FI98930C - Menetelmä uusien ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorimutanttien valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 98930

Menetelmä uusien ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori-mutanttien valmistamiseksi Tämä on US-patenttihakemuksen sarjan:o 06/725 468, joka on jätetty huhtikuun 22. päivänä, 1985, osittainen 5 j atkohakemus.

Tämä keksintö koskee tiettyjä, uusia ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin (t-PA) mutantteja. Nämä mutan-tit, vaikka ne yleisesti sisältyvätkin aikaisempaan julkaisuun, kuten myöhempänä on mainittu, ovat uusia, määrät-10 tyjä johdannaisia, joilla on vaikutuksia, joita oli mahdotonta ennustaa muiden aikaisemmin tekemästä ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin perusmolekyyliin tai mallise-riiniproteaaseihin, trypsiiniin ja kymotrypsiiniin, kohdistuvasta tutkimuksesta.

15 ' Ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin identifioi vat ensimmäisinä luonnollisesta lähteestä oleellisesti puhtaana eristettynä ja vaaditun plasminogeeniaktivaattoriak-tiivisuuden suhteen testattuna Collen et ai., eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu n:o 041766, joka on julkaistu 20 joulukuun 16. päivänä, 1981, ja joka perustuu kesäkuun 11. päivältä, 1980, olleeseen ensimmäiseen hakemuksen jättöön.

Myöhemmin siirron saajan laboratorioiden tutkijat tuottivat ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin käytännöllisesti katsoen puhtaana niistä proteiineistä, joihin 25 se alunperin on liittynyt, yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Tämä työ on julkaistu tieteellisessä kirjallisuudessa ja eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa n:o 093619, joka on julkaistu marraskuun 9. päivänä, 1983, ja joka perustuu toukokuun 5. päivältä, 1982, olleeseen ensim-50 mäiseen hakemuksen jättöön. Yllä mainittu patenttihakemus (EP-patenttijulkaisu n:o 093619) koskee erilaisten ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorijohdannaisten valmistusta, ja nämä johdannaiset on monin tavoin modifioitu.aminohapposubs-tituutioilla, -deleetioilla, -additioilla tai -korvauksilla, 55 jotka saatiin aikaan esimerkiksi pohjana olleen DNA:n piste-mutageneesillä.

98930 2

Kuten siinä on tuotu julki, ihmisen kudosplasmino-geeniaktivaattori (t-PA) esiintyy sekä yksi- että kaksi-ketjuisessa muodossa. Jälkimmäinen on edellisen proteolyyt-tinen johdannainen. On osoitettu, että yksiketjuisen muo-5 don proteolyyttinen muuttaminen kaksiketjuiseksi muodoksi tapahtuu fibriinihyytymän hajoamisen aikana. Rijken et ai., J. Biol.Chem. 257 (1982) 2920. Uskotaan, että kaksiketjui-nen muoto on se aine, josta plasminogeeniaktivaattorin aktiivisuus johtuu, vaikka jotkut ensimmäiset raportit osoit-10 tivatkin, että ihmisen t-PA:n yksiketjuisella muodolla,

Rijken, sama julkaisu, ja sian t-PA:n yksiketjuisella muodolla, Ranby et ai., Thromb.Res. 27 (1982) 176, saattaa olla vähän aktiivisuutta. Katso myös Rijken et ai., Bio-chim. Biophy.Acta 580 (1979) 140.

15 Myöhemmät tutkijat ovat kuitenkin hylänneet nämä raportit yksiketjuisen muodon aktiivisuudesta todeten niiden johtuneen näiden valmisteiden kontaminoitumisesta pienillä määrillä kaksiketjuista muotoa. Andreasen et ai., EMBO J. 30 (1984) 151; Ichinose et ai., FEBS Letters 175 20 (1984) 412. Nämä myöhemmät raportit ovat vahvistaneet sitä yleistä käsitystä, että seriiniproteaasit, mukaanlukien t-PA, ilmennetään inaktiivisina, yksiketjuisina tsymogee-neina, jotka aktivoituvat vain proteiinin hydrolysoituessa tietyssä kohdassa, esimerkiksi t-PA;n tapauksessa ase-*;·; 25 massa 275 olevan arginiinin kohdassa.

; In vivo-vertailu j a yksiketjuisen ja kaksiket juisen • · · .·.·. plasminogeeniaktivaattorin kyvystä hajoittaa fibriinihyyty- • · miä on suoritettu kaneilla ja koirilla. Kaneissa tämän ent- .. syymin molempien muotojen on havaittu olevan lähes yhtä te- "... hokkaita. Collen et ai., J. Clin. Invest. 71 (1983) 368.

• · « * Mutta kun samantapaista mallia käytettiin koirissa, yksi- j ·’: ketjuisen muodon raportoitiin olevan hieman vähemmän aktii- vinen kuin kaksiketjuisen muodon. Korninger et ai., J. Clin.

. Invest. 69 (1982) 573. Siten nämä tutkimukset osoittavat, '; 35 ettei yksiketjuinen plasminogeeniaktivaattori ole parempi 3 - 98930 ja että se saattaa itse asiassa olla tehottomampikin kuin plasminogeeniaktivaattorin kaksiketjuinen muoto verrattaessa niiden kykyä hajoittaa fibriinihyytyrniä in vivo. Tämä patenttihakemus koskee ihmisen t-PA:n uusia 5 mutantteja, jotka yllättäen ovat yhtä aktiivisia tai aktiivisempia kuin Collen et ai.'n (EP-patenttijulkaisu n:o 041766) ensimmäisenä eristämä ihmisen t-PA samoin kuin yllämainitussa yhdistelmä-DNA-tekniikoita käyttäneessä patenttihakemus julkaisussa kuvatut t-PA-molekyylit (EP-pa-10 tenttijulkaisu n:o 093619). Erityisessä suoritusmuodossa tämän keksinnön kattamat tietyt mutantit sisältävät ne mutantit, joissa ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemia 275 ja 276, joissa on arginiini ja isoleusiini mainitussa järjestyksessä, ympäröivässä kohdassa esiintyy tiettyjä 15 aminohapposubstituutioita. Tietyt entsymaattisesti aktiiviset molekyylit tunnistavat tämän kohdan/nämä kohdat (ehkä yhdessä yhden tai useamman viereisen aminohapon kanssa) ja funktionaalisesti hydrolysoivat emäksisten aminohappojen jälkeiset sidokset, erityisesti arginiinin ja isoleu-20 siinin sekä lysiinin ja glysiinin väliset sidokset, jolloin , syntyy kaksiketjuista ainetta. Nämä kaksi ketjua pysyvät : toisiinsa liittyneinä kysteiinitähteiden muodostamien di- sulfidisidosten avulla. Tämän keksinnön tämän suoritusmuo-•don mukaisesti esimerkiksi näiden asemien substituutio muil-25 la aminohapoilla kuin esim. arginiinilla ja lysiinillä tuot- : taa mutantteja, joissa vastaavat pilkkoutumiskohdat ovat • · · muuttuneet sellaisiksi, ettei kaksiket juista ihmisen t-PA: • · ta muodostu in vivo eikä in vitro tai sitä muodostuu alem- :·. maila nopeudella. Siten tämän keksinnön tämä puoli saa ai- • · ♦ ’...^ 30 kaan mutaation sisältävän yksiketjuisen ihmisen t-PA:n käy- • ♦ ♦ tettäväksi biologisen aktiivisuuden kokeiluihin. On havait- ·· · : \; tu, että tällaiset mutantit ovat immuuneja tai ainakin re- '\m/· sistenttejä hydrolyysille asemassa 275/276 ja että synty- : .·. neet yksiketjuiset ihmisen t-PA:n mutantit ovat yllättäen Ί’ 35 yhtä aktiivisia kuin yllä kuvatut Collen et al.'n eristämä 4 - 98930 ja/tai yhdistelmä-DNA-tekniikoilla valmistetut t-PA-mole-kyylit tietyissä biologisissa määrityksissä. Lisäksi on aihetta otaksua, että nämä mutantit ovat vähemmän reaktiivisia luonnostaan esiintyvien t-PA:n inhibiittoreiden kans-5 sa.

Kuvio 1 on ihmisen t-PA:n DNA:n restriktiokartta ja siinä ovat mukana 5'- ja 3'- päiden kääntämättömät alueet samoin kuin pre-t-PA:ta koodittavat sekvenssit. Pilkutettu alue on t-PA:n rakennegeeni.

10 Kuviot 2a-2f esittävät pre-t-PA:n Dna- ja ami nohapposekvenssejä 12H & k10H mukaanlukien 5'- ja 3'-pään kääntämättömät alueet.

Kuvio 3 on yleiskaavio, jota käytettiin asemassa 275 esiintyviä substituutioita sisältävien yksittäisten 15 kloonien tuottamiseksi.

Kuviot 4-8 kuvaavat pXAPPA18 3'AX10trpR:n muodostamista.

Kuvio 9 kuvaa plasmidia pPADHFR-6 asianmukaisine restriktiokohtineen.

20 Kuvio 10 kuvaa plasman proteaasi-inhibiittorikomp- lekseja, jotka on muodostettu radioaktiivisella aineella leimatun t-PA:n (vasemmanpuoleinen paneeli) ja EIKGG-t-PA:n (oikeanpuoleinen paneeli) avulla SDS-PAGE-geelin autoradio-grafiällä osoitettuina.

..... 25 Kuvio 11 esittää yksiketjuisen t-PA:n, kaksiketjui- , .·. sen t-PA:n ja mutaation sisältävän yksiket juisen t-PA:n • · · • (EIKGG) fibriinin sitomisominaisuuksia.

• · ·

Kuvio 12 kuvaa hyytymän hajoamisen in vivo annos-vaste-käyrää (EIK on mutaation sisältävä yksiketjuinen t-PA; • · rt-PA on normaali t-PA) .

• · · ’ Tässä käytettyinä "ihmisen kudosplasminogeeniakti- ·*·*: vaattori", "ihmisen t-PA" tai "t-PA" tarkoittavat ihmisen • · ulkosyntyistä (kudostvyppistä) plasminogeeniaktivaattoria, joka on tuotettu esimerkiksi yhdistelmäsoluviljelymenetel-: · 35 millä elimistössä aktiivisina esiintyvissä muodoissa, ja . 98930 5 se sisältää proteaasiosan ja vastaa ihmiskudoksessa muuten luonnostaan esiintyvää plasminogeeniaktivaattoria. On ymmärretty, että luonnollisia alleelisia muunnelmia on olemassa ja että niitä esiintyy yksilöstä toiseen, ja tämän 5 osoituksena ovat ero/erot aminohappojen kokonaissekvenssis-sä. Lisäksi glykosylaatiomallit ovat riippuvaisia isännän soluympäristön luonteesta.

Ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori on polypep-tidi, jossa on kaksi funktionaalista aluetta, jotka sisäl-10 tävät proteaasialueen, joka pystyy muuttamaan plasminogee-nin plasmiiniksi, sekä Kringle-osan sisältävän alueen, jonka uskotaan olevan vastuussa fibriinin sitomisesta. Siten t-PA käsittää ne polypeptidit, jotka sisältävät nämä funktionaaliset alueet osana kokonaissekvenssiä.

15 "Kaksiketjuinen pilkkoutumispaikka" t-PA:ssa sisäl tää ainakin arginiinitähteen asemassa 275. Mutta myös eri aminohappojen, jotka ovat aseman 275 vieressä tai useiden tähteiden sisällä asemasta 275 lukien, uskotaan olevan osa sitä aluetta, jonka plasminogeeniaktivaattorin kaksiketjui-20 seksi muodokseen muuttavat entsyymit tunnistavat. Siten aminohappojen korvaaminen alueen sisällä olevissa muissa asemissa kuin asemassa 275 saattaa johtaa mutantteihin plas-minogeeniaktivaattoreihin, jotka ovat resistenttejä muuttamiselle kaksiketjuiseksi muodoksi.

..... 25 Erityisessä suoritusmuodossa "yksiketjuisen plasmi nogeeniaktivaattorin mutantti" on plasminogeeniaktivaattori, • · · joka on resistentti muuttamiselle kaksiket juiseksi muodoksi.

« · · ' * Sille on luonteenomaista yksi tai useampi aminohapposubsti- tuutio kaksiketjuiseksi aktivoitumiskohdassa. Modifioituna • « * " 30 tällaista aktivoitumiskohtaa ei tunnisteta entsymaattisesti, V ’ eivätkä sitä siksi hydrolysoi sellaiset entsyymit, jotka ta- ·*·*: vallisesti muuttavat plasminogeeniaktivaattorin kaksiketjui- .···. seksi muodokseen.

Analogisesti trypsiiniin ja kymotrypsiiniin verrat- • : : 35 tuna uskotaan, että minkä tahansa seriiniproteaasin kaksi- 6 - 98930 ketjuiseksi muodoksi muodostuminen on tärkeää siksi, että siitä on seurauksena vapaa oi-aminoryhmä t-PA:ssa asemassa 276. Tässä vertailussa pilkkoutuminen arg-275-asemassa johtaa siihen, että ού-aminoryhmä 276 olisi vapaa reagoimaan 5 polypeptidiketjun kanssa t-PA:n aktiivisen kohdan seriinin alueella. Siten tämä keksintö kattaa minkä tahansa mutaation, joka häiritsisi tällaisen oC-aminoryhmän ja prote-aasin aktiivisen kohdan välistä vuorovaikutusta vähentämättä molekyylin itsensä kokonaisaktiivisuutta.

10 Lukuisia menetelmiä voidaan käyttää saamaan aikaan mutaatioita pohjana olevassa DNA:ssa sen mutanttien valmistamiseksi. Eräs tällainen menetelmä, joka tässä kuvataan erityisen edullisena suoritusmuotona, sisältää ensin natiivin t-PA-geenin fragmentin, joka sisältää mutatoita-15 vaa aluetta koodittavat sekvenssit, liittämisen faagin

Ml3mp8 replikoituvaan muotoon, jolloin muodostuu M13mp8PA. Sitten synteettinen oligonukleotidi, joka on komplementaarinen liitetyille t-PA-sekvensseille mutta joka sisältää yhden tai useamman korvattavaa aminohappoa koodittavan nuk-20 leotiditripletin, liitetään Ml3mp8PA:n yksisäikeiseen muotoon kaksisäikeisen alueen muodostamiseksi. Tämä alue toimii alukkeena DNA-polymeraasi I :n katalysoimalle jäljelle jäävän komplementaarisen säikeen synteesille. Replikaation ja tunnistamisen jälkeen mutantti-t-PA-sekvenssi voidaan ..... 25 edelleen modifioida tai käyttää prokaryoottisen tai eukary- oottisen vektorin muodostamiseksi mutaation sisältävän t-PA- « « · polypeptidin ilmentämiseksi.

« · 1 * ' Yllä kuvattua yleistä menetelmää voidaan käyttää myös aiheuttamaan mutaatio t-PA:n muissa asemissa kuin 275/276- * · • *' 30 ja/tai 277/278-kaksiketjuiseksi pilkkoutumiskohdissa tämän • · · V : keksinnön piiriin kuuluvien, mutaation sisältävien t-PA- johdannaisten tuottamiseksi. Tällaisia muita asemia ovat ,···. polypeptidisekvenssit, jotka ovat herkkiä entsymaattiselle hydrolyysille, kuten trypsiininkaltaiset pilkkoutumiskohdat, 35 jotka tyypillisesti sisältävät arginiinin tai lysiinin, jota 98930 7 seuraa isoleusiini, seriini tai alaniini. Yhden tai useamman aminohapon substituutio tällaisessa trypsiininkaltai-sessa pilkkoutumispaikassa johtaa mutantti-t-PA:hin, jotka ovat resistenttejä trypsiininkaltaisten proteaasien hyd-5 rolyysille. Tällainen resistenssi entsymaattiselle hajoamiselle ilmentymisen ja puhdistuksen aikana samoin kuin in vivo annostelun aikana farmaseuttisena aineena käytettäessä johtaa t-PA:hän, joka ei menetä biologista aktiivisuuttaan normaaliin t-PA:han verrattuna. Esimerkkejä tällaisis-10 ta trypsiininkaltaisista pilkkoutumiskohdista ihmisen t- PA-molekyyIissä ovat arginiini-alaniini (asemat 40-41), ar-giniini-seriini (asemat 27-28) ja arginiini-seriini (asemat 462-463).

A. Yleistä 15 Valmistetaan mutaation sisältävät t-PA-johdannaiset 1) joiden ensimmäisenä aminohappona on metioniini (joka muodostuu, koska ATG-aloitussignaalikodoni liitetään raken-negeenin etuosaan) tai 2) silloin, kun metioniini on irrotettu solun sisällä tai sen ulkopuolella, joiden ensimmäi-20 senä aminohappona on niiden normaali aminohappo tai 3) yhdessä joko signaalipolypeptidinsä kanssa tai jonkun muun konjugoidun proteiinin kuin tavanomaisen signaalipolypeptidinsä kanssa, joka signaalipolypeptidi tai konjugaatti voidaan spesifisesti pilkkoa solunsisäisessä tai -ulkoisessa ..... 25 ympäristössä tai 4) suoraan ilmentämällä kypsässä muodossa • · tarvitsematta pilkkoa pois mitään ulkopuolista, ylimääräis- II# tä polypeptidiä. Joka tapauksessa näin tuotettu mutaation x ; .

• " sisältävä ihmisen t-PA eri muodoissaan otetaan talteen ja puhdistetaan sellaiselle tasolle, jossa se sopii erilaisten • · : ·· 30 verisuonisairauksien, kuten sepelvaltimokuolion, halvauksen, V * keuhkoembolian, syväsuonitukoksen, perifeerisen valtimotu- koksen tai muiden verisuonitukostilojen hoitoon.

,··. Ihmisen mutaation sisältävällä t-PA:11a on myös se • toiminnallinen tehtävä, että se pystyy sitoutumaan fibrii- ; 35 niin ja välittämään plasminogeenin muuttumisen in vivo tai 8 - 98930 in vitro plasmiiniksi, joka puolestaan liuottaa fibriini-hyytymiä.

"Ekspressiovektori” sisältää vektorit, jotka pystyvät ilmentämään niihin sisältyvät DNA-sekvenssit silloin, 5 kun nämä sekvenssit on käyttökelpoisesti liitetty toisiin sekvensseihin, jotka pystyvät saamaan aikaan niiden ilmentämisen ja jotka voidaan monistaa isäntäorganismissa joko episomeina tai kromosomaaliseen DNA:hän kuuluvina osina.

"Yhdistelmäisäntäsolut" viittaavat soluihin, jotka 10 on transformoitu yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen muodostettujen ekspressiovektoreiden avulla.

B. Isäntäsoluviljelmät ja vektorit

Vektorit ja tässä julki tuotu menetelmä sopivat käytettäviksi isäntäsoluissa, joita voivat olla suuri joukko 15 prokaryoottisia ja eukaryoottisia organismeja. Esimerkiksi E. coli K12 kanta 294 (ATCC no 31446) on erityisen käyttökelpoinen. Muita mikrobikantoja, joita voidaan käyttää, ovat E. coli B ja E. coli X1776 (ATCC no 31537). Nämä esimerkit ovat tietysti tarkoitetut pikemminkin valaiseviksi 20 kuin rajoittaviksi.

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää eukaryoottisia organismeja kuten hiivaviljelmiä. Monisoluisista orga-nismeista peräisin olevat soluviljelmät ovat paras isäntä-. valinta tällä hetkellä. Periaatteessa mitä tahansa tällais- 25 ta soluviljelmää voidaan käyttää, suurin mielenkiinto koh- distuu kuitenkin selkärankaisten soluihin ja näiden solutti jen kasvattamisesta viljelmässä (kudosviljelmässä) on tul- * ** lut toistettava menetelmä - katso Tissue Culture, Academic

Press, Kruse ja Patterson, toim. (1973). Esimerkkejä näistä • * i ** 30 käyttökelpoisista isäntäsolulinjoista ovat VERO- ja HeLa- V * solut, kiinalaisen hamsterin munasarja- (CHO-) solulinjat, V.\ W138-, BHK-, COS-7- ja MDCK-solulinjät.

,· . Esimerkit, jotka tässä alempana julkaistaan, kuvaa vat E. colin käyttöä trp-promoottorisysteemiä käyttämällä ‘ · 35 ja CHO-solujen käyttöä käyttämällä ekspressiovektoreita, • · . 98930 9 jotka sisältävät SV40-replikaatioalun promoottorina. Alan asiantuntemuksen mukaista olisi kuitenkin käyttää myös vaihtoehtoisia prokaryoottisia tai eukaryoottisia isäntä-soluviljelmiä.

5 C. Käytetyt menetelmät 1. Transfektio

Jos isäntäsoluina käytetään soluja, joissa ei ole suuria solunseinäesteitä, transfektio voidaan suorittaa kalsiumfosfaattisaostusmenetelmällä kuten Graham et ai., 10 Virology 52 (1978) 546, ovat kuvanneet. Tumainjektiota tai protoplastifuusiota voidaan kuitenkin myös käyttää.

Jos käytetään prokaryoottisia soluja tai soluja, joissa on huomattavia solunseinärakenteita, edullinen transfektiomenetelmä on Cohen et al.'n, Proc. Natl. Acad.

15 Sei. (USA) 69 (1972) 2110, kuvaama kalsiumkloridin välityksellä tapahtuva fransfektio.

2. Vektorin muodostaminen

Halutun koodittavan sekvenssin ja kontrollisekvens-sin sisältävien sopivien vektoreiden muodostamisessa käyte-20 tään sinänsä tunnettuja vakioliittämismenetelmiä. Eristetyt plasmidit tai DNA-fragmentit pilkotaan, muotoillaan halutuiksi ja liitetään uudelleen halutussa muodossa tarvittavien plasmidien muodostamiseksi.

D. Esimerkit ,..j 25 1. M13mp8PABg1 II:n muodostaminen t-PA:n mutageneesiä • varten • « * * * V. Ihmisen t-PA:n DNA saatiin plasmideista pPADHFR-6 '* (jota nimitetään myös pETPFRrksi) ja pA25E10. Näiden kahden t-PA-plasmidin valmistus on kuvattu EP-patenttihakemusjul-» ** 30 kaisussa no 093619, johon yllä on viitattu ja joka on lii- rl» V : tetty tähän viitteeksi.

• Plasmidi pA25E10 sisältää sekvenssit, jotka koodit- , , tavat t-PA-geenin 508 viimeistä aminohappoa ja 3'-pään kään- « « tämättömän alueen 772 emäsparia. Tämä plasmidi pilkottiin 35 Saclrllä ja BglIII:lla, jolloin saatiin 744:n emäsparin « · * 10 - 98930 fragmentti, joka eristettiin vakiomenetelmillä, kuten aikaisemmin on kuvattu. Kuten t-PA:n tunnetusta sekvenssistä sekä restriktiokartasta kuviossa 1 voidaan nähdä, tämä fragmentti sisältää kodonit t-PA:n aminohapoille 411-527 5 sekä osan 3'-pään kääntämättömästä alueesta.

Plasmidi pPADHFR-6 sisältää t-PA:n koko rakennegee-nin ja osan 3'-pään kääntämättömästä alueesta. Tämä plasmidi pilkottiin Sacl:llä ja BglII:lla, jolloin saatiin 1230:n emäsparin fragmentti, joka eristettiin. Tämä frag-10 mentti sisältää kodonit t-PA:n kypsän muodon 410 ensimmäiselle aminohapolle.

Nämä fragmentit liitettiin yhteen käyttämällä vakio-menetelmiä ja pilkottiin Bglllrlla. 1974:n emäsparin fragmentti, joka sisälsi kodonit kypsän t-PA:n koko sekvenssil-15 ie sekä osan 3'-pään kääntämättömästä alueesta, eristettiin. Kaksoissäikeinen MI3mp8 (Messing et ai., Third Cleveland Symposium of Macromolecules Recombinant DNA, toim. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), s. 143) pilkottiin BamHI: llä ja liitettiin Bglllrlla pilkottuun t-PA:han, jolloin 20 saatiin M13mp8PABglII. E. coli JM 101-solut (ATCC no 33876) transformoitiin M13mp8PABglII:n kaksoissäikeisellä replikoitavalla muodolla. M13mp8PABglII:n yksi- ja kaksoisketjui-set (RF) muodot voidaan eristää tässä faagilla infektoi-duista E. coli JM 101-soluista. Yksisäikeistä muotoa käy-. 25 tettiin t-PA:n paikkaspesifiseen mutageneesiin.

2. Alukkeiden synteesi paikkaspesifistä mutageneesiä • · « *.··' varten « 4 :.V Ihmisen t-PA:n rakennegeeni modifioitiin paikkaspe sif isellä mutageneesillä sellaisten t-PA:iden ilmentämisek- j '.. 30 si, jotka sisältävät aminohapposubstituutioita eri asemissa.

Valmistettiin synteettisiä oligonukleotidejä esimerkiksi Crea et ai.'n, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75 (1978) 5765, mukaisella kiinteä faasi-fosfotriesterimenetelmällä. Valmis-·;· tettiin seuraavat synteettiset alukkeet ja niitä käytettiin : : : 35 tällaiseen paikkaspesifiseen mutageneesiin: - 98930 1 1

Natiivi amino- 275 279 happosekvenssi Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Natiivi DNA-

sekvenssi G CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA G

5 Aluke 1B8-

Gly DNA-sekvenssi G CCT CAG TTT GGT ATC AAA GGA G Aluke 2C9-

Glu DNA-sekvenssi G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G Aluke 4A10-

Gly Ile

10 DNA-sekvenssi TT G TTT GGT ATC ATC GGA GGG CTG

Aluke 3A7- T1

Gly Ile

DNA-sekvenssi G CCT CAG TTT GGT ATC ATC GGA G

Aluke 4B3- _Ί

Glu Ile DNA-sekvenssi G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G Natiivin t-PA:n aminohappo ja geenisekvenssi on kuvattu kahdella ensimmäisellä rivillä. Alukkeet sisältävät tripletit, jotka poikkeavat natiivista geenisekvenssistä osoitetussa tähteessä. Vastaava aminohapposubstituutio on esitetty tätä aminohappoa koodittavan tripletin yläpuolella.

2^ 3. Paikkaspesifinen mutageneesi Tässä myöhemmin kuvattua menetelmää käytettiin synteettisten alukkeiden mutaation sisältävän sekvenssin sisältävien eri t-PA-kloonien muodostamiseksi. Käytettiin Adelman et al.'n, DNA 2 (1983) 183 yleismenetelmää, joka . 25 on liitetty tähän viitteeksi. Yleiskaavio jokaisen tällai- . sen kloonin muodostamiseksi on esitetty kuviossa 3. M13RF1B8, t ♦ · *···' M13RF2C9 ja M13RD4A10 muodostettiin käyttämällä alukkeita, • · · *·*«* jotka sisälsivät mutaatiot kunkin esitetyn aminohapon koh dalla. Yksi ainoa vakio-M13RD4A10, joka sisälsi mutaation •’·· asemassa 277, liitettiin yhteen alukkeen 3A7 tai 4B3 kansioi sa M13RF3A7 ja Ml3RF4B3:n muodostamiseksi mainitussa järjes- :·*·, tyksessä. Puhdistettu M13RF-DNA jokaisesta näistä mutaation sisältävästä t-PA-geeneistä valmistettiin E. coli JM 101-soluista. Tämän jälkeen DNA-fragmentteja, jotka sisälsivät mutaation sisältävän t-PA-DNA-sekvenssin, käytettiin mutaa- • ’ 35 98930 12 tion sisältävän t-PA:n ekspressiovektoreiden valmistamisessa.

50 ng synteettistä oligonukleotidia fosforyloitiin

30 min:n ajan 37°C:ssa 10 /lltssa 50 mmol/1 Tris-HClta, pH

5 7,5, 10 mmol/1 MgC^sa, 10 mmol/1 ditiotreitolia ja 1 mmol/ 1 ATP:tä sisältävässä liuoksessa, joka sisälsi 8 U:ä T4- polynukleotidikinaasia. Koettimena käyttöä varten 400 ng synteettistä oligonukleotidia fosforyloitiin kuten yllä lukuunottamatta sitä, että ATP:n sijasta käytettiin 60 mCi 32 10 P-ATP:tä (3000 /iCi/mmol), jolloin saatiin noin 50-60 x 10^ cmp/400 ng 24-meeriä. Heterodupleksin muodostamiseksi 10 ng yksisäikeistä M13mp8PABglII:ta kuumennettiin 95°C:ksi (10 min) ja hitaasti jäähdytettiin huoneenlämpöiseksi (30 min) 40 /lltssa 10 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, 10 mmol/1 15 MgC^sa, 1 mmol/1 ditiotreitolia sisältävässä liuoksessa, joka sisälsi 10 ng fosforyloitua aluketta ja 50 ng EcoRI: 11a pilkottua M13mp8PABglIIRF:n suurta fragmenttia. Aluke-pidennys aloitettiin lisäämällä 10 /il ligaasipuskuria, joka sisälsi 2 mmol/1 ATP:tä, 0,25 mmol(l sekä dGTP:tä, 20 dTTP:tä, dCTP:tä että dATPttä, 5 U E. colin DNA-polymeraa-si I:n suurta fragmenttia ja 400 U T4-DNA-ligaasia. 1 tunnin 12°C:ssa inkuboinnin jälkeen reaktioseos käytettiin transformoimaan E. colin JM 101-solut.

Transformaatio suoritettiin sekoittamalla 10 /il 25 liittämisseosta 200 /iltaan vaadittuja JM101-soluja, jonka jälkeen seosta inkuboitiin 30 min:n ajan jäiden päällä ja ‘.1.· 5 min:n ajan 37°C:ssa. Sitten 3,5 ml 55°C:sta 2YT-päällys- agaria sekoitettiin 300 /iltaan kyllästettyjä JM1 01-soluja, 10 /iltaan IPTGttä (200 mmol/l) ja 50 pltaan Xgalta, ja sen 30 jälkeen, kun transformoidut solut oli lisätty, agar valet-·’·*: tiin 9 cm tn petri-mal joille, jotka sisälsivät LBttä, jossa ei ollut mitään lääkeainetta.

Värittömät plakit poimittiin ja siirrettiin mikro-'·;·* tiitteriastiaan, joka sisälsi 100 /il 2YT-väliainetta. Siir- : 35 rostetut mikrotiitterinesteet siirrettiin halkaisijaltaan . 98930 13 15 cm oleville LB-agarlevylie, joiden päällä oli 600 μπκη kerros JM101-soluja 8 ml:ssa 2YT-päällysagaria ja levyjä inkuboitiin yli yön 37°C:ssa. Muodostuneet plakit siirrettiin nitroselluloosakiekolle laittamalla kiekko plakin 5 päälle 1 min:n ajaksi. Nitroselluloosakiekkoa käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 0,5 mol/1 NaOH:a ja 1,5 mol/1 NaCl:a, 3 minuuttia ja se pestiin kahdesti 3 mol/1 NaCl-0,5 mol/1 Tris-HCl-liuoksella, pH 7,5, 15 min:n ajan ja sitten 2X SSC:llä 15 min:n ajan. Esihybridisaatioseos si-10 sältää 10 mmol/1 Tris:ä, pH 7,5, 5 mmol/1 EDTAsta, 0,9 mol/1 NaClra, 1 X Denhardtin liuosta, joka oli 0,5 %:inen NP40:n suhteen, 100 /jmol/l ATP:tä, 1 mmol/1 natriumpyro-fosfaattia, 1 mmol/1 natriumfosfaattia ja 50 /ig/ml E. Colin tRNArta. 1X Denhardtin liuos sisältää litraa kohti 15 200 mg Ficoll'ia, 200 mg polyvinyylipyrrolidonia, 200 mg naudan seerumin albumiinia (BSA; fraktio V). Kiekkoa pidettiin 80°C:ssa vakuumissa 90 minuuttia. Sitten kiekkoa inkuboitiin 3 tuntia 6 ml:ssa esihybridisaationestettä petrimaljassa, jonka jälkeen astiaan lisättiin 5 x 106 20 cpm:a leimattua aluketta ja hybridisoitiin yli yön. Kiekon valikoiva pesu tehtiin 0,4X SSC:llä 49°C:ssa ja ilmassa kuivatuksen jälkeen kiekko altistettiin röntgen-filmil-le. Positiivisesti hybridisoituneet kloonit analysoitiin edelleen dideoksisekvensoimalla. Katso Aldeman, sama jul-25 kaisu.

* * 4. Vektoreiden muodostus mutantti-t-PA;n ilmentämi- seksi E. colin ρΧΑΡΡΑΐδ 3'AXiotrpR:ssä

PlasmidipXAPPA18 3,Δχ1OtrpR-plasmidi muodostettiin ·*·.. 30 käytettäväksi ekspressiovektorina eri mutaation sisältävil- le t-PA-DNA-sekvensseille. Tämän plasmidin muodostamisessa • <i*t käytetty yleiskaavio on kuvattu kuvissa 4-8. Saatu plasmi- : di on kuvattu kuvassa 8. Se sisältää trpR-repressorigeenin '···' ja pBR322-DNA-sekvenssien deleetion, joka estää plasmidin •35 lisääntymisen. Tämä deleetio, joka tunnetaan XAP-deleetiona, . '98930 14 muodostuu 641:n emäsparin poistamisesta pBR322-DNA-sek-vensseistä pBR322:n Aval- ja PvuII-restriktiokohtien välistä, kuten Sutcliff on kuvannut, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43 (1979) 77, Cold Spring 5 Harbor Press, joka julkaisu on liitetty tähän viitteeksi, trpR-repressorigeeni kompensoi nousseesta plasmidikopioi-den lukumäärästä aiheutuvaa t-PA:n ilmentymisen epäkypsää depressiota. Välituote pXAPPA18 3'Ax10trpR:n muodostamisessa on plasmidi ρΡΑΐδ, joka muodostettiin kuten kuvassa 10 4 on kuvattu. Tämä plasmidi sisältää koko pre-t-PA:n ra- kennegeenin samoin kuin 5'- ja 3'-pään kääntämättömät alueet. t-PA-geeniin ja -sekvensseihin liittynyt trp-pro-moottori, joka antaa resistenssin ampisilliinille ja tet-rasykliinille, on myös tälle plasmidille ominainen.

15 pPA18:n muodostamiseksi käytettiin neljää plasmi- dia, nimittäin pFIFtrp69:ää, pHKY10:tä, ptPAtrp12:ta ja pPA25E10:tä. Plasmidin pFIFtrp69 ovat julkaisseet Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057. Plasmidi ρΗΚΥΙΟ on julkaistu US-patenttihakemuksesa sarjano 685 521, joka 20 on jätetty joulukuun 24. päivänä, 1984, ja joka on jatko US-patenttihakemukselle sarjanumero 307 473, joka on jätetty lokakuun 1. päivänä, 1981, joka on jatko patenttihakemukselle sarjanumero 113 296, joka on jätetty maaliskuun 24. päivänä, 1980, (Eurooppalainen patenttihakemus-25 julkaisu no 0036776). Plasmidit ptPAtrp12 ja pPA25WlO on **’* julkaistu Pennica et al.'n julkaisussa, Nature 301 (1983) 214 ja EP-patenttijulkaisussa no 093 61 9, yllä.

:: Yleisesti, plasmidi pFIFtrp69 hajoitettiin Pstl:llä ja Xbalrllä fragmentti 1:ksi kuvassa 4 nimetyn, 950 emäs-•‘•<r 30 paria sisältävän fragmentin tuottamiseksi. Plasmidi ptPA- .*;·. trp1 2 hajotettiin Xbal:llä ja Narl:llä. Tästä eristettiin fragmentiksi 4 kuvassa 4 nimetty, 340 emäsparia sisältävä sekvenssi. Plasmidi pPA25E10 hajoitettiin Narl:llä ja Bg1-’··* 11:11a. Tästä eristettiin fragmentiksi 3 kuvassa 4 nimet- 35 ty, 1604 emäsparia sisältävä fragmentti. Plasmidi ρΗΚΥΙΟ 98930 15 hajoitettiin Pstl:llä ja Bg1II:lla fragmentiksi 2 kuvassa 4 nimetyn, 2900 emäsparia sisältävän fragmentin tuottamiseksi. Nämä neljä fragmenttia liitettiin toisiinsa ja tätä DNA:ta käytettiin transformoimaan E. colin solut, jol-5 loin saatiin pPA18.

Plasmidi pPA18 eristettiin ja hajoitettiin Sau3A:-11a, jonka jälkeen sitä käsiteltiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla restriktiopaikan täyttämiseksi. Ei-pvöreää plasmidia käsiteltiin Saclslla ja fragmentiksi 5 "Ό kuvassa 5 nimetty, 389 emäsparia sisältävä sekvenssi eristettiin. Plasmidi pPA18 hajoitettiin myös Sacl:llä ja BamHIrllä. Tästä eristettiin vektorifragmentti 6. Plasmidi pBR322, Boyer et ai., Gene 2 (1977) 95, hajoitettiin EcoRIrllä, jonka jälkeen sitä käsiteltiin DNA-polymeraasi 15 i:n Klenow-fragmentilla. Tämä DNA-sekvenssi, jonka pää oli auki, käsiteltiin BamHIilla fragmentiksi 7 kuvassa 5 nimetyn, 375 emäsparia sisältävän sekvenssin tuottamiseksi. Fragmentit 5, 6 ja 7 liitettiin toisiinsa ja tätä valmistetta käytettiin E. colin transformoimiseksi, josta 20 saatiin plasmidi pPA183'4. Tämä plasmidi on yhtäläinen pPA18:n kanssa lukuunottamatta sitä, että osa t-PA-geenin 3'-pään kääntämätöntä aluetta on poistettu.

Plasmidi ρΡΑ183'Δ hajoitettiin Pstlrllä ja Narl:llä fragmentiksi 8 kuvassa 6 nimetyn, 313 emäsparia sisältävän . 25 fragmentin tuottamiseksi. Tämä fragmentti koodittaa amino happoja 8-109. Synteettisen oligonukleotidifragmentin 9 J » · ···' sekvenssi on seuraava:

5’ CTAGAATTATGTCTTATCAAGTTATTTGGA

TTAATACAGAATAGTTCAATAA 5' 50 Tämä synteettinen DNA liitettiin fragmentin 8 Pstl- ·*·*: kohtaan kypsän t-PA-molekyylin asemassa 7 olevan arginiini- kodonin ja kuuden ensimmäisen aminohapon kodonien muodos-• tamiseksi. Lisäksi ribosomin sitomiskohta sijoitettiin 5'- ‘ ···’ päähän synteettistä N-terminaalista metioniinikodonia, jo- 55 ka sijaitsi välittömästi 5'-päässä kypsän t-PA:n aminohap- 98930 16 poja koodittavan sekvenssin tähteeseen 1 nähden. Tämän oligonukleotidin 5'-pää sisältää Xbal-restriktiokohdan.

Siten fragmentti 8 liitettiin synteettisen oligonukleoti-difragmentin 9 läsnäollessa ja seosta käsiteltiin Xbal:llä 5 ja Narlillä, jolloin saatiin fragmentti 10 (katso kuva 6).

Plasmidi ρΡΑ183'Δ hajoitettiin Narlillä ja Saclrllä fragmentiksi 11 kuvassa 7 nimetyn, 900 emäsparia sisältävän sekvenssin tuottamiseksi. Tämä plasmidi hajoitettiin myös Saclrllä ja Xbal:llä kuvan 7 vektorifragmentin 12 10 tuottamiseksi. Fragmentit 10, 11 ja 12 liitettiin toisiinsa ja käytettiin E. colin transformoimiseen, josta pPA183'-ΔΧ10 eristettiin. DNA-sekvenssi, joka sisälsi XAP-deleetion ja trpR-repressorigeenin, on peräisin pFMPtrpR:stä, joka on julkaistu US-patenttihakemuksessa sarjanumero 538 730, 15 joka on jätetty lokakuun 3. päivänä, 1983, (EP-patentti- julkaisu no 136907). Lyhyesti, tämä plasmidi muodostettiin kolmesta plasmidista, jotka alan asiantuntijat tuntevat: phGH107:ää, joka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 022242, ja joka on julkaistu tammikuun 14. päivänä, 1981, käytet-20 tiin lac-indusoituvan promoottorin lähteenä; ptrpR3:a, jonka Roeder et ai., Molecular Genetics 176 (1979) 361, ovat kuvanneet, käytettiin trp-repressoria koodittavan sekvenssin lähteenä; ja pFMB1:tä, joka on kuvattu EP-patenttijul-] kaisussa no 0068693, joka on julkaistu tammikuun 5. päivä- * 25 nä, 1983, käytettiin kannasta A24 peräisin olevaa FMD-an- tigeenia koodittavan sekvenssin lähteenä.

,···' trp-repressori sekvenssin saamiseksi ptrpR3:a käsi- *.·.* teltiin HaeIII:lla ja 334 emäsparia sisältävä fragmentti eristettiin 6-prosenttisesta polyakryyliamidigeelistä, ja • *.· 30 eristetty fragmentti liitettiin 1 6-mer EcoRI-liittyjiin, joiden sekvenssi oli 5 'CCATAGAATTCTATGG.

Vektorirungon ja lac-promoottorin saamiseksi phGH- 107 hajoitettiin ensin EcoRI:llä ja käsiteltiin bakteeris-·/· 35 ta peräisin olevalla alkaalisella fosfataasilla. Suuri - 98930 1 7 vektorifragmentti, joka sisälsi lacUV5-promoottorin, liitettiin sitten haluttuun muotoon saatettuun trpR-plasmi-diin T4-ligaasia käyttäen ja liittämisseos transformoitiin E. coliin. Transformaateista eristettiin plasmidi-DNA ja 5 halutun plasmidin, joka nimettiin ptrpR/hGH 107:ksi, läsnäolo varmistettiin. Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1 981 ) 309.

ptrpR/hGH107 hajoitettiin osittain EcoI:llä, pää tylpistettiin Klenow:llä ja käsiteltiin PvuIIrlla lac-pro-10 moottori/trp-repressorioperonin (530:n emäsparin fragmentti) aikaansaamiseksi. pFMB1:n osittainen hajoitus PvuII: 11a ja vektorifragmentin eristäminen 6-prosenttisesta po-lyakryyliamidigeelistä antoi käyttöön ekspressiovektori-rungon, joka sisälsi trp-promoottorin kontrolloiman FMB: 15 tä koodittavan sekvenssin. ptrpR/hGH107-fragmentti sekoitettiin pFNB1:n PvuIIrlla hajoitettuun seokseen ja liitettiin T4-ligaasin avulla. Liittämisseosta käytettiin sitten transformoimaan E. colin kanta 294 ja transformaatteja käytettiin plasmidi-DNA:n lähteenä. Saatu plasmidi, pFMB/trpR, 20 todettiin oikeaksi pienoisseulonnalla ja insertin suunta määritettiin Aval-PvuII-hajoituksen avulla. Plasmidi pFMB/ trpR hajoitettiin Ndelrllä ja BamHIrllä, trpR-repressorin sisältävä fragmentti eristettiin. Plasmidi ρΡΑ183ΆΧ10 hajoitettiin Ndelrllä ja Bamlrllä. Päävektorifragmentti eris- ^ 25 tettiin. Tämä vektorifragmentti ja trpR-repressorifragment- ti pFMB trpRrstä yhdistettiin toisiinsa ja DNA-seosta käy-tettiin transformoimaan E. coli, josta plasmidi pXAPAl83‘-4X10trpR eristettiin, kuten kuvassa 8 on esitetty.

5. E. coli-ekspressiovektorit t-PA-mutanteille 30 Kuva 8 kuvaa pXAPPA183 Άχ1 OtrpR-vektoria, jota käy- ·*·*; tettiin t-PA:n ja t-PA:n mutanttien ilmentämiseen E. co- • lissa. Kuten voidaan nähdä, natiivin t-PA:n rakennegeenin • ilmentymistä kontrolloi trp-promoottori. Huomio kohdiste- y * taan Xbal-, Narl- ja Sacl-restriktiokohtiin. Plasmidi . : 35 pXAPPA!83'ax1OtrpR hajoitettiin Narlrllä ja Xbalrllä. Frag- 18 '98930 mentiksi 1 kuvassa 8 nimetty, 340 emäsparia sisältävä fragmentti eristettiin. Fragmentiksi 2 kuvassa 8 nimetty vektorifragmentti saatiin eristämällä Xbalillä ja Sacl:llä hajoitetusta pXAPPAl83'δχ1OtrpR:stä saatu suuri fragmentti.

5 Fragmentti 3 (900 emäsparia) saatiin hajoittamalla Narl: llä ja Sacl:llä jokaisen paikkaspesifisellä mutageneesillä saadun mutantti-t-PA M13-kloonien RF-DNA. (Kuva 3). Eri t-PA:ita ilmentävät vektorit saatiin liittämällä fragmentit 1 ja 2 vastaaviin fragmentteihin 3 ja niitä käytettiin 10 transformoimaan E. coli, josta eristettiin jokainen E. co-li-mutantti-t-PA-ekspressiovektoreista: pXAPPAl8 3'4x1OtrpR 1B8 pXAPPAl8 3'4x1OtrpR 2C9 pXAPPAl 8 3'4x1 OtrpR 4A1 0 15 pXAPPAl 8 3'4x1 OtrpR 3A7 pXAPPAl 8 3'4x1 OtrpR 4B3 Nämä plasmidit samoin kuin villityyppinen t-PA—ekspressio— vektori pXAPPAl 83 '4x1 OtrpR käytettiin transformoimaan E. coli W3110fhuA-.

20 E. coli W3110fhuA on Tl-faagiresistentti bakteeri, jolle on ominaista fhuA-geeniin liittyvien DNA-sekvenssien deleetio tai inversio. Lyhyesti, E. coli W3110 (ATCC 27325) transdusoidaan lambdabakteriofaagilla, joka sisältää transpo-soituvan elementin TnlO, joka antaa molekyylille tetrasyk-25 liiniresistenssin, TnlO:llä transdusoidut W3110-kannat vali-• * taan niiden resistenssin faagi-infektiolle perusteella.

Faagiresistentit kannat yhdistetään ja infektoidaan bakterio-xl/' faagilla Pl. Saatua lysaattia käytetään E. coli AT982:n (Bukhari et ai., J. Bacteriology 105 (1971) 844) transdusoi-·*·.. 30 miseksi. Kanta AT 982 sisältää Dap-mutaation, joka sijait- see fhu-A-geenin lähellä. Siitä seuraa, että kannan AT982 transduktio Pl-lysaatilla ja transduktanttien, jotka ovat *_ ; resistenttejä tetrasykliini lie ja jotka reagoivat DAP-funktion, välit-

S I

, i y. i i i n i r t 98930 19 seminen osoittaa, että transposoni Tn10 sijaitsee fhuA-geenissä. Kannat, jotka ovat resistenttejä tetrasykliinil-le ja jotka osoittavat regeneroitua DAP-funktiota, ovat DNA:n lähde E. colin W3110:n bakteriofaagi Pl-transduk-5 tiolle. Transdusoidut W3110-kannat, jotka ilmentävät tet-rasykliiniresistenssiä ja faagiresistenssiä, valitaan.

Naloy et ai., J. Bacteriology 145 (1981) 1110. Tetrasykli iniherkkyyden palautuminen, joka liittyy Tl-faagi-infek-tion resistenssin säilymiseen osoittaa, että DNA-sekvens-10 si, joka on liittynyt fhuA-geeniin, on joko poistettu ja muutettu palautumattomasta. Näin muodostetut kannat on nimetty E. coli W3110 fhuA :ksi.

Faagi, joka sisältää transposoidun elementin Tn10, jota käytettiin Tn10:n lisäämiseen W3110:aan, muodostet-15 tiin seuraavasti. Lähtömateriaalina oli lambda cl857b 2210am29. Tämän faagin tuntevat alan asiantuntijat, Kleck-ner, J. Mol.Biol. 116 (1977) 125, ja se muodostettiin kolmesta hyvin tunnetusta lambda-mutantista vakiomenetelmiä käyttäen. Tämän lambda-faagin lysaatti valmistettiin am-20 ber-supressori E. coli C600:lla (ATCC no 23724), jota oli ·.·, käsitelty alan asiantuntijoiden tuntemilla menetelmillä

i I

siten, että se sisälsi myös Tn10-transposonin. Kleckner et ai., J. Mol. Biol. 116 (1977) 125. Tätä lysaattia käy-‘• 't tettiin infektoimaan E. coli C600 (lambda C1857), joka si- 25 saltää ambersupressorin ja lambda-profaagin, jolla on *.ϊ.' cl857 genotyyppi. Tetrasykliiniresistenttien pesäkkeiden # t V,· lysaatit valmistettiin lämpöinduktiolla kasvattamalla tet- rasykliiniresistenttejä pesäkkeitä ensin liemessä 32°C:ssa ja sitten 42°C:ssa 90 minuuttia. Sitten lysaatti levitet-/:·; 30 tiin E. coli C600:n päälle ja siirrostettiin replica pla- . \ ting-menetelmällä. Pesäkkeet, jotka ilmestyivät E. coli • < · *ti; C600:lle siirrostettiin replica plating-menetelmällä 32° ' ‘ C:ssa E. coli C600:lle ja E. coli W3102 sup +:lle (lambda ; . ; imm434), joka sisältää heteroimmuunin profaagin lambda t « - ♦ 98930 20 imm 434. Kleckner N. et al., Genetics 90 (1978) 427. He-teroimmuunille kannalle ilmestyneet pesäkkeet levitettiin tetrasykliinilevyille. Näille levyille ilmestyneet pesäkkeet pystyvät transdusoimaan tetrasykliiniresistenssin ja 5 niitä käytetään yllä kuvatussa menetelmässä E. coli W3110 fhuA :n muodostamiseksi.

Natiivi t-PA ja mutantti-t-PA saatiin 10 litrasta näiden solujen viljelmää, jotka oli transformoitu sopivalla t-PA- tai mutantti-t-PA-plasmidilla. Ilmentyminen saa-10 tiin aikaan tryptofaanivapaalla väliaineella.

6. Ekspressiovektorit imettäväissolujen t-PA-mutan- teille.

Plasmidi pPADHFR-6 (jota nimitetään myös pETPFR: ksi - katso EP-patenttihakemusjulkaisu no 93619 yllä) on 15 kuvattu kuvassa 9. Natiivin t-PA:n rakennegeenin ilmentyminen on SV40 T-antigeenin varhaisen promoottorin kontrolloima. Tämä promoottori kontrolloi myös DHFR-geenin ilmentymistä. Huomio kohdistetaan Bg1II-, BstXI- ja BstEII-res-triktiokohtiin. Fragmentiksi 1 kuvassa 9 nimetty vektoriko fragmentti saatiin eristämällä suuri fragmentti, joka oli saatu hajoittamalla pPADHFR-6 Bg1II:lla ja BstEII:lla. Fragmentiksi 2 kuvassa 9 nimetty fragmentti saatiin eris-tämällä 400 emäsparia sisältävä t-PA-fragmentti, joka oli ;·, saatu hajoittamalla pPADHFR-6 Bg1II:lla ja BstXI :11a. 1141 k5 emäsparia sisältävä t-PA-fragmentti, joka sisälsi halutut • · · * *. mutaatiot ja vastasi fragmenttia 3 kuvassa 9, saatiin ha joittamalla jokaisen mutantti-t-PA-kloonin RF-DNA BstXI: • · « *·:·’ llä ja BstEII: 11a. Fragmentit 1 ja 2 liitettiin jokaiseen fragmenttiin 3. DNA-seokset käytettiin transformoimaan E. coli. Jokaisesta transformaatista saatiin vastaavat euka- • ♦ • *·· ryoottiset ekspressiovektorit: :T: pPADHFR-6 1B8 pPADHFR-6 2C9 ’..I pPADHFR-6 4A10 *·;·’ 35 pPADHFR-6 3A7 I,:’: pPADHFR-6 4B3 98930 21 Näitä plasmideja samoin kuin normaalia t-PA-ekspressio-vektoria pPADHFR-6 käytettiin transfektoimaan CHO-solut, joista puuttui DHFR, kuten yllä on tuotu julki. (Graham et ai., Virology 52 (1973) 456; katso myös EP-patentti-5 julkaisu no 093619). Natiivin ja mutantti-T-PA:n ilmentymistä lisättiin altistamalla viljelmät suurenevilla pitoisuuksilla metotreksaattia.

Esimerkiksi plasmideja pPADHFR-6 2C9 ja pPADHFR-6 1B8 käytettiin CHO-solujen, joista puuttui DHFR, transfek-10 toimiseen (Uriah & Chasin, PNAS 77 (1980) 4216) käyttäen kalsiumfosfaattisaostusmenetelmää, jonka ovat kuvanneet Graham et ai., Virology 52 (1973) 456.

Jokaisessa tapauksessa pesäkkeet, jotka nousivat valikoivalle väliaineelle (väliaineelle, josta puuttui hy-15 piksantiini, glysiini ja tymidiini (-HGT) yhdistettiin ja niitä kasvatettiin edelleen -HGT-väliaineessa. Nämä solut 5 levitettiin pitoisuudessa 2 x 10 solua 100 mm:ä levyä kohti 250 nmol/1 metotreksaatissa (MTX) plasmidisekvens-sien määrän lisäyksen valitsemiseksi. Viisi kloonia, jot-20 ka kasvoivat 250 nmol/1 MTX:ssa uutettiin levyltä ja niiden kaikkien havaittiin erittävän t-PA:ta väliaineeseen.

Näitä klooneja käytettiin lisätutkimuksiin.

E. Määritysmenetelmät 1. Mutantti-t-PA:n ja t-PA:n puhdistus 25 Yllä kuvatulla tavalla ilmennetyt eri t-PA:t eri- • · · • · · * *. tettiin soluviljelyväliaineeseen. Väliainetta, joka sisäl- «*··· si näitä t-PA:ita käytettiin sellaisenaan eri määrityksis- « « « *♦·♦* sä, jotka tullaan kuvaamaan tässä myöhempänä, tai ne puh- • · distettiin yhdellä tai useammalla seuraavanlaisella puh-30 distusvaiheella t-PA:n tai mutantti-t-PA:n puhtauden li-: saamiseksi ennen tällaisia määrityksiä.

Mutantti-t-PA: ta sisältävä CHO-solujen väliaine pa-nos uutettiin kelatoivalla Sepharosella (Pharmacia) (10-20 ml hartsia/1 väliainetta), joka oli aktivoitu sinkki-35 kloridilla, kuten Rijken et ai., Biochem. & Biophys. Acta.

98930 22 580 (1979) 140, ovat kuvanneet, ja kerättiin suodattimel-le. Hartsi kaadettiin pylvääseen, pestiin puskurilla, joka sisälsi 0,02 mol/1 natriumfosfaattia, pH 8,0, 0,25 mol/ 1 NaCl:a, 0,01 % Tween 80:tä ja 10 mg/litra aprotiinia.

5 t-PA eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 50 mmol/1 imidatsolia. t-PA-pooli dialysoitiin 0,02 mol/1:een nat-riumfosfaattiin, pH 8, 0,25 mol/1 NaCl:iin ja 0,01 %:een Tween 80:een ja ladattiin lysiini-Sepharose-hartsin päälle, Radcliffe et ai., Arch. Biochem. Biophys. 189 (1978) 10 185 ja Allen et ai., Thrombosis Heamostasis 45 (1981) 43 tai bentsamidiini-Sepharose-hartsin päälle, Bykowska et ai., Biochim. & Biophys. Acta 703 (1982) 113. Sinkki-ke-laattihartsi pestiin lyhyesti 0,02 mol/1:11a natriumfos-faatilla, pH 8, 1 mol/1 NaClsllä ja 0,01 %:lla TWEEN 80: 15 Hä ja t-PA tai mutantti-t-PA eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 0,05 mol/1 arginiinia. Bentsamidiini-Sepharose pestiin dialyysipuskurilla ja eluoitiin dialyy-sipuskurilla, joka sisälsi 1 mol/1 guanidiinia. Saadut proteiinit olivat yli 90 %:sti puhtaita SDS-PAGE-analyy-20 sin perusteella. Edellä kuvattujen puhdistustekniikoiden lisäksi voidaan käyttää kiinnitettyjä monoklonaalisia vasta-aineita (Katso Nielsen et ai., EMBO J. 2 (1983) 115.

2. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS- PAGE) . 25 t-PA-proteiinin tai t-PA-mutanttiproteiinit sisäl- • · · *·\ tävät väliainenäytteet konsentroitiin vakuumissa ja lai mennettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-näytepuskuriin. Silloin, kun oli aiheellista, 10 mmol/1 ditiotreitolia • « V.' (DTT) lisättiin pelkistämään proteiinien disulfidisidok- 30 set. Epäjatkuva SDS-elektroforeesi käyttäen 10 % tai 7-17 :*·.. % polyakryyliamidi-erotusgeeliä suoritettiin Laemmlin me- :*·*: netelmän mukaisesti. (Laemmli, Nature 227 (1970) 680).

Plasmanäytteiden analysoinnissa käytettiin 4-10 % SDS-• ; gradienttierotusgeelejä Laemmlin mukaisessa puskurisystee- 35 missä. SDS-PAGE-analyysistä saadut arvioidut molekyylipa!- 98930 23 not (Mo) saatiin vertaamalla proteiinien liikkuvuutta sellaisten proteiinien liikkuvuuteen, joiden molekyylipainot ovat tunnettuja.

3. Kuplanvapautus hyytymän hajoitus 5 Yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistetun (ei-mutatoi- dun) t-PA:n ja sen mutantti-t-PA:iden (mutantti-t-PA:iden) kyky liuottaa fibriinihyytyrniä määritettiin kuplanvapautus hyytymän hajoitus-analyysillä.

Lyhyesti, trombiinia (Sigma Chemicals Co.) liuotet-10 tiin tislattuun veteen noin 1000 yksikköä/ml. Tämä kanta-liuos laimennettiin suhteessa 1:30 määrityspuskurilla, joka sisälsi 0,06 mol/1 yksiemäksistä natriumfosfaattia, 0,06 mol/1 kaksiemäksistä natriumfostaattia, 200 mg/litra natriummatsidia ja 0,01 % TWEEN 80:tä. Sarja koeputkia, 15 jotka sisälsivät 0,5 ml laimennettua trombiinia (30-40 yksikköä/ml) ja 0,5 ml jokaista eri pitoisuutta t-PA:ta (16 - 1 x 10^ ng/ml); sopivien kontrollien tai tuntemattoman näytteen sopivat laimennokset valmistettiin. Valmistettiin myös toinen sarja koeputkia, jotka sisälsivät 20 /il plas-20 minogeeniä (1,0 mg/ml) ja 1,0 ml fibrinogeeniä (1 mg/ml) ja 10 /il onttoja lasipalloja, joiden huokoskoko oli suurempi kuin 45 mesh (3M-yhtiö).

Yllämainittuja reagensseja ja koeputkia pidettiin jäähauteessa määrityksen viimeiseen vaiheeseen saakka.

25 200 /il:aa joko trombiini-t-PA tai trombiini-mutantti-t-PA- • · · *·'·] liuosta lisättiin peräkkäin koeputkeen, joka sisälsi plas- * * minogeeniä, fibrinogeeniä ja mikropalloja, sekoitettiin 15 s.:.: sekuntia ja putki laitettiin 37°C:een vesihauteeseen. Jo- m · kaisessa putkessa syntyi hyytymiä 30 sekunnissa. t-PA:n 30 lisäyksen ja reaktion loppupisteen välinen aika mitattiin. Loppupisteeksi määriteltiin se aika, jona mikropallot oli-vat nousseet pinnalle määrityksessä.

Tietyn näytteen trombolyyttisen aktiivisuuden määrä : ;* määritettiin vertaamalla t-PA-vakiokäyrään. Spesifinen ak- 35 tiivisuus laskettiin radioimmunologisella määrityksellä 98930 24 määritellyn läsnäolevan t-PA:n tai mutantti-t-PA:n määrän perusteella.

4. In vitro hyytymän hajoitus määritys

Yhdistelmä-t-PA ja mutantti-t-PA määritettiin myös 5 in vitro hyytymän hajoitusmenetelmällä.

Lyhyesti, ihmisen veri otettiin talteen käyttäen 3,13 %:sta natriumsitraattia antikoagulanttina ja solut poistettiin sentrifugoimalla. 50 /ui 0,5 mol/1 CaCl2:a, 25 /il naudan trombiinia (100 yksikköä/ml) ja 10 /il ihmisen 125 10 I-fibrinogeenia (100 000 cpm/10 /il) lisättiin jokaista ml:aa plasmaa kohti. Tämä plasmaseos imettiin silikoniletkuun, jonka sisähalkaisija oli 4 mm, ja inkuboitiin 37°C: ssa 1 tunti. Letku leikattiin palasiin (1 cm) ja hyytymä poistettiin. Hyytymät laitettiin puskuriin, joka sisälsi 15 0,3 mol/1 NaCl:a 0,02 mol/1 natriumsitraattia, pH 5, ja 0,01 % TWEEN 80:tä. Hyytymät huuhdeltiin neljä kertaa yhden tunnin aikana tuoreella puskurilla. Viimeisen pesuliu-oksen radioaktiivisuuden pitoisuus ei ylittänyt noin 10 %:a hyytymän radioaktiivisuuden määrästä. Jokainen hyytymä 20 laitettiin 2,5 ml:aan plasmaa. Plasmasta otettiin 250 μ1:η näyte nollapisteeksi. t-PA- tai mutantti-t-PA-näyte lisättiin 100 μΐιη tilavuudessa. Näytteet (250 /1) otettiin 1, 2, 3 ja 4 tunnin kuluttua ja niiden radioaktiivisuus määritettiin. Vakiot, jotka sisälsivät 5, 10, 20 ja 40 yksik- ♦ 25 köä t-PA-aktiivisuutta millilitraa kohti, määritettiin sa- ♦ · ♦ manaikaisesti. Hajoamisprosentti laskettiin sen jälkeen, • · , kun tilavuudenmuutoskorjaus oli tehty jokaiselle näytteelle.

·*·* 5. Kromogeenimääritykset • · « *·*.* S-2288: t-PA voidaan mitata suoraan käyttäen Kabin 30 synteettistä tripeptidi-kromogeenisubstraattia, S-2288:aa « · • *·· (Helena Laboratories, Beumont, Texas). Tässä määrityksessä : Γ: t-PA:ta ja 1 mmol/1 S-2288:aa (loppupitoisuus) 0,05 mol/1

Tris:ssä, pH 7,4, joka sisälsi 0,012 mol/1 NaCl:a ja 0,01 % TWEEN 80:tä, inkuboitiin 37°C:ssa 10 minuutin ajan. Reak-35 tio pysäytettiin lisäämällä 50 /il jääetikkahappoa 0,5 ml:aan 98930 25 reaktioseosta. Aktiivisuus laskettiin absorbanssista 405 nmrssä seuraavaa valmistajan vakioimaa yhtälöä käyttäen:

Aktiivisuus 0,5 ml:ssa TTT .

a «.q nqm - iu-min

reaktioseosta (IU, kan- = _*_[_ABS

5 sainvälinen yksikkö) inkubaatioaika S-2251: t-PA:n aiheuttama plasminogeenin aktivoituminen mitattiin plasmiinille spesifistä Kabin spesifistä tripeptidi-kromogeenisubstraattia (Helena Laboratories) käyttäen. Pieni määrä näytettä sekoitettiin 0,10 ml:aan 10 0,7 mg/ml plasminogeenia (0,05 mol/1 Tris, pH 7,4, joka sisälsi 0,012 mol/1 NaCl:a) sekä 0,02 ml:aan ihmisen fib-rinogeenia, 20 mg/ml (0,05 mol/1 Tris, pH 7,4, joka sisälsi 0,012 mol/1 NaCl) ja tilavuus säädettiin 0,15 ml:ksi. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 10 minuuttia, 0,35 ml S2251:tä 15 (1 mmol/1 liuos yllämainitussa puskurissa) lisättiin ja reaktiota jatkettiin 5 tai 10 minuuttia 37°C:ssa. Jääetik-kahappoa (50 μΐ) lisättiin reaktion pysäyttämiseksi ja ab-sorbanssi 405 nm:ssä mitattiin. Aktiivisuuden määrä kvan-titoitiin vertaamalla tuloksiin, jotka oli saatu yhdistel-20 mä-DNA-tekniikalla valmistettua natiivi-t-PA-näytettä käyttäen, joka oli vakioitu S-2288-määrityksellä. Tämä oli tarpeellista alun perin, koska absorbanssi 405 nm:ssä vaih-teli päivästä toiseen plasminogeenin vanhetessa ja muuttui myös, jos eri plasminogeeni- ja fibrinogeenivalmisteita ^ ^ 25 käytettiin. Tämä vaihtelu saatiin vähäisemmäksi lopulta • « * valmistamalla huolellisesti suuria määriä ihmisen plasmi- • * nogeenia (glu-plasminogeenia), joka seuraavaksi kylmäkui-vattiin annoksina. Annokset säilytettiin -20°C:ssa. Liuo-V. tettuja plasminogeenivalmisteita ei säilytetty 0°C:ssa en- 20 nen käyttöä kauempaa kuin 4 tuntia. t-PA:n aktiivisuuden • · i *·· stimuloituminen fibrinogeenillä mitattiin vertaamalla kor- keitä fibrinogeenipitoisuuksia sisältävien liuosten aktii-... visuutta samantapaisiin reaktioseoksiin, jotka eivät sisäl- ! täneet fibrinogeenia. Fibrinogeeniä käytettiin tässä mää- 25 rityksessä, koska fibriini ei liukene. Stimuloituminen kor- 98930 26 keillä pitoisuuksilla fibrinogeeniä näyttää muistuttavan sitä stimuloitumista, jonka liukenematon fibriini aiheuttaisi .

6. In vivo-inhibiittorikompleksien määritys 5 Yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettu t-PA ja mu- tantti-t-PA määritettiin in vitro niiden reaktiivisuuden luonnollisesti esiintyvien t-PA-aktiivisuuden inhibiitto- reiden kanssa määrittämiseksi. Yleisesti, t-PA ja mutant- 125 ti t-PA joditettiin I:lla käyttämällä Iodobeads-valmis-10 tetta (Pierce Chemical Co.), jolloin saatiin t-PA:ta tai mutantti-t-PA:ta, joiden spesifiset aktiivisuudet olivat noin 2 x 10° cpm/pg. In vitro-kompleksin muodostamiseksi radioaktiivisella isotoopilla leimattua t-PA:ta (1 pg) lisättiin vasta otettuun sitraattia sisältävään ihmisen ve-15 reen (500 μΐ). Näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa ja reaktio pysäytettiin laimentamalla näyteannos 2 %:lla SDS:llä. Näytteet analysoitiin 4-10 %:sta polyakryyliami-digradientti-SDS-PAGE:a käyttäen. Kompleksit osoitettiin autoradiografisesti.

20 7. Fibriinin sitomismääritys

Menetelmä fibriinin sitomisen määrittämiseksi on

Rijken et ai.'n, J. Eiol. Chem. 257 (1982) 2920, kuvaaman menetelmän muunnos. Kokeessa käytettävä t-PA-näyte (500 ng) lisätään liuokseen, joka sisältää 0,05 mol/1 Tris:ä, . 25 PH 7,4, 0,012 mol/1 NaCl:a, 0,01 % TWEEN 80:tä, 1 mg/ml « · · ihmisen seerumin albumiinia sekä eri pitoisuuksia fibrino- IM»* ♦ geenitonta plasminogeenia (0, 0,1, 0,5 ja 1,0 mg/ml). Re- • * · ··;' aktioseoksen lopputilavuus on 1 ml. Näytettä inkuboidaan

i * r O

·*·* 37 C:ssa viisi minuuttia, jonka jälkeen lisätään 1 yksik- 30 kö trombiinia. Näytteitä inkuboidaan yksi tunti 37°C:ssa.

' '·· Hyytymä poistetaan lasisauvaa käyttäen ja jäljelle jääneen, • · * : sitoutumattoman t-PA:n määrä supernatantissa määritetään.

<·., Tulokset esitetään graafisesti prosentteina sitoutunutta t-PA:ta fibrinogeenipitoisuutta vastaan, (kuva 11).

35 8. In vivo hyytymän hajoitus · Käytettiin Collen et ai.'n, J. Clin. Invest. 71 (1983) 98930 27 368, mukaista in vivo hyytymän hajoamismallia. New Zea- land-rotuiset valkoiset uroskanit, jotka painoivat 2,5- 3 kg, nukutettiin ketamiinilla, kaulasuoni katetrisoitiin ja alueella olevat pienet yhdyssuonet yhdistettiin. Noin 5 2 cm kaulasuonta eristettiin sitomalla suoni palautuvasta, lanka pujotettiin segmentin proksimaalisesta päästä dis- taaliseen päähän, segmentti huuhdottiin fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi trombiinia, ja täytettiin 1 25 tuoreella kanin verellä, joka sisälsi I:llä leimattua 10 ihmisen fibrinogeenia. 30 minuutin kuluttua veren annettiin virrata uudelleen hyytymän läpi. t-PA:n suonensisäinen infuusio aloitettiin 10 %:lla kokonaisannoksesta olevalla alkuannoksella. Infuusio annettiin neljän tunnin aikana. 30 minuutin kuluttua infuusion lopettamisesta hyy-15 tymä otettiin talteen ja sen radioaktiivisuus mitattiin. Radioaktiivisuuden talteenottoa käytettiin laaduntarkkai-lukontrollina; verinäytteiden, virtsan, pyyhelappujen ja ruiskujen radioaktiivisuus mitattiin sen varmistamiseksi, että alkuperäisen hyytymän sisältämän radioaktiivisuuden 20 määrän arviointi oli tarkka.

F. Määritystulokset t-PA-mutantit, jotka sisälsivät seuraavat sekvenssit kaksiketjuiseksi aktivoitumispaikassa, tähteet 270-279, on ilmennetty sekä E. colissa että kiinalaisen hams-, 25 terin munasarjasoluissa (CHO-soluissa): *·*·! 275 279 natiivi -Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- (RIKGG) '.T.: 1B8 -Gly-Ile-Lys-Gly-Gly- (GIKGG) i * ',v 2C9 -Glu-Ile-Lys-Gly-Gly- (EIKGG) 30 1. Western blot-analyysit ja tsymografia EIKGG & GIKGG-mutantit, jotka oli ilmennetty CHO- *’*: soluissa analysoitiin Western-blot-menetelmällä pelkiste tyistä ja pelkistämättömistä SDS-PAGE-geeleistä. Natiivi, yksiketjuinen t-PA esiintyy kahtena nauhana, joiden mole- ; ^5 kyylipainot ovat 52 000 ja 50 000 daltonia, glykosylaatio- * * I ·

4 I

98930 28 asteen erosta johtuen. EIKGG-mutantti pelkistämättömästä SDS-PAGE:sta esiintyi yhtenä, pääasiallisena immunoreak-tiivisena nauhana, jonka molekyylipaino oli noin 50 000 daltöniä. Mutantti-GIKGGin Western blot-analyysi pelkis-5 tämättömästä SDS-PAGE:sta kuitenkin osoitti 55 000 dalto-nin molekyylipainon. GIKGG-mutantin havaitun molekyylipai-non ero verrattuna natiiviin t-PA:han osoittaa hiemen erilaista konformaätiota tai hiilihydraattirakennetta natiiviin t-PA:han verrattuna. Proteiinin pilkkoutuminen ase-10 massa arg-275 voidaan havaita t-PA:n matalamman molekyyli-painon perusteella, kun analyysi tehdään pelkistyksen jälkeen (jolloin erotetaan proteaasi- ja Kringle-ketjut). Pelkistettyjen SDS-PAGE-geelien tsymografiat osoittivat, että plasminogeenin aktivaattorin aktiivisuus näissä näyt-15 teissä oli t-PA:n yksiketjuisen muodon immunoreaktiivisen nauhan molekyylipainon kohdalla (noin 60 000 daltonia). t-PA:n kaksiketjuisen muodon elektroforeettinen liikkuvuus vastaa yhdenmukaisesti molekyylipainoa noin 30 000 daltonia. Tämä menetelmä osoitti, että mutantti-t-PA-pro-20 teiinien yksiketjuiset muodot ovat läsnä transformoitujen solujen väliaineessa.

S-2251-määritys

Natiivin ja mutantti-EIKGG-t-PA:n analysointi S- 2251-määrityksellä on esitetty taulukossa I. Nämä arvot . .·. 25 saatiin ennen glu-plasminogeenin käyttöä määrityksessä • · · • · esiintyvien vaihteluiden vähentämiseksi.

φ · . Luonnollisesti esiintyvä t-PA-sekvenssi RIKGG määriteltiin • · · • · « ·" kokeelliseksi spesifiseksi aktiivisuudeksi fibrinogeenin • « · *·*·' läsnäollessa S2288-määrityksen perusteella. Tämä vakio-t- 30 PA määritettiin jokaiselle EIKGG-t-PA-mutantille tulosten • · : *·· normalisoimiseksi.

• · · v : Kuten voidaan nähdä, EIKGG-t-PA-mutantin spesifinen aktiivisuus S2251 plus fibrinogeeni-määrityksessä on suu- , rempi kuin yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistetun t-PA:n 35 spesifinen aktiivisuus.

'98930 29

TAULUKKO I

S-2251 + S-2251 - Fibrinogeeni-

Mutaatio Mutantti fibrinogeeni fibrinogeeni stimulaatio RIKGG1 natiivi (250.000)4 25.000 10,0 5 EIKGG1 2C9 1.000.000 3.400 290,0 EIKGG2 2C9 420.000 3.100 134,0 EIKGG3 2C9 520.000 7.000 74,0 1puhdistettu sinkkikelaatti-lysiiniagaroosia käyttäen 2 puhdistettu sinkkikelaatti- ja bentsamidiiniagaroosia 10 käyttäen 3 analysoitu puhdistamattomana 4 ilmoitettu aktiivisuus

Taulukon IA tulokset saatiin korkealaatuista, kylmäkuivattua glu-plasminogeenia käyttäen. Toistettavammalla määri-15 tvsmenetelmällä EIKGG-mutantin aktiivisuuden S-2251-määrityksessä fibrinogeenin läsnäollessa havaittiin olevan yhtä suuri. Kun fibrinogeenia ei ollut läsnä, mutantti oli edelleen vähemmän aktiivinen kuin natiivi (taulukot I ja IA), mikä osoittaa suurempaa spesifisyyttä.

20 TAULUKKO IA

S-2251 + S-2251 - Fibrinogeeni-

Mutaatio Mutantti fibrinogeeni fibrinogeeni stimulaatio RIKGG1 natiivi (250.000)2 17.600 14 EIKGG1 2C9 248.000 500 500 -| . .·. 25 puhdistettu sinkkikelaatti-lysiiniagaroosia käyttäen • · · 2 ilmoitettu aktiivisuus • « . 2. Kuplanvapautus hyytymän hajoitus ja in vitro hyy- tymän hajoitusmääritys • · · *·*·’ Kuplanvapautus-hyytymänhajoitus-määritystä käytet- 30 tiin yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistetun t-PA:n ja puh- • · • *·· distetun ElKGG-t-PA-mutantin spesifisen aktiivisuuden mää- V? rittämiseksi. Kummankin näiden t-PA:iden aktiivisuus määri- teltiin yllä kuvattuja menetelmiä käyttäen. t-PA:n ja EIKGG-. * mutantti-t-PA:n pitoisuudet määritettiin radioimmunologisel- 35 ia määritysmenetelmällä. Tämän määrityksen tulokset samoin .. 98930 30 kuin spesifiset aktiivisuudet on esitetty taulukossa II.

TAULUKKO II

U/ml Proteiini- Spesifinen Näyte Mutantti aktiivisuus pitoisuus mg/ml aktiivisuus 5 1 EIKGG* 8440 0,088 95.909 2 EIKGG* 7698 0,088 87.477 3 t-PA** 5640 0,088 64.090 1) jäädytetty ja sulatettu kerran 2) jäädytetty ja sulatettu neljä kertaa 10 * puhdistettu sinkkikelaatti- ja bentsamidiiniagaroosia käyttäen ** puhdistettu sinkkikelaatti- ja lysiiniagaroosia käyttäen .

Kuplanvapautus-hyytyjänhajoittamismääritys osoittaa, että 15 yksiketjuisen mutantti-t-PA:n, erityisesti EIKGG-mutantti- t-PA:n, spesifinen aktiivisuus on 50 % suurempi kuin yh- distelmä-DNA-tekniikalla valmistetun t-PA:n. Kuten voidaan nähdä, toistuvat jäädytykset ja sulatukset johtavat EIKGG- t-PA-mutantin spesifisen aktiivisuuden vähäiseen alenemi- 20 seen. Mutantti-t-PA säilytti kuitenkin edelleen suuremman spesifisen aktiivisuuden kuin yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistetun t-PA:n aktiivisuus.

3. In vivo inhibiittorikompleksimääritys

Proteaasien inaktivoiminen plasman proteaasi-inhi- 25 biittoreilla on hyvin tutkittu mekanismi seerumin prote-• · · “ * \ aasien inaktivoimiseksi. Saadut kompleksit ovat denaturaa- tion kestäviä ja ne voidaan määrittää SDS-PAGE-elektrofo-reesilla. Tässä menetelmässä radioaktiivisella isotoopil- • « :.V la leimattua t-PA:ta lisätään plasmaan tai kokovereen ja 30 näytettä inkuboidaan 37°C:ssa. Näytteestä ajetaan SDS-PAGE, :*·.. jonka jälkeen suoritetaan autoradiografia. Radioaktiivisen leiman havaitseminen Mp-alueella, joka on suurempi kuin va-paalia t-PA:11a, on osoitus muodostuneen t-PA-proteaasi-inhibiittorikompleksin määrästä. Rotan verestä analysoitu-’ 35 na t-PA:n havaittiin muodostavan hitaasti komplekseja, joi- » « * 98930 31 den molekyylipaino on suurempi kuin 200 000. Useiden tuntien inkuboinnin jälkeen enemmän kuin 70 % radioaktiivisesta leimasta voitiin havaita näissä komplekseissa. Päinvastoin, mutaation sisältävä t-PA ei muodostanut näitä 5 komplekseja; autografiässä havaittu radioaktiivinen leima pysyi vapaan, inaktivoitumattoman entsyymin kohdalla. Kun samantapainen analyysi suoritettiin ihmisen verestä, (kuva 10), t-PA muodosti myös näitä komplekseja, mutta tämän lisäksi muodostui komplekseja, joiden molekyylipainot oli-10 vat 100 000 - 200 000. Kuten rotan verellä, mutantti-t-PA muodosti huomattavasti vähemmän inhibiittorikomplekseja, joiden Mp oli suurempi kuin 200 000. Proteaasi-inhibiitto-rikomplekseja, joiden molekyylipainot olivat välillä 100 000 ja 200 000, oli edelleen läsnä. Nämä tulokset 15 osoittavat, että mutantti ei inaktivoidu proteaasi-inhi-biittoreilla, jotka muodostavat komplekseja, joiden Mp-arvot ovat suurempia kuin 200 000. Pannaan merkille laji-erot sekä t-PA:n että mutaation sisältävän t-PA:n reaktiivisuudessa muodostaa komplekseja, joiden molekyylipainot 20 ovat välillä 100 000 ja 200 000.

4. Fibriinin sitominen

Aikaisemmin on raportoitu, että t-PA:n yksiketjui- silla ja kaksiketjuisilla muodoilla on noin yhtä suuri fib- riini-affiniteetti (Rijken et ai., J. Biol. Chem. 257 ^ 25 (1982) 2920. Tässä yllä kuvatussa määrityksessä havaittiin ♦ · · päinvastoin huomattavasti korkeampi affiniteetti t-PA:n • · yksiketjuiselle muodolle verrattuna kaksiketjuiseen muo- *···’ toon (kuva 11).

• * :.V 5. In vivo hyytymän hajoitus 30 Kuva 12 osoittaa t-PA:n (o) ja EIK-mutantin (o) suh- • *·· teellisen annos-vastekäyrän. Tulokset on esitetty keskiar- vona +/- SEM, kun jokaisessa ryhmässä oli 5 kania. Kahden käyrän välinen ero 50 % hajoamiskohdalla mitattiin ja t-PA:n EIK-muodon tehokkuuden arvioitiin olevan 2,4 kertaa 35 suurempi kuin normaalin muodon (RIK). Tilastollisesti mer- . 98930 32 kittävä ero saatiin annoksella 0,25 mg/kg (p < 0,01).

G. Johtopäätös

Ylläolevat tulokset osoittavat, että mutaatio t-PA:n tähteessä 275 saattaa olla tehokkaampi kuin luonnol-5 linen muoto kahdesta eri syystä: 1. Lisääntynyt spesifisyys: t-PA-funktion määritykset osoittavat aktiivisempaa spesifistä proteiinia.

2. Vähentynyt plasman inhibiittorin sitominen in vivo: näiden mutanttien in vivo-inhibitio osoittaa tiet- 10 tyjen proteaasi-inhibiittoreiden aiheuttaman inhibition vähenemistä. Tämän pitäisi sallia t-PA:n aktiivisen, kompleksiin sitoutumattoman muodon kiertämisen verenkierrossa ja siten sallivan lisääntyneen funktionaalisen t-PA:n liuottavan hyytymää.

15 Tieteellisessä kirjallisuudessa esiintyy ristirii taisia tuloksia t-PA:n yksiketjuisen muodon entsymaatti-sista ominaisuuksista. Jotta t-PA:n funktio ymmärrettäisiin paremmin, voidaan tarkastella homologisia proteiineja. Perusteellisia tutkimuksia on suoritettu seriiniprote-20 aaseilla, trypsiinillä ja kymotrypsiinillä. t-PA:n prote-aasialue on hyvin samanlainen kuin näiden kahden proteiinin ja sen voidaan odottaa toimivan samalla tavalla. Tryp-siinille ja kymotrypsiinille määritettyjen toimintamekanismien perusteella t-PA:n asemassa arginiini-275 pikkou-25 tumisen estämisen voisi odottaa vaikuttavan vain proteaasi- • · · * alueen toiminnallisiin ominaisuuksiin. Sen mutanttien lisääntynyt fibriini-affiniteetti on sen vuoksi hämmästyttä- « · ( •»< vää.

• · :.V Olipa vaikuttava mekanismi (mekanismit) mikä tahan- 30 sa (lisääntynyt spesifisyys, proteaasi-inhibiittoriin si- : ·.. toutumisen puute, lisääntynyt affiniteetti fibriiniin tai näiden yhdistelmä) testattaessa yhtä mutanttia sen kyvyn suhteen hajoittaa tukkeutunut suoni in vivo, mutantin ha-valttiin olevan noin 2,5 kertaa aktiivisempi kuin t-PA:n < · ·;’ 35 luonnollinen sekvenssi. Kuten aikaisemmin on tarkastettu, 98930 33 on osoitettu, että t-PA:n yksiketjuinen muoto muuttuu kaksiketjuiseksi muodoksi hyytymäpaikalla. Tämä muuttuminen saattaisi tuhota yksiketjuiseen muotoon liittyvät edut. Vain t-PA:n mutaation sisältävä muoto pystyy fysio-5 logisten proteaasien muuttamana kaksiketjuiseen muotoonkin säilyttämään etunsa, kun se on hyytymän paikalla.

Kun tämän keksinnön edulliset suoritusmuodot on kuvattu, alan asiantuntijoille on yleensä selvää, että monia modifikaatioita voidaan tehdä julkaistuihin suori-10 tusmuotoihin ja että nämä modifikaatiot on tarkoitettu tämän keksinnön piiriin kuuluviksi.

• · · • · · • · • · : : .

• · • « « « < • · • · • · · m « · · 9 1 Ψ

• I I

1 1

Claims (11)

1. 98930
2. 1. Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaatto-rin (t-PA) mutantin valmistamiseksi, jonka mutantin ase-5 massa 275 on jokin muu aminohappo kuin arginiini ja joka mutantti on resistentti spesifiselle entsymaattiselle pilkkoutumiselle kaksiketjuiseen muotoon, tunnettu siitä, että viljellään yhdistelmä-isäntäsoluviljelmää ja tuotettu mutantti otetaan talteen.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan mutantti, jonka asemassa 275 on glysiini.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan mutantti, jonka 15 asemassa 275 on glutamiinihappo.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan mutantti, jonka asemassa 277 on jokin muu aminohappo kuin lysiini.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan mutantti, jonka asemassa 277 on isoleusiini.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen kudos- . 25 plasminogeeniaktivaattorin Glu275-Ile277-mutantti. • ·
8. 7. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se * r . ,·. koodaa jossakin patenttivaatimuksista 1-6 kuvattua mu- * < · ! . tanttia. « · • < * * 8. Replikoituva ekspressiovektori, tunnettu 30 siitä, että se pystyy transformoidussa isäntäsolussa il- * « • “ mentämään patenttivaatimuksen 7 mukaisen DNA-sekvenssin. *·»
9. 9. Bakteeri, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella vektorilla. i < i * « « 98930
10. 10. Nisäkässoluviljelmä, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella vektorilla.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen soluviljelmä, 5 tunnettu siitä, että se on saatu transformoimalla kiinalaisen hamsterin munasolu-solulinja. • * · • · · • · ···· r c i : * * • · • · · « 4 • · • · • · «i * · m ··· » · 98930