％ペクチンが補充されておりそしてリン酸塩が高
濃度で添加されている（１５ｇ／ｊ！のＫＨｚＰＯ４）
液体最少基壇地中で増殖せしめる。接種は１６６胞子／
ｄでありそしてインキュベーシヨンは３０℃にてガレン
カンブ回転振とう機中で２５０ｒｐ−で行う。
接種の後６５時間で培養濾液を得、そして次に濾液をあ
らかじめ精製又は濃縮することなく分析する。
ＰＣＩ及びＰＧＩＩ（実施例ｉ、　Ｚ　＞に対して生じ
た抗体の混合物と共にウェスタンプロットをインキエベ
ートする。　０．２５％のガラクチユロン酸（ＵＳＢ　
）を含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｔ１４．８）中で
活性測定（参考文献２）を行う。
ウェスタンブロッティングによれば、得られた形質転換
体のほとんどが多量のポリガラクチュロナーゼＣ（ＰＧ
Ｃ）を生産する。この結果は、形質転換体及び対照株（
ｐＧＷ６３５により形質転換されたＡ。
ニドランスＧ　１９１）の上清中のＰＣ活性を測定する
ことにより確認される。
１！　１　、ｆｆｌ　ＩＩ及び里Ｃ遺伝子に加えて、Ａ
。
ニガーのポリガラクチュロナーゼ遺伝子群の他の構成を
用いてＡ、ニドランスを形質転換する。本寞施例におい
ては、ファージλ中のクローンを使用しプラスミドベク
ター中のそのサブクローンは使用しない。
実施例３．５．に記載したようにしてプレート溶解物か
らファージλＤＮＡを調製し、そして次にフェノール及
びクロロホルムにより再度抽出する。同時形質転換のた
め２０ｘのλＤＮＡを使用し、そして同じクラスの２つ
のファージ（例えばλＰＧ−Ａ４３と組合わせたλＰＧ
−ＡＩＯ１又はλＰＧ−Ｄｌｌと組合わせたλＰＧ−０
８）からＤＮＡをおよそ等量得る。Ａ、ニドランスＧ１
９１の同時形質転換を実施例９．２．に記載したように
して行い、対照は今回は別々にｐＧＷ１９００及びλＰ
Ｇ　Ｉ−７を用いる同時形質転換を含む、上記のように
して調製したλフアージＤＮＡを使用する場合、塩化セ
シウムグラジェント中のバンド形成により精製したプラ
スミドＤＮＡに比べて形質転換頻度が低い。
有意義な形質転換体を純化し、そして実施例１２゜にｐ
ＧＷ１９１０形賞転換体について記載したようにして分
析する。この場合は、形質転換体はまた炭素源として３
％のグルコ−、スを含有する培地（高リン酸塩、０．１
％酵母エキス、１％塩化アンモニウム）にも増殖せしめ
る。
形質転換体Ａ、ニドランスＧ　１９１／λ＾−１及びＧ
　１９１／λＤ−１はそれぞれクラスＰＧ−Ａ及びＰＧ
−Ｄファージを用いて前記のようにして得られた。接種
の後６５時間目における甜菜パルプ／ペクチン培地の培
養濾液中のポリガラクチュロナーゼ活性は対照株Ｇ１９
１／ｐＧＷ６３５−１の場合より有意に高かった。
従って、クラスＡ及びＤファージ中に存在する四■関遅
配列はポリガラクチュロナーゼ活性を有する蛋白質をコ
ードしている。ウェスタンプロットに基いて、これらの
遺伝子生成物であるそれぞれポリガラクチュロナーゼＡ
及びポリガラクチュロナーゼＤはＰＧＩに類僚する電気
泳動移動度をもって移動することが結論される。
Ａ、ニドランスＧ１９１／λＡ−１は炭素源としてグル
コースを含有する培地においてもポリガラクチュロナー
ゼＡを生産する。
同時形質転換実験のため、約２０ｔａｒのプラスミドＤ
ＮＡであるｐｃ　ｎ　−ＩＦＮ　ＡＭ１１９又は９Ｇ　
ＩＩ　５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭＩＩ≦を使用する。実施例９
．２．に記載したようにしてＡ。
ニドランスＧ　１９１の同時形質転換を行う。
有意義な形質転換体を精製しそして実施例８．４゜にお
いて形質転換体について記載したようにして分析する。
この場合、形質転換体を炭素源として３％グルコースを
含有する培地（高ホスフェート、０．１％酵母エキス、
１％塩化アンモニウム）においても増殖せしめる。
種々の時間（２０時間毎）にサンプルを採取し、遠心分
離により細胞をベレット化し、そして凍結及び解凍によ
り破壊する。上清及び細胞抽出物の両者を前記のように
してインターフェロン活性について試験する。　ｐＧ　
ｎ　５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９を担持する形質転換体に
おいては多量のインターフェロン活性が培地中に分泌さ
れ、他方ｐＧｎ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９を担持する形質転
換体においてはそれは主として細胞抽出物中に存在する
。唯一の炭素源としてグルコース使用される場合にＡ、
ニドランスはｐＧ■−ＩＦＮＡＭ１１９又はｐｃ　ｎ　
５ｓ−ＩＦＮ　ＡＭ１１９から［ＦＮを生産することを
示している。
Ａ、ニガーポリガラクチュロナーゼ類の軟化（＋５ａｃ
ｅｒａｔｉｏｎ）活性を測定するためにキュウリの組織
の細胞分離を用いる。地方の食品店からキュウリを購入
し、そして次に、エタノールに浸したティシェペーパー
にふくことにより又はジャヘルＵａｖｅｌ）水（食品銘
柄、０．５％次亜塩素酸ナトリウムに稀釈）に１時間浮
べることにより表面を無菌化する０次にキュウリを切り
きざみ、スライスの軟い内部を除去する。得られるスラ
イスの内の２個を、ポリガラクチュロナーゼがあらかじ
め添加されているか又は添加されていない軟化緩衝液２
５−を収容した１００ａｆのエルレンマイヤーフラスコ
に入れる０次に、３０℃に調節された水浴中での穏やか
な一方向振とうにより２４時間インキュベージ！ンを行
う０次にフラスコを視覚観察する。完全な軟化は次の基
準に合致する：　（ｉ）巨視的観察において、キュウリ
の皮が付着組織を実質的に含まない；（ｉｉ）軟化緩衝
液が非常に濁る；　（ｉｉ）顕微鏡観察により判定する
場合に無傷のように見える遊離細胞の高い比率により示
されるように、細胞の分離と軟化緩衝液の高い濁度との
間に正の関係が存在する。
実施例１．に記載したようにして調製したポリガラクチ
ュロナーゼ■及びポリガラクチュロナーゼＩを異る緩衝
液中で試験する。軟化緩衝液Ａ　（ＮＢＡ　）は５０−
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）である、軟化緩衝液Ｂ
　（ＭＢＢ）はリン酸−クエン酸緩衝液〔イシイ（１９
７６）、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　６６、２８１
−２８９頁〕である。
ＭＢＢは、０．１　Ｍクエン酸溶液及び０．１　Ｍ　Ｎ
ａｔＨＰＯ溶液を目的ｐＨ値４．５が達成されるまで混
合することにより調製し、そして次に等容量の蒸留水を
加え、そして次に１０■／ｄのウシ血清アルブミンを用
いてウシ血清アルブミンを最終濃度１０■／２５ｍに加
える。
ＭＢＡ中１ａ＋ｇのポリガラクチュロナーゼ■を用いて
キュウリの組織が２４時間以内に完全に軟化される。こ
の緩衝液中でキュウリの組織はポリガラクチュロナーゼ
の非存在下又は１層のポリガラクチュロナーゼＩの存在
下では軟化しない、ＭＢＢ中でのキュウリの軟化をポリ
ガラクチュロナーゼの非存在下、又はＬｏｇのポリガラ
クチュロナーゼＩもしくはポリガラクチュロナーゼ■の
存在下で試験する。やはり、酵素の非存在下又はポリガ
ラクチュロナーゼＩの存在下では軟化は観察されないが
、ポリガラクチュロナーゼ■はキュウリ組織を完全に軟
化する。実施例１０．に従って製造されたＰＧＩ［もま
た軟化性を有する。
皇１文献 １、　　Ｒｏｇｇｂｏｕｔｓ、　Ｆ、Ｍ、、　Ｇｅｒａ
ｅｄｓ、　Ｃ，Ｃ，Ｊ、Ｍ、、　Ｖｆｓｓｅｒ＋Ｊ、及
びＰｉｌｎｉｋ、　Ｗ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｆｏｎ　ｏ
ｆ　ｖａｒｉｏｕｓｐｅｃｔｉｃ　ｅｎｚｙｔａｅｓ　
ｏｎ　ｃｒｏｓ３１ｉｎｋｅｄ　ｐｏｌｙｕｒｏｎｉｄ
ｅｓｉｎ　Ｔ、Ｃ，Ｊ、Ｇｒｉｂｎａｕ、　Ｊ、Ｖｉｓ
ｓｅｒ　ａｎｄ　Ｒ，Ｆｊ。
Ｎ１ｖａｒｄ（Ｅｄｓ）　　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｐｐ、２５５−２６（Ｌ　　１
９８２＋Ｅｌｓｅｖｉｅｒ＋　　Ａｍａｔｅｒｄａｓ　
　。
Ｒｏｚｉｅ＋　　Ｈ，、Ｓｏｍｅｒｓ、　　Ｗ、、　　
Ｂｏｎｔｅ＋　　ＬＩ　　Ｖｉｓｓｅｒ。
Ｊ、、　ｖａｎ’ｔ　Ｒｉｅｔ、　Ｋ、及びＲｏｓｂｏ
ｕｔｓ、　Ｐ、Ｍ、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、Ａ
ｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０．３４６−３５８　ｍＲ
ｏｂｙｔ＋　Ｊ、Ｆ−＋　Ａｃｋｅｒｓａｎ、　Ｒ，Ｊ
、及びＫｅｎｇ、　Ｊ。
Ｇ、（１９７３）、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、４５
．５１７−５２４　。
Ｍａｔｓｕｄａｒａｉ＋　　Ｐ、（１９８７）＋　　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ４旦？。
１００３５−１００３８　。
Ａｍｏｎｓ＋　　Ｒ，（１９８７））　　Ｖａｐｏｒ−
ｐｈａｓｅ　　ｅｅｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　５ｕ
ｌｆｈｙｄｒｙｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ＋　　ＦＢＢＳＬｅｔｔｅｒｓ　２１２＋　　６８
−７２　ｍＭａｎｉａｔｉｓ＋　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ＋　Ｅ、Ｆ、及び５ａｓｂｒｏｏｋ＋Ｊ、、　　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　　ａ　　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　ｍａｎｕａＬＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）
　　＊Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、Ｄ、及びＤａｖｉｓ＋　Ｒ
Ｊ、（１９７７）、　５ｃｉｅｎｃｅ１９６、　１８０
−１８２　。
Ｃａｒｕｔｈｅｒａ、　　Ｍ、Ｈ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
　ａｎｄ　　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　
　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　　：　　
ａ　　ｌａ−ｈａｚａｔｏｒｙｍａｎｕａＬ　　Ｖｅｒ
ｌａｇ　　Ｃｈｅｍｉｅ（１９８２）　　。
９゜ １０゜ １１゜ １２゜ １３゜ １４゜ １５゜ １６゜ Ｆｒｔｓｃｈａｕｆ、　　Ａ、Ｍ、＋　　Ｌｅｈｒａｃ
ｈ、　　Ｈ−＋　　Ｐｏｕｓｔｒａ、　　Ａ。
及びＭｕｒｒａｙ、　Ｎ、（１９８３）、　Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、１７０．８２７−８４２゜ Ｄｅｎｔｅ、　Ｌ、及びＣｏｒｔｅｓｅ＋　Ｒ，（１９
８７）＋　？１ｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ＋　　ｖｏｌ、１５５　　ｐｐ、１１１−１１９　
　ｅＢＲＬ＋　　Ｎ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ／ｄｉｄｅｏ
ｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　１ｎａｔ−ｒｕＣｔｉＯ
ｎ　５ａｎｕａｌ。
１１ｏ１ｓｓ、　Ｄ、Ｓ、及びＱｕｉｇｌｅｙ＋　Ｍ、
（１９８１）、　Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４．　１９３　　。
Ｇｏｏｓｅｎ＊　　ｔ、ｌ　　Ｂｌｏｅｍｈｅｕｖｅｌ
、　ｃ、ｌ　　Ｇｙｓｌｅｒ、　Ｃｈ、。
ｄｅ　Ｂｉｅ、　　Ｄ、Ａ、、　　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂ
ｒｏｅｋ、　　ＨＪ、Ｊ、　　ａｎｄＳｗａｒｔ、　ｉ
［、（１９Ｂ７Ｌ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃａ
　ＩＬ４９９−５０３　。
Ｂｏｅｋｅ、　Ｊ、ｏ、ｔ　Ｌａｃｒｏｕｔｅ、　Ｆ、
及びＦｉｎｋ、Ｇ、Ｒ。
（１９８４）、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１９７
．３４５−３４６　。
Ｒｏｍｂｏｕｔｓ＋　Ｆ、Ｍ、及びＰｉｌｎｉｋ、　Ｍ
、（１９８０）、　ＰｅｃｔｉｃＥｎｚｙｍｅｓ、Ｉｎ
　　：　　Ａ、Ｂ、Ｒｏｓｅ（ｅｄ、）　　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ′Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｃｏｎ
ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｅｃｏｎｏｍｉｃ　　Ｍｉｃｒｏ−ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　　ｖｏｆ、５．　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
　Ｐｒｅｓｓ、　　ｐｐ、２２７−２８２゜０ｈｔｓｕ
ｋａ、　　Ｂ、＋　　Ｍａｔｓａｋｉ＋　　Ｓ、、　　
Ｉｋｅｈａｒａ、　　Ｍ。
１８゜ １９゜ ２０゜ ２１゜ ２２゜ ２３゜ Ｔａｋａｈａｓｈｉ＋　Ｙ、及びＭａｔｓｕｂａｒａ＋
　Ｋ、（１９８５）＋　Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２６０．　２６０５−２６０８　
　。
Ｐｈａｒｓａｃｉａ　　Ｔ７　　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　　ＴＭ　　Ｋｉｔ　　ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭａｎ
ｕａＬ　　ｐｐ−１−３５ｍ Ｙｅｌｔｏｎ＋　　Ｍ、Ｍ、、　　Ｈａｓｅｒ＋　　Ｊ
、Ｅ、　　及びＴｉ５ｂｅｒｌａｋｅ。
Ｗ、Ｅ、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８１゜１４７０−１４７４　。
Ｋａｒｎ＋　Ｊ、Ｉ　Ｂｒｅｎｎｅｒ、　ＳｅＩ　Ｂａ
ｒｎｅｆｆ、　Ｌ、及びＣｅ５ａｒｅｎｉ、　　Ｇ、’
（１９８０）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ７７、５１７２−５１７６　。
５ｌａｔｅｒ、　　Ｒ，Ｊ、（１９８４）　　ｉｎ　　
：　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ　　ｖｏｌ、２　　Ｂｄ、Ｊ、ＭＪａｌｋ
ｅｒ＋　　Ｔｈｅ　　ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ　　Ｉｎ
ｃ　。
Ｚｉｓｓｌｅｒ、　　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（１９７１）　
　ｉｎ　　：　Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｐｈａｇｅ
　Ｌａｍｂｄａ、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｓ。
Ｎｅ＠Ｙｏｒｋ、Ａ、Ｄ、Ｈｅｒｓｌｅｙ　ｅｄｉｔｏ
ｒ。
Ｄｅｎｔｅ、　Ｌ、Ｉ　Ｃｅ５ａｒｅｎｉ＋　Ｇ、及び
Ｃｏｒｔｅｓｅ、　Ｒ。
（１９８３）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１
１．　１６４５−１６５５　。
Ｄｅｎｔｓ、　　Ｌ、、５ｏｌｌａｚｚｏ、　　Ｍ、、
　　Ｂａ１ｄａｒｉ、　　Ｃ，、Ｇ。
Ｃｅ５ａｒｅｎｉ　　ａｎｄ　Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ　　
ｉｎ　　：　　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２４゜ ２５゜ ２６゜ ２７゜ ２８゜ ２９゜ ３０゜ ３１゜ ｖｏｌ、１．　　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏ
ａｃｈ　ｅｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ。
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　　０ｘｆｏｒｄ　１９８５゜Ｎ
ｏｒｒａｎｄｅｒ＋　Ｊ、、　Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ、及び
Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。
（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２６．１０１−１０６　。
Ｂｏｅｌ　Ｂ、、　　Ｈａｎｓｅｎ　Ｍ、Ｔ、＋　　Ｈ
ｊｏｒｔ　１．＋　　Ｈｏｅｇｈ　１．＋Ｆｉｉｌ　Ｎ
、Ｐ、（１９８４）、　ＥＭＢＯＪ、塁、　１５８１−
１５８５　。
Ｍｏｕｎｔ　Ｓ、Ｍ、（１９８２）＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０゜４５９−４７２　。
Ｂａ１ｌａｎｃｅ　Ｄ、Ｊ、及びＴｕｒｎｅｒ　Ｇ、（
１９８５）＋　Ｇｅｎｅ韮、　３２１−３３１　。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　　Ｈ，Ｃ，＆　　Ｄｏｌｙ　　Ｊ、
（１９７９Ｌ　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ
、ヱ、１５１３−１５２３　。
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ＋　　ｃ、Ｉ　　Ｖｉｅ
ｉｒａ＋　　Ｊ、　　ａｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ＋Ｊ、
（１９８５）　　Ｇｅｎｅ　３３．ｐｐ、１０３−１１
９゜Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ｌ　Ｃｒｅａ、　Ｒ，及び
Ｓｅｅｂｕｒｇ＋　Ｐ、Ｈ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９＋　　３０９
−３２０１９８１）ｅＲｅｎａｒｄ、　　Ｃ，Ｍ、Ｇ、
Ｃ，、Ｖｏｒａｇｅｎ＋　　Ａ、Ｇ、Ｊ、、　　５ｃｈ
ｏｌｓ＋Ｈ，Ａ、、５ｅａｒｌｅ−ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗ
ｅｎ＋　　Ｍ、Ｊ、Ｆ、＋　　Ｔｈ１ｂａｕｌｔ。
Ｊ、Ｐ、、　　Ｐｉｌｎｉｋ、　　Ｗ、＋（１９８９）
、　　Ａｐｐｌｅ　ｐｒｏｔｏｐｅｃｔｉｎ：ｐｒｅｌ
ｉｍｉｎａｒｙ　　５ｔｕｄｙ　　ｏｆ　　ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ　　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ。
３２゜ ３３゜ ３４゜ ３５゜ Ｉｎ　　：　　Ｊ、Ｐ、Ｒｏｏｚｅｎ、　　Ｆ、Ｍ、Ｒ
ｏｓｂｏｕｔｓ＋　　Ａ、Ｇ、Ｊ。
Ｖｏｒａｇｅｎ（ｅｄｓ、）　　：　Ｆｏｏｄ　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　：　Ｂａ５ｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ　ｆｏｒ　
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、　Ｐ
ＵＤＯＣ。
Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、　　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓ　。
Ｖｏｒａｇｅｎ、　　Ａ、Ｇｊ、（１９８９）　　：　
Ｆｏｏｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ　：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　　
ａｎｄ　　１１ｍ１ｔａｔｉｏｎｓ、　　Ｉｎ　　：　
　Ｊ、Ｐ、Ｒｏｏｚｅｎ。
Ｆ、Ｍ、Ｒｏｍｂｏｕｔｓ＋　Ａ、Ｇ、Ｊ、Ｖｏｒａｇ
ｅｎ（ａｄｓ、）　　：　ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ　：
　Ｂａ５ｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｆｏｒ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｇｒｅｓｓ、　ＰＵＤＯＣ，Ｗ
ａｇｅｎｉｎｇｅｎ＋　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒ−１ａｎ
ｄｓ　　。
Ｂｅ１ｄｓａｎ、　　ｃ、、　　Ｒｏｓ＋ｂｏｕｔｓ＋
　　Ｆ、Ｍ、、　　Ｖｏｒａｇｅｎ、　　Ａ。
Ｇ、Ｊ、＋　　Ｐｉｌｎｉｋ、　Ｈ，（１９８４）　Ｅ
ｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、旦、　５０３−５０７　。
Ｓｃｈｍｉｔｔ、　Ｊ、Ｊ、＋　及びＣｏｈｅｎ、　Ｂ
、Ｎ、（１９８３）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　　ｌ５
ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａ
ｇｓｅｎｔｓ　　ｆｒｏｍ　　ｌｏｗ−ｍｅｌｔｉｎｇ
　　ａｇａｒｏｓｅ　　ｂｙＥｌｕｔｉｐ−ａ　ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ａｎａ
ｌｙ−ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ１３３
ｅ　４６２−４　。
Ｈｏｒｔｏｎ、　　Ｒ，Ｍ、、　　Ｈｕｎｔ、　　Ｈ，
Ｄ、＋　　Ｈｏ、　　ｓ、ＬＩ　　Ｐｕ１ｌｅｎ。
Ｊ、に、、及びＰｅａｓｅ＋　Ｌ、Ｒ，（１９８９）、
　Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇｈｙｂｒｉｄ　ｇｅｎｅｓ　
ｗｉｔｈｏｕｔ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉ
ｃ−ｔｉｏｎ　　ｅｎｚｙｍｅｓ　　：　　ｇｅｎｅ　
　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　　ｂｙ　　ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔ
ｅｎｓｉｏｎ、　Ｇｅｎｅ　７’Ｌ　６１−６８　ｍ３
６、　Ｊ、ｔｌ、Ａ、＾、Ｕｉｔｚｅｔｔｅｒ（１９Ｂ
２）、　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｃａｒｂｏｎｍｅｔａ
ｂｏｌｉｓｍ　　ｉｎ　　ｗｉｌｄ　　ｔｙｐｅ　　ａ
ｎｄ　　ｍｕｔａｎｔｓ　　ｏｆＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕ
ｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ、ＰｈＤ　Ｔｈｅｓｉｓ、Ａｇｒ
ｉｃｕｌ−ｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗａｇ
ｅｎｉｎｇｅｎ、　　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒ−１ａｎｄ
ｓ　　＊ ３７、　　Ｂｏｗｅｎ＋　　Ｂ、＋　　Ｓｔｅｉｎｂｅ
ｒｇ　　Ｊ、、　　Ｌａｃｖ＋ｍｌｉ＋　　ＵＪ。
ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ，（１９８０）、　Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ旦。
１−２０゜ ３Ｂ、　Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、Ｍ、及びＧ１１ｂｅｒｔ
、　Ｍ、（１９８４）　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．１９９１
−１９９５　。
３９、　　ｗｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　　Ｇ、（１９８６
）＋　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
　１４．４６８３−４６９０　。
４０、　　Ａｕ５ｕｂｅ１．　　ｐ、Ｍ、ｌ　　Ｂｒｅ
ｎｔ、　　Ｒ，、Ｋｉｎｇｓｔｏｎｓ　　Ｒ，！、＋Ｍ
ｏｏｒｅ、　　Ｄ、Ｄ、、　　Ｓｍ１ｔｈ＋　　Ｊ、Ａ
、＋　　Ｓｅｉｄｍａｎ＋　　Ｊ、Ｇ。
及び５ｔｒｕｈ１．　Ｋ、（ｅｄｓ、）（１９Ｂ？）、
　ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　　ｉｎ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｃｈｉｃｈｅｓ
ｔｅｒ＋　　Ｂｒ１ｓｂａｎｅ。
Ｔｏｒｏｎｔｏ＊　　Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ。
４１．　Ｒａａｂｏｓｅｋ、　Ｊ、及びＬｅａｃｈ＋　
Ｊ、（１９８７Ｌ　Ｒｅｃｏｓｂｉ−ｎａｎｔ　ＤＮＡ
　　ｉｎ　ｆｉｌａａ＋ｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｉ：　
　ｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、　　
ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉ、３５７−３９３　ｅ４２、
　　Ｇｏｏｓｅｎ＋　　Ｔ、、　　Ｖａｎ　Ｈｎｇｅｌ
ｅｎｂｕｒｇ＋　　ｐ、ｌ　　Ｄｅｂｅｔｓ。
Ｆ、Ｉ　Ｓｗａｒｔ＋　Ｋ、ｌ　Ｂｏｓ、　Ｋ、、及び
Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｋ＋Ｈ，Ｗ、Ｊ、（１９８９
）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２１９．２８２−
２８８゜４３、５ｈａｐｉｒｏ、　Ｍ、Ｂ、、及びＰ、
５ｅｎａｐａｔｈｙ（１９Ｂ？）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５＊　７１５５−７１４１　＊４４
、　　Ｋ、Ｓ、Ｐｏｕｔａｎｅｎ（１９９０）、　　Ｃ
ｏｍｍｕｎｉｃａｔｅｄ　　ａｔ　　ｔｈｅ１９９”　
ＡＣＳ　Ｍｅｅｔｉｎｇ＋　　Ｂｏｓｔｏｎ　Ｍａｓｓ
、、　　Ａｐｒｉ１２２−２’Ｌ　　１９９０　；　　
Ａｂｓｔｒａｃｔ　９０　ｏｆ　　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌｕ
ｌｏａｅ＋Ｐａｐｅｒ　ａｎｄ　Ｔｅｘｔｉｌｅ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ。
！五ｍ１隻 下記の微生物及びファージがＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇｖｏｎ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
　　ｕｎｄ　　Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）。
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　１６＋　Ｄ−３３０
０Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されている。
Ｄ針雇　−！−五−旦一 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　５５
０５　１９８９年８月３０８ＪＭ１０９／　ｐＧＷ１８
００ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）０１５α
Ｆ’／ｐＧ匈１９００ １９９０年３月２１日 大腸菌（１！ａｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ＤＨ５
αＦ’　／ｐＧＷ１７５６ 大腸菌（Ｅ！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５
αＦ’　／ｐＧＷ１９１０ １９９０年５月１８日 １９９０年５月１８日 ｍ−１ｕｊ１−− ０５Ｍ 隘 −１ヨｉｌｌ 〔配列表〕 藍且ｌ豆１ 配列の型 配列の長さ 鎖の数 トポロジー 配列の種類 ヌクレオチド及び対応するペプチド 二本鎖 直鎖状 ｇｅｎｏ−１Ｃ 起源生物　： 直接実験源： 特　　　　徴： １−９０９　　： ９０１−９６３　　： アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ
ｇｅｒ）　Ｎ４００ プラスミドｐＧＷ１９００　（０３Ｍ５８６６）Ａ、ニ
ガーＮ４００プレプロ−ポリガ ラクチュロナーゼＩをコードする遺 伝子ｐｇａ　１ プロモーター領域 ＰＣＩシグナルペプチドコード領域 ＰＧＩブレブロー配列コード領域 成熟ＰＣＩコード領域 イントロン イントロン 終止コドン ３′−非コード領域、転写ターミネ ータ−領域の部分 説劉 （）　　ｒｌ Ｃく Ｅ−ＩＮ １４＋＋１ 　Ｕ 配置１１１１ 配列の型　：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：　３０３１ 鎖　の　数：二本鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類：　ｇｅｎｏｍｉｃ 起源生物　：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）　Ｎ　４００ 直接実験源；プラスミドｐＧＷ１８００　（ＤＳＩＩＩ
５５０５）特　　　＠：Ａ、ニガーＮ４００ブレプロー
ポリガラクチュロナーゼ■をコードする遺 伝子ｐｇａ　ｌｌ ｌ−１３５６：プロモーター領域 １３５７−１４１９　：　ＰＧ　ＩＩシグナルペプチド
コード領域１３５７−１４３７　：　ＰＧ　ｎプレプロ
−配列コード領域１４３８−２４９４　：成熟ＰＧＩＩ
コード領域１９８７−２０３８　：イントロン ２４９５−２４９７　：終止コドン ２４９８−３０３１　：　３　’−非コード領域、転写
ターミネ−ター領域の部分 Ｅ−ＩＱ、０ く　の　Ｈ Ｑ４＋−＋ ０　の Ｑ　＞ Ｅ−１（Ｊ Ｅ−１１： １浣 Ｑ　　Φ 一 く　Ｈ Ｑコ トΦ 一 〇のの く　・−〇 Ｑ工Ｈ Ｏ＞ 一 （りＣ！Ｉ 一 〇Φ Ｅ−１ｃ／） （Ｊｆｉ ｌ−１ Ｑく Ｉ＋論 〇− ＱＱ Ｅ−４１−１゜ 〇二〇 ＜Ｅ−１、−１ ｌ−Ｉづ ■〉 −ロ 淵ヘ ト− Ｅ＠　　コ ト　　■ 〇　− Ｑ　＞ 　Ｈ Ｑ トの く・Ｈ Ｏ工 Ｑ田 ＱＰ＠ ０く （Ｊ＄−ＩＱ ＜＞ｒ’＋ Ｅ−＋　Ｅ−＋　ｓ トΦ ト淵 Ｅ−４山 ＱＱ Ｆ：＠淵 ト山 りり ２．５ Ｌ）Ｌ＋ Ｑ山 ０００の １片斜 Ｑの ２、Ｉｆｉ Ｑの ２．５ 仁 の く ＬＡＬ＋＋１ ＞　マ ＱＱ、Ｌｍ ＜　の　ｎ Ｑ　＜　Ｈ □〕ＩＬ１１ ５りの型　： 列の長さ： の　　数： ポロジー： ５りの種類： １生物　： （実験源： 徹ニ ＝０−９５２ −１０−９７０　　： １−２０２７： シ０−１５７１　Ｆ ヌクレオチド及び対応するポリペプ チド 二本鎖 直鎖状 ｇｅｎｏｍｉｃ アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌｌｕｓｎ
ｉｇｅｒ）ＮＷ７５６ ｐＧＷ１７５６　（ＤＳＭ５９４２） Ａ、ニガーＮＷ７５６プレブローボリガラクチユロナー
ゼ■をコードする遺 伝子ｐｇａ　ＩＩ プロモーター領域 ＰＧＩＩシグナルペプチドコード領域 仮定的ＰＧＩ［プレプロ−配列コード領域 仮定的成熟ＰＧｎコード領域 イントロン 終止コドン ２０３１−３０４７　：　３　’ 一非コード領域、 転写ターミネ ーター領域の部分 トー Ｑ　〉 ＜　Ｈ 訣浣 訣−冒 リ− ＜　ト く　ト Ｕ　　ニー く　ト 〜　　−） ト　ト 訣ご葛 ＜　９ １（Ｌ＃ Ｑ　＜ Ｅ−ＩＣ／） ｆ１１Ｌ１先 巳列の型　：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 巳列の長さ：　２３０４ イ　の　数：二本鎖 ポロジー：直鎖状 巳列の種類：　ｇｅｎｏｍｉｃ シ源生物　：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）　Ｎ４００ ＝接実験源：　ｐＧＷ１９１０（ＤＳＭ５９４３）＝　
　　　＠：Ａ、ニガーＮ　４００ブレブローポリガラク
チユロナーゼＣをコードする遺 伝子ｐｇａ　Ｃ １−６６２：プロモーター領域 ：６３−７１０　　：ＰＧＣシグナルペプチドコード領
域、６３−７８２　：仮定的ＰＧＣプレブロー配列コー
ド領域 ８３−１９９５：仮定的成熟ＰＧＣコード領域２７−１
００１　：イントロン ２８−１４８３：イントロン １６１４−１６６６　：イントロン １９９６−１９９８　：終止コドン １９９９−２３０４　：　３　’−非コード領域、転写
ターミネータ−領域の部分
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＣＩ［遺伝子の一部をコードする組換えＤ
ＮＡプローブＨＲ６１９５及びＨＲ６１９６とのハイブ
リダイゼーシゴンによりＡ、ニガーのゲノムライブラリ
ーから得られたファージλＤ及びλＥのＢｃｏＲＩ断片
の部分的制限地図である。数値は右手のＥＣＯＲ１部位
からのおよその距離をｋｂｐで示す。 第２図は、ｐＧＷ１８０００部分的制限地図であり、こ
のプラスミドはＡ、ニガーＮ４００ＰＧｎ遺伝子を含ん
で成るファージλＥから得られる４、　１　ｉ＜ｂｐの
Ｘｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ挿入部及びベクターｐＥ？ｔ
ＢＬ１８のＤＮＡを含有する。Ａｐはアンピシリン耐性
遺伝子であり、そして矢印はＡ、ニガー由来のＤＮＡを
示す。 第３図は、ｐＧＩｌｉ１９００の部分的制限地図であり
、このものはファージＰＧＩ−λ７のｓ、５ｋｂｐのＢ
ａｉ＊ｔｌ　Ｉ断片及びｐＵＣ９ベクターから構成され
ている。 第４図は、プラスミドｐＧＩ［−１ＦＮ　ＡＭ１１９及
びｐＧ■３．＝ＩＦＭ　ＡＭ１１９のクローニング方針
を示す。 第５図は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって
、それぞれｐｃ　ＩＩ　−ＩＦＮ　Ａ？１１１９及び９
Ｇ　ＩＩ　ｓｓ−ＩＦＮＡＭ１１９を作製するためのＤ
ＮＡ挿入部であるＤＮＡ　５及びＤＮＡ　６の段階的調
製方法を示す。 第６図は、ｐＧＷ１７５６の部分的制限地図を示す。 ｐＧＷ１７５６は、Ａ、ニガーＮＷ７５６ボリガラクチ
ユロナーゼ■遺伝子を担持する５、　５　ｋｂｐのＸｈ
ｏ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩｎ断片ベクターｐＥ？ＩＢＬ１
Ｂ中に挿入されたものである。該断片の以前のＸｈｏ　
Ｉ及びＢｇ１１１部位も示されているが、これらはベク
ターのそれぞれＳａｌ　Ｉ及びＢａｍＨ１部位での挿入
により破壊されている。 第７図は、ｐＧＷ１９１０の部分的制限地図である。 ｐＧＷ１９１０はλフ１−ジλＰＧ−Ｃ２０の７．８　
ｋｂｐのＢｇｌ　ｎ断片がベクターｐｕｃ　９のＢａａ
＋Ｈ１部位に挿入されたものである。 図面の浄書（内容に変更なし） オ ゴＡ い ＣＲ１ Ｂａ−１− ＾＾Ｃｆ：ＡＧＧＡＴＣＣＡＧｌ；ＧＴＣＣＣＴＡＧＩ
ＶＥ！ ＣＩ 第 図（”＋す１） オ ゴＤ い ＣＲ１ 第 図　し７０２） ＮＡ にオ ゴＡ い ＰＣＲ＋ １；ＩＶＥ’Ｓ 成熟ＩＦＮ−＾１１１１９コード領域の５°末端とＰＧ
Ｉ１の第一メチニオンとの完全シＩＶＥＳ 第 図（セ→） 【イン−フレーム融合 なイン−フレーム融合 （ＤＭＡ　５） （ＤＭＡ　６） 第 医 第 図 手 続 補 正 書（方式） 事件の表示 平成２年特許願第２２８４８５号 ２゜ 発明の名称 真核生物発現系 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）ｐＧＷ１８００又はｐＧＷ１９００のアスペル
    ギルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥￥ｎｉｇ
    ｅｒ￥）ＤＮＡ挿入部、ｂ）前記ａ）のＤＮＡ挿入部に
    含まれる成熟ＰＧII又はＰＧ I のコード領域にハイブ
    リダイズし、そしてガラクチュロナーゼ又はポリガラク
    チュロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子並
    びに場合によってはプロモーター、シグナルもしくはリ
    ーダーペプチドのためのコード領域及び／又は転写ター
    ミネーターを含んで成るＤＮＡ配列、ｃ）前記ａ）又は
    ｂ）において定義されたＤＮＡ配列の誘導体、又は ｄ）成熟ＰＧ又はそのシグナルペプチドもしくはリーダ
    ーペプチドをコードし、そして前記ａ）、ｂ）又はｃ）
    のＤＮＡ配列に関して遺伝子コードの意味において縮重
    しているＤＮＡ配列、 から選択されたＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分
    子。 ２、ｐＧＷ１８００又はｐＧＷ１９００のアスペルギル
    ス・ニガーＤＮＡ挿入部を含んで成る、請求項１に記載
    の組換えＤＮＡ分子。 ３、ｐＧＷ１８００又はｐＧＷ１９００のＤＮＡ挿入部
    に含まれる成熟ＰＧII又はＰＧ I のコード領域にハイ
    ブリダイズし、そしてガラクチュロナーゼもしくはポリ
    ガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチド及び／又
    はシグナルもしくはリーダーペプチドをコードし、そし
    て／又はプロモーター及び／又は転写ターミネーター活
    性を有するＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１に記載の
    組換えＤＮＡ分子。 ４、ｐＧＷ１８００もしくはｐＧＷ１９００のアスペル
    ギルス・ニガーＤＮＡ挿入部の誘導体、又はｐＧＷ１８
    ００もしくはｐＧＷ１９００のＤＮＡ挿入部に含まれる
    成熟ＰＧIIもしくはＰＧ I のコード領域にハイブリダ
    イズし、そしてガラクチュロナーゼもしくはポリガラク
    チュロナーゼ活性を有するポリペプチド及び／又はシグ
    ナルもしくはリーダーペプチドをコードし、そして／又
    はプロモーター及び／又は転写ターミネーター活性を有
    するＤＮＡ配列の誘導体を含んで成る、請求項１に記載
    の組換えＤＮＡ分子。 ５、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−Ｂ
    ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ３
    ７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８、
    −Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３、
    ｐＧＷ１７５６、ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐ
    ＧＷ１９００並びにｐＧＷ１７５６から成るベクターの
    群から選択されたベクターの挿入部又はその断片を含ん
    で成る、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６、ｐＧＷ１８００もしくはｐＧＷ１９００のＡ．ニガ
    ー（￥Ａ．￥￥ｎｉｇｅｒ￥）挿入部に由来するＤＮＡ
    断片、あるいは前記ＤＮＡ挿入部の１つに含まれる成熟
    ＰＧIIもしくはＰＧ I のコード領域にハイブリダイズ
    し、構造遺伝子及び／又はリーダーもしくはシグナルペ
    プチドをコードし、そして／又はプロモーター及び／又
    はターミネーター活性を有するＤＮＡ配列、を含んで成
    る、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ７、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−Ｂ
    ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ３
    ７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８、
    −Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３、
    ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００並び
    にｐＧＷ１７５６から成るベクターの群から選択された
    ベクターの挿入部に由来するプロモーター活性を有する
    ＤＮＡ断片を含んで成る、請求項６に記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。 ８、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−Ｂ
    ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ３
    ７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８、
    −Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３、
    ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００並び
    にｐＧＷ１７５６から成るベクターの群から選択された
    ベクターの挿入部に由来するリーダーペプチドをコード
    するＤＮＡ断片を含んで成る、請求項６に記載の組換え
    ＤＮＡ分子。 ９、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−Ｂ
    ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ３
    ７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８、
    −Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３、
    ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００並び
    にｐＧＷ１７５６から成るベクターの群から選択された
    ベクターの挿入部に由来するシグナルペプチドをコード
    するＤＮＡ断片を含んで成る、請求項６に記載の組換え
    ＤＮＡ分子。 １０、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−
    Ｂ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ
    ３７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８
    、−Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３
    、ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００並
    びにｐＧＷ１７５６から成るベクターの群から選択され
    たベクターの挿入部に由来する転写ターミネーター活性
    を有するＤＮＡ断片を含んで成る、請求項６に記載の組
    換えＤＮＡ分子。 １１、λＰＧ−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ４３、−Ｂ４、−
    Ｂ３５、−Ｂ３６、−Ｃ１、−Ｃ１６、−Ｃ２０、−Ｃ
    ３７、−Ｄ８、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｅ６、−Ｅ３８
    、−Ｆ５、−Ｇ１７、−Ｇ２７、−Ｘ３１及び−Ｙ３３
    、ｐＧＷ１９１０、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００並
    びにｐＧＷ１７５６から成るベクターの群から選択され
    たベクターの挿入部に由来し、ガラクチュロナーゼもし
    くはポリガラクチュロナーゼ又はガラクチュロナーゼ活
    性もしくはポリガラクチュロナーゼ活性を有するその断
    片の構造遺伝子をコードするＤＮＡ断片を含んで成る、
    請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。 １２、発現カセットである請求項１に記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。 １３、ハイブリドベクターである請求項１に記載の組換
    えＤＮＡ分子。 １４、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９００、ｐＧＷ１７５
    ６、ｐＧＷ１９１０、λＰＧ−Ａ９、λＰＧ−Ａ１０、
    λＰＧ−Ａ４３、λＰＧ−Ｂ４、λＰＧ−Ｂ３５、λＰ
    Ｇ−Ｂ３６、λＰＧ−Ｃ１、λＰＧ−Ｃ１６、λＰＧ−
    Ｃ２０、λＰＧ−Ｃ３７、λＰＧ−Ｄ８、λＰＧ−Ｄ１
    １、λＰＧ−Ｄ１２、λＰＧ−Ｅ６、λＰＧ−Ｅ３８、
    λＰＧ−Ｆ５、λＰＧ−Ｇ１７、λＰＧ−Ｇ２７、λＰ
    Ｇ−Ｘ３１及びλＰＧ−Ｙ３３から成るベクターの群か
    ら選択された請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子。 １５、ＰＧ生産性糸状真菌株から単離されるＰＧ又はそ
    の機能的断片のための遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子。 １６、アスペルデルス属の種から単離される請求項１５
    に記載のＤＮＡ分子。 １７、ｐＧＷ１８００、ｐＧＷ１９０Ｏ、ｐＧＷ１７５
    ６、ｐＧＷ１９１０、λＰＧ−Ａ９、λＰＧ−Ａ１０、
    λＰＧ−Ａ４３、λＰＧ−Ｂ４、λＰＧ−Ｂ３５、λＰ
    Ｇ−Ｂ３６、λＰＧ−Ｃ１、λＰＧ−Ｃ１６、λＰＧ−
    Ｃ２０、λＰＧ−Ｃ３７、λＰＧ−Ｄ８、λＰＧ−Ｄ１
    １、λＰＧ−Ｄ１２、λＰＧ−Ｅ６、λＰＧ−Ｅ３８、
    λＰＧ−Ｆ５、λＰＧ−Ｇ１７、λＰＧ−Ｇ２７、λＰ
    Ｇ−Ｘ３１及びλＰＧ−Ｙ３３から成るハイブリドベク
    ターの群から選択されたハイブリドベクターの挿入部、
    あるいは、ＰＧ遺伝子のプロモーター領域、又はシグナ
    ルペプチド、リーダーペプチド、プレプロ−ＰＧ、ＰＧ
    もしくはガラクチュロナーゼ活性もしくはポリガラクチ
    ュロナーゼ活性を有するＰＧ断片のコード領域、又はＰ
    Ｇ遺伝子の転写ターミネーター領域を含んで成る前記挿
    入部の断片、である請求項１５に記載のＤＮＡ分子。 １８、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項１
    ５に記載のＤＮＡ分子の製造方法であって、ａ）適当な
    真菌細胞からゲノムＤＮＡを単離し、所望のＤＮＡを例
    えばＤＮＡプローブを用いて又は適当な発現系を用いて
    選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスク
    リーニングし；あるいは ｂ）適当な真菌細胞からｍＲＮＡを単離し、所望のｍＲ
    ＮＡを例えばＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
    ンにより又は適当な発現系での発現により選択し、所望
    のポリペプチドの発現についてスクリーニングし、該ｍ
    ＲＮＡに相補的な単鎖ｃＤＮＡを調製し、次にそれから
    二本鎖ｃＤＮＡを調製し；あるいはｃ）ｃＤＮＡライブ
    ラリーからｃＤＮＡを単離しそして所望のｃＤＮＡを例
    えばＤＮＡプローブを用いて又は適当な発現系を用いて
    選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスク
    リーニングし；そして／あるいは、 ｄ）段階ａ）、ｂ）又はｃ）の二本鎖ＤＮＡを適当なベ
    クターに導入し； ｅ）得られたハイブリドベクターにより適切な宿主細胞
    を形質転換し； ｆ）所望のＤＮＡを含有する形質転換された宿主細胞を
    未形質転換宿主細胞から選択し、又は形質転換された宿
    主細胞を増加せしめ；そして必要であれば ｇ）所望のＤＮＡを単離しそして／又は該ＤＮＡをその
    変異体又は断片に転換する； ことを含んで成る方法。 １９、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子により形質転
    換された宿主。 ２０、請求項１９に記載の形質転換された宿主の製造方
    法であって、適当な宿主細胞を形質転換条件下で本発明
    の組換えＤＮＡ分子特に本発明のハイブリドベクターに
    より、場合によっては選択マーカー遺伝子と一緒に処理
    し、そして場合によっては形質転換体を選択する、こと
    を含んで成る方法。 ２１、ポリペプチドの製造方法であって、請求項１２に
    記載の発現カセット中に挿入されている構造遺伝子を適
    当な形質転換された宿主中で常法に従って発現せしめ、
    そして場合によっては該ペプチドを常法に従って単離す
    る、ことを含んで成る方法。 ２２、宿主としてアスペルギルス・ニガーの株を使用す
    る、請求項２１に記載の方法。 ２３、宿主としてアスペルギルス・ニドランス（￥Ａｓ
    ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥￥ｎｉｄｕｌａｎｓ￥）を使用す
    る、請求項２１に記載の方法。 ２４、前記構造遺伝子がハイブリドインターフェロンＢ
    ＤＢＢをコードしている、請求項２１に記載の方法。 ２５、前記構造遺伝子がガラクチュロナーゼ活性又はポ
    リガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
    ドしており、そして請求項１に記載のＤＮＡ配列に由来
    するものである、請求項２１に記載の方法。 ２６、ＰＧを粗原料から常法に従って精製することを特
    徴とする単一ＰＧの製造方法。 ２７、アスペルギルス・ニガーから得られた粗酵素混合
    物からＰＧを精製された形で製造することを特徴とする
    請求項２６に記載の方法。 ２８、請求項１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる
    単一ガラクチュロナーゼもしくはポリガラクチュロナー
    ゼ又はガラクチュロナーゼ活性もしくはポリガラクチュ
    ロナーゼ活性を有するその断片、及びそれらの生物学的
    に許容される塩。 ２９、請求項２８に記載のポリペプチド又はその任意の
    混合物を、場合によってはＰＧ活性以外の活性を有する
    １又は複数の酵素との所定の組合わせにおいて含んで成
    る酵素組成物。 ３０、請求項２８に記載のポリペプチド又は請求項２９
    に記載の酵素組成物を植物材料の加工において使用する
    方法。
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