JPS6224A - 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 - Google Patents
新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子(t−P
A)の新規な突然変異体に関するものである。これらの
突然変異体は、後述する様に、既に文献中に総括的に開
示されている。しかし、本発明の突然変異体は、他の研
究者によってなされた基本的なヒトープラスミノゲン活
性化因子分子を用いた研究や、セリンプロテアーゼ類、
トリプシンおよびキモトリプシンを用いたモデル研究の
結果からは予測し得ない活性を示す、新規で特異的なも
のである。
A)の新規な突然変異体に関するものである。これらの
突然変異体は、後述する様に、既に文献中に総括的に開
示されている。しかし、本発明の突然変異体は、他の研
究者によってなされた基本的なヒトープラスミノゲン活
性化因子分子を用いた研究や、セリンプロテアーゼ類、
トリプシンおよびキモトリプシンを用いたモデル研究の
結果からは予測し得ない活性を示す、新規で特異的なも
のである。
発明の背景
コレン(Co11en )らは、初めて、天然起源から
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子を実質上、純粋な形
で単離して同定し、プラスミノゲン活性化因子にとって
必要な活性の測定を行った(ヨーロッパ特許出願公開A
O41766,1981年12月16日公開、最初の
出願日、1980年6月11日)。
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子を実質上、純粋な形
で単離して同定し、プラスミノゲン活性化因子にとって
必要な活性の測定を行った(ヨーロッパ特許出願公開A
O41766,1981年12月16日公開、最初の
出願日、1980年6月11日)。
その後、譲受人の研究室において、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子に通常伴なっているタンパク質を、実
質上、含まない状態のt −PA’を、組換えDNA技
術を用いで生産することに成功した。この研究は化学の
学術文献およびヨーロッパ特許出願公開盃093619
(1983年11月9日公開、1982年5月5日出願
)に記載されでいる。上記の特許出願(EPO公開&0
93619)は、ヒトプラスミノゲン活性化因子の誘導
体、即ち、アミノ酸の置換、欠失、付加、あるいは、基
礎的fl D N Aに対する部位特異的突然変異誘発
による置換等により様々な修飾を受けている種々の誘導
体をも想定している。
ーゲン活性化因子に通常伴なっているタンパク質を、実
質上、含まない状態のt −PA’を、組換えDNA技
術を用いで生産することに成功した。この研究は化学の
学術文献およびヨーロッパ特許出願公開盃093619
(1983年11月9日公開、1982年5月5日出願
)に記載されでいる。上記の特許出願(EPO公開&0
93619)は、ヒトプラスミノゲン活性化因子の誘導
体、即ち、アミノ酸の置換、欠失、付加、あるいは、基
礎的fl D N Aに対する部位特異的突然変異誘発
による置換等により様々な修飾を受けている種々の誘導
体をも想定している。
上記出願で開示されでいる様に、ヒトプラスミノゲン活
性化因子(t−PA)は、−水路および二本鎖のいずれ
の形でも、存在しでいる。後者は前者のタンパク分解的
加水分解産物である。一本鎖形から2本鎖形へのタンパ
ク分解的変換は、フィブリン血餅(クロット)の溶解段
階に起きることが示された〔リツケン(Rijken
)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(J。
性化因子(t−PA)は、−水路および二本鎖のいずれ
の形でも、存在しでいる。後者は前者のタンパク分解的
加水分解産物である。一本鎖形から2本鎖形へのタンパ
ク分解的変換は、フィブリン血餅(クロット)の溶解段
階に起きることが示された〔リツケン(Rijken
)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(J。
Riot、 Chem、 ) 257.2920(19
82))。
82))。
プラスミノゲン活性化因子の活性は二本鎖形にあると考
えられているが、初期の報告では、一本鎖形のヒトc−
PA(!Jツケン、同上)や、一本鎖形のプロジン(p
rocine ) t −PA (ランビイ(Ranb
y )ら、トロンボ・レス(Thromb、Res、)
27 176(1982)) も幾分かの活性を有し
ているかもしれないと、指摘されていた〔リツケンら、
ビオシミ力・工・ビオフイジ力・アクタ(Biochi
m、Biophy、Acta ) 580 、140(
1979)をも参照〕。
えられているが、初期の報告では、一本鎖形のヒトc−
PA(!Jツケン、同上)や、一本鎖形のプロジン(p
rocine ) t −PA (ランビイ(Ranb
y )ら、トロンボ・レス(Thromb、Res、)
27 176(1982)) も幾分かの活性を有し
ているかもしれないと、指摘されていた〔リツケンら、
ビオシミ力・工・ビオフイジ力・アクタ(Biochi
m、Biophy、Acta ) 580 、140(
1979)をも参照〕。
しかしながら、その後の研究者達は、一本鎖形のt−P
A 製品には、少量の二本鎖形t−PAが不純物として
含まれていたことから、上記の如き一本鎖形の活性につ
いでの報告を放遂した〔アンドL/−セフ (Andr
easen ) ら、EMBOジャーナル、30.1
51 (1984):イチノセ(Ichinose )
ら、FEBS、 レターズ上75゜412(19
84))。これらの後続文献において、研究者達は、j
−PA等のセリンプロテアーゼは一本鎖形の不活性な酵
素原として発現され、このタンパク質が特異的な部位(
t−PAの場合は、275番目の位置にあるアルギニン
)で加水分解されて初めて活性となる、という一般的な
説を再確認している。
A 製品には、少量の二本鎖形t−PAが不純物として
含まれていたことから、上記の如き一本鎖形の活性につ
いでの報告を放遂した〔アンドL/−セフ (Andr
easen ) ら、EMBOジャーナル、30.1
51 (1984):イチノセ(Ichinose )
ら、FEBS、 レターズ上75゜412(19
84))。これらの後続文献において、研究者達は、j
−PA等のセリンプロテアーゼは一本鎖形の不活性な酵
素原として発現され、このタンパク質が特異的な部位(
t−PAの場合は、275番目の位置にあるアルギニン
)で加水分解されて初めて活性となる、という一般的な
説を再確認している。
ウサギおよび犬を用い、一本鎖プラスミノゲン活性化因
子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、フィブリン血
餅溶解活性のインビボでの比較研究がなされた。ウサギ
の場合、この酵素の2つの形における能力は同等である
ことが認められた〔コレンら、ジエイ・クリソ・インベ
スト(J、Cl1n。
子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、フィブリン血
餅溶解活性のインビボでの比較研究がなされた。ウサギ
の場合、この酵素の2つの形における能力は同等である
ことが認められた〔コレンら、ジエイ・クリソ・インベ
スト(J、Cl1n。
Invest、 ) 71 368 (1983) )
。しかし、犬に関して、同じモデルを用いて行った評価
では、二本鎖形のプラスミノゲン活性因子に比べて一本
鎖形のものの方がやや活性が低いことが報告されティる
〔コーニンガ−(Korninger ) ら、ジエ
イ・クリソ・インベスト(J、 C目n、 Inves
t、)69 573(198,2))。これらの研究報
告は、インビボにおけるフィブリン血餅の溶解能力にお
いて、一本鎖プラスミノーゲン活性化因子が、二本鎖プ
ラスミノーゲン活性化因子以上に優れていることはなく
、むしろ、実際には、劣っていることを示唆している。
。しかし、犬に関して、同じモデルを用いて行った評価
では、二本鎖形のプラスミノゲン活性因子に比べて一本
鎖形のものの方がやや活性が低いことが報告されティる
〔コーニンガ−(Korninger ) ら、ジエ
イ・クリソ・インベスト(J、 C目n、 Inves
t、)69 573(198,2))。これらの研究報
告は、インビボにおけるフィブリン血餅の溶解能力にお
いて、一本鎖プラスミノーゲン活性化因子が、二本鎖プ
ラスミノーゲン活性化因子以上に優れていることはなく
、むしろ、実際には、劣っていることを示唆している。
発明の要約
本発明は、ヒ) t−PAの新規な突然変異体であって
、驚ろくべきことに、コレンら(EPO公開AO476
6)によって最初に単離されたヒトt−PA、並びに前
記の組換え特許出願(EPO公開1093619)に示
されているt−PA分子と同等、あるいはそれ以上の活
性を示す突然変異体に関するものである。さらに詳しく
は、本発明は、ヒトt−PAアミノ酸配列の275およ
び276位(それぞれ、アルギニンおよびイソロイシン
によって占められている)付近の部位に、あるアミノ酸
置換を有する特異的な突然変異体に関するものである。
、驚ろくべきことに、コレンら(EPO公開AO476
6)によって最初に単離されたヒトt−PA、並びに前
記の組換え特許出願(EPO公開1093619)に示
されているt−PA分子と同等、あるいはそれ以上の活
性を示す突然変異体に関するものである。さらに詳しく
は、本発明は、ヒトt−PAアミノ酸配列の275およ
び276位(それぞれ、アルギニンおよびイソロイシン
によって占められている)付近の部位に、あるアミノ酸
置換を有する特異的な突然変異体に関するものである。
ある種の酵素的に活性な分子は、この(これらの)部位
(1または1以上)を認識しくおそらく、それと隣接し
でいる1またはそれ以上のアミノ酸と一緒に)、塩基性
アミノ酸の後方で機能的に加水分解して結合(特に、ア
ルギニン/イソロイシンおよびリジン/グリシン間)を
切り、その結果、二本鎖物質を与える。これらの2本の
鎖は、システィン残基を介したジスルフィド結合により
、互いに結合しでいる。本発明によれば、これらの位置
で、例えばアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸によ
る置換が起るので、開裂部位に変化を来し、2末鎖ヒト
t−PAがインビトロまたはインビボで生成されないか
、あるいは、その形成成度が遅延されている突然変異体
が生産される。従って、本発明によれば、生物学的な活
性を試験する目的で、突然変異を誘発された一水路ヒト
t−PAを得ることができる。これらの突然変異体は免
疫を与えることができ、または、少なくとも27572
76部位で加水分解されることに抵抗性を有しており、
さらには、得られた一本鎖t −PA突然変異体は、意
外にも、コレンらのt−PAおよび/または前記の組換
えt−PA分子と同等の活性を有することが、ある生物
学的検定法で見出された。その上、これら突然変異体は
、突然に存在しているt−PA阻害物質との反応性が低
いことも示された。
(1または1以上)を認識しくおそらく、それと隣接し
でいる1またはそれ以上のアミノ酸と一緒に)、塩基性
アミノ酸の後方で機能的に加水分解して結合(特に、ア
ルギニン/イソロイシンおよびリジン/グリシン間)を
切り、その結果、二本鎖物質を与える。これらの2本の
鎖は、システィン残基を介したジスルフィド結合により
、互いに結合しでいる。本発明によれば、これらの位置
で、例えばアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸によ
る置換が起るので、開裂部位に変化を来し、2末鎖ヒト
t−PAがインビトロまたはインビボで生成されないか
、あるいは、その形成成度が遅延されている突然変異体
が生産される。従って、本発明によれば、生物学的な活
性を試験する目的で、突然変異を誘発された一水路ヒト
t−PAを得ることができる。これらの突然変異体は免
疫を与えることができ、または、少なくとも27572
76部位で加水分解されることに抵抗性を有しており、
さらには、得られた一本鎖t −PA突然変異体は、意
外にも、コレンらのt−PAおよび/または前記の組換
えt−PA分子と同等の活性を有することが、ある生物
学的検定法で見出された。その上、これら突然変異体は
、突然に存在しているt−PA阻害物質との反応性が低
いことも示された。
第1図はヒトt−PA(5’および3′非翻訳領域を含
む)、および、プレーt −PAをコードしている配列
のDNAの制限地図を示すものである。
む)、および、プレーt −PAをコードしている配列
のDNAの制限地図を示すものである。
斑点を付した部分はt−PAの構造遺伝子である。
第2A、2Bおよび2C図は5′−および3′−非翻訳
領域を含む、プレーt−PAのDNA配列およびアミノ
酸配列12H&に10Hを表わす模式第3図は275位
に置換を有するクローン類それぞれの組立て模式図であ
る。
領域を含む、プレーt−PAのDNA配列およびアミノ
酸配列12H&に10Hを表わす模式第3図は275位
に置換を有するクローン類それぞれの組立て模式図であ
る。
第4図〜第8図はpXAPPAI83’△Xl0trp
Rの組立て模式図である。
Rの組立て模式図である。
第9図はプラスミドp P A D HF R−6の制
限部位を示す模式図である。
限部位を示す模式図である。
第10図は、5DS−PAGEゲルを用い、オートラジ
オグラフィーで検出した、放射性標識【−PA(左側)
およびEIKGG t−PA(右側)と血漿プロテアー
ゼ阻害物質とのコンプレックス形成像を写した写真の模
写図である。
オグラフィーで検出した、放射性標識【−PA(左側)
およびEIKGG t−PA(右側)と血漿プロテアー
ゼ阻害物質とのコンプレックス形成像を写した写真の模
写図である。
第11図は、1重鎖t−PA(−0−)、二本鎖t−P
A(・・・口・・・)および−水路突然変異(−P A
(E IKGC,、−・−)のフィブリンとの結合活
性を示すグラフである。
A(・・・口・・・)および−水路突然変異(−P A
(E IKGC,、−・−)のフィブリンとの結合活
性を示すグラフである。
第12図は、インビボにおけるEIK (−水路t−P
Aの突然変異体)およびrt−PA (突然変異しで
いないt−PA)の血餅溶解作用の用量一応答曲線を示
すグラフである。図中、■は賦形剤、・・・0・・・は
rt−PA、−・−はEIKを表わす。
Aの突然変異体)およびrt−PA (突然変異しで
いないt−PA)の血餅溶解作用の用量一応答曲線を示
すグラフである。図中、■は賦形剤、・・・0・・・は
rt−PA、−・−はEIKを表わす。
詳しい記述
本明細書において、「ヒト組織プラスミノゲン活性化因
子」、「ヒ1−t−PAJまたは「t−PA」という語
句は、例えば組換え細胞培養系において、プロテアーゼ
部分を含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性因子以
外のプラスミノゲン活性化因子に相当する生物活性な形
で生産された外因性のヒト(組織型)プラスミノゲン活
性化因子を意味する。全配列を通じて、1個またはそれ
以上のアミノ酸が異なることに起因する天然のアレル変
異体が存在し、また、生成され得ることは理解されるで
あろう。また、宿主の細胞環境の性質により、グリコジ
ル化のパターンにも変化がある。
子」、「ヒ1−t−PAJまたは「t−PA」という語
句は、例えば組換え細胞培養系において、プロテアーゼ
部分を含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性因子以
外のプラスミノゲン活性化因子に相当する生物活性な形
で生産された外因性のヒト(組織型)プラスミノゲン活
性化因子を意味する。全配列を通じて、1個またはそれ
以上のアミノ酸が異なることに起因する天然のアレル変
異体が存在し、また、生成され得ることは理解されるで
あろう。また、宿主の細胞環境の性質により、グリコジ
ル化のパターンにも変化がある。
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子は、プラスミノゲン
をプラスミンに変化させるプロテアーゼ領域と、フィブ
リンとの結合に関与すると考えられているクリングル(
kringle )含有領域との2個の機能的な領域を
有するポリペプチドである。
をプラスミンに変化させるプロテアーゼ領域と、フィブ
リンとの結合に関与すると考えられているクリングル(
kringle )含有領域との2個の機能的な領域を
有するポリペプチドである。
従って、t−PAは、全配列の一部にこれらの機能的な
配列を含有しでいるポリペプチドを包含するものである
。
配列を含有しでいるポリペプチドを包含するものである
。
t−PAの「2本鎖開裂部位」は、少くとも、275位
のアルギニン残基を含有する。しかしながら、275位
の残基と隣接する、あるいは、275位付近の数個の残
基内の種々のアミノ酸もまた、プラスミノゲン活性化因
子をその二本鎖形に変換する酵素によって認識され得る
領域の一部であると思われる。従って、この領域内であ
って、275位以外の位置のアミノ酸が置換されること
により、2本鎖形への変換に抵抗し得る突然変異プラス
ミノゲン活性化因子を得ることができる。
のアルギニン残基を含有する。しかしながら、275位
の残基と隣接する、あるいは、275位付近の数個の残
基内の種々のアミノ酸もまた、プラスミノゲン活性化因
子をその二本鎖形に変換する酵素によって認識され得る
領域の一部であると思われる。従って、この領域内であ
って、275位以外の位置のアミノ酸が置換されること
により、2本鎖形への変換に抵抗し得る突然変異プラス
ミノゲン活性化因子を得ることができる。
本明細書では特に、「−水路プラスミノゲン活性化因子
突然変異体」という語句は、2本鎖形への変換に抵抗性
を有するプラスミノゲン活性化因子を指すものとする。
突然変異体」という語句は、2本鎖形への変換に抵抗性
を有するプラスミノゲン活性化因子を指すものとする。
これは、二本鎖活性化部位における1または腹数個のア
ミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。修飾された結
果、その様な活性化部位は認識されなくなり、通常、プ
ラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換する酵素によ
って認識されなくなる。
ミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。修飾された結
果、その様な活性化部位は認識されなくなり、通常、プ
ラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換する酵素によ
って認識されなくなる。
トリプシンおよびキモトリプシンとの類似性に基づき、
セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成において重要
な点を考慮し、t−PAの場合は、276位に遊離のα
−アミノ基が存在することが重要と思われる。275位
のargにおいて開裂されると、276位のα−アミノ
基が遊離の状態になり、ポリペプチド鎖と、t −PA
の活性なセリン領域で反応が自由に行われるようになる
。従って、本発明は、分子全体としての活性全てを消失
させることなしに、前記の如きσ−アミン基とプロテア
ーゼ活性部位との相互作用を妨げ得る全ての突然変異を
包含するものである。
セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成において重要
な点を考慮し、t−PAの場合は、276位に遊離のα
−アミノ基が存在することが重要と思われる。275位
のargにおいて開裂されると、276位のα−アミノ
基が遊離の状態になり、ポリペプチド鎖と、t −PA
の活性なセリン領域で反応が自由に行われるようになる
。従って、本発明は、分子全体としての活性全てを消失
させることなしに、前記の如きσ−アミン基とプロテア
ーゼ活性部位との相互作用を妨げ得る全ての突然変異を
包含するものである。
基本の(元々の)DNAに突然変異を誘発し、本発明の
突然変異体を調製するために利用し得る様々な方法があ
る。その内、本明細書において特に好ましい例示の方法
は、突然変異を起こそうとする領域をコードしている配
列を含む、天然の【−PA遺伝子のフラグメントを復製
可能な形のファージM13mP8に挿入してM13mp
gPAを組立てることを含む。次いで、挿入したt−P
A配列と相補的であるが、置換すべきアミノ酸をコード
している1またはそれ以上のヌクレオチドトリプレット
を含んでいる合成オリゴヌクレオチド′
。
突然変異体を調製するために利用し得る様々な方法があ
る。その内、本明細書において特に好ましい例示の方法
は、突然変異を起こそうとする領域をコードしている配
列を含む、天然の【−PA遺伝子のフラグメントを復製
可能な形のファージM13mP8に挿入してM13mp
gPAを組立てることを含む。次いで、挿入したt−P
A配列と相補的であるが、置換すべきアミノ酸をコード
している1またはそれ以上のヌクレオチドトリプレット
を含んでいる合成オリゴヌクレオチド′
。
≠を一本鎖形のM13mp8PAにアニールし、二本鎖
領域を形成する。この領域は、DNAポリメラーゼエに
よる、残りの相補鎖の形成におけるプライマーとなる。
領域を形成する。この領域は、DNAポリメラーゼエに
よる、残りの相補鎖の形成におけるプライマーとなる。
複製、同定の後、この突然変異t−PA配列を更に修飾
するか、あるいは・突然変異t−PAポリペプチドを発
現させるための原核性または真核性ベクターの組立てに
用いることができる。
するか、あるいは・突然変異t−PAポリペプチドを発
現させるための原核性または真核性ベクターの組立てに
用いることができる。
上記の一般的な方法を用い、275/276および/ま
たは277/278二本鎖開裂部位以外の位置でt−P
Aを突然変異させ、本発明の範囲に含まれる突然変異t
−PA誘導体を生産することができる。その様な他の部
位は、通常、アルギニンまたはリジンに、イソロイシン
、セリンまたはアラニンが続<トリプシン様開裂部位等
の酵素的な加水分解を受は易いポリペプチド≠配列であ
る。その様なトリペプシン様開裂部位内の1またはそれ
以上のアミノ酸の置換によって、トリプシン様プロテア
ーゼによる加水分解に抵抗する突然変異t−PAが得ら
れる。発現および精製の工程中で、さらに、医薬として
インビボに投与した場合に、これらの有する酵素的分解
に対する抵抗性に基づき、本発明のt−PAは、突然変
異していないt −PAに比べて生物学的な活性を失な
い難いことになる。ヒ) t−PA内のその様なトリプ
シン様開裂部位には、例えば、アルギニン−アラニン(
40−41位)、アルギニン−セリン(27−28位)
およびアルギニン−セリン(462−463位)が含ま
れる。
たは277/278二本鎖開裂部位以外の位置でt−P
Aを突然変異させ、本発明の範囲に含まれる突然変異t
−PA誘導体を生産することができる。その様な他の部
位は、通常、アルギニンまたはリジンに、イソロイシン
、セリンまたはアラニンが続<トリプシン様開裂部位等
の酵素的な加水分解を受は易いポリペプチド≠配列であ
る。その様なトリペプシン様開裂部位内の1またはそれ
以上のアミノ酸の置換によって、トリプシン様プロテア
ーゼによる加水分解に抵抗する突然変異t−PAが得ら
れる。発現および精製の工程中で、さらに、医薬として
インビボに投与した場合に、これらの有する酵素的分解
に対する抵抗性に基づき、本発明のt−PAは、突然変
異していないt −PAに比べて生物学的な活性を失な
い難いことになる。ヒ) t−PA内のその様なトリプ
シン様開裂部位には、例えば、アルギニン−アラニン(
40−41位)、アルギニン−セリン(27−28位)
およびアルギニン−セリン(462−463位)が含ま
れる。
A、一般論
本発明の突然変異t−PAは、1)第1番目のアミノ酸
にメチオニンを含有させ(ATG開始シグナルコドンを
構造遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にする
)、または、2)メチオニンが細胞内または細胞外で開
裂される場合には、そのものが正常状態で有している第
1番目のアミノ酸を含有させ、または、3)そのものが
普通に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリ
ペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプチドであっ
て、細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシ
グナルポリペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプ
チドと一緒に調製し、または、4)余分な、不要のポリ
ペプチドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現され
、調製される。どの方法によっても、得られた種々の突
然変異したヒトt−PAを回収し、これを、心筋梗塞、
発作、肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞そ
の他の血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾患に
対する治療に適合し得る程度に精製することができる。
にメチオニンを含有させ(ATG開始シグナルコドンを
構造遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にする
)、または、2)メチオニンが細胞内または細胞外で開
裂される場合には、そのものが正常状態で有している第
1番目のアミノ酸を含有させ、または、3)そのものが
普通に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリ
ペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプチドであっ
て、細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシ
グナルポリペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプ
チドと一緒に調製し、または、4)余分な、不要のポリ
ペプチドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現され
、調製される。どの方法によっても、得られた種々の突
然変異したヒトt−PAを回収し、これを、心筋梗塞、
発作、肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞そ
の他の血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾患に
対する治療に適合し得る程度に精製することができる。
ヒト突然変異t−PAは機能的にフィブリンと結合し、
インビトロまたはインビボにおいて、プラスミノゲンを
変化させて、フィブリン血餅の可溶化作用を有するプラ
スミンを与える様、触媒し得るものと定義される。
インビトロまたはインビボにおいて、プラスミノゲンを
変化させて、フィブリン血餅の可溶化作用を有するプラ
スミンを与える様、触媒し得るものと定義される。
「発現ベクター」という語句は、自身が含有しでいるD
NA配列であって、該DNAを発現させるための他の配
列と機能的(操作可能)に結合しでいるDNA配列を発
現させることができ、宿主生物内で、エピンームとしで
、あるいは染色体DNAの一部として複製可能なベクタ
ーを包含する。
NA配列であって、該DNAを発現させるための他の配
列と機能的(操作可能)に結合しでいるDNA配列を発
現させることができ、宿主生物内で、エピンームとしで
、あるいは染色体DNAの一部として複製可能なベクタ
ーを包含する。
「組換え宿主細胞」という語句は、組換えDNA技術を
用いて組立てられた発現ベクターで形質転換された細胞
を指す。
用いて組立てられた発現ベクターで形質転換された細胞
を指す。
B、宿主細胞培養およびベクタ一
本明細書で開示したベクターは広範な範囲に及ぶ原核性
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌に12株2g4(ATCC31537)も用いるこ
とができる。これらの例は、当然例示にすぎず、限定的
なものではない。
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌に12株2g4(ATCC31537)も用いるこ
とができる。これらの例は、当然例示にすぎず、限定的
なものではない。
原核生物に加えて、酵母培養等の真核性生物も用いるこ
とができる。多核生物からの細胞培養は、今日選択され
る宿主である。原則として、その様な細胞培養はすべて
有効である。しかしながら、を椎動物由来の細胞に大き
い関心が寄せられており、これらの細胞を培養(組織培
養)して増殖させる方法は、再現性のある方法となって
いる〔組織培養(Ti5sue Cul Lure )
、アカデミツク・プレス(Academic Pre
ss )、 クルスおよびパターンン(Kruse a
nd Patterson )編(1973)J。
とができる。多核生物からの細胞培養は、今日選択され
る宿主である。原則として、その様な細胞培養はすべて
有効である。しかしながら、を椎動物由来の細胞に大き
い関心が寄せられており、これらの細胞を培養(組織培
養)して増殖させる方法は、再現性のある方法となって
いる〔組織培養(Ti5sue Cul Lure )
、アカデミツク・プレス(Academic Pre
ss )、 クルスおよびパターンン(Kruse a
nd Patterson )編(1973)J。
その様な有用な宿主セルラインには、VEROおよびH
eLa 細胞、チヤイニーズ・ハムスター・卵巣(CH
O)セルライン、W2B5、BHK。
eLa 細胞、チヤイニーズ・ハムスター・卵巣(CH
O)セルライン、W2B5、BHK。
cos−7およびMDCKセルラインが含まれる。
以下に記載する実施例においては、trpプロモーター
系を使用して大腸菌を用い、また、プロモーターとして
5V4Q複製起源を含有している発現ベクターを使用し
でCHO細胞を用いた。しかしながら当該技術者ならば
他の原核性あるいは真核性宿主細胞培養を用い得ること
を理解できる。
系を使用して大腸菌を用い、また、プロモーターとして
5V4Q複製起源を含有している発現ベクターを使用し
でCHO細胞を用いた。しかしながら当該技術者ならば
他の原核性あるいは真核性宿主細胞培養を用い得ること
を理解できる。
C1方法
1、トランスフェクション
強固な細胞壁障害を持っでいない細胞を宿主細胞として
用いる場合には、グラハム(Graham )ら、ピロ
ロシイ(Vivology ) 52 546(197
8)の示したりん酸カルシウム沈降法によってトランス
フェクションを行う。しかしながら、核注入またはプロ
トプラスト融合を利用することもできる。
用いる場合には、グラハム(Graham )ら、ピロ
ロシイ(Vivology ) 52 546(197
8)の示したりん酸カルシウム沈降法によってトランス
フェクションを行う。しかしながら、核注入またはプロ
トプラスト融合を利用することもできる。
原核性細胞または実質的な細胞壁構築物を有する細胞を
用いる場合には、コーエン(Cohen )ら、プロシ
ーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンスイズ(Proc、Natl。
用いる場合には、コーエン(Cohen )ら、プロシ
ーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンスイズ(Proc、Natl。
Acad、 5ci、 ) (USA ) 69211
0(1972) ノ記載した塩化カルシウム法が、トラ
ンスフェクションにとって好ましい方法である。
0(1972) ノ記載した塩化カルシウム法が、トラ
ンスフェクションにとって好ましい方法である。
所望の暗号配列およびコントロール配列を含有しでいる
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーション(結合)法を用いる。
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーション(結合)法を用いる。
単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを切り開
き、修復して再結合(ライゲート)させ、所望のプラス
ミドを組立てるのに望ましい形にする。
き、修復して再結合(ライゲート)させ、所望のプラス
ミドを組立てるのに望ましい形にする。
D、実施例
ヒトt−PAのDNAは、プラスミドpPADHFR−
5(pETPFRとも呼称)およびPA25E10から
得られた。これら2個のt−PAプラスミドの調製法は
、EPO出願公開煮093619(前掲)に記載されて
いる。
5(pETPFRとも呼称)およびPA25E10から
得られた。これら2個のt−PAプラスミドの調製法は
、EPO出願公開煮093619(前掲)に記載されて
いる。
プラスミドPA25E10は、t−PA 遺伝子の後
部508アミノ酸をコードしでいる配列と、3′非翻訳
領域の772塩基対を含有しでいる。
部508アミノ酸をコードしでいる配列と、3′非翻訳
領域の772塩基対を含有しでいる。
このプラスミドをSac IおよびBgl ■ で消
化して得た744塩基対フラグメントを既述の標準的手
法により単離した。t−PAの既知の配列および第1図
に示した制限地図から分る様に、このフラグメントは、
t−PAのアミノ酸411がら527に対するコドン、
並びに3′非翻訳領域の一部を含んでいる。
化して得た744塩基対フラグメントを既述の標準的手
法により単離した。t−PAの既知の配列および第1図
に示した制限地図から分る様に、このフラグメントは、
t−PAのアミノ酸411がら527に対するコドン、
並びに3′非翻訳領域の一部を含んでいる。
プラスミドpPADHFR−5は、t −PAの全構造
遺伝子、および3′非翻訳領域の一部を含んでいる。こ
のプラスミドをSac 工およびBgl■で消化し、生
成した1、230 塩基対フラグメントを単離した。
遺伝子、および3′非翻訳領域の一部を含んでいる。こ
のプラスミドをSac 工およびBgl■で消化し、生
成した1、230 塩基対フラグメントを単離した。
このフラグメントは、成熟型L−PAの最初の410ア
ミノ酸に関するコドンを含有している。
ミノ酸に関するコドンを含有している。
これらのフラグメントを標準的な方法でライゲートさせ
・Bgl ffで消化した。成熟t−PAの全配列と3
′非翻訳領域の一部に関するコドンを含む1,974
塩基対フラグメントを単離した。二本鎖M13mp8
[メッシング(Messing)ら、[巨大分子組換え
DNAに関する第3回クリーブランド・シンポジウム(
Th1rd C1eve landSymposium
on Macromolecules Recomb
inantDNA)J、A、ウォルト:/ (A、 W
al ton ) 編、エルセピア−(Elsevi
er )アムステルダム(1981) P、 143
EをBamHIで消化し、Bgl■消化t−PAとアニ
ールさせ、M13mp8PABgl ■を組立てた。こ
の二本鎖の、複製可能なM13mp8 PABgl ■
で大腸菌JMIOI細胞(ATCCA33876 )
を形質転換した。このファージでトランスフェクトされ
た大腸菌JMIOI細胞から一本鎖形および二本鎖(R
F)形のM13mp 8PA Bgl ’flを単離す
ることができる。−水路形のM l 3 mp 8PA
Bgl ’Jlを、t−PA の特定部位における(部
位特異的)突然変異誘発に用いた。
・Bgl ffで消化した。成熟t−PAの全配列と3
′非翻訳領域の一部に関するコドンを含む1,974
塩基対フラグメントを単離した。二本鎖M13mp8
[メッシング(Messing)ら、[巨大分子組換え
DNAに関する第3回クリーブランド・シンポジウム(
Th1rd C1eve landSymposium
on Macromolecules Recomb
inantDNA)J、A、ウォルト:/ (A、 W
al ton ) 編、エルセピア−(Elsevi
er )アムステルダム(1981) P、 143
EをBamHIで消化し、Bgl■消化t−PAとアニ
ールさせ、M13mp8PABgl ■を組立てた。こ
の二本鎖の、複製可能なM13mp8 PABgl ■
で大腸菌JMIOI細胞(ATCCA33876 )
を形質転換した。このファージでトランスフェクトされ
た大腸菌JMIOI細胞から一本鎖形および二本鎖(R
F)形のM13mp 8PA Bgl ’flを単離す
ることができる。−水路形のM l 3 mp 8PA
Bgl ’Jlを、t−PA の特定部位における(部
位特異的)突然変異誘発に用いた。
−の合成
ヒ1−t−PA構造遺伝子を部位特異的突然変異1丁
天然のt−PAのアミノ酸配列および遺伝子配列は、最
初の2列に記載されている。プライマーは、指摘した残
基において、天然の遺伝子配列と異っている。対応する
アミノ酸置換体は、このアミノ酸をコードしているトリ
プレットの上方に示されている。
初の2列に記載されている。プライマーは、指摘した残
基において、天然の遺伝子配列と異っている。対応する
アミノ酸置換体は、このアミノ酸をコードしているトリ
プレットの上方に示されている。
3、部位特異的突然変異誘発
以下に、合成プライマーの突然変異配列を含有する種の
t−PAクローンの組立て方法を示す。
t−PAクローンの組立て方法を示す。
ココテは、アゾ/L/77 (Adelman )ら[
:「DNAJ2.183(1983))の一般的な方法
を用いた。各クローンの全組立で模式図を第3図に示し
た。M13RFIB8、M13RF2C9およびM13
RF4A10は、前記の、唯1個のアミノ酸に突然変異
を有するプライマーを用いて組立てられた。単一の標準
M13RF4A10 (277位に突然変異を有する)
をプライマー3A?または4B3とアニールさせること
により、M13RA3A7およびM13RF4B3が、
それぞれ得られた。これら突然変異t−PA遺伝子の精
製M13RF DNAを、大腸菌JMI O1細胞を用
いて得た。次いで、突然変異t−PADNA配列を含有
するフラグメントを用いて、突然変異t−PAのための
発現ベクターを組立てた。
:「DNAJ2.183(1983))の一般的な方法
を用いた。各クローンの全組立で模式図を第3図に示し
た。M13RFIB8、M13RF2C9およびM13
RF4A10は、前記の、唯1個のアミノ酸に突然変異
を有するプライマーを用いて組立てられた。単一の標準
M13RF4A10 (277位に突然変異を有する)
をプライマー3A?または4B3とアニールさせること
により、M13RA3A7およびM13RF4B3が、
それぞれ得られた。これら突然変異t−PA遺伝子の精
製M13RF DNAを、大腸菌JMI O1細胞を用
いて得た。次いで、突然変異t−PADNA配列を含有
するフラグメントを用いて、突然変異t−PAのための
発現ベクターを組立てた。
合成オリゴヌクレオチド50mgを、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼ8Uを含有する、50mMトリス−HCI
(PH7,5)、10mM MgCl2.10mMジチ
オトレイトール、および1mMATP の混液10μ
m中、37℃で30分間、ホスホリル化(りん酸化)し
た。プローブとして用いるために、ATPの代りに5
Q mCl(1−P 〕−ATP(300μCi/nm
ol ) ヲ用い、合成オリゴヌクレオチド401g
を上記の如くにしてホスホリル化することにより、約5
0〜60 X 10 cpm/(24量体400ng
) を得た。ヘテロ二本鎖を形成させるために、−水
路M l 3 mp 8P ABglUlong を
、りん酸化したプライマー10ngとEcoRJ消化M
l 3mp 8PABgl TIRF(7)大きいフラ
グメント50 ngとを含む、lQmMトリフ、、 −
HCI (pf(7,5)、10mM MgCl 2.
1mMジチオトレイトールの混合物40μj中で、95
℃において10分間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却
した(30分) 、2mM AT P 、0.25mM
づつのdGTP、dTTP、dCTP およびdATP
、大腸菌DNAポリメラーゼエラージフラグメント5U
、およびT4DNAリガーゼ400単位を含有するリガ
ーゼバッファー10μjを加えてプライマー延長を開始
させた。12℃で1時間経過した後1反応混合物を大腸
菌JMIOI細胞にトランスフオーム(導入)シタ。
チドキナーゼ8Uを含有する、50mMトリス−HCI
(PH7,5)、10mM MgCl2.10mMジチ
オトレイトール、および1mMATP の混液10μ
m中、37℃で30分間、ホスホリル化(りん酸化)し
た。プローブとして用いるために、ATPの代りに5
Q mCl(1−P 〕−ATP(300μCi/nm
ol ) ヲ用い、合成オリゴヌクレオチド401g
を上記の如くにしてホスホリル化することにより、約5
0〜60 X 10 cpm/(24量体400ng
) を得た。ヘテロ二本鎖を形成させるために、−水
路M l 3 mp 8P ABglUlong を
、りん酸化したプライマー10ngとEcoRJ消化M
l 3mp 8PABgl TIRF(7)大きいフラ
グメント50 ngとを含む、lQmMトリフ、、 −
HCI (pf(7,5)、10mM MgCl 2.
1mMジチオトレイトールの混合物40μj中で、95
℃において10分間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却
した(30分) 、2mM AT P 、0.25mM
づつのdGTP、dTTP、dCTP およびdATP
、大腸菌DNAポリメラーゼエラージフラグメント5U
、およびT4DNAリガーゼ400単位を含有するリガ
ーゼバッファー10μjを加えてプライマー延長を開始
させた。12℃で1時間経過した後1反応混合物を大腸
菌JMIOI細胞にトランスフオーム(導入)シタ。
ライゲーション混合物10μlとコンピテントJMI
O1細胞200μjとを混合し、氷上で30分間、次い
で37℃で5分間インキュベートすることにより、形質
転換を行った。次いで、2YTトツプ寒天(アガー)3
.5mlと飽和JMI O1細胞300 pi、IPT
C,10pl (200mM)およびXga15QμI
を55℃において混合し、形質転換された細胞を加えた
後、薬物不含のLBを入れた9Gのペトリ皿上で平板培
養した。
O1細胞200μjとを混合し、氷上で30分間、次い
で37℃で5分間インキュベートすることにより、形質
転換を行った。次いで、2YTトツプ寒天(アガー)3
.5mlと飽和JMI O1細胞300 pi、IPT
C,10pl (200mM)およびXga15QμI
を55℃において混合し、形質転換された細胞を加えた
後、薬物不含のLBを入れた9Gのペトリ皿上で平板培
養した。
無着色のプラークを拾い上げ、2YT培地10゜0μl
の入ったマイクロタイター(微量力価窓)ディツシュに
移した。接種されたマイクロタイター液を直径15CM
のLB塞天平板上にスタンプしく押し付け)、2YTl
−ツブ寒天8−中のJM101細胞菌 600ttlを
重層して37℃で一夜インキユベートした。形成された
プラークを物理的な接触(1分間)により、ニトロセル
ロース(pH7,5)で15分間処理して洗浄しく2回
)、次いで、2X SSCで15分間洗浄処理した。プ
レハイブリダイゼーションミックスは、19mMトリス
(pH7,5)、5mM EDTA 、Q、9MN a
Cl!、1xデンハート(Denhardt )0.
5%NP4Q、100/AMATP、1mM ピロり
ん酸ナトリウム、1mMりん酸ナトリウムおよび50μ
g/rnl大腸菌tRNAを含有している。1xデンハ
ートは、II!当り、フィコール(Ficoll )2
00m9、ポリビニルピロリドン200〜、ウシ血清ア
ルブミン(BSA:フラクションV ) 200■を含
有している。真空中において、80℃で90分間、ディ
スクを焼いた。次いで、ディスクを、ペトリ皿中でプレ
ハイブリダイゼーション液6−と一緒に3時間インキュ
ベートし1次いで、5xlQ cpmの標識プライマ
ーを加え、−夜ハイブリダイズさせた。49℃において
、Q、4xSSCを用い、選択的な洗浄を行い、ディス
クを風乾した後、X線フィルムに露出させた。次いで、
陽性にハイブリダイズしたクローンを、゛ジデオキシ配
列決定により、分析した〔アルデマン(#J掲)参照〕
。
の入ったマイクロタイター(微量力価窓)ディツシュに
移した。接種されたマイクロタイター液を直径15CM
のLB塞天平板上にスタンプしく押し付け)、2YTl
−ツブ寒天8−中のJM101細胞菌 600ttlを
重層して37℃で一夜インキユベートした。形成された
プラークを物理的な接触(1分間)により、ニトロセル
ロース(pH7,5)で15分間処理して洗浄しく2回
)、次いで、2X SSCで15分間洗浄処理した。プ
レハイブリダイゼーションミックスは、19mMトリス
(pH7,5)、5mM EDTA 、Q、9MN a
Cl!、1xデンハート(Denhardt )0.
5%NP4Q、100/AMATP、1mM ピロり
ん酸ナトリウム、1mMりん酸ナトリウムおよび50μ
g/rnl大腸菌tRNAを含有している。1xデンハ
ートは、II!当り、フィコール(Ficoll )2
00m9、ポリビニルピロリドン200〜、ウシ血清ア
ルブミン(BSA:フラクションV ) 200■を含
有している。真空中において、80℃で90分間、ディ
スクを焼いた。次いで、ディスクを、ペトリ皿中でプレ
ハイブリダイゼーション液6−と一緒に3時間インキュ
ベートし1次いで、5xlQ cpmの標識プライマ
ーを加え、−夜ハイブリダイズさせた。49℃において
、Q、4xSSCを用い、選択的な洗浄を行い、ディス
クを風乾した後、X線フィルムに露出させた。次いで、
陽性にハイブリダイズしたクローンを、゛ジデオキシ配
列決定により、分析した〔アルデマン(#J掲)参照〕
。
−の組立て
種々の突然変異t−PADNA配列のための発現ベクタ
ーとして用いるために、プラスミドpXAPPA183
’△xlQtrpRプラスミドを組立でた。このプラス
ミド9全組立て模式図は添付の第4〜8図に示されてい
る。得られたプラスミドは第8図に示されでいる。この
プラスミドはtrpRリプレッサー遺伝子を含有してお
り、また、プラスミドの増巾を阻害するp B R32
2DNAを欠失している。この欠失はXAP欠失として
知られており、サツトクリツフ(5utcliff )
、コールド・スフリング・ハーバ−・シンホブラム、オ
ン・クオンテイテイテイブ・バイオロジイ(Cold
Spring Harber Symposium
onQuantitative −Biology )
Vol、43 77 (1979)、コールド・ス
プリング・ハーバ−・プレス、が開示した様に、pBR
322のAva工制限部位からPvu ■制限部位まで
の641塩基対のPBR322DNA配列が除去される
ことを意味する。trpRリプレッサーは、プラスミド
のコピー数増加に起因して、t−PA発現が、未成熟な
ままで脱抑制されることを補償するよう、作用する。p
XAPPA18 3’△xlQtrpRの組立てにおけ
る中間体プラスミドPPA18の組立て模式図は第4図
に示されでいる。このプラスミドは、全てのプレーt−
PA構造遺伝子と、5′および3′ 非翻訳領域とを含
有しでいる。このプラスミドはまた、特徴的に、t −
PA遺伝子に伴なうtrp プロモーター、並びにア
ンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の付与に係る配
列を含有しでいる。
ーとして用いるために、プラスミドpXAPPA183
’△xlQtrpRプラスミドを組立でた。このプラス
ミド9全組立て模式図は添付の第4〜8図に示されてい
る。得られたプラスミドは第8図に示されでいる。この
プラスミドはtrpRリプレッサー遺伝子を含有してお
り、また、プラスミドの増巾を阻害するp B R32
2DNAを欠失している。この欠失はXAP欠失として
知られており、サツトクリツフ(5utcliff )
、コールド・スフリング・ハーバ−・シンホブラム、オ
ン・クオンテイテイテイブ・バイオロジイ(Cold
Spring Harber Symposium
onQuantitative −Biology )
Vol、43 77 (1979)、コールド・ス
プリング・ハーバ−・プレス、が開示した様に、pBR
322のAva工制限部位からPvu ■制限部位まで
の641塩基対のPBR322DNA配列が除去される
ことを意味する。trpRリプレッサーは、プラスミド
のコピー数増加に起因して、t−PA発現が、未成熟な
ままで脱抑制されることを補償するよう、作用する。p
XAPPA18 3’△xlQtrpRの組立てにおけ
る中間体プラスミドPPA18の組立て模式図は第4図
に示されでいる。このプラスミドは、全てのプレーt−
PA構造遺伝子と、5′および3′ 非翻訳領域とを含
有しでいる。このプラスミドはまた、特徴的に、t −
PA遺伝子に伴なうtrp プロモーター、並びにア
ンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の付与に係る配
列を含有しでいる。
pPA18の組立でのために、4個のプラスミド、即ち
、pFIFtrp69、pHKYIQ、ptPAtrp
12および’pPA25E10を用いた。
、pFIFtrp69、pHKYIQ、ptPAtrp
12および’pPA25E10を用いた。
プラスミドp F I F trp59はゲッデ/L/
(Goeddel)ら、ヌクレイツクアシツブ・リサ
ーチ(NucleiCAcids Re5earch
) 84057(1980)により開示された。プラス
ミドpHKYIQは、米国特許出願A685.521
(1984年12月24日出願)に開示されでおり、こ
れは、米国特許黒307,473(1981年10月1
日出願)および瓜133,296 (1980年3月2
4日出願)(ヨーロッパ特許出頼公開、糸003677
6)と一連の出願である。プラスミドptPAtrp1
2およびpPA25E 10はヘニヵ(Penn i
ca )ら、ネイチャー(Nature ) 3j月−
214(1983)およびEPO公開&o93,6x9
c前掲)に開示されている。
(Goeddel)ら、ヌクレイツクアシツブ・リサ
ーチ(NucleiCAcids Re5earch
) 84057(1980)により開示された。プラス
ミドpHKYIQは、米国特許出願A685.521
(1984年12月24日出願)に開示されでおり、こ
れは、米国特許黒307,473(1981年10月1
日出願)および瓜133,296 (1980年3月2
4日出願)(ヨーロッパ特許出頼公開、糸003677
6)と一連の出願である。プラスミドptPAtrp1
2およびpPA25E 10はヘニヵ(Penn i
ca )ら、ネイチャー(Nature ) 3j月−
214(1983)およびEPO公開&o93,6x9
c前掲)に開示されている。
通常、プラスミドPFIFtrP69をPstIとXb
a Iで消化し、第4図中、フラグメント1と表示さ
れている950塩基対のフラグメントを得ル。プラスミ
ドPtPALrP12を、XbalとNari で消化
した。この消化により、第4図中、フラグメント4と表
示されでいる340塩基対の配列を単離した。プラスミ
ドp P A 25 EloをNariとBgl II
で消化した。この消化により、第・1図中、フラグ
メント3と表示されている1604塩基対フラグメント
を単離した。プラスミドp HK Y 10をPstI
とBgl ’flで消化し、第4図中、フラグメント
2と表示されでいる2900塩基対フラグメントを生成
させた。これらの4フラグメントをライゲート(結合)
させ、得られたDNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し
、pPA18を得た。
a Iで消化し、第4図中、フラグメント1と表示さ
れている950塩基対のフラグメントを得ル。プラスミ
ドPtPALrP12を、XbalとNari で消化
した。この消化により、第4図中、フラグメント4と表
示されでいる340塩基対の配列を単離した。プラスミ
ドp P A 25 EloをNariとBgl II
で消化した。この消化により、第・1図中、フラグ
メント3と表示されている1604塩基対フラグメント
を単離した。プラスミドp HK Y 10をPstI
とBgl ’flで消化し、第4図中、フラグメント
2と表示されでいる2900塩基対フラグメントを生成
させた。これらの4フラグメントをライゲート(結合)
させ、得られたDNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し
、pPA18を得た。
プラスミドpPAl 8を単離し、Sau 3 A 消
化に付した後、DNAポリメラーゼ■のフレノウ(kl
enow )フラグメントで処理し、制限部位をうめた
。この非環式プラスミドをSaC■で処理し、第5図中
、フラグメント5と表示されている389塩基対配列を
単離した。プラスミドpPA18を、Sac工およびB
amH■で消化した。
化に付した後、DNAポリメラーゼ■のフレノウ(kl
enow )フラグメントで処理し、制限部位をうめた
。この非環式プラスミドをSaC■で処理し、第5図中
、フラグメント5と表示されている389塩基対配列を
単離した。プラスミドpPA18を、Sac工およびB
amH■で消化した。
この消化により、ベクターフラグメント6が単離された
。プラスミドpBR322(ボイヤー(Boyer )
ら、「ジー”J 2 95(1977)〕をEcoR工
で消化し、次いで、DNAポリメラーゼ■のフレノウ
フラグメントで処理した。この開放−末端DNA配列を
BamH工で消化し、第5図中、フラグメント7と表示
されている375塩基対配列を得た。フラグメント5.
6および7を結合させ、得られた生成物で大腸菌を形質
転換し、プラスミドpPA183’△を得た。このプラ
スミドは、t−PA遺伝子の3′非翻訳領域の一部が除
去されている外は、pPA18と同等である。
。プラスミドpBR322(ボイヤー(Boyer )
ら、「ジー”J 2 95(1977)〕をEcoR工
で消化し、次いで、DNAポリメラーゼ■のフレノウ
フラグメントで処理した。この開放−末端DNA配列を
BamH工で消化し、第5図中、フラグメント7と表示
されている375塩基対配列を得た。フラグメント5.
6および7を結合させ、得られた生成物で大腸菌を形質
転換し、プラスミドpPA183’△を得た。このプラ
スミドは、t−PA遺伝子の3′非翻訳領域の一部が除
去されている外は、pPA18と同等である。
このプラスミドpPA183’△をPstJとNar
■で消化し、第6図中、フラグメント8と表示されで
いる313塩基対フラグメントを生成させた。このフラ
グメントはアミノ酸8から109までをコードしでいる
。合成オリゴヌクレオチドフラグメント9は、式: で示される配列を有する。
■で消化し、第6図中、フラグメント8と表示されで
いる313塩基対フラグメントを生成させた。このフラ
グメントはアミノ酸8から109までをコードしでいる
。合成オリゴヌクレオチドフラグメント9は、式: で示される配列を有する。
この合成りNAをフラグメント8のPstI部位に結合
させ、成熟t−PA分子の第7番目のアルギニンコドン
を再生すると共に、最初の6個のアミノ酸コドンを得た
。加えて、成熟t−PAアミノ酸暗号配列の残基1の炉
側に隣接している合成N−末端メチオニンコドンの5′
側にリボンーム結合部位が位置している。このオリゴヌ
クレオチドの5′末端にはXbal 制限部位が存在し
ている。従って、フラグメント8を、合成オリゴヌクレ
オチドフラグメント9の存在下でライゲートさせ、この
混合物をXbal:およびNari で消化することに
より、フラグメント10(第6図)が得られた。
させ、成熟t−PA分子の第7番目のアルギニンコドン
を再生すると共に、最初の6個のアミノ酸コドンを得た
。加えて、成熟t−PAアミノ酸暗号配列の残基1の炉
側に隣接している合成N−末端メチオニンコドンの5′
側にリボンーム結合部位が位置している。このオリゴヌ
クレオチドの5′末端にはXbal 制限部位が存在し
ている。従って、フラグメント8を、合成オリゴヌクレ
オチドフラグメント9の存在下でライゲートさせ、この
混合物をXbal:およびNari で消化することに
より、フラグメント10(第6図)が得られた。
プラスミドpPA 183’△をNari とSac
I テ消化し、900塩基対配列のフラグメント11
()を生成させた。フラグメント10.11および12
をライゲートして大腸菌の形質転換に用い、pPA18
3’△×10 を単離した。米国特許出願&538.7
30 (1983年10月3日出願、Epo公開A13
6907)に開示されているpFMBtrpRから、X
AP欠失とtrpRリプレッサー遺伝子を含有している
DNA配列を単離した。簡単に述べると、このプラスミ
ドは、当業者既知の以下に示す3つのプラスミドから組
立てられた。phGHIQ7 : EPO公開A O2
242に記載(1981年1月14日公開)されており
、このプラセミドは、誘導可能rjlacプロモーター
の供給源として使用された。ptrpR3: ローダ
−(Roeader )ら、モレキュラー・ジエネテイ
ツクス(Mo1ecular Genetics )
175 、351(1979) に記載されており、
このプラスミドは、trpljプレツサーの暗号配列の
供給源として使用された。pFMBl:EPO公開A
0068693(1983年1月5日公開)に記載され
ており、このプラスミドは、A24株由来のF、MD抗
原の暗号配列の供給源として用いられた。
I テ消化し、900塩基対配列のフラグメント11
()を生成させた。フラグメント10.11および12
をライゲートして大腸菌の形質転換に用い、pPA18
3’△×10 を単離した。米国特許出願&538.7
30 (1983年10月3日出願、Epo公開A13
6907)に開示されているpFMBtrpRから、X
AP欠失とtrpRリプレッサー遺伝子を含有している
DNA配列を単離した。簡単に述べると、このプラスミ
ドは、当業者既知の以下に示す3つのプラスミドから組
立てられた。phGHIQ7 : EPO公開A O2
242に記載(1981年1月14日公開)されており
、このプラセミドは、誘導可能rjlacプロモーター
の供給源として使用された。ptrpR3: ローダ
−(Roeader )ら、モレキュラー・ジエネテイ
ツクス(Mo1ecular Genetics )
175 、351(1979) に記載されており、
このプラスミドは、trpljプレツサーの暗号配列の
供給源として使用された。pFMBl:EPO公開A
0068693(1983年1月5日公開)に記載され
ており、このプラスミドは、A24株由来のF、MD抗
原の暗号配列の供給源として用いられた。
jrplJプレツサー配列を得るには、p t r p
R3をHae[で処理して6%アクリルアミドゲルに
より、334塩基対のフラグメントを単離し、単離した
フラグメントを、式: %式% で示される配列を有する16量体のEcoRI’Jンカ
ーとライゲートさせた。
R3をHae[で処理して6%アクリルアミドゲルに
より、334塩基対のフラグメントを単離し、単離した
フラグメントを、式: %式% で示される配列を有する16量体のEcoRI’Jンカ
ーとライゲートさせた。
ベクターバックボーンとIacプロモーターを得るため
に、phGHIQ7をEcoR工 で消化した後、細菌
性アルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、Ia
cUV5を含有している大きいベクターフラグメントを
T4リガーゼを用いて修復したtrpRプラスミドとラ
イゲートさせ、このライゲーション・ミックスを用いて
大腸菌を形質転換した。プラスミドDNAを形質転換体
から単離し、所望のプラスタl’ (ptrp R/h
GHl 07と命名)の存在を確認した〔メツシング
(Messing)ら、ニュークレイツク・アシツズ・
リサーチ9,309(1981)J。
に、phGHIQ7をEcoR工 で消化した後、細菌
性アルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、Ia
cUV5を含有している大きいベクターフラグメントを
T4リガーゼを用いて修復したtrpRプラスミドとラ
イゲートさせ、このライゲーション・ミックスを用いて
大腸菌を形質転換した。プラスミドDNAを形質転換体
から単離し、所望のプラスタl’ (ptrp R/h
GHl 07と命名)の存在を確認した〔メツシング
(Messing)ら、ニュークレイツク・アシツズ・
リサーチ9,309(1981)J。
ptrp R/hGH107をEcoR工 で部分消化
し、フレノウで平滑末端化した後、Pvu II で
処理してIacプロモーター/crpリプレッサーオペ
ロン(530bp フラグメント)を得た。pFMB
lをPvulIで部分消化し、6%ポリアクリルアミド
ゲルを用いてベクターフラグメントを単離することによ
り、trpプロモーターのコントロール下にある、FM
B暗号配列を含有している、発現ベクターのバックボー
ンを得た。pt rp R/ h GH107フラグメ
ントをpFMBlのPvu ’fl 消化物と混合し、
T41Jガーゼでライゲートさせた。
し、フレノウで平滑末端化した後、Pvu II で
処理してIacプロモーター/crpリプレッサーオペ
ロン(530bp フラグメント)を得た。pFMB
lをPvulIで部分消化し、6%ポリアクリルアミド
ゲルを用いてベクターフラグメントを単離することによ
り、trpプロモーターのコントロール下にある、FM
B暗号配列を含有している、発現ベクターのバックボー
ンを得た。pt rp R/ h GH107フラグメ
ントをpFMBlのPvu ’fl 消化物と混合し、
T41Jガーゼでライゲートさせた。
次いで、ライゲーション混合物を用いて大腸菌株294
を形質転換し、得られた形質転換体をプラスミドの供給
源として使用した。得られたプラスミドpFMB/1r
pRをミニスクリーンにより立証し、また、Ava■−
Pvu■消化によって挿入体の方向性を証明した。プラ
スミドp F M B /1rpRをNde工とBam
HIで消化した。trp1リプレッサーを含有しでいる
フラグメントを単離した。プラスミドPPA183’
△xlOをNde 工およびBamHI で消化し
た。主要なベクターフラグメントを単離した。このベク
ターフラグメントとpFMB trpR由来のtrpR
リプレッサーフラグメントとをライゲートさせ、得られ
たDNA混合物を用いて大腸菌を形質転換し、この形質
転換体からプラスミドpXAPA183’△XIQtr
pRを単離した(第8図参照)。
を形質転換し、得られた形質転換体をプラスミドの供給
源として使用した。得られたプラスミドpFMB/1r
pRをミニスクリーンにより立証し、また、Ava■−
Pvu■消化によって挿入体の方向性を証明した。プラ
スミドp F M B /1rpRをNde工とBam
HIで消化した。trp1リプレッサーを含有しでいる
フラグメントを単離した。プラスミドPPA183’
△xlOをNde 工およびBamHI で消化し
た。主要なベクターフラグメントを単離した。このベク
ターフラグメントとpFMB trpR由来のtrpR
リプレッサーフラグメントとをライゲートさせ、得られ
たDNA混合物を用いて大腸菌を形質転換し、この形質
転換体からプラスミドpXAPA183’△XIQtr
pRを単離した(第8図参照)。
フタ−
大腸菌内でt−PAおよびt −PA突然変異体を発現
させるのに用いられるベクター、pXAPPA183’
△xlO(rpRを第8図に示す。図から分る様に、天
然のt−PA構造遺伝子の発現はtrp7”ロモーター
によってコントロール下している。Xba工、NarI
および5aCI 制限部位に注意が寄せられた。プラス
ミドpXAPPA183’xlQcrpRをNarIと
Xba工で消化した。
させるのに用いられるベクター、pXAPPA183’
△xlO(rpRを第8図に示す。図から分る様に、天
然のt−PA構造遺伝子の発現はtrp7”ロモーター
によってコントロール下している。Xba工、NarI
および5aCI 制限部位に注意が寄せられた。プラス
ミドpXAPPA183’xlQcrpRをNarIと
Xba工で消化した。
340塩基対からなるフラグメント1(第8図)を単離
した。、、PXAPPA183′△x l Q trp
RをXba工 とSac 工で消化して生成された大き
いフラグメントを単離することにより、ベクターフラグ
メントである、フラグメント2(第8図)を得た。フラ
グメン)3 (900bP )は、部位特異的突然変異
の誘発(第3図)によって得られた各突然変異t−PA
クローン類のRFDNAをNarI およびSac 工
で消化することにより、得られた。フラグメント1およ
びフラグメント2と、各フラグメント3とをライゲート
することにより、別々の突然変異t−PA類を発現する
ベクター類を組立て、これらを用いて大腸菌を形質転換
し、各大腸菌突然変異t−PA発現ベクターを単離した
。各ベクターを次に示す。
した。、、PXAPPA183′△x l Q trp
RをXba工 とSac 工で消化して生成された大き
いフラグメントを単離することにより、ベクターフラグ
メントである、フラグメント2(第8図)を得た。フラ
グメン)3 (900bP )は、部位特異的突然変異
の誘発(第3図)によって得られた各突然変異t−PA
クローン類のRFDNAをNarI およびSac 工
で消化することにより、得られた。フラグメント1およ
びフラグメント2と、各フラグメント3とをライゲート
することにより、別々の突然変異t−PA類を発現する
ベクター類を組立て、これらを用いて大腸菌を形質転換
し、各大腸菌突然変異t−PA発現ベクターを単離した
。各ベクターを次に示す。
pXAPPA183’△x IQ trpRIB8pX
APPA183’△x 10 trpR2C9pXAP
PA183’△x IQ trpR4AIQpXAPP
A183’△x 10 t rpR3A7pXAPPA
183’△x IQ trpR4B3これらのプラスミ
ドを、野生型t−PA発現ベクターp X A P P
A 183’△X10trpRと同様に:大腸菌W3
110 fhuA−の形質転換に用いた。
APPA183’△x 10 trpR2C9pXAP
PA183’△x IQ trpR4AIQpXAPP
A183’△x 10 t rpR3A7pXAPPA
183’△x IQ trpR4B3これらのプラスミ
ドを、野生型t−PA発現ベクターp X A P P
A 183’△X10trpRと同様に:大腸菌W3
110 fhuA−の形質転換に用いた。
大腸菌W3110 fhuA−ハ、77−ジ耐性菌で
あって、fhuA遺伝子に伴なうDNA配列の欠失また
は逆転(位)を有することを特徴としている。要するに
、大腸菌W3110(ATCC27325)を、テトラ
サイクリン耐性を付与し得る、転送可能な(トランスポ
ーザブル)因子、 T n10を含有しているラムダバ
クテリオファージにより、形質導入する。TnlO形質
導入W3110を、ファージ感染に対する抵抗性に基づ
いて選択する。ファージ耐性株をプールし、バクテリオ
ファージP1に感染させる。得られたリゼイトを用(N
で大腸菌AT982[:ブクハリ(Bukhari )
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−105,84
4(1971)’J に形質導入する。AT982株は
fhuA遺伝子に接近した位置にDap 突然変異を
有している。従って、AT982株をP1リゼイトで形
質導入し、テトラサイクリン耐性であって、DAP機能
を再生しでいる形質導入体を選択することにより、トラ
ンスポゾンTnlQがfhu A遺伝子内に位置してい
ることが示される。テトラサイクリン耐性であって、D
AP機能を再生している株は、大腸菌W3110にバク
テリア・ファージP1を形質導入するためのDNAの供
給源である。テトラサイクリン耐性とファージ耐性を示
す形質導入されたW3110株を選択する。次いで、こ
れらの株を、ファージ感染に対する抵抗性とテトラサイ
クリン感受性への逆転に基づいて選択する〔ナロイ(N
aloy)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ、
145.1110(1981)]。
あって、fhuA遺伝子に伴なうDNA配列の欠失また
は逆転(位)を有することを特徴としている。要するに
、大腸菌W3110(ATCC27325)を、テトラ
サイクリン耐性を付与し得る、転送可能な(トランスポ
ーザブル)因子、 T n10を含有しているラムダバ
クテリオファージにより、形質導入する。TnlO形質
導入W3110を、ファージ感染に対する抵抗性に基づ
いて選択する。ファージ耐性株をプールし、バクテリオ
ファージP1に感染させる。得られたリゼイトを用(N
で大腸菌AT982[:ブクハリ(Bukhari )
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−105,84
4(1971)’J に形質導入する。AT982株は
fhuA遺伝子に接近した位置にDap 突然変異を
有している。従って、AT982株をP1リゼイトで形
質導入し、テトラサイクリン耐性であって、DAP機能
を再生しでいる形質導入体を選択することにより、トラ
ンスポゾンTnlQがfhu A遺伝子内に位置してい
ることが示される。テトラサイクリン耐性であって、D
AP機能を再生している株は、大腸菌W3110にバク
テリア・ファージP1を形質導入するためのDNAの供
給源である。テトラサイクリン耐性とファージ耐性を示
す形質導入されたW3110株を選択する。次いで、こ
れらの株を、ファージ感染に対する抵抗性とテトラサイ
クリン感受性への逆転に基づいて選択する〔ナロイ(N
aloy)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ、
145.1110(1981)]。
このテトラサイクリン感受性への逆転は、T1 ファー
ジ感染に対する抵抗性の保持と相まって、fhu A遺
伝子に伴なっているDNA配列が欠失されたか、非可逆
的に逆転されたことを示唆している。この様にして組立
てられた株が大腸菌W311 Q fhuA−である。
ジ感染に対する抵抗性の保持と相まって、fhu A遺
伝子に伴なっているDNA配列が欠失されたか、非可逆
的に逆転されたことを示唆している。この様にして組立
てられた株が大腸菌W311 Q fhuA−である。
転送可能な因子TnlQ をW3110に挿入するの
に用いた、Tn10含有ファージは以下の様にして組立
てられた。出発物質は、ラムダC工857b2210a
m29である。このファージは当業者にとって既知であ
り〔クレックナ−(Klecknet ) 、ジャーナ
ル・オブ、モレキュラー・バイオロジー116,125
(1977))、ラムダの良く知られた3種の突然
変異体から標準的な4方法で組立てられた。このラムダ
ファージのリゼイトを、当業者既知の方法で操作し、T
n10トランスポゾンを担持させでおいたアンバー・サ
プレッサー(抑圧)大腸菌C600(ATCCジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー116.125
(1977)Jo このリゼイトを用い、アンバーサプ
レッサーとC1857遺伝型を持ったラムダプロファー
ジを含有する大PA 600△ (ラムダCl857)に感染させた。テトラサイクリン
耐性コロニーを、ブロス中、32℃、次いで42℃で9
0分間、増殖させることによって熱誘導し、テトラサイ
クリン耐性コロニーノリゼイトを調製した。このリゼイ
トを大腸菌C600上にプレートし、レプリカ平板法に
付した。大腸菌C600上に現われたプラークを大腸菌
C600と、異種免疫プロファージ・ラムダimm 4
34を含有している大腸菌wa 102 sup+(ラ
ムダ1mm434 )Cクレツクナーら、ジエネテイツ
クス90,427 (1978))との上でレプリカ平
板法に付した。異種免疫株上に現われたプラークをテト
ラサイクリン平板上にプレートした。これらの平板上に
現われたプラークはテトラサイクリン耐性を形質導入す
ることができ、これらを、上記の大腸菌W3110 f
hu A−の調製法に適用することができる。
に用いた、Tn10含有ファージは以下の様にして組立
てられた。出発物質は、ラムダC工857b2210a
m29である。このファージは当業者にとって既知であ
り〔クレックナ−(Klecknet ) 、ジャーナ
ル・オブ、モレキュラー・バイオロジー116,125
(1977))、ラムダの良く知られた3種の突然
変異体から標準的な4方法で組立てられた。このラムダ
ファージのリゼイトを、当業者既知の方法で操作し、T
n10トランスポゾンを担持させでおいたアンバー・サ
プレッサー(抑圧)大腸菌C600(ATCCジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー116.125
(1977)Jo このリゼイトを用い、アンバーサプ
レッサーとC1857遺伝型を持ったラムダプロファー
ジを含有する大PA 600△ (ラムダCl857)に感染させた。テトラサイクリン
耐性コロニーを、ブロス中、32℃、次いで42℃で9
0分間、増殖させることによって熱誘導し、テトラサイ
クリン耐性コロニーノリゼイトを調製した。このリゼイ
トを大腸菌C600上にプレートし、レプリカ平板法に
付した。大腸菌C600上に現われたプラークを大腸菌
C600と、異種免疫プロファージ・ラムダimm 4
34を含有している大腸菌wa 102 sup+(ラ
ムダ1mm434 )Cクレツクナーら、ジエネテイツ
クス90,427 (1978))との上でレプリカ平
板法に付した。異種免疫株上に現われたプラークをテト
ラサイクリン平板上にプレートした。これらの平板上に
現われたプラークはテトラサイクリン耐性を形質導入す
ることができ、これらを、上記の大腸菌W3110 f
hu A−の調製法に適用することができる。
天然のt−PAおよび突然変異t t!PAは、適当r
l t −P Aおよび突然変異t−PAプラスミドに
よって形質転換された細胞の培養物(101りから得ら
れた。トリプトファン欠損培地を用いて発現を誘導した
。
l t −P Aおよび突然変異t−PAプラスミドに
よって形質転換された細胞の培養物(101りから得ら
れた。トリプトファン欠損培地を用いて発現を誘導した
。
現ベクター
プラスミドpPADHFR−5(pETPFRとも称さ
れる。EPO出願公開493619(前掲)参照。〕を
第9図に示す。天然のt−PA構造遺伝子の発現は、5
V4QT−抗原の初期プロモーターのコントロール下に
ある。このプロモーターは、DHFR遺伝子の発現をも
コントロールする。Bgl ’Jl、BstXIおよび
BstE■制限部位に注意が払われた。pPADHFR
−6をBgl 、[とBstE■で消化し、生成した大
きいフラグメントを単離することにより、フラグメント
1(第9図)を得た。pPADHFR−6をBgl■と
BstXI とで消化し、400塩基対の【−PAフ
ラグメントを単離することにより、フラグメント2(第
9図)を得た。各突然変異t−PAクローンから得たR
FDNAをBst X 工とBstE■で消化すること
により、第9図のフラグメント3に相当する、所望の突
然変異を含む1,141塩基対のt−PAフラグメント
を得た。フラグメント1およびフラグメント2を、各フ
ラグメント3とライゲートさせた。このDNA混合物を
用いて、大腸菌を形質転換した。各形質転換体か―歩←
争以下の真核性発現ベクターが得られた。
れる。EPO出願公開493619(前掲)参照。〕を
第9図に示す。天然のt−PA構造遺伝子の発現は、5
V4QT−抗原の初期プロモーターのコントロール下に
ある。このプロモーターは、DHFR遺伝子の発現をも
コントロールする。Bgl ’Jl、BstXIおよび
BstE■制限部位に注意が払われた。pPADHFR
−6をBgl 、[とBstE■で消化し、生成した大
きいフラグメントを単離することにより、フラグメント
1(第9図)を得た。pPADHFR−6をBgl■と
BstXI とで消化し、400塩基対の【−PAフ
ラグメントを単離することにより、フラグメント2(第
9図)を得た。各突然変異t−PAクローンから得たR
FDNAをBst X 工とBstE■で消化すること
により、第9図のフラグメント3に相当する、所望の突
然変異を含む1,141塩基対のt−PAフラグメント
を得た。フラグメント1およびフラグメント2を、各フ
ラグメント3とライゲートさせた。このDNA混合物を
用いて、大腸菌を形質転換した。各形質転換体か―歩←
争以下の真核性発現ベクターが得られた。
pPADHFR−61B8
pPADHFR−62C9
pPADHFR−54AIQ
pPADHFR−63A7
pPADHFR−64B3
これらのプラスミドを、非−突然変異t−PA発現ベク
ターpPADHFR−5と同様に用い、DHFR欠損C
HO細胞をトランスフェクトした〔グラハム(Grah
am )ら、ヴイロロジイ(Virology ) 5
2.456(1973)、およびEPO公開AO936
19参照〕。培養物を、濃度の高いメトトレキセートに
さらすことにより、天然および突然変異t−PAの発現
を増巾することができる。
ターpPADHFR−5と同様に用い、DHFR欠損C
HO細胞をトランスフェクトした〔グラハム(Grah
am )ら、ヴイロロジイ(Virology ) 5
2.456(1973)、およびEPO公開AO936
19参照〕。培養物を、濃度の高いメトトレキセートに
さらすことにより、天然および突然変異t−PAの発現
を増巾することができる。
例えば、グラハムらのりん酸カルシウム沈降法〔ヴイロ
ロジイ52,456(1973)E を用い、プラスミ
ドpPADHFR−62C9およびpPADHFR−6
1B8により、DHFR欠損CHO細胞をトランスフェ
クトすることができる〔ウーラブおよびチャッシン(U
rlab andChasin ) PNAS 77
.4219(1980)3゜いずれの場合においでも、
選択培地(ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く培地、即ち、−HGT培地)中に生じたコロニーを
プールし、さらに−HGH培地で増殖させる。これらの
細胞を、250 nMメトトレキセート中、100mm
の平板当り2X105 細胞の割合でプレートし、プラ
スミド配列の増幅に関して選択する。
ロジイ52,456(1973)E を用い、プラスミ
ドpPADHFR−62C9およびpPADHFR−6
1B8により、DHFR欠損CHO細胞をトランスフェ
クトすることができる〔ウーラブおよびチャッシン(U
rlab andChasin ) PNAS 77
.4219(1980)3゜いずれの場合においでも、
選択培地(ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く培地、即ち、−HGT培地)中に生じたコロニーを
プールし、さらに−HGH培地で増殖させる。これらの
細胞を、250 nMメトトレキセート中、100mm
の平板当り2X105 細胞の割合でプレートし、プラ
スミド配列の増幅に関して選択する。
250 nMメトトレセート中で増殖した5個のり△
ローンを平板から抽出したところ、これら全てがt−P
Aを培地中に分泌していることが分った。
Aを培地中に分泌していることが分った。
これらのクローンを以後の研究に充てた。
上記の如<、咄乳類細胞中で発現された様々なt−PA
類が細胞培養の培地中に分泌された。この様r、(t−
PA類を含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用
いるか、あるいは、それらの測定法に適用する前に下記
の精製工程の1またはそれ以上に付し、t−PAまたは
突然変異t−PAの純度を高めた。
類が細胞培養の培地中に分泌された。この様r、(t−
PA類を含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用
いるか、あるいは、それらの測定法に適用する前に下記
の精製工程の1またはそれ以上に付し、t−PAまたは
突然変異t−PAの純度を高めた。
突然変異t −PAを含むCHO細胞の培地を、リッケ
ン(Ri jken )ら〔ビオシミ力・工・ビオライ
ジオ・アクタ(Biochim、 k Biophy
s。
ン(Ri jken )ら〔ビオシミ力・工・ビオライ
ジオ・アクタ(Biochim、 k Biophy
s。
Acta、 ) 580.140(1979) 〕 o
方法に従い、塩化亜鉛で活性化したキレート化セファロ
ース(5epharose )(ファルマシア)により
、バッチ抽出し〔樹脂10〜20 (m/)/培地(I
り )、フィルター上に収集した。樹脂をカラムに注入
し、0.02Mりん酸ナトリウム(pHs、o ) 、
0.25M Na(J 、 Q、Q l % TWEE
N 13 Q 、およびアプロチニンIOm!i’/I
!を含んだバッファー中で洗浄した。5QmMイミダゾ
ールを含有する同じバッファーでt−PAを溶離した。
方法に従い、塩化亜鉛で活性化したキレート化セファロ
ース(5epharose )(ファルマシア)により
、バッチ抽出し〔樹脂10〜20 (m/)/培地(I
り )、フィルター上に収集した。樹脂をカラムに注入
し、0.02Mりん酸ナトリウム(pHs、o ) 、
0.25M Na(J 、 Q、Q l % TWEE
N 13 Q 、およびアプロチニンIOm!i’/I
!を含んだバッファー中で洗浄した。5QmMイミダゾ
ールを含有する同じバッファーでt−PAを溶離した。
t−PAプールを、0.02Mりん酸ナトリウム(pH
8)、0.25MN a C!および0. OI X
TWEEN 80 中テ透析L、リジン・セファロース
樹脂〔ラドクリッフエ(Radcliffe ) ラ
、アーク・バイオヶム・パイオフィス(Arch、Bi
ochem、Binphys ) 189、185 (
197s )および、アレ7 (A11en )ら、ト
ロンボシス・ヘモスタシス(Thrombos i s
Heamostasis ) 45.43(1981)
)に適用するか、または、ベンザミジン・セファロース
樹脂〔ビコース力(Bykowska )ら、ビオシミ
力・工°ビオフイジカ°アクタ、703113 (19
82)〕に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合には、0
゜02Mりん酸ナトリウム(pH8)、1MNacIお
よび0.01%TWEEN3Qで簡単に洗浄した後、0
.5Mアルギニンを含む同一のバッファーでL −PA
または突然変異t−PAを溶離した。ベンザミジンセフ
ァロースは、透析バッファーで洗浄した後、1Mグアニ
ジンを含む透析バッファーで溶離した。得られたタンパ
ク質は、5DS−PAGEによる分析で、純度90%以
上であることが示された。上記の精製法の外、固定化し
たモノクローナル抗体を用いる方法〔ニールセン(Ni
elsen )ら、EMBOJ、2.115(1983
)参照〕をも使用できる。
8)、0.25MN a C!および0. OI X
TWEEN 80 中テ透析L、リジン・セファロース
樹脂〔ラドクリッフエ(Radcliffe ) ラ
、アーク・バイオヶム・パイオフィス(Arch、Bi
ochem、Binphys ) 189、185 (
197s )および、アレ7 (A11en )ら、ト
ロンボシス・ヘモスタシス(Thrombos i s
Heamostasis ) 45.43(1981)
)に適用するか、または、ベンザミジン・セファロース
樹脂〔ビコース力(Bykowska )ら、ビオシミ
力・工°ビオフイジカ°アクタ、703113 (19
82)〕に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合には、0
゜02Mりん酸ナトリウム(pH8)、1MNacIお
よび0.01%TWEEN3Qで簡単に洗浄した後、0
.5Mアルギニンを含む同一のバッファーでL −PA
または突然変異t−PAを溶離した。ベンザミジンセフ
ァロースは、透析バッファーで洗浄した後、1Mグアニ
ジンを含む透析バッファーで溶離した。得られたタンパ
ク質は、5DS−PAGEによる分析で、純度90%以
上であることが示された。上記の精製法の外、固定化し
たモノクローナル抗体を用いる方法〔ニールセン(Ni
elsen )ら、EMBOJ、2.115(1983
)参照〕をも使用できる。
SDS −PAGE )
t−PAタンパク質またはt−PA突突然変異体タンパ
雪質含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SOS)試料バッファーで希釈した。指示された
如く、lQmMジチオトレイトール(DTT)を加えて
タンパク質ジスルフィドを減少させた。レムIJ (L
aemml i ) の方法〔レムリ、ネイチャー2
27.680 (1970)〕に従い、10%または7
〜17%ポリアクリルアミド溶解ゲルを用い、不連続な
SDS電気泳動を行った。血漿試料の分析には、レムリ
のバッファー系と一緒に、4%〜10%SDSポリアク
リルアミド・グラディエンド・溶解ゲルを用いた。
雪質含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SOS)試料バッファーで希釈した。指示された
如く、lQmMジチオトレイトール(DTT)を加えて
タンパク質ジスルフィドを減少させた。レムIJ (L
aemml i ) の方法〔レムリ、ネイチャー2
27.680 (1970)〕に従い、10%または7
〜17%ポリアクリルアミド溶解ゲルを用い、不連続な
SDS電気泳動を行った。血漿試料の分析には、レムリ
のバッファー系と一緒に、4%〜10%SDSポリアク
リルアミド・グラディエンド・溶解ゲルを用いた。
分子量既知のタンパク質の移動度との比較により、5D
S−PAC,E分析に基づく分子量を概算した。
S−PAC,E分析に基づく分子量を概算した。
気泡放出血餅溶解法(バブル・IJ IJ−ズ・クロッ
ト・リシス・アッセイ)により、組換え(非−突然変異
)t−PAおよび、本発明の突然変異を−PA(突然変
異t−PA)のフィブリン血餅溶解活性を調べた。
ト・リシス・アッセイ)により、組換え(非−突然変異
)t−PAおよび、本発明の突然変異を−PA(突然変
異t−PA)のフィブリン血餅溶解活性を調べた。
簡単に述べると、トロンビン(シグマ・ケミカルC01
)を約1000単位/mtの割合で蒸留水に溶かした。
)を約1000単位/mtの割合で蒸留水に溶かした。
このストック溶液を、0.06M−塩基性りん酸ナトリ
ウム、0.06M二塩基性りん酸ナトリウム、200m
f/l ナトリウム・アジドおよび0.01%TWE
EN80を含むアッセイ・バッファーで1:30に希釈
した。トロンヒン希釈液(30〜40単位/mり0.5
1nlと種々の濃度のt−PA(16ng/m/〜1x
lO6ng/rnl)の内、いずれか0.5rnlとを
入れた一連の試験管、並びに適当な対照または、適当に
希釈した未知試料を入れた試験管を用意した。第2の試
験管群として、プラスミノゲン(1,0■/m/)20
μ!、およびフイブリノゲン(1■/m/)1.0−お
よび40メツシュ以上の中空ガラス製微小球(3Mカン
パニー)10μjを入れたものを用意した。
ウム、0.06M二塩基性りん酸ナトリウム、200m
f/l ナトリウム・アジドおよび0.01%TWE
EN80を含むアッセイ・バッファーで1:30に希釈
した。トロンヒン希釈液(30〜40単位/mり0.5
1nlと種々の濃度のt−PA(16ng/m/〜1x
lO6ng/rnl)の内、いずれか0.5rnlとを
入れた一連の試験管、並びに適当な対照または、適当に
希釈した未知試料を入れた試験管を用意した。第2の試
験管群として、プラスミノゲン(1,0■/m/)20
μ!、およびフイブリノゲン(1■/m/)1.0−お
よび40メツシュ以上の中空ガラス製微小球(3Mカン
パニー)10μjを入れたものを用意した。
上記の試験管および諸薬を、この測定の最終段階に至る
まで、氷上に保持した。トロンビン−【−PAまたはト
ロンビン−突然変異t−PA溶液のいずれか一方200
μlを、プラスミノゲン、フイブリノゲン、および微小
球を含む試験管に順次加え、15秒間旋回攪拌(ポルテ
ックス)した後、37℃の水浴中に入れた。各試験管内
には、30秒以内に血餅が形成された。t −PA添加
から反応終点までの所要時間を測定した。終点を、測定
中に、微小球が表面へ上昇した時点と定めた。
まで、氷上に保持した。トロンビン−【−PAまたはト
ロンビン−突然変異t−PA溶液のいずれか一方200
μlを、プラスミノゲン、フイブリノゲン、および微小
球を含む試験管に順次加え、15秒間旋回攪拌(ポルテ
ックス)した後、37℃の水浴中に入れた。各試験管内
には、30秒以内に血餅が形成された。t −PA添加
から反応終点までの所要時間を測定した。終点を、測定
中に、微小球が表面へ上昇した時点と定めた。
特定の試料の血栓崩壊活性の値は、t−PAA準曲線を
参照して決定された。比活性は、ラジオイムノアッセイ
により測定したt −PAまたは突然変異t−PAの量
に基づいて算出された。
参照して決定された。比活性は、ラジオイムノアッセイ
により測定したt −PAまたは突然変異t−PAの量
に基づいて算出された。
4、インビトロにおける血餅溶解測定
インビトロの血餅溶解系を用い、組換えt−PAおよび
突然変異L−PAの測定を行った。
突然変異L−PAの測定を行った。
ヒト血液を、抗凝固剤として3.13%クエン酸すl−
IJウムを用いて採取し、遠心して細胞分画を除いた。
IJウムを用いて採取し、遠心して細胞分画を除いた。
各血漿1−に、0゜5 M Ca C/ 2501’
l、ウシ−トロンビン(Zoo単位/m/)25μlお
よびヒト I−フイブリノゲン(100,000cp
m/10μ1)10μjを加えた。この血漿ミッリスを
内径4 mmのシリコン管に吸上げ、37℃で1時間イ
ンキュベートした。管のセグメント(小片、1備)を切
り、血餅を除9)だ。この血餅を、0.3MNaC/、
0.02M クエン酸ナトリウム(pH5)および0
.01%TWEEN80から成るバッファーに入れた。
l、ウシ−トロンビン(Zoo単位/m/)25μlお
よびヒト I−フイブリノゲン(100,000cp
m/10μ1)10μjを加えた。この血漿ミッリスを
内径4 mmのシリコン管に吸上げ、37℃で1時間イ
ンキュベートした。管のセグメント(小片、1備)を切
り、血餅を除9)だ。この血餅を、0.3MNaC/、
0.02M クエン酸ナトリウム(pH5)および0
.01%TWEEN80から成るバッファーに入れた。
血餅を、1時間当り4回。
調製したでのバッファーで洗浄した。最後の洗液中の放
射性活性は、血餅中の放射性活性の約10%を越すこと
はなかった。各血餅を血92.5 tnl中に入れた。
射性活性は、血餅中の放射性活性の約10%を越すこと
はなかった。各血餅を血92.5 tnl中に入れた。
血漿試料250μlをとり、0点とした。t−PAまた
は突然変異t −PA紙試料容量100μlづつ加えた
。1,2.3および4時間口に試料(250μj)を採
取し、その放射性活性を測定した。t−PA活性を1r
nl中に5.10.20および40単位含有する標準試
料についでも同時に行った。各試料採取後の容量変化を
補正した後、溶解%を算出した。
は突然変異t −PA紙試料容量100μlづつ加えた
。1,2.3および4時間口に試料(250μj)を採
取し、その放射性活性を測定した。t−PA活性を1r
nl中に5.10.20および40単位含有する標準試
料についでも同時に行った。各試料採取後の容量変化を
補正した後、溶解%を算出した。
5、色素原法(クロモゲニツク・アッセイ)S−22F
8 : t−pAは、カビ(Kabi )合成トリペ
プチド色素原基質、52288 [ヘレナ・ラボラトリ
イズ(He1ena Laboratories )、
ビューモント、テキサス〕を用いて直接測定することが
できる。この測定は、t−PAとl m M S−22
88(終濃度)とを0.012MNaclおよび0.0
1%丁wEEN80とを含む0.05Mトリス(PH7
,4)中で37℃において10分間インキュベートする
ことにより1行われた。反応混合物0.5−に氷酢酸5
0μjを加えて反応を止めた。
8 : t−pAは、カビ(Kabi )合成トリペ
プチド色素原基質、52288 [ヘレナ・ラボラトリ
イズ(He1ena Laboratories )、
ビューモント、テキサス〕を用いて直接測定することが
できる。この測定は、t−PAとl m M S−22
88(終濃度)とを0.012MNaclおよび0.0
1%丁wEEN80とを含む0.05Mトリス(PH7
,4)中で37℃において10分間インキュベートする
ことにより1行われた。反応混合物0.5−に氷酢酸5
0μjを加えて反応を止めた。
活性は、4050mにおける吸収に基づき、以下の、業
者によって標準化されている等式を用いて算出された。
者によって標準化されている等式を用いて算出された。
S−2251: t−PAによるプラスミノゲンの活性
化を、プラスミンに特異的fl Ka b l特異的ト
リペプチド色素原基質、S−2251(ヘレナ・ラボラ
トリイズ)を用いて測定した。試料の一部をプラスミノ
ゲン0.7 m97m1 (0,012mNaC1!含
有0.05M)リス、pH7,4) o、t o−およ
びヒトフイブリノゲン20’W/rnl(0,012M
NaC!!含有0.05M1−リスHCl、 pH7,
4) 0.02−と混合し、容量を0.15iに調節し
た。この混合物を37℃で10分間インキュベートし、
52251 (上記バッファー中1.QmM溶液)0
.35−を加え、更に37℃で5または10分間反応を
続けた。氷酢酸50μlを加えて反応を終了させ、4
Q 5 nmにおける吸収を測定した。活性の定量化は
、結果を、S−2288アツセイによって予め標定され
た組換え天然t−PA試料から得た結果と比較しで行っ
た。これは、当初、プラスミノゲンが古くなることによ
って4 Q 5 nmにおける吸収が日々に異なり、ま
た、プラスミノゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる
方法が異なることによっても吸収が変化するので、必須
であった。
化を、プラスミンに特異的fl Ka b l特異的ト
リペプチド色素原基質、S−2251(ヘレナ・ラボラ
トリイズ)を用いて測定した。試料の一部をプラスミノ
ゲン0.7 m97m1 (0,012mNaC1!含
有0.05M)リス、pH7,4) o、t o−およ
びヒトフイブリノゲン20’W/rnl(0,012M
NaC!!含有0.05M1−リスHCl、 pH7,
4) 0.02−と混合し、容量を0.15iに調節し
た。この混合物を37℃で10分間インキュベートし、
52251 (上記バッファー中1.QmM溶液)0
.35−を加え、更に37℃で5または10分間反応を
続けた。氷酢酸50μlを加えて反応を終了させ、4
Q 5 nmにおける吸収を測定した。活性の定量化は
、結果を、S−2288アツセイによって予め標定され
た組換え天然t−PA試料から得た結果と比較しで行っ
た。これは、当初、プラスミノゲンが古くなることによ
って4 Q 5 nmにおける吸収が日々に異なり、ま
た、プラスミノゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる
方法が異なることによっても吸収が変化するので、必須
であった。
この可変性は、大量のヒトプラスミノゲン(glu−プ
ラスミノゲン)物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で
調製することにより、完全に減少された。各部分を一2
0℃で保存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノ
ゲン製品を0℃に保存するが、この時間は4時間以上で
あってはならない。
ラスミノゲン)物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で
調製することにより、完全に減少された。各部分を一2
0℃で保存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノ
ゲン製品を0℃に保存するが、この時間は4時間以上で
あってはならない。
フイブリノゲンによるt−PA活性の刺激は、フイブリ
ノゲンを除いた同一の反応混合物中に高濃度のフイブリ
ノゲンを入れた混液の活性との比較に基づき、測定され
た。フィブリンが不溶性であるために、このアッセイに
はフイブリノゲンが用いられた。高濃度のフイブリノゲ
ンによる刺激は予測される不溶性フィブリンによる刺激
と似ていると考えられる。
ノゲンを除いた同一の反応混合物中に高濃度のフイブリ
ノゲンを入れた混液の活性との比較に基づき、測定され
た。フィブリンが不溶性であるために、このアッセイに
はフイブリノゲンが用いられた。高濃度のフイブリノゲ
ンによる刺激は予測される不溶性フィブリンによる刺激
と似ていると考えられる。
ツセイ)
組換えt−PAおよび突然変異t−PAの、天然に存在
するt−PA活性に対する阻害物質との反応性をインビ
トロで測定した。一般的な方法として、L−PAおよび
突然変異t−PAを、ヨードビーズ(Iodobead
s ) (ピアス・ケミカル(Pierce Chem
ical ) co、 )を用いて 工でヨー素化し
、約2 X 1106cp/μgの放射性比活性を有す
るt −PAおよび突然変異t−PAを調製した。イン
ビトロでコンプレックスを形成させるには、放射性標識
t−PA(14g)を、採取したでのクエン酸処理−ヒ
ト全血(500μj)に加えた。試料を室温でインキュ
ベートした後、一部を2%SDS中に希釈することによ
り、反応を止めた。試料を4〜10%ポリアクリルアミ
ド・グラディエン)SDS−PAC,Eにかけて分析し
た。オートラジオグラフィーにより、コンプレックスを
検出した。
するt−PA活性に対する阻害物質との反応性をインビ
トロで測定した。一般的な方法として、L−PAおよび
突然変異t−PAを、ヨードビーズ(Iodobead
s ) (ピアス・ケミカル(Pierce Chem
ical ) co、 )を用いて 工でヨー素化し
、約2 X 1106cp/μgの放射性比活性を有す
るt −PAおよび突然変異t−PAを調製した。イン
ビトロでコンプレックスを形成させるには、放射性標識
t−PA(14g)を、採取したでのクエン酸処理−ヒ
ト全血(500μj)に加えた。試料を室温でインキュ
ベートした後、一部を2%SDS中に希釈することによ
り、反応を止めた。試料を4〜10%ポリアクリルアミ
ド・グラディエン)SDS−PAC,Eにかけて分析し
た。オートラジオグラフィーにより、コンプレックスを
検出した。
リツケンら(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ 257.2920(1982))の方法の改
良法でフィブリン結合を行った。被検【−PA試料(5
00ng)を、0.05M1−リス(PH7,4)、0
.12 M NaC/ 、 0.01%TWEEN8Q
、1rI!g/rnl ヒト血清アルブミンおよび種
々の濃度のプラスミノゲン不含フィブリノゲン(0,0
,1゜0.5および1.0rI1g/m/)を含む溶液
に加えた。反応混合物の最終容量は1rnlである。試
料を37℃で5分間インキュベートした後、トロピン1
単位を加えた。試料を37℃で1時間インキュベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清中に残存している非
−結合t−PAの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するt−PA結合%としてプロットした(
第11図)。
ストリイ 257.2920(1982))の方法の改
良法でフィブリン結合を行った。被検【−PA試料(5
00ng)を、0.05M1−リス(PH7,4)、0
.12 M NaC/ 、 0.01%TWEEN8Q
、1rI!g/rnl ヒト血清アルブミンおよび種
々の濃度のプラスミノゲン不含フィブリノゲン(0,0
,1゜0.5および1.0rI1g/m/)を含む溶液
に加えた。反応混合物の最終容量は1rnlである。試
料を37℃で5分間インキュベートした後、トロピン1
単位を加えた。試料を37℃で1時間インキュベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清中に残存している非
−結合t−PAの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するt−PA結合%としてプロットした(
第11図)。
8、インビボ血餅溶解
コレン(Co11en )らのインビボ血餅溶解モデル
〔ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーシ
ョ7 (J、 C11m、 Invest、) 71
.368(1983)J を用いた。雄性ニューシー
ラント・シロウサギ(2,5〜3.0kg)をケタミン
麻酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その付近の連結
小血管を結紮した。可逆的結紮法で約2cmの頚静脈を
単離し、このセグメント(切片)の近位側から遠位側へ
糸を渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で洗浄し
た後、125エ ヒトフィブリノゲンを含有する、ウサ
ギの鮮血を満たした。30分後、血餅を横切って血液は
流れ続けていた。t−PAの静脈内注入を、初期投与量
として全用量の10%を注入することで開始した。注入
は4時間にわたって行われた。注入終了の30分後、血
餅を収穫し・数えた。放射性活性の回収を定性対照に用
い、最初の血餅中に存在していた放射性活性量の概算値
の正確さを確認するために、血液試料、尿、綿棒および
注射器についても計算した。
〔ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーシ
ョ7 (J、 C11m、 Invest、) 71
.368(1983)J を用いた。雄性ニューシー
ラント・シロウサギ(2,5〜3.0kg)をケタミン
麻酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その付近の連結
小血管を結紮した。可逆的結紮法で約2cmの頚静脈を
単離し、このセグメント(切片)の近位側から遠位側へ
糸を渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で洗浄し
た後、125エ ヒトフィブリノゲンを含有する、ウサ
ギの鮮血を満たした。30分後、血餅を横切って血液は
流れ続けていた。t−PAの静脈内注入を、初期投与量
として全用量の10%を注入することで開始した。注入
は4時間にわたって行われた。注入終了の30分後、血
餅を収穫し・数えた。放射性活性の回収を定性対照に用
い、最初の血餅中に存在していた放射性活性量の概算値
の正確さを確認するために、血液試料、尿、綿棒および
注射器についても計算した。
F、測定の結果
二本鎖活性化部位、残基270〜279に以下の配列を
有するt−PA突然変異体が、大腸菌およびチヤイニー
ズ・ハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)内で発現され
た。
有するt−PA突然変異体が、大腸菌およびチヤイニー
ズ・ハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)内で発現され
た。
天然 −Ar g−11e−d、y、s −C,l y
−Gl y−(RIKGG)IB8 −Gay−11e
−Lys−Gly−Gly −(GIKGG)2C9−
Glu−11e−Lys−Gly−Gly −(EIK
GG)1、 ウェスタン・ブロツッ詔よびチモグラフィ
CHO細胞内で発現されたEIKCG突然変異体および
G I KGC;突然変異体を、還元または非還元5D
S−PAGEゲルによって導かれるウエスタンブロツッ
法で分析した。天然のj −PAは、グリコジル化の程
度の差により、分子量52.000およびso、ooo
ダルトンの2本のバンドとして現われた。非−還元
5DS−PAGEにおけるEIKGG突然変異体は、分
子量約50,000ダルトンの位置に、1本の主要な免
疫反応性バンドを示した。しかしながら、非−還元5D
S−PAGEにおけるGIKGG突然変異体のウェスタ
ンプロットは分子量55,000 ダルトンを示してい
た。
−Gl y−(RIKGG)IB8 −Gay−11e
−Lys−Gly−Gly −(GIKGG)2C9−
Glu−11e−Lys−Gly−Gly −(EIK
GG)1、 ウェスタン・ブロツッ詔よびチモグラフィ
CHO細胞内で発現されたEIKCG突然変異体および
G I KGC;突然変異体を、還元または非還元5D
S−PAGEゲルによって導かれるウエスタンブロツッ
法で分析した。天然のj −PAは、グリコジル化の程
度の差により、分子量52.000およびso、ooo
ダルトンの2本のバンドとして現われた。非−還元
5DS−PAGEにおけるEIKGG突然変異体は、分
子量約50,000ダルトンの位置に、1本の主要な免
疫反応性バンドを示した。しかしながら、非−還元5D
S−PAGEにおけるGIKGG突然変異体のウェスタ
ンプロットは分子量55,000 ダルトンを示してい
た。
GIKGG突然変異体の見掛は上の分子量と、天然のt
−PAの分子量との差異は、その炭水化物構造の立体配
座が天然のt−PAと異っていることを示すものと思わ
れる。arg275におけるタンパク質の開裂は、以下
の還元により(このことによってプロテアーゼ鎖とクリ
ングル鎖とが分離する)低分子量のt−PAを分析する
ことにより、検出される。還元5DS−PAGEゲルの
チモグラフは、これらの試料中のプラスミノゲン活性化
因子の活性が、一本鎖形t−PAの免疫反応性バンドの
分子量(約60,000 )の位置にあることを示して
いる。二本鎖形t−PAの電気泳動における移動度は、
分子量約30,000 ダルトンと一致している。こ
の方法により、一本鎖形の突然変異t−PAタンノエタ
質が・形質転換された細胞の培地中に存在していること
が証明された。
−PAの分子量との差異は、その炭水化物構造の立体配
座が天然のt−PAと異っていることを示すものと思わ
れる。arg275におけるタンパク質の開裂は、以下
の還元により(このことによってプロテアーゼ鎖とクリ
ングル鎖とが分離する)低分子量のt−PAを分析する
ことにより、検出される。還元5DS−PAGEゲルの
チモグラフは、これらの試料中のプラスミノゲン活性化
因子の活性が、一本鎖形t−PAの免疫反応性バンドの
分子量(約60,000 )の位置にあることを示して
いる。二本鎖形t−PAの電気泳動における移動度は、
分子量約30,000 ダルトンと一致している。こ
の方法により、一本鎖形の突然変異t−PAタンノエタ
質が・形質転換された細胞の培地中に存在していること
が証明された。
S−2251法による天然、並びに突然変異EIKGG
t−PAの分析結果を表工に示す。これらの値は、
測定の変動性を減少するために、測定中にglu−プラ
スミノゲンを用いる前に得たものである。天然に存在し
ているt−PA配列艮I KGC,は、52288法に
基づき、フィブリノゲンの存在下、無作為な(任意の)
比活性を示すものと帰属された。このt−PA積標準、
各EIKGGt−PA突然変異体と一緒に測定し、結果
の規格化を図った。
t−PAの分析結果を表工に示す。これらの値は、
測定の変動性を減少するために、測定中にglu−プラ
スミノゲンを用いる前に得たものである。天然に存在し
ているt−PA配列艮I KGC,は、52288法に
基づき、フィブリノゲンの存在下、無作為な(任意の)
比活性を示すものと帰属された。このt−PA積標準、
各EIKGGt−PA突然変異体と一緒に測定し、結果
の規格化を図った。
EIKGG t−PA突然変異体は、精製の程度に関
係なく、52251+フイブリノゲン法において、組換
えt−PAよりも大きい比活性を有することが・jる。
係なく、52251+フイブリノゲン法において、組換
えt−PAよりも大きい比活性を有することが・jる。
表 工
RIKGG’ native (250,000)
’ 25,000 10.0EIKGG 2C9
1,000,0003,400290,0EIKGG
2C9420,0003,100134,0EIKGG
2G9520,0007,00074.01、亜鉛キ
レート・リジン−アガロースを用いて精製。
’ 25,000 10.0EIKGG 2C9
1,000,0003,400290,0EIKGG
2C9420,0003,100134,0EIKGG
2G9520,0007,00074.01、亜鉛キ
レート・リジン−アガロースを用いて精製。
2、亜鉛キレートおよびベンザミジン・アガロースを用
いて精製。
いて精製。
3、精製せずに測定。
4、帰属された活性値。
表工Aのデーターは、高質度の凍結乾燥glu−プラス
ミノゲンを用いで得られた。より再現性の高い方法にお
いて、フィブリノゲン存在下、S−2251法における
E IKGG突然変異体の活性は等しいことが分った。
ミノゲンを用いで得られた。より再現性の高い方法にお
いて、フィブリノゲン存在下、S−2251法における
E IKGG突然変異体の活性は等しいことが分った。
フィブリノゲン不存在下では、突然変異体の活性は依然
として天然物のそれよりも低く(表■および表IA)、
特異性の大きいことが証明された。
として天然物のそれよりも低く(表■および表IA)、
特異性の大きいことが証明された。
表 工A
RIKGG’ native (250,000)2
17,600 14EIKGG’ 2C924
8,0005005001、亜鉛キレート・リジンアガ
ロースを用いて精製。
17,600 14EIKGG’ 2C924
8,0005005001、亜鉛キレート・リジンアガ
ロースを用いて精製。
2、帰属された活性。
血餅溶解法
組換えt−PAおよび精製EIKGG t−PA突然
変異体の比活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法
を用いた。上記の方法で、これら各【−PA類の活性を
測定した。t−PAおよびEIKGG突然変異体t−P
Aの濃度は、放射線免疫検定法で求めた。測定結果およ
び比活性を表■に表 ■ I EIKGG* 8440 0.088
95,9092 EIKGG* 7698
0.088 87,4773 t−PA
# 5640 0.088 64,0901
)凍結−解凍(1回)。
変異体の比活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法
を用いた。上記の方法で、これら各【−PA類の活性を
測定した。t−PAおよびEIKGG突然変異体t−P
Aの濃度は、放射線免疫検定法で求めた。測定結果およ
び比活性を表■に表 ■ I EIKGG* 8440 0.088
95,9092 EIKGG* 7698
0.088 87,4773 t−PA
# 5640 0.088 64,0901
)凍結−解凍(1回)。
2)凍結−解凍(4回)。
八
で精製。
**亜鉛キレートおよびリジン−アガロースで精製。
この気泡放出血餅溶解法の結果は、一本鎖【−PA突然
変異体、特に、EIKGG突然変異を−PAO比活性が
、組換えt−PAよりも50%以上高いことを証明する
ものである。凍結と解凍を繰返すことにより、EIKG
Gt −PA突然変異体の比活性が僅かに減少されると
思われる。しかしながら、それでもなお、突然変異t−
PAO比活性は、組換えt−PAのそれよりも高く維持
される。
変異体、特に、EIKGG突然変異を−PAO比活性が
、組換えt−PAよりも50%以上高いことを証明する
ものである。凍結と解凍を繰返すことにより、EIKG
Gt −PA突然変異体の比活性が僅かに減少されると
思われる。しかしながら、それでもなお、突然変異t−
PAO比活性は、組換えt−PAのそれよりも高く維持
される。
(アッセイ)
血漿プロテアーゼ阻害物質によるプロテアーゼ類の不活
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されでいる。生成されたコンプレックス(複合体)
は変性に対して安定であるため、505−PAGE電気
泳動法によって評価することができる。この方法では、
放射性標識L−PAを血漿または全血に加え、37℃で
インキュベートする。試料を、5DS−PAGE1次い
でオートラジオグラフィーにかける。遊離のt−PAよ
りも大きい分子量(Mr)位置における放射性標識を検
出することにより、形成された1 −PAプロテアーゼ
阻害物質とのコンプレックスの量が求められる。ラット
の血液中で分析したところ、t−PAは、Mr200,
000以上ノコンプレックスをゆっくり、形成すること
が分った。数時間のインキュベーションの後、これらの
コンプレックス中に、70%以上の放射性標識が検出さ
れた。これに反して、突然変異t−PAはこの様なコン
プレックスを形成しなかった。即ち、オートラジオグラ
フィーで検出した放射性標識の大部分は、遊離の、不活
化されでいない酵素の位置に止まっていた。ヒト血液中
で同様な実験を行うと(第10図)、t−PAはここで
も同様なコンプレックスを形成すると共に、Mrが10
0,000〜200.000 のコンプレックスをも
形成した。ラットの血液を用いた場合と同様に、突然変
異体L−PAと阻害物質とは、Mr200.000以上
のコンプレツ・クスを殆んど形成しなかった。しかし、
Mr値ioo、ooo 〜200,000の、プロテア
ーゼ阻害物質コンプレックスは存在しでいた。これらの
結果は、突然変異体が、分子量200.QOO以上のコ
ンプレックスを形成する様なプロテア−ゼ阻害物質によ
っては不活化されないことを示すものである。t−PA
および突然変異t−PA両者の、分子量100.000
〜200,000のコンプレックス形成における反応性
には種特異性が認められた。
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されでいる。生成されたコンプレックス(複合体)
は変性に対して安定であるため、505−PAGE電気
泳動法によって評価することができる。この方法では、
放射性標識L−PAを血漿または全血に加え、37℃で
インキュベートする。試料を、5DS−PAGE1次い
でオートラジオグラフィーにかける。遊離のt−PAよ
りも大きい分子量(Mr)位置における放射性標識を検
出することにより、形成された1 −PAプロテアーゼ
阻害物質とのコンプレックスの量が求められる。ラット
の血液中で分析したところ、t−PAは、Mr200,
000以上ノコンプレックスをゆっくり、形成すること
が分った。数時間のインキュベーションの後、これらの
コンプレックス中に、70%以上の放射性標識が検出さ
れた。これに反して、突然変異t−PAはこの様なコン
プレックスを形成しなかった。即ち、オートラジオグラ
フィーで検出した放射性標識の大部分は、遊離の、不活
化されでいない酵素の位置に止まっていた。ヒト血液中
で同様な実験を行うと(第10図)、t−PAはここで
も同様なコンプレックスを形成すると共に、Mrが10
0,000〜200.000 のコンプレックスをも
形成した。ラットの血液を用いた場合と同様に、突然変
異体L−PAと阻害物質とは、Mr200.000以上
のコンプレツ・クスを殆んど形成しなかった。しかし、
Mr値ioo、ooo 〜200,000の、プロテア
ーゼ阻害物質コンプレックスは存在しでいた。これらの
結果は、突然変異体が、分子量200.QOO以上のコ
ンプレックスを形成する様なプロテア−ゼ阻害物質によ
っては不活化されないことを示すものである。t−PA
および突然変異t−PA両者の、分子量100.000
〜200,000のコンプレックス形成における反応性
には種特異性が認められた。
t−PAの一本鎖形および二本鎖形が、略等しいフィブ
リン親和性を有することは既に報告されている〔リッケ
ンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
257.2920(1982)J。
リン親和性を有することは既に報告されている〔リッケ
ンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
257.2920(1982)J。
本明細書に記載した測定法によると、二本鎖形【−PA
との比較において、一本鎖形t−PAは、フィブリンに
対し、著しく高い親和性を示した(第11図)。
との比較において、一本鎖形t−PAは、フィブリンに
対し、著しく高い親和性を示した(第11図)。
5、 インビボにおける血餅溶解
第12図は、t−PA(o )およびEIK突然変異体
(0)の相対的な用量一応答曲線を示すグラフである。
(0)の相対的な用量一応答曲線を示すグラフである。
これらのデーターは、各群5匹づつのウサギに関する平
均値+/−5EMで示されでいる。50%溶解点の2本
の曲線間の距離を測定し、EIK形のt−PAの能力は
、非突然変異形(RIK)のt−PAの2.4倍以上で
あると見積られた。統計上有意な差は、用量0.25■
/kgにおいて得られた(P<0.01)。
均値+/−5EMで示されでいる。50%溶解点の2本
の曲線間の距離を測定し、EIK形のt−PAの能力は
、非突然変異形(RIK)のt−PAの2.4倍以上で
あると見積られた。統計上有意な差は、用量0.25■
/kgにおいて得られた(P<0.01)。
G、結論
以上の結果に基づき、以下の2つの理由から、t−PA
の275位における突然変異体は、天然形のt−PAよ
りも有効と思われる。
の275位における突然変異体は、天然形のt−PAよ
りも有効と思われる。
1)特異性の増大:t−PA機能の測定結果は、より活
性およびまたは特異的なタンパク質(活性/特異性タン
パク質)であることを示している。
性およびまたは特異的なタンパク質(活性/特異性タン
パク質)であることを示している。
2)インビボにおける血漿性阻害物質との結合性の低下
;その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある
種のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレックスを形成していない
形のt−PAが循還されることになり、従って、血餅溶
解機能が増大されたt−PAが循還されるのである。
;その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある
種のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレックスを形成していない
形のt−PAが循還されることになり、従って、血餅溶
解機能が増大されたt−PAが循還されるのである。
科学文献における一水路形t−PAの酵素的特性に関す
る報告は逆である。t−PAの機能をより良く理解する
には、それとホモローガスなタンパク質を考察すると良
い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリ
プシンに関しで、広範な研究が行われでいる。t−PA
のプロテアーゼ領域はこれらのタンパク質と非常によく
似ており、従って、同様の方法で機能するものと思われ
る。
る報告は逆である。t−PAの機能をより良く理解する
には、それとホモローガスなタンパク質を考察すると良
い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリ
プシンに関しで、広範な研究が行われでいる。t−PA
のプロテアーゼ領域はこれらのタンパク質と非常によく
似ており、従って、同様の方法で機能するものと思われ
る。
トリプシンおよびキモトリプシンに関して決定された機
能的な機構に基づき、t−PAの275番目のアルギニ
ン位置における開裂を阻止すると、プロテアーゼ領域の
機能上の特徴のみが影響を受けると予想された。従って
、突然変異体のフィブリン親和性の増大は驚ろくべきこ
とである。
能的な機構に基づき、t−PAの275番目のアルギニ
ン位置における開裂を阻止すると、プロテアーゼ領域の
機能上の特徴のみが影響を受けると予想された。従って
、突然変異体のフィブリン親和性の増大は驚ろくべきこ
とである。
関連する機構(類)(特異性の増大、プロテアーゼ阻害
物質との結合性の欠如、フィブリンとの親和性の増加、
あるいはこれらの組合わせ)を考慮しないにしでも、イ
ンビボでの、ブロックされた静脈に対する溶解能力に関
する試験においで、突然変異体は、天然のt−PAの約
2.5倍もの高い活性を示した。既に述べた様に、−水
路形【−PAは、血餅の部分で二本鎖形に変換されるこ
と換 が示された。その様な変によって、−水路形が有△ する長所は全て破壊されでしまうことになる。生理的プ
ロテアーゼによって2本鎖に変換され得る突然変異形の
t−PAのみが、血餅の部位で一度、その長所を保持し
続けることができる。
物質との結合性の欠如、フィブリンとの親和性の増加、
あるいはこれらの組合わせ)を考慮しないにしでも、イ
ンビボでの、ブロックされた静脈に対する溶解能力に関
する試験においで、突然変異体は、天然のt−PAの約
2.5倍もの高い活性を示した。既に述べた様に、−水
路形【−PAは、血餅の部分で二本鎖形に変換されるこ
と換 が示された。その様な変によって、−水路形が有△ する長所は全て破壊されでしまうことになる。生理的プ
ロテアーゼによって2本鎖に変換され得る突然変異形の
t−PAのみが、血餅の部位で一度、その長所を保持し
続けることができる。
本発明の好ましい態様を記載したが、当業者ならば、本
明細書中で開示した態様に種の修飾を施△ すことカイでき、また、それらの修飾も本発明の範囲内
にあることを理解できる。
明細書中で開示した態様に種の修飾を施△ すことカイでき、また、それらの修飾も本発明の範囲内
にあることを理解できる。
第1図はヒトt−PA並びにその5′および3′よび2
+図は、プレーt −PAおよびその5′−および3′
−非翻訳領域のDNA配列およびアミノ酸配列12H2
klOHである。第3図は275位に突然変異を有する
クローン類の組立て模式図である。第4.5.6.7お
よび8図はpXAPPA183′△xlQtrpRの組
立て模式図である。第9図はプラスミドpPADHFR
,−5の制限部位を示す模式図である。第10図は5D
S−PAGEゲルを用い、オートラジオグラフィーで検
出した放射性標識t−PA(左側)およびE I KG
G t −PA(右側)と血桑プロテアーゼ阻害物質と
のコンプレックスの形成を示す映像の模写図である・第
11図は一水路t−PA、二本鎖t−PAおよび一水路
突然変異t−PAとフィブリンとの結合活性を示すグラ
フである。第12図は、インビボでのEIKおよびrt
−PAの血餅溶解作用の用量一応答曲線を示すグラフ
である。
+図は、プレーt −PAおよびその5′−および3′
−非翻訳領域のDNA配列およびアミノ酸配列12H2
klOHである。第3図は275位に突然変異を有する
クローン類の組立て模式図である。第4.5.6.7お
よび8図はpXAPPA183′△xlQtrpRの組
立て模式図である。第9図はプラスミドpPADHFR
,−5の制限部位を示す模式図である。第10図は5D
S−PAGEゲルを用い、オートラジオグラフィーで検
出した放射性標識t−PA(左側)およびE I KG
G t −PA(右側)と血桑プロテアーゼ阻害物質と
のコンプレックスの形成を示す映像の模写図である・第
11図は一水路t−PA、二本鎖t−PAおよび一水路
突然変異t−PAとフィブリンとの結合活性を示すグラ
フである。第12図は、インビボでのEIKおよびrt
−PAの血餅溶解作用の用量一応答曲線を示すグラフ
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、組換え宿主細胞によつて生産され、特異的な酵素的
開裂に抵抗性を有する、ヒト組織プラスミノゲン活性化
因子(t−PA)突然変異体。 2、実質上、二本鎖形を含まない第1項記載の突然変異
体。 3、一本鎖突然変異体である第1項記載の突然変異体。 4、二本鎖開裂部位における部位特異的突然変異誘発に
より、一本鎖形が安定化されている第3項記載の一本鎖
突然変異体。 5、275位がアルギニン以外のアミノ酸残基によつて
占められている第4項記載の突然変異体。 6、該アミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸からなる
群から選択されるものである第5項記載の突然変異体 7、該二本鎖活性化部位がt−PAの残基270から2
79の範囲内に存在しており、該部位特異的突然変異誘
発が、該二本鎖活性化部位内の少なくとも1個のアミノ
酸残基の置換によるものである、第4項記載の突然変異
体。 8、該置換が残基276のイソロイシンの置換である第
7項記載の突然変異体。 9、該置換が残基275のアルギニンの置換である第7
項記載の突然変異体。 10、組換え宿主細胞によつて生産され、プロテアーゼ
阻害物質との親和性が減少されている、一本鎖組織プラ
スミノゲン活性化因子突然変異体。 11、組換え宿主細胞によつて生産され、プラスミノゲ
ンの変換において、非−突然変異組織プラスミノゲン活
性化因子よりも高い比活性を有する一本鎖組織プラスミ
ノゲン活性化因子突然変異体。 12、トリプシン様開裂部位における酵素的加水分解に
対して安定化された突然変異体であつて、該開裂部位が
アルギニンまたはリジンを含み、該開裂部位の1または
それ以上のアミノ酸が異るアミノ酸で置換されているこ
とを特徴とする第1項記載の突然変異体。 13、第1項〜第4項のいずれかに記載の突然変異体を
コードしているDNA配列。 14、形質転換体宿主細胞内で第13項記載のDNA配
列を発現させ得る複製可能な発現ベクター。 15、第14項記載のベクターで形質転換された微生物
。 16、第14項記載のベクターで形質転換された細胞培
養。 17、第14項記載のベクターで形質転換された哺乳類
の細胞培養。 18、チヤイニーズ・ハムスターの卵巣セルラインを形
質転換することにより得られた第17項記載の細胞培養
。 19、第1項〜第12項のいずれかに記載のプラスミノ
ゲン活性化因子突然変異体の治療有効量と薬学的に許容
し得る担体とを混合してなる組成物。 20、血管性疾患または血管症状を有する患者に投与す
るための、第19項記載の組成物。
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