CN109400695B - 一种多肽的修饰方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多肽的修饰方法及应用，所述方法包括以下步骤：(1)向多肽的N端引入X，获得X‑多肽；(2)将所述X氧化为醛基；(3)加入还原剂，将步骤(2)获得的氧化产物与PEG进行共价偶联，得到PEG修饰的多肽；其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。本发明向多肽的N端引入一个苏氨酸或一个丝氨酸，并采用高度特异性的氧化方法将多肽N端的临位氨基醇结构衍生为醛基，与PEG共价偶联后得到成分单一的PEG修饰多肽，方法通用性强，应用范围广，修饰后的多肽分离方法简便，提高了多肽的稳定性和循环半衰期。

Description

一种多肽的修饰方法及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种多肽的修饰方法及应用，尤其涉及一种GLP-1受体激动剂类似物及其制备方法和应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是肠道L细胞分泌的葡萄糖依赖性降血糖多肽激素，具有阻止胰腺细胞退化、刺激胰腺细胞增殖和分化、促进胰岛素生成等作用，是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素。GLP-1可通过促进胰岛β细胞的再生和修复、增加胰岛β细胞的数量等多种机制改善II型糖尿病患者的血糖情况。此外，GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑抑制食欲，降低食物摄入量从而控制血糖。GLP-1在II型糖尿病治疗方面具有良好的应用前景，成为近年来糖尿病治疗领域的研究热点。
GLP-1由30个氨基酸组成，包括2种生物活性形式：GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，这两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80％的循环活性来源于GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1的分子量较小，仅3kDa，容易被肾小球过滤清除；同时，GLP-1氮端的His-Ala序列是二肽基肽酶IV的识别位点，极易被体内的二肽基肽酶IV降解，酶解后残留片段的活性只有原GLP-1的百分之一。因此，GLP-1在体内的半衰期很短(约2min)，药物的生物利用度低，临床使用中需要通过频繁注射来维持血药浓度，给患者带来了额外的痛苦，极大地限制了GLP-1的临床应用。提高GLP-1体内稳定性、延长药物半衰期是亟待解决的问题。
目前，对GLP-1的改造主要包括两个方面：CN1329620A、CN1350548A等通过对GLP-1的氨基酸序列进行改造，达到了降低酶解速度、提高循环稳定性的效果；CN101337989A通过在GLP-1的氨基酸序列上偶联脂肪酸链，增加了GLP-1的分子量，提高了GLP-1与血浆的亲和力，延长了半衰期；上市药物利拉鲁肽通过将GLP-1的第34位赖氨酸取代为精氨酸，并在第26位赖氨酸处偶联一个C-16脂肪酸和一个谷氨酸间隔物而获得，半衰期延长至13小时，但是利拉鲁肽的药物依从性仍然有待于提高，其链上偶联的脂肪酸溶解度不高，水溶性较差，并且其氮端的His-Ala序列仍然会被二肽酶识别而降解，导致半衰期降低。
蛋白质和多肽的聚乙二醇(PEG)修饰是成为一种成熟的修饰方法，可以改善药物稳定性、提高药物溶解性、降低药物免疫原性、提高抗酶解能力、延长药物半衰期以及改善体内药代动力学性质等，至今已经有12种聚乙二醇修饰药物通过FDA批准上市，并且有超过40种聚乙二醇修饰药物处于不同的临床实验阶段。对GLP-1进行PEG修饰是解决其临床应用问题的有效途径。
Kang Choon Lee等对GLP-1的氮末端和链内氨基进行了PEG修饰，一定程度上可以获得具有活性的单修饰产物，但是由于氨基修饰方法本身的局限性，存在着修饰位点不确定、分离困难等问题，无法获得均一的单修饰产物。
CN107266555A和CN107266557A采用定点突变技术将GLP-1序列中的某一氨基酸突变为半胱氨酸，并使用PEG马来酰亚胺进行定点修饰，一定程度上延长了药物的半衰期，但是由于其氨基酸序列与原有GLP-1不完全相同，同源性降低，可能会增强药物在体内的免疫原性，降低了体内药效动力学。CN1372570A、CN101125207A等对GLP-1类似物Exendin-4进行聚乙二醇修饰，同样也存在免疫原性和耐药性问题。
CN106421471A公开了一种新型非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)缀合肽及其应用，通过在非洲爪蟾GLP-1的C端引入促螺旋序列，同时进行PEG化修饰，得到降糖活性保持和具有更长药理作用时间的非洲爪蟾GLP-1类似物，然而所述方法同样需要对GLP-1进行半胱氨酸改构，可能会增强药物在体内的免疫原性。
因此，提供一种通用性好、工艺简便的多肽修饰方法，用于GLP-1受体激动剂的PEG修饰，提高GLP-1受体激动剂的成分均一性、药物稳定性和循环半衰期，在医药技术领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种多肽的修饰方法及应用，所述方法通过向多肽的N端定点引入苏氨酸或丝氨酸，实现了多肽的定点PEG修饰，提高了多肽的成分均一性、稳定性和循环半衰期。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多肽的修饰方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向多肽的N端引入X，获得X-多肽；
(2)将所述X氧化为醛基，示例性地，反应如式(A)所示；
Figure BDA0001848610440000031
(3)加入还原剂，将步骤(2)获得的氧化产物与PEG进行共价偶联，得到PEG修饰的多肽，示例性地，反应如式(B)所示；
Figure BDA0001848610440000041
其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。
本发明中，通过向多肽的N端定点引入苏氨酸或丝氨酸，采用高度特异性的氧化方法将多肽N端的临位氨基醇结构衍生为醛基，并与端基能与醛基反应的PEG进行共价偶联，实现了对多肽定点修饰的目的；同时，氮末端引入的苏氨酸或者丝氨酸，在氧化反应这一步已经去除，仅留下一个-CH2-CO-结构在原有多肽的氮末端，不改变原多肽的序列，有效地保留了原多肽的生物活性。
优选地，步骤(1)所述引入的方法包括固相合成法或生物表达法。
优选地，所述固相合成法为Fmoc法。
优选地，所述生物表达法包括将构建的X-多肽表达载体转入宿主菌，诱导收集菌体，裂解纯化后得到X-多肽。
优选地，步骤(2)所述氧化采用氧化剂进行。
本发明的氧化剂仅对临位氨基醇结构具有氧化作用，因此对多肽的N端的苏氨酸或丝氨酸具有高度特异性的氧化作用，实现了将N末端的苏氨酸或丝氨酸氧化为醛基的作用。
优选地，所述氧化剂包括高碘酸盐氧化剂，优选为高碘酸钠。
优选地，所述氧化剂与所述X-多肽的摩尔比为(1-3):1，例如可以是1:1、1:2或1:3。
优选地，步骤(2)所述氧化的温度为3-6℃，例如可以是3℃、4℃、5℃或6℃，优选为3-4℃。
优选地，步骤(2)所述氧化的时间为20-40min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min或40min，优选为30-35min。
优选地，步骤(3)所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠或氰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为氰基硼氢化钠。
本发明的还原剂用于偶联反应过程中所生成双键的还原，有利于偶联反应的进行并保持偶联产物的稳定性。
优选地，步骤(3)所述PEG为甲氧基聚乙二醇。
优选地，步骤(3)所述甲氧基聚乙二醇的端基包括氨基、氧氨基或酰肼中的任意一种。
优选地，步骤(3)所述PEG与所述氧化产物的摩尔比为(4-6):1，例如可以是4:1、5:1或6:1。
优选地，步骤(3)所述共价偶联的温度为3-6℃，例如可以是3℃、4℃、5℃或6℃，优选为3-4℃。
优选地，步骤(3)所述共价偶联的时间为1-3h，例如可以是1h、2h或3h。
优选地，步骤(3)所述共价偶联的pH为4-5，例如可以是4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5，优选为4-4.5。
作为优选技术方案，本发明提供了一种多肽的修饰方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在多肽的N端通过固相合成法或生物表达法引入X，获得X-多肽；
(2)按氧化剂与X-多肽的摩尔比为(1-3):1，加入高碘酸盐氧化剂，在3-6℃下反应20-40min，将所述X氧化为醛基；
(3)加入还原剂，将步骤(2)获得的氧化产物与甲氧基聚乙二醇在3-6℃、pH为4-5下共价偶联1-3h，所述甲氧基聚乙二醇与所述氧化产物的摩尔比为(4-6):1，得到PEG修饰的多肽；
其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。
第二方面，本发明提供了一种多肽类似物，所述多肽类似物采用如第一方面所述的方法制备得到。
第三方面，本发明提供了一种GLP-1受体激动剂类似物，所述GLP-1受体激动剂类似物采用如第一方所述的方法制备得到。
优选地，所述GLP-1受体激动剂类似物的结构为PEG-X-GLP-1受体激动剂；
其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。
本发明中，通过在GLP-1受体激动剂的N端定点引入苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)，不仅实现了PEG在GLP-1受体激动剂上的定点单修饰，获得了成分均一的GLP-1受体激动剂类似物，而且有效保护了GLP-1的N端His-Ala序列不被二肽基肽酶IV降解，提高了GLP-1受体激动剂的稳定性，延长了半衰期。
优选地，所述GLP-1受体激动剂包括GLP-1、艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽或索马鲁肽中的任意一种。
本发明中，GLP-1包括GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)酰胺，其中，GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG；
GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2。
优选地，所述PEG为甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
本发明中，所述PEG可以是直链型PEG或分支型PEG，优选为直链型PEG。
优选地，所述甲氧基聚乙二醇的端基包括氨基、氧氨基或酰肼中的任意一种，得到mPEG氨基(mPEG-NH2)、mPEG氧氨(mPEG-O-NH2)或mPEG酰肼(mPEG-CO-NH-NH2)中的任意一种。
本发明中，在还原剂存在的情况下，采用端基为氨基、氧氨基或酰肼的PEG与醛基发生反应，实现了PEG在GLP-1受体激动剂上的定点共价偶联。
优选地，所述甲氧基聚乙二醇的分子量为2000-50000Da，例如可以是2000Da、5000Da、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da或50000Da，优选为5000-20000Da，进一步优选为5000-10000Da。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第二方面所述的多肽类似物和/或如第三方面所述的GLP-1受体激动剂类似物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种如第二方面所述的多肽类似物、如第三方面所述的GLP-1受体激动剂类似物或如第四方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备预防和/或治疗肥胖、糖尿病或阿尔兹海默症疾病药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用固相合成或生物表达的方法向多肽的N端引入一个苏氨酸或一个丝氨酸，并采用高度特异性的氧化方法将多肽N端的临位氨基醇结构衍生为醛基，与PEG共价偶联后得到成分单一的PEG修饰多肽，方法通用性强，应用范围广，修饰后的多肽分离方法简便，提高了多肽的稳定性和循环半衰期；
(2)采用本发明的多肽修饰方法制备得到的GLP-1受体激动剂类似物与GLP-1受体激动剂具有100％同源性，不仅保留了GLP-1受体激动剂的降血糖效果，而且避免了免疫原性与耐药性问题；
(3)本发明的PEG修饰GLP-1受体激动剂的整体修饰率为80.3％；
(4)本发明通过在GLP-1的N端进入一个苏氨酸或一个丝氨酸，有效地保护了GLP-1的N端His-Ala序列不被二肽基肽酶IV降解，获得的GLP-1类似物的体内半衰期提高了60倍以上，AUC值为原GLP-1的10倍。
附图说明
图1为T-GLP-1的SDS-PAGE电泳图，其中，1-标准蛋白样，分子量依次为14.4KDa、18.4KDa、25.0KDa、35.0KDa、45.0KDa、66.2KDa和116.0KDa，2-大肠杆菌可溶性表达含T-GLP-1的混合物，3-经过亲和层析初步纯化的T-GLP-1，4-经过离子交换层析得到的T-GLP-1；
图2为T-GLP-1、T-GLP-1和mPEG5k-T-GLP-1的高效液相色谱图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1Fmoc固相合成X-GLP-1受体激动剂
取活化好的Fmoc-环酰胺-MBHA树脂(Fmoc-rink amide-MBHA resin)置于CS Bio多肽合成仪中，依次通过脱保护和偶合步骤按照X-GLP-1受体激动剂的序列连接氨基酸，得到连接有X-GLP-1受体激动剂的树脂；使用茚三酮法测定偶合步骤的效率，显色反应呈阴性则进入下一个偶合循环；反应完成后，加入裂解液将多肽从树脂上裂解下来，洗涤过后得到X-GLP-1受体激动剂粗品；粗品使用制备级HPLC进行纯化，流动相为A(纯水+0.1％TFA)、B(乙腈+0.1％TFA)，收集目标出峰，冻干得到X-GLP-1受体激动剂纯品。
本实施例中，X为苏氨酸或丝氨酸，GLP-1受体激动剂为GLP-1、艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽或索马鲁肽。
实施例2生物表达X-GLP-1受体激动剂
在GLP-1受体激动剂基因片段的末端增加一个苏氨酸密码子或一个丝氨酸密码子，构建至pET28a载体中肠激酶位点(DDDDK)和组氨酸标签的上游，得到融合多肽Histag-DDDDK-T-GLP-1的表达质粒；将构建的质粒转化至大肠杆菌BL21(Takara)，使用0.5mM IPTG诱导，收集菌体；细菌裂解后离心收集上清，使用Ni亲和柱初步纯化，然后使用肠激酶酶切去除肠激酶位点序列和组氨酸标签，最后使用离子交换层析纯化获得X-GLP-1受体激动剂。
本实施例中，X为苏氨酸或丝氨酸，GLP-1受体激动剂为GLP-1、艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽或索马鲁肽。
将表达与纯化过程各样品收集进行SDS-PAGE检测，如图1所示，示例性地，制备获得的T-GLP-1的纯度达95％以上。
实施例3X-GLP-1受体激动剂的N端定点氧化
取X-GLP-1受体激动剂溶解于PB缓冲液(50mM，pH＝7.0)中，按NaIO4与X-GLP-1受体激动剂的摩尔比为2:1，加入1mg/mL NaIO4溶液，4℃下反应30min，加入100μL乙二醇终止反应；
将样品加入GE G25脱盐柱收取多肽峰，加入消色品红显色试剂进行显色。
显色结果发现，氧化后的X-GLP-1受体激动剂显鲜红色，为消色品红检测醛基的特征颜色，表明NaIO4将苏氨酸或丝氨酸氧化为醛基。
本实施例中，X为苏氨酸或丝氨酸，GLP-1受体激动剂为GLP-1、艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽或索马鲁肽。
将氧化前后的样品进行高效液相色谱检测，结果如图2所示，示例性地，T-GLP-1在C18柱上的保留时间为14.68min，氧化后生成带有唯一醛基的T-GLP-1-CHO，保留时间为15.01min。
实施例4mPEG5k-HZ修饰的GLP-1类似物的制备
向氧化的Thr-GLP-1中加入分子量为5000Da的mPEG酰肼粉末(mPEG5k-HZ)，mPEG5k-HZ与Thr-GLP-1的摩尔比为5:1，反应过程中加入5mM的氰基硼氢化钠作为还原剂，在pH为4.5、4℃条件下振荡反应2h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，流动相为含有20mM PB的Na2SO4缓冲体系(0.1M，pH＝7.4)，流速为0.6mL/min，在检测波长为220nm下收集出峰，将收集的样品在含有20mM PB、5％甘露醇的体系下透析过夜，超滤浓缩后保存。
结果如图2所示，成功分离纯化得到的mPEG5k-T-GLP-1的保留时间达15.3min，整体修饰率为80.3％。
实施例5mPEG20k-HZ修饰的艾塞那肽类似物的制备
向氧化的Thr-艾塞那肽中加入分子量为20000Da的mPEG酰肼粉末(mPEG20k-HZ)，mPEG20k-HZ与Thr-艾塞那肽的摩尔比为5:1，反应过程中加入5mM的氰基硼氢化钠作为还原剂，在pH为4.5、4℃条件下振荡反应2h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，流动相为含有20mM PB的Na2SO4缓冲体系(0.1M，pH＝7.4)，流速为0.6mL/min，在检测波长为220nm下收集出峰，将收集的样品在含有20mM PB、5％甘露醇的体系下透析过夜，超滤浓缩后保存。
结果发现，成功分离纯化得到mPEG20k-HZ修饰的艾塞那肽。
实施例6mPEG10k-O-NH2修饰的利拉鲁肽类似物的制备
向氧化的Thr-利拉鲁肽中加入分子量为10000Da的mPEG氧氨粉末(mPEG10k-O-NH2)，mPEG10k-O-NH2与Thr-利拉鲁肽的摩尔比为5:1，反应过程中加入5mM的氰基硼氢化钠作为还原剂，在pH为4.5、4℃条件下振荡反应2h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，收集样品经HPLC检测，发现成功分离纯化得到mPEG10k-O-NH2修饰的利拉鲁肽。
实施例7mPEG2k-NH2修饰的阿必鲁肽类似物的制备
向氧化的Ser-阿必鲁肽中加入分子量为2000Da的mPEG氨基粉末(mPEG2k-NH2)，mPEG2k-NH2与Ser-阿必鲁肽的摩尔比为6:1，反应过程中加入5mM的硼氢化钠作为还原剂，在pH为4、3℃条件下振荡反应3h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，收集样品经HPLC检测，发现成功分离纯化得到mPEG2k-NH2修饰的阿必鲁肽。
实施例8mPEG50k-NH2修饰的度拉糖肽类似物的制备
向氧化的Ser-度拉糖肽中加入分子量为50000Da的mPEG氨基粉末(mPEG50k-NH2)，mPEG50k-NH2与Ser-度拉糖肽的摩尔比为4:1，反应过程中加入5mM的醋酸硼氢化钠作为还原剂，在pH为5、6℃条件下振荡反应1h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，收集样品经HPLC检测，发现成功分离纯化得到mPEG50k-NH2修饰的度拉糖肽。
实施例9mPEG5k-HZ修饰的索马鲁肽类似物的制备
向氧化的Thr-索马鲁肽中加入分子量为5000Da的mPEG酰肼粉末(mPEG5k-HZ)，mPEG5k-HZ与Thr-索马鲁肽的摩尔比为5:1，反应过程中加入5mM的氰基硼氢化钠作为还原剂，在pH为4.5、4℃条件下振荡反应2h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，收集样品经HPLC检测，发现成功分离纯化得到mPEG50k-NH2修饰的索马鲁肽。
实施例10mPEG5k-HZ修饰的胸腺肽类似物的制备
向氧化的Ser-胸腺肽中加入分子量为5000Da的mPEG酰肼粉末(mPEG5k-HZ)，mPEG5k-HZ与Ser-胸腺肽的摩尔比为5:1，反应过程中加入5mM的氰基硼氢化钠作为还原剂，在pH为4.5、4℃条件下振荡反应2h；
反应完成后，将反应液经GE Superdex 75 10/300GL柱进行层析分离，收集样品经HPLC检测，发现成功分离纯化得到mPEG50k-NH2修饰的胸腺肽。
实施例11mPEG5k-T-GLP-1的体内药代动力学检测
mPEG5k-T-GLP-1的体内药代动力学活性检测采用30只雄性SD大鼠，7-8周龄，体重为200-250g/只，大鼠随机分组后注射GLP-1或mPEG5k-T-GLP-1，注射剂量为2μg/kg体重，注射方式采用皮下注射；
从第一次注射开始计时，于第1、2、4、8、30、60、120和240min从大鼠眼窝处取血，置于含有EDTA的小管中，在5000rpm下4℃离心5min，弃去下层的细胞，取上清保存于-80℃；
将保存的样本统一取出解冻，使用大鼠GLP-1酶联免疫分析ELISA试剂盒测定不同时间点的GLP-1浓度，根据测量结果计算PEG修饰前后GLP-1的半衰期和AUC值。
结果表明，mPEG5k-T-GLP-1的体内半衰期提高了60倍以上，AUC值为原GLP-1的10倍。
实施例12mPEG5k-T-GLP-1的体内药效学活性检测
mPEG5k-T-GLP-1的体内药效学活性检测采用30只雄性II型糖尿病db/db小鼠，7-8周龄，给予高脂饲料喂养造模，自动物饲养开始，每日观察动物情况，每周三于禁食8h后逐一称量体重，并测量小鼠尾静脉血糖水平；
干预8周后随机选取造模成功的小鼠18只分为三组，每只小鼠注射GLP-1或mPEG5k-T-GLP-1，注射剂量为2μg/kg体重，注射方式采用皮下注射；
从第一次注射开始计时，于第1、2、4、8、30、60、120和240min从小鼠尾静脉取血，置于含有EDTA的小管中，在5000rpm下4℃离心5min，弃去下层的细胞，取上清保存于-80℃；
将保存的样本统一取出解冻，采用酶联免疫试剂盒测定血糖浓度和胰岛素含量。
结果表明，mPEG5k-T-GLP-1在体内具有显著的降血糖效果，注射5小时后，db/db小鼠的血糖达到正常水平。
综上所述，本发明采用固相合成或生物表达的方法向多肽的N端引入一个苏氨酸或一个丝氨酸，并采用高度特异性的氧化方法将多肽N端的临位氨基醇结构衍生为醛基，与PEG共价偶联后得到成分单一的PEG修饰多肽，方法通用性强，应用范围广，修饰后的多肽分离方法简便，提高了多肽的稳定性和循环半衰期；采用本发明的多肽修饰方法制备得到的GLP-1受体激动剂类似物与GLP-1受体激动剂具有100％同源性，不仅保留了GLP-1受体激动剂的降血糖效果，而且避免了免疫原性与耐药性问题；引入的苏氨酸或丝氨酸有效地保护了GLP-1的N端His-Ala序列不被二肽基肽酶IV降解，获得的GLP-1类似物的体内半衰期提高了60倍以上，AUC值为原GLP-1的10倍。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 一种多肽的修饰方法及应用
<130> 20180929
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30

Claims (18)

1.一种保留多肽氨基酸序列的多肽的修饰方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）向多肽的N端引入X，获得X-多肽；
（2）将所述X氧化为醛基；
（3）加入还原剂，将步骤（2）获得的氧化产物与PEG进行共价偶联，得到PEG修饰的多肽；
其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸；
所述PEG为mPEG-NH2或mPEG-O-NH2；
步骤（1）所述引入的方法为Fmoc固相合成法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化采用氧化剂进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂包括高碘酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂与所述X-多肽的摩尔比为(1-3):1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化的温度为3-6℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化的温度为3-4℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化的时间为20-40 min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化的时间为30-35 min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠或氰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述还原剂为氰基硼氢化钠。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述PEG与所述氧化产物的摩尔比为(4-6):1。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述共价偶联的温度为3-6℃。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述共价偶联的温度为3-4℃。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述共价偶联的时间为1-3 h。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述共价偶联的pH为4-5。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述共价偶联的pH为4-4.5。
18.根据权利要求1-17任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在多肽的N端通过Fmoc固相合成法引入X，获得X-多肽；
（2）按氧化剂与X-多肽的摩尔比为(1-3):1，加入高碘酸盐氧化剂，在3-6℃下反应20-40 min，将所述X氧化为醛基；
（3）加入还原剂，将步骤（2）获得的氧化产物与甲氧基聚乙二醇在3-6℃、pH为4-5下共价偶联1-3 h，所述甲氧基聚乙二醇与所述氧化产物的摩尔比为(4-6):1，得到PEG修饰的多肽；
其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。
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