MXPA99001184A - Polipeptidos que tienen en su n-terminal un solopolimero soluble en agua covalentemente enlazado - Google Patents

Abstract

Esta invención provee composiciones que constan, esencialmente de un polipéptido y un polímero soluble en agua enlazados covalentemente al mismo en elátomo de alfa-carbono N-terminal a través de un enlace de hidrazona o hidrazona reducida, o un enlace de oxima u oxima reducida;esta invención también provee métodos para hacer las presentes composiciones, composiciones farmacéuticas que contienen las mismas, y equipos para utilizarse en la preparación de las mismas.

Description

POLIPEPTIDOS OUE TIENEN EN SU N-TERMINAL UN SOLO POLÍMERO SOLUBLE EN AGUA COVALENTEMENTE ENLAZADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención del momento se refiere a polipéptidos que tienen enlazado en su N-terminal un solo polímero, soluble en agua. Estos polipéptidos tiene propiedades que los vuelven ventajosos para utilizarse como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. La invención también se refiere a métodos para hacer estos polipéptidos, y composiciones farmacéuticas relacionadas y equipos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A través de esta solicitud, varias publicaciones son citadas. La descripción de estas publicaciones está incorporada a la presente por referencia dentro de esta solicitud para describir más ampliamente el estado de la técnica a el cual esta invención se refiere. En años recientes, polímeros no antigénicos solubles en agua, tales como polietilenglicol ("PEG"), han sido utilizados para la modificación covalente de polipéptidos de importancia terapéutica y de diagnóstico. Por- ejemplo, la adhesión covalente de PEG a polipéptidos terapéuticos tales como interleucinas (Knauf, M. J. y otros., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15,064; Tsutsumi, Y. y otros., J. Controlled Reléase 1995, 33, 447), interferones (Kita, Y. y otros., Drug Des. Delivery 1990, 6, 157), catalasa (Abuchowski, A. y otros. M J. Biol. Chem. 1977, 252, 3,582), superoxido de dismutasa (Beauchampo, C. O. y otros Anal. Biochem. 1983, 131, 25), y adenosina deaminasa (Chen, R. y otros., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293) han sido reportados que extienden su vida promedio in vivo, y/o reducen su inmunogenicidad y antigenicidad. Sin embargo, tales métodos tienen serias desventajas. Específicamente, en la mayoría de los casos, las moléculas de PEG están adheridas a través de grupos amino sobre polipéptidos utilizando PEG metoxilado ("mPEG") que tienen porciones reactivas diferentes. Tales polímeros incluyen mPEG-sucinimidilsucinato, mPEG-sucinimidilcarbonato, mPEG-imidato, y mPEG-cloruro cianúrico. La adhesión utilizando estos polímeros fue usualmente no específica, es decir, ocurriendo a varios grupos amino sobre los polipéptidos en un modo aleatorio, y no exclusivamente a un grupo amino particular. Tal adhesión no específica puede modificar los residuos ácidos amino en sitios activos de tal modo como para eliminar la actividad biológica de los polipéptidos. Además, los conjugados resultantes pueden contener una mezcla heterogénea de polipéptidos modificados, que es indeseable para uso farmacéutico. Para superar estos problemas, fue conveniente adherir específicamente por sitio un polímero a un polipéptido. Para el polipéptido, hacerlo así preservaría la actividad biológica, prolongaría el tiempo de circulación en sangre, reduciría la inmunogenicidad, incrementa la solubilidad en agua, y mejora la resistencia a digestión de proteasa. La pegilación de sitio específico en el N termino, lado de cadena y C-término de un análogo potente de factor de crecimiento de liberación de hormona ha sido realizado a través de síntesis de fase sólida (Félix, A. M. y otros., Int J. Peptide Protein Res. 1995, 46,253) . Debido a que la pegilación específica fue lograda durante el esamble del péptido sobre una resina, el método no puede ser aplicado a un péptido existente. Un método adicional utilizado involucró adherir un péptido a extremidades de cadenas de PEG de superficie liposomal injertada en un modo de sitio específico a través de un grupo aldehido de reacción en el N-terminal generado por oxidación de peryodato de sodio de treonina N-terminal (Zalipsky s. y otros., Bioconj . Chem. 1995, 6, 705). Sin embargo, este método es limitado a polipétidos con residuos N terminal de serina o treonina. Los métodos asistidos por enzima para introducir grupos activados específicamente en la C-termino de un polipéptido han sido también descritos, (Schwarz, A. y otros., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose, K. y otros., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaerther, H. F. y otros., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224) . Típicamente estos grupos activos pueden ser hidrazida, aldehido, y grupos aromáticos amino para adhesión subsecuente de sondas funcionales a polipéptidos. Sin embargo, debido a que los métodos están basados en la especificidad de proteasas, requieren extrema precaución, y el alcance de su aplicación es limitado. La mutagénesis en sitio específico es un método adicional que ha sido utilizado para preparar polipéptidos para adhesión de polímero en sitio especifico. WO 90/12874 describe la pegilación dirigida a un sitio de proteínas modificadas por la inserción de residuos de cisteina o la substitución de otros residuos por residuos de cistenina. Esta publicación también describe la preparación de mPEG-eritropoietina ("mPEG-EPO") reaccionando un derivado de mPEG específico de cisteina con un residuo de cisteina introducido recombinantemente sobre EPO. Similarmente, la interleucina-2 fue pegilatada en su sitio de glicosilación después de mutagénesis de sitio dirigido. (Goodnson, R. J. y otros., Bio/Technology 1990, 8, 343). Las glicoproteínas proporcionan carbohidratos como sitios blanco adicionales para modificación. La enzima peroxidasa ha sido modificada con PEG-diamina a través de su porción carbohidrato (Urrutiogoity, M. y otros., Biocatalysis 1989, 2, 145) . WO 94/28024 describe los métodos para preparar mPEG-EPO a través de carbohidrato de periodato-oxidizado . La química involucrada fue formación de hidrazona raccionando mPEG-hidrazida con grupos aldehido de la porción carbohidrato sobre EPO. Este tipo de modificación genera grupos aldehidos de reacción a través de un paso de oxidación, que potencialmente puede oxidizar varios tipos de residuos de azúcar en la porción carbohidrato y algunos residuos de ácido amino en el polipéptido, tal como metionina. Otra desventaja de este método viene de la heterogeneidad de las porciones carbohidrato de EPO. El EPO expresado de células de ovario de hámster chino tiene cuatro cadenas de carbohidrato, que incluyen tres cadenas N-encadenadas a asparaginos 24, 38, y 83 y una cadena 0-encadenada a serina 126. Un total de 52 estructuras de olisacárido diferentes N-encadenadas, y al menos 6 0-encadenadas, han sidos identificadas (Rush, R.S. y otros., Anal. Chem 1995, 67, 1442; Linsley, K. B. y otros., Anal. Biochem, 1994, 219, 207) . De acuerdo con esto, es difícil controlar el número de, o sitios de adhesión, de moléculas de polímero cuando se modifica el EPO u otra proteína a través de sus cadenas de carbohidrato. En resumen, los métodos en la técnica para adherir un polímero soluble en agua a un polipéptido sufren de serias desventajas. Estas desventajas incluyen lo siguiente: (a) una falta de presición, tanto estoiquiométricamente y con respecto al sitio de adhesión; (b) la necesidad de realizar técnicas difíciles y de labor intensiva como mutagénesis de sitio específico; (c) la necesidad de utilizar síntesis de péptido de fase sólida concurrentemente con adhesión de polímero, en lugar de adherir un polímero a un polipéptido preexistente; y (d) el requerimiento rígido de que la identidad del residuo de ácido amino N-terminal sea treonina o serina. Por algún tiempo, ha existido una necesidad de un método general para adherir en sitio específico un polímero soluble en agua al residuo de ácido amino N-terminal de un polipéptido, cuyo método no sufre de las desventajas identificadas anteriormente. Sin embargo, no existe tal método^.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona dos composiciones de materia. La primera composición de materia consiste esencialmente de un polipéptido y un polímero soluble en agua enlazado covalentemente al mismo en el átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de hidrazona o enlace de hidrazona reducida, con la condición de que (a) el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, (b) .la función natural de polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal, y (c) el residuo de ácido-amino N-terminal del polipéptido no es serina o treonina. La segunda composición de materia consiste esencialmente de un polipéptido y un polímero soluble en agua enlazado covalentemente al mismo en el átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de oxima o enlace de oxima reducida con la condición de que (a) el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y (b) la función natural de polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. Esta invención también proporciona cuatro métodos para enlazar covalentemente un polímero soluble en agua al átomo de alfa-carbono N-terminal de un polipéptido. El primer método, que enlaza el polímero al átomo de carbono a través de un enlace de hidrazona, consta de los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido con (i) un ion de glicoxilato o derivado del mismo a una concentración de 0.1 M a 2.0 M, (ii) un ion de .metal de transición a una concentración de 10 µM a 1 M, y (iii) una base Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH de 3.0 a 8.0 y a una temperatura de 0°C a 100°C, como para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo alfa-carbonilo N-terminal y (b) poner en contacto el polipéptido transaminado, a un pH de 1.0 a 7.5, con un polímero soluble en agua que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con el grupo alfa-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrazona, por lo tanto uniendo covalentemente el polipéptido al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de hidrazona, con la condición de que el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y la función natural de polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. El segundo método, que enlaza el polipéptido al átomo de carbono a través de un enlace de oxima, consta de los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido con (i) un ion de glicoxilato o derivado del mismo a una concentración de 0.1 M a 2.0 M, (ii) un ion de metal de transición a una concentración de 10 µM a ÍM, y (iii) una base Lewis a una concentración de 10 µM a 10 M, a un pH de 3.0 a 8.0 y una temperatura de 0°C a 100°C, como para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo alfa-carbonilo N-terminal; y (b) poner en contacto el polipéptido transaminado, a un pH de 1.0 a 7.5, con un polipéptido soluble en agua que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con el grupo alfa-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de oxima, por lo tanto uniendo covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de oxima, con la condición de que el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y la función natural de polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. El tercer método consta de los pasos del primer método, así como un paso adicional de reducir el enlace de hidrazona formado en el paso (b) . El cuarto método consta de los pasos del segundo método, así como un paso adicional de reducir el enlace de oxima formado en el paso (b) . Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que consta de una cantidad efectiva de la composición primera o segunda del instante, y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Finalmentente, esta invención proporciona equipos para utilizarse en la preparación de las composiciones del instante. El primer equipo, para preparar la primera composición del instante, consta de los siguiente: (a) un ion glicoxilato o derivado del mismo; (b) un ion de metal de transición; (c) una base Lewis; y (d) una polímero soluble en agua que tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y que tiene una porción unida covalentemente al mismo que reacciona con un grupo alfa-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrazona, por lo tanto uniendo covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido. El segundo equipo, para utilizarse en la preparación de la segunda composición del instante, consta de lo siguiente: (a) un ion glicoxilato o derivado del mismo; (b) un ion de metal de transición; (c) una base Lewis; y (d) un polímero soluble en agua que tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y que tiene una porción unida covalentemente al mismo que reacciona con un grupo alfa-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de oxima, por lo tanto uniendo covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un esquema para preparar EPO modificado N-terminal. Esta es una reacción de dos pasos: transaminación y pegilación. Cuatro derivados mPEG5000 (es decir, mPEG que tiene un p.m. de 500 daltons) con carboxilato de hidrazina (HZC) , hidrazida (HZ) , semicarbazida (SCZ) y grupos oxilamina funcionales fueron utilizados. La figura 2 muestra el cromatograma de filtración del gel de mPEG-EPO con un enlace de hidrazona formado utilizando una porción de carboxilato de hidrazina (HZC) , EPO nativo, y carboxilato de mPEG500 hidrazina sobre una columna TSK G3000SWXL (7.5 x 30 mm) . La fase móvil es 20 mM de citrato de sodio (pH 7.0) que contiene 100 mM NaCl. La figura 3 muestra un espectro de masa de tiempo de vuelo de desabsorción de láser asistido por matriz de carboxilato de mPEG5000 hidrazina, EPO nativo, y mPEG-EPO con un enlace de hidrazona formado utilizando una porción de carboxilato de hidrazina (HZC) . La figura 4 muestra la caracterización de mPEG-EPO por métodos de electrofóresis: (1) 4-15% SDS-PAGE, tinción de Coomassie; (2) mancha Western; (3) 4-15% SDS-PAGE, tinción de yodo; y (4) enfoque isoeléctrico (IEF, pH 3-7) . Carril 1, PM o marcadores pl; carril 2, EPO nativo; carril 3, EPO transaminado; y carriles 4 y 5, mPEG-EPO con enlaces de hidrazona formados utilizando porciones de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) , respectivamente. La figura 5 muestra una gráfica de resultados de un ensayo ELISA para mPEG-EPO con enlace de hidrazona formado utilizando porciones de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) . La figura 6 muestra una gráfica de los resultados de un ensayo de proliferación de células de EPO nativo, EPO transaminado, y mPEG-EPO con enlaces de hidrazona formados utilizando porciones de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) . La figura 7 muestra una gráfica de los resultados de un bioensayo de mouse exipóxico para mPEG-EPO con enlaces de hidrazona formados utilizando porciones de carboxilato de hidrazina (HZC) , hidrazida (HZ) y semicarbazida (SCZ)^ DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona dos composiciones de materia. La primera composición de materia consiste esencialmente de un polipéptido y un polímero soluble en agua covalentemente enlazado al mismo en el átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de hidrazona o enlace de hidrazona reducida, con la condición de que (a) el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, (b) la función natural del polipéptido no esta eliminada con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal, y (c) el residuo de ácido amino N-terminal del polipéptido no es serina o treonina. La segunda composición de materia consiste esencialmente de un polipéptido y un polímero soluble en agua covalentemente enlazado al mismo en el átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de oxima o enlace de oxima reducida, con la condición de que (a) el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y (b) la función natural del polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. Como se usa en la presente, "polipéptidos" incluye péptidos y proteínas. "Péptido" significa un polipéptido de menos de 10 residuos de ácido amino en longitud, y "proteína" significa un polipéptido de 10 o más residuos de ácido amino en longitud. En esta invención, los péptidos pueden ser ocurrentes naturalmente o recombinantes (es decir, producidos a través de tecnología de ADN recombinante) , y pueden contener mutaciones (por ejemplo, mutaciones de punto, inserción y deleción) así como otras modificaciones covalentes (por ejemplo glicosilación y etiquetación a través de biotina, estreptavidina, fluoracina, y radioisótopos tales como I ) . Más aún, cada composición del instante puede contener más de un solo polipéptido, por ejemplo, cada uno puede ser un monómero (un polipéptido enlazado a un polímero) o un multímero (dos o más polipéptidos enlazados a un polímero o uno a otro) . Los polipéptidos incluyen, a manera de ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, citocinas tales como M-CSF y GM-CSF, limfocinas, IL-2, IL-3, factores de crecimiento tales como PDGF y EGF, hormonas péptido tales como hGH, EPO y derivados del mismo, factores de coagulación de sangre tales como Factor VIII, inmunógenos, enzimas, inhibidores de enzima, y otros ligandos. En la modalidad preferida de la composición del instante, el polipéptido es EPO o derivados del mismo. El EPO puede ocurrir naturalmente o ser recombinante . Los derivados de EPO incluyen, pero no están limitados a, los polipéptidos : GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG, VGNYMCHFGPITWVCRPGGG, GGVYACRMGPITWVCSPLGG, VGNYMAHMGPITWVCRPGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ, GGLYACHMGPMTWVCQPLRG, TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, YSCHFGPLTWVCK, y YCHFGPLTWVC, así como los mutantes enlistados en el cuadro 1 en seguida.

CUADRO 1 Mutación Actividad en Referencia relación a T.S. L5S +/- 9 L5S/W51S/M54S/V82S/W88S/ L112A/A124S/A125S +/- 9 S9A ++++ 3 R10A ++++ 3 E13A ++++ 3 R14L ++++ 3 R14A ++ 3 L17A ++++ 3 E18A ++++ 3 K20A ++++ 3 E21A ++++ 3 N24Q ++ 1 N24Q/N83Q + 1 N24Q/N38Q/N83Q +++ 1 C29Y/C33Y ++++ 3 A30S/L35S +++ 9 A30S/A124S/A125S ++ 9 C33P/R139C ++++ 7 L35S/A124S/A125S ++ 9 N38Q ++ 1 N38Q/N83Q ++++ 1 V41S +/- 9 CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) K45A ++++ 3 F48S ++++ 3 Y49S ++++ 3 A50S ++++ 3 W51S ++++ 3 W51S/V144S + 9 W51S/V82S/W88S ++ 9 W51S/V82S/W88S/V144N ++ 9 W51S/V82S/W88S/L112A/I119A A124S/A125S +++ 9 W51S/M54S/V82S/W88S/A124S A125S ++ 9 W51S/M54S/V82S/W88S/L112A A124S/A125S + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/L112A A124S/A125S/L130A +++ 9 W51S/M54S/V82S/W88S/I119A A124S/A125S + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/L112A I119A/A124S/A125S +++ 9 W51S/M54S/V82S/W88S/A124S A125S/L130A +++ 9 W51S/V82S/W88S/A125S/A125S L130A +++ 9 K52S ++++ 3 M54L ++++ 10 M54S/V56S ++++ 9 W57S/V82S/W88S/L112A/I119A A124S/A125S +++ 9 CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) E62A ++++ 3 W64A ++++ 3 Q65A ++++ 3 G66A ++++ 3 L69A ++++ 3 L69N ++++ 4 S71A +++ 3 A73G ++++ 3 R76A ++++ 3 V82S +/- 9 V82S/W88S/V144N ++ 9 V82S/W88S/A124S/A125S ++++ 9 N83Q ++ 9 Q92A ++++ 3 L93A ++++ 3 K97A ++++ 3 S100A ++++ 3 G101A ++++ 3 L102A ++++ 8 R103A ++ 2 S104A ++ 3 S104N +/- 6 L105A ++ 8 CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) L105F +/- 6 T106A ++++ 3 T107A +++ 8 L108A ++ 3 L109A +++ 8 L112A +/- 9 L112A/I119S/L130A/I133A ++++ 9 P122Q +/- 6 A124P/A125T ++++ 4 A125T ++++ 4 A125/A127S ++++ 4 L130A +/- 9 D136A ++++ 3 R139A ++++ 3 K140A ++++ 3 R143A ++++ 3 S146A ++++ 3 N147A ++++ 3 R150A +++ 3 K152A ++ 3 L153A , +++ 3 K154A ++++ 3 L155A ++++ 3 Y156A ++ 3 CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) T157A ++++ 3 G158A ++++ 3 E159A ++++ 3 R162K/T163D/G164E/D165L ++ 3 R162H/T163H/G164H/D165H/ R166H/(167)H ++++ 3 ÍE2-5 ++ 3 ÍEE1133--1177 + +++++++ 2 E32-36 ++ 3 ÍE43-47 ++ 3 ÍE53-57 ++ 3 JE78-82 + 3 JiEE1l1l1l--111199 + + ++ ++ 3 ?E115-121 +++ 2 ÍE120-122 ++++ 5 7E123-125 ++++ 5 ÍE126-129 +++ 5 EE116633--116666 + +++++++ 3 K116 (inserción de LISEEDL) ++++ 3 * Relativo a tipo silvestre es definido como sigue: ++++ = Tipo silvestre o actividad mejor +++ = c.a. 75% de actividad de tipo silvestre ++ = c.a. 50% de actividad de tipo silvestre + = c.a. 25% de actividad de tipo silvestre +/- = EPO mutante reportado como siendo activo, sin embargo, los datos no están completos para calcular la actividad en relación al tipo silvestre.

REFERENCIAS CITADAS (1) Akai, K. , Yamaguchi, K. y Ueda, M. , Modified forms of human erythropoietin and DNA sequences enconding genes which can express them, EP 0427 189 Al. (2) Bittorf, T., Jaster, R. y Brock, J. (1993) FEBS Letts. 336:133-136- (3) Results of Bunn, H.F., y otros. (4) Byrne, T.E. y Elliott, S.G., Erythropoietin isoforms, EP 0 668 351 Al. (5) Chern, Y., Chung, T., y Sytkowski, A.J. (1991) Eur. J. Biochem. 202: 225-229. (6) Funakoshi, A., Muta, H. , Baba, T. y Shimizu, S. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 717-722. (7) Okasinski, G. , Devries, P.J., Mellovitz, B.S., Meuth, J.L. y Schaefer, V.G., Erythropoietin analog co positíons and methods, WO 94/25055. (8) Grodberg, J. , Davis, K.L. y Sytkowski, A.J. (1993) Eur. J.

Biochem. 218: 597-601. (9) Results of Pulito, V. y otros. (10) Shoemaker, C.B., Erythropoietin composition, U.S. 4,835,260.

Como se usa en la presente, la "función natural" de un polipéptido significa su función antes de modificación covalente de su grupo alfa-amino N-terminal. Las funciones naturales incluyen, por ejemplo, actividad enzimática, receptor de enlace (por ejemplo anticuerpos), enlaces de ligandos, e inmunogenicidad . Los métodos del momento descritos más ampliamente en seguida provocan la pérdida del grupo alfa-amino N-terminal del polipéptido siendo modificado covalentemente. De acuerdo con esto, el polipéptido debe tener una estructura primaria de tal modo que su función natural sea conservada después de la modificación covalente, y no pueda ser eliminada. La función natural de polipéptido es "eliminada" por la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal si tal remoción reduce, por más de 99%, la capacidad del polipéptido de realizar su función natural. En una modalidad, la remoción no reduce la capacidad de polipéptido de realizar su función natural por más de 90%. En la modalidad preferida, la remoción no reduce la capacidad del polipéptido de realizar su función natural por más de 50%. Como se usa en la presente un "enlace de hidrozona" es un enlace que consta de la estructura covalente NH-N=C, un "enlace de óxima" es un enlace que consta de la estructura covalente 0-N=C, un "enlace de hidrozona reducida" es un enlace que consta de la estructura covalente NH-NH-C, y un "enlace de óxima reducida" es un enlace que consta de la estructura covalente 0-NH-C. Los compuestos que contienen enlaces de hidrazona reducida y óxima son provistos en la presente, debido a que estos enlaces poseen mayor estabilidad química.

Como se discutió anteriormente, son conocidos métodos en la técnica para enlazar polímeros solubles en agua a el átomo de alfa-carbono N-terminal de un polipéptido a través de un enlace de hidrozona en tanto que el residuo de ácido amino N-terminal es serina o treonina. Estos métodos conocidos no funcionarán sobre polipéptidos que tienen cualquier otro residuo N-terminal. Aunque estos métodos conocidos difieren fundamentalmente de los métodos del instante, resultan en polipéptidos de serina y treonina N-terminal que tienen un enlace de polímero en el átomo de alfa-carbono N-terminal a través de un enlace de hidrazona. Por esta razón, la primera composición del instante no abarca un enlace de polipéptido a un polímero a través de un enlace de hidrazona, en donde el residuo de ácido amino N-terminal del polipéptido es serina o treonina. Los polímeros solubles en agua utilizados en la invención del instante incluyen, pero no están limitados a, (a) dextranan y derivados de dextran, incluyendo dextransulfato, dextrina entrecruzada, y carboximetildextrina; (b) celulosa y derivados de celulosa, incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa; (c) almidón y dextrinas, y derivados de los mismos; (d) polialquilenglicol y derivados del mismo, incluyendo PEG, mPEG, homopolímeros de PEG, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol con propilenglicol, según los cuales dichos homopolímeros y copolímeros son insubstituidos o substituidos en un extremo con un grupo de alquilo; (e) heparina y fragmentos de heparina; (f) alcohol polivinílico y éteres etilpolivinílicos; (g) polivinilpirrolidona; (h) a,b-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida; y (i) polioles polioxietilados. Estos polímeros pueden ser lineales, ramificados o en forma de estrella con una amplia escala de peso molecular. En la modalidad preferida en polímero es mPEG. Cuando las composiciones del momento son para ser utilizadas como farmacéuticos, el polímero es no tóxico. Además, cuando un polímero se dice que tiene un peso molecular dado, este peso molecular puede ser solo aproximado, reflejando el peso molecular promedio de una población de moléculas de polímero que difieren con respecto una a otra en relación a el número de subunidades presentes en cada molécula. En una modalidad, el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 700 a 20,000 daltons. En la modalidad preferida, el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 5,000 daltons. Además, en la modalidad preferida de las composiciones del momento, el polipéptido es EPO, y el polímero es mPEG que tiene un peso molecular de 5,000 daltons. Esta invención también proporciona cuatro métodos para enlazar covalentemente un polímero soluble en agua a el átomo de alfa-carbono N-terminal de un polipéptido. El primer método, que enlaza el polímero a el átomo de carbón a través de un enlace de hidrazona consta de los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido con (i) un ion de glioxilato o derivado del mismo a una concentración de 0.1 M a 2.0 M, (ii) un ion de metal de transición a una concentración de 10 µM, a 1 M y (iii) una base Lewis a una concentración de 10 µM a 10 M a un pH de 3.0 a 8.0 y a una temperatura de 0o a 100 °C, como para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo alfa-carbonilo N-terminal; y (b) poner en contacto el polipéptido transaminado, a un pH de 1.0 a 7.5, con un polímero soluble en agua que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con el grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrazona, por lo tanto enlazando covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través de un enlace de hidrazona, con la condición de que el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons y la función natural de polipéptido no está eliminada con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. El segundo método, que enlaza el polímero al átomo de carbono a través de un enlace de óxima, consta de los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido con (i) un ion de glioxilato o derivado del mismo a una concentración de 0.1 M a 2.0 M, (ii) un ion de metal de transición a una concentración de 10 µM a 1 M, y (iii) una base Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH 3.0 a 8.0 y a una temperatura de 0°C a 100°C, como para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo alfa-carbonil N-terminal; y (b) poner en contacto el polipéptido transaminado, a un pH de 1.0 a 7.5, con un polímero soluble en agua que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con el grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transimanatado para formar un enlace de óxima, por lo tanto enlazando covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido a través un enlace de óxima, con la condición de que el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons y la función natural del polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. El tercer método consta de los pasos del primer método, así como un paso adicional de reducir el enlace de hidrazona formado en el paso (b) . El cuarto método adicional consta de los pasos del segundo método, así como un paso adicional de reducir el enlace de óxima formado en el paso (b) . El paso de reducción puede ser realizado utilizando, por ejemplo, borohidruro de sodio (NaBH^ y cianoborohidruro de sodio (NaBH3C ) , de acuerdo a métodos conocidos. Los derivados de ion de glioxilato incluyen, pero no están limitados a, iones de glioxilamida y fenilglioxil . Los iones de metal de transición incluyen, pero no están limitados a, iones cúpricos, de niquel, cobaltos o zinc. Las bases Lewis incluyen, pero no están limitadas a, acetato y piridina. Las porciones que reaccionan con el grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrazona incluyen, pero no están limitados a, carboxilato de hidrazina, hidrazina, semicarbazida, hidrazida, tiosemicarbazida, ácido dihidrazida carbónico, carbazida, tiocarbazida, y arilhidrazida . Los polímeros solubles en agua con estas porciones enlazadas covalentemente al mismo están disponibles comercialmente. Además, las porciones que reaccionan el grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de óxima incluyen, pero no están limitados a, oxilamina. Los polímeros solubles en agua con oxilamina (así como otras porciones que forma oxima) enlazadas covalente al mismo están disponibles comercialmente. En la modalidad preferida de los métodos del momento el pH para el paso (a) es de 5.0 a 7.0, el pH para el paso (b) es de 3.0 a 5.0, y la proteína es EPO o derivado del mismo. En una modalidad de los métodos del momento, el polímero es PEG o derivado del mismo. En una modalidad adicional, el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 700 a 20,000 daltons. En la modalidad preferida el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 5,000 daltons. En una modalidad del primer método, la porción enlazada al polímero que está reaccionada con el polipéptido transaminado es carboxilato de hidrazina. En la modalidad preferida, el polipéptido es EPO, el polímero es mPEG que tiene un peso molecular de 5,000 daltons y la porción enlazada covalentemente al polímero es carboxilato de hidrazina. En una modalidad del segundo método, la porción enlazada al polímero que es reaccionada con el polipéptido transaminado es oxilamina.

En cada uno de los métodos del momento, el tiempo de contacto preferido para el paso (a) es de 20 minutos a 2 horas, y para el paso (b) , el tiempo de contacto preferido y la temperatura son de 10 a 50 horas y de 4°C a temperatura ambiente, respectivamente. Con ciertos polipéptidos, el N-término de un polipéptido es "enterrado", es decir, no se expone a solventes o reagentes en el mismo, cuando el polipéptido está en su conformación nativa. Los reagentes tales como tetrametilurea o urea pueden ser utilizados para desdoblar tal polipéptido con el fin de permitir que su residuo N-terminal sufra las reacciones requeridas de los métodos del instante. Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que consta de una cantidad efectiva de la primera y segunda composición del momento, y un vehículo aceptable farmacéuticamente. A manera de ejemplo, la composición farmacéutica del instante puede constar de una cantidad efectiva de mPEG-EPO del instante para tratar un sujeto que sufre de anemia. Los vehículos aceptables farmacéuticamente son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, 0.01-0.1 M y preferiblemente 0.05 M de amortiguador de fosfato o 0.8% salino. Adicionalmente, tales vehículos aceptables farmacéuticamente pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer's, cloruro de sodio y dextrosa, de Ringer's lactada o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores, fluidos y nutrientes, rellenadores de electrolito tales como aquellos basados en la dextrosa de Ringer, y similares. Los conservadores y otros aditivos pueden también estar presentes, tales como, por ejemplo, antimicrobiales, antioxidantes, agentes quelatadores, gases inertes y similares. Finalmente esta invención proporciona equipos para utilizarse en la preparación de las composiciones del instante. El primer equipo, para preparar la primera composición del instante, consta de lo siguiente: (a) un ion de glioxilato o derivado del mismo; (b) un ion de metal de transición; (c) una base Lewis; y (d) un polímero soluble en agua que tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons y que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con un grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrozona, por lo tanto enlazando covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido.

El segundo equipo, para utilizarse en la preparación de la segunda composición del instante, consta de lo siguiente: (a) un ion de glioxilato o derivado del mismo; (b) un ion de metal de transición; (c) una base Lewis; y (d) un polímero soluble en agua que tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con un grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de óxima, enlazando por lo tanto covalentemente el polímero al átomo alfa-carbono N-terminal del polipéptido. Los reagentes en estos equipos pueden ser empacados en un cantidad predeterminada, y pueden estar contenidos en compartimientos separados. Alternativamente, ciertos reagentes pueden estar contenidos en los mismos compartimientos conforme la restricciones del método del instante lo permitan. Finalmente los equipo's pueden constar adicionalmente de reagentes reductores para generar enlaces de hidrazona reducida y óxima de acuerdo a los métodos del instante, así como amortiguadores adecuados y recipientes de reacción. Esta invención será mejor entendida por referencia a los ejemplos experimentales que siguen, pero aquellos expertos en la técnica apreciarán rápidamente que los experimentos específicos detallados son solo ilustrativos de la invención como se describe más adelante en las reivindicaciones que siguen después.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES 1.- Preparación de EPO transaminado 5 mg de EPO en 29 mM de citrato de sodio (Ph 6.9) y 100 mM de NaCl fueron intercambiados a 100 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 7.0) utilizando Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA) . Las concentraciones finales fueron ajustadas a 1 mg/ml EPO, 2 M de acetato de sodio, 0.4 M de ácido acético, 0.1 M de ácido glioxílico, y 10 mM de sulfato cúprico (pH 5.5) (figura 1) . La reacción se dejó durante 2 horas a temperatura ambiente, y fue detenida añadiendo 100 ml de 0.5 M EDTA. El EPO transaminado fue purificado a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando 100 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 4.5) . El grado de transaminación fue estimado por 2,4-dinitrofenilhidrazina como se describe en la literatura (Fields, R. y otros Biochem. J. , 1971, 121, 587). La extinción a 370 nm fue medida después de los primeros pocos minutos y después de una hora. La diferencia en absorbencia es proporcional a la cantidad de grupos carbonilo presentes sobre la molécula EPO. El EPO transaminado fue también sometido a análisis de ácido de amino sobre un sistema ABl 420H (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando química de precolumna PITC. Los resultados indican que residuos de licina, es decir residuos de no-N-terminal, no fueron transaminados . 2. - Preparación de mPEG-EPO con Carboxilato de mPEG-hidrazina. El EPO transaminado (1 mg) en 100 mM de acetato de sodio (pH 4.5) fue ajustado a 0.5 M de cloruro de sodio a un volumen final de 1 ml, al cual 10 mg de mPEG5000 hidrazina carboxilada (Shearwater Polymers, Hunstivile, AL) fueron añadidos. La mezcla de reacción fue agitada durante 40 horas a temperatura ambiente, y purificada a través de una columna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando 20 mM de amortiguador de citrato de sodio (7.0) conteniendo 100 mM de NaCl. Adicionalmente, 0.1% SDS puede ser añadido a la mezcla de reacción para incrementar la producción de conjugación. En cromatografía de penetración de gel, el conjugado MPEG-EPO mostró un peso molecular substancialmente incrementado comparado con aquel de EPO y mPEG5000 hidrazina carboxilada (figura 2) . La espectrometría de masa por desabsorción de láser asistida por matriz (Finningan-MAT LaserMAT 2000, tiempo de vuelo lineal) fue utilizada para caracterizar mPEG-EPO por determinación de peso molecular (figura 3) . La mPEG500 hidrazina carboxilada muestra un ion a m/z 5157.4. El EPO muestra un monómero de dos cargas (m/z 14604) , un monómero de una carga (m/z 28569), un dímero (m/z 57208) y un trímero (m/z 85284) . Similarmente, mPEG-EPO muestra un monómero de dos cargas (m/z 17092) , un monómero de una carga (m/z 34279) , un dímero (m/z 69071) y un trímero (m/z 102955) . Un espectro de dicroismo circular (CD) (Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer Instruments, SA, Edison, NJ) de mPEG-EPO mostró que la proteína retuvo la estructura de atado alfa-helicoidea presente en EPO nativo. (los datos no se muestran) . Este resultado significa que una molécula PEG en el extremo N-terminal de EPO no disrumpe su estructura secundaria. 3.- Preparación de mPEG-EPO con mPEG-hidrazida, mPEG-semicarbazida y oxilamina. El EPO transaminado (1 mg) en 100 mM de acetato de sodio (pH 4.5) fue ajustado a 0.5 M de cloruro de sodio, 0.1% SDS a un volumen final de 1 ml, y 10-20 mg de mPEG500 hidrazida semicarbazida u oxilamina fueron añadidos. La mezcla de reacción fue agitada durante 40 horas a temperatura ambiente y purificada a través de una columna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando 20 mM de un amortiguador de citrato de sodio (7.0) conteniendo 100 mM NaCl. Los conjugados mPEG-EPO fueron analizados por 4-15% SDS-PAG (Bio-Rad, Hercules, CA) con varios métodos: Macha de azul de Comassie (específico para proteínas) , mancha Western (específica para EPO) , y mancha de yodo (específica para PEG) . La distancia de emigración de conjugados mPEG-EPO de mayor peso molecular sobre SDS-PAGE es menos que aquella de EPO nativo. El patrón de enfoque isoeléctrico indica que el punto isoeléctrico (pl) de EPO no está alterado significativamente con la modificación. Sin embargo, el EPO transaminado es ligeramente más acídico que el EPO nativo y mPEG-EPO. Debido a que las bandas EPO y mPEG-EPO están bien separadas a través de SDS-PAGE, esta técnica puede ser utilizada para supervisar eficientemente la reacción de conjugación. Se observó que la reacción de conjugación fue >95% completa cuando se utilizó carboxilato de mPEG5000-hidrazina, mientras que la reacción fue solo 20% completa cuando se utilizó mPEG5000-hidrazina, mPEG5000-semicarbazida, o mPEG5000-oxilamina. De este modo, la porción carboxilato de hidrazina parece ser más reactiva hacia los grupos carbonilo que sus porciones hidrazida, semicarbazida, u oxilamina. 4. Reactividad de mPEG-EPO con anticuerpo Anti-EPO La antigenicidad de mPEG-EPO fue estudiada utilizando un equipo Quantikine™ IVD™ EPO ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN) . El ensayo constó de una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo monoclonal a EPO. Al EPO o mPEG-EPO se permitió interactuar con la placa recubierta. Después de lavar la placa, un conjugado de anticuerpo policlonal anti-EPO y peroxidasa de rábano picante fue añadido. Después de remover el exceso de conjugado, un cromogeno es añadido a los pozos y es oxidizado por la reacción de enzima para formar un complejo de color azul. La absorbencia de este complejo es medida a 450 nm. Los resultados del ensayo ELISA para mPEG-EPO con un enlace de hidrazona formado a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) se presentan en la figura 5. Los datos indican que aún una molécula PEG adherida a el N-término de EPO reduce significativamente la afinidad del enlace de anticuerpo monoclonal a EPO, posiblemente debido a hindrancia esférica.

. Actividad in vitro de mPEG-EPO La actividad biológica in vitro de mPEG-EPO fue evaluada por un ensayo de proliferación de célula utilizando células FDC-Pl/HER, una línea de célula murina hematopoiética. La línea de célula expresa el receptor EPO y su dependiente sobre EPO para cultivo. Después de que las células son cultivadas en ausencia de EPO durante 24 horas, EPO o mPEG-EPO fue añadido a las células. Las células fueron incubadas durante 42 horas, y entonces se añadió timidina triturada a las células. Después de 6 horas, el crecimiento de células fue determinado por la incorporación de timidina. Los resultados del ensayo de proliferación de célula para EPO y mPEG-EPO transaminado con enlaces de hidrazona formados a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) se presentan en la figura 6. El EPO transaminado muestra actividad biológica completa comparable a EPO nativo como se determina por su ED50. Las muestras mPEG-EPO con enlaces de hidrazona formadas a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) solo retienen 38.5% y 25% de actividad, respectivamente, como se determina por su ED50. Los datos indican que una molécula PEG adherida a el N-término de EPO reduce significativamente la afinidad de EPO por su receptor, posiblemente debido a hindrancia esférica. 6. Actividad in vivo de mPEG-EPO La actividad in vivo de mPEG-EPO fue evaluada por un bioensayo de mouse exhipótico (Coates, P.M. y otros., Nature, 1961, 191, 1065) . La formación de células rojas endógenas murinas es suprimida por la policitemia producida a través de exposiciones a presión reducida. El conjugado EPO o mPEG-EPO es inyectado a el nivel de 1 unidad/mouse . Hierro-59 fue administrado 48 horas después de la inyección EPO o mPEG-EPO. La incorporación de hierro-59, que indica formación de nuevas células de sangre roja, fue medida 48, 72 y 96 horas después de la administración de EPO o mPEG-EPO. Los resultados del bioensayo de mouse exhipótico para mPEG-EPO con enlaces de hidrazona formados con carboxilato de hidrazina (HZC) , hidrazida (HZ) y semicarbazida (SCZ) se presentan en la figura 7. Las muestras mPEG-EPO muestran alta actividad in vivo así como una duración más larga de actividad, comparado a EPO nativo. Los resultados in vivo indican que las muestras mPEG-EPO tienen un tiempo más largo de circulación in vivo y una liberación sostenida de EPO durante la circulación. 7. Preparación de dímero roPEG-Fibrina 17-29 Un dímero de fibrina 17-29 tiene la siguiente estructura : Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys S S Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys 2 mg de dímero de fibrina 17-29 fueron disueltos en 0.5 ml de 2 M de acetato de sodio, 0.4 M de ácido acético, 0.1 M de ácido glioxílico, y 10 mM de sulfato cúprico (pH 5.5) . Se permitió proceder a la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente, y fue detenida añadiendo 20 ml de 0.5 M EDTA. El dímero de fibrina transaminado fue purificado a través de una columna Sephadex G-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando 100 mM de un amortiguador de acetato de sodio (pH 4.5) . El dímero de fibrina transaminado mostró una reducción significante Gly en el análisis de ácido amino, indicando la transaminación de Gly N-terminal. 1 mg de dímero de fibrina transaminada en 0.5 ml de 100 mM de acetato de sodio (pH 4.5) fueron añadidos a 10 mg.de carboxilato de mPEG5000 hidrazina. La mezcla de reacción fue agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. El dímero mPEG-fibrina fue purificado pro cromatografía de intercambio de anión con una columna HEMA IEC BIO CM (Alltech) . La fase móvil A fue 20 mM de acetato de sodio (pH 5.5) . La fase móvil B fue 0.2 M MOPS, 0.05 M de fosfato de sodio monobásico y 0.25 M de fosfato de potasio dibásico (pH 7.5) . El gradiente fue 100% A durante 5 minutos, entonces 0 a 100% B en 25 minutos. Un nuevo pico a 14-.5 minutos, apareciendo antes del dímero de fibrina no modificada (18 minutos) fue reunido para análisis adicional. Un espectro de masa por desabsorción de láser mostró el ion a m/z 8070.9, que probó que una molécula PEG fue adherida al dímero de fibrina (m/z 2986.8)^.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de materia que consta esencialmente de un péptido o una proteína y un polímero soluble en agua enlazado covalentemente al mismo en el átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido, con la condición de que (a) el polímero y el polipéptido estén enlazados uno a otro a través de un enlace de hidrazona o enlace de hidrazona reducida, (b) el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, (c) la función natural del polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal, y (d) el residuo de ácido amino N-terminal de la proteína no es serina o treonina.

2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la proteína es EPO o derivado del mismo .

3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el polímero es PEG o derivado del mismo.

4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 700 a 20,000 daltons.

5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 5,000 daltons.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la proteína es EPO, y el polímero es mPEG que tiene un peso molecular de 5,000 daltons .

7.- Un método para enlazar covalentemente un polímero soluble en agua al átomo de alfa-carbono N-terminal de un polipéptido, que consta de los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido con (i) un ion de glioxilato o derivado del mismo a una concentración de 0.1 M a 2.0 M, (ii) un ion de metal de transición a una concentración de 10 µM a 1 M, y (iii) una base Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH de 3.0 a

8.0 y a una temperatura de 0°C a 100°C, como para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo alfa-carbonil N-terminal; y (b) poner en contacto el polipéptido transaminado, a un pH de 1.0 a 7.5, con un polímero soluble en agua que tiene una porción enlazada covalentemente al mismo que reacciona con el grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, por lo tanto enlazando covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido, con la condición de que el polímero tiene un peso molecular de 200 a 200,000 daltons, y la función natural del polipéptido no se elimina con la remoción de su grupo alfa-amino N-terminal. - 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el pH para el paso (a) es de 5.0 a 7.0.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el pH para el paso (b) es de 3.0 a 5.0.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la proteína es EPO o un derivado del mismo.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el polímero es PEG o derivado del mismo.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 700 a 20,000 daltons.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el PEG o derivado del mismo tiene un peso molecular de 5,000 daltons.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la porción enlazada covalentemente a el polímero es carboxilato de hidrazina.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la proteína es EPO, el polímero es mPEG que tiene un peso molecular de 5,000 daltons, y la porción enlazada covalentemente al polímero es carboxilato de hidrazina.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque consta adicionalmente del paso de reducir el enlace de hidrazona formado en el paso (b) como para formar un enlace de hidrazona reducida.

17.- Una composición farmacéutica que consta de una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

18. - Un equipo para utilizarse en la preparación de la composición de conformidad con la reivindicación 1, que consta de lo siguiente: (a) un ion glioxilato o derivado del mismo; (b) un ion de metal de transición; (c) una base Lewis; y (d) un polímero soluble en agua que tiene un peso molecular de 200 a 200,000, y que tiene una porción enlazada covalentemente a el mismo que reacciona con un grupo alfa-carbonil N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace de hidrazona, por lo tanto enlazando covalentemente el polímero al átomo de alfa-carbono N-terminal del polipéptido.