HU206520B

HU206520B - Process for producing new human tissue plasminogen activator /tpa/ mutants and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU206520B
Application number: HU861676A
Authority: HU
Inventors: Herbert Luis Heyneker; Gordon Allen Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1992-11-30
Also published as: CA1341580C; ES8802184A1; DK181286D0; DK181286A; NO175216C; GB8609683D0; GR861037B; ES554251A0; NO861559L; DD258026A5; GB2173804B; EP0199574A3; FR2581652A1; US5147643A; GB2173804A; HUT40703A; FI861673A; FI861673A0; DE3682104D1; JP2529816B2

Description

A találmány új humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) mutánsokra vonatkozik. Ezek a mutánsok, bár korábban általános formában már kinyilvánításra kerültek a 725 468 számú USA-beli szabadalmi bejelentésben, újak, olyan speciális származékok, amelyek olyan aktivitást mutatnak, amely nem vezethető le a korábbi, a humán szöveti plazminogén aktivátor alapmolekulával vagy modell szerint proteáz tripszinnel vagy kímotripszinnel végzett kutatások eredményeiből.

A humán szöveti plazminogén aktivátort először lényegében tiszta, természetes forrásból származó izolátumként azonosították, és vizsgálták plazminogén aktivitás szempontjából (Collen és munkatársai. 041766 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés.)

Később laboratóriumunkban rekombináns DNS technikával olyan humán szöveti plazminogén aktivátort állítottunk elő, amely lényegében mentes volt az őt rendszerint kisérő proteinektől. Erről a munkáról beszámoltunk a szakirodalomban, és a 093619 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben. A fenti szabadalmi bejelentés különböző humán plazminogén aktivátor származékok előállításával foglalkozik, amelyekben a módosítások aminosav szubsztitúciókkal, deléciókkal, addíciókkal vagy olyan helyettesítésekkel történtek, amelyek például a szóbanforgó DNS hely-irányított mutagenezisével jöttek létre.

A humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) egyes és kettős szálú formában egyaránt létezik. Az utóbbi az előbbinek proteolitikus származéka. Kimutattuk, hogy az egyes szálú fonnának kettős szálú formává történő proteolitikus konverziója egy fibrincsomó lizise során megy végbe [Rijken és munkatársai, I. Bioi. Chem. 257, 2920 (1982)]. Feltehetőleg a kettős láncú forma felelős a plazminogén aktivátor aktivitásért, bár korábban megjelent néhány olyan közlemény is, amelyek szerint a humán t-PA egyes szálú formája (Rijken Ibid.) és a sertés t-PA egyes szálú formája [Ranby és munkatársai, Thromb. Rés. 27, 176 (1982)] is rendelkezik bizonyos aktivitással. Ezzel kapcsolatban lásd még: Rijken és munkatársai Biochim. Biophy. Acta 580, 140(1979).

Későbbi vizsgálatok szerint azonban ezekben az esetekben az egyes szálú forma feltételezett aktivitása voltaképpen a jelenlevő, kis mennyiségű kettős láncú szennyezés következménye volt [Andreasen és munkatársai, FEBS Letters 175,412 (1984)]. Ezek a közlemények megerősítették azt az általános feltevést, hogy a szerin proteázok, beleértve a t-PA-t inaktív, egyes szálú zimogenekként fejeződnek ki, amelyek csupán a protein speciális helyein, például t-PA esetében a 275 helyzetű argininnál lejátszódó hidrolízise útján aktiválódnak.

Nyulakon és kutyákon elvégezték az egyes szálú és a kettős szálú plazminogén aktivátorok fibrincsomók lízisét eredményező aktivitásának összevetését. Nyulak esetében az enzim két formájára közel azonos potenciát figyeltek meg [Collen és munkatársai, J. Clin. Invest 71, 368 (1983)]. Kutyákon, hasonló modellen azonban az egyes szálú formát kissé kevésbé aktívnak találták, mint a kettős szálú formát (Kominger és munkatársai,

J. Clin. Invest. 69, 573 (1982)]. Ezek a vizsgálatok tehát azt mutatják, hogy az egyes szálú plazminogén aktivátor nem jobb, sőt esetleg kevésbé hatásos, mint a kettős szálú plazminogén aktivátor a fibrincsomók in vivő feloldásában.

A találmány a humán t-PA új mutánsaira vonatkozik, amelyek meglepő módon legalább olyan vagy jobb aktivitást mutatnak, mint az elsőként Colién és munkatársai által izolált (041766 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) humán t-PA valamint a fent említett szabadalmi bejelentésben (093 619 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) szereplő t-PA molekulák. Egy előnyös változat szerint a találmány szerinti specifikus mutánsok közé tartoznak azok, amelyek a humán t-PA aminosav szekvencia 275 és 276 pozícióit környező helyeken bizonyos aminosav szubsztitúciókkal rendelkeznek, közelebbről azok, amelyekben ezeken a helyeken arginin, illetve izoleucin van jelen. Bizonyos enzimatikusan aktív molekulák felismerik ez(eke)t a helye(ke)t (talán egy vagy több szomszédos aminosavval együtt) és funkcionálisan hidrolizálják az alap aminosavak utáni kötéseket, különösen az arginin/izoleucin és a lizin/glicin kötéseket, kettős láncú anyagot eredményezve. A két lánc diszulfid kötéseken keresztül, a cisztein maradékok útján kapcsolatban marad egymással. A találmány e változata szerint például az ezeken a helyeken arginíntől és lizintől eltérő aminosavakkal történő helyettesítés olyan mutánsokat szolgáltat, amelyekben a megfelelő hasítási helyek megváltoznak úgy, hogy a kettős láncú humán t-PA nem képződik in vitro vagy in vivő, vagy amelynek képződése csökkent sebességgel történik. így a találmány e változata szerint mutagenizált egyes láncú humán t-PA-hoz lehet jutni, a biológiai aktivitás tesztelése céljából. Azt találtuk, hogy az ilyen mutánsok immunisak vagy legalábbis rezisztensek a 275/276 helyen történő hidrolízissel szemben, és hogy a keletkezett egyes szálú humán t-PA mutánsok váratlan egyezést mutatnak a Collen és munkatársai szerinti és/vagy a fentiekben leírt rekombináns t-PA molekulák aktivitásával bizonyos biológiai tesztekben. Ezen felül bizonyos jelek arra mutatnak, hogy ezek a mutánsok kevésbé reaktívak a természetesen fellépő t-PA inhibitorokkal.

A rajzok ismertetése.

1. ábra: A humán t-PA DNS-ének restrikciós térképe, amely felöleli az 5’- és 3’-nem-transzlatált régiókat, valamint a pre-t-PA-t kódoló szekvenciákat egyaránt. A pontozott terület a t-PA struktúrgénje.

2. a, b, c, d, e és f ábrák: a 12H és klOHof pre-t-PA DNS és aminosav szekvenciákat mutatják, beleértve az 5’ - és 3’-nem transzlatált régiókat.

3. ábra: A 275 helyen szubsztitúciókat tartalmazó egyedi kiónok generálására alkalmazott általános séma.

4-8. ábrák: a pXAPPAl8 3’ XlOtrpR konstrukciója.

9. ábra: pPADHFr-6 a releváns restrikciós helyekkel.

10. ábra: a radioaktív-jelzett t-PA (baloldali ábra) és

HU 206 520 Β az EIKGG t-PA (jobboldali ábra) által képzett plazma proteáz inhibitor komplexek, SDS-PAGE gélen végzett autoradiográfiás úton detektálva.

11. ábra: Az egyes szálú t-PA, a kettős szálú t-PA és a mutáns egyes szálú t-PA (EIKGG) fibrin kötő tulajdonságait szemlélteti.

12. ábra: az in vivő rög lízis dózis-válasz görbéje (egyes szálú t-PA-ra mutált EK, rt-PA és nem-mutált t-PA).

A találmány ismertetése során a „humán szöveti plazminogén aktivátor, a „humán t-PA” vagy „t-PA” kifejezések humán extrinsic (szöveti típusú) plazminogén aktivátort jelölnek, amely például rekombináns szövet tenyésztési rendszerekben keletkezik, olyan bioaktív formákban, amelyek egy proteáz részt tartalmaznak, és egyebekben megfelelnek a humán szövet számára natív plazminogén aktivátomak. Megjegyezzük, hogy természetes, allelomorf változatok léteznek és előfordulnak, egyedtől függően, ami a szekvenciában aminosav differenciá(ka)t okozhat Ezen felül a glükozilezési mérték függ a gazda sejtbeli környezetétől.

A humán szöveti plazminogén aktivátor olyan polipeptid, amely két funkcionális régióval rendelkezik, amelyek egy a plazminogén plazminná aktiválására alkalmas proteáz tartományból és egy „kringle-tartalmú tartományból állnak, ahol az utóbbi feltehetőleg a fibrin-kőtésért felelős. Ezért a t-PA olyan polipeptideket jelöl, amelyek teljes szekvenciájuk részeként tartalmazzák ezeket a tartományokat.

A t-PA-ban egy „kettős lánc hasítási hely” legalább az arginin maradékot tartalmazza a 275 pozícióban. Azonban feltehetően a 275 pozícióval szomszédos vagy attól néhány maradékon belüli egyéb aminosavak is részei annak a tartománynak, amelyet a plazminogén aktivátort kettős láncú formába átalakító enzimek felismernek. így a 275-től eltérő pozíciókban lévő aminosavak helyettesítése ezen a tartományon belül olyan mutáns plazminogén aktivátorokat eredményezhet, amelyek ellenállnak a kettős láncú formába történő átalakításnak.

Egy meghatározott foganatosítási mód szerint az „egyes láncú plazminogén aktivátor mutáns” egy olyan plazminogén aktivátor, amely rezisztens a kettős láncú formába történő átalakítással szemben. Jellemzői, hogy egy vagy több aminosav szubsztitúciót tartalmaz a kettős láncú aktivátor helyen. A módosítás következtében ez az aktivációs hely enzimatikusan nem felismert, ezért az enzimek, amelyek szokásosan a plazminogén aktivátort kettős láncú formába alakítják, nem hidrolizálják.

A tripszin és kimotripszin analógiájára feltételezhető, hogy bármilyen szerin proteáz kettős láncú formájának kifejeződéséhez fontos a szabad a-aminocsoport jelenléte a t-PA 276. helyénél. Ennek értelmében az arg-275-nél hasítva a 276. α-aminocsoport szabaddá válik arra a célra, hogy kölcsönhatásba kerüljön a t-PA aktív szerin helyében levő polipeptid lánccal. A jelen találmány tehát magában foglal minden olyan mutációt, amely eredményesen befolyásolja egy ilyen a-aminocsoport kölcsönhatását proteáz-aktív hellyel anélkül, hogy a molekula egészének általános aktivitását csökkentené.

Számos módszer alkalmazható a kérdéses DNS mutációinak létrehozására. A megváltozott szekvenciát tartalmazó DNS-t önmagában ismert kémiai módszerekkel állíthatjuk elő [Itakura és Riggs: „Chemical DNA Synthesis and Recombinant DNA Studies”, Science 209, 1401-1405 (1980)]. Egy ilyen módszer, amelyet itt egy különösen előnyös kiviteli módként szemléltetünk, abban áll, hogy először a natív t-PA gén egy olyan fragmensét, amely a mutáltatni kívánt tartományt kódoló szekvenciákat tartalmaz, az M13mp8 fág replikatív formájává inszertáljuk, az M13mp8PA-t létrehozva. Ezután az M13mp8PA egyes szálú formájához egy olyan szintetikus oligonukleotidot anellálunk, amely komplementer az inszertált t-PA szekvenciához, de egy vagy több olyan nukleotid tripletet tartalmaz, amelyek a helyettesíteni kívánt aminosavat kódolják. Ezáltal egy kettős szálú tartományt hozunk létre. Ez a tartomány szolgál a maradék komplementer szál DNS polimeráz I szintézisének printerjéül. Replikálás és azonosítás után a mutáns t-PA szekvencia tovább módosítható vagy felhasználható egy a mutált t-PA polipeptid expressziójára szolgáló prokariota vagy eukariota vektor konstruálására.

A fentiekben ismertetett általános módszer alkalmazható a t-PA-nak a 275/276 és/vagy 277/278 kettős láncú hasítási helyektől eltérő pozíciókban történő mutálására is, olyan mutáns t-PA származékokat eredményezve, amelyek szintén a jelen találmány oltalmi körébe esnek. Ilyen egyéb pozíciók olyan polipeptid szekvenciák, amelyek enzimatikus hidrolízisre hajlamosak, így tripszin-szerű hasítási helyek, amelyek jellegzetes képviselője az izoleucin, szerin vagy alanin által követett arginin vagy lizin. Egy ilyen tripszin-szerű hasítási helyen egy vagy több aminosav szubsztitúciója olyan mutáns t-PA-kat eredményez, amelyek ellenállnak a tripszin-szerű proteázokkal végrehajtott hidrolízisnek. Ez az enzimatikus degradációval szembeni ellenállóképesség az expresszió és tisztítás során és az in vivő adagolás során is, gyógyszerként történő alkalmazás esetén, olyan t-PA-t eredményez, amely nem veszít biológiai aktivitásából a nem-mutált t-PAval összehasonlítva. Ilyen tripszin-szerű hasítási helyek a humán t-PA molekulán belül például az arginin-alanin (40-41 pozíciók), az arginin-szerin (27-28 pozíciók) és az arginin-szerin (462-463 pozíciók).

A) Általános ismertetés

Mutáns t-PA származékokat készítünk 1. amelyek első aminosavként metionint tartalmaznak (az ATG start szignál kodonnak a struktúr gén előtt történő inszerciója következtében) vagy 2. amelyekben a metionin intra- vagy extracellulárisan hasítva van, és amely szokásos első aminosavat tartalmazza, vagy 3. amelyekben akár a szignál polipeptidjével együtt, akár egy szokásos szignál polipeptidjétől eltérő konjugált proteinnel együtt a szignál polipeptid vagy a konjugátum specifikusan hasítható az intra- vagy extracelluláris környezetben, vagy 4. közvetlen expresszióval, érett

HU 206 520 Β formában, anélkül, hogy szükséges lenne bármely belső, felesleges polipeptid kihasítása. Minden esetben az így létrehozott humán mutáns t-PA-t, különböző formáiban, kinyerjük és tisztítjuk mindaddig, míg érbetegségek vagy kóros állapotok, így miokardiális infarktus, szívroham, keringési embóliák, mély vénás trombózis, perifériás artériás elzáródás és más, trombotikus kondíciók kezelésére alkalmassá válik.

A humán mutáns t-PA-t funkcionálisan úgy definiáljuk, hogy képes a fibrinhez való kötődésre, és a plazminogén plazminná történő átalakulásának közvetítésére, ahol az utóbbi szolubilizálja a fibrin csomókat.

Az „expressziós vektor” kifejezés olyan vektorokra vonatkozik, amelyek képesek az itt leírt DNS szekvenciák expressziójára, ahol ezek a szekvenciák operábilisen kapcsolódnak más, expressziójukat befolyásolni képes szekvenciákhoz, és amelyek replikálhatók a gazda szervezetekben, akár episzomaként, akár a kromoszómái is DNS integráns részeként.

A „rekombináns gazdasejtek” kifejezés olyan sejtekre vonatkozik, amelyeket rekombináns DNS technikákkal konstruált expressziós vektorokkal transzformáltunk.

B) Gazdasejt-kultúrák és vektorok

Az itt ismertetett vektorok és módszer prokariota és eukariota szervezetek közül választott gazdasejtek széles választékával kombinálva használhatók. Különösen alkalmas például az E. coli K12 294 törzs (ATCC 31 446). Más mikroorganizmus törzsek, például E. coli B. és E. coli X1776 (ATCC 31537) szintén felhasználhatók. Ezek természetesen inkább illusztrációként szolgáló példák, és nem jelentenek semmiféle korlátozást.

A prokariotákon kívül eukariota szervezetek, így élesztő kultúrák is alkalmazhatók. Többsejtű szervezetekből származó sejtek tenyészetei is felhasználásra kerültek már a legutóbbi időben. Elvben bármely ilyen sejttenyészet működőképes, de az érdeklődés különösen a gerincesek sejtjeinek alkalmazása iránt nagy, és az ilyen sejtek szövettenyésztéses módszerekkel történő tenyésztése reprodukálható eljárássá vált [lásd Tissue Culture, Academic Press, Kruse és Patterson (1973)]. Ilyen sejtvonalak például a VERŐ és a HeLa sejtek, a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtvonal, a W13, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak.

A továbbiakban megadott példák az E. coli felhasználást mutatják be a trp promoter rendszert alkalmazva, valamint a CHO sejtek felhasználását szemléltetik, olyan kifejező vektorokat alkalmazva, amelyek promoterként SV40 replikációs origót foglalnak magukban. Más prokariota vagy eukariota gazdasejt tenyészetek alkalmazása azonban átlagos tudású szakember számára nem okoz problémát.

C) Alkalmazod módszerek

1. Transzfekció

Ha gazdasejtként nagyméretű sejtfal nélküli sejteket használunk, a transzfekciót a kalcium-foszfát precipitációs módszerrel hajthatjuk végre a Graham és munkatársai [Virology, 52,546 (1978)] által ismertetett módszerrel. Azonban mag-injekció vagy protoplasztfúzió is alkalmazható.

Ha jelentős sejtfal konstrukciókat tartalmazó sejteket vagy prokariota sejteket alkalmazunk, az előnyös módszer a kalcium-kloridos eljárás [Cohen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69,2110 (1972)].

2. Vektor konstrukció

A kívánt kódoló és kontroll szekvenciát tartalmazó alkalmas vektorok konstrukciójára standard, önmagában ismert ligálási eljárások alkalmazhatók. Az izolált plazmidokat vagy DNS fragmentumokat hasítjuk, szabjuk és újra ligáljuk, a kívánt plazmidnak megfelelő formában.

Az alább következő példákban szereplő különféle, a szakmában szokásos rövid elnevezéssel említett reagensek és oldatok az alábbi összetételűek:

20xSSC: 3 mól/1 (175 g/1) NaCl oldat

0,3 mól/1 (88 g/1) Na3-citrátx2H2O 1 mól/l-es HCl-oldattal 7,0 pH-ra beállítva

2xSSC a 20xSSC törzsoldat 10-szeres hígítás

2xSDS minta pufferoldat:

1,52 g trisz-bázis 20 ml glicerin

2,0 g nátrium-dodecil-szulfát (SDS)

2,0 ml merkapto-etanol 1 mg brómfenolkék 40 ml vízzel készített oldata N HCl-oldattal 6,8 pH-ra beállítva.

Egyéb

SDS minta pufferoldatok a fenti törzsoldat megfelelő arányú hígításai borostyán (amber) szupresszor az „amber” mutáció egy kodon mutációja egy olyan UAG kodonná, amely polipeptidlánc érés előtti bevégződését okozza baktériumokban. A borostyán-szupresszor visszaszorítja ezt a nem kívánatos mutációt.

D) Példák

1. Az MI3mp8PABgIU konstrukciója t-PA mutagenczis céljára

A humán t-PA DNS-t pPADHFR-6 (más elnevezéssel pETPFR) és a pA25E10 plazmidokból állítottuk elő. E két t-PA plazmid előállítási módját a 093619 közzétett európai szabadalmi bejelentés leírása ismerteti.

A pA25E10 plazmid a t-PA gén utolsó 508 aminosavát és a 3’ lefordítatlan tartomány 772 bázispárját kódoló szekvenciákat tartalmazza. Ezt a plazmidot a SacI és BglII enzimekkel emésztettük és így egy 744 bázispárt tartalmazó fragmentumot képeztünk, amelyet azután a szokásos gélelektroforézises módszerekkel különítettünk el. A fragmentum a t-PA 411-527 aminosavak kodonjait és a 3’ lefordítatlan tartomány egy részét tartalmazza.

A pPADHFR-6 plazmid a t-PA teljes struktúrgénjét tartalmazza és magában foglalja a 3’ lefordítatlan tartomány egy részét is. Ezt a plazmidot SacI és BglII t

HU 206 520 B enzimmel kezeltük és így egy 1230 bázispárból álló fragmentumot kaptunk, amelyet azután elkülönítettünk. Ez a fragmentum a t-PA érett alakja első 410 aminosavának a kodonjait tartalmazza.

Ezeket a fragmentumokat azután a szokásos mód- 5 szerekkel kapcsoltuk össze egymással, majd BglII enzimmel kezeltük a terméket. Egy 1974 bázispárból álló fragmentumot különítettünk el, amely a teljes érett t-PA szekvencia és a 3’ lefordítatlan tartomány egy részének kodonjait tartalmazza. Egy kétszálas M13mp8-at 10 (Messing és munkatársai, Third Cleveland Symposium on Macrómolecules Recombinant DNA, Ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam 1981., 143 1) BamHI enzimmel hasítottuk, majd kapcsoltuk a BglH-vel hasított t-PA-hoz, és így M13mp8PA-BglH keletkezett. Az 15

M13mp8PABgiH egyszálas és kétszálas (RF) alakjait az e fággal fertőzött E. coli JM 101 sejtekből különíthetjük el. Az egyszálas alakot hely-specifikus mutageneziséhez használtuk fel.

2. Primerek szintézise a hely-specifikus mutagenezishez

A humán t-PA struktúrgént hely-specifikus mutagenezissel úgy módosítottuk, hogy különböző pozíciókban aminosav-szubsztitúciókat tartalmazó t-PA-kat fejezzen ki. Szintetikus oligonukleotidokat állítottunk elő, például a szilárd fázisú foszfo-triészter módszerrel [Crea és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, (1978)]. A következő szintetikus primereket állítottuk elő a használatuk hely-specifikus mutagenezishez:

Natív aminosav szekvencia Natív DNS szekvencia Primer 1B8 DNS szekvencia Primer 2C9 DNS szekvencia Primer 4A10 DNS szekvencia Primer 3A7 DNS szekvencia Primer 4B3 DNS szekvencia

275 279

Pro Gin Phe Arg He Lys Gly Gly

G CCT CAG TIT CGC ATC AAA GGA G Gly

G CCT CAG ITT CGT ATC AAA GGA G Glu

G CCT CAG TIT GAA ATC AAA GGA G Gly He

G TIT GGT ATC ATC GGA GGG CTC Gly He

G CCT CAG TIT GGT ATC ATC GGA G Glu He

G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G

Az első két sorban a natív t-PA aminosav és gén szekvenciáját tüntetjük fel. A következőkben olyan primereket mutatunk be, amelyek a natív gén szekvenciától eltérő tripleteket tartalmaznak. A megfelelő aminosav-szubsztitúciót az aminosavat kódoló triplet fölött tüntetjük fel.

3. Hely-specifikus mutagenezis

A következőkben ismertetendő eljárást alkalmaztuk különböző, a szintetikus primerek mutált szekvenciáját tartalmazó t-PA kiónok generálására. Az alkalmazott általános módszer Adelman és munkatársai eljárása [DNA, 2, 183 (1983)]. Akiónok generálására alkalmazott eljárás vázlatát a 3. ábrán mutatjuk be. Az M13RFlB8-at, az M13RF2C9-et és az M13RF4A10-et olyan primerek alkalmazásával generáltuk, amelyek a bemutatott egyes aminosavaknál mutációkat tartalmaztak. Az M13RF4A10 egyes standardot, amely a 277 pozícióban tartalmazott mutációt, a 3A7 vagy 4B3 primerrel anellálva kaptuk az M13RF3A7-et, illetve az M13RF4B3-at. Ezen mutáns t-PA gének mindegyikéből származó tisztított M13 RF DNS-t készítettünk E. coli JM 101 sejtekből. Ezután a mutáns t-PA DNS szekvenciát tartalmazó DNS fragmentumokat használtuk expressziós vektorok készítésére a mutáns t-PA expressziójához.

ng szintetikus oligonukleotidot 30 percig 37 °C hőmérsékleten foszforileztünk, 10 μΐ 50 mmólos TrisHC1 (pH - 75) puffer, 10 mmól/1 MgCl₂, 10 mmól/1 ditiotreitol és 1 mmól ATP 8 egység T4 polinukleotid 60 kinázt tartalmazó elegyében. Próbaként 400 ng szintetikus oligonukleotidot a fentiek szerint foszforileztünk, azzal a különbséggel, hogy az ATP-t 60 mCi (γ³²-?)35 ATP-vel (300 pCi/mmól) helyettesítettünk, ami körülbelül 50-60 xlO⁶ cpm/400 ng 24mer-t eredményezett. Heteroduplex kialakítására 10 ng egyes szálú M13mp8PABglH-et 95 ^eC-ra melegítettünk (10 perc) majd lassan (30 perc alatt) szobahőfokra hűtöttük, 40 40 μΐ 10 mmólos Tris-HCl (pH - 75) puffer, 10 mmól/1 MgCl₂, 1 mmól/1 ditiotreitol 10 ng foszforilezett prímért tartalmazó oldata és 50 ng EcoRI-emésztett M13mp8PABglHRF nagy fragmentum elegyében. A primer meghosszabbítását 10 μΐ 2 mmól/1 ATP-t, 45 0,25 mmól/1 dGTP-t, dTTP, dCTP és dATP-t, 5 E E.coli DNS polimeráz I nagy fragmentumot és 400 Ε T4 DNS ligázt tartalmazó ligáz puffer hozzáadásával indítottuk be. 1 órás, 12 °C-on végzett reakció után a reakcióelegyet E. coli JM101 (ATCC 33 876) sejtek transz50 formálására használtuk fel.

A transzformációt úgy végeztük, hogy 10 μΐ ligációs elegyet 200 μΐ JM101 sejttel elegyítettünk, majd az elegyet 30 percig jégen és 5 percig 37 °C-on inkubáltuk. Ezután 35 ml 2YT agart 55 ’C hőmérsékleten 55 elkevertünk 300 μΐ telített JM101 sejttel, 10 μΐ izopropil- Ι-ϋο-β-D-galaktoziddal (IPTG) (200 mmól) és 50 μΐ Xgal-lal, és a transzformált sejtek hozzáadása után LB-t antibiotikum nélkül tartalmazó 9 cm átmérőjű Petri-csészékre helyeztük.

Kiválasztottuk a színtelen plakkokat és átvittük egy

HU 206 520 Β

100 μΐ 2ΥΤ tápkőzeget tartalmazó mikrotiter csészébe. Az inokulált mikrotiter folyadékokat 15 cm átmérőjű LB agar lemezekre cseppentettük, 600 μΐ JM101 8 ml 2YT top agárral készült elegyével felülrétegeztük, és egy éjszakán át 37 ’C-on ínkubáltuk. A keletkezett plakkokat 1 percig tartó fizikai kontaktussal átvittük egy nitrocellulóz lemezre. A nitrocellulóz lemezt 04 mól/1 nátrium-hidroxiddal és 14 mól/1 nátrium-kloriddal kezeltük 3 percen át, és kétszer 3 mól/1 nátriumklorid és 04 mól/l Tris HC1 (pH - 7,5) elegyével mostuk 15 percen át. Ezután a mosást 2XSSC-vel folytattuk 15-15 percig. A prehibridizációs elegy 10 mmól/1 Tris puffért (pH - 74), 5 mmól/1 EDTA-t, 0,9 mól/1 nátrium-kloridot, 1 x Denhardt, 04% NP40-et, (Nonidet P 40 detergens, Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo, USA), 100 pmól ATP-t, 1 mmól nátrium-pirofoszfátot és 50 pg/ml E. coli tRNS-t tartalmaz. Az 1 x Denhardt oldat literenként 200 mg Ficollt, 200 mg poli(vinil-pirrolidon)-t, 200 mg szarvasmarha szérum albumint (BSA, V, frakció) tartalmaz. A lemezt 80 ’C-on, vákuumban 90 percen át ínkubáltuk. A lemezt ezután 3 órán át 6 ml prehibridizációs folyadékkal ínkubáltuk Petri-csészében, majd hozzáadtunk 5 xlO⁶ cpm jelzett prímért és egy éjszakán át hibridizáltuk. A lemez szelektív mosását 0,4X SSC-vel 49 ’C-on végeztük, és levegőn történő szárítás után a lemezt röntgen sugarakkal világítottuk meg. A pozitívan hibridizáló kiónokat tovább analizáltuk didezoxi szekvenálással (lásd Aldeman korábban idézett munkáját).

4. Vektorok konstruálása mutáns t-PA E. coli pXAEPA18 3' AxlOtrpR-ben történő expressziójához

A pXAPPAlS 3’4xl0trpR plazmidot különböző mutáns t-PA DNS szekvenciák expressziója során történő felhasználás céljából konstruáltuk. A plazmid kialakításának általános sémáját a 4-8. ábrákon mutatjuk be. A kapott plazmidot a 8. ábra szemlélteti. A plazmid tartalmazza a trpR represszor gént és a pBR 322 DNS olyan szekvenciáinak delécióját, amelyek gátolják a plazmid amplifikációt. Ez a deléció, amely XAP delécióként ismert a pBR322-ben az Aval és Pvull restrikciós helyek között 641 bázispár hosszúságú szakasz eltávolítását jelenti [lásd Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitaíive Biology, Vol. 43, ~l~l (1979) Cold Spring Harbor Press]. A trpO represszor gén kompenzálja a t-PA expressziónak a megnövekedett kópiaszám következtében fellépő idő előtti derepresszióját. A pXAPPA18 3’óxl0trpR kialakítása során intermedier plazmid a pPA 18, amelyet a 4. ábrán szemléltetett módon alakítottunk ki. Ez a plazmid tartalmazza a teljes pre-t-PA struktúr gént és az 5’ és 3’ nemtranszlált régiókat. A plazmid további jellemzője a t-PA génnel kapcsolatban lévő trp promoter és az ampicillin és tetraciklin rezisztenciáért felelős szekvenciák.

A pPA18 plazmid felépítéséhez négy plazmidot, nevezetesen a pFIFtrp69, a pHKYlO, a ptPAtrp!2 és a pPA25ElO plazmidokat használtuk. A pFIFtrp69 plazmidot Goeddel és munkatársai Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980) cikke ismerteti. A pHKYlO plazmid a 0036776 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben szerepel. A pTPAtrpl2 és pPA25E10 plazmidokkal Pennica és munkatársai foglalkoznak a Natúré 301,214 (1983) folyóiratban megjelent cikkükben és a 093 619 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben.

Általában a pFEFtrp69 plazmidot PstI és Xbal enzimekkel emésztve egy 1 fragmentumként jelölt, 950 bázispárhosszúságú fragmentumot hoztunk létre a 4. ábrán bemutatott módon. A ptPAtrp!2 plazmidot Xbal és Narl enzimekkel emésztettük. Ebből a 4. ábrán 4 fragmentumként jelölt, 340 bázispárhosszúságú szekvenciát izoláltuk. A pPA25E 10 plazmidot Narl és BglII enzimekkel emésztettük. Ebből a 4. ábrán 3 fragmentumként jelölt, 1604 bázispárhosszúságú fragmentumot izoláltuk. A pHKYlO plazmidot PstI és BglII enzimekkel emésztve egy, a 4. ábrán 2 fragmentumként jelölt, 2900 bázispárhosszúságú fragmentumot hoztunk létre. A négy fragmentumot ligáltuk, és ezt a DNS-t használtuk az E. coli sejtek pPA18-at eredményező transzformációjához.

A pPA18 plazmidot izoláltuk és Sau3A-val emésztettük, majd a DNS polimeráz I Klenow fragmentumával kezeltük a restrikciós hely feltöltése céljából. A nem-cirkularizált plazmidot Sacl-el kezeltük és egy az 5B. ábrán 5 fragmentumként feltüntetett, 389 bázispárhosszúságú szekvenciát izoláltunk. A pPA18 plazmidot SacI és BamHI enzimekkel is emésztettük. Ebből a vektorból a 6 fragmentumot izoláltuk. A pBR 322 plazmidot [Boyer és munkatársai, Gene 2, 95 (1977)] EcoRI enzimmel, majd a DNS polimeráz I Klenow fragmentumával kezeltük. Ezt a nyitott végű DNS szekvenciát BamHI enzimmel kezeltük, és így egy az 5. ábrán 7 fragmentumként jelölt, 375 bázispárhosszúságú szekvenciához jutottunk. Az 5, 6 és 7 fragmentumokat ligáltuk, és ezt a készítményt használtuk az E. coli sejtek transzformálásához a ρΡΑ183’Δ plazmid előállítása céljából. Ez a plazmid megfelel a pPA 18-nak, azzal az eltéréssel, hogy a t-PA gén 3' nem-transziáit régiójának egy része hiányzik.

A ρΡΑ183’Δ plazmid PstI és Narl enzimmel történő emésztésével a 6. ábrán 8 fragmentumként jelölt, 313 bázispárhosszúságú fragmentumhoz jutottunk, amely a 8—109 aminosavakat kódolja. A 9 szintetikus oligonukleotid fragmentum szekvenciája a következő:

5’ ctagaattatgtcttatcaagttatttgcattaat

ACAGAATAGTTCAATAA 5'

Ezt a szintetikus DNS-t a 8 fragmentum PstI helyéhez ligáltuk, hogy így regeneráljuk az arginin kodont a

7. pozícióban és az érett t-PA molekula első hat aminosav kodonját. Ezen felül egy riboszóma kötőhelyet helyeztünk el 5’ helyzetben a szintetikus N-terminális metionin kodonhoz képest, amely közvetlenül 5'-helyzetben van az érett t-PA aminosav kódoló szekvencia maradékához képest. Az oligonukleotid 5' vége egy Xbal restrikciós helyet tartalmaz. így a 8 fragmentumot a 9 szintetikus oligonukleotid fragmentum jelenlétében ligáltuk, és az elegyet Xbal és Narl jelenlétében kezelve előállítottuk a 10 fragmentumot (6. ábra).

A ρΡΑ183’Δ plazmidot Narl és SacI enzimekkel ?

HU emésztve a 7A. ábrán 11 fragmentumként jelölt, 900 bázispárhosszúságú szekvenciát hoztuk létre. Ezt a plazmidot SacI és Xbal enzimekkel is emésztettük, és így a 7A. ábrán 12 fragmentumként jelölt vektor fragmentumhoz jutottunk. A 10, 11 és 12 fragmentumokat ligáltuk, és a ligátummal E. coli-t transzformáltunk, majd izoláltuk a ρΡΑ183’ΔΧ1Ο plazmidot. Az XAP deléciót és trp represszor gént tartalmazó DNS szekvencia a pFMB/trpR-ből származik, melyet a 136907 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés ismertet. Röviden, ezt a plazmidot három, szakember számára ismert plazmidból konstruálták. A phGH107 plazmid (022 242 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) volt a forrása a lac indukálható promotemek, a ptrpR3-at [Roeder és munkatársai, Molecular Genetics 176, 361 (1979)] használták a trp represszor kódoló szekvenciájának forrásaként, és a 0068693 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben szereplő pFMBl-et használták az A24 törzsből származó FMD antigén kódoló szekvenciájaként.

A trp represszor szekvencia előállítása céljából a ptrpR3-at HaelII-vel kezeltük, és a 334 bázispárhoszszúságú fragmentumot 6%-os akril-amid gélről izoláltuk, és az izolált fragmentumot a következő szekvenciájú 16-mer EcoRI linketekkel ligáltuk:

’CCATAGAATTCTATGG.

A vektor gerincének és a lac promotemek előállítása céljából a phGH107-et először EcoRI-gyel emésztettük, majd bakteriális alkáli foszfatázzal kezeltük. A lacUV5 promotert tartalmazó nagy vektor fragmentumot ezután T4 ligázzal a megszabott trpR plazmiddal ligáltuk, és a ligációs elegyet E. coliba transzformáltuk. A transzformánsokból plazmid DNS-t izoláltunk, és meggyőződtünk a kívánt, ptrpR/hGH 107-ként jelölt plazmid jelenlétéről [Messing és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 9,309(1981)].

A ptrpR/hGH107-et EcoRI-el részlegesen emésztettük, Klenow fragmentummal tompa véget hoztunk létre, PvuII-vel kezeltük a lac promoter/trp represszor operon (az 530 bp fragmentum) előállítása céljából. A pFMBl részleges PvuH emésztése és a vektor fragmentum izolálása 6%-os poli(akril-amid)-on az expressziós vektornak az FMB kódoló szekvenciát a trp promoter kontrollja alatt tartalmazó vázához vezetett. A ptrpR/hGH 107 fragmentumot összekevertük a pFMBl PvuII emésztésével kapott eleggyel, és T4 ligázzal ligáltuk. A ligációs elegyet ezután E. coli 294 (ATCC 31446) törzs transzformálására használtuk, és a transzformánsokat a plazmid DNS forrásaként alkalmaztuk. A kapott pFMB/trpR plazmidot miniscreenen azonosítottuk, és - az inszertum orientálásra céljából Aval-Pvuü emésztéssel. A pFMB/trpR plazmidot Ndel és BamHI enzimekkel emésztettük. A trpR represszort - amely azonos a fentebb leírt módon a trpR3-ból előállított represszorral - tartalmazó fragmentumot izoláltuk. A pPA 183’ XlO plazmidot Ndel és BamHI enzimekkel emésztettük. A fő vektor fragmentumot izoláltuk. Ezt a vektor fragmentumot és a pFMB trpR

206520 B 2 represszor fragmentumát ligáltuk, és a DNS enzim elegyet E. coli transzformálására használtuk, majd a pXAPA183’ XlOtrpR plazmidot izoláltuk, amint a 8. ábra mutatja.

5. E. coli expressziós vektorok t-PA mutánsokhoz

A 8. ábra a pXAPPA183’ xlOtrpR vektort ábrázolja, amelyet t-PA és t-PA mutánsok expressziőjához használtunk E. coliban. Mint látható, a natív t-P\szerkezeti gén expresszióját a trp promoter kontrollálja. Felhívjuk a figyelmet az Xbal, NarI és SacI restrikciós helyekre. A pXAPPA183’ xlOtrpR plazmidot NarI és Xbal enzimekkel emésztettük. A 340 bázispárhosszúságú, a 8. ábrán 1. fragmentumként azonosított fragmentumot izoláltuk. A 8. ábrán 2 fragmentumként jelölt vektor fragmentumot úgy kaptuk, hogy a pXAPPA183’Axl0trpR Xbal-el és Sacl-el végzett emésztésével kapott nagy fragmentumot izoláltuk. A 3. fragmentumhoz úgy jutottunk, hogy a mutáns t-PA M13 kiónok mindegyikének RF DNS-ét NarI és SacI enzimekkel emésztettük. A mutáns kiónokat hely specifikus mutagenezissel állítottuk elő (3. ábra). Különböző mutáns t-PA-kat kifejező vektorokat úgy hoztunk létre, hogy az 1 és 2 fragmentumokat a megfelelő 3 fragmentumokkal ligáltuk, és ezeket használtuk az E. coli transz25 formálására, amelyből a következő E. coli mutáns t-PA expressziós vektorok izolálhatók voltak:

pXAPPA18 3’Axl0trpR 1B8 pXAPPA18 3’Axl0trpR 2C9 pXAPPA18 3’Axl0trpR 4A10 ^dU pXAPPA18 3’Axl0trpR 3A7 pXAPPA18 3’Axl0trpR 4B3

Ezeket a plazmidokat és a pXAPPA18 3’Axl0trpR vad típusú t-PA expressziós vektort használtuk az E.

coli W 311 Ofhu A transzformálására.

Az E. coli W3110 fhuA olyan TI fág rezisztens baktérium, amelyet a fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvenciákban levő deléció vagy inverzió jellemez (lásd a párhuzamosan benyújtott, 06/673955 számú

USA-beli szabadalmi bejelentést). Röviden, az E. coli W3110-et (ATCC 27 325) a TnlO transzponálható elemet tartalmazó lambda bakteriofág transzdukálja. A TnlO elem felelős a tetraciklin-rezisztenciáért. ATnlOzel transzdukált W/3110 törzseket a fág infekcióval szembeni ellenállóképesség alapján szelektáljuk. A fág-rezisztens törzseket összegyűjtjük és a P1 bakteriofággal infektáljuk. A kapott lizátumot használjuk az E. coli AT 982 [Bukhari és munkatársai. J. Bacteriology 105, 844 (1971)] transzdukálásához. Az AT 982 törzs egy a fhuA génhez közel elhelyezkedő Dap mutációt tartalmaz. Ennek megfelelően, az AT 982 transzdukációja a Pl lizátummal és a tetraciklin-rezisztens, és a diamino pimelát (DAP) funkciót regeneráló transzdukánsok szelekciója azt mutatja, hogy a TnlO transzpozon a fhuA génen belül helyezkedik el. A tetraciklin-rezisztens és regenerált DAP funciót mutató törzsek a fonásai az E. coli W3110 Pl baktérium fággal történő transzdukciója DNS-ének. A tetraciklin-rezrsz· tenciát és fág-rezisztenciát mutató transzdukált W3110 törzseket szelektáljuk Ezeket a törzseket azután a fág

HU 206 520 Β infekcióval szembeni rezisztencia és a tetraciklin-érzékennyé válás megfordítása alapján szelektáljuk (Naloy és munkatársai, J. Bacteriology 145, 1110 (1981)]. A tetraciklin-érzékenység megjelenése a TI fág infekcióval szembeni rezisztencia megtartásával társulva azt mutatja, hogy a fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvencia vagy hiányzik deléció következtében, vagy irreverzíbilis módon invertálódott. Az így kialakított törzseket E. coli W3110 fhuA-nak jelöljük.

A TnlO transzpozálható elemet tartalmazó fágot, amelyet a Tn 10-nek a W3110-be történő beéptítéséhez használtunk, a következőképpen konstruáltuk. A kiindulási anyag a lambda cl 1857b 2210 am29 volt. Ez a fág az irodalomból ismert [Kleckner, J. Mól. Bioi. 116, 125 (1977)], és a lambda három jól ismert mutánsából szokásos eljárásokkal készült. E lambda fág lizátumát az E. coli C600 (ATCC 23 724) borostyán szupresszoron készítettük, amelyet a szakember számára ismert technikával manipuláltunk, hogy a TnlO transzpozont is hordozza [Lásd Kleckner és munkatársai, J. Mól, Bioi. 116, 125 (1977)]. Ezt a lizátumot használtuk az E. coli C600 (lambda CI857) infektálására, amely egy borostyán szupresszort és a cI857 genotípust hordozó lambda profágot tartalmaz. Tetraciklin-rezisztens kolóniák lizátumait hoztuk létre hő indukcióval, a tetraciklin-rezisztens kolóniákat folyékony tápkőzegben először 32 °C hőmérsékleten, majd 42 °C hőmérsékleten 90 percen át növesztve. A lizátumot ezután E. coli C600-ra vittük fel és replikát készítettünk. Az E. coli C600-on készített plakkokról 32 °C hőmérsékleten E. coli C60Q-on és E. coli W3102 sup⁺-on (lambda imm434) replikát készítettünk, ahol az utóbbi a lambda imm434 heteroimmun makrofágot tartalmazta (Kleckner és munkatársai, Genetics, 90, 427 (1978)]. A heteroimmun törzsön megjelenő plakkokat tetraciklin lemezekre helyeztük. Az ezeken a lemezeken megjelenő plakkok képesek a tetraciklin-rezisztencia transzdukálására, és a fent ismertetett eljárás során felhasználhatók az E. coli W3110 fhuA generálására.

A natív t-PA-t és mutáns t-PA-t 10 sejttenyészetből kaptuk, amelyet a megfelelő t-PA vagy mutáns t-PA plazmiddal transzformáltunk. Az expressziót triptofánhiányos táptalajjal indukáltuk.

6. Expressziós vektorok t-PA mutánsokhoz emlős sejtekben

A pPADHFR-6 plazmidot (a 93619 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés szerint pETPFR-nek is nevezik) a 9. ábrán mutatjuk be. A natív t-PA struktúr gén expresszióját az SV40 T-antigén korai promotere kontrollálja. Ez a promoter kontrollálja a DHFR gén expresszióját is. Érdemes figyelemmel lenni a Bglll, BstXI és a BstEII restrikciós helyekre. A

9. ábrán 1 fragmentumként jelölt vektor fragmentumot úgy kaptuk, hogy a pPADHFR-6 BglH-vel és BstEIIvel végzett emésztésével kapott nagy fragmentumot izoláltuk. A 9. ábrán 2 fragmentumként jelölt fragmentumot úgy állítottuk elő, hogy egy a pPADHFR-6 BglII-el és BstXI-el végzett emésztésével kapott 400 bázispárhosszúságú t-PA fragmentumot izoláltunk.

Egy 1141 bázispárhosszúságú, a kívánt mutációkat tartalmazó t-PA fragmentumot, melyet a 9. ábrán 3 fragmentumként jelölünk, úgy állítottuk elő, hogy a mutáns t-PA kiónok mindegyikének RF DNS-ét BstXIel és BstEH-vel emésztettük. Az 1 és 2 fragmentumokat ligátok az egyes 3 fragmentumokkal. A DNS elegyeket használtuk az E. coli transzformálására. Mindegyik transzformánsból a megfelelő eukariota expressziós vektorokhoz jutottunk:

pPADHFR-6 1B8 pPADHFR-6 2C9 pPADHFR-6 4A10 pPADHFR-6 3A7 pPADHFR-6 4B3

Ezeket a plazmidokat valamint a nem-mutált pPADHFR-6 t-PA expressziós vektort használtuk a DHFR-hiányos CHO sejtek expressziójához, a Graham és munkatársai, Virology 52, 456 (1973) cikkben, illetve a 093619 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben foglaltak szerint. A natív és mutáns t-PA expressziót úgy erősítettük, hogy a tenyészeteket metotrexát növekvő koncentrációival kezeltük.

Például a pPADHFR-6 2C9 és a pPADHFR-6 1B8 plazmidokat a DHFR-hiányos CHO sejtek transzfektálására [Erlaub és Chasin, PNAS 77,4216 (1980)] használtuk, Graham és munkatársai, Virology 52, 456 (1973) kalcium-foszfát precipitációs módszerét használva.

Mindegyik esetben a szelektív (a hipoxantínt, glicint és tímidint nem tartalmazó, azaz -HGT) közegben megjelenő kolóniákat összegyűjtöttük és -HGT közegben tovább növesztettük. Ezeket a sejteket 2X10⁵sejt/100 mm lemezeken 250 mmól metotrexátban (MTX) kezeltük, a plazmid szekvenciák amplifikációjának szelektálása céljából. Öt, a 250 mmólos MTXben növekvő kolóniát extraháltunk a lemezről. Azt találtuk, hogy mind az öt t-PA-t szekretált a táptalajba. Ezeket a kolóniákat használtuk a további vizsgálatokhoz.

E) Vizsgálati módszerek

1. Mutáns t-PA és t-PA tisztítás

A különböző, emlősök sejtjeiben a fenti módon növesztett t-PA-k a szövettenyészet közegébe ürültek. Az ilyen t-PA-kat tartalmazó közeget használtuk közvetlenül a különböző, a következőkben leírandó vizsgálatokhoz vagy vetettük alá a későbbiekben ismertetendő egy vagy több tisztítási lépésnek, a t-PA vagy mutáns t-PA tisztaságának növelése céljából.

A mutáns t-PA-t tartalmazó CHO sejtek mellől a táptalajokat kelatáló Sepharose-zal (Pharmacia) (1020 ml gyanta/1 táptalaj) szakaszosan extrahátok. A gyanta cink-klorid aktiválást kapott [Rijken és munkatársai, Biochim. és Biophys. Acta 580, 140 (1979)]. A gyantát szűrön gyűjtöttük össze. A gyantát egy oszlopba öntöttük, 0,02 mól nátrium-foszfátot (pH 8,0), 0,25 mól nátrium-kloridot, 0,01% Tween 80-at és 10 mg/liter aprotinint tartalmazó pufferrel mostuk. A t-PA-t ugyanezzel, de 50 mmól imidazolt is tartalmazó puffferrel eluáltuk. Az összegyűjtött t-PA-t 0,02 mólos

HU 206520 Β nátrium-foszfát (pH - 8), 0,25 mól NaCl és 0,01% Tween 80 elegyébe dializáltuk, és egy lizin Sepharose gyantára vittük fel. [Radcliffe és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 189, 185 (1978) és Allén és munkatársai, Thrombosis Heamostasis 45, 43 (1981)] vagy benzamidin Sepharose gyantára [Bykowska és munkatársai, Biochim. és Biophys. Acta, 703,113 (1982)]. A cink-kelát gyantát röviden 0,02 mólos nátrium-foszfát (pH - 8), 1 mól NaCl és 0,01% Tween 80 elegyével mostuk, és a t-PA-t vagy mutáns t-PA-t ugyanezzel, de 04 mól arginint is tartalmazó pufferrel eluáltuk. A benzamidin Sepharose-t a dialízis pufferrel mostuk és 1 mól guanidint tartalmazó dialízis puffeael eluáltuk. A keletkezett proteinek 90%-nál tisztábbak voltak SDS-PAGE analízis alapján. Az eddigi tisztítási technikákon felül immobilizált monoklonális ellenanyagok is használhatók [lásd Nielsen és munkatársai, EMBO J. 2, 115(1983)].

2. SDS poli(akril-amld) gél elektroforézis (SDSPAGE) t-PA proteint vagy a t-PA mutáns proteineket tartalmazó táptalajok mintáit vákuumban koncentráltuk, és nátrium-dodecil-szulfát (SDS) minta pufferrel hígítottuk. Ahol megjegyezzük, 10 mmól ditiotreitolt (DTT) adtunk a protein diszulfidok redukálása céljából. A szakaszos SDS elektroforézist 10%-os vagy 7-17%-os poli(akril-amid) gélek felhasználásával Laemmli módszerével hajtottuk végre [Laemmli, Natúré 227, 680 (1970)]. A plazma minták analíziséhez 4-10%-os SDS poli(akril-amid) gradiens rezolváló géleket használtunk, Laemmli puffer rendszerével. Az SDS-PAGE analízisből a becsült molekulatömegeket (Mr) úgy kaptuk, hogy ismert molekulatömegú proteinek mozgékonyságával végeztünk összehasonlítást.

3. Buborék felszabadító rög lízis

A rekombináns (nem-mutáns) t-PA-t és mutáns tPA-t (mutáns t-PA) megvizsgáltuk olyan szempontból, mennyire képesek a fibrin rögök lízisére. A vizsgálatot a buborék felszabadító lízis módszerrel végeztük.

Röviden, a trombint (Sigma Chemical Co.) feloldottuk desztillált vízben, körülbelül lOOOegység/ml mennyiségben. Ezt a törzsoldatot 1:30 arányban hígítottuk 0,06 mól monobázisos nátrium-foszfátot, 0,06 mól dibázisos nátrium-foszfátot, 200 mg/liter nátrium-azidot és 0,01% Tween 80-at tartalmazó vizsgálati pufferrel. A 04 ml hígított trombint (30-40 egység/ml) és 04-04 ml különböző koncentrációjú t-PA-t (16 ng/ml - 1 xlO⁶ ng/ml) kémcsövekbe töltve sorozatot készítettünk, és alkalmas kontrollokat vagy megfelelő hígítású ismeretlen mintákat készítettünk el. Ezen kívül előállítottunk egy másik kémcső sorozatot, amely 20 μΐ plazminogént (1,0 mg/ml) és 1,0 ml fibrinogént (1 mg/ml) és 10 μΐ 45 mesh-nél nagyobb lyukszámú lyukas üveg mikrogömböket (3M Company) tartalmazott.

A fenti reagenseket és kémcsöveket jégen tartottuk a vizsgálat végső lépéséig. 200 μΐ trombin-t-PA-t vagy trombin-mutáns t-PA oldatokat adtunk egymás után a plazminogént, fibrinogént és mikrogömbőket tartalmazó kémcsövekhez, az egészet 15 másodpercig megforgattuk és 37 ’C-os vízfürdőre helyeztük. Mindegyik csőben 30 másodpercen belül rögök képződtek. Mértük a t-PA hozzáadása és a reakció végpontja között eltelt időt Végpontként azt az időt definiáltuk, amikor a mikrogömbök a felszínre emelkedtek.

Egy adott minta trombolitikus aktivitásának mértékét egy standard t-PA görbére hivatkozva határoztuk meg. A fajlagos aktivitást a t-PA vagy mutáns t-PA radioimmun vizsgálattal meghatározott mennyisége alapján számítottuk.

4. In vitro rög lízis vizsgálat

A rekombináns t-PA-t és mutáns t-PA-kat in vitro rög lízis rendszerben is vizsgáltuk.

Röviden, humán vért gyűjtöttünk, 3,13% nátriumcitrát antikoagulánst használva, és a sejt frakciót centrifugálással eltávolítottuk. 50 μΐ 04 mólos CaCl₂-ot, 25 μΐ szarvasmarha-trombint (100 egység/ml) és 10 μΐ humán ^12ÍI fibrinogént (100000 cpm/10 μΐ) adtunk a plazma minden ml-éhez. A plazma elegyet 4 mm belső átmérőjű szilikon csőbe vezettük, majd 37 ’C hőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. A csövet 1 cm-es szegmensekre vágtuk, és a rögöket eltávolítottuk. A rögöket 0,3 mól nátriumkloridböl, 0,02 mól nátrium-citrátból (pH 5) és 0,01% Tween 80-ból álló pufferbe helyeztük. A rögöket négyszer, egy-egy órán keresztül friss pufferrel öblítettük. Az utolsó öblítő folyadékban a radioaktivitás nem haladta meg a rögben lévő radioaktivitás körülbelül-10%-át. Minden rögöt 2,5 ml plazmába helyeztünk. Nulla pontként egy 250 μΐ-es plazma mintát választottunk. A t-PA vagy mutáns t-PA mintáját 100 μΐ-es térfogatba adtuk. 250 μΐ-es mintákat vettünk 1,

2,3 és 4 óránként, és a radiokativitást meghatároztuk. Párhuzamosan ml-enként 5, 10, 20 és 40 egység t-PA aktivitást tartalmazó standardokat futtattunk. A százalékos lízist minden egyes minta esetében a térfogat változások korrekciója után számoltuk.

5. Kromogén vizsgálatok

S-2288: A t-PA-t közvetlenül is mérhetjük, a Kabiféle szintetikus tripeptid kromogén szubsztrát felhasználásával (S-2288, Helena Laboratories, Beaumont, Texas). Ehhez a vizsgálathoz t-PA-t és 1 mmól S-2288at és 0,01% Tween 80-at 37 °C-on 10 percen át inkubáltunk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy 50 μΐ jégecetet adtunk 04 ml reakcióelegyhez. Az aktivitást a 405 nm-en mért abszorbanciából határoztuk meg, a gyártó által standardizált következő egyenlet felhasználásával:

aktivitás 0,5 ml reakcióelegyben (EE, nemzetközi egység)

ODx793,05^=j?p inkubálási idő

HU 206 520 Β

S-2251: A t-PA-val történő plazminogén aktiválást az S-2251-re specifikus Kabi-féle specifikus tripeptid kromogén szubsztrát (Helena Laboratories) felhasználásával mértük. A minta alikvot mennyiségét 0,1 ml 0,7 mg/ml-es plazminogénnel (0,05 mól Tris, pH - 7,4, amely 0,012 mól NaCl-ot tartalmaz) kevertük el, és a térfogatot 0,15 ml-re állítottuk be. Az elegyet 37 °C-on inkubáltuk 10 percen át, 0,35 ml S 2251-et (1,0 mmólos oldat a fenti pufferben) adtunk hozzá, és a reakciót 37 °C hőmérsékleten 5 vagy 10 percig folytattuk. Hozzáadtunk 50 pl jégecetet a reakció leállítására, és mértük a 405 nm-en mutatkozó abszorpciót.

Az aktivitás mértékét úgy tettük kvantitatívvá, hogy összehasonlítóként egy, az S-2288 vizsgálat szerint standardizált rekombináns natív t-PA-t használtunk, és az eredményeket az azzal kapott eredményekkel vetettük össze. Erre kezdetben azért volt szükség, mert a 405 nm-en mért abszorpció napról napra változott, ahogy a plazminogén öregedett, és változott akkor is, ha különböző plazminogén és fibrinogén készítményeket használtunk. Ezt a változékonyságot később a lehető legnagyobb mértékben lecsökkentettük úgy, hogy óvatosan nagy mennyiségű humán plazminogént (gluplazminogén) készítettünk, és az anyag alikvot menynyiségeit liofilizáltuk. Az alikvot mintákat -20 °C hőmérsékleten tároltuk. Használat előtt az újra oldott plazminogén preparátumokat legfeljebb 4 órán át 0 °C hőmérsékleten tároltok. A t-PA aktivitás stimulálását fibrinogénnel úgy mértük, hogy a nagy koncentrációjú plazminogént tartalmazó oldatok aktivitását hasonló, de plazminogént nem tartalmazó elegyek aktivitásával hasonlítottuk össze. A fibrin oldhatatlansága következtében ebben a vizsgálatban fibrinogént használtunk. A nagy fibrinogén koncentrációkkal végzett stimulálás várhatóan hűen utánozza az oldhatatlan fibrintől várt stimulációt.

6. In vivő inhibitor-komplex vizsgálat

Arekombináns és mutáns t-PA-t in vitro vizsgáltuk annak érdekében, hogy meghatározzuk a természetben előforduló t-PA inhibitorokkal szembeni reaktivitásukat. Általában a t-PA-t és mutáns t-PA-t jódoztuk ^l2íI izotóppal, Iodobeads (Pierce Chemical C.o.) felhasználásával. így nagy (megközelítőleg 2xlCÉ cpm/pg) fajlagos radioaktivitású t-PA-t vagy mutáns t-PA-t kaptunk. In vitro komplex képzéshez a radioaktív jelzett t-PA-t (1 pg) frissen vett, citrátozott humán teljes vérhez adtok (500 pl). A mintákat szobahőmérsékleten inkubáltuk, és a reakciót úgy állítottuk le, hogy egy alikvot mintát 2%-os SDS-sel hígítottunk. A mintákat 4-10%-os poli(akril-amin) gradiens SDS-PAGE-vel vizsgáltok. A komplexeket autoradiográfiás úton detektáltok.

7. Fibrin megkötési vizsgálat

A fibrin megkötésére használt vizsgálat a Rijken és munkatársai [J. Bioi. Chem. 257,2920 (1982)] módosított változata. A vizsgálni kívánt t-PA mintát (500 ng) 0,05 mól Tris-t (pH - 7,4), 0,12 mól NaCl-ot, 0,01% Tween 80-at, 1 mg/ml humán szérium albumint és különböző koncentrációjú plazminogén-mentes fibrinogént (0, 0,1, 0,5 és 1,0 mg/ml) tartalmazó oldathoz adjuk. A reakcióelegy végtérfogata 1 ml. A mintát 37 °C hőmérsékleten öt percig inkubáljuk, majd 1 egység trombint adunk hozzá. A mintákat egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A rögöt üvegbottal eltávolítjuk, és meghatározzuk a felülúszóban kötetlenül megmaradt t-PA mennyiségét. Az adatokat úgy ábrázoljuk, hogy a kötött t-PA százalékos mennyiségét tüntetjük fel a fibrinogén koncentráció függvényében (11. ábra).

8. In vivő rög analízis

Collen és munkatársai [J. Clin. Invest 71, 368 (1983)] in vivő rög lízis modelljét használtuk. 2,5-3 kg súlyú hím, új-zélandi fehér nyulakat ketaminnal altattunk, a nyaki eret katétereztűk, és kis, kapcsolódó edényeket kapcsoltunk ehhez a területhez. A nyaki ér kb. 2 cm-es szakaszát reverzibilis kötésekkel izoláltuk, a szegmens proximális végétől a disztális végig egy szálat vezettünk, a szegmenst átöblítettük egy konyhasós trombin oldattal, és feltöltöttük friss, ^,2ÍI humán fibrinogént tartalmazó nyúl vérrel. 30 perc után meghatároztok a vér áramlást a rögön keresztül. A t-PA i.v. infúziót a teljes dózis 10%-ával indítottuk. Az infúziót 4 órán át folytattok. Az infúzió befejezése után 30 perccel a rögöket összegyűjtöttük és számoltok. A radioaktivitást használtuk minőségi kontrollként Mértük a radioaktivitást a vér mintákban, vizeletben, a tamponokban és fecskendőkben, annak megerősítésére, hogy a kezdeti rögben a radioaktivitás mennyiségét helyesen becsültük meg.

F) Vizsgálati eredmények

A 270-279. maradékoknál, a kettős szálú lízisációs helyeket a következő szekvenciával rendelkező t-PA mutánsokat fejeztük ki E. coliban és Chinese Hamster Ovary sejtekben:

natív -Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- (RKGC)

1B8 -G/y-Ile-Lys-Gly-Gly- (GIKGG)

2C9 -G/u-Ile-Lys-Gly-Gly- (EIKGG)

/. Western foltok és zimográfia

A CHO sejtekben kifejezett EIKGG és GIKGG mutánsokat redukált és nem-redukált SDS-PAGE gélekből származó Western foltokkal analizáltuk. A natív, egyes szálú t-PA két, 52000 és 50000 dalton molekulatőmegű sávként jelentkezik, a glikozilezésben mutatkozó különbség következtében. A nem-redukált SDS-PAGEből származó EIKGG mutáns egy nagyobb immunreaktív sávot mutatott, körülbelül 50000 dalton molekulatömegnél. A nem-redukált SDS-PAGE-ből származó GIKGG mutáns azonban 55 000 dalton molekulatömegűnek mutatkozott. A GIKGG mutáns és a natív t-PA molekulatömege közötti különbség a natív t-PA-tól kissé eltérő konformáció vagy szénhidrát szerkezet jele lehet. A redukciót követő analízissel (a proteáz és Kringle láncok elválasztása után) a t-PA kisebb molekulatömege a protein arg 275 helyen történő hasadását mutatja. A redukált SDS-PAGE gélek zimogiáfjai az mutatták, hogy ezekben a mintákban a plazminogén lízisátor aktivitás a t-PA egyes szálú formájának immunreaktív sávjának molekulatömegénél (megközelítőleg) 60000 volt. A kettős szálú forma körülbelül

HU 206520 Β

30000 dalton molekulatömegnek megfelelő mozgékonyságot mutat.

A különböző 275 (XYZ) mutánsok, amelyeket a fentebb leírtak szerint állítottunk elő, egyetlen csíkként tűnnek fel mind redukált, mind nem redukált SDS-PAGE-ben, a Lys₂₇₅ kivételével, amely redukálás után kisebb molekulatömeget mutat. Ez a munkamenet azt demonstrálja, hogy - egyetlen kivétellel - a mutáns. t-PA fehéq'ék egyláncú formái vannak jelen a transzformált sejtekből kapott tápközegben.

S-2251 vizsgálat

A natív és mutáns EIKGG t-PA S-2251 vizsgálatának analízis eredményeit az I. táblázatbanmutatjuk be. Ezeket az értékeket a glu-plazminogén használata előtt kaptuk, annak érdekében, hogy a vizsgálat során a paraméterek változását csökkentsük. A természetben előforduló RIKGG t-PA szekvenciának az S 2288 vizsgálat alapján egy önkényes fajlagos aktivitást tulajdonítottunk a fibrinogén jelenlétében. Az EIKGG t-PA mutánsok mindegyikénél ezt a standard t-PA-t használtuk az eredmények normalizálásához.

Mint látható, az EIKGG t-PA mutáns, függetlenül a tisztítás fokától, az S-2251 vizsgálatban nagyobb fajlagos aktivitással rendelkezik, mint a rekombináns t-PA.

7. táblázat

Mutáció	Mutáns	S-2251+ Fibrinogén	S—2251— Fibrinogén	Fibrinogén stimuláció
RIKGG¹	natív	(250 (XX))⁴	25 000	10,0
EIKGG¹	2Cp	1000000	3400	290,0
EIKGG²	2C9	420000	3100	134,0
EIKGG³	2C9	520000	7000	74,0

t cink-kelát lizin-agaróz felhasználásával tisztított cink-kelát ás benzamidin agaróz felhasználásával tisztított tisztítás nélkül vizsgált önkényesen hozzárendelt aktivitás

Az IA táblázatban közölt adatokat nagy-tisztaságú, liofilizált, glu-plazminogénnel végeztük. Egy jobban reprodukálható vizsgálat során azt találtuk, hogy az S-2251 vizsgálat során fibrinogén jelenlétében az EIKGG mutáns azonos aktivitású volt. Fibrinogén távollétében azonban a mutáns ebben az esetben is kevésbé volt aktív, mint a natív anyag (I. és LA táblázatok), ami nagyobb specificitást demonstrál.

IA táblázat

Mutáció	Mutáns	S-2251+ Fibrinogén	S—2251— Fibrinogén	Fibrinogén stimuláció
RIKGG¹	natív	(250000)²	17600	14
EIKGG¹	209	248000	500	500

cink-kelát lizin-agaróz felhasználásával tisztított önkényesen hozzárendelt aktivitás

A fentebb leírt további 275 (XYZ) mutánsokat is átvizsgáltuk, és azt találtuk, hogy ezek az EIK mutánshoz hasonló aktivitást mutatnak.

2. Buborék felszabadítást rög lízis és in vitro rög lízis vizsgálat

A buborék felszabadítást rög lízis vizsgálatot a rekombináns t-PA és a tisztított EIKGG t-PA mutáns fajlagos aktivitásának meghatározására használtuk. Mindegyik t-PA aktivitását a korábban ismertetett eljárásokkal határoztuk meg. A t-PA és EIKGG t-PA mutánsok koncentrációját radioimmunvizsgálattal határoztuk meg. E vizsgálatok eredményeit, beleértve a fajlagos aktivitást a II. táblázatban foglaljuk össze.

77. táblázat

Minta	I.D.	U/ml Aktivitás	Protein konc. mg/1	Fajlagos aktivitás
1	EIKGG*	8440	0,088	95909
2	EIKGG**	7698	0,088	87477
3	t-PA**	5640	0,088	64090

1. fagyasztott - egyszer megolvasztva

2. fagyasztott - négyszer megolvasztva * cink-kelét és benzamidin-agaróz felhasználásával tisztított ·· cink-kelát és lizin-agaróz felhasználásával tisztított

A buborék felszabadítási rög lízis azt mutatja, hogy a t-PA egyes szálú mutáns, közelebbről az EIKGG t-PA mutáns 50%-kal nagyobb fajlagos aktivitással rendelkezik, mint a rekombináns t-PA. Mint látható, a megismételt fagyasztás és megolvasztás az EIKGG t-PA mutáns fajlagos aktivitásának kis csökkenéséhez vezetett. Azonban a mutáns t-PA ebben az esetben is megőrizte a rekombináns t-PA-ét meghaladó fajlagos aktivitását.

A vizsgálati reprodukálhatóság határain belül, és finomabb technikákat is alkalmazva [lásd Carlson és munkatársai: Anal. Biochem. 168, 428 (1988)], a többi 275. (XYZ) mutáns az EIK mutánshoz hasonló rög-lízis aktivitást mutat a CIK (C₂₇₅ t-PA) kivételével, amely kisebb aktivitást mutat. Ebben a vizsgálatban az EIK (Ej/j t-PA) mintegy a vad típusú (RIK) t-PA-val ekvivalens.

3. In vivő inhibitor-komplex vizsgálat

A proteázok plazma proteáz inhibitorokkal történő inlízisálása jól ismert és tanulmányozott mechanizmus szérum proteázok inlízisálására. A keletkezett komplexek denaturálással szemben stabilak, és SDS-PAGE elektroforézissel vizsgálhatók. Ebben az eljárásban radioaktív-jelzett t-PA-t adunk plazmához vagy teljes vérhez, és a mintát 37 “C hőmérsékleten inkubáljuk. A mintát SDS-PAGE elektroforézissel, majd autoradiográfiásan vizsgáljuk. A radioaktivitásnak a szabad t-PA-nál nagyobb Mr-nél történő detektálása a képződött t-PA proteáz inhibitor komplex mennyiségére jellemző. Patkány vérben analizálva azt találtuk, hogy a t-PA lassan 200000-néI nagyobb molekulatömegű komplexeket képzett. Néhány órás inkubálás után a radioaktivitásnak több mint 70%-a ilyen komplexekben volt detektálható. Ezzel szemben, a mutáns t-PA nem hozott létre ilyen komplexeket; az autoradiográfi11

HU 206 520 Β ásan detektált radioaktivitás fő tömege a szabad, nemlízisált enzim pozíciójában maradt Hasonló analízist humán vérrel végezve (10. ábra) a t-PA szintén létrehozott ilyen komplexeket, de 100000 és 20000 közötti molekulatömegű komplexeket is képzett. Ugyanúgy, mint a patkányvér esetében, a mutáns t-PA lényegesen kevesebb 200000-nél nagyobb molekulatömegű komplexet hozott létre. A 100000 és 200000 közötti molekulatömegű proteáz komplexek még jelen voltak. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy a mutánst nem tnlízisálják a proteináz inhibitorok, amelyek 200000-nél nagyobb molekulatömeggel képeznek komplexeket. A 100000 és 200000 közötti tartományban az egyes speciesek között eltéréseket figyeltünk meg mind a t-PA, mind a mutáns t-PA esetében.

4. Fibrin kötés

Korábban azt közölték, hogy a t-PA egyes szálú és kettős szálú formái megközelítőleg azonos affinitást mutatnak fibrinnel szemben [Rijken és munkatársai, J. Bioi. Chem. 257,2920 (1982)]. Az itt leírt vizsgálatban azonban azt találtuk, hogy az egyes szálú t-PA forma lényegesen nagyobb affinitást mutatott a fibrinnel szemben, mint a kettős szálú fonna (11. ábra).

Az összes többi 275(XYZ) mutáns az EIK-hoz hasonló aktivitást mutal a fíbrin-kötési vizsgálatban. Meghatároztuk, hogy a fentiek szerint előállított GIK (G275-t-PA) mutáns kisebb fajlagos aktivitást mutat ebben a vizsgálatban az RIK-hoz viszonyítva; ez vélhetően egy második, megelőző mutáció (a 261. aminosavnál sys helyett tyr) feltételezett jelenléte miatti konformációs rendellenességnek tulajdonítható. A CIK és KIK mutánsok szintén kisebb aktivitásokat mutatnak, mint a vad típus (RIK), ez vélhetően bizonyos hibás feltekeredésnek és bizonyos kettős láncú forma jelenlétének tulajdonítható.

5. ín vivő rög lízls

A 12. ábra a relatív dózis-válasz görbéket mutatja t-PA (o) és az EIK mutáns (o) esetében. Az adatokat átlag +/SEM értékekként adjuk meg, egy csoportban 5 nyúl adatait értékelve. Megmértük a távolságot a két görbe között az 50%-os lizis pontnál, és a t-PA EK formájának potenciálját 2,4-szer nagyobbra becsültük, mint a nem-mutált formáét (RK). A statisztikusan szignifikáns különbséget 0/25 mg/kg dózisnál értük el (p<01).

A fentiekből világosan kitűnik, hogy szokásos vivőanyagokkal és adalékanyagokkal összekeverve a találmány szerinti vegyületek gyógyszerekként alkalmazhatók.

G) Következtetések

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a t-PA 275. maradékánál bekövetkezett mutáció hatékonyabb lehet, mint a természetes forma két külön ok miatt;

1. Megnövekedett specificitás: a t-PA funkció vizsgálatai aktívabb/specifikusabb proteinre mutatnak.

2. Lecsökkent in vivő plazma inhibitor kötés; az ilyen mutánsok lecsökkent in vivő gátlása a bizonyos proteáz inhibitorokkal történő inlízisálás csökkenésére utal. Ez meg kell hogy engedje az aktív, nemkomplexált formában levő t-PA keringését, ezáltal lehetővé téve, hogy a megnövekedett funkcionális t-PA feloldjon egy vérTőgöL

A t-PA egyes szálú formájának enzimatikus tulajdonságai tekintetében a tudományos irodalom ellentmondásos. A t-PA funkciójának jobb megértése érdekében homológ proteineket lehet megvizsgálni. Részletes vizsgálatok folytak a szerin proteázok közül a tripszinnel és kimotripszinnel. A t-PA proteáz tartománya igen hasonló ezekhez a proteinekhez, és feltehetően hasonló módon funkcionál. A tripszin és kimotripszin funkcióján alapuló mechanizmus alapján az lenne várható, hogy a t-PA 275 argininjénél a hasadás megakadályozása csak a proteáz tartomány funkcionális jellemzőit befolyásolja. Ezért meglepő a mutánsok megnövekedett fibrin affinitása.

Függetlenül a szóbanforgó mechanizmus(ok)tól (megnövekedett specifitás, a proteáz inhibitor kötés hiánya, megnövekedett fibrin affinitás vagy ezek kombinációja), amikor egy mutáns esetében in vivő vizsgáltuk a létrejött, az eret elzáró vérrög lízisét, azt találtuk, hogy a mutáns körülbelül 2,5-szer aktívabb volt, mint a természetes szekvenciájú t-PA. Mint korábban részletesen tárgyaltuk, a t-PA egyes szálú formája a rög helyén kettős szálú formává alakult. Egy ilyen átalakulás tönkretenné minden az egyes szálú formával kapcsolatos előnyt. Csak a mutáns t-PA képes arra, hogy miközben a fiziológiás proteázok kettős szálú formájúvá alakítják, megőrizze a korábbi előnyöket a rög képződésének helyén.

A találmány ismertetése során a találmány előnyös megvalósítási módjait írtuk le. Szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy számos változtatásra van lehetőség, amelyek nem érintik a találmány lényegét és így szintén az oltalmi körbe esnek.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás DNS szekvencia előállítására, amely olyan egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutánst kódol, amelynek a 270-279. aminosav-tartományában legalább a 275. helyen az eredeti szekveniától eltérő aminosav áll, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra 1-527 aminosavait kódoló, de a 270-279. aminosavnak megfelelő tartományban legalább a 275. aminosavnak megfelelő helyen a 2. ábrán feltüntetettől eltérő DNS szekvenciát, amely adott esetben valamely szignál-pepiidet kódoló szekvenciával, továbbá 3’ és 5’ nem transzlatált területet jelentő szekvenciával van kiegészítve, önmagában ismert kémiai és/vagy biotechnológiai módszerekkel alakítjuk ki, előnyösen a természetes t-PA-t kódoló, 2. ábra szerinti szekvenciának a 270-279. aminosavnak megfelelő tartományában legalább a 275. aminosavnak megfelelő CGC kódot pontmutációval cseréljük ki.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás DNS szekvencia előállítására, amely olyan egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutánst kódol, amelyben a 275. helyzetet glicin vagy glutaminsav foglalja el, azzal jellemezve, hogy a 275. aminosavnak megfelelő helyen ι

HU 206520 Β

CGC helyett valamely glicint vagy glutaminsavat kódoló tripletet tartalmazó DNS szekvenciát önmagában ismert kémiai és/vagy biotechnológiai módszerekkel, előnyösen pontmutációval alakítjuk ki.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra -35- -1 aminosavainak megfelelő szignálpeptidet kódoló szekvenciával kiegészített DNS szekvenciát önmagában ismert kémiai és/vagy biotechnológiai módszerekkel, előnyösen pontmutációval alakítjuk ki.
4. Az 1-3 igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra 3’ és 5’ nem transzlatált területet jelentő szekvenciáival kiegészített DNS szekvenciát önmagában ismén kémiai és/vagy biotechnológiai módszerekkel, előnyösen pontmutációval alakítjuk ki.
5. Eljárás vektor előállítására, amely egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutánst kódoló DNS szekvenciát foglal magában kifejezésre alkalmas formában, ahol a nevezett mutánsnak a 270-279. helyzetű tartományában legalább a 275. helyzetet valamely más, az eredetitől eltérő aminosav foglalja el, azzal jellemezve, hogy valamely, 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított szekvenciát

a) megfelelő operátor rendszenei együtt valamely vektorba iktatunk, vagy

b) valamely megfelelő operátor rendszerrel bíró vektorba iktatunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás vektor előállítására, mely egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutánst kódoló DNS szekvenciát foglal magában kifejezésre alkalmas formában, ahol a nevezett mutánsban a 275. helyzetet glicin vagy glutaminsav foglalja el, azzal jellemezve, hogy valamely, a 2. igénypont szerint előállított DNS szekvenciát

a) megfelelő operátor rendszenei együtt valamely vektorba iktatunk, vagy

b) valamely megfelelő operátor rendszenei bíró vektorba iktatunk.
7. Eljárás prokarióta vagy állati sejt- vagy szövettenyészet eredetű transzformánsok előállítására, amelyek egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutáns kifejezésére képesek, ahol a nevezett mutánsnak a 270-279. helyzetű tartományában legalább a 275. helyzetet valamely az eredetitől eltérő aminosav foglalja el, azzaljellemezve, hogy valamely prokarióta organizmust vagy valamely állati sejt- vagy szövettenyészet sejtjeit valamely 5. vagy 6. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás prokarióta vagy állati sejt- vagy szövettenyészet eredetű transzformánsok előállítására, amelyek egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutáns kifejezésére képesek, ahol a nevezett mutánsban a 275. helyzetet glicin vagy glutaminsav foglalja el, azzal jellemezve, hogy valamely prokarióta organizmust vagy valamely állati sejt- vagy szövettenyészet sejtjeit valamely 6. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás prokarióta eredetű transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely prokarióta organizmust transzformálunk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás E.coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely E.coli törzset transzformálunk.
11. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás állati sejtvagy szövettenyészet eredetű transzformánsok előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely állati sejtvagy szövettenyészet sejtjeit transzformáljuk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás kínai hörcsög petefészek (CHO) eredetű transzformánsok előállítására, azzaljellemezve, hogy CHO sejttenyészetet transzformálunk.
13. Eljárás egyes szálú humán szöveti plazminogén lízisátor mutáns előállítására, amelynek a 270-279. helyzetű tartományában legalább a 275. helyzetet egy, az eredetitől eltérő aminosav foglalja el, azzal jellemezve, hogy valamely, 7-12. igénypontok bármelyike szerint előállított prokarióta vagy állati sejt- vagy szövettenyészet eredetű transzformánst megfelelő tápközegben tenyésztünk, a tenyészetből a szöveti plazminogén lízisátor mutánst elkülönítjük, és kívánt esetben a-szignál szekvenciát lehasítjuk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás egyes szálú szöveti plazminogén lízisátor mutáns előállítására, amelyben a 275. helyzetet glicin vagy glutaminsav foglalja el, azzal jellemezve, hogy valamely, a 8. igénypont szerint előállított transzformánst tenyésztünk.
15. Eljárás szöveti plazminogén lízisátor hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely 13. vagy 14. igénypont szerint előállított egyes szálú szöveti plazminogén aktivátor mutánst valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.