JPS6224A - 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）の新規な突然変異体に関するものである。これらの
突然変異体は、後述する様に、既に文献中に総括的に開
示されている。しかし、本発明の突然変異体は、他の研
究者によってなされた基本的なヒトープラスミノゲン活
性化因子分子を用いた研究や、セリンプロテアーゼ類、
トリプシンおよびキモトリプシンを用いたモデル研究の
結果からは予測し得ない活性を示す、新規で特異的なも
のである。

発明の背景 コレン（Ｃｏ１１ｅｎ　）らは、初めて、天然起源から
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子を実質上、純粋な形
で単離して同定し、プラスミノゲン活性化因子にとって
必要な活性の測定を行った（ヨーロッパ特許出願公開Ａ
　Ｏ４１７６６，１９８１年１２月１６日公開、最初の
出願日、１９８０年６月１１日）。

その後、譲受人の研究室において、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子に通常伴なっているタンパク質を、実
質上、含まない状態のｔ　−ＰＡ’を、組換えＤＮＡ技
術を用いで生産することに成功した。この研究は化学の
学術文献およびヨーロッパ特許出願公開盃０９３６１９
（１９８３年１１月９日公開、１９８２年５月５日出願
）に記載されでいる。上記の特許出願（ＥＰＯ公開＆０
９３６１９）は、ヒトプラスミノゲン活性化因子の誘導
体、即ち、アミノ酸の置換、欠失、付加、あるいは、基
礎的ｆｌ　Ｄ　Ｎ　Ａに対する部位特異的突然変異誘発
による置換等により様々な修飾を受けている種々の誘導
体をも想定している。

上記出願で開示されでいる様に、ヒトプラスミノゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）は、−水路および二本鎖のいずれ
の形でも、存在しでいる。後者は前者のタンパク分解的
加水分解産物である。一本鎖形から２本鎖形へのタンパ
ク分解的変換は、フィブリン血餅（クロット）の溶解段
階に起きることが示された〔リツケン（Ｒｉｊｋｅｎ　
）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ。

Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　）　２５７．２９２０（１９
８２））。

プラスミノゲン活性化因子の活性は二本鎖形にあると考
えられているが、初期の報告では、一本鎖形のヒトｃ−
ＰＡ（！Ｊツケン、同上）や、一本鎖形のプロジン（ｐ
ｒｏｃｉｎｅ　）　ｔ　−ＰＡ　（ランビイ（Ｒａｎｂ
ｙ　）ら、トロンボ・レス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、）
２７　１７６（１９８２））　　も幾分かの活性を有し
ているかもしれないと、指摘されていた〔リツケンら、
ビオシミ力・工・ビオフイジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、Ａｃｔａ　）　５８０　、１４０（
１９７９）をも参照〕。

しかしながら、その後の研究者達は、一本鎖形のｔ−Ｐ
Ａ　製品には、少量の二本鎖形ｔ−ＰＡが不純物として
含まれていたことから、上記の如き一本鎖形の活性につ
いでの報告を放遂した〔アンドＬ／−セフ　（Ａｎｄｒ
ｅａｓｅｎ　）　　ら、ＥＭＢＯジャーナル、３０．１
５１　（１９８４）：イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ　）
　　ら、ＦＥＢＳ、　　レターズ上７５゜４１２（１９
８４））。これらの後続文献において、研究者達は、ｊ
−ＰＡ等のセリンプロテアーゼは一本鎖形の不活性な酵
素原として発現され、このタンパク質が特異的な部位（
ｔ−ＰＡの場合は、２７５番目の位置にあるアルギニン
）で加水分解されて初めて活性となる、という一般的な
説を再確認している。

ウサギおよび犬を用い、一本鎖プラスミノゲン活性化因
子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、フィブリン血
餅溶解活性のインビボでの比較研究がなされた。ウサギ
の場合、この酵素の２つの形における能力は同等である
ことが認められた〔コレンら、ジエイ・クリソ・インベ
スト（Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　）　７１　３６８　（１９８３）　）
。しかし、犬に関して、同じモデルを用いて行った評価
では、二本鎖形のプラスミノゲン活性因子に比べて一本
鎖形のものの方がやや活性が低いことが報告されティる
〔コーニンガ−（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ　）　　ら、ジエ
イ・クリソ・インベスト（Ｊ、　Ｃ目ｎ、　Ｉｎｖｅｓ
ｔ、）６９　５７３（１９８，２））。これらの研究報
告は、インビボにおけるフィブリン血餅の溶解能力にお
いて、一本鎖プラスミノーゲン活性化因子が、二本鎖プ
ラスミノーゲン活性化因子以上に優れていることはなく
、むしろ、実際には、劣っていることを示唆している。

発明の要約 本発明は、ヒ）　ｔ−ＰＡの新規な突然変異体であって
、驚ろくべきことに、コレンら（ＥＰＯ公開ＡＯ４７６
６）によって最初に単離されたヒトｔ−ＰＡ、並びに前
記の組換え特許出願（ＥＰＯ公開１０９３６１９）に示
されているｔ−ＰＡ分子と同等、あるいはそれ以上の活
性を示す突然変異体に関するものである。さらに詳しく
は、本発明は、ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２７５およ
び２７６位（それぞれ、アルギニンおよびイソロイシン
によって占められている）付近の部位に、あるアミノ酸
置換を有する特異的な突然変異体に関するものである。

ある種の酵素的に活性な分子は、この（これらの）部位
（１または１以上）を認識しくおそらく、それと隣接し
でいる１またはそれ以上のアミノ酸と一緒に）、塩基性
アミノ酸の後方で機能的に加水分解して結合（特に、ア
ルギニン／イソロイシンおよびリジン／グリシン間）を
切り、その結果、二本鎖物質を与える。これらの２本の
鎖は、システィン残基を介したジスルフィド結合により
、互いに結合しでいる。本発明によれば、これらの位置
で、例えばアルギニンおよびリジン以外のアミノ酸によ
る置換が起るので、開裂部位に変化を来し、２末鎖ヒト
ｔ−ＰＡがインビトロまたはインビボで生成されないか
、あるいは、その形成成度が遅延されている突然変異体
が生産される。従って、本発明によれば、生物学的な活
性を試験する目的で、突然変異を誘発された一水路ヒト
ｔ−ＰＡを得ることができる。これらの突然変異体は免
疫を与えることができ、または、少なくとも２７５７２
７６部位で加水分解されることに抵抗性を有しており、
さらには、得られた一本鎖ｔ　−ＰＡ突然変異体は、意
外にも、コレンらのｔ−ＰＡおよび／または前記の組換
えｔ−ＰＡ分子と同等の活性を有することが、ある生物
学的検定法で見出された。その上、これら突然変異体は
、突然に存在しているｔ−ＰＡ阻害物質との反応性が低
いことも示された。

第１図はヒトｔ−ＰＡ（５’および３′非翻訳領域を含
む）、および、プレーｔ　−ＰＡをコードしている配列
のＤＮＡの制限地図を示すものである。

斑点を付した部分はｔ−ＰＡの構造遺伝子である。

第２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ図は５′−および３′−非翻訳
領域を含む、プレーｔ−ＰＡのＤＮＡ配列およびアミノ
酸配列１２Ｈ＆に１０Ｈを表わす模式第３図は２７５位
に置換を有するクローン類それぞれの組立て模式図であ
る。

第４図〜第８図はｐＸＡＰＰＡＩ８３’△Ｘｌ０ｔｒｐ
Ｒの組立て模式図である。

第９図はプラスミドｐ　Ｐ　Ａ　Ｄ　ＨＦ　Ｒ−６の制
限部位を示す模式図である。

第１０図は、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、オートラジ
オグラフィーで検出した、放射性標識【−ＰＡ（左側）
およびＥＩＫＧＧ　ｔ−ＰＡ（右側）と血漿プロテアー
ゼ阻害物質とのコンプレックス形成像を写した写真の模
写図である。

第１１図は、１重鎖ｔ−ＰＡ（−０−）、二本鎖ｔ−Ｐ
Ａ（・・・口・・・）および−水路突然変異（−Ｐ　Ａ
　（Ｅ　ＩＫＧＣ，、−・−）のフィブリンとの結合活
性を示すグラフである。

第１２図は、インビボにおけるＥＩＫ　（−水路ｔ−Ｐ
Ａの突然変異体）およびｒｔ−ＰＡ　　（突然変異しで
いないｔ−ＰＡ）の血餅溶解作用の用量一応答曲線を示
すグラフである。図中、■は賦形剤、・・・０・・・は
ｒｔ−ＰＡ、−・−はＥＩＫを表わす。

詳しい記述 本明細書において、「ヒト組織プラスミノゲン活性化因
子」、「ヒ１−ｔ−ＰＡＪまたは「ｔ−ＰＡ」という語
句は、例えば組換え細胞培養系において、プロテアーゼ
部分を含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性因子以
外のプラスミノゲン活性化因子に相当する生物活性な形
で生産された外因性のヒト（組織型）プラスミノゲン活
性化因子を意味する。全配列を通じて、１個またはそれ
以上のアミノ酸が異なることに起因する天然のアレル変
異体が存在し、また、生成され得ることは理解されるで
あろう。また、宿主の細胞環境の性質により、グリコジ
ル化のパターンにも変化がある。

ヒト組織プラスミノゲン活性化因子は、プラスミノゲン
をプラスミンに変化させるプロテアーゼ領域と、フィブ
リンとの結合に関与すると考えられているクリングル（
ｋｒｉｎｇｌｅ　）含有領域との２個の機能的な領域を
有するポリペプチドである。

従って、ｔ−ＰＡは、全配列の一部にこれらの機能的な
配列を含有しでいるポリペプチドを包含するものである
。

ｔ−ＰＡの「２本鎖開裂部位」は、少くとも、２７５位
のアルギニン残基を含有する。しかしながら、２７５位
の残基と隣接する、あるいは、２７５位付近の数個の残
基内の種々のアミノ酸もまた、プラスミノゲン活性化因
子をその二本鎖形に変換する酵素によって認識され得る
領域の一部であると思われる。従って、この領域内であ
って、２７５位以外の位置のアミノ酸が置換されること
により、２本鎖形への変換に抵抗し得る突然変異プラス
ミノゲン活性化因子を得ることができる。

本明細書では特に、「−水路プラスミノゲン活性化因子
突然変異体」という語句は、２本鎖形への変換に抵抗性
を有するプラスミノゲン活性化因子を指すものとする。

これは、二本鎖活性化部位における１または腹数個のア
ミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。修飾された結
果、その様な活性化部位は認識されなくなり、通常、プ
ラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換する酵素によ
って認識されなくなる。

トリプシンおよびキモトリプシンとの類似性に基づき、
セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成において重要
な点を考慮し、ｔ−ＰＡの場合は、２７６位に遊離のα
−アミノ基が存在することが重要と思われる。２７５位
のａｒｇにおいて開裂されると、２７６位のα−アミノ
基が遊離の状態になり、ポリペプチド鎖と、ｔ　−ＰＡ
の活性なセリン領域で反応が自由に行われるようになる
。従って、本発明は、分子全体としての活性全てを消失
させることなしに、前記の如きσ−アミン基とプロテア
ーゼ活性部位との相互作用を妨げ得る全ての突然変異を
包含するものである。

基本の（元々の）ＤＮＡに突然変異を誘発し、本発明の
突然変異体を調製するために利用し得る様々な方法があ
る。その内、本明細書において特に好ましい例示の方法
は、突然変異を起こそうとする領域をコードしている配
列を含む、天然の【−ＰＡ遺伝子のフラグメントを復製
可能な形のファージＭ１３ｍＰ８に挿入してＭ１３ｍｐ
ｇＰＡを組立てることを含む。次いで、挿入したｔ−Ｐ
Ａ配列と相補的であるが、置換すべきアミノ酸をコード
している１またはそれ以上のヌクレオチドトリプレット
を含んでいる合成オリゴヌクレオチド′　　　　　　　
　　　　　　。

≠を一本鎖形のＭ１３ｍｐ８ＰＡにアニールし、二本鎖
領域を形成する。この領域は、ＤＮＡポリメラーゼエに
よる、残りの相補鎖の形成におけるプライマーとなる。

複製、同定の後、この突然変異ｔ−ＰＡ配列を更に修飾
するか、あるいは・突然変異ｔ−ＰＡポリペプチドを発
現させるための原核性または真核性ベクターの組立てに
用いることができる。

上記の一般的な方法を用い、２７５／２７６および／ま
たは２７７／２７８二本鎖開裂部位以外の位置でｔ−Ｐ
Ａを突然変異させ、本発明の範囲に含まれる突然変異ｔ
−ＰＡ誘導体を生産することができる。その様な他の部
位は、通常、アルギニンまたはリジンに、イソロイシン
、セリンまたはアラニンが続＜トリプシン様開裂部位等
の酵素的な加水分解を受は易いポリペプチド≠配列であ
る。その様なトリペプシン様開裂部位内の１またはそれ
以上のアミノ酸の置換によって、トリプシン様プロテア
ーゼによる加水分解に抵抗する突然変異ｔ−ＰＡが得ら
れる。発現および精製の工程中で、さらに、医薬として
インビボに投与した場合に、これらの有する酵素的分解
に対する抵抗性に基づき、本発明のｔ−ＰＡは、突然変
異していないｔ　−ＰＡに比べて生物学的な活性を失な
い難いことになる。ヒ）　ｔ−ＰＡ内のその様なトリプ
シン様開裂部位には、例えば、アルギニン−アラニン（
４０−４１位）、アルギニン−セリン（２７−２８位）
およびアルギニン−セリン（４６２−４６３位）が含ま
れる。

Ａ、一般論 本発明の突然変異ｔ−ＰＡは、１）第１番目のアミノ酸
にメチオニンを含有させ（ＡＴＧ開始シグナルコドンを
構造遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にする
）、または、２）メチオニンが細胞内または細胞外で開
裂される場合には、そのものが正常状態で有している第
１番目のアミノ酸を含有させ、または、３）そのものが
普通に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリ
ペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプチドであっ
て、細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシ
グナルポリペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプ
チドと一緒に調製し、または、４）余分な、不要のポリ
ペプチドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現され
、調製される。どの方法によっても、得られた種々の突
然変異したヒトｔ−ＰＡを回収し、これを、心筋梗塞、
発作、肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞そ
の他の血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾患に
対する治療に適合し得る程度に精製することができる。

ヒト突然変異ｔ−ＰＡは機能的にフィブリンと結合し、
インビトロまたはインビボにおいて、プラスミノゲンを
変化させて、フィブリン血餅の可溶化作用を有するプラ
スミンを与える様、触媒し得るものと定義される。

「発現ベクター」という語句は、自身が含有しでいるＤ
ＮＡ配列であって、該ＤＮＡを発現させるための他の配
列と機能的（操作可能）に結合しでいるＤＮＡ配列を発
現させることができ、宿主生物内で、エピンームとしで
、あるいは染色体ＤＮＡの一部として複製可能なベクタ
ーを包含する。

「組換え宿主細胞」という語句は、組換えＤＮＡ技術を
用いて組立てられた発現ベクターで形質転換された細胞
を指す。

Ｂ、宿主細胞培養およびベクタ一 本明細書で開示したベクターは広範な範囲に及ぶ原核性
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌に１２株２ｇ４（ＡＴＣＣ３１５３７）も用いるこ
とができる。これらの例は、当然例示にすぎず、限定的
なものではない。

原核生物に加えて、酵母培養等の真核性生物も用いるこ
とができる。多核生物からの細胞培養は、今日選択され
る宿主である。原則として、その様な細胞培養はすべて
有効である。しかしながら、を椎動物由来の細胞に大き
い関心が寄せられており、これらの細胞を培養（組織培
養）して増殖させる方法は、再現性のある方法となって
いる〔組織培養（Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕｌ　Ｌｕｒｅ　）
　、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　）、　クルスおよびパターンン（Ｋｒｕｓｅ　ａ
ｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　）編（１９７３）Ｊ。

その様な有用な宿主セルラインには、ＶＥＲＯおよびＨ
ｅＬａ　細胞、チヤイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨ
Ｏ）セルライン、Ｗ２Ｂ５、ＢＨＫ。

ｃｏｓ−７およびＭＤＣＫセルラインが含まれる。

以下に記載する実施例においては、ｔｒｐプロモーター
系を使用して大腸菌を用い、また、プロモーターとして
５Ｖ４Ｑ複製起源を含有している発現ベクターを使用し
でＣＨＯ細胞を用いた。しかしながら当該技術者ならば
他の原核性あるいは真核性宿主細胞培養を用い得ること
を理解できる。

Ｃ１方法 １、トランスフェクション 強固な細胞壁障害を持っでいない細胞を宿主細胞として
用いる場合には、グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）ら、ピロ
ロシイ（Ｖｉｖｏｌｏｇｙ　）　５２　５４６（１９７
８）の示したりん酸カルシウム沈降法によってトランス
フェクションを行う。しかしながら、核注入またはプロ
トプラスト融合を利用することもできる。

原核性細胞または実質的な細胞壁構築物を有する細胞を
用いる場合には、コーエン（Ｃｏｈｅｎ　）ら、プロシ
ーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　５ｃｉ、　）　（ＵＳＡ　）　６９２１１
０（１９７２）　ノ記載した塩化カルシウム法が、トラ
ンスフェクションにとって好ましい方法である。

所望の暗号配列およびコントロール配列を含有しでいる
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーション（結合）法を用いる。

単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切り開
き、修復して再結合（ライゲート）させ、所望のプラス
ミドを組立てるのに望ましい形にする。

Ｄ、実施例 ヒトｔ−ＰＡのＤＮＡは、プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−
５（ｐＥＴＰＦＲとも呼称）およびＰＡ２５Ｅ１０から
得られた。これら２個のｔ−ＰＡプラスミドの調製法は
、ＥＰＯ出願公開煮０９３６１９（前掲）に記載されて
いる。

プラスミドＰＡ２５Ｅ１０は、ｔ−ＰＡ　　遺伝子の後
部５０８アミノ酸をコードしでいる配列と、３′非翻訳
領域の７７２塩基対を含有しでいる。

このプラスミドをＳａｃ　ＩおよびＢｇｌ　■　　で消
化して得た７４４塩基対フラグメントを既述の標準的手
法により単離した。ｔ−ＰＡの既知の配列および第１図
に示した制限地図から分る様に、このフラグメントは、
ｔ−ＰＡのアミノ酸４１１がら５２７に対するコドン、
並びに３′非翻訳領域の一部を含んでいる。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−５は、ｔ　−ＰＡの全構造
遺伝子、および３′非翻訳領域の一部を含んでいる。こ
のプラスミドをＳａｃ　工およびＢｇｌ■で消化し、生
成した１、２３０　　塩基対フラグメントを単離した。

このフラグメントは、成熟型Ｌ−ＰＡの最初の４１０ア
ミノ酸に関するコドンを含有している。

これらのフラグメントを標準的な方法でライゲートさせ
・Ｂｇｌ　ｆｆで消化した。成熟ｔ−ＰＡの全配列と３
′非翻訳領域の一部に関するコドンを含む１，９７４　
　塩基対フラグメントを単離した。二本鎖Ｍ１３ｍｐ８
［メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、［巨大分子組換え
ＤＮＡに関する第３回クリーブランド・シンポジウム（
Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅ　ｌａｎｄＳｙｍｐｏｓｉｕｍ
　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔＤＮＡ）Ｊ、Ａ、ウォルト：／　（Ａ、　Ｗ
ａｌ　ｔｏｎ　）　　編、エルセピア−（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ　）アムステルダム（１９８１）　Ｐ、　１４３　
ＥをＢａｍＨＩで消化し、Ｂｇｌ■消化ｔ−ＰＡとアニ
ールさせ、Ｍ１３ｍｐ８ＰＡＢｇｌ　■を組立てた。こ
の二本鎖の、複製可能なＭ１３ｍｐ８　ＰＡＢｇｌ　■
　で大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞（ＡＴＣＣＡ３３８７６　）
を形質転換した。このファージでトランスフェクトされ
た大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞から一本鎖形および二本鎖（Ｒ
Ｆ）形のＭ１３ｍｐ　８ＰＡ　Ｂｇｌ　’ｆｌを単離す
ることができる。−水路形のＭ　ｌ　３　ｍｐ　８ＰＡ
Ｂｇｌ　’Ｊｌを、ｔ−ＰＡ　の特定部位における（部
位特異的）突然変異誘発に用いた。

−の合成 ヒ１−ｔ−ＰＡ構造遺伝子を部位特異的突然変異１丁 天然のｔ−ＰＡのアミノ酸配列および遺伝子配列は、最
初の２列に記載されている。プライマーは、指摘した残
基において、天然の遺伝子配列と異っている。対応する
アミノ酸置換体は、このアミノ酸をコードしているトリ
プレットの上方に示されている。

３、部位特異的突然変異誘発 以下に、合成プライマーの突然変異配列を含有する種の
ｔ−ＰＡクローンの組立て方法を示す。

ココテは、アゾ／Ｌ／７７　（Ａｄｅｌｍａｎ　）ら［
：「ＤＮＡＪ２．１８３（１９８３））の一般的な方法
を用いた。各クローンの全組立で模式図を第３図に示し
た。Ｍ１３ＲＦＩＢ８、Ｍ１３ＲＦ２Ｃ９およびＭ１３
ＲＦ４Ａ１０は、前記の、唯１個のアミノ酸に突然変異
を有するプライマーを用いて組立てられた。単一の標準
Ｍ１３ＲＦ４Ａ１０　（２７７位に突然変異を有する）
をプライマー３Ａ？または４Ｂ３とアニールさせること
により、Ｍ１３ＲＡ３Ａ７およびＭ１３ＲＦ４Ｂ３が、
それぞれ得られた。これら突然変異ｔ−ＰＡ遺伝子の精
製Ｍ１３ＲＦ　ＤＮＡを、大腸菌ＪＭＩ　Ｏ１細胞を用
いて得た。次いで、突然変異ｔ−ＰＡＤＮＡ配列を含有
するフラグメントを用いて、突然変異ｔ−ＰＡのための
発現ベクターを組立てた。

合成オリゴヌクレオチド５０ｍｇを、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ８Ｕを含有する、５０ｍＭトリス−ＨＣＩ
（ＰＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチ
オトレイトール、および１ｍＭＡＴＰ　　の混液１０μ
ｍ中、３７℃で３０分間、ホスホリル化（りん酸化）し
た。プローブとして用いるために、ＡＴＰの代りに５　
Ｑ　ｍＣｌ（１−Ｐ　〕−ＡＴＰ（３００μＣｉ／ｎｍ
ｏｌ　）　　ヲ用い、合成オリゴヌクレオチド４０１ｇ
を上記の如くにしてホスホリル化することにより、約５
０〜６０　Ｘ　１０　　ｃｐｍ／（２４量体４００ｎｇ
）　　を得た。ヘテロ二本鎖を形成させるために、−水
路Ｍ　ｌ　３　ｍｐ　８Ｐ　ＡＢｇｌＵｌｏｎｇ　　を
、りん酸化したプライマー１０ｎｇとＥｃｏＲＪ消化Ｍ
ｌ　３ｍｐ　８ＰＡＢｇｌ　ＴＩＲＦ（７）大きいフラ
グメント５０　ｎｇとを含む、ｌＱｍＭトリフ、、　−
ＨＣＩ　（ｐｆ（７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．
１ｍＭジチオトレイトールの混合物４０μｊ中で、９５
℃において１０分間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却
した（３０分）　、２ｍＭ　ＡＴ　Ｐ　、０．２５ｍＭ
づつのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ　およびｄＡＴＰ
、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエラージフラグメント５Ｕ
、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ４００単位を含有するリガ
ーゼバッファー１０μｊを加えてプライマー延長を開始
させた。１２℃で１時間経過した後１反応混合物を大腸
菌ＪＭＩＯＩ細胞にトランスフオーム（導入）シタ。

ライゲーション混合物１０μｌとコンピテントＪＭＩ　
Ｏ１細胞２００μｊとを混合し、氷上で３０分間、次い
で３７℃で５分間インキュベートすることにより、形質
転換を行った。次いで、２ＹＴトツプ寒天（アガー）３
．５ｍｌと飽和ＪＭＩ　Ｏ１細胞３００　ｐｉ、ＩＰＴ
Ｃ，１０ｐｌ　（２００ｍＭ）およびＸｇａ１５ＱμＩ
を５５℃において混合し、形質転換された細胞を加えた
後、薬物不含のＬＢを入れた９Ｇのペトリ皿上で平板培
養した。

無着色のプラークを拾い上げ、２ＹＴ培地１０゜０μｌ
の入ったマイクロタイター（微量力価窓）ディツシュに
移した。接種されたマイクロタイター液を直径１５ＣＭ
のＬＢ塞天平板上にスタンプしく押し付け）、２ＹＴｌ
−ツブ寒天８−中のＪＭ１０１細胞菌　６００ｔｔｌを
重層して３７℃で一夜インキユベートした。形成された
プラークを物理的な接触（１分間）により、ニトロセル
ロース（ｐＨ７，５）で１５分間処理して洗浄しく２回
）、次いで、２Ｘ　ＳＳＣで１５分間洗浄処理した。プ
レハイブリダイゼーションミックスは、１９ｍＭトリス
（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、Ｑ、９ＭＮ　ａ
　Ｃｌ！、１ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）０．
５％ＮＰ４Ｑ、１００／ＡＭＡＴＰ、１ｍＭ　　ピロり
ん酸ナトリウム、１ｍＭりん酸ナトリウムおよび５０μ
ｇ／ｒｎｌ大腸菌ｔＲＮＡを含有している。１ｘデンハ
ートは、ＩＩ！当り、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　）２
００ｍ９、ポリビニルピロリドン２００〜、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：フラクションＶ　）　２００■を含
有している。真空中において、８０℃で９０分間、ディ
スクを焼いた。次いで、ディスクを、ペトリ皿中でプレ
ハイブリダイゼーション液６−と一緒に３時間インキュ
ベートし１次いで、５ｘｌＱ　　ｃｐｍの標識プライマ
ーを加え、−夜ハイブリダイズさせた。４９℃において
、Ｑ、４ｘＳＳＣを用い、選択的な洗浄を行い、ディス
クを風乾した後、Ｘ線フィルムに露出させた。次いで、
陽性にハイブリダイズしたクローンを、゛ジデオキシ配
列決定により、分析した〔アルデマン（＃Ｊ掲）参照〕
。

−の組立て 種々の突然変異ｔ−ＰＡＤＮＡ配列のための発現ベクタ
ーとして用いるために、プラスミドｐＸＡＰＰＡ１８３
’△ｘｌＱｔｒｐＲプラスミドを組立でた。このプラス
ミド９全組立て模式図は添付の第４〜８図に示されてい
る。得られたプラスミドは第８図に示されでいる。この
プラスミドはｔｒｐＲリプレッサー遺伝子を含有してお
り、また、プラスミドの増巾を阻害するｐ　Ｂ　Ｒ３２
２ＤＮＡを欠失している。この欠失はＸＡＰ欠失として
知られており、サツトクリツフ（５ｕｔｃｌｉｆｆ　）
、コールド・スフリング・ハーバ−・シンホブラム、オ
ン・クオンテイテイテイブ・バイオロジイ（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅｒ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　
ｏｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　−Ｂｉｏｌｏｇｙ　）
　Ｖｏｌ、４３　７７　　（１９７９）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・プレス、が開示した様に、ｐＢＲ
３２２のＡｖａ工制限部位からＰｖｕ　■制限部位まで
の６４１塩基対のＰＢＲ３２２ＤＮＡ配列が除去される
ことを意味する。ｔｒｐＲリプレッサーは、プラスミド
のコピー数増加に起因して、ｔ−ＰＡ発現が、未成熟な
ままで脱抑制されることを補償するよう、作用する。ｐ
ＸＡＰＰＡ１８　３’△ｘｌＱｔｒｐＲの組立てにおけ
る中間体プラスミドＰＰＡ１８の組立て模式図は第４図
に示されでいる。このプラスミドは、全てのプレーｔ−
ＰＡ構造遺伝子と、５′および３′　非翻訳領域とを含
有しでいる。このプラスミドはまた、特徴的に、ｔ　−
ＰＡ遺伝子に伴なうｔｒｐ　　プロモーター、並びにア
ンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の付与に係る配
列を含有しでいる。

ｐＰＡ１８の組立でのために、４個のプラスミド、即ち
、ｐＦＩＦｔｒｐ６９、ｐＨＫＹＩＱ、ｐｔＰＡｔｒｐ
１２および’ｐＰＡ２５Ｅ１０を用いた。

プラスミドｐ　Ｆ　Ｉ　Ｆ　ｔｒｐ５９はゲッデ／Ｌ／
　（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、ヌクレイツクアシツブ・リサ
ーチ（ＮｕｃｌｅｉＣＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
）　８４０５７（１９８０）により開示された。プラス
ミドｐＨＫＹＩＱは、米国特許出願Ａ６８５．５２１　
（１９８４年１２月２４日出願）に開示されでおり、こ
れは、米国特許黒３０７，４７３（１９８１年１０月１
日出願）および瓜１３３，２９６　（１９８０年３月２
４日出願）（ヨーロッパ特許出頼公開、糸００３６７７
６）と一連の出願である。プラスミドｐｔＰＡｔｒｐ１
２およびｐＰＡ２５Ｅ　１０はヘニヵ（Ｐｅｎｎ　ｉ　
ｃａ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　３ｊ月−
２１４（１９８３）およびＥＰＯ公開＆ｏ９３，６ｘ９
ｃ前掲）に開示されている。

通常、プラスミドＰＦＩＦｔｒＰ６９をＰｓｔＩとＸｂ
ａ　　Ｉで消化し、第４図中、フラグメント１と表示さ
れている９５０塩基対のフラグメントを得ル。プラスミ
ドＰｔＰＡＬｒＰ１２を、ＸｂａｌとＮａｒｉ　で消化
した。この消化により、第４図中、フラグメント４と表
示されでいる３４０塩基対の配列を単離した。プラスミ
ドｐ　Ｐ　Ａ　２５　ＥｌｏをＮａｒｉとＢｇｌ　ＩＩ
　　で消化した。この消化により、第・１図中、フラグ
メント３と表示されている１６０４塩基対フラグメント
を単離した。プラスミドｐ　ＨＫ　Ｙ　１０をＰｓｔＩ
とＢｇｌ　　’ｆｌで消化し、第４図中、フラグメント
２と表示されでいる２９００塩基対フラグメントを生成
させた。これらの４フラグメントをライゲート（結合）
させ、得られたＤＮＡを用いて大腸菌細胞を形質転換し
、ｐＰＡ１８を得た。

プラスミドｐＰＡｌ　８を単離し、Ｓａｕ　３　Ａ　消
化に付した後、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ（ｋｌ
ｅｎｏｗ　）フラグメントで処理し、制限部位をうめた
。この非環式プラスミドをＳａＣ■で処理し、第５図中
、フラグメント５と表示されている３８９塩基対配列を
単離した。プラスミドｐＰＡ１８を、Ｓａｃ工およびＢ
ａｍＨ■で消化した。

この消化により、ベクターフラグメント６が単離された
。プラスミドｐＢＲ３２２（ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ　）
ら、「ジー”Ｊ　２　９５（１９７７）〕をＥｃｏＲ工
　で消化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ
フラグメントで処理した。この開放−末端ＤＮＡ配列を
ＢａｍＨ工で消化し、第５図中、フラグメント７と表示
されている３７５塩基対配列を得た。フラグメント５．
６および７を結合させ、得られた生成物で大腸菌を形質
転換し、プラスミドｐＰＡ１８３’△を得た。このプラ
スミドは、ｔ−ＰＡ遺伝子の３′非翻訳領域の一部が除
去されている外は、ｐＰＡ１８と同等である。

このプラスミドｐＰＡ１８３’△をＰｓｔＪとＮａｒ　
　■で消化し、第６図中、フラグメント８と表示されで
いる３１３塩基対フラグメントを生成させた。このフラ
グメントはアミノ酸８から１０９までをコードしでいる
。合成オリゴヌクレオチドフラグメント９は、式： で示される配列を有する。

この合成りＮＡをフラグメント８のＰｓｔＩ部位に結合
させ、成熟ｔ−ＰＡ分子の第７番目のアルギニンコドン
を再生すると共に、最初の６個のアミノ酸コドンを得た
。加えて、成熟ｔ−ＰＡアミノ酸暗号配列の残基１の炉
側に隣接している合成Ｎ−末端メチオニンコドンの５′
側にリボンーム結合部位が位置している。このオリゴヌ
クレオチドの５′末端にはＸｂａｌ　制限部位が存在し
ている。従って、フラグメント８を、合成オリゴヌクレ
オチドフラグメント９の存在下でライゲートさせ、この
混合物をＸｂａｌ：およびＮａｒｉ　で消化することに
より、フラグメント１０（第６図）が得られた。

プラスミドｐＰＡ　１８３’△をＮａｒｉ　　とＳａｃ
　Ｉ　テ消化し、９００塩基対配列のフラグメント１１
（）を生成させた。フラグメント１０．１１および１２
をライゲートして大腸菌の形質転換に用い、ｐＰＡ１８
３’△×１０　を単離した。米国特許出願＆５３８．７
３０　（１９８３年１０月３日出願、Ｅｐｏ公開Ａ１３
６９０７）に開示されているｐＦＭＢｔｒｐＲから、Ｘ
ＡＰ欠失とｔｒｐＲリプレッサー遺伝子を含有している
ＤＮＡ配列を単離した。簡単に述べると、このプラスミ
ドは、当業者既知の以下に示す３つのプラスミドから組
立てられた。ｐｈＧＨＩＱ７　：　ＥＰＯ公開Ａ　Ｏ２
２４２に記載（１９８１年１月１４日公開）されており
、このプラセミドは、誘導可能ｒｊｌａｃプロモーター
の供給源として使用された。ｐｔｒｐＲ３：　　ローダ
−（Ｒｏｅａｄｅｒ　）ら、モレキュラー・ジエネテイ
ツクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　
１７５　、３５１（１９７９）　　に記載されており、
このプラスミドは、ｔｒｐｌｊプレツサーの暗号配列の
供給源として使用された。ｐＦＭＢｌ：ＥＰＯ公開Ａ　
００６８６９３（１９８３年１月５日公開）に記載され
ており、このプラスミドは、Ａ２４株由来のＦ、ＭＤ抗
原の暗号配列の供給源として用いられた。

ｊｒｐｌＪプレツサー配列を得るには、ｐ　ｔ　ｒ　ｐ
　Ｒ３をＨａｅ［で処理して６％アクリルアミドゲルに
より、３３４塩基対のフラグメントを単離し、単離した
フラグメントを、式： ％式％ で示される配列を有する１６量体のＥｃｏＲＩ’Ｊンカ
ーとライゲートさせた。

ベクターバックボーンとＩａｃプロモーターを得るため
に、ｐｈＧＨＩＱ７をＥｃｏＲ工　で消化した後、細菌
性アルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、Ｉａ
ｃＵＶ５を含有している大きいベクターフラグメントを
Ｔ４リガーゼを用いて修復したｔｒｐＲプラスミドとラ
イゲートさせ、このライゲーション・ミックスを用いて
大腸菌を形質転換した。プラスミドＤＮＡを形質転換体
から単離し、所望のプラスタｌ’　（ｐｔｒｐ　Ｒ／ｈ
　ＧＨｌ　０７と命名）の存在を確認した〔メツシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、ニュークレイツク・アシツズ・
リサーチ９，３０９（１９８１）Ｊ。

ｐｔｒｐ　Ｒ／ｈＧＨ１０７をＥｃｏＲ工　で部分消化
し、フレノウで平滑末端化した後、Ｐｖｕ　ＩＩ　　で
処理してＩａｃプロモーター／ｃｒｐリプレッサーオペ
ロン（５３０ｂｐ　　フラグメント）を得た。ｐＦＭＢ
ｌをＰｖｕｌＩで部分消化し、６％ポリアクリルアミド
ゲルを用いてベクターフラグメントを単離することによ
り、ｔｒｐプロモーターのコントロール下にある、ＦＭ
Ｂ暗号配列を含有している、発現ベクターのバックボー
ンを得た。ｐｔ　ｒｐ　Ｒ／　ｈ　ＧＨ１０７フラグメ
ントをｐＦＭＢｌのＰｖｕ　’ｆｌ　消化物と混合し、
Ｔ４１Ｊガーゼでライゲートさせた。

次いで、ライゲーション混合物を用いて大腸菌株２９４
を形質転換し、得られた形質転換体をプラスミドの供給
源として使用した。得られたプラスミドｐＦＭＢ／１ｒ
ｐＲをミニスクリーンにより立証し、また、Ａｖａ■−
Ｐｖｕ■消化によって挿入体の方向性を証明した。プラ
スミドｐ　Ｆ　Ｍ　Ｂ　／１ｒｐＲをＮｄｅ工とＢａｍ
ＨＩで消化した。ｔｒｐ１リプレッサーを含有しでいる
フラグメントを単離した。プラスミドＰＰＡ１８３’　
　△ｘｌＯをＮｄｅ　工およびＢａｍＨＩ　　で消化し
た。主要なベクターフラグメントを単離した。このベク
ターフラグメントとｐＦＭＢ　ｔｒｐＲ由来のｔｒｐＲ
リプレッサーフラグメントとをライゲートさせ、得られ
たＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換し、この形質
転換体からプラスミドｐＸＡＰＡ１８３’△ＸＩＱｔｒ
ｐＲを単離した（第８図参照）。

フタ− 大腸菌内でｔ−ＰＡおよびｔ　−ＰＡ突然変異体を発現
させるのに用いられるベクター、ｐＸＡＰＰＡ１８３’
△ｘｌＯ（ｒｐＲを第８図に示す。図から分る様に、天
然のｔ−ＰＡ構造遺伝子の発現はｔｒｐ７”ロモーター
によってコントロール下している。Ｘｂａ工、ＮａｒＩ
および５ａＣＩ　制限部位に注意が寄せられた。プラス
ミドｐＸＡＰＰＡ１８３’ｘｌＱｃｒｐＲをＮａｒＩと
Ｘｂａ工で消化した。

３４０塩基対からなるフラグメント１（第８図）を単離
した。、、ＰＸＡＰＰＡ１８３′△ｘ　ｌ　Ｑ　ｔｒｐ
ＲをＸｂａ工　とＳａｃ　工で消化して生成された大き
いフラグメントを単離することにより、ベクターフラグ
メントである、フラグメント２（第８図）を得た。フラ
グメン）３　（９００ｂＰ　）は、部位特異的突然変異
の誘発（第３図）によって得られた各突然変異ｔ−ＰＡ
クローン類のＲＦＤＮＡをＮａｒＩ　およびＳａｃ　工
で消化することにより、得られた。フラグメント１およ
びフラグメント２と、各フラグメント３とをライゲート
することにより、別々の突然変異ｔ−ＰＡ類を発現する
ベクター類を組立て、これらを用いて大腸菌を形質転換
し、各大腸菌突然変異ｔ−ＰＡ発現ベクターを単離した
。各ベクターを次に示す。

ｐＸＡＰＰＡ１８３’△ｘ　ＩＱ　ｔｒｐＲＩＢ８ｐＸ
ＡＰＰＡ１８３’△ｘ　１０　ｔｒｐＲ２Ｃ９ｐＸＡＰ
ＰＡ１８３’△ｘ　ＩＱ　ｔｒｐＲ４ＡＩＱｐＸＡＰＰ
Ａ１８３’△ｘ　１０　ｔ　ｒｐＲ３Ａ７ｐＸＡＰＰＡ
１８３’△ｘ　ＩＱ　ｔｒｐＲ４Ｂ３これらのプラスミ
ドを、野生型ｔ−ＰＡ発現ベクターｐ　Ｘ　Ａ　Ｐ　Ｐ
　Ａ　１８３’△Ｘ１０ｔｒｐＲと同様に：大腸菌Ｗ３
１１０　ｆｈｕＡ−の形質転換に用いた。

大腸菌Ｗ３１１０　　ｆｈｕＡ−ハ、７７−ジ耐性菌で
あって、ｆｈｕＡ遺伝子に伴なうＤＮＡ配列の欠失また
は逆転（位）を有することを特徴としている。要するに
、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）を、テトラ
サイクリン耐性を付与し得る、転送可能な（トランスポ
ーザブル）因子、　Ｔ　ｎ１０を含有しているラムダバ
クテリオファージにより、形質導入する。ＴｎｌＯ形質
導入Ｗ３１１０を、ファージ感染に対する抵抗性に基づ
いて選択する。ファージ耐性株をプールし、バクテリオ
ファージＰ１に感染させる。得られたリゼイトを用（Ｎ
で大腸菌ＡＴ９８２［：ブクハリ（Ｂｕｋｈａｒｉ　）
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−１０５，８４
４（１９７１）’Ｊ　に形質導入する。ＡＴ９８２株は
ｆｈｕＡ遺伝子に接近した位置にＤａｐ　　突然変異を
有している。従って、ＡＴ９８２株をＰ１リゼイトで形
質導入し、テトラサイクリン耐性であって、ＤＡＰ機能
を再生しでいる形質導入体を選択することにより、トラ
ンスポゾンＴｎｌＱがｆｈｕ　Ａ遺伝子内に位置してい
ることが示される。テトラサイクリン耐性であって、Ｄ
ＡＰ機能を再生している株は、大腸菌Ｗ３１１０にバク
テリア・ファージＰ１を形質導入するためのＤＮＡの供
給源である。テトラサイクリン耐性とファージ耐性を示
す形質導入されたＷ３１１０株を選択する。次いで、こ
れらの株を、ファージ感染に対する抵抗性とテトラサイ
クリン感受性への逆転に基づいて選択する〔ナロイ（Ｎ
ａｌｏｙ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ、
１４５．１１１０（１９８１）］。

このテトラサイクリン感受性への逆転は、Ｔ１　ファー
ジ感染に対する抵抗性の保持と相まって、ｆｈｕ　Ａ遺
伝子に伴なっているＤＮＡ配列が欠失されたか、非可逆
的に逆転されたことを示唆している。この様にして組立
てられた株が大腸菌Ｗ３１１　Ｑ　ｆｈｕＡ−である。

転送可能な因子ＴｎｌＱ　　をＷ３１１０に挿入するの
に用いた、Ｔｎ１０含有ファージは以下の様にして組立
てられた。出発物質は、ラムダＣ工８５７ｂ２２１０ａ
ｍ２９である。このファージは当業者にとって既知であ
り〔クレックナ−（Ｋｌｅｃｋｎｅｔ　）　、ジャーナ
ル・オブ、モレキュラー・バイオロジー１１６，１２５
　　（１９７７））、ラムダの良く知られた３種の突然
変異体から標準的な４方法で組立てられた。このラムダ
ファージのリゼイトを、当業者既知の方法で操作し、Ｔ
ｎ１０トランスポゾンを担持させでおいたアンバー・サ
プレッサー（抑圧）大腸菌Ｃ６００（ＡＴＣＣジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１１６．１２５
（１９７７）Ｊｏ　このリゼイトを用い、アンバーサプ
レッサーとＣ１８５７遺伝型を持ったラムダプロファー
ジを含有する大ＰＡ　６００△ （ラムダＣｌ８５７）に感染させた。テトラサイクリン
耐性コロニーを、ブロス中、３２℃、次いで４２℃で９
０分間、増殖させることによって熱誘導し、テトラサイ
クリン耐性コロニーノリゼイトを調製した。このリゼイ
トを大腸菌Ｃ６００上にプレートし、レプリカ平板法に
付した。大腸菌Ｃ６００上に現われたプラークを大腸菌
Ｃ６００と、異種免疫プロファージ・ラムダｉｍｍ　４
３４を含有している大腸菌ｗａ　１０２　ｓｕｐ＋（ラ
ムダ１ｍｍ４３４　）Ｃクレツクナーら、ジエネテイツ
クス９０，４２７　（１９７８））との上でレプリカ平
板法に付した。異種免疫株上に現われたプラークをテト
ラサイクリン平板上にプレートした。これらの平板上に
現われたプラークはテトラサイクリン耐性を形質導入す
ることができ、これらを、上記の大腸菌Ｗ３１１０　ｆ
ｈｕ　Ａ−の調製法に適用することができる。

天然のｔ−ＰＡおよび突然変異ｔ　ｔ！ＰＡは、適当ｒ
ｌ　ｔ　−Ｐ　Ａおよび突然変異ｔ−ＰＡプラスミドに
よって形質転換された細胞の培養物（１０１りから得ら
れた。トリプトファン欠損培地を用いて発現を誘導した
。

現ベクター プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−５（ｐＥＴＰＦＲとも称さ
れる。ＥＰＯ出願公開４９３６１９（前掲）参照。〕を
第９図に示す。天然のｔ−ＰＡ構造遺伝子の発現は、５
Ｖ４ＱＴ−抗原の初期プロモーターのコントロール下に
ある。このプロモーターは、ＤＨＦＲ遺伝子の発現をも
コントロールする。Ｂｇｌ　’Ｊｌ、ＢｓｔＸＩおよび
ＢｓｔＥ■制限部位に注意が払われた。ｐＰＡＤＨＦＲ
−６をＢｇｌ　、［とＢｓｔＥ■で消化し、生成した大
きいフラグメントを単離することにより、フラグメント
１（第９図）を得た。ｐＰＡＤＨＦＲ−６をＢｇｌ■と
ＢｓｔＸＩ　　とで消化し、４００塩基対の【−ＰＡフ
ラグメントを単離することにより、フラグメント２（第
９図）を得た。各突然変異ｔ−ＰＡクローンから得たＲ
ＦＤＮＡをＢｓｔ　Ｘ　工とＢｓｔＥ■で消化すること
により、第９図のフラグメント３に相当する、所望の突
然変異を含む１，１４１塩基対のｔ−ＰＡフラグメント
を得た。フラグメント１およびフラグメント２を、各フ
ラグメント３とライゲートさせた。このＤＮＡ混合物を
用いて、大腸菌を形質転換した。各形質転換体か―歩←
争以下の真核性発現ベクターが得られた。

ｐＰＡＤＨＦＲ−６１Ｂ８ ｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９ ｐＰＡＤＨＦＲ−５４ＡＩＱ ｐＰＡＤＨＦＲ−６３Ａ７ ｐＰＡＤＨＦＲ−６４Ｂ３ これらのプラスミドを、非−突然変異ｔ−ＰＡ発現ベク
ターｐＰＡＤＨＦＲ−５と同様に用い、ＤＨＦＲ欠損Ｃ
ＨＯ細胞をトランスフェクトした〔グラハム（Ｇｒａｈ
ａｍ　）ら、ヴイロロジイ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　５
２．４５６（１９７３）、およびＥＰＯ公開ＡＯ９３６
１９参照〕。培養物を、濃度の高いメトトレキセートに
さらすことにより、天然および突然変異ｔ−ＰＡの発現
を増巾することができる。

例えば、グラハムらのりん酸カルシウム沈降法〔ヴイロ
ロジイ５２，４５６（１９７３）Ｅ　を用い、プラスミ
ドｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９およびｐＰＡＤＨＦＲ−６
１Ｂ８により、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランスフェ
クトすることができる〔ウーラブおよびチャッシン（Ｕ
ｒｌａｂ　ａｎｄＣｈａｓｉｎ　）　ＰＮＡＳ　　７７
．４２１９（１９８０）３゜いずれの場合においでも、
選択培地（ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く培地、即ち、−ＨＧＴ培地）中に生じたコロニーを
プールし、さらに−ＨＧＨ培地で増殖させる。これらの
細胞を、２５０　ｎＭメトトレキセート中、１００ｍｍ
の平板当り２Ｘ１０５　細胞の割合でプレートし、プラ
スミド配列の増幅に関して選択する。

２５０　ｎＭメトトレセート中で増殖した５個のり△ ローンを平板から抽出したところ、これら全てがｔ−Ｐ
Ａを培地中に分泌していることが分った。

これらのクローンを以後の研究に充てた。

上記の如＜、咄乳類細胞中で発現された様々なｔ−ＰＡ
類が細胞培養の培地中に分泌された。この様ｒ、（ｔ−
ＰＡ類を含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用
いるか、あるいは、それらの測定法に適用する前に下記
の精製工程の１またはそれ以上に付し、ｔ−ＰＡまたは
突然変異ｔ−ＰＡの純度を高めた。

突然変異ｔ　−ＰＡを含むＣＨＯ細胞の培地を、リッケ
ン（Ｒｉ　ｊｋｅｎ　）ら〔ビオシミ力・工・ビオライ
ジオ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　ｋ　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ。

Ａｃｔａ、　）　５８０．１４０（１９７９）　〕　ｏ
方法に従い、塩化亜鉛で活性化したキレート化セファロ
ース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）（ファルマシア）により
、バッチ抽出し〔樹脂１０〜２０　（ｍ／）／培地（Ｉ
り　）、フィルター上に収集した。樹脂をカラムに注入
し、０．０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨｓ、ｏ　）　、
０．２５Ｍ　Ｎａ（Ｊ　、　Ｑ、Ｑ　ｌ　％　ＴＷＥＥ
Ｎ　１３　Ｑ　、およびアプロチニンＩＯｍ！ｉ’／Ｉ
！を含んだバッファー中で洗浄した。５ＱｍＭイミダゾ
ールを含有する同じバッファーでｔ−ＰＡを溶離した。

ｔ−ＰＡプールを、０．０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ
８）、０．２５ＭＮ　ａ　Ｃ！および０．　ＯＩ　Ｘ　
ＴＷＥＥＮ　８０　中テ透析Ｌ、リジン・セファロース
樹脂〔ラドクリッフエ（Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ　）　　ラ
、アーク・バイオヶム・パイオフィス（Ａｒｃｈ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｎｐｈｙｓ　）　１８９、１８５　（
１９７ｓ　）および、アレ７　（Ａ１１ｅｎ　）ら、ト
ロンボシス・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ　ｉ　ｓ
Ｈｅａｍｏｓｔａｓｉｓ　）　４５．４３（１９８１）
）に適用するか、または、ベンザミジン・セファロース
樹脂〔ビコース力（Ｂｙｋｏｗｓｋａ　）ら、ビオシミ
力・工°ビオフイジカ°アクタ、７０３１１３　（１９
８２）〕に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合には、０
゜０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ８）、１ＭＮａｃＩお
よび０．０１％ＴＷＥＥＮ３Ｑで簡単に洗浄した後、０
．５Ｍアルギニンを含む同一のバッファーでＬ　−ＰＡ
または突然変異ｔ−ＰＡを溶離した。ベンザミジンセフ
ァロースは、透析バッファーで洗浄した後、１Ｍグアニ
ジンを含む透析バッファーで溶離した。得られたタンパ
ク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、純度９０％以
上であることが示された。上記の精製法の外、固定化し
たモノクローナル抗体を用いる方法〔ニールセン（Ｎｉ
ｅｌｓｅｎ　）ら、ＥＭＢＯＪ、２．１１５（１９８３
）参照〕をも使用できる。

ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　　） ｔ−ＰＡタンパク質またはｔ−ＰＡ突突然変異体タンパ
雪質含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＯＳ）試料バッファーで希釈した。指示された
如く、ｌＱｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて
タンパク質ジスルフィドを減少させた。レムＩＪ　（Ｌ
ａｅｍｍｌ　ｉ　）　　の方法〔レムリ、ネイチャー２
２７．６８０　（１９７０）〕に従い、１０％または７
〜１７％ポリアクリルアミド溶解ゲルを用い、不連続な
ＳＤＳ電気泳動を行った。血漿試料の分析には、レムリ
のバッファー系と一緒に、４％〜１０％ＳＤＳポリアク
リルアミド・グラディエンド・溶解ゲルを用いた。

分子量既知のタンパク質の移動度との比較により、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＣ，Ｅ分析に基づく分子量を概算した。

気泡放出血餅溶解法（バブル・ＩＪ　ＩＪ−ズ・クロッ
ト・リシス・アッセイ）により、組換え（非−突然変異
）ｔ−ＰＡおよび、本発明の突然変異を−ＰＡ（突然変
異ｔ−ＰＡ）のフィブリン血餅溶解活性を調べた。

簡単に述べると、トロンビン（シグマ・ケミカルＣ０１
）を約１０００単位／ｍｔの割合で蒸留水に溶かした。

このストック溶液を、０．０６Ｍ−塩基性りん酸ナトリ
ウム、０．０６Ｍ二塩基性りん酸ナトリウム、２００ｍ
ｆ／ｌ　　ナトリウム・アジドおよび０．０１％ＴＷＥ
ＥＮ８０を含むアッセイ・バッファーで１：３０に希釈
した。トロンヒン希釈液（３０〜４０単位／ｍり０．５
１ｎｌと種々の濃度のｔ−ＰＡ（１６ｎｇ／ｍ／〜１ｘ
ｌＯ６ｎｇ／ｒｎｌ）の内、いずれか０．５ｒｎｌとを
入れた一連の試験管、並びに適当な対照または、適当に
希釈した未知試料を入れた試験管を用意した。第２の試
験管群として、プラスミノゲン（１，０■／ｍ／）２０
μ！、およびフイブリノゲン（１■／ｍ／）１．０−お
よび４０メツシュ以上の中空ガラス製微小球（３Ｍカン
パニー）１０μｊを入れたものを用意した。

上記の試験管および諸薬を、この測定の最終段階に至る
まで、氷上に保持した。トロンビン−【−ＰＡまたはト
ロンビン−突然変異ｔ−ＰＡ溶液のいずれか一方２００
μｌを、プラスミノゲン、フイブリノゲン、および微小
球を含む試験管に順次加え、１５秒間旋回攪拌（ポルテ
ックス）した後、３７℃の水浴中に入れた。各試験管内
には、３０秒以内に血餅が形成された。ｔ　−ＰＡ添加
から反応終点までの所要時間を測定した。終点を、測定
中に、微小球が表面へ上昇した時点と定めた。

特定の試料の血栓崩壊活性の値は、ｔ−ＰＡＡ準曲線を
参照して決定された。比活性は、ラジオイムノアッセイ
により測定したｔ　−ＰＡまたは突然変異ｔ−ＰＡの量
に基づいて算出された。

４、インビトロにおける血餅溶解測定 インビトロの血餅溶解系を用い、組換えｔ−ＰＡおよび
突然変異Ｌ−ＰＡの測定を行った。

ヒト血液を、抗凝固剤として３．１３％クエン酸すｌ−
ＩＪウムを用いて採取し、遠心して細胞分画を除いた。

各血漿１−に、０゜５　Ｍ　Ｃａ　Ｃ／　２５０１’　
ｌ、ウシ−トロンビン（Ｚｏｏ単位／ｍ／）２５μｌお
よびヒト　　Ｉ−フイブリノゲン（１００，０００ｃｐ
ｍ／１０μ１）１０μｊを加えた。この血漿ミッリスを
内径４　ｍｍのシリコン管に吸上げ、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。管のセグメント（小片、１備）を切
り、血餅を除９）だ。この血餅を、０．３ＭＮａＣ／、
０．０２Ｍ　　クエン酸ナトリウム（ｐＨ５）および０
．０１％ＴＷＥＥＮ８０から成るバッファーに入れた。

血餅を、１時間当り４回。

調製したでのバッファーで洗浄した。最後の洗液中の放
射性活性は、血餅中の放射性活性の約１０％を越すこと
はなかった。各血餅を血９２．５　ｔｎｌ中に入れた。

血漿試料２５０μｌをとり、０点とした。ｔ−ＰＡまた
は突然変異ｔ　−ＰＡ紙試料容量１００μｌづつ加えた
。１，２．３および４時間口に試料（２５０μｊ）を採
取し、その放射性活性を測定した。ｔ−ＰＡ活性を１ｒ
ｎｌ中に５．１０．２０および４０単位含有する標準試
料についでも同時に行った。各試料採取後の容量変化を
補正した後、溶解％を算出した。

５、色素原法（クロモゲニツク・アッセイ）Ｓ−２２Ｆ
　８　：　ｔ−ｐＡは、カビ（Ｋａｂｉ　）合成トリペ
プチド色素原基質、５２２８８　［ヘレナ・ラボラトリ
イズ（Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）、
ビューモント、テキサス〕を用いて直接測定することが
できる。この測定は、ｔ−ＰＡとｌ　ｍ　Ｍ　Ｓ−２２
８８（終濃度）とを０．０１２ＭＮａｃｌおよび０．０
１％丁ｗＥＥＮ８０とを含む０．０５Ｍトリス（ＰＨ７
，４）中で３７℃において１０分間インキュベートする
ことにより１行われた。反応混合物０．５−に氷酢酸５
０μｊを加えて反応を止めた。

活性は、４０５０ｍにおける吸収に基づき、以下の、業
者によって標準化されている等式を用いて算出された。

Ｓ−２２５１：　ｔ−ＰＡによるプラスミノゲンの活性
化を、プラスミンに特異的ｆｌ　Ｋａ　ｂ　ｌ特異的ト
リペプチド色素原基質、Ｓ−２２５１（ヘレナ・ラボラ
トリイズ）を用いて測定した。試料の一部をプラスミノ
ゲン０．７　ｍ９７ｍ１　（０，０１２ｍＮａＣ１！含
有０．０５Ｍ）リス、ｐＨ７，４）　ｏ、ｔ　ｏ−およ
びヒトフイブリノゲン２０’Ｗ／ｒｎｌ（０，０１２Ｍ
ＮａＣ！！含有０．０５Ｍ１−リスＨＣｌ、　ｐＨ７，
４）　０．０２−と混合し、容量を０．１５ｉに調節し
た。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、
５２２５１　　（上記バッファー中１．ＱｍＭ溶液）０
．３５−を加え、更に３７℃で５または１０分間反応を
続けた。氷酢酸５０μｌを加えて反応を終了させ、４　
Ｑ　５　ｎｍにおける吸収を測定した。活性の定量化は
、結果を、Ｓ−２２８８アツセイによって予め標定され
た組換え天然ｔ−ＰＡ試料から得た結果と比較しで行っ
た。これは、当初、プラスミノゲンが古くなることによ
って４　Ｑ　５　ｎｍにおける吸収が日々に異なり、ま
た、プラスミノゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる
方法が異なることによっても吸収が変化するので、必須
であった。

この可変性は、大量のヒトプラスミノゲン（ｇｌｕ−プ
ラスミノゲン）物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で
調製することにより、完全に減少された。各部分を一２
０℃で保存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノ
ゲン製品を０℃に保存するが、この時間は４時間以上で
あってはならない。

フイブリノゲンによるｔ−ＰＡ活性の刺激は、フイブリ
ノゲンを除いた同一の反応混合物中に高濃度のフイブリ
ノゲンを入れた混液の活性との比較に基づき、測定され
た。フィブリンが不溶性であるために、このアッセイに
はフイブリノゲンが用いられた。高濃度のフイブリノゲ
ンによる刺激は予測される不溶性フィブリンによる刺激
と似ていると考えられる。

ツセイ） 組換えｔ−ＰＡおよび突然変異ｔ−ＰＡの、天然に存在
するｔ−ＰＡ活性に対する阻害物質との反応性をインビ
トロで測定した。一般的な方法として、Ｌ−ＰＡおよび
突然変異ｔ−ＰＡを、ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄ
ｓ　）　（ピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　）　ｃｏ、　）を用いて　　工でヨー素化し
、約２　Ｘ　１１０６ｃｐ／μｇの放射性比活性を有す
るｔ　−ＰＡおよび突然変異ｔ−ＰＡを調製した。イン
ビトロでコンプレックスを形成させるには、放射性標識
ｔ−ＰＡ（１４ｇ）を、採取したでのクエン酸処理−ヒ
ト全血（５００μｊ）に加えた。試料を室温でインキュ
ベートした後、一部を２％ＳＤＳ中に希釈することによ
り、反応を止めた。試料を４〜１０％ポリアクリルアミ
ド・グラディエン）ＳＤＳ−ＰＡＣ，Ｅにかけて分析し
た。オートラジオグラフィーにより、コンプレックスを
検出した。

リツケンら（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ　２５７．２９２０（１９８２））の方法の改
良法でフィブリン結合を行った。被検【−ＰＡ試料（５
００ｎｇ）を、０．０５Ｍ１−リス（ＰＨ７，４）、０
．１２　Ｍ　ＮａＣ／　、　０．０１％ＴＷＥＥＮ８Ｑ
、１ｒＩ！ｇ／ｒｎｌ　　ヒト血清アルブミンおよび種
々の濃度のプラスミノゲン不含フィブリノゲン（０，０
，１゜０．５および１．０ｒＩ１ｇ／ｍ／）を含む溶液
に加えた。反応混合物の最終容量は１ｒｎｌである。試
料を３７℃で５分間インキュベートした後、トロピン１
単位を加えた。試料を３７℃で１時間インキュベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清中に残存している非
−結合ｔ−ＰＡの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するｔ−ＰＡ結合％としてプロットした（
第１１図）。

８、インビボ血餅溶解 コレン（Ｃｏ１１ｅｎ　）らのインビボ血餅溶解モデル
〔ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーシ
ョ７　（Ｊ、　Ｃ１１ｍ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、）　７１
．３６８（１９８３）Ｊ　　を用いた。雄性ニューシー
ラント・シロウサギ（２，５〜３．０ｋｇ）をケタミン
麻酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その付近の連結
小血管を結紮した。可逆的結紮法で約２ｃｍの頚静脈を
単離し、このセグメント（切片）の近位側から遠位側へ
糸を渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で洗浄し
た後、１２５エ　ヒトフィブリノゲンを含有する、ウサ
ギの鮮血を満たした。３０分後、血餅を横切って血液は
流れ続けていた。ｔ−ＰＡの静脈内注入を、初期投与量
として全用量の１０％を注入することで開始した。注入
は４時間にわたって行われた。注入終了の３０分後、血
餅を収穫し・数えた。放射性活性の回収を定性対照に用
い、最初の血餅中に存在していた放射性活性量の概算値
の正確さを確認するために、血液試料、尿、綿棒および
注射器についても計算した。

Ｆ、測定の結果 二本鎖活性化部位、残基２７０〜２７９に以下の配列を
有するｔ−ＰＡ突然変異体が、大腸菌およびチヤイニー
ズ・ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）内で発現され
た。

天然　−Ａｒ　ｇ−１１ｅ−ｄ、ｙ、ｓ　−Ｃ，ｌ　ｙ
−Ｇｌ　ｙ−（ＲＩＫＧＧ）ＩＢ８　−Ｇａｙ−１１ｅ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−（ＧＩＫＧＧ）２Ｃ９−
Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−（ＥＩＫ
ＧＧ）１、　ウェスタン・ブロツッ詔よびチモグラフィ
ＣＨＯ細胞内で発現されたＥＩＫＣＧ突然変異体および
Ｇ　Ｉ　ＫＧＣ；突然変異体を、還元または非還元５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルによって導かれるウエスタンブロツッ
法で分析した。天然のｊ　−ＰＡは、グリコジル化の程
度の差により、分子量５２．０００およびｓｏ、ｏｏｏ
　　ダルトンの２本のバンドとして現われた。非−還元
５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＥＩＫＧＧ突然変異体は、分
子量約５０，０００ダルトンの位置に、１本の主要な免
疫反応性バンドを示した。しかしながら、非−還元５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにおけるＧＩＫＧＧ突然変異体のウェスタ
ンプロットは分子量５５，０００　ダルトンを示してい
た。

ＧＩＫＧＧ突然変異体の見掛は上の分子量と、天然のｔ
−ＰＡの分子量との差異は、その炭水化物構造の立体配
座が天然のｔ−ＰＡと異っていることを示すものと思わ
れる。ａｒｇ２７５におけるタンパク質の開裂は、以下
の還元により（このことによってプロテアーゼ鎖とクリ
ングル鎖とが分離する）低分子量のｔ−ＰＡを分析する
ことにより、検出される。還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
チモグラフは、これらの試料中のプラスミノゲン活性化
因子の活性が、一本鎖形ｔ−ＰＡの免疫反応性バンドの
分子量（約６０，０００　）の位置にあることを示して
いる。二本鎖形ｔ−ＰＡの電気泳動における移動度は、
分子量約３０，０００　　ダルトンと一致している。こ
の方法により、一本鎖形の突然変異ｔ−ＰＡタンノエタ
質が・形質転換された細胞の培地中に存在していること
が証明された。

Ｓ−２２５１法による天然、並びに突然変異ＥＩＫＧＧ
　　ｔ−ＰＡの分析結果を表工に示す。これらの値は、
測定の変動性を減少するために、測定中にｇｌｕ−プラ
スミノゲンを用いる前に得たものである。天然に存在し
ているｔ−ＰＡ配列艮Ｉ　ＫＧＣ，は、５２２８８法に
基づき、フィブリノゲンの存在下、無作為な（任意の）
比活性を示すものと帰属された。このｔ−ＰＡ積標準、
各ＥＩＫＧＧｔ−ＰＡ突然変異体と一緒に測定し、結果
の規格化を図った。

ＥＩＫＧＧ　　ｔ−ＰＡ突然変異体は、精製の程度に関
係なく、５２２５１＋フイブリノゲン法において、組換
えｔ−ＰＡよりも大きい比活性を有することが・ｊる。

表　　　　工 ＲＩＫＧＧ’　　ｎａｔｉｖｅ　　（２５０，０００）
’　　２５，０００　　　１０．０ＥＩＫＧＧ　２Ｃ９
１，０００，０００３，４００２９０，０ＥＩＫＧＧ　
２Ｃ９４２０，０００３，１００１３４，０ＥＩＫＧＧ
　２Ｇ９５２０，０００７，０００７４．０１、亜鉛キ
レート・リジン−アガロースを用いて精製。

２、亜鉛キレートおよびベンザミジン・アガロースを用
いて精製。

３、精製せずに測定。

４、帰属された活性値。

表工Ａのデーターは、高質度の凍結乾燥ｇｌｕ−プラス
ミノゲンを用いで得られた。より再現性の高い方法にお
いて、フィブリノゲン存在下、Ｓ−２２５１法における
Ｅ　ＩＫＧＧ突然変異体の活性は等しいことが分った。

フィブリノゲン不存在下では、突然変異体の活性は依然
として天然物のそれよりも低く（表■および表ＩＡ）、
特異性の大きいことが証明された。

表　　工Ａ ＲＩＫＧＧ’　　ｎａｔｉｖｅ　（２５０，０００）２
１７，６００　　　　１４ＥＩＫＧＧ’　　２Ｃ９２４
８，０００５００５００１、亜鉛キレート・リジンアガ
ロースを用いて精製。

２、帰属された活性。

血餅溶解法 組換えｔ−ＰＡおよび精製ＥＩＫＧＧ　　ｔ−ＰＡ突然
変異体の比活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法
を用いた。上記の方法で、これら各【−ＰＡ類の活性を
測定した。ｔ−ＰＡおよびＥＩＫＧＧ突然変異体ｔ−Ｐ
Ａの濃度は、放射線免疫検定法で求めた。測定結果およ
び比活性を表■に表　　　■ Ｉ　　　ＥＩＫＧＧ＊　　８４４０　　　０．０８８　
　　　９５，９０９２　　　ＥＩＫＧＧ＊　　７６９８
　　　０．０８８　　　８７，４７７３　　　ｔ−ＰＡ
＃　　５６４０　　　０．０８８　　　６４，０９０１
）凍結−解凍（１回）。

２）凍結−解凍（４回）。

八 で精製。

＊＊亜鉛キレートおよびリジン−アガロースで精製。

この気泡放出血餅溶解法の結果は、一本鎖【−ＰＡ突然
変異体、特に、ＥＩＫＧＧ突然変異を−ＰＡＯ比活性が
、組換えｔ−ＰＡよりも５０％以上高いことを証明する
ものである。凍結と解凍を繰返すことにより、ＥＩＫＧ
Ｇｔ　−ＰＡ突然変異体の比活性が僅かに減少されると
思われる。しかしながら、それでもなお、突然変異ｔ−
ＰＡＯ比活性は、組換えｔ−ＰＡのそれよりも高く維持
される。

（アッセイ） 血漿プロテアーゼ阻害物質によるプロテアーゼ類の不活
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されでいる。生成されたコンプレックス（複合体）
は変性に対して安定であるため、５０５−ＰＡＧＥ電気
泳動法によって評価することができる。この方法では、
放射性標識Ｌ−ＰＡを血漿または全血に加え、３７℃で
インキュベートする。試料を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ１次い
でオートラジオグラフィーにかける。遊離のｔ−ＰＡよ
りも大きい分子量（Ｍｒ）位置における放射性標識を検
出することにより、形成された１　−ＰＡプロテアーゼ
阻害物質とのコンプレックスの量が求められる。ラット
の血液中で分析したところ、ｔ−ＰＡは、Ｍｒ２００，
０００以上ノコンプレックスをゆっくり、形成すること
が分った。数時間のインキュベーションの後、これらの
コンプレックス中に、７０％以上の放射性標識が検出さ
れた。これに反して、突然変異ｔ−ＰＡはこの様なコン
プレックスを形成しなかった。即ち、オートラジオグラ
フィーで検出した放射性標識の大部分は、遊離の、不活
化されでいない酵素の位置に止まっていた。ヒト血液中
で同様な実験を行うと（第１０図）、ｔ−ＰＡはここで
も同様なコンプレックスを形成すると共に、Ｍｒが１０
０，０００〜２００．０００　　のコンプレックスをも
形成した。ラットの血液を用いた場合と同様に、突然変
異体Ｌ−ＰＡと阻害物質とは、Ｍｒ２００．０００以上
のコンプレツ・クスを殆んど形成しなかった。しかし、
Ｍｒ値ｉｏｏ、ｏｏｏ　〜２００，０００の、プロテア
ーゼ阻害物質コンプレックスは存在しでいた。これらの
結果は、突然変異体が、分子量２００．ＱＯＯ以上のコ
ンプレックスを形成する様なプロテア−ゼ阻害物質によ
っては不活化されないことを示すものである。ｔ−ＰＡ
および突然変異ｔ−ＰＡ両者の、分子量１００．０００
〜２００，０００のコンプレックス形成における反応性
には種特異性が認められた。

ｔ−ＰＡの一本鎖形および二本鎖形が、略等しいフィブ
リン親和性を有することは既に報告されている〔リッケ
ンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
２５７．２９２０（１９８２）Ｊ。

本明細書に記載した測定法によると、二本鎖形【−ＰＡ
との比較において、一本鎖形ｔ−ＰＡは、フィブリンに
対し、著しく高い親和性を示した（第１１図）。

５、　インビボにおける血餅溶解 第１２図は、ｔ−ＰＡ（ｏ　）およびＥＩＫ突然変異体
（０）の相対的な用量一応答曲線を示すグラフである。

これらのデーターは、各群５匹づつのウサギに関する平
均値＋／−５ＥＭで示されでいる。５０％溶解点の２本
の曲線間の距離を測定し、ＥＩＫ形のｔ−ＰＡの能力は
、非突然変異形（ＲＩＫ）のｔ−ＰＡの２．４倍以上で
あると見積られた。統計上有意な差は、用量０．２５■
／ｋｇにおいて得られた（Ｐ＜０．０１）。

Ｇ、結論 以上の結果に基づき、以下の２つの理由から、ｔ−ＰＡ
の２７５位における突然変異体は、天然形のｔ−ＰＡよ
りも有効と思われる。

１）特異性の増大：ｔ−ＰＡ機能の測定結果は、より活
性およびまたは特異的なタンパク質（活性／特異性タン
パク質）であることを示している。

２）インビボにおける血漿性阻害物質との結合性の低下
；その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある
種のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレックスを形成していない
形のｔ−ＰＡが循還されることになり、従って、血餅溶
解機能が増大されたｔ−ＰＡが循還されるのである。

科学文献における一水路形ｔ−ＰＡの酵素的特性に関す
る報告は逆である。ｔ−ＰＡの機能をより良く理解する
には、それとホモローガスなタンパク質を考察すると良
い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリ
プシンに関しで、広範な研究が行われでいる。ｔ−ＰＡ
のプロテアーゼ領域はこれらのタンパク質と非常によく
似ており、従って、同様の方法で機能するものと思われ
る。

トリプシンおよびキモトリプシンに関して決定された機
能的な機構に基づき、ｔ−ＰＡの２７５番目のアルギニ
ン位置における開裂を阻止すると、プロテアーゼ領域の
機能上の特徴のみが影響を受けると予想された。従って
、突然変異体のフィブリン親和性の増大は驚ろくべきこ
とである。

関連する機構（類）（特異性の増大、プロテアーゼ阻害
物質との結合性の欠如、フィブリンとの親和性の増加、
あるいはこれらの組合わせ）を考慮しないにしでも、イ
ンビボでの、ブロックされた静脈に対する溶解能力に関
する試験においで、突然変異体は、天然のｔ−ＰＡの約
２．５倍もの高い活性を示した。既に述べた様に、−水
路形【−ＰＡは、血餅の部分で二本鎖形に変換されるこ
と換 が示された。その様な変によって、−水路形が有△ する長所は全て破壊されでしまうことになる。生理的プ
ロテアーゼによって２本鎖に変換され得る突然変異形の
ｔ−ＰＡのみが、血餅の部位で一度、その長所を保持し
続けることができる。

本発明の好ましい態様を記載したが、当業者ならば、本
明細書中で開示した態様に種の修飾を施△ すことカイでき、また、それらの修飾も本発明の範囲内
にあることを理解できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトｔ−ＰＡ並びにその５′および３′よび２
＋図は、プレーｔ　−ＰＡおよびその５′−および３′
−非翻訳領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２
ｋｌＯＨである。第３図は２７５位に突然変異を有する
クローン類の組立て模式図である。第４．５．６．７お
よび８図はｐＸＡＰＰＡ１８３′△ｘｌＱｔｒｐＲの組
立て模式図である。第９図はプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ
，−５の制限部位を示す模式図である。第１０図は５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルを用い、オートラジオグラフィーで検
出した放射性標識ｔ−ＰＡ（左側）およびＥ　Ｉ　ＫＧ
Ｇ　ｔ　−ＰＡ（右側）と血桑プロテアーゼ阻害物質と
のコンプレックスの形成を示す映像の模写図である・第
１１図は一水路ｔ−ＰＡ、二本鎖ｔ−ＰＡおよび一水路
突然変異ｔ−ＰＡとフィブリンとの結合活性を示すグラ
フである。第１２図は、インビボでのＥＩＫおよびｒｔ
　−ＰＡの血餅溶解作用の用量一応答曲線を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換え宿主細胞によつて生産され、特異的な酵素的
   開裂に抵抗性を有する、ヒト組織プラスミノゲン活性化
   因子（ｔ−ＰＡ）突然変異体。 ２、実質上、二本鎖形を含まない第１項記載の突然変異
   体。 ３、一本鎖突然変異体である第１項記載の突然変異体。 ４、二本鎖開裂部位における部位特異的突然変異誘発に
   より、一本鎖形が安定化されている第３項記載の一本鎖
   突然変異体。 ５、２７５位がアルギニン以外のアミノ酸残基によつて
   占められている第４項記載の突然変異体。 ６、該アミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸からなる
   群から選択されるものである第５項記載の突然変異体 ７、該二本鎖活性化部位がｔ−ＰＡの残基２７０から２
   ７９の範囲内に存在しており、該部位特異的突然変異誘
   発が、該二本鎖活性化部位内の少なくとも１個のアミノ
   酸残基の置換によるものである、第４項記載の突然変異
   体。 ８、該置換が残基２７６のイソロイシンの置換である第
   ７項記載の突然変異体。 ９、該置換が残基２７５のアルギニンの置換である第７
   項記載の突然変異体。 １０、組換え宿主細胞によつて生産され、プロテアーゼ
   阻害物質との親和性が減少されている、一本鎖組織プラ
   スミノゲン活性化因子突然変異体。 １１、組換え宿主細胞によつて生産され、プラスミノゲ
   ンの変換において、非−突然変異組織プラスミノゲン活
   性化因子よりも高い比活性を有する一本鎖組織プラスミ
   ノゲン活性化因子突然変異体。 １２、トリプシン様開裂部位における酵素的加水分解に
   対して安定化された突然変異体であつて、該開裂部位が
   アルギニンまたはリジンを含み、該開裂部位の１または
   それ以上のアミノ酸が異るアミノ酸で置換されているこ
   とを特徴とする第１項記載の突然変異体。 １３、第１項〜第４項のいずれかに記載の突然変異体を
   コードしているＤＮＡ配列。 １４、形質転換体宿主細胞内で第１３項記載のＤＮＡ配
   列を発現させ得る複製可能な発現ベクター。 １５、第１４項記載のベクターで形質転換された微生物
   。 １６、第１４項記載のベクターで形質転換された細胞培
   養。 １７、第１４項記載のベクターで形質転換された哺乳類
   の細胞培養。 １８、チヤイニーズ・ハムスターの卵巣セルラインを形
   質転換することにより得られた第１７項記載の細胞培養
   。 １９、第１項〜第１２項のいずれかに記載のプラスミノ
   ゲン活性化因子突然変異体の治療有効量と薬学的に許容
   し得る担体とを混合してなる組成物。 ２０、血管性疾患または血管症状を有する患者に投与す
   るための、第１９項記載の組成物。