JPH0740940B2 - 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−P
A）の新規な突然変異体に関するものである。これらの
突然変異体は、後述する様に、既に文献中に総括的に開
示されている。しかし、本発明の突然変異体は、他の研
究者によつてなされた基本的なヒト−プラスミノゲン活
性化因子分子を用いた研究や、セリンプロテアーゼ類、
トリプシンおよびキモトリプシンを用いたモデル研究の
結果からは予測し得ない活性を示す、新規で特異的なも
のである。

発明の背景 コレン（Collen）らは、初めて、天然起源からヒト組織
プラスミノゲン活性化因子を実質上、純粋な形で単離し
て同定し、プラスミノゲン活性化因子にとつて必要な活
性の測定を行つた（ヨーロツパ特許出願公開No.04176
6、1981年12月16日公開、最初の出願日、1980年６月11
日）。

その後、讓受人の研究室において、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子に通常伴なつているタンパク質を、実
質上、含まない状態のｔ−PAを、組換えDNA技術を用い
て生産することに成功した。この研究は化学の学術文献
およびヨーロッパ特許出願公開No.093619（1983年11月
９日公開、1982年５月５日出願）に記載されている。上
記の特許出願（EPO公開No.093619）は、ヒトプラスミノ
ゲン活性化因子の誘導体、即ち、アミノ酸の置換、欠
失、付加、あるいは、基礎的なDNAに対する部位特異的
突然変異誘発による置換等により様々な修飾を受けてい
る種々の誘導体をも想定している。

上記出願で開示されている様に、ヒトプラスミノゲン活
性化因子（ｔ−PA）は、一本鎖および二本鎖のいずれの
形でも、存在している。後者は前者のタンパク分解的加
水分解産物である。一本鎖形から２本鎖形へのタンパク
分解的変換は、フイブリン血餅（クロツト）の溶解段階
に起きることが示された〔リツケン（Rijken）ら、ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）257、2920（1982）〕。プラスミノゲン活性化
因子の活性は二本鎖形にあると考えられているが、初期
の報告では、一本鎖形のヒトｔ−PA（リツケン、同上）
や、一本鎖形のプロシン（Procine）ｔ−PA〔ランビイ
（Ranby）ら、トロンボ・レス（Thromb.Res.）27 176
（1982）〕も幾分かの活性を有しているかもしれない
と、指摘されていた〔リツケンら、ビオシミカ・エ・ビ
オフイジカ・アクタ（Biochim.Biophy.Acta）580,140
（1979）をも参照〕。

しかしながら、その後の研究者達は、一本鎖形のｔ−PA
製品には、少量の二本鎖形ｔ−PAが不純物として含まれ
ていたことから、上記の如き一本鎖形の活性についての
報告を放遂した〔アンドレーセン（Andreasen）ら、EMB
O ジヤーナル、30、151（1984）；イチノセ（Ichinos
e）ら、FEBS.レターズ175,412（1984）〕。これらの後
続文献において、研究者達は、ｔ−PA等のセリンプロテ
アーゼは一本鎖形の不活性な酵素原としての発現され、
このタンパク質が特異的な部位（ｔ−PAの場合は、275
番目の位置にあるアルギニン）で加水分解されて初めて
活性となる、という一般的な説を再確認している。

ウサギおよび犬を用い、一本鎖プラスミノゲン活性化因
子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、フイブリン血
餅溶解活性のインビボでの比較研究がなされた。ウサギ
の場合、この酵素の２つの形における能力は同等である
ことが認められた〔コレンら、ジエイ・クリン・インベ
スト（J.Clin.Invest.）71 368（1983）〕。しかし、犬
に関して、同じモデルを用いて行つた評価では、二本鎖
形のプラスミノゲン活性因子に比べて一本鎖形のものの
方がやや活性が低いことが報告されている〔コーニンガ
ー（Korninger）ら、ジエイ・クリン・インベスト（J.C
lin.Invest.）69 573（1982）〕。これらの研究報告
は、インビボにおけるフイブリン血餅の溶解能力におい
て、一本鎖プラスミノーゲン活性化因子が、二本鎖プラ
スミノーゲン活性化因子以上に優れていることはなく、
もしろ、実際には、劣つていることを示唆している。

発明の要約 本発明は、ヒトｔ−PAの新規な突然変異体であつて、驚
くべきことに、コレンら（EPO公開No.04766）によつて
最初に単離されたヒトｔ−PA、並びに前記の組換え特許
出願（EPO公開No.093619）に示されているｔ−PA分子と
同等、あるいはそれ以上の活性を示す突然変異体に関す
るものである。さらに詳しくは、本発明は、ヒトｔ−PA
アミノ酸配列の275および276位（それぞれ、アルギニン
およびイソロイシンによつて占められている）付近の部
位に、あるアミノ酸置換を有する特異的な突然変異体に
関するものである。ある種の酵素的に活性な分子は、こ
の（これらの）部位（１または１以上）を認識し（おそ
らく、それと隣接している１またはそれ以上のアミノ酸
と一緒に）、塩基性アミノ酸の後方で機能的に加水分解
して結合（特に、アルギニン／イソロイシンおよびリジ
ン／グリシン間）を切り、その結果、二本鎖物質を与え
る。これらの２本の鎖は、システイン残基を介したジス
ルフイド結合により、互いに結合している。本発明によ
れば、これらの位置で、例えばアルギニンおよびリジン
以外のアミノ酸による置換が起るので、開裂部位に変化
を来し、２本鎖ヒトｔ−PAがインビトロまたはインビボ
で生成されないか、あるいは、その形成成度が遅延され
ている突然変異体が生産される。従つて、本発明によれ
ば、生物学的な活性を試験する目的で、突然変異を誘発
された一本鎖ヒトｔ−PAを得ることができる。これらの
突然変異体は免疫を与えることができ、または、少なく
とも275/276部位で加水分解されることに抵抗性を有し
ており、さらには、得られた一本鎖ｔ−PA突然変異体
は、意外にも、コレンらのｔ−PAおよび／または前記の
組換えｔ−PA分子と同等の活性を有することが、ある生
物学的検定法で見出された。その上、これら突然変異体
は、天然に存在しているｔ−PA阻害物質との反応性が低
いことも示された。

図面の簡単な説明 第１図はヒトｔ−PA（５′および３′非翻訳領域を含
む）、および、プレ−ｔ−PAをコードしている配列のDN
Aの制限地図を示すものである。斑点を付した部分はｔ
−PAの構造遺伝子である。

第2A、2Bおよび2C図は５′−および３′−非翻訳領域を
含む、プレ−ｔ−PAのDNA配列およびアミノ酸配列12H＆
K10Hを表わす模式図である。

第３図は275位に置換を有するクローン類それぞれの組
立て模式図である。

第４図〜第８図はpXAPPA183′△X10trpRの組立て模式図
である。

第９図はプラスミドpPADHFR−６の制限部位を示す模式
図である。

第10図は、SDS−PAGEゲルを用い、オートラジオグラフ
イーで検出した、放射性標識ｔ−PA（左側）およびEIKG
G t−PA（右側）と血漿プロテアーゼ阻害物質とのコン
プレツクス形成像を写した写真の模写図である。

第11図は、１本鎖ｔ−PA（−ｏ−）、二本鎖ｔ−PA（…
ロ…）および一本鎖突然変異ｔ−PA（EIKGG、−●−）
のフイブリンとの結合活性を示すグラフである。

第12図は、インビボにおけるEIK（一本鎖ｔ−PAの突然
変異体）およびrt−PA（突然変異していないｔ−PA）の
血餅溶解作用の用量一応答曲線を示すグラフである。図
中、■は賦形剤、…ｏ…はrt−PA、−●−はEIKを表わ
す。

詳しい記述 本明細書において、「ヒト組織プラスミノゲン活性化因
子」、「ヒトｔ−PA」または「ｔ−PA」という語句は、
例えば組換え細胞培養系において、プロテアーゼ部分を
含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性因子以外のプ
ラスミノゲン活性化因子に相当する生物活性な形で生産
された外因性のヒト（組織型）プラスミノゲン活性化因
子を意味する。全配列を通じて、１個またはそれ以上の
アミノ酸が異なることに起因する天然のアレル変異体が
存在し、また、生成され得ることは理解されるであろ
う。また、宿主の細胞環境の性質により、グリコシル化
のパターンにも変化がある。

ヒト組織プラスミノゲン活性化因子は、プラスミノゲン
をプラスミンに変化させるプロテアーゼ領域と、フイブ
リンとの結合に関与すると考えられているクリングル
（kringle）含有領域との２個の機能的な領域を有する
ポリペプチドである。従つて、ｔ−PAは、全配列の一部
にこれらの機能的な配列を含有しているポリペプチドを
包含するものである。

ｔ−PAの「２本鎖開裂部位」は、少くとも、275位のア
ルギニン残基を含有する。しかしながら、275位の残基
と隣接する、あるいは、275位付近の数個の残基内の種
々のアミノ酸もまた、プラスミノゲン活性化因子をその
二本鎖形に変換する酵素によつて認識され得る領域の一
部であると思われる。従つて、この領域内であつて、27
5位以外の位置のアミノ酸が置換されることにより、２
本鎖形への変換に抵抗し得る突然変異プラスミノゲン活
性化因子を得ることができる。

本明細書では特に、「一本鎖プラスミノゲン活性化因子
突然変異体」という語句は、２本鎖形への変換に抵抗性
を有するプラスミノゲン活性化因子を指すものとする。
これは、二本鎖活性化部位における１または複数個のア
ミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。修飾された結
果、その様な活性化部位は認識されなくなり、通常、プ
ラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換する酵素によ
つて認識されなくなる。

トリプシンおよびキモトリプシンとの類似性に基づき、
セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成において重要
な点を考慮し、ｔ−PAの場合は、276位に遊離のα−ア
ミノ基が存在することが重要と思われる。275位のargに
おいて開裂されると、276位のα−アミノ基が遊離の状
態になり、ポリペプチド鎖と、ｔ−PAの活性なセリン領
域で反応が自由に行われるようになる。従つて、本発明
は、分子全体としての活性全てを消失させることなし
に、前記の如きα−アミノ基とプロテアーゼ活性部位と
の相互作用を妨げ得る全ての突然変異を包含するもので
ある。

基本の（元々の）DNAに突然変異を誘発し、本発明の突
然変異体を調製するために利用し得る様々な方法があ
る。その内、本明細書において特に好ましい例示の方法
は、突然変異を起こそうとする領域をコードしている配
列を含む、天然のｔ−PA遺伝子のフラグメントを複製可
能な形のフアージM13mp8に挿入してM13mp8PAを組立てる
ことを含む。次いで、挿入したｔ−PA配列と相補的であ
るが、置換すべきアミノ酸をコードしている１またはそ
れ以上のヌクレオチドトリプレツトを含んでいる合成オ
リゴヌクレオチドを一本鎖形のM13mp8PAにアニールし、
二本鎖領域を形成する。この領域は、DNAポリメラーゼ
Ｉによる、残りの相補鎖の形成におけるプライマーとな
る。複製、同定の後、この突然変異ｔ−PA配列を更に修
飾するか、あるいは、突然変異ｔ−PAポリペプチドを発
現させるための原核性または真核性ベクターの組立てに
用いることができる。

上記の一般的な方法を用い、275/276および／または277
/278二本鎖開裂部位以外の位置でｔ−PAを突然変異さ
せ、本発明の範囲に含まれる突然変異ｔ−PA誘導体を生
産することができる。その様な他の部位は、通常、アル
ギニンまたはリジンに、イソロイシン、セリンまたはア
ラニンが続くトリプシン様開裂部位等の酵素的な加水分
解を受け易いポリペプチド配列である。その様なトリペ
プシン様開裂部位内の１またはそれ以上のアミノ酸の置
換によつて、トリプシン様プロテアーゼによる加水分解
に抵抗する突然変異ｔ−PAが得られる。発現および精製
の工程中で、さらに、医薬としてインビボに投与した場
合に、これらの有する酵素的分解に対する抵抗性に基づ
き、本発明のｔ−PAは、突然変異していないｔ−PAに比
べて生物学的な活性を失ない難いことになる。ヒトｔ−
PA内のその様なトリプシン様開裂部位には、例えば、ア
ルギニン−アラニン（40−41位）、アルギニン−セリン
（27−28位）およびアルギニン−セリン（462−463位）
が含まれる。

A.一般論 本発明の突然変異ｔ−PAは、１）第１番目のアミノ酸に
メチオニンを含有させ（ATG開始シグナルコドンを構造
遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にする）、
または、２）メチオニンが細胞内または細胞外で開裂さ
れる場合には、そのものが正常状態で有している第１番
目のアミノ酸を含有させ、または、３）そのものが普通
に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリペプ
チドまたはコンジユゲートしたポリペプチドであつて、
細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシグナ
ルポリペプチドまたはコンジユゲートしたポリペプチド
と一緒に調製し、または、４）余分な、不要のポリペプ
チドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現され、調
製される。どの方法によつても、得られた種々の突然変
異したヒトｔ−PAを回収し、これを、心筋梗塞、発作、
肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞その他の
血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾患に対する
治療に適合し得る程度に精製することができる。

ヒト突然変異ｔ−PAは機能的にフイブリンと結合し、イ
ンビトロまたはインビボにおいて、プラスミノゲンを変
化させて、フイブリン血餅の可溶化作用を有するプラス
ミンを与える様、触媒し得るものと定義される。

「発現ベクター」という語句は、自身が含有しているDN
A配列であつて、該DNAを発現させるための他の配列と機
能的（操作可能）に結合しているDNA配列を発現させる
ことができ、宿主生物内で、エピソームとして、あるい
は染色体DNAの一部として複製可能なベクターを包含す
る。

「組換え宿主細胞」という語句は、組換えDNA技術を用
いて組立てられた発現ベクターで形質転換された細胞を
指す。

B.宿主細胞培養およびベクター 本明細書で開示したベクターは広範な範囲に及ぶ原核性
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌K12株294（ATCCNo.31446）は特に有用である。その
他の微生物株、例えば大腸菌Ｂおよび大腸菌X1776（ATC
CNo.31537）も用いることができる。これらの例は、当
然例示にすぎず、限定的なものではない。

原核生物に加えて、酵母培養等の真核性生物も用いるこ
とができる。多核性物からの細胞培養は、今日選択され
る宿主である。原則として、その様な細胞培養はすべて
有効である。しかしながら、脊椎動物由来の細胞に大き
い関心が寄せられており、これらの細胞を培養（組織培
養）して増殖させる方法は、再現性のある方法となつて
いる〔組織培養（Tissue Culture）、アカデミツク・プ
レス（Academic Press）、クルスおよびパターソン（Kr
use and Patterson）編（1973）〕。その様な有用な宿
主セルラインには、VEROおよびHeLa細胞、チヤイニーズ
・ハムスター・卵巣（CHO）セルライン、W138、BHK、CO
S−７およびMDCKセルラインが含まれる。

以下に記載する実施例においては、trpプロモーター系
を使用して大腸菌を用い、また、プロモーターとしてSV
40複製起源を含有している発現ベクターを使用してCHO
細胞を用いた。しかしながら当該技術者ならば他の原核
性あるいは真核性宿主細胞培養を用い得ることを理解で
きる。

C.方法 1.トランスフエクシヨン 強固な細胞壁障害を持つていない細胞を宿主細胞として
用いる場合には、グラハム（Graham）ら、ピロロジイ
（Vivology）52546（1978）の示したりん酸カルシウム
沈降法によつてトランスフエクシヨンを行う。しかしな
がら、核注入またはプロトプラスト融合を利用すること
もできる。

原核性細胞または実質的な細胞壁構築物を有する細胞を
用いる場合には、コーエン（Cohen）ら、プロシ−デイ
ングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスイズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）（USA）692110
（1972）の記載した塩化カルシウム法が、トランスフエ
クシヨンにとつて好ましい方法である。

2.ベクターの組立て 所望の暗号配列およびコントロール配列を含有している
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーシヨン（結合）法を用いる。単離したプラスミド
またはDNAフラグメントを切り開き、修復して再結合
（ライゲート）させ、所望のプラスミドを組立てるのに
望ましい形にする。

D.実施例 1.t−PA突然変異誘発のためのM13mp8PABal IIの組立て ヒトｔ−PAのDNAは、プラスミドpPADHFR−６（pETPFRと
も呼称）およびPA25E10から得られた。これら２個のｔ
−PAプラスミドの調製法は、EPO出願公開No.093619（前
掲）に記載されている。

プラスミドpP25E10は、ｔ−PA遺伝子の後部508アミノ酸
をコードしている配列と、３′非翻訳領域の772塩基対
を含有している。このプラスミドをSac IおよびBgl II
で消化して得た744塩基対フラグメントを既述の標準的
手法により単離した。ｔ−PAの既知の配列および第１図
に示した制限地図から分る様に、このフラグメントは、
ｔ−PAのアミノ酸411から527に対するコドン、並びに
３′非翻訳領域の一部を含んでいる。

プラスミドpPADHFR−６は、ｔ−PAの全構造遺伝子、お
よび３′非翻訳領域の一部を含んでいる。このプラスミ
ドをSac IおよびBgl IIで消化し、生成した1,230塩基対
フラグメントを単離した。このフラグメントは、成熟型
ｔ−PAの最初の410アミノ酸に関するコドンを含有して
いる。

これらのフラグメントを標準的な方法でライゲートさ
せ、Bgl IIで消化した。成熟ｔ−PAの全配列と３′非翻
訳領域の一部に関するコドンを含む1,974塩基対フラグ
メントを単離した。二本鎖M13mp8〔メツシング（Messin
g）ら、「巨大分子組換えDNAに関する第３回クリーブラ
ンド・シンポジウム（Third Cleveland Symposium on M
acromolecules Recombinant DNA）」、A,ウオルトン
（A.Walton）編、エルセビアー（Elsevier）アムステル
ダム（1981）P.143〕をBamHIで消化し、BgI II消化ｔ−
PAとアニールさせ、M13mp8PABgI IIを組立てた。この二
本鎖の、複製可能なM13mp8PABgI IIで大腸菌JM101細胞
（ATCCNo.33876）を形質転換した。このフアージでトラ
ンスフエクトされた大腸菌JM101細胞から一本鎖形およ
び二本鎖（RF）形のM13mp8PABgI IIを単離することがで
きる。一本鎖形のM13mp8PABgI IIを、ｔ−PAの特定部位
における（部位特異的）突然変異誘発に用いた。

2.部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの合成 ヒトｔ−PA構造遺伝子を部位特異的突然変異誘発に付
し、種々の位置にアミノ酸置換を有するｔ−PA（複数）
を発現する様、修飾した。合成オリゴヌクレオチドは、
例えば、クレアら〔プロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ（USA）7
5 5765（1978）〕の固相ホスホトリエステル法により調
製された。その様な特定部位における突然変異誘発のた
めに以下の合成プライマーを調製した。

天然のｔ−PAのアミノ酸配列および遺伝子配列は、最初
の２列に記載されている。プライマーは、指摘した残基
において、天然の遺伝子配列と異つている。対応するア
ミノ酸置換体は、このアミノ酸をコードしているトリプ
レツトの上方に示されている。

3.部位特異的突然変異誘発 以下に、合成プライマーの突然変異配列を含有する種の
ｔ−PAクローンの組立て方法を示す。ここでは、アデル
マン（Adelman）ら、〔「DNA」２、183（1983）〕の一
般的な方法を用いた。各クローンの全組立て模式図を第
３図に示した。M13RF1B8、M13RF2C9およびM13RF4A10
は、前記の、唯１個のアミノ酸に突然特異を有するプラ
イマーを用いて組立てられた。単一の標準M13RF4A10（2
77位に突然変異を有する）をプライマー3A7または4B3と
アニールさせることにより、M13RA3A7およびM13RF4B3
が、それぞれ得られた。これら突然変異ｔ−PA遺伝子の
精製M13RF DNAを、大腸菌JM101細胞を用いて得た。次い
で、突然変異ｔ−PADNA配列を含有するフラグメントを
用いて、突然変異ｔ−PAのための発現ベクターを組立て
た。

合成オリゴヌクレオチド50mgを、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ8Uを含有する、50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM
MgCl₂、10mMジチオトレイトール、および1mMATPの混液
10μｌ中、37℃で30分間、ホスホリル化（りん酸化）し
た。プローブとして用いるために、ATPの代りに60mCi
〔γ³²−Ｐ〕−ATP（300μCi/nmol）を用い、合成オリ
ゴヌクレオチド40ngを上記の如くにしてホスホリル化す
ることにより、約50〜60×10⁶cpm/（24量体400ng）を得
た。ヘテロ二本鎖を形成させるために、一本鎖M13mp8PA
Bgl II10ngを、りん酸化したプライマー10ngとEcoR I消
化M13mp8PABgl II RFの大きいフラグメント50ngとを含
む、10mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、1mMジチ
オトレイトールの混合物40μ中で、95℃において10分
間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却した（30分）。2m
M ATP、0.25mMづつのdGTP、dTTP、dCTPおよびdATP、大
腸菌DNAポリメラーゼＩラージフラグメント5U、およびT
4DNAリガーゼ400単位を含有するリガーゼバツフアー10
μを加えてプライマー延長を開始させた。12℃で１時
間経過した後、反応混合物を大腸菌JM101細胞にトラン
スフオーム（導入）した。

ライゲーシヨン混合物10μとコンピテントJM101細胞2
00μとを混合し、氷上で30分間、次いで37℃で５分間
インキユベートすることにより、形質転換を行つた。次
いで、2YTトツプ寒天（アガー）3.5mlと飽和JM101細胞3
00μ、IPTG10μ（200mM）およびXgal50μを55℃
において混合し、形質転換された細胞を加えた後、薬物
不含のLBを入れた9cmのペトリ皿上で平板培養した。

無着色のプラークを拾い上げ、2YT培地10.0μの入つ
たマイクロタイター（微量力価定）デイツシユに移し
た。接種されたマイクロタイター液を直径15cmのLB寒天
平板上にスタンプし（押し付け）、2YTトツプ寒天８μm
l中のJM101細胞菌600μを重層して37℃で一夜インキ
ュベートした。形成されたプラークを物理的な接触（１
分間）により、ニトロセルロース・デイスクに移した。
このニトロセルロース・デイスクを0.5MNaOHおよび1.5M
NaClで３分間処理した後、3MNaCl−0.5MトリスHCl（pH
7.5）で15分間処理して洗浄し（２回）、次いで、2XSSC
で15分間洗浄処理した。プレハイブリダイゼーシヨンミ
ツクスは、10mMトリス（pH7.5）、5mM EDTA、0.9M NaC
l、1Xデンハート（Denhardt）0.5％NP40、100μMATP、1
mMピロりん酸ナトリウム、1mMりん酸ナトリウムおよび5
0μg/ml大腸菌tRNAを含有している。1Xデンハートは、
１当り、フイコール（Ficoll）200mg、ポリビニルピ
ロリドン200mg、ウシ血清アルミン（BSA:フラクシヨン
Ｖ）200mgを含有している。真空中において、80℃で90
分間、デイスクを焼いた。次いで、デイスクを、ペトリ
皿中でプレハイブリダイゼーシヨン液6mlと一緒に３時
間インキユベートし、次いで、５×10⁶cpmの標識プライ
マーを加え、一夜ハイブリダイズさせた。49℃におい
て、0.4×SSCを用い、選択的な洗浄を行い、デイスクを
風乾した後、Ｘ線フイルムに露出させた。次いで、陽性
にハイブリダイズしたクローンを、ジデオキシ配列決定
により、分析した〔アルデマン（前掲）参照〕。

4.大腸菌pXAPPA183′△×10trpR内で突然変異ｔ−PAを
発現させるためのベクターの組立て 種々の突然変異ｔ−PADNA配列のための発現ベクターと
して用いるために、プラスミドpXAPPA183′△×10trpR
プラスミドを組立てた。このプラスミドの全組立て模式
図は添付の第４〜８図に示されている。得られたプラス
ミドは第８図に示されている。このプラスミドはtrpRリ
プレツサー遺伝子を含有しており、また、プラスミドの
増巾を阻害するpBR322DNAを欠失している。この欠失はX
AP欠失として知られており、サツトクリツフ（Sutclif
f）、コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム
・オン・クオンテイテイブ・バイオロジイ（Cold Sprin
g Harber Symposium on Quantitative.Biology）Vol.43
77（1979）、コールド・スプリング・ハーバー・プレ
ス、が開示した様に、pBR322のAva I制限部位からPvu I
I制限部位までの641塩基対のpBR322DNA配列が除去され
ることを意味する。trpRリプレツサーは、プラスミドの
コピー数増加に起因して、ｔ−PA発現が、未成熟なまま
で脱抑制されることを補償するよう、作用する。pXAPPA
18 3′△×10trpRの組立てにおける中間体プラスミドpP
A18の組立て模式図は第４図に示されている。このプラ
スミドは、全てのプレ−ｔ−PA構造遺伝子と、５′およ
び３′非翻訳領域とを含有している。このプラスミドは
また、特徴的に、ｔ−PA遺伝子に伴なうtrpプロモータ
ー、並びにアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の
付与に係る配列を含有している。

pPA18の組立てのために、４個のプラスミド、即ち、pFI
Ftrp69、pHKY10、ptPAtrp12およびpPA25E10を用いた。
プラスミドpFIFtrp69はゲツデル（Goeddel）ら、ヌクレ
イシツクアツズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）
８ 4057（1980）により開示された。プラスミドpHKY10
は、米国特許出願No.685,521（1984年12月24日出願）に
開示されており、これは、米国特許No.307,473（1981年
10月１日出願）およびNo.133,296（1980年３月24日出
願）（ヨーロツパ特許出願公開No.0036776）と一連の出
願である。プラスミドptPAtrp12およびpPA25E10はペニ
カ（Pennica）ら、ネイチヤー（Nature）301 214（198
3）およびEPO公開No.093,619（前掲）に開示されてい
る。

通常、プラスミドpFIFtrp69をPst I とXba Iで消化し、
第４図中、フラグメント１と表示されている950塩基対
のフラグメントを得る。プラスミドptPAtrp12を、Xba I
とNar Iで消化した。この消化により、第４図中、フラ
グメント４と表示されている340塩基対の配列を単離し
た。プラスミドpPA25E10をNar IとBgl IIで消化した。
この消化により、第４図中、フラグメント３と表示され
ている1604塩基対フラグメントを単離した。プラスミド
pHKY10をPst IとBgl IIで消化し、第４図中、フラグメ
ント２と表示されている2900塩基対フラグメントを生成
させた。これらの４フラグメントをライゲート（結合）
させ、得られたDNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し、p
PA18を得た。

プラスミドpPA18を単離し、Sau3A消化に付した後、DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ（klenow）フラグメントで処
理し、制限部位をうめた。この非環式プラスミドをSac
Iで処理し、第５図中、フラグメント５と表示されてい
る389塩基対配列を単離した。プラスミドpPA18を、Sac
IおよびBamH Iで消化した。この消化により、ベクター
フラグメント６が単離された。プラスミドpBR322〔ボイ
ヤー（Boyer）ら、「ジーン」２ 95（1977）〕をEcoR I
で消化し、次いで、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメントで処理した。この開放−末端DNA配列をBamH I
で消化し、第５図中、フラグメント７と表示されている
375塩基対配列を得た。フラグメント５、６および７を
結合させ、得られた生成物で大腸菌を形質転換し、プラ
スミドpPA18 3′△を得た。このプラスミドは、ｔ−PA
遺伝子の３′非翻訳領域の一部が除去されている外は、
pPA18と同等である。

このプラスミドpPA18 3′△をPst IとNar Iで消化し、
第６図中、フラグメント８と表示されている313塩基対
フラグメントを生成させた。このフラグメントはアミノ
酸８から109までをコードしている。合成オリゴヌクレ
オチドフラグメント９は、式： ５′CTAGAATTATGTCTTATCAAGTTATTTGCA TTAATACAGAATAGTTCAATAA ５′ で示される配列を有する。

この合成DNAをフラグメント８のP_st I部位に結合させ、
成熟ｔ−PA分子の第７番目のアルギニンコドンを再生す
ると共に、最初の６個のアミノ酸コドンを得た。加え
て、成熟ｔ−PAアミノ酸暗号配列の残基１の５′側に隣
接している合成Ｎ−末端メチオニンコドンの５′側にリ
ボソーム結合部位が位置している。このオリゴヌクレオ
チドの５′末端にはXba I制限部位が存在している。従
つて、フラグメント８を、合成オリゴヌクレオチドフラ
グメント９の存在下でライゲートさせ、この混合物をXb
a IおよびNar Iで消化することにより、フラグメント10
（第６図）が得られた。

プラスミドpPA18 3′△をNar IとSac Iで消化し、900塩
基対配列のフラグメント11（第７図）を生成させた。同
じプラスミドをSac IとXba Iで消化し、ベクターフラグ
メント12（第７図）を生成させた。フラグメント10、11
および12をライゲートして大腸菌の形質転換に用い、pP
A18 3′△×10を単離した。米国特許出願No.538,730（1
983年10月３日出願、Epo公開No.136907）に開示されて
いるpFMBtrpRから、XAP欠失とtrpRリプレツサー遺伝子
を含有しているDNA配列を単離した。簡単に述べると、
このプラスミドは、当業者既知の以下に示す３つのプラ
スミドから組立てられた。phGH107:EPO公開No.02242に
記載（1981年１月14日公開）されており、このプラセミ
ドは、誘導可能なlacプロモーターの供給源として使用
された。ptrpR3:ローダー（Roeader）ら、モレキユラー
・ジエネテイツクス（Molecular Genetics）176、361
（1979）に記載されており、このプラスミドは、trpリ
プレツサーの暗号配列の供給源として使用された。pFMB
1:EPO公開No.0068693（1983年１月５日公開）に記載さ
れており、このプラスミドは、A24株由来のFMD抗原の暗
号配列の供給源として用いられた。

trpリプレツサー配列を得るには、ptrpR3をHae IIIで処
理して６％アクリルアミドゲルにより、334塩基対のフ
ラグメントを単離し、単離したフラグメントを、式： ５′CCATAGAATTCTATGG で示される配列を有する16量体のEcoR Iリンカーとライ
ゲートさせた。

ベクターバツクボーンとlacプロモーターを得るため
に、phGH107をEcoR Iで消化した後、細菌性アルカリ性
ホスフアターゼで処理した。次いで、lacUV5を含有して
いる大きいベクターフラグメントをT4リガーゼを用いて
修復したtrpRプラスミドとライゲートさせ、このライゲ
ーシヨン・ミツクスを用いて大腸菌を形質転換した。プ
ラスミドDNAを形質転換体から単離し、所望のプラスミ
ド（ptrpR/hGH107と命名）の存在を確認した〔メツシン
グ（Messing）ら、ニユークレイツク・アシツズ・リサ
ーチ９、309（1981）〕。

ptrpR/hGH107をEcoR Iで部分消化し、クレノウで平滑末
端化した後、Pvu IIで処理してlacプロモーター/trpリ
プレツサーオペロン（530bpフラグメント）を得た。pFM
B1をPvu IIで部分消化し、６％ポリアクリルアミドゲル
を用いてベクターフラグメントを単離することにより、
trpプロモーターのコントロール下にある、FMB暗号配列
を含有している、発現ベクターのバツクボーンを得た。
ptrpR/hGH107フラグメントをpFMB1のPvu II消化物と混
合し、T4リガーゼでライゲートさせた。次いで、ライゲ
ーシヨン混合物を用いて大腸菌株294を形質転換し、得
られた形質転換体をプラスミドの供給源として使用し
た。得られたプラスミドpFMB/trpRをミニスクリーンに
より立証し、また、Ava I−Pvu II消化によつて挿入体
の方向性を証明した。プラスミドpFMB/trpRをNde IとBa
mH Iで消化した。trpRリプレツサーを含有しているフラ
グメントを単離した。プラスミドpPA18 3′△×10をNde
IおよびBamH Iで消化した。主要なベクターフラグメン
トを単離した。このベクターフラグメントとpFMB trpR
由来のtrpRリプレツサーフラグメントとをライゲートさ
せ、得られたDNA混合物を用いて大腸菌を形質転換し、
この形質転換体からプラスミドpXAPA183′△×10trpRを
単離した（第８図参照）。

5.t−PA突然変異体のための大腸菌発現ベクター 大腸菌内でｔ−PAおよびｔ−PA突然変異体を発現させる
のに用いられるベクター、pXAPPA183′△×10trpRを第
８図に示す。図から分る様に、天然のｔ−PA構造遺伝子
の発現はtrpプロモーターによつてコントロールされて
いる。Xba INar IおよびSac I制限部位に注意が寄せら
れた。プラスミドpXAPPA183′×10trpRをNar IとXba I
で消化した。340塩基対からなるフラグメント１（第８
図）を単離した。pXAPPA183′△×10trpRをXba IとSac
Iで消化して生成された大きいフラグメントを単離する
ことにより、ベクターフラグメントである、フラグメン
ト２（第８図）を得た。フラグメント３（900bp）は、
部位特異的突然変異の誘発（第３図）によつて得られた
各突然変異ｔ−PAクローン類のRFDNAをNar IおよびSac
Iで消化することにより、得られた。フラグメント１お
よびフラグメント２と、各フラグメント３とをライゲー
トすることにより、別々の突然変異ｔ−PA類を発現する
ベクター類を組立て、これらを用いて大腸菌を形質転換
し、各大腸菌突然変異ｔ−PA発現ベクターを単離した。
各ベクターを次に示す。

pXAPPA18 3′△×10trpR 1B8 pXAPPA18 3′△×10trpR 2C9 pXAPPA18 3′△×10trpR 4A10 pXAPPA18 3′△×10trpR 3A7 pXAPPA18 3′△×10trpR 4B3 これらのプラスミドを、野生型ｔ−PA発現ベクタ−pXAP
PA18 3′△×10trpRと同様に、大腸菌W3110fhuA−の形
質転換に用いた。

大腸菌W3110fhuA−は、フアージ耐性菌であつて、fhuA
遺伝子に伴なうDNA配列の欠失または逆転（位）を有す
ることを特徴としている。要するに、大腸菌W3110（ATC
C27325）を、テトラサイクリン耐性を付与し得る、転送
可能な（トランスポーザブル）因子、Tn10を含有してい
るラムダバクテリオフアージにより、形質導入する。Tn
10形質導入W3110を、フアージ感染に対する抵抗性に基
づいて選択する。フアージ耐性株をプールし、バクテリ
オフアージP1に感染させる。得られたリゼイトを用いて
大腸菌AT982〔ブクハリ（Bukhari）ら、ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロイジー105、844（1971）〕に形質導入
する。AT982株はfhuA遺伝子に接近した位置にDap突然変
更を有している。従つて、AT982株をP1リゼイトで形質
導入し、テトラサイクリン耐性であつて、DAP機能を再
生している形質導入体を選択することにより、トランス
ポゾンTn10がfhu A遺伝子内に位置していることが示さ
れる。テトラサイクリン耐性であつて、DAP機能を再生
している株は、大腸菌W3110にバクテリア・フアージP1
を形質導入するためのDNAの供給源である。テトラサイ
クリン耐性とフアージ耐性を示す形質導入されたW3110
株を選択する。次いで、これらの株を、フアージ感染に
対する抵抗性とテトラサイクリン感受性への逆転に基づ
いて選択する〔ナロイ（Naloy）ら、ジヤーナル・オブ
・バクテリオロジイ、145、1110（1981）〕。このテト
ラサイクリン感受性への逆転は、T1フアージ感染に対す
る抵抗性の保持と相まつて、fhuA遺伝子に伴なつている
DNA配列が欠失されたか、非可逆的に逆転されたことを
示唆している。この様にして組立てられた株が大腸菌W3
110fhuA~である。

転送可能な因子Tn10をW3110に挿入するのに用いた、Tn1
0含有フアージは以下の様にして組立てられた。出発物
質は、ラムダcI857b2210am29である。このフアージは当
業者にとつて既知であり〔クレツクナー（Kleckner）、
ジヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー116、1
25（1977）〕、ラムダの良く知られた３種の突然変異体
から標準的な方法で組立てられた。このラムダフアージ
のリゼイトを、当業者既知の方法で操作し、Tn10トラン
スポゾンを担持させておいたアンバー・サプレツサー
（抑圧）大腸菌C600（ATCCNo.23724）に関して調製した
〔クレツクナーら、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・
バイオロジー116、125（1977）〕。このリゼイトを用
い、アンバーサプレツサーとcI857遺伝型を持つたラム
ダプロフアージを含有する大腸菌C600（ラムタcI857）
に感染させた。テトラサイクリン耐性コロニーを、ブロ
ス中、32℃、次いで42℃で90分間、増殖させることによ
つて熱誘導し、テトラサイクリン耐性コロニーのリゼイ
トを調製した。このリゼイトを大腸菌C600上にプレート
し、レプリカ平板法に付した。大腸菌C600上に現われた
プラークを大腸菌C600と、異種免疫プロフアージ・ラム
ダimm434を含有している大腸菌W3102sup⁺（ラムダimm43
4）〔クレツクナーら、ジエネテイツクス90、427（197
8）〕との上でレプリカ平板法に付した。異種免疫株上
に現われたプラークをテトラサイクリン平板上にプレー
トした。これらの平板上に現われたプラークはテトラサ
イクリン耐性を形質導入することができ、これらを、上
記の大腸菌W3110fhuA−調製法に適用することができ
る。

天然のｔ−PAおよび突然変異tlPAは、適当なｔ−PAおよ
び突然変異ｔ−PAプラスミドによつて形質転換された細
胞の培養物（10）から得られた。トリプトフアン欠損
培地を用いて発現を誘導した。

6.哺乳類細胞内でのｔ−PA突然変異体の発現ベクター プラスミドpPADHFR−６〔pETPFRとも称される。EPO出願
公開No.93619（前掲）参照。〕を第９図に示す。天然の
ｔ−PA構造遺伝子の発現は、SV40T−抗原の初期プロモ
ーターのコントロール下にある。このプロモーターは、
DHFR遺伝子の発現をもコントロールする。Bal II、BstX
IおよびBstE II制限部位に注意が払われた。pPADHFR−
６をBgl IIとBstE IIで消化し、生成した大きいフラグ
メントを単離することにより、フラグメント１（第９
図）を得た。pPADHFR−６をBgl IIとBstX Iとで消化
し、400塩基対のｔ−PAフラグメントを単離することに
より、フラグメント２（第９図）を得た。各突然変異ｔ
−PAクローンから得たRFDNAをBstX IとBstE IIで消化す
ることにより、第９図のフラグメント３に相当する、所
望の突然変異を含む1,141塩基対のｔ−PAフラグメント
を得た。フラグメント１およびフラグメント２を、各フ
ラグメント３とライゲートさせた。このDNA混合物を用
いて、大腸菌を形質転換した。各形質転換体から以下の
真核性発現ベクターが得られた。

pPADHFR−6 1B8 pPADHFR−6 2C9 pPADHFR−6 4A10 pPADHFR−6 3A7 pPADHFR−6 4B3 これらのプラスミドを、非−突然変異ｔ−PA発現ベクタ
ーpPADHFR−６と同様に用い、DHFR欠損CHO細胞をトラン
スフエクトした〔グラハム（Graham）ら、ヴイロロジイ
（Virology）52、456（1973）、およびEPO公開No.09361
9参照〕。培養物を、濃度の高いメトトレキセートにさ
らすことにより、天然および突然変異ｔ−PAの発現を増
巾することができる。

例えば、グラハムらのりん酸カルシウム沈降法〔ヴイロ
ロジイ52、456（1973）〕を用い、プラスミドpPADHFR−
62C9およびpPADHFR−61B8により、DHFR欠損CHO細胞をト
ランスフエクトすることができる〔ウーラブおよびチヤ
ツシン（Urlab and Chasin）PNAS77、4219（1980）〕。

いずれの場合においても、選択培地（ヒポキサンチン、
グリシンおよびチミジンを欠く培地、即ち、−HGT培
地）中に生じたコロニーをプールし、さらに−HGH培地
で増殖させる。これらの細胞を、250nMメトトレキセー
ト中、100mmの平板当り２×10⁵細胞の割合でプレート
し、プラスミド配列の増幅に関して選択する。250nMメ
トトレキセート中で増殖した５個のクローンを平板から
抽出したところ、これら全てがｔ−PAを培地中に分泌し
ていることが分つた。これらのクローンを以後の研究に
充てた。

E.測定（アツセイ）法 1.突然変異ｔ−PAおよびｔ−PAの精製 上記の如く、哺乳類細胞中で発現された様々なｔ−PA類
が細胞培養の培地中に分泌された。この様なｔ−PA類を
含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用いるか、
あるいは、それらの測定法に適用する前に下記の精製工
程の１またはそれ以上に付し、ｔ−PAまたは突然変異ｔ
−PAの純度を高めた。

突然変異ｔ−PAを含むCHO細胞の培地を、リツケン（Rij
ken）ら〔ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Bio
chim.＆Biopys.Acta.）580、140（1979）〕の方法に従
い、塩化亜鉛で活性化したキレート化セフアロース（Se
pharose）（フアルマシア）により、バツチ抽出し〔樹
脂10〜20（ml）／培地（）〕、フイルター上に収集し
た。樹脂をカラムに注入し、0.02Mりん酸ナトリウム（p
H8.0）、0.25MNaCl、0.01％TWEEN80、およびアプロチニ
ン10mg/を含んだバツフアー中で洗浄した。50mMイミ
ダゾールを含有する同じバツフアーでｔ−PAを溶離し
た。ｔ−PAプールを、0.02Mりん酸ナトリウム（pH8）、
0.25MNaClおよび0.01％TWEEN80中で透析し、リジン・セ
フアロース樹脂〔ラドクリツフエ（Radcliffe）ら、ア
ーク・バイオケム・バイオフイス（Arch.Biochem,Binph
ys）189、185（1978）および、アレン（Allen）ら、ト
ロンボシス・ヘモスタシス（Thrombosis Heamostasis）
45、43（1981）〕に適用するか、または、ベンザミジン
・セフアロース樹脂〔ビコースカ（Bykowska）ら、ビオ
シミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ、703 113（198
2）〕に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合には、0.02M
りん酸ナトリウム（pH8）、1MNaC1および0.01％TWEEN80
で簡単に洗浄した後、0.5Mアルギニンを含む同一のバツ
フアーでｔ−PAまたは突然変異ｔ−PAを溶離した。ベン
ザミジンセフアロースは、透析バツフアーで洗浄した
後、1Mグアニジンを含む透析バツフアーで溶離した。得
られたタンパク質は、SDS−PAGEによる分析で、純度90
％以上であることが示された。上記の精製法の外、固定
化したモノクローナル抗体を用いる方法〔ニールセン
（Nielsen）ら、EMBO J.２、115（1983）参照〕をも使
用できる。

2.SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE） ｔ−PAタンパク質またはｔ−PA突然変異体タンパク質を
含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）試料バツフアーで希釈した。指示された如く、1
0mMジチオトレイトール（DTT）を加えてタンパク質ジス
ルフイドを減少させた。レムリ（Laemmli）の方法〔レ
ムリ、ネイチヤー227、680（1970）〕に従い、10％また
は７〜17％ポリアクリルアミド溶解ゲルを用い、不連続
なSDS電気泳動を行った。血漿試料の分析には、レムリ
のバツフアー系と一緒に、４％〜10％SDSポリアクリル
アミド・グラデイエント・溶解ゲルを用いた。分子量既
知のタンパク質の移動度との比較により、SDS−PAGE分
析に基づく分子量を概算した。

3.気泡放出血餅溶解 気泡放出血餅溶解法（バブル・リリーズ・クロツト・リ
シス・アツセイ）により、組換え（非−突然変異）ｔ−
PAおよび、本発明の突然変異ｔ−PA（突然変異ｔ−PA）
のフイブリン血餅溶解活性を調べた。

簡単に述べると、トロンビン（シグマ・ケミカルCo.）
を約1000単位/mlの割合で蒸溜水に溶かした。このスト
ツク溶液を、0.06M−塩基性りん酸ナトリウム、0.06M二
塩基性りん酸ナトリウム、200mg/ ナトリウム・アジ
ドおよび0.01％TWEEN80を含むアツセイ・バツフアーで
1:30に希釈した。トロンビン希釈液（30〜40単位/ml）
0.5mlと種々の濃度のｔ−PA（16ng/ml〜１×10⁶ng/ml）
の内、いずれか0.5mlとを入れた一連の試験管、並びに
適当な対照または、適当に希釈した未知試料を入れた試
験管を用意した。第２の試験管群として、プラスミノゲ
ン（1.0mg/ml）20μ、およびフイブリノゲン（1mg/m
l）1.0mlおよび40メツシユ以上の中空ガラス製微小球
（3Mカンパニー）10μを入れたものを用意した。

上記の試験管および諸薬を、この測定の最終段階に至る
まで、氷上に保持した。トロンビン−ｔ−PAまたはトロ
ンビン−突然変異ｔ−PA溶液のいずれか一方200μ
を、プラスミノゲン、フイブリノゲン、および微少球を
含む試験管に順次加え、15秒間旋回撹拌（ボルテツク
ス）した後、37℃の水浴中に入れた。各試験管内には、
30秒以内に血餅が形成された。ｔ−PA添加から反応終点
までの所要時間を測定した。終点を、測定中に、微小球
が表面へ上昇した時点と定めた。

特定の試料の血栓崩壊活性の値はｔ−PA標準曲線を参照
して決定された。比活性は、ラジオイムノアツセイによ
り測定したｔ−PAまたは突然変異ｔ−PAの量に基づいて
算出された。

4.インビトロにおける血餅溶解測定 インビトロの血餅溶解系を用い、組換えｔ−PAおよび突
然変異ｔ−PAの測定を行つた。

ヒト血液を、抗凝固剤として3.13％クエン酸ナトリウム
を用いて採取し、遠心して細胞分画を除いた。各血漿1m
lに、0.5MCaCl₂50μ、ウシートロンビン（100単位/m
l）25μおよびヒト¹²⁵I−フイブリノゲン（100,000cp
m/10μ）10μを加えた。この血漿ミツクスを内径4m
mのシリコン管に吸上げ、37℃で１時間インキユベート
した。管のセグメント（小片、1cm）を切り、血餅を除
いた。この血餅を、0.3MNaCl、0.02Mクエン酸ナトリウ
ム（pH5）および0.01％TWEEN80から成るバツフアーに入
れた。血餅を、１時間当り４回、調製したてのバツフア
ーで洗浄した。最後の洗液中の放射性活性は、血餅中の
放射性生活性の約10％を越すことはなかつた。各血餅を
血漿2.5ml中に入れた。血漿試料250μをとり、Ｏ点と
した。ｔ−PAまたは突然変異ｔ−PA試料を容量100μ
づつ加えた。1,2,3および４時間目に試料（250μ）を
採取し、その放射性活性を測定した。ｔ−PA活性を1ml
中に５、10、20および40単位含有する標準試料について
も同時に行つた。各試料採取後の用量変化を補正した
後、溶解％を算出した。

5.色素原法（クロモゲニツク・アツセイ）Ｓ−2288:t−
PAは、カビ（Kabi）合成トリペプチド色素原基質、S228
8〔ヘレナ・ラボラトリイズ（Helena Laboratories）、
ビユーモント、テキサス〕を用いて直接測定することが
できる。この測定は、ｔ−PAと1mMS−2288（終濃度）と
を0.012MNaclおよび0.01％TWEEN80と含む0.05Mトリス
（pH7.4）中で37℃において10分間インキユベートする
ことにより、行われた。反応混合物0.5mlに氷酢酸50μ
を加えて反応を止めた。活性は、405nmにおける吸収
に基づき、以下の、業者によつて標準化されている等式
を用いて算出された。

Ｓ−2251:t−PAによるプラスミノゲンの活性化を、プラ
スミンに特異的なKabi特異的トリペプチド色素原基質、
Ｓ−2251（ヘレナ・ラボラトリイズ）を用いて測定し
た。試料の一部をプラスミノゲン0.7mg/ml（0.012mNaCl
含有0.05Mトリス、pH7.4）0.10mlおよびヒトフイブリノ
ゲン20mg/ml（0.012MNaCl含有0.05MトリスHCl、pH7.4）
0.02mlと混合し、容量を0.15mlに調節した。この混合物
を37℃で10分間インキユベートし、S2251（上記バツフ
アー中1.0mM溶液）0.35mlを加え、更に37℃で５または1
0分間反応を続けた。氷酢酸50μを加えて反応を終了
させ、405nmにおける吸収を測定した。活性の定量化
は、結果を、Ｓ−2288アツセイによつて予め標定された
組換え天然ｔ−PA試料から得た結果と比較して行つた。
これは、当初、プラスミノゲンが古くなることによつて
405nmにおける吸収が日々に異なり、また、プラスミノ
ゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる方法が異なるこ
とによつても吸収が変化するので、必須であつた。この
可変性は、大量のヒトプラスミノゲン（glu−プラスミ
ノゲン）物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で調製す
ることにより、完全に減少された。各部分を−20℃で保
存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノゲン製品
を０℃に保存するが、この時間は４時間以上であつては
ならない。フイブリノゲンによるｔ−PA活性の刺激は、
フイブリノゲンを除いた同一の反応混合物中に高濃度の
フイブリノゲンを入れた混液の活性との比較に基づき、
測定された。フイブリンが不溶性であるために、このア
ツセイにはフイブリノゲンが用いられた。高濃度のフイ
ブリノゲンによる刺激は予測される不溶性フイブリンに
よる刺激と似ていると考えられる。

6.インビボ阻害物質−コンプレツクス法（アツセイ） 組換えｔ−PAおよび突然変異ｔ−PAの、天然に存在する
ｔ−PA活性に対する阻害物質との反応性をインビトロで
測定した。一般的な方法として、ｔ−PAおよび突然変異
ｔ−PAを、ヨードビーズ（Indobeads）〔ピアス・ケミ
カル（Pierce Chemical）co.〕を用いて¹²⁵Iでヨー素化
し、約２×10⁶cpm/μｇの放射性比活性を有するｔ−PA
および突然変異ｔ−PAを調製した。インビトロでコンプ
レツクスを形成させるには、放射性標識ｔ−PA（１μ
ｇ）を、採取したてのクエン酸処理−ヒト全血（500μ
）に加えた。試料を室温でインキユベートした後、一
部を２％SDS中に希釈することにより、反応を止めた。
試料を４〜10％ポリアクリルアミド・グラデイエントSD
S−PAGEにかけて分析した。オートラジオグラフイーに
より、コンプレツクスを検出した。

7.フイブリン結合法（フイブリン・バインデイング・ア
ツセイ） リツケンら（ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ257、2920（1982）〕の方法の改良法でフイブ
リン結合を行つた。被険ｔ−PA試料（500ng）を、0.05M
トリス（pH7.4）、0.12MNaCl、0.01％TWEEN80、1mg/ml
ヒト血清アルブミンおよび種々の濃度のプラスミノゲン
不含フイブリノゲン（0,0.1,0.5および1.0mg/ml）を含
む溶液に加えた。反応混合物の最終容量は1mlである。
試料を37℃で５分間インキユベートした後、トロビン１
単位を加えた。試料を37℃で１時間インキユベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清精中に残存している
非−結合ｔ−PAの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するｔ−PA結合％としてプロツトした（第
11図）。

8.インビボ血餅溶解 コレン（Collen）らのインビボ血餅溶解モデル〔ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーシヨン（J.
Clim.Invest.）71、368（1983）〕を用いた。雄性ニユ
ージーランド・シロウサギ（2.5〜3.0kg）をケタミン麻
酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その付近の連結小
血管を結紮した。可逆的結紮法で約2cmの頚静脈を単離
し、このセグメント（切片）の近位側から遠位側へ糸を
渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で洗浄した
後、¹²⁵Iヒトフイブリンノゲンを含有する、ウサギの鮮
血を満たした。30分後、血餅を横切つて血液は流れ続け
ていた。ｔ−PAの静脈内注入を、初期投与量として全用
量の10％を注入するとことで開始した。注入は４時間に
わたつて行われた。注入終了の30分後、血餅を収獲し、
数えた。放射性活性の回収を定性対照に用い、最初の血
餅中に存在していた放射性活性量の概算値の正確さを確
認するために、血液試料、尿、綿棒および注射器につい
ても計算した。

F.測定の結果 二本鎖活性化部位、残基270〜279に以下の配列を有する
ｔ−PA突然変異体が、大腸菌およびチヤイニーズ・ハム
スターの卵巣細胞（CHO細胞）内で発現された。

1.ウエスタン・ブロツツおよびチモグラフイー CHO細胞内で発現されたEIKGG突然変異体およびGIKGG突
然変異体を、還元または非還元SDS−PAGEゲルによつて
導かれるウエスタンブロツツ法で分析した。天然のｔ−
PAは、グリコシル化の程度の差により、分子量52,000お
よび50,000ダルトンの２本のバンドとして現われた。非
−還元SDS−PAGEにおけるEIKGG突然変異体は、分子量約
50,000ダルトンの位置に、１本の主要な免疫反応性バン
ドを示した。しかしながら、非−還元SDS−PAGEにおけ
るGIKGG突然変異体のウエスタンブロツトは分子量55,00
0ダルトンを示していた。GIKGG突然変異体の見掛け上の
分子量と、天然のｔ−PAの分子量との差異は、その炭水
化物構造の立体配座が天然のｔ−PAと異つていることを
示すものと思われる。arg275におけるタンパク質の開裂
は、以下の還元により（このことによつてプロテアーゼ
鎖とクリングル鎖とが分離する）低分子量のｔ−PAを分
析することにより、検出される。還元SDS−PAGEゲルの
チモグラフは、これらの試料中のプラスミノゲン活性化
因子の活性が、一本鎖形ｔ−PAの免疫反応性バンドの分
子量（約60,000）の位置にあることを示している。二本
鎖形ｔ−PAの電気泳動における移動度は、分子量約30,0
00ダルトンと一致している。この方法により、一本鎖形
の突然変異ｔ−PAタンパク質が、形質転換された細胞の
培地中に存在していることが証明された。

Ｓ−2251法（アツセイ） Ｓ−2251法による天然、並びに突然変異EIKGGt−PAの分
析結果を表Ｉに示す。これらの値は、測定の変動性を減
少するために、測定中にglu−プラスミノゲンを用いる
前に得たものである。天然に存在しているｔ−PA配列RI
KGGは、S2288法に基づき、フイブリノゲンの存在下、無
作為な（任意の）比活性を示すものと帰属された。この
ｔ−PA標準を、各EIKGG^t−PA突然変異体と一緒に測定
し、結果の規格化を図つた。

EIKGG ｔ−PA突然変異体は、精製の程度に関係なく、S
2251＋フイブリノゲン法において、組換えｔ−PAよりも
大きい比活性を有することが分る。

表I Aのデーターは、高質度の凍結乾燥glu−プラスミノ
ゲンを用いて得られた。より再現性の高い方法におい
て、フイブリノゲン存在下、Ｓ−2251法におけるEIKGG
突然変異体の活性は等しいことが分つた。フイブリノゲ
ン不存在下では、突然変異体の活性は依然として天然物
のそれよりも低く（表Ｉおよび表I A）、特異性の大き
いことが証明された。

2.気泡放出血餅溶解法およびインビトロでの血餅溶解法 組換えｔ−PAおよび精製EIKGG ｔ−PA突然変異体の比
活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法を用いた。
上記の方法で、これら各ｔ−PA類の活性を測定した。ｔ
−PAおよびEIKGG突然変異体ｔ−PAの濃度は、放射線免
疫検定法で求めた。測定結果および比活性を表IIに この気泡放出血餅溶解法の結果は、一本鎖ｔ−PA突然変
異体、特に、EIKGG突然変異ｔ−PAの比活性が、組換え
ｔ−PAよりも50％以上高いことを証明するものである。
凍結と解凍を繰返すことにより、EIKGGt−PA突然変異体
の比活性が僅かに減少されると思われる。しかしなが
ら、それでもなお、突然変異ｔ−PAの比活性は、組換え
ｔ−PAのそれよりも高く維持される。

3.インビボでの阻害物質−コンプレツクス法（アツセ
イ） 血漿プロテアーゼ阻害物質によるプロテアーゼ類の不活
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されている。生成されたコンプレツクス（複合体）
は変性に対して安定であるため、SDS−PAGE電気泳動法
によつて評価することができる。この方法では、放射性
標識ｔ−PAを血漿または全血に加え、37℃でインキユベ
ートする。試料を、SDS−PAGE、次いでオートラジオグ
ラフイーにかける。遊離のｔ−PAよりも大きい分子量
（Mr）位置における放射性標識を検出することにより、
形成されたｔ−PAプロテアーゼ阻害物質とのコンプレツ
クスの量が求められる。ラツトの血液中で分析したとこ
ろ、ｔ−PAは、Mr200,000以上のコンプレツクスをゆつ
くり、形成することが分つた。数時間のインキユベーシ
ヨンの後、これらのコンプレツクス中に、70％以上の放
射性標識が検出された。これに反して、突然変異ｔ−PA
はこの様なコンプレツクスを形成しなかつた。即ち、オ
ートラジオグラフイーで検出した放射性標識の大部分
は、遊離の、不活化されていない酵素の位置に止まつて
いた。ヒト血液中で同様な実験を行うと（第10図）、ｔ
−PAはここでも同様なコンプレツクスを形成すると共
に、Mrが100,000〜200,000のコンプレツクスをも形成し
た。ラツトの血液を用いた場合と同様に、突然変異体ｔ
−PAと阻害物質とは、Mr200,000以上のコンプレツクス
を殆んど形成しなかつた。しかし、Mr値100,000〜200,0
00の、プロテアーゼ阻害物質コンプレツクスは存在して
いた。これらの結果は、突然変異体が、分子200,000以
上のコンプレツクスを形成する様なプロテイナーゼ阻害
物質によつては不活化されないことを示すものである。
ｔ−PAおよび突然変異ｔ−PA両者の、分子量100,000〜2
00,000のコンプレツクス形成における反応性には種特異
性が認められた。

4.フイブリン結合 ｔ−PAの一本鎖形および二本鎖形が、略等しいフイブリ
ン親和性を有することは既に報告されている〔リツケン
ら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー25
7、2920（1982）〕。本明細書に記載した測定法による
と、二本鎖形ｔ−PAとの比較において、一本鎖形ｔ−PA
は、フイブリンに対し、著しく高い親和性を示した（第
11図）。

5.インビボにおける血餅溶解 第12図は、ｔ−PA（ｏ）およびEIK突然変異対（ｏ）の
相対的な用量−応答曲線を示すグラフである。これらの
データーは、各群５匹づつのウサギに関する平均値＋／
−SEMで示されている。50％溶解点の２本の曲線間の距
離を測定し、EIK形のｔ−PAの能力は、非突然変異形（R
IK）のｔ−PAの2.4倍以上であると見積られた。統計上
有意な差は、用量0.25mg/kgにおいて得られた）Ｐ＜0.0
1）。

G.結論 以上の結果に基づき、以下の２つの理由から、ｔ−PAの
275位における突然変異体は、天然形のｔ−PAよりも有
効と思われる。

１）特異性の増大:t−PA機能の測定結果は、より活性お
よびまたは特異的なタンパク質（活性／特異性タンパク
質）であることを示している。

２）インビボにおける血漿性阻害物との結合性の低下：
その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある種
のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレツクスを形成していない
形のｔ−PAが循還されることになり、従つて、血餅溶解
機能を増大されたｔ−PAが循還されるのである。

科学文献における一本鎖形ｔ−PAの酵素的特性に関する
報告は逆である。ｔ−PAの機能をより良く理解するに
は、それとホモローガスなタンパク質を考察すると良
い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリ
プシンに関して、広範な研究が行われている。ｔ−PAの
プロテアーゼ領域はこれらのタンパク質と非常によく似
ており、従つて、同様の方法で機能するものと思われ
る。トリプシンおよびキモトリプシンに関して決定され
た機能的な機構に基づき、ｔ−PAの275番目のアルギニ
ン位置における開裂を阻止すると、プロテアーゼ領域の
機能上の特徴のみが影響を受けると予想された。従つ
て、突然変異体のフイブリン親和性の増大は驚ろくべき
ことである。

関連する機構（類）（特異性の増大、プロテアーゼ阻害
物質との結合性の欠如、フイブリンとの親和性の増加、
あるいはこれらの組合わせ）を考慮しないにしても、イ
ンビボでの、ブロツクされた静脈に対する溶解能力に関
する試験において、突然変異体は、天然のｔ−PAの約2.
5倍もの高い活性を示した。既に述べた様に、一本鎖形
ｔ−PAは、血餅の部分で二本鎖形に変換されることが示
された。その様な変換によつて、一本鎖形が有する長所
は全て破壊されてしまうことになる。生理的プロテアー
ゼによつて２本鎖に変換され得る突然変異形のｔ−PAの
みが、血餅の部位で一度、その長所を保持し続けること
ができる。

本発明の好ましい態様を記載したが、当業者ならば、本
明細書中で開示した態様に種々の修飾を施すことがで
き、また、それらの修飾も本発明の範囲内にあることを
理解できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトｔ−PA並びにその５′および３′非翻訳領
域のDNAおよびプレｔ−PAをコードしている配列の制限
地図である。第2a、2b、2c、2d、2eおよび2f図は、プレ
−ｔ−PAおよびその５′−および３′−非翻訳領域のDN
A配列およびアミノ酸配列12H2k10Hである。第３図は275
位に突然変異を有するクローン類の組立て模式図であ
る。第４、５、６、７および８図はpXAPPA18 3′△×10
trpRの組立て模式図である。第９図はプラスミドpPADHF
R−６の制限部位を示す模式図である。第10図はSDS−PA
GEゲルを用い、オートラジオグラフイーで検出した放射
性標識ｔ−PA（左側）およびEIKGGt−PA（右側）と血漿
プロテアーゼ阻害物質とのコンプレツクスの形成を示す
映像の模写図である。第11図は一本鎖ｔ−PA、二本鎖ｔ
−PAおよび一本鎖突然変異ｔ−PAとフイブリンとの結合
活性を示すグラフである。第12図は、インビボでのEIK
およびrt−PAの血餅溶解作用の用量−応答曲線を示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】部位特異的突然変異により275位のアミノ
   酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、そし
   て／または277位のアミノ酸がリジン以外のアミノ酸で
   置換されている、組換え宿主細胞によって生産されたヒ
   ト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体。
2. 【請求項２】275位がグリシンまたはグルタミン酸で置
   換されている第１項に記載の突然変異体。
3. 【請求項３】277位がイソロイシンで置換されている第
   １項に記載の突然変異体。
4. 【請求項４】部位特異的突然変異により275位のアミノ
   酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、そし
   て／または277位のアミノ酸がリジン以外のアミノ酸で
   置換されている、組換え宿主細胞によって生産されたヒ
   ト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体を必須成分
   として含有する血栓溶解剤。