JPH03254683A - ダニの主要アレルゲンの還伝情報を有するｄｎａおよび該アレルゲンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野） 本発明は、ダニの主要アレルゲンの遺伝的情報を有する
Ｄ　Ｎ　Ａ　、このＤＮＡに関連した複製ベクター、プ
ラスミド、宿主細胞、およびその用途に関する。

（従来の技術） アレルギー疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作さ
れることにより、血清および組織でアレルゲンに特異的
なＩｇＥ抗体（レアギン抗体）が産生され、再びその抗
原に暴露されることにより、各組織上で抗原とＩｇＥ抗
体が抗原抗体反応を起こし、その際、生じる種々の症状
によるものと考えられている。

このアレルギー疾患を根本的に治療する方法として、滅
感作療法がある。この方法は、その原因抗原を少量ずつ
、また、症状に応じて投与量を徐々に増量しながら、反
復投与する方法である。この療法により遮断抗体産生、
ＩｇＥ抗体産生抑制、マスト細胞から遊離するヒスタミ
ン量の低下が起こり、治療効果が得られると考えられて
いる。

一方、気管支喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎などの
アレルギー性疾患は、室内塵中に生息しているダニに対
するアレルギーが主な原因であることが明らかになって
おり、既にいくつかのダニ主要アレルゲンタンパク質が
同定されている（プランツミルズ（Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉ
１１ｓ）ら、ザ・ジャーナル・オプ・アレルギー・アン
ド・クリニカル・イムノロジー（Ｊ、　Ａ１１ｅｒｇｙ
　Ｃ１１ｎ、　１ｍ＋５ｕｎｏ１．）、８０巻、７５５
頁、１９８７年）、従って、この主要アレルゲンを用い
た上記アレルギー疾患の滅感作療法は、きわめて有効で
あるが、多量の精製アレルゲンを必要とする。しかし、
これまで精製ダニ主要アレルゲンを多量に調製すること
は、実質的に不可能であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、これらの問題は、ヒヨウヒダニ（Ｄｅｒ
ｍａｔｏ　ｈａ　ｏｉｄｅｓ　ｆａｒｉｎａｅ）虫体か
らｍＲＮＡを調製し、それに対応するＣＤＮＡ遺伝子ラ
イブラリーを作威し、探索すること、およびコロニーイ
ムノアッセイ法でダニ主要アレルゲンタンパク質Ｄｅｒ
ｆ　ＩＩを発現しているクローンを単離し、当該クロー
ンから目的とする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離するこ
とにより解決できることを見出した。

それゆえ、本発明の目的は、遺伝子工学を使ってダニ主
要アレルゲンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を得る
ことであり、かつそのＤＮＡがコードしているダニ主要
アレルゲンを発現、生産して目的とするアレルゲンタン
パク質を大量に製造する方法を提供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ヒツウヒダニ主要アレルゲン（Ｄｅｒｆ■）
の生化学的および免疫学的性質を有するタンパク質の遺
伝的情報の少なくとも一部分をコードするＤＮＡである
。

ダニ主要アレルゲンＤｅｒｆ　Ｉｆをコードする遺伝子
を得るには、ダニを動物飼育用飼料（たとえば、実験動
物飼育用配合飼料、家畜飼育用飼料、愛玩動物飼育用飼
料など）、またはその組成物で人工的に飼育し、特開昭
４９−６９８２０号公報に開示されている方法等を使用
して、ダニ虫体を単離することができる。得られたダニ
虫体からｍＲＮＡを得るには、チャーブウィン（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ　Ｊ、　Ｍ、）　らの方法などが利用できる
（バイオケミストリー（Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８１１．５２９４〜５２９９
頁、１９７９年）、さらには、市販のＲＮＡ抽出キット
（アマジャム社製、商品名、ＲＰＮ、　１２６４）を使
用することができる。

一般に真核性ｍＲＮＡ群は、その３′末端にポリ（Ａ）
テールを持つことから、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用
いたアフィニテイクロマトグラフィーで簡便に精製でき
る（オーフレー（Ａｕｆｆｒａｙ　Ｃ，）ら、ヨーロピ
アン・ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ
、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１０７　ｔ−３０３
〜３０４頁、１９８０年）、さらには、市販のｍＲＮＡ
精製キット（ファルマシア社製、商品名、ｍＲＮＡ精製
キｙ　）　２７−９２５８−０１）の使用が便利である
。

精製ｍＲＮＡは逆転写酵素およびブライマーを用いて行
うｃＤＮＡ第−鎖の台底テンプレートとして用いる。用
いるプライマーはオリゴ（ｄ　Ｔ）または台底プライマ
ーが使用できる。ｃＤＮＡの第二鎖は種々の従来法によ
って台底できる（バイン（Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、）
　ら、ＤＮＡクローニング、１巻、２章、４９〜７８頁
、１９８５年、グローバー（Ｄ、　Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ）編）、さらには、市販のｃＤＮＡ作戒キ
作成（アマジャム社製、商品名、ＲＰＮ、　１２５６　
Ｙ）も使用できる。しかして得られた２本鎖ＣＤＮＡは
適当なベクター、好ましくは、プラスミドｐｕｔ！Ｘ　
１（ブレラサン（Ｂｒｅｓｓａｎ　Ｇ、）、スタンレイ
（ＳｔａｎｌｅｙＫ、）、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ。

＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、）　、１５巻、１００５６頁、１
９８７年）のクローニング部位に挿入することができる
。２本鎖ＣＤＮＡの挿入は従来用いられてきた種々の方
法を使うことが可能である（マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　Ｔ。

Ｍ、）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２年）、シか
して得られたダニ虫体由来のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリ
ーは適当な宿主、特に好ましくは大腸菌を形質転換する
ことによって遺伝子産物を発現させることができる。

次に、形質転換した大腸菌の中から目的とするダニ主要
抗原Ｄｅｒｆ　ＩＩを生産しているコロニーを検索しな
ければならない、このためには種々の方法が使用できる
が、コロニーイムノアンセイ法を用いるのが有利である
０例えばプラスくドとして、ｐｔ１１ｌ’Ｘ　１を用い
た場合は以下に記載した方法で検索できる。

形質転換した大腸菌をＬプロス寒天培地（１％バクトド
リプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％バクトアガー５０ｎ／ｄアン
ピシリン、ｐＨ７，４＞上に生育させた後、生じたコロ
ニーをニトロセルロースフィルター（アマジャム社製、
ハイボンドＣ）などの上へレプリカしてフィルター上で
生育させ、さらに外来タンパク質を生産させた後、この
フィルターをクロロホルム蒸気に暴露して溶菌させ、産
生しているタンパク質をこのフィルター上に固定した。

挿入されたダニ虫体由来ＤＮＡはβ−ガラクトシダーゼ
をコードしているＤＮＡの下流に連結されており、それ
に対応するタンパク質はβ−ガラクトシダーゼとの融合
タンパク質の形で生産されていた。ダニ主要アレルゲン
であるＤｅｒｆ　ｎに対する抗体をウサギを用いて調製
しておき、その抗体を用いて目的とするＤｅｒｆ　ＩＩ
タンパク質をこのフィルター上で検出し、陽性のクロー
ンを２個得ることができた。保存しておいた元の寒天プ
レートから対応する大腸菌コロニーを選択し、Ｌブロス
液体培地（Ｌブロス寒天培地から寒天を除いたもの）へ
接種した。３０℃で約１８時間振盪培養する。培養液か
ら菌体を集め、常法のアルカリ抽出によってプラスミド
を回収した。続いて得られたプラスミドを種々の制限酵
素で消化した後、あるいは消化せずにアガロースゲル電
気泳動に供し、挿入されているダニ虫体由来のＤＮＡを
分析した。得られた二つのプラスミドｐＦＬ　１　＃よ
びｐＦＬ１１にはそれぞれ約５００ベースペアのＤＮＡ
が挿入されていた。

一方、大腸菌を、得られた二つのプラスミドおよびダニ
由来ＤＮＡが挿入されていないベクターｐＵＥＸ　１で
形質転換し、それぞれ前述したＬブロス培地に接種した
。３０℃で約３時間振盪培養した後、培養温度を４２℃
に上げて、さらに、約３時間培養を継続した。菌体を集
めて緩衝液（トリス塩酸緩衝液、１０ｍＭ、　ｐＨ７）
にて洗浄したのち、マルストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）およ
びキャロル（Ｃａｒｒｏ１１）らの方法（ＤＮＡクロー
ニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬプレス、３
巻、４章、１９８５年）で融合タンパク質を抽出した。

抽出したタンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供した。電気泳動した後、ウェスタンブロッ
ティング法（トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ。

Ｈ，）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、５ｃｉ−）　Ｕ、ｓ、　Ａ、１７６巻、４３
５０頁、１９７９年）で産生されているタンパク質をセ
ルロースフィルターに転写した。タンパク質が転写され
たフィルターをウシ血清アルブミンでブロッキングし、
ウサギで作成しておいた抗ＤｅｒｆＩＩ抗体を反応させ
た。その後に緩衝液（トリス塩酸緩衝液、１０ｓ＋Ｍ、
ｐＨ７，４、塩化ナトリウム、１５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ
　２０．０，０５％〉で洗浄した後、そのフィルターを
さらにパーオキシダーゼでＩＩｍされた抗つサギＩｇＧ
抗体（アマジャム社製）で反応させた。再び、同じ緩衝
液で洗浄し、反応しないで残存しているパーオキシダー
ゼ標識抗体を除去した。さらに、このフィルターを過酸
化水素および色素４−クロロ−１−ナフトールを用いて
反応させた。

その結果、プラスミドｐｐｔ、　１およびｐＦＬ１１で
形質転換した大腸菌から得られた上滑中には、分子量約
１３万のタンパク質のバンドが陽性反応を示したが、Ｄ
ＮＡが挿入されていないベクターで形質転換した大腸菌
からの上滑中には陽性を示すタンパク質は検出されなか
った。この結果、プラスミドｐＦＬ　１およびｐＦＬ１
１中にはダニ主要抗原であるＤｅｒｆ　Ｕをコードして
いるＤＮＡが存在し、かつその遺伝子はβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合タンパク質として大腸菌中で発現してい
ることが明らかとなった。

前述したプラスミドｐＦＬ　１およびｐＦＬ１１に挿入
されているダニ由来ＤＮＡ断片は、適当な制限酵素、好
ましくは、Ｂａｓ＋旧による完全分解、またはＮｃｏ　
Ｉによる部分分解で切り出すことができる。

切り出されたＤＮＡ断片は、ダイデオキシ法（サンガー
（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、）ら、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー〇、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、
１６２巻、７２９〜７７３頁、１９８２年）などを用い
てその塩基配列を決定できる。しかして、決定されたダ
ニ主要アレルゲンタンパク質をコードしているＤＮＡ配
列を式Ｉおよび■に示した。また、式Ｉおよび■にはそ
の配列に対応するアミノ酸も示しである。

式Ｉ： ４５１　　ＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡ　ＣＡＡ　
　ＡＡＴ　　ＴＣＡ　　ＡＴＡ　　ＡＣＣ４８０４８１
ＡＡＡ　　ＡＴＴ　ＴＧＡ　　ＡＴＣＣＡＡ　　ＡＡＡ
　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　ＡＡＡ　５１０５１
１　　ＡＣＣＡＴＧ　　Ｇ 式中： １４１　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　＊＊傘４５１　　ＡＴ
Ｔ　ＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡ　　ＣＡＡ　　Ａ
ＡＴ　ＴＣＡ　　ＡＴＡ　　４８０４８１　　ＡＣＣＡ
ＡＡ　　ＡＴＴ　　ＴＧＡ　　ＡＴＣＡＡＡ　　ＡＡＡ
　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＣＣＡ　　５１０５１１　　
ＴＧＣ 尚、式中の下線部分は下記の表Ｉに示したアミノ酸配列
と一致する配列を示す。０傘は終止コドンを示す。

式Ｉおよび■に示した塩基配列が本来のダニ主要アレル
ゲンであるＤｅｒｆ　ｎをコードしているものであるこ
とを確認するために、Ｄｅｒｆ　ＩＩタンパク質を精製
し、そのアミノ酸配列を決定して、式Ｉおよび■に示し
たアミノ酸配列とを比較した。アレルゲンタンパク質Ｄ
ｅｒｆ　Ｕの精製は従来から用いられている種々の精製
法（生化学実験講座１巻、タンパク質の化学、山川民夫
、今堀和友編、東京化学同人）を組み合わせて使用でき
るが、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる方法が
有利である。得られた精製アレルゲンＤｅｒｆ　Ｕをペ
プチドシーケンサ−４７１Ａ型（アプライドバイオシス
テムズ社製）に供して、そのアミノ酸配列を決定した。

その結果を表Ｉに示した。これらの結果を併せて、本発
明者らが単離したその配列を決定したＤＮＡ配列は、確
かにダニ主要アレルゲンであるＤｅｒｆ　Ｕをコードし
ていることが確かめられた。

表Ｉ 本ＤＮＡ断片およびその一部は適当なベクター例えばｙ
ｇｐｉ３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　Ｊ、　Ｒ，）ら、
ジ−ン（Ｇｅｎｅ）、　　８巻、１２１〜１３３頁、１
９７９年）などを用いて、酵母中で発現させることがで
きる。本発明に従ったダニＤｅｒｆ　Ｉｆ遺伝子を伴う
発現カセットを持つ酵母ベクターを用い、適当な酵母細
胞を形質転換することができる。この目的のため本発明
に従ったＤＮＡ配列は、大腸菌プロモーターではなく、
強力な真核性プロモーター、例えばΔＰ８（大竹ら、ア
グリカルテャラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、）＋５
２巻、２７５３〜２７６２頁、１９８８年）などの制御
下におかなければならない。

遺伝子工学により調製した、本発明に従うダニＤｅｒｆ
　ｎタンパク質、その一部およびそれらが他のタンパク
質と融合した形のもので、生化学的、免疫学的にダニ主
要アレルゲンＤｅｒｆ　ＩＩの性質を有するタンパク質
は、ダニに起因する各種のアレルギー疾患の治療あるい
は診断に使用できる。

（発明の効果） 本発明によれば、遺伝子工学を使ってヒヨウヒダニ主要
アレルゲンタンパク質Ｄｅｒｆ　Ｉｆを発現しているク
ローンを単離し、当該クローンから目的とする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を単離することができた。

それゆえ、このＤＮＡがコードしているダニ主要アレル
ゲンを発現、生産してアレルゲンタンパク質を大量に製
造する方法を提供することができ、このタンパク質を用
いて各種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用す
ることができる。

（実施例） 次に、実施例に基づき本発明を一層具体的に説明する。

実施例１ ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーの作成 温度２５℃、湿度７５％の条件下、実験動物飼育用飼料
中で約３０日間人工飼育したダニを、飽和食塩水で餌と
分離し、吸引濾過してダニ虫体のみを調製したく特開昭
４９−６９８２０号公報〉。得られた虫体（約５ｇ）を
液体窒素につけて、急速凍結させ、それから総ＲＮＡを
ＲＮＡ抽出キット（アマジャム社製ＲＰＮ、　１２６４
）を用いて抽出精製した。その総ＲＮＡからｍＲＮＡを
オリゴ−ｄＴカラム（ファルマシア社製、商品名、ｍ　
ＲＮ　Ａ精製キット２７９２５８−０１）を用いて精製
し、約３ｎのｍＲＮＡが得られた。その全量を用いてｃ
ＤＮＡを合成したがその合成には、ｃＤＮＡ合威システ
ム・プラスを用いた（アマジャム社製、商品名、ＲＰＮ
、　１２５６　Ｙ）。

ＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡ精製およびｃＤＮＡ合威は１すべ
てキットに添付されているマニュアルに従って実施した
。

発現ベクターは、ブレラサン（Ｂｒｅｓｓａｎ）等によ
って報告されているｐＵＥＸｌ　　（ヌクレイツク・ア
シッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）
１５巻、１００５６頁、１９８７年）を用いた。この発
現ベクターは、βガラクトシダーゼ遺伝子の下流にｃＤ
ＮＡ断片を挿入し、目的遺伝子を融合蛋白質として発現
できる。またその発現量は上流のラムダ（λ）　Ｐａプ
ロモーターにより決定され、培養温度を４２℃ヘシフト
すると大きく増大させることができる。クローニング手
順は、ハイメール（Ｈａｙｍｅｒｌｅ）等の方法（ヌク
レイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１４巻、８６１５〜８６２４
頁、１９８６年）に従い、試薬等は、ｃＤＮＡクローニ
ングシステムｐＵＥＸＩ　　（アマジャム社製、商品名
、ＲＰＮ、　１２８２）を用いた。このとき形質転換に
用いる細菌としては、大腸菌ＭＣ１０６１（遺伝子型ａ
ｒａＤ１３９．Δ［轡。

騰］　７６９７．Δ石χ７４．但Ｕ−、但に一、加匹−
１Ｉ！゛、政Ａ、担Ａ−，ＩＩ（ズＢ−）を用い、コン
ピテント・セルの調製はハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の
方法（ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、
　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ）、　Ｅｄ
、　Ｇｌｏｖｅｒ、　ｏ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　
　１巻、１０９頁、１９８５年）に従った。

実施例２ ｐＰＬ　１およびｐＦＬ１１の検出 得られた形質転換株からウサギ由来の抗Ｄｅｒｆ　ｎ抗
体と反応するクローンを、コロニーイムノアッセイ法で
検出した。形質転換株は、アンピシリンを５０■／ｄ含
むＬブロス寒天培地（１％トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ、デイフコ社製）、０．５％イースト・イクストラク
ト（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、デイフコ社製）、０
．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天〉上に散布し、３
０℃でコロニーの直径が１ｍｍ＋程度になるように培養
した。ニトロセルロースフィルター（ハイボンド−Ｃ、
アマジャム社製、商品名、ＲＰＮ、　１７８２　Ｃ）を
菌がずれないように注意深くコロニーの上に重ね、菌体
を写し取った。写し取ったプレートはもう一度、３０℃
で培養した。

一方、コロニーを転写したニトロセルロースフィルター
は、新しいＬプロス寒天プレートにコロニーの面を上側
にして置き、４２℃で２時間培養した。タンク中にクロ
ロホルムを充満させ、培養後のニトロセルロースフィル
ターをその中に釣り下げ、約２５分間、クロロホルムに
暴露した。フィルターを一枚ずつペトリ皿にコロニー面
を下にして宣き、４ｍｇのリソ゛チームと１００＃１ｒ
のデオキシリボヌクレアーゼを含むＴＢＳ緩衝液（１０
Ｉｌ１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、１５０ｍＭ
塩化ナトリウム）１〇−に浸し、室温で１時間、ゆっく
り振盪し、溶菌させた。２０−のＴＢＳ緩衝液で５分間
振盪する洗浄操作を４回繰り返した後、抗体の非特異的
吸着を防ぐためブロッキング操作として、２％牛血清ア
ルブミンを含むＴＢＳ緩衝液１０−に１時間浸した。

−次抗体としてのウサギ由来のＤｅｒｆ　ＩＩ抗体を、
０．２％牛血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液１０ｍで
希釈（１０００〜３０００倍）した溶液にフィルターを
浸し１時間振盪した。ＴＢＳＴ緩衝液（０，０５％、ツ
イーン２０を含むＴＢＳＩｌ衝液）　２０−で４回洗浄
して吸着しなかった一次抗体を洗い流した。

二次抗体はパーオキシダーゼ標識したウサギ抗ＩｇＧ抗
体（バイオランド社製）を用い、−次抗体の時と同様に
吸着、洗浄操作を行った。発色試薬のジアミノベンチジ
ンを０．４ｍｇ／ｌ１１の濃度でＴＢＳ緩衝液に溶解し
、過酸化水素水を最終濃度０．０１％になるように添加
した後、フィルターを浸し発色を行った。

この操作を約１，６００株の形質転換株について行った
ところ、強いシグナルを示すコロニーが２株見出された
。それぞれ対応するコロニーを、３０℃で培養している
元プレートからＬブロス培地に植え継ぎ、培養した後、
それぞれからプラスミドを調製し、その解析を行った。

このときのプラスミド抽出法、制限酵素切断、ゲル電気
泳動等の方法はマニアテス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法（モレキュラークローニング、コールド・スプリング
・ハーバ−・プレス、１９８２年）に準拠した。この様
にして得た２種の大腸菌はどれもｃＤＮＡ由来と考えら
れる断片（約５００ベース・ペア）が挿入されたプラス
ミドを保持しており、それぞれのプラスミドをｐＦＬ　
１およびｐｐｔ、ｉｉと命名した。

実施例３ Ｄｅｒｆ　ＩＩ遺伝子（ｐＦＬ　１およびｐＰＬ１１）
の塩基配列決定 ｐＦＬｌおよびｐＦＬ１１のｃＤＮＡ断片の制限酵素処
理、及びライゲーシヨン、及び大腸菌宿主ＪＭ１０５（
遺伝子型　與、μＬ１世Ａ、與Ｂ１５．川Ｒ４゜Δ（厖
−鵠ＡＢ）、　［旦゛、鵠ＡＢ、哩Ｉ９ΔＤ阿１５．膣
Ｄ３６］）のトランスフォーメーションは通常の方法（
マニアテス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モレキュラークロ
ーニング、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、
１０４頁、１４６頁、３９６頁、１９８２年；ＤＮＡク
ローニング、ＩＲＬプレス、１巻、６章、１９８５年）
によって、サンガーの配列決定法（サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）　２１４巻、１２０５〜１２１０頁、１９８
５年）に適したベクター（ｐＵｃ１１８及びｐＵｃ１１
９　（メソシング（Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ）等、メソンズ・
イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｓｏｌｏｇｙ）　１０１巻、２０〜７８頁、１９７
８年））へのクローニングを行った。

この様に単離したＢａｌ１１旧−ｃＤＮＡ断片をそのま
ま、もしくはＮｃｏ　Ｉを始めとする数種類の制限酵素
で切断し、同様に処理したベクターに挿入した後に、大
腸菌のコンピテント・セルをトランスフオームした。こ
の組換えプラスミドの一本鎖ＤＮＡをそれぞれ単離、精
製し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の方法に従い、塩基配
列を決定した。この配列は日立ソフトウェアエンジニア
リング社製のコンピュータプログラム（ＤＮＡＳ　Ｉ　
Ｓ）で処理した。

実施例４ Ｄｅｒｆ　ＩＩ蛋白のＮ末端ア旦ノ酸配列決定逆相ＨＬ
ＰＣで精製したＤｅｒｆ　ｎ蛋白質アミノ酸配列を決定
した。配列決定は、アプライド・バイオシステムズ社製
の気相シークエンサー（モデル４７１Ａ）で行った。Ｉ
Ｏｘの初期量でＮ末端から４５アミノ酸残基までの配列
決定が可能であった。得られたアミノ酸配列は上記表Ｉ
に示したように、期待された配列、即ちｃＤＮＡの塩基
配列からの推定アミノ酸配列と１００％一致していた。

実施例５ 融合蛋白質の抽出と抗原性の確認 Ｄｅｒｆ　ｎを融合蛋白質として発現している２種の大
腸菌（それぞれｐＦＬ　１およびｐＦＬ１１を保持して
いる〉のうち、代表としてｐＦＬ　１を保持する大腸菌
をＬプロス培地で液体培養して、融合蛋白の抽出及びそ
の抗原性を確認した。５ＯＮ／−アンピシリンを含むＬ
ブロス培地（Ｌプロス−Ａｐ培地）５１Ｒ１に接種し、
３０℃−晩振盪培養した。それを本培養としてＬブロス
−Ａｐ培培地１接接した。３０℃で振盪培養し、０Ｄｉ
ｂｏｎ１１ｌが０．６になった所で、あらかじめ５４℃
に温めておいたＬブロス−Ａｐ培地を同量加え、４２℃
でさらに２時間振盪培養した。

培養後の菌体を回収しマルストン（Ｍａｒｓ　ｔｏｎ）
及びキャロル（Ｃａｒｒｏ１１）等の方法（ＤＮＡクロ
ーリング、ＩＲＬプレス、３巻、４章、５章、１９８５
年）により融合蛋白質を抽出した。このときの菌体を位
相差顕微鏡にて観察（１，０００倍）すると、融合蛋白
質が菌内にインクルージヨンボディとして存在している
のが確認された。

得られた融合蛋白質を５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気
泳動（第−化学型、垂直型カセット電気泳動システム、
ゲル濃度４〜２０％）で分離し、一部はクーマシーブリ
リアントプルーで染色し、一部はウェスタン・プロット
法（トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等、プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデよ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）　６９巻、１４０９〜１４１２頁、１９７２年
）を用いて、メンプラン（イモピロン・ミリポア社製）
上に転写した後、抗Ｄｅｒｆ　Ｉ［抗体によって、Ｄｅ
ｒｆ　Ｉｔ抗原蛋白質が発現していることを確認した。

陽性反応を示した蛋白質は分子量約１３万を示し、β−
ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として生産されている
ことが判明した。

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒョウヒダニ主要アレルゲン（￥Ｄｅｒｆ￥II）
   の生化学的および免疫学的性質を有するタンパク質の遺
   伝情報の少なくとも一部をコードするＤＮＡ。
2. （２）次の式 I ： 【遺伝子配列があります。】 および次の式II： 【遺伝子配列があります。】 および次の表 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、式 I および式IIの下線部分は表 I に示したア
   ミノ酸配列と一致する配列を示す。）に従うヌクレオチ
   ド配列に対応するＤＮＡ配列を有することを特徴とする
   請求項１記載のＤＮＡ。
3. （３）合成、半合成あるいは天然の起源を持ち、請求項
   １または２記載のＤＮＡおよびその突然変異体と関連し
   、かつ￥Ｄｅｒｆ￥IIの生化学的および免疫学的性質を
   もつタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するもので
   、請求項１または２記載のＤＮＡとハイブリダイズする
   ＤＮＡ。
4. （４）請求項２に記載したＤＮＡ配列を含むことを特徴
   とする、少なくとも一つの選択マーカー、および、複製
   開始点の外でかつ他の基本的遺伝子領域の外に少なくと
   も一つの制限酵素の認識部位を有する複製ベクター。
5. （５）ウィルス起源であることを特徴とする請求項４記
   載の複製ベクター。
6. （６）プラスミド起源であることを特徴とする請求項４
   記載の複製ベクター。
7. （７）請求項２または３に記載したＤＮＡ配列をＤＮＡ
   配列を含む発現カセットを持ち、安定した形で原核性ま
   たは真核性宿主を形質転換でき、該宿主細胞中で複製可
   能で、かつ、その中に含まれる￥Ｄｅｒｆ￥IIの遺伝情
   報が正しく転写されるプラスミド。
8. （８）ｐＦＬ１またはｐＦＬ１１である請求項７記載の
   プラスミド。
9. （９）請求項３に記載したＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ
   配列を含む発現カセットを持ち、安定した形で原核性ま
   たは真核性宿主を形質転換でき、該宿主細胞中で複製可
   能で、かつ、その中に含まれる￥Ｄｅｒｆ￥IIの遺伝情
   報が正しく転写されるプラスミド。
10. （１０）ｐＦＬ１またはｐＦＬ１１である請求項９記載
    のプラスミド。
11. （１１）￥Ｄｅｒｆ￥IIをコードする遺伝情報を含む、
    形質転換した宿主細胞。
12. （１２）原核生物である請求項１１記載の宿主細胞。
13. （１３）大腸菌である請求項１２記載の宿主細胞。
14. （１４）真核性物である請求項１１記載の宿主細胞。
15. （１５）酵母である請求項１４記載の宿主細胞。
16. （１６）請求項１または２記載のＤＮＡを用いて、￥Ｄ
    ｅｒｆ￥IIの生化学的、免疫学的性質を満たすタンパク
    質を製造する方法。
17. （１７）請求項１または２記載のＤＮＡを用いて、￥Ｄ
    ｅｒｆ￥IIの生化学的、免疫学的性質を満たすペプチド
    を製造する方法。
18. （１８）請求項３記載のＤＮＡを用いて￥Ｄｅｒｆ￥I
    Iの生化学的、免疫学的性質を満たすタンパク質を製造
    する方法。
19. （１９）請求項３記載のＤＮＡを用いて￥Ｄｅｒｆ￥I
    Iの生化学的、免疫学的性質を満たすペプチドを製造す
    る方法。
20. （２０）請求項１６記載の方法で得られたタンパク質。
21. （２１）請求項１７記載の方法で得られたペプチド。
22. （２２）請求項１８記載の方法で得られたタンパク質。
23. （２３）請求項１９記載の方法で得られたペプチド。
24. （２４）請求項１または２記載のＤＮＡを用いてアレル
    ギー疾患を予防する方法。
25. （２５）請求項３記載のＤＮＡを用いてアレルギー疾患
    を予防する方法。
26. （２６）請求項１または２記載のＤＮＡを用いて製造さ
    れたアレルギー疾患治療薬。
27. （２７）請求項３記載のＤＮＡを用いて製造されたアレ
    ルギー疾患治療薬。